JP5751824B2 - 情報取得方法 - Google Patents
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Description
前記タンパク質又はペプチドを限定分解した後、前記試料の一定領域を質量分析する工程と、
限定分解された前記タンパク質又は前記ペプチドの親イオンに帰属されないが、相関しているイオンピークであって、限定分解された前記タンパク質又はペプチドの親イオンに帰属されるイオンピークの前記一定領域の強度分布および積算スペクトルのピーク強度に対して、ピアソンの積率相関係数が0.5以上1.0以下の強度分布を有し、前記一定領域の積算スペクトルのピーク強度比が1.0よりも大きく、m/zが500以上の前記イオンピーク、を用いて、前記分布状態に関する情報を得る工程と、
を有することを特徴とする情報取得方法に関する。
本発明の方法では、生体組織等の試料中のタンパク質を限定分解した後、試料の一定領域を質量分析する。
タンパク質の限定分解(消化分解)に用いる物質(以下、「消化物質」と言う)は、特に限定されるものではない。消化物質は、(I)消化酵素(II)消化酵素以外の化学物質に大別される。(I)消化酵素の代表例としては、トリプシン、キモトリプシン、Lys−C、Asp−Nなどが挙げられる。また、(II)消化酵素以外の化学物質の代表例としては、ブロモシアン(CNBr)、3−メチル−3−ブロモ−2−[(2−ニトロフェニル)チオ]−3H−インドール(BNPS−skatole)、2−ニトロ−5−チオシアノベンゾエート(NTCB)、ヒドロキシアラニン、ギ酸、ジメチルスルホキシド−塩酸−臭化水素(DMSO−HCl−HBr)、N−ブロモスクシンイミド(NBS)などが挙げられる。
・一次イオンを用いる方法。
・MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization、マトリックス支援レーザー脱離イオン化)法。
・DESI(Desorption Electrospray Ionization、脱離エレクトロスプレーイオン化)法。
・FAB(Fast Atom Bombardment、高速原子衝突)法。
(a)四重極型。
(b)磁場偏向型。
(c)フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型。
(d)イオントラップ型。
(e)飛行時間型(TOF)型。
(f)タンデム型。
(b)磁場偏向型とは、イオンを磁場中に通し、その際に受けるローレンツ力による飛行経路の変化を利用する分析法である。
(c)フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型では、イオンを静電場と静磁場のかかったセルに導入し、イオン運動を励起するための高周波電圧を印加してイオンの周回周期を検出する。そして、サイクロトロン条件から質量を算出する分析法である。
(d)イオントラップ型とは、イオンを電極からなるトラップ室に保持し、この電位を変化させることで選択的にイオンを放出することで分離を行う分析法である。
また、(f)タンデム型は、上記の分析法を複数組み合わせる方法である。
本工程では、質量分析をする工程で得られた質量スペクトルのイオンピーク群の質量情報(m/zの値)とタンパク質のアミノ酸配列データベースとを対照して、ピークを同定する。そして、アミノ酸配列の同定ならびに特定の消化断片の親イオンへの帰属を行う。
(I)質量イメージング法で得た質量情報を、タンパク質のアミノ酸配列データベースと照合する。
(II)質量イメージング法で得た質量情報と、別途他の質量分析法で得た質量情報とタンパク質のアミノ酸配列データベースとの照合により得られたアミノ酸配列情報とを照合する。
次に、本工程では、質量分析で得られたピークを帰属する工程でアミノ酸配列を同定し、特定の消化断片の親イオンへと帰属したイオンピークの中から、目的とするタンパク質又はペプチドより生成した消化断片の親イオンとして帰属されたイオンピークを検出する。検出するイオンピークは一つであってもよく、また複数であってもよい。
次に、本工程では、消化断片の親イオンピークを検出する工程で得たタンパク質又はペプチドより生成した消化断片の親イオンピークと、強度分布が相関するイオンピークを検出する。具体的には、以下の方法による。
本工程では、位置および強度情報が相関するイオンピークを検出する工程で検出した、位置および強度情報が相関するイオンピークの中でm/zの値が500以上のイオンピークを用いてタンパク質の分布状態の情報を取得する。ここで、タンパク質の分布情報を取得することには、タンパク質の分布情報の可視化及び画像化を含む。m/zの値が500未満の場合には、位置及び強度情報が相関するイオンピークは、親イオンとは無関係のイオンの断片や脂質などに起因するピークを含んでいる。したがって、m/zの値が500未満の場合には、親イオンのタンパク質と関係のあるタンパク質の質量情報だけを取得することが困難である。
比較例1では、特開2006−010658号公報を参照して、生体組織中のタンパク質を消化分解した。そして、TOF−SIMS法により限定分解されたタンパク質の消化断片の親イオンピークを検出し、この親イオンの強度分布と相関するイオンピークを用いてタンパク質を可視化した。
一次イオン:25kV Bi+、1pA(パルス電流値)、ステージラスタースキャンモード
一次イオンのパルス周波数:5kHz(200μs/shot)
一次イオンパルス幅:約1ns
一次イオンビーム直径:約2μm
測定領域:4mm×4mm
二次イオン像の画素数:256×256
1画素当たりのショット数:256shots
検出二次イオン:正イオン
本実施例では、比較例1と同様に、試料としてHER2を用い、限定分解の消化酵素としてトリプシンを用い、質量分析法としてTOF−SIMS法を用いた。
実施例1において、実施例1で画像化したイオンピーク以外のイオンピークを用いて二次元分布状態を画像化した。以下の例では、いずれも実施例1の画像よりも相関係数が低かった。
上記実施例1で得た画像(図3乃至5)と比較例1で得た画像(図2)とを比較すると、明らかに実施例1で得た画像のほうがより明瞭であった。
Claims (7)
- 試料中のタンパク質又はペプチドを質量分析して、前記質量分析で得られた質量情報に基づいて前記試料中の前記タンパク質又は前記ペプチドの分布状態に関する情報を得る情報取得方法であって、
前記タンパク質又はペプチドを限定分解した後、前記試料の一定領域を質量分析する工程と、
限定分解された前記タンパク質又は前記ペプチドの親イオンに帰属されないが、相関しているイオンピークであって、限定分解された前記タンパク質又はペプチドの親イオンに帰属されるイオンピークの前記一定領域の強度分布および積算スペクトルのピーク強度に対して、ピアソンの積率相関係数が0.5以上1.0以下の強度分布を有し、前記一定領域の積算スペクトルのピーク強度比が1.0よりも大きく、m/zが500以上の前記イオンピーク、を用いて、前記分布状態に関する情報を得る工程と、
を有することを特徴とする情報取得方法。 - 前記質量分析の工程の結果得られた質量スペクトルについて、限定分解された前記タンパク質又は前記ペプチドの親イオンへのピーク帰属を行う工程を有する請求項1に記載の情報取得方法。
- 前記ピーク帰属を行う工程が、限定分解された前記タンパク質又は前記ペプチドの親イオンの帰属ピークと、前記タンパク質又は前記ペプチドの親イオンに対する未帰属ピークとに分別する工程である請求項2に記載の情報取得方法。
- 前記質量分析法が、TOF−SIMS法であることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の情報取得方法。
- 前記タンパク質がHER2であり、前記限定分解は消化酵素としてトリプシンが用いられ、前記イオンピークのm/zが719.7±0.5、1267.7±0.5、1298.0±0.5より選ばれる一つまたは複数のピークであることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の情報取得方法。
- 前記イオンピークのm/zが719.7±0.5であることを特徴とする請求項5に記載の情報取得方法。
- 前記親イオンに帰属されるイオンピークを用いず、前記親イオンに帰属されないが、相関している前記イオンピークを用いた分布画像を取得する請求項1から4のいずれか1項に記載の情報取得方法。
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