CN1813190B - 信息获取方法 - Google Patents

Abstract

获取目标对象信息的信息获取方法，该方法包括使用促进目标对象电离的物质促进目标对象的电离以引起目标对象发射的步骤，和使用飞行时间次级离子质谱获取脱逸的目标对象的质量信息的步骤。

Description

信息获取方法

技术领域

本发明涉及获取信息的方法，获取信息的装置和诊断疾病的方法，和更特别地涉及使用飞行时间次级离子质谱(TOF-SIMS)的方法或装置。 

背景技术

基因组学近年来的进展导致对体内存在的基因产物——蛋白质分析重要性的快速注视。 

在现在之前已经显示了分析蛋白质的表达和功能的重要性，并且已有分析方法得以开发。具体地，使用如下方面的组合实施这些方法： 

(1)通过两向电泳或高效液相色谱(HPLC)的分离和精制，和 

(2)检测系统如辐射度量学，光学分析或质谱。 

分析蛋白质技术中的发展包括通过蛋白质组分析(细胞间蛋白质的彻底分析)的数据库构建，它可以被认为是蛋白质分析的基础。基于获得的数据库的设备因此可以粗分成诊断设备和和开发创新药物的设备(药物候选物的筛选)。然而，关于每种形式的应用，通常的方法具有在关于分析时间、产量、灵敏度、分析能力、灵活性等的问题。因此需要在这此方面不同于常规方法和能够实现微型化，提高的速度和自动化的设备。因此，其中在高密度下累积蛋白质的所谓“蛋白质芯片”的开发作为满足这些需要的方法正在吸引着注意力。 

在蛋白质芯片上捕集的靶分子可以由以下所述的各种检测措施检测。 

在涉及蛋白质质谱(MS)的方法中，近年来飞行时间次级离子质谱(以下缩写为“TOF-SIMS”)用作高灵敏度质谱措施或表面分析措施。术语“TOF-SIMS”表示研究什么类型原子或分子在固体样品最外表面上存在的分析方法。TOF-SIMS具有如下特性。即，它可检测10⁹个原 子/cm²的痕量成分(相当于最外表面1个原子层的1/10⁵的数量)，它可以应用于有机物质和无机物质两者，它可测量表面上存在的所有化学元素或化合物，它能够从样品表面上存在的物质将次级离子成像。 

以下简要描述此方法的原理。 

在高真空中，将高速脉冲化离子束(初级离子)施加到固体样品表面，因此由溅射现象将表面的成分释放入真空。将在此时产生的具有正或负电荷的离子(次级离子)由电场在一个方向会聚和在从样品间隔固定距离的位置检测。当将脉冲化初级离子施加到固体表面时，根据样品表面的组成产生具有各种质量的次级离子。由于离子越轻它发射得越快速，和相反，离子越重它发射得越缓慢，可以通过测量从次级离子产生直到检测的时间(飞行时间)分析产生的次级离子的质量。由于当将初级离子在样品上辐射时仅将在固体样品最外表面上产生的次级离子释放入真空，可以获得最外表面的信息(大约几nm的深度)。由于TOF-SIMS中的初级离子能流显著小，有机化合物在保持化学结构的状态下电离，可以从质谱了解有机化合物的结构。然而，当使用TOF-SIMS在正常条件下分析人造高聚物如聚乙烯或聚酯，生物聚合物如蛋白质等时，形成小的分解的碎片离子种，因此通常难以知道样品的初始结构。当固体样品是绝缘体时，可以通过在初级离子辐射的脉冲中在间隙期间使用另外的脉冲化电子束分析绝缘体，以由此中和在固体表面上累积的正电荷。此外，在TOF-SIMS中，也可以通过扫描经过样品表面的初级离子束产生样品表面的离子图像(绘图)。 

使用TOF-SIMS的蛋白质分析的例子包括分析，其中将特定蛋白质的一部分采用同位素如¹⁵N标记，使用次级离子如C¹⁵N^-检测蛋白质的成像(A.M.Belu等人，Anal.Chem.，73，143(2001))。此外，有报导研究根据相应于氨基酸残基及其相对强度的碎片离子种(次级离子)的种类预测蛋白质的种类(D.S.Mantus等人，Anal.Chem.，65，1431(1993))。此外，调查在各种类别基板上吸附的蛋白质的TOF-SIMS检测极限的研究是已知的(M.S.Wagner等人，J.Biomater.Sci.Polymer Edn.，13，407(2002))。 

采用蛋白质作为靶的另一种质谱方法是采用场发射的方法(USP5,952,654)。在此方法中，通过可分裂的开放基团根据施加的能量将蛋白质经历在金属电极上的共价键合或配位键合，通过施加高电场将蛋白质引入质谱仪。 

然而，由于常规质谱不分析目标物质自身，但相反地取洗脱的蛋白质等作为它的对象，对获得的信息存在限制。 

MALDI方法和SELDI方法，MALDI方法的改进版本，是目前已知的最温和电离方法。它们具有优异的特性，能够实现自身易于发生断裂的高分子量蛋白质的电离，然后对母离子或与其符合的离子的检测。当分析蛋白质的质量时这是目前的一种标准电离方法。然而，当应用这些方法于蛋白质芯片的质谱时，由于基体物质的存在，难以获得具有高空间分辨率的蛋白质的二维分布图像(使用质量信息的成像)。更具体地，尽管是激发源的激光束自身可以容易地缩小到约1-2μm的直径，在分析靶的蛋白质附近存在的基体物质由激光束蒸发和电离，因此当由以上方法产生蛋白质的二维分布图像时获得的空间分辨率通常仅在约100μm的水平。同样，为扫描缩小的激光束必须采用复杂方式操作透镜和镜子。简言之，当由以上方法产生蛋白质的二维分布图像时难以扫描激光束，技术限于移动放置了要分析的样品的样品台的方法。当尝试在高空间分辨率下获得蛋白质的二维分布图像时，移动样品台的方法通常不是优选的。 

与以上方法比较，由于TOF-SIMS方法使用初级离子，可以容易地进行其会聚和扫描。因此，可以获得高空间分辨率的次级离子图像(二维分布图像)，可以获得约1μm水平的空间分辨率。然而，关于基板上的目标物质，当在正常条件下进行TOF-SIMS测量时，如上所述由于几乎所有产生的次级离子是小的分解碎片离子种，通常难以知道目标物质的初始结构。因此，对于样品如在基板上放置了多个蛋白质的蛋白质芯片，为获得可以区分蛋白质的种类的高空间分辨率的次级离子图像(二维分布图像)，必须采用一些形式的设计方案。上述A.M.Belu等人的方法是中将特定蛋白质的一部分采用同位素标记以允许适当地 开发TOF-SIMS的高空间分辨率的方法。然而，对于每种测量向特定蛋白质提供同位素标记不是通常的技术。在D.S.Mantus等人的方法中，该方法从相应于氨基酸残基及其相对强度的碎片离子种(次级离子)种类预测蛋白质的种类，当存在具有相似氨基酸结构的蛋白质混合物时产生难度。 

当应用TOF-SIMS方法于来自活体的组织，例如蛋白质分子时，当包括蛋白质分子的肽链处于″保持状态″时，次级离子的电离效率下降很大的程度。同样，在使用TOF-SIMS的测量中，由于在高真空中进行初级离子的辐射，预先要对测量靶样品进行干燥处理。如果在蛋白质分子和来自活体的组织中存在的其它生物材料之间在干燥处理时产生相互作用和通过分子间键合引起聚集，次级离子的电离效率进一步下降。 

因此，优选在高检测灵敏度下和采用高定量化分析来自活体的组织中存在的一定量的特定蛋白质分子，释放在组织中处于“保持状态”的包括蛋白质分子的肽链状态，以对在组织切片上的大量特定蛋白质分子分布状态进行二维成像。此外，优选抑制在蛋白质分子和其它生物材料之间的相互作用，保持此状态由此在高效率下从已经从“保持”状态释放的肽链产生次级离子。或者，优选促进和增进从在来自活体的组织切片上存在的蛋白质分子的次级离子的产生。 

同时，在TOF-SIMS方法中，尽管由采用初级离子辐射是分析目标的分子进行离子溅射，根据在其上进行初级离子辐射的表面的形态产生溅射效率的差异。结果是，在衍生自作为分析目标的分子的次级离子产生效率中也产生差异。这是引起分析精度变化的因素。因此，优选也抑制来自在其上进行初级离子辐射的表面形态的变化导致的次级离子产生效率中的波动。然而，迄今为止公开的方法在克服这些问题中不是必须适当的。 

发明公开 

根据本发明的一方面，提供一种获取目标对象的信息的信息获取方法，其特征在于它包括如下步骤： 

使用促进目标对象的电离的物质促进目标对象的电离以引起目标对象发射；和 

使用飞行时间次级离子质谱获取脱逸的目标对象的质量信息。 

目标对象优选是蛋白质。 

脱逸的目标对象优选是任何如下物质： 

(1)对应于目标对象母分子的离子； 

(2)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加获得的质量的离子； 

(3)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子； 

(4)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加，和进一步向其加成至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子，和从其消除至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子； 

(5)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加获得的质量的离子； 

(6)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加，和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子；和 

(7)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加，和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子，和从其消除至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子。 

优选根据脱逸的目标对象的检测结果获取通过初级离子的扫描得到的目标对象二维分布状态的信息。 

促进目标对象电离的步骤优选由如下步骤构成：使目标对象和促进电离的物质接触，然后在接触部分上辐射初级离子。接触步骤优选采用银镜反应进行。 

本发明进一步提供使用质谱分析目标对象的化学组成的化学组成分析方法，该方法的特征在于它包括使用促进目标对象电离的物质促进目标对象的电离以引起目标对象发射的步骤，和根据关于脱逸的目标对象的信息分析目标对象化学组成的步骤。 

本发明进一步提供使用质谱从目标对象获取信息的信息获取装置，其特征在于它包括进行目标对象化学改性的设施，产生可以由化学改性得以区分的目标对象次级离子的设施，和检测次级离子的设施。 

根据本发明的另一方面，提供使用飞行时间质谱仪获取目标对象的质量信息的信息获取方法，其特征在于它包括如下步骤： 

施加促进目标对象电离的物质； 

使用聚焦的、脉冲化和可扫描的初级束电离目标对象以引起目标对象发射；和 

使用飞行时间质谱仪获取脱逸的目标对象的质量信息。 

初级束优选是离子束。 

施加促进目标对象电离的物质的步骤优选是使用包括电离促进物质的水溶液的步骤，并在单步骤工艺中进行。促进目标对象电离的物质优选是水溶性物质。或者，促进目标对象电离的物质优选由至少一种选自贵金属和碱金属的原子构成。促进目标对象电离的物质优选由Ag或Na的原子构成。 

目标对象的质量信息优选是任何如下物质的质量信息： 

(1)对应于由选自贵金属和碱金属的至少一种原子的质量向目标对象的母分子质量的附加获得的质量的离子； 

(2)对应于由选自贵金属和碱金属的至少一种原子的质量向目标对象的母分子质量的附加和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子的质量获得的质量的离子； 

(3)对应于由选自贵金属和碱金属的至少一种原子的质量向目标对象的母分子质量的附加和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子的质量，和从其消除至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子的质量获得的质量的离子。 

制备目标对象的步骤和施加促进目标对象电离的物质的步骤中的至少一个步骤优选通过施加小滴进行。小滴优选由水和表面活性剂构成。 

以上聚焦的、脉冲化和可扫描的初级束选自离子、中性粒子、电子、和聚焦的、脉冲化和可扫描的激光束，优选是离子。在此情况下，信息获取方法是使用飞行时间次级离子质谱的方法。 

本发明也提供以上的方法，其特征在于目标对象是蛋白质。 

本发明进一步提供以上的方法，其特征在于施加目标对象或促进电离的物质，或其两者的步骤是使用喷墨方法的步骤。 

本发明再进一步提供以上的信息获取方法，其特征在于施加促进目标对象电离的物质的步骤是使用包含电离促进物质的水溶液的步骤。以上信息获取方法的特征也在于促进目标对象电离的物质是含水物质，该物质包含金属元素和碱金属的至少一种。 

本发明进一步提供信息获取装置，该装置是使用飞行时间次级离子质谱获得测量用目标对象信息的装置，含有离子束辐射设施、离子束极化(polarization)设施和检测来自测量用目标对象的次级离子的检测设施，其特征在于它包括施加小滴的设施。 

本发明进一步提供以上的信息获取装置，其特征在于施加小滴的设施是使用喷墨方法的设施。 

根据本发明的进一步方面，提供一种使用飞行时间质谱仪获取目标对象的成分质量的信息以根据获取的信息获得成分分布信息的信息获取方法，其特征在于该方法包括如下步骤： 

制备包括来自活体组织的成分作为目标对象的样品； 

进行促进衍生自该成分的离子种的电离的处理； 

采用聚焦的离子束辐射目标对象以引起衍生自该成分的离子种发射；和 

使用飞行时间质谱仪测量脱逸的离子种的强度以根据测量的数值获得成分分布的信息。 

用于促进电离的处理优选是向该成分施加促进衍生自该成分的离 子种电离的物质。 

用于促进电离的处理优选是利用消化酶的该成分的降解。 

根据本发明的更进一步方面，提供一种使用飞行时间质谱仪获取目标对象的成分质量的信息以根据获取的质量信息获得成分分布信息的信息获取方法，其特征在于方法包括如下步骤： 

制备包括来自活体的组织成分的样品； 

以基板表面与样品接触以转移至少一部分该成分到基板； 

将聚焦的离子束辐射到基板上以引起衍生自该成分的离子种发射，其中至少一部分该成分被转移到该基板上作为目标对象；和 

使用飞行时间质谱仪测量脱逸的离子种的强度以根据测量的数值获得成分分布的信息。 

优选与样品接触的基板表面包括促进衍生自该成分的离子种电离的物质。或者，优选与样品接触的基板表面被化学处理以促进成分到基板的转移。化学处理优选是将马来酰亚胺基团引入到基板表面上。 

根据本发明的再进一步方面，提供一种使用飞行时间次级离子质谱获取目标对象信息的信息获取装置，其特征在于装置包括接触目标对象与促进目标对象电离的物质的设施和采用离子束辐射在目标对象和促进目标对象电离的物质之间的接触区域的设施，其中由从辐射设施的辐射获取电离该对象至少一部分的目标对象质量的信息。 

根据本发明的另进一步方面，提供一种疾病诊断方法，其特征在于疾病的诊断通过采用本发明的信息获取方法进行。蛋白质优选包括在来自活体的组织的成分中，和通过采用脱逸的离子种的分布状态进行诊断，该离子种衍生自包括在蛋白质中质量为500-5000的肽。 

本发明进一步提供疾病诊断方法，其特征在于疾病的诊断通过采用本发明的信息获取方法进行。 

一种使用飞行时间质谱仪获取由目标对象构成的成分质量的信息以根据获取的质量信息获得成分分布信息的信息获取装置，其特征在于它包括： 

用于使成分与基板表面接触以转移至少一部分该成分到基板侧的 设施； 

采用向其转移了至少一部分该成分作为目标对象的基板，以聚焦的离子束辐射目标对象以引起衍生自该成分的离子种发射，测量脱逸的离子种的强度的飞行时间质谱仪；和 

根据测量的数值获得成分分布状态的测量结果分析设施。 

在此必须的情况下，促进离子种电离的物质可以称为“敏化剂”.同样在此必须的情况下，接触包含来自活体的组织成分的样品与基板表面以转移至少一部分成分到基板表面的行为可以称为“转移”。此外，术语“分析”在此可用于代替术语“信息获取”。 

根据本发明，可以提供对于每种目标对象获得高空间分辨率的二维分布图像的方法，以及可以有利地对其应用的信息获取装置。根据本发明的信息获取方法，可以有效进行衍生自来自活体的组织成分的次级离子的生成，可以在高灵敏度下容易地确定来自活体的组织成分的分布状态。此外，可以采用优异的定量性能确定来自活体的组织成分的分布状态。 

附图简述 

图1A和1B显示根据实施例4的正次级离子质谱区段的放大视图，其中图1A显示测量的谱图，图1B显示根据同位素比例计算的理论谱图； 

图2A，2B和2C显示根据实施例9的正次级离子质谱区段的放大视图，其中图2A显示测量的谱图，图2B显示根据同位素比例计算的理论谱图；图2C是通过使用在获得的次级离子质谱中对应的次级离子峰成像产生的图像； 

图3显示根据实施例11的测量的正次级离子质谱区段的放大视图； 

图4A，4B和4C显示根据实施例13的正次级离子质谱区段的放大视图，其中图4A显示测量的谱图，图4B显示根据同位素比例计算的理论谱图；图4C是通过使用在获得的次级离子质谱中对应的次级离子峰成像产生的图像； 

图5显示根据对比例1的测量的正次级离子质谱区段的放大视图； 

图6是显示根据实施例14的肽的概要布置的视图； 

图7A，7B和7C显示根据实施例14的正次级离子质谱区段的放大视图，其中图7A显示肽1)的质谱，图7B显示肽2)的质谱，图7C显示肽3)的质谱； 

图8显示使用图7A-7C中所示的质谱生成的次级离子图像； 

图9是根据实施例20的信息获取装置的简图； 

图10显示根据实施例20的次级离子图像； 

图11A、11B、11C和11D是简要显示根据本发明第三方面的信息获取方法的视图。图11B、11C和11D概念性地显示作为例子的对于来自活体的组织样品的分裂切片(图11A)，通过施加包含敏化剂的溶液到切片表面上产生的，敏化剂对切片表面上存在的蛋白质组分的作用和粘结，以及由切片表面上存在的经过敏化剂的作用和粘结的处理蛋白质组分的TOF-SIMS成像产生的图像；和 

图12A、12B、12C、12D和12E是简要显示根据本发明第四方面的信息获取方法的视图。图12B、12C和12D概念地显示作为例子的在来自活体的组织样品切片表面上存在的蛋白质组分(图12A)向转移板的转移，和由转移到转移板的蛋白质组分的TOF-SIMS成像产生的图像。 

进行本发明的最好方式 

在此必须的情况下，促进离子种电离的物质可以称为“敏化剂”。同样在此必须的情况下，接触包含来自活体的组织成分的样品与基板表面以转移至少一部分该成分到基板表面的行为可以称为“转移”。此外，术语“分析”在此可用于代替术语“信息获取”。 

I.涉及本发明第一方面的发明描述 

本发明的第一方面的特征在于使用促进目标对象电离的物质引起目标对象发射，以获得可以区分脱逸的目标对象的次级离子的质量信息。第一方面在此的特征也在于检测目标对象的二维分布状态(进行成像)，它可以通过初级离子的扫描获得。 

根据本发明的促进目标对象电离的物质可以由任何如下方法对其 施加： 

(1)在基板上布置目标对象之后施加该物质， 

(2)对于在基板上布置的特定的一种或多种目标对象，预先施加该物质，和 

(3)在基板上布置目标对象之前施加该物质到基板表面。 

作为施加物质的方法的例子，可以提及化学改性。 

在以上(1)-(3)中列出的技术中，以上(1)的技术可以应用于每种形式的目标对象的分析，因此是非常灵活的通用目的技术。当对在基板上二维分布的目标对象施加促进电离的物质时，要求小心以保证其中涉及的工艺不引起目标对象的扩散。目标对象的二维分布状态因处理如化学改性改变的原因在于不能完成本发明的目的。目标对象的二维分布是否改变，例如可以由与未进行化学改性的蛋白质芯片的TOF-SIMS分析结果的比较确定。 

以上(2)的技术是这样一种技术，其中将促进目标对象电离和增加TOF-SIMS分析中灵敏度的物质(敏化剂)在先结合到特定目标对象的特定部位。此技术是有利的在于可以选择性地和在高灵敏度下检测特定目标对象的二维分布状态。采用此技术的缺点在于，由于必须预先对于每种目标对象进行化学改性，在一定程度上操作复杂。结合以上敏化剂的方法不特别限定，可以应用的方法的例子包括共价结合和离子结合，以及当使用金属配合物作为敏化剂时的配位结合。不过，由于经受化学改性处理的目标对象如蛋白质要在基板上布置，结合必须是稳定的。 

以上(3)的技术是这样一种技术，其中将促进目标对象电离和增加TOF-SIMS分析中灵敏度的物质(敏化剂)预先在基板表面上形成。在此技术中，重要的是适当考察是否敏化剂的存在会产生关于非特异吸附的新问题。敏化剂只要是能引起TOF-SIMS分析中灵敏度增加的，就不特别限定，它可以是不与目标对象直接结合的物质(即，只要在TOF-SIMS分析中产生次级离子的过程中具有提高目标对象电离效率的效果，可以使用任何物质)。尽管优选敏化剂在基板的最上表面上形 成，也可以以单分子膜的程度在敏化剂顶部上提供另一种物质以防止非特异吸附。 

尽管根据本发明的化学改性，只要如上所述在TOF-SIMS分析中产生次级离子的过程中具有提高目标对象电离效率的效果和涉及不改变蛋白质二维分布状态的工艺，就不特别限定，优选使用包含金属的物质作为化学改性剂。关于金属的种类，由本发明人进行的研究显示优选是银和金，特别优选是包括其两者的物质，尽管这些以外的金属只要显示以上的效果，也可以使用。 

作为化学改性技术的一个例子，可以提及如下方法，其中对于在基板上布置的多个蛋白质，银镜反应用于向蛋白质施加银或银离子。术语“银镜反应”表示如下反应，其中将含氨硝酸银溶加入到样品，然后还原二氨合银(I)离子以引起银沉积。由于银具有对于离子的高亲和力，此反应对于含有半胱氨酸(Cys)的蛋白质是特别有效的。当对于在基板上二维分布的蛋白质采用此反应时，要求小心以保证其中涉及的工艺不引起目标对象扩散。市售试剂(例如，Silver Staining IIKit Wako，由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)可以用作此反应中的试剂。 

化学改性方法不限于上述的方法，只要能显示提高TOF-SIMS分析中目标对象的次级离子产生效率的效果和涉及不改变目标对象二维分布状态的工艺，可以使用任何方法。 

根据本发明的目标对象的二维分布状态的检测(成像)的特征在于使用可区分目标对象的次级离子，优选次级离子是其质荷比为500或更大的离子，特别优选是质荷比为1000或更大的离子。 

作为在此使用的初级离子种，从电离效率、质量分辨率等的观点来看，可以有利地使用镓离子、铯离子、或在某些情况下，金(Au)离子等。金离子的使用是优选的在于能够实现特别高灵敏度的分析。这时，不仅仅Au离子，而且多原子金离子Au₂离子和Au₃离子也可以使用，由于存在许多其中需要采用该方式增加灵敏度的情况，多原子金离子的采用是进一步优选的形式。铋离子和C₆₀离子可以用作金以外的 其它多原子离子。 

初级离子的脉冲频率优选为1kHz-50kHz。优选，初级离子束能量为12keV-25keV，初级离子束的脉冲宽度为0.5ns-10ns。 

在本发明中，为提高定量测定的精度必须保持高质量分辨率和在比较短的时间内完成测量(一次测量需要大约几十秒到几十分钟)。因此优选在一些程度下牺牲初级离子束的直径进行测量。具体地，初级离子束的直径不聚焦到亚微米级，优选设定为1μm-10μm。 

此外，本发明也可应用于绝缘基板上的蛋白质芯片。 

II.涉及本发明第二方面的本发明描述 

本发明的第二方面的特征在于使用促进目标对象电离的物质以引起目标对象发射，以获得可以区分脱逸的目标对象的次级离子质量信息。第二方面的特征也在于它能够实现目标对象二维分布状态的检测(成像)，它可以由初级离子的扫描获得。用于电离目标对象以引起目标对象发射的初级束，只要可以聚焦、脉冲化和扫描，则不特别限制。可用于初级束的物质的例子包括离子、中性粒子、电子和激光束。其中优选使用离子束。 

根据本发明的促进目标对象电离的物质与以上I中描述的相同。施加物质的方法也可以采用与上述相同的方式进行。除非另外说明，其它条件等也可以与以上I中描述的相同。 

当对于在基板上二维分布的蛋白质采用上述化学改性而不改变二维分布的状态时，要求小心以保证操作不引起蛋白质的扩散。通过温和地滴加包含化学改性剂的水溶液到布置有蛋白质的基板上的部位，化学改性可以容易地以单步骤工艺进行而不改变蛋白质的二维分布状态。化学改性的方法不限于上述的方法，只要具有提高TOF-SIMS分析中目标对象的次级离子产生效率的效果和涉及不改变目标对象二维分布状态的工艺，可以使用任何方法。 

在本发明中，尽管在其上金基板或金膜粘合到基板表面的基板优选作为在其上将蛋白质布置为分析目标的基板，只要不包括阻碍蛋白质质量信息的获得的发射的质量的次级离子的物质，基板并不特别进 行限定，导电基板如硅基板或绝缘基板如有机聚合物或玻璃也可应用于蛋白质芯片。此外，在其上将蛋白质布置为分析目标的介质的形式并不限于基板，可以使用任何形式的固体物质，如粉末或颗粒。 

本发明的第二方面包括，例如使用喷墨方法进行施加目标对象或促进电离的物质，或两者的步骤。 

在根据本发明使用喷墨方法的方法中，可以通过施加几到几十pl每滴的痕量小滴到所需位置，施加物质而不改变目标对象的二维分布状态。当通过施加大量的痕量小滴，在宽区域内对基板进行处理时，多个目标对象可以在基板上不混合在一起而进行分析。 

通过也使用喷墨方法形成根据本发明的目标对象，多个蛋白质可以在高密度下在一个基板上布置，因此能够实现更大效率的分析。特别地，在上述的分析方法中，由于它提供高空间分辨率，使用初级束中离子的TOF-SIMS分析是有利的。 

当对于预先在基板上二维分布的目标对象施加促进电离的物质时，在使用光学显微镜、CCD等确认位置之后，可以通过施加促进电离的物质到所需位置使用喷墨方法进行所需区域中存在的蛋白质的分析。此外，在由喷墨方法施加目标对象到基板上之后，可以将电离促进剂施加到目标对象的顶上。 

本发明的电离促进物质，和/或用于本发明分析的目标对象可以在水或合适的有机溶剂中溶解、然后将获得的混合物加入包含表面活性剂的水溶液之后，由喷墨方法施加到目标对象。尽管在此使用的有机溶剂不特别限定，高度挥发性或不稳定的溶剂是不可取的，从在排出时的稳定性的观点来看，优选溶剂是粘度为之调整者。在除电离促进物质和分析用目标对象以外的所谓“油墨组分”中，不包含在固相中沉积的物质的组分是合适的。 

尽管电离促进物质只要是具有电离促进效果的含水物质则不特别限定，但优选是包含金属的物质。特别地，由于银离子容易与氨基酸或肽形成配合物，包含银的物质是有利的。此外，作为以上化学改性剂，可以使用含有钠代替银的物质。 

根据本发明的信息获取装置是使用飞行时间次级离子质谱获得测量用目标对象的信息的装置，该装置具有离子束辐射设施、离子束极化设施、和检测来自测量用目标对象的次级离子的检测设施，其特征在于它包括施加小滴的设施。信息获取装置进一步的特征在于施加小滴的设施是使用喷墨方法的设施。 

在根据本发明的信息获取装置中，电离促进物质和测量条件等与以上对于信息获取方法所述的相同。 

根据本发明的信息获取装置包括具有飞行时间次级离子质谱仪的测量腔，进行常规初步抽真空的初步真空腔，和具有施加小滴的排出装置的预处理腔。 

预处理腔具有施加小滴的排出装置、确认样品位置的确认设施、样品夹具和样品台。样品台的位置以μm为单位被位置控制程序控制。位置控制程序与测量腔的样品台的位置控制程序相同。优选的，例如测量可以在测量腔中确定位置之后进行，由排出装置对该位置施加电离促进物质的小滴，相同的位置由自动样品台保持。确认设施例如可以是光学显微镜、实体显微镜、或CCD照相机，不作特别限定。 

预处理腔也可具有抽真空装置。在此情况下，优选在预处理腔和放电装置之间提供阀门等以在抽真空时防护电离促进物质排出装置。 

排出装置具有用于喷墨方法的打印头，在样品上的任何位置上排出几到几十pls的小滴。通过向其中引入用于以上信息获取方法的电离促进物质溶液或蛋白质溶液并进行排出，可以在所需的位置布置蛋白质或施加电离促进物质到所需的蛋白质。此外，通过将染色溶液或颜料溶液引入喷墨打印头的一部分，可以显示像水一样清澈的蛋白质溶液的X、Y坐标或进行编号，因此提供能够确认所需位置的优点。 

III.涉及本发明第三方面的本发明描述 

根据本发明第三方面的信息获取方法是获得来自活体的组织成分分布状态的信息的方法，该成分典型地为蛋白质。根据本发明，对于来自活体的组织切片，使用包括切片的样品，该切片被切下使得其切割区域是平的，诸如存在于其表面上的大量蛋白质分子的分布由 TOF-SIMS方法测定。 

在来自活体的组织中，作为测量目标的蛋白质分子肽链缠结在一起，和因此在使用TOF-SIMS方法的测量时引起次级离子种产生效率的下降。因此，在本发明的第三方面中，可以允许包含敏化剂的溶液在包括来自活体的组织切片的样品表面上起作用，以由此提高衍生自表面上存在的蛋白质分子的次级离子种的产生效率。敏化剂是显示如下功能的物质：在初级离子的辐射时促进和增加衍生自蛋白质分子的次级离子种的产生。为允许敏化剂对在包括来自活体的组织切片的样品表面上存在的蛋白质分子直接起作用，将包含敏化剂的溶液施加到切片样品表面，并保持在覆盖整个表面的状态下。例如，当稀的硝酸银水溶液用作包含敏化剂的溶液时，在水溶液中离解的银离子对构成蛋白质分子的肽链作用，因此在银离子和蛋白质分子之间产生结合以促进次级离子种的产生。采用此方式，根据本发明的第一方面，敏化剂自身或敏化剂的成分元素对构成蛋白质分子的肽链作用以产生与肽链的结合，该作用当蛋白质分子的缠结肽链解开的状态下达到顶点。作为可用于本发明第三方面的敏化剂的例子，除上述硝酸银以外，可以提及盐如碳酸钠、包含金属如金或银等的物质(如金属配合物)或金属胶体等。优选的，包含敏化剂的溶液的形式为水溶液。 

例如，当对上述在切片样品表面上存在的已经结合了银离子的蛋白质分子辐射初级离子束时，与银离子结合的蛋白质分子部分降解。这导致衍生自伴随着蛋白质分子的降解的部分降解肽链片段的次级离子种的产生。因此，部分降解的肽链片段比初始蛋白质分子自身更易于受离子溅射影响，与此同时，碎片离子的产生效率也极大地增加了。根据本发明的第三方面，通过利用这两种作用，当辐射初级离子时显示如下效果：促进和增加衍生自表面上存在的蛋白质分子的次级离子种的产生。 

在施加包含敏化剂的溶液到切片样品表面上、使之保持覆盖整个表面的状态并允许其对存在于表面上的蛋白质分子作用之后，包含敏化剂的溶液通过洗涤除去。其后，由于由TOF-SIMS方法的测量在高真 空中进行，预先除去包括来自活体的组织切片的样品中包含的水分。优选的，真空干燥方法用于此干燥处理。由于真空干燥方法不采用热量用于水分的蒸发，可以进行干燥而不引起在蛋白质分子之间的相互聚集。在此系列处理和随后的TOF-SIMS分析时，优选使包括来自活体的组织切片的样品在贴附到具有平表面的基板、如包括硅、铝、金或银或载玻片等的片状基板的表面的状态下处理。因此，贴附到具有平表面的基板表面的包括来自活体的组织切片的样品可以保持即使在干燥之后也紧凑地贴合到基板表面的状态。在干燥处理完成之后获得的切片样品的表面形态反映平基板表面的形态，展示均匀的表面。 

根据本发明第三方面的信息获取方法，如上所述是一种使用飞行时间质谱仪获取目标对象的成分质量的信息以根据获取的信息获得成分分布信息的信息获取方法，其特征在于该方法包括如下步骤： 

制备包括来自作为目标对象的活体组织的成分的样品； 

进行促进衍生自该成分的离子种的电离的处理； 

采用聚焦的离子束辐射目标对象以引起衍生自该成分的离子种发射；和 

使用飞行时间质谱仪测量脱逸的离子种的强度以根据测量的数值获得成分分布的信息。 

在此，来自活体的组织成分包括特定蛋白质。在此情况下，衍生自特定蛋白质的次级离子种是源自构成特定蛋白质的肽链的部分片段的碎片离子或源自含有以上敏化剂或连接到其的敏化剂组分的肽链的部分片段的碎片离子。 

对于衍生自特定蛋白质的次级离子种的离子强度分布，可以关于衍生自讨论的特定蛋白质的碎片离子的离子强度，选择涉及分析在来自活体的组织样品一个切片表面上二维分布的形式。 

优选的，在将切片冷却到0℃或更低温度的状态下进行来自活体的组织样品一个切片的分析。 

此外，用于采用敏化剂的处理步骤的包含敏化剂的溶液优选为水溶液的形式。 

以下，进一步详细描述根据本发明第三方面的优选实施方案。 

根据本发明的第三方面，包括来自提供用于分析的活体的组织切片的样品优选是厚度为大约几百nm到几百μm的切片。只要可以获得平的切割表面，可以采用各种切割工艺用作从活体组织生产切片的方法。更优选的，为制备具有上述切片厚度的切片，使用为生产切片目的建造的装置，如切片机。通常，将取作为样品的来自活体的组织在冷却状态下贮存以抑制其中内部生物化学反应的进展。在切割切片样品的步骤中，为防止其上存在的蛋白质分子的性能变化，切割操作也优选在0℃或更低的温度下进行。通常，用于为生产切片目的建造的装置、如切片机的切割对象是使用冷冻介质如液氮使之处于冷冻贮存的状态下的来自活体的组织。 

用于本发明第三方面的敏化剂只要它是具有如下性质的物质则不特别限定：通过允许它预先对蛋白质分子作用，当在TOF-SIMS测量步骤中辐射初级离子时，该物质发挥提高衍生自蛋白质分子的次级离子产生效率的效果。例如，可以有利地使用包含金属如金或银或其金属离子的物质，即金属配合物、金属盐化合物、或金属胶体等。包含这些金属的物质可以与蛋白质分子结合。例如，金属离子与构成蛋白质分子的肽链形成离子键，金属配合物与肽链配合并被固定，或金属胶体粒子粘合到肽链。在此状态下，当将蛋白质分子被初级离子辐射时，敏化剂具有提高衍生自蛋白质分子的次级离子种例如碎片离子种的产生效率的效果。 

只要可以在良好的再现性下在每单位面积上施加所需体积的溶液，可以采用各种施加措施将包含此敏化剂的溶液施加到包括来自活体的组织切片的样品表面。例如，可以提及的方法有使用喷墨方法等以小滴的形式将溶液施加到包括来自活体的组织切片的样品表面。通常，在来自活体的组织中，感兴趣的蛋白质分子所存在的部位及其丰度是不确定的，和因此在包括组织切片的整个样品表面上均匀地施加溶液。其后，允许样品静置预定的时间以允许施加溶液层中所含的敏化剂对表面上存在的蛋白质分子起作用。由此，就将敏化剂施加到感 兴趣的蛋白质分子上。根据使用的敏化剂种类，包括蛋白质分子的肽链解开和可在TOF-SIMS分析时引起大量碎片离子的容易生成。可用于喷墨方法的包含敏化剂的溶液的例子包括含有均匀溶解了金属配合物或金属盐化合物的水溶液，或硝酸银水溶液。在施加包含敏化剂的溶液的处理完成之后，通过洗涤除去切片样品表面上保留的包含敏化剂的任何溶液。其后，优选将整个切片样品进行冷冻干燥处理。 

此后，讨论要施加到包括来自活体的组织切片的样品表面的包含敏化剂的溶液数量。以使用银离子作为敏化剂为例，对于预测为在切片样品表面的第一层上存在的肽链，优选应用选自相等数量到100倍的摩尔比的银离子，特别优选应用两倍到十倍的摩尔比的银离子(即比例依赖于肽链的长度及其丰度)。通常，以银离子为例，施加到切片样品表面的敏化剂总体积是大约10¹¹-10¹³个离子/cm²(即单分子膜或以下的水平)。含敏化剂的溶液中包含的敏化剂的浓度优选选自1μmol/mL到10μmol/mL的范围。 

例如，将要用于敏化剂的硝酸银在水溶液中离解以提供单价银离子。当允许单价银离子对蛋白质分子作用时，可以与在包括其肽链的氨基酸残基的侧链上存在的羧基形成盐键。由于高浓度硝酸银水溶液显示引起蛋白质分子聚集的作用，当使用硝酸银水溶液作为本发明第一方面中的敏化剂时，使用稀的硝酸银水溶液。更具体地，有利地使用硝酸银浓度选自1mmol/L-10mmol/L的稀硝酸银水溶液。在允许稀硝酸银水溶液对包括来自活体的组织切片的样品作用时，如果当进行干燥处理时硝酸银水溶液保留在其表面上，溶液浓缩而形成高浓度硝酸银水溶液。因此优选在干燥处理之前由洗涤除去该溶液。 

如前所述，TOF-SIMS中次级离子种的产生效率强烈地由其中使用的样品表面形态影响。然而，通过使包括来自活体的组织切片的样品帖附到板状基板的表面，切片样品的表面即使在干燥处理之后也保持平面。因此，可以基本消除源自样品表面形态的影响，后者是损害TOF-SIMS分析中定量性能的一个因素。 

在干燥处理之后在其中样品连接到板状基板表面的状态下，使用 TOF-SIMS分析在切片样品表面上存在的蛋白质成分以进行成像分析。 

对于TOF-SIMS分析的条件，为进行二维成像，相应于来自要用作分析对象的样品的活体的组织切片尺寸，初级离子束直径优选选自0.1μm-10μm。对于初级离子种，通常使用金属阳离子，从电离效率，质量分辨率等的观点来看，可以有利地使用镓离子、铯离子或视情况使用金(Au)离子等。金离子等的使用是有利的在于能够实现特别高灵敏度的分析。在此情况下，不仅使用Au离子，而且可以使用多原子金离子Au₂离子和Au₃离子。由于存在许多其中需要以Au离子＜Au₂离子＜Au₃离子的顺序增加灵敏度的情况，多原子金离子的采用在这时是进一步优选的形式。可以使用其它多原子离子如Bi离子或C₆₀等，采用它们可以获得同等或更高的灵敏度。 

由于进行表面分析，初级离子束能量优选自12keV-25keV的范围。为避免在分析用样品表面上正电荷的累积(充电)，在初级离子束的脉冲之间进行低能电子(大约数十eV)的脉冲辐射以破碎正电荷。此时初级离子束的脉冲宽度优选为0.5ns-10ns。脉冲频率优选为1kHz-50kHz。其它条件，如分析区域、扫描初级离子的方法和初级离子剂量可以适当地根据目的设定。 

蛋白质是由肽链组成的聚合物，大多数情况下，优选测量源自肽链部分片段的碎片离子。优选的，要测量的碎片离子至少是质量(m/z)为500或更大的离子种(包括那些连接了敏化剂等的)，它反映包括数目为大约5或更多的氨基酸残基的部分片段的质量信息。特别优选是质量(m/z)为1000或更大的离子种(包括那些连接了敏化剂等的)，它反映包括数目为大约10或更多的氨基酸残基的部分片段的质量信息。尽管当采用标准TOF-SIMS分析条件时可以同时获得质量(m/z)为大约0-10000的次级离子种，如上所述，优选选择可区分靶蛋白质分子的质量(m/z)为大约500-5000的特征碎片离子作为分析对象。 

在鉴定可区分靶蛋白质分子的碎片离子之后，将在XY平面上采用对应于来自三维数据的相关碎片离子的质谱中峰(强度)成像产生的图像显示为上述蛋白质的二维分布图像，由TOF-SIMS测量获得该三维数 据(对于XY平面上的X×Y点，各自的质谱存在；这得到经受整体测量的四维数据)。当多个蛋白质分子作为检测目标存在时，可以重复此过程。通过采用此方式进行分析，如图1A和1B所示，可以对于每个蛋白质分子对于其丰度在作为分析对象的包括来自活体的组织切片的样品上的分布进行分析。此外，在单独的过程中，由对比使用显微镜观察，对应于测量的样品的样品切片表面的图像与其中二维显示次级离子种峰强度的图像，可以确定在来自活体的组织切片上靶蛋白质分子的定位部位。 

通常，为保证TOF-SIMS测量中的定量性能，初级离子剂量数量是1×10¹²个离子/cm²，它对应于溅射大约1％表面的数量。当在此条件下测量时，当作为靶的碎片离子质量(m/z)是500时，基于要讨论的碎片离子重量，对于样品切片表面上蛋白质的检测下限大约是10pg/cm²。如果牺牲定量性能，理论上可以期望高两个数量级的灵敏度增强。 

应用根据本发明第三方面的分析来自活体的组织的方法能够实现在来自活体的细胞或组织切片上感兴趣的蛋白质的直接成像检测，因此使医学诊断的新方法成为可能。此时，可以期望提供大约0.1μm到几μm的空间分辨率的成像。 

IV.根据本发明第四方面的发明描述 

根据本发明第四方面的信息获取方法是获得来自活体的组织成分分布状态信息的方法，该成分典型地为蛋白质。本发明的特征在于，对于来自活体的组织切片，一旦切片的表面与具有平表面的基板顶部接触，例如在切片表面上存在的包含蛋白质分子的液体层转移到基板表面。其后，将转移到基板表面的包含蛋白质分子的液体层进行干燥处理以将蛋白质组分粘合到作为干燥物质的表面，然后可使用TOF-SIMS进行分析。因此，当由TOF-SIMS进行分析时，可以具有作为基础的平的基板表面，因此可以基本消除由测量目标表面形状导致的分析精度的波动。 

此外，作为进行转移的转移剂，可以使用具有清洁金属表面或金属氧化物表面的介体(agent)，或具有经受化学处理的平基板表面的 介体。在来自活体的组织中，存在蛋白质分子处于肽链缠结的状态的情况，在使蛋白质分子与转移介体表面接触和向其转移蛋白质分子时，肽链解开并以作为包含蛋白质组分的液体层而转移。可以用作转移介体表面的金属表面的例子包括银-金属、金-金属等。可以用作转移剂表面的金属-氧化物表面的例子包括二氧化钛(TiO₂)表面、二氧化硅(SiO₂)表面等。经受化学处理的平基板表面的例子包括含有向其由化学处理引入官能团如马来酰亚胺基团的表面的基板。 

根据本发明第四方面的信息获取方法，如上所述，是一种使用飞行时间质谱仪获取目标对象的成分质量的信息以根据获取的质量信息获得成分分布信息的信息获取方法，其特征在于该方法包括如下步骤： 

制备包括来自活体的组织成分的样品； 

使样品与基板表面接触以转移至少一部分成分到基板； 

辐射聚焦的离子束到基板上，将至少一部分成分转移到该基板上作为目标对象以引起衍生自成分的离子种发射；和 

使用飞行时间质谱仪测量脱逸的离子种的强度以根据测量的数值获得成分分布的信息。 

在此，来自活体的组织成分包括特定蛋白质。在此情况下，衍生自特定蛋白质的次级离子种是源自构成特定蛋白质的肽链的部分片段的碎片离子。 

作为衍生自特定蛋白质的次级离子种的离子强度分布，可以选择对于衍生自特定蛋白质的碎片离子的离子强度分析在表面上的二维分布的形式。优选的，用于以上转移步骤的金属表面、金属氧化物表面、或基板表面包括对要转移的特定蛋白质起作用的物质以提高衍生自特定蛋白质的次级离子种的产生效率。 

用于转移步骤的经受化学处理的平基板表面优选是经受化学处理的表面，该表面在与特定蛋白质的反应时显示提高转移到特定蛋白质表面的效率的作用。 

也可以采用在转移步骤之前，在进行以提高对于包括来自活体的组织的获得样品的一个表面上存在的特定蛋白质的转移效率的处理之 后，进行使得包括来自活体的组织的获得样品的一个表面与进行转移的表面紧密接触的操作的形式。 

例如，用于转移步骤的经受化学处理的平基板表面可以是将马来酰亚胺基团在其表面上作为显示对于特定蛋白质的反应性的官能团引入的表面。 

优选的，在将转移到以上金属表面、金属氧化物表面、或基板表面的特定蛋白质冷却到0℃或更低温度的状态下进行分析。 

以下，进一步详细描述根据本发明第四方面的优选实施方案。 

根据本发明的第四方面，银-金属表面或二氧化钛表面可以在转移板的表面上使用。当在含水溶剂存在下将这些物质与蛋白质分子接触时，它们显示诱导对于其肽链的反应的效果。超薄氧化物层通常在银-金属表面上存在，由于从氧化物层提供的银离子或氧化银作用于细菌，引起包括真菌体的生物材料的功能抑制或分解。氧化银(I)起氧化剂的作用，可引起氧化分解反应。 

二氧化钛，和特别地，金红石形式的二氧化钛晶体，是在紫外范围中具有吸收的半导体，通过因紫外线的辐射的光载体的产生，它显示各种类型的催化活性。例如，当在含水溶剂存在下采用紫外线辐射二氧化钛表面时，它显示作为光催化剂的功能，促进粘合到要讨论的表面的有机物质的氧化降解。 

当将在湿条件下的来自活体的组织切片与具有此类活性的金属表面或显示催化活性的金属氧化物表面接触时，对于在切片表面上存在的蛋白质分子被诱导分解反应。结果是，在切片表面上存在的蛋白质分子的肽链部分分解，也失去与其它生物分子的相互作用。在此状态下，它们与包含在来自活体的组织中的流体组分一起转移到对其接触的转移板表面。 

然而，如果用于进行转移的金属表面或金属氧化物表面自身由其它蛋白质分子污染，分析中会产生问题。因此，在转移工艺之前，优选进行为进行转移的金属表面或金属氧化物表面的清洁。 

由银、金、硅等组成的表面可以用作进行转移的金属表面。为进 行表面的清洁，由离子束溅射蚀刻等通过除去最外表面上存在的分子和原子而预先曝露清洁金属表面的技术是有效的。通常用于TOF-SIMS分析的离子枪可用于溅射蚀刻处理。优选的，为避免再污染，在清洁处理之后，向由蚀刻处理清洁的金属表面的转移步骤应尽可能快地进行。在由于操作过程不可避免的情况下，如果在提供防止表面再污染的措施之后将表面曝露于气氛几分钟到几十分钟不产生问题。 

由二氧化硅、二氧化钛等组成的表面可以用作进行转移的金属氧化物表面。以上的离子束溅射蚀刻技术也可有效用于清洁金属氧化物表面。此外，对于具有充分耐化学品性能的金属氧化物表面，可以使用湿式工艺的清洁方法。优选的，为避免再污染，在清洁之后，对于清洁的金属氧化物表面的转移步骤同样尽可能快地进行。 

作为用于转移经受化学处理的平基板表面的例子，可以提及在USP6,476,215中公开的表面，其中将马来酰亚胺基团引入到玻璃基板的表面上。引入了马来酰亚胺基团的此基板表面部分对于转移含有SH基团的肽和蛋白质特别有效。更具体地，要转移的肽或蛋白质中存在的SH基团与引入到基板表面上的马来酰亚胺基团反应以将肽链结合到基板表面。含有厚度为大约几十nm的氧化区的硅基板也可用作含有平表面的基板代替玻璃基板。 

在转移到转移板的表面时，优选在单分子层的水平下转移要转移到表面的蛋白质分子。因此，优选在转移时在适当的范围中调节接触在湿状态的来自活体的组织切片到转移板的压力，通常，可以将来自活体的组织切片放置在转移板表面上(或与其接触)并静置几秒。这样，将包含蛋白质分子的液体层转移到转移板表面，优选转移体积是在单分子层水平或以下。当使用双波长形式的椭圆光度法时，可以从约1nm的膜厚度进行测量。然而，有可能考虑到在此椭圆光度法中的转移体积太大而无法对含有蛋白质分子的液体层进行观察。因此，优选根据用作目标的来自活体的组织切片合适地调节用于以上转移的条件。通过保持蛋白质分子的转移体积在单分子层水平或以下，基板的曝露表面可以与转移的体积共同存在，在该条件下的样品可容易地在 TOF-SIMS分析中产生大量碎片离子(当初级离子不与蛋白质分子自身碰撞，反而在离蛋白质在曝露的基板表面上存在的部位约0.2-0.5nm的部位碰撞时产生最软的离子；即产生保持蛋白质部分结构的碎片离子)。 

此外，转移到转移板表面的大量蛋白质分子的分布状态反映在来自活体的对应组织切片上大量蛋白质分子的分布状态。 

根据本发明的第四方面，使用TOF-SIMS测定转移到转移板表面的大量蛋白质分子的分布状态。由于由TOF-SIMS的测定在高真空中进行，预先除去包含在转移到转移板的表面的包含蛋白质的液体层中的水分。优选真空干燥方法用于此干燥处理，不过它也可以在用于给TOF-SIMS分析提供的上述初步排空腔中进行。由于真空干燥方法不利用热量蒸发水分，可以进行干燥而不引起在蛋白质分子之间的相互聚集。转移到转移板表面的大量蛋白质分子的分布状态可在干燥之前保持其分布状态。在干燥处理完成之后获得的样品处于其中干燥的蛋白质分子连接到平转移板的表面并在平转移板的表面上累积的状态。在转移工艺和随后的干燥处理之后，在提供用于TOF-SIMS分析的同时，经历干燥处理的样品优选在清洁箱或真空中贮存以防止污染物质粘到其表面上。 

在TOF-SIMS分析中，将在辐射点存在的干燥的蛋白质分子经历由初级离子束的辐射的离子溅射，产生衍生自蛋白质分子的次级离子种。尽管如上讨论的那样，TOF-SIMS中次级离子种的产生效率强烈地受样品表面的形态影响，通过预先转移样品到经历化学处理的上述平金属表面、金属氧化物表面或平基板表面，样品表面形成平面，因此可以基本消除源自损害TOF-SIMS分析中定量性能的一个因素——样品表面形态的影响。 

由TOF-SIMS分析转移到平转移板表面上的蛋白质成分以进行成像分析。 

对于TOF-SIMS分析的条件，为进行二维成像，相应于用作分析对象的样品的来自活体的组织切片尺寸，初级离子束直径优选在 0.1μm-10μm的范围内选择。对于初级离子种，通常使用金属阳离子，从电离效率，质量分辨率等的观点来看，可以有利地使用镓离子、铯离子或视情况金(Au)离子等。金离子的使用是有利的，在于能够实现特别高灵敏度的分析。在此情况下，不仅仅Au离子，而且多原子金离子Au₂离子和Au₃离子也可以使用。由于存在许多需要以Au离子＜Au₂ 离子＜Au₃离子的顺序增加灵敏度的情况，多原子金离子的采用在这时是进一步优选的形式。可以使用其它多原子离子如Bi离子或C₆₀等，采用它们可以获得同等或更高的灵敏度。 

由于进行表面分析，初级离子束能量优选选自12keV-25keV的范围。为避免在分析用样品表面上正电荷的累积(充电)，低能电子(大约几十eV)的脉冲辐射在初级离子束的脉冲之间进行以破碎正电荷。此时初级离子束的脉冲宽度优选为0.5ns-10ns。脉冲频率优选为1kHz-50kHz。其它条件，如分析区域，扫描初级离子的方法，和初级离子剂量可以适当地根据目的设定。 

蛋白质是由肽链组成的聚合物，大多数情况下，优选测量源自肽链部分片段的碎片离子。优选的，要测量的碎片离子至少是质量(m/z)为500或更大的离子种(包括那些连接了敏化剂等的)，它反映包括数目为大约5或更多的氨基酸残基的部分片段的质量信息。特别优选是质量(m/z)为1000或更大的离子种(包括那些连接了敏化剂等的)，它反映包括数目为大约10或更多的氨基酸残基的部分片段的质量信息。尽管当采用标准TOF-SIMS分析条件时可以同时获得质量(m/z)为大约0-10000的次级离子种，如上所述，优选选择可区分靶蛋白质分子的质量(m/z)为大约500-5000的特征碎片离子作为分析对象。 

在确定能够区分靶蛋白质分子的碎片离子之后，将在XY平面上采用对应于来自三维数据的相关碎片离子的质谱中峰(强度)成像产生的图像显示为上述蛋白质的二维分布图像，由TOF-SIMS测量获得该三维数据(对于XY平面上的X×Y点，各自的质谱存在；这得到经受整体测量的四维数据)。当多个蛋白质分子作为检测目标存在时，可以重复此过程。通过采用此方式进行分析，如图2A-2C所示，可以对于每个蛋 白质分子对于其丰度在作为分析对象的包括来自活体的组织切片的样品上的分布进行分析。此外，在单独的过程中，由对比使用显微镜观察，对应于测量的样品的样品切片表面的图像与其中二维显示次级离子种峰强度的图像，可以确定在来自活体的组织切片上靶蛋白质分子的定位部位(相应于来自活体的组织切面)。 

通常，为保证TOF-SIMS测量中的定量性能，初级离子剂量数量是1×10¹²个离子/cm²，它对应于溅射大约1％表面的数量。当在此条件下测量时，当作为靶的碎片离子质量(m/z)是500时，基于要讨论的碎片离子重量，对于样品切片表面上蛋白质的检测下限大约是100fg/cm² -1pg/cm²。更具体地，与利用TOF-SIMS对来自活体的组织片段的直接分析相比，可以期望高一到两个数量级的灵敏度。如果牺牲定量性能，理论上可以期望再提高到两个数量级的灵敏度增强。 

应用根据本发明第四方面的分析来自活体的组织的方法能够实现在来自活体的细胞或组织切片上感兴趣的蛋白质的直接成像检测，因此使医学诊断的新方法成为可能。此时，可以期望提供大约0.1μm到几μm的空间分辨率的成像。 

根据本发明第四方面的信息获取装置的进一步特征在于它包括：形成洁净金属表面或金属氧化物表面的清洁装置或在基板表面上进行化学处理的装置；接触来自活体的样品组织切片与上述洁净金属表面或金属氧化物表面或经历化学处理的基板表面以转移切片表面上存在的蛋白质组分的装置；由TOF-SIMS分析分析从来自活体的组织切片转移到转移板表面的蛋白质组分的装置；和根据分析结果分析在包括来自活体的组织切片的样品表面上存在的特定蛋白质分布状态的测量结果分析装置。 

在此，可以设计转移装置以具有安置功能，因此可以固定来自活体的取样组织切片和转移切片上存在的蛋白质组分到转移板表面上的特定位置。优选的，本装置包括可以调节转移时接触力的装置，以在单分子层水平下转移蛋白质组分到转移板表面。从防止蛋白质组分性能中变化的观点来看，优选设计处理来自活体的以上样品组织切片和 转移到转移板表面上的蛋白质组分的装置，使得所有的操作在0℃或更低的温度下使用冷冻混合物如液氮进行，排除其中由于操作的特性而使得冷却不可能的步骤。 

在以上内容中，根据第一到第四方面分部描述了本发明。只要常识允许，对于各自方面描述的内容可以合适地应用于其它方面，并不限于其中提供描述的各自方面。 

此外，本发明也包括在各自方面中描述的本发明组成要素替代在其它方面中描述的组成要素的形式。 

以下，参考实施例进一步详细解释本发明。以下描述的实施例是本发明的说明性优选实施方案，本发明不限于如下具体的实施例。 

实施例1 

用合成肽点样的芯片的生产 

将5nm的Ti膜形成在没有杂质的硅基板上，随后在其上形成100nm的Au膜。在下述的合成肽在其上点样之前将此连接了Au的硅基板进行如下处理。 

将100μl过氧化氢溶液(30％溶液)插入玻璃烧杯，在其中温和滴加300μl浓硫酸，和将获得的混合物搅拌同时轻微摇动。其后，将溶液加热到80℃，将与Au连接的以上硅基板在此溶液中洗涤5min。将基板随后取出，采用蒸馏水仔细洗涤，空气干燥。 

然后，制备购自SIGMA Genosys日本的合成肽I(SEQ ID NO：1，C₂₁H₃₄N₁₀O₁₁S(平均分子量：634.61；包括具有最高同位素比的元素的分子质量：634.21))的10μM水溶液。选择包含胱氨酸(Cys)的合成肽是由于氨基酸残基中包括的SH基团与金结合，因此希望肽固定在基板上。此外，由于银具有对于硫的高亲和力，判断含有硫将对下述银镜反应中采用银或银离子改性肽时是有利的。 

将带有Au的以上硅基板采用包含以上合成肽I的溶液由针眼法(pin method)点样。点样的间隔是1mm，在基板的中心部分中形成总计8×8个点。生产此类型的芯片。 

实施例2 

实施例1中生产的芯片的TOF-SIMS 

将在实施例1中生产的芯片空气干燥，使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa⁺，0.6pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：2.5kHz(400μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约5μm 

测量场：300μm×300μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分数：256 

在以上条件下测量正和负次级离子质谱时，在正次级离子质谱中，可以检测到对应于具有加上Au的合成肽I母分子质量的次级离子。使用符合合成肽I母离子的这些次级离子可以获得由二维成像产生的图像，该图像反映合成肽I的二维分布状态。 

实施例3 

实施例1中生产的芯片的银镜反应处理 

将在实施例1中生产的芯片空气干燥，在其中几乎所有水分已蒸发的状态下，芯片经受如下处理(银镜反应)。 

首先，在制备硝酸银溶液之后，将氨水加入其中以形成银氨配合物。形成银氨配合物以防止当该化学品溶液变成碱性时银变成氧化银并分离出，并且也稳定银的氧化-还原电势值。 

然后，将适当数量包含银氨配合物的水溶液滴到以上基板的表面上，静置10min。其后，以适当的数量将其中将氢氧化钠加入甲醛水溶液的弱碱性水溶液滴到以上基板的表面上。允许基板静置10分钟，然后用蒸馏水仔细洗涤并空气干燥。 

实施例4 

实施例3中处理的芯片的TOF-SIMS分析 

在与实施例2相同的条件下测量正和负次级离子质谱。结果是， 在正次级离子质谱中可以检测相应于含有加上Ag和进一步连接到其上的两个氧原子的合成肽I母分子质量的次级离子。在图1A中显示此谱图区域的放大视图，根据同位素比例计算的理论质谱在图1B中显示。在图1A和1B中，由箭头指示的峰对应于以上离子[(合成肽I)+(Ag)+2(O)]⁺，两个箭头分别对应于两种Ag同位素(质量数：107，109)。由右侧箭头指示的峰是包括¹⁰⁹Ag的峰，其m/z数值(775.1)大致与[(合成肽I)+(¹⁰⁹Ag)+2(O)]⁺的理论值匹配。使用符合合成肽I母离子的这些次级离子可以获得由二维成像产生的图像，该图像反映合成肽I的二维分布状态。 

实施例5 

含有在绝缘基板上点样的合成肽的芯片的制备 

首先，二氧化硅玻璃基板的表面处理根据在日本专利申请公开公报No.H11-187900中公开的方法进行。 

将尺寸为25.4mm×25.4mm×1mm的合成石英基板放入支架，在用纯水稀释到10％超声清洁用洗涤剂(Branson：GP III)中浸泡过夜。其后，在洗涤剂中进行超声清洁20min，然后通过水洗涤除去洗涤剂。在采用纯水清洁之后，在装有纯水的容器中进一步进行超声处理20min。然后，在预先加热到80℃的1N氢氧化钠水溶液中浸泡基板10min。在水洗涤之后用纯水清洁以后，将基板作为下一工艺中的清洁剂基板以该状态使用而不干燥。 

将包含1wt％与氨基结合的硅烷偶合剂，N-β-(氨基乙基)-Y-氨基丙基三甲氧基硅烷KBM603(Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.)的水溶液在室温下搅拌2hrs以水解硅烷化合物的分子内甲氧基。在此溶液中在室温下浸没在以上(1)中获得的清洁剂基板1hr之后，将基板采用纯水洗涤，然后将基板的两个表面以氮气吹风至干燥。然后，将基板在加热到120℃的烘箱中烘烤1hr，由此将氨基引入到基板表面上。 

随后，将2.7mg N-(马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(DojindoLaboratories；以下称为“EMCS”)溶于1∶1(容积比)二甲亚砜(DMSO)/乙醇溶液到0.3mg/ml的浓度。将经历硅烷偶合处理的以上石英基板 在室温下浸入此EMCS溶液2hrs以使通过硅烷偶合处理引入到基板表面上的氨基与EMCS的琥珀酰亚胺基团反应。伴随着此反应，EMCS中的马来酰亚胺基团在基板表面上出现。将基板提出EMCS溶液，用DMSO/乙醇混合溶剂、之后用乙醇洗涤，采用氮气吹风干燥。 

然后，由与实施例1相同的方法，将包含合成肽I的溶液点样到经历表面处理的以上石英基板上。更具体地，制备购自SIGMA Genosys日本的合成肽I的10μM水溶液，和将经历表面处理的以上石英基板采用此溶液由针眼法点样。点样之间的间隔是1mm，在基板的中心部分中形成总计8×8个点。生产多个此类型的芯片。由于合成肽I含有SH基团，考虑合成肽I由在此取代基和马来酰亚胺基团之间的加成反应固定到基板表面。 

实施例6 

实施例5中生产的芯片的银镜反应处理 

银镜反应处理由与实施例3中所述相同的方法进行。提供此样品用于如下TOF-SIMS分析。 

实施例7 

实施例5中生产的芯片和实施例6中处理的芯片的TOF-SIMS分析 

正和负次级离子质谱在与实施例2相同的条件下测量。结果是，对于在实施例6中经历银镜反应处理的芯片，在正次级离子质谱中观察到如在实施例4中显示的那些相似的峰。使用符合合成肽I母离子的这些次级离子可以获得由二维成像产生的图像，该图像反映合成肽I的二维分布状态。 

对于不经历银镜反应处理的芯片(实施例5)，没有观察到符合以上母离子的二维离子峰。在相应于母分子的质量区域中，也没有观察到次级离子峰。 

根据本发明的方法，对于其中在基板上布置多个蛋白质的蛋白质芯片，通过使用蛋白质的“质量信息”进行成像测量，可以在高空间分辨率(可达1μm)下实现多个蛋白质每一个的二维分布状态的可视化。本发明也可应用于在绝缘基板上的蛋白质芯片。 

实施例8 

肽对硅基板的点样和银离子处理 

在此使用的基板是没有杂质的硅基板，将该硅基板依次采用丙酮和去离子水洗涤，然后干燥。使用去离子水制备购自PhoenixPharmaceuticals Inc.的吗啡感受素(SEQ ID NO：2，C₂₈H₃₃N₄O₆(平均分子量：521.58；包括具有最高同位素比的元素的分子质量：521.24))的10μM水溶液。将以上硅基板采用此溶液由微量移液管点样。在冰箱中干燥以此方式生产的基板之后，将基板采用大约10μM硝酸银溶液由微量移液管点样以覆盖由吗啡感受素溶液点样的位置。在空气干燥之后，基板用于TOF-SIMS分析。 

实施例9 

实施例8中生产的芯片的TOF-SIMS分析 

将在实施例8中生产的芯片空气干燥，然后使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa⁺，1.6pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：7.5kHz(150μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约3μm 

测量场：200μm×200μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分时间：600sec。 

正和负次级离子质谱在以上条件下测量。结果是，在正次级离子质谱中，可以检测出对应于含有加上Ag的吗啡感受素母分子质量的次级离子。在图2A中显示此谱图区域的放大视图，根据同位素比例计算的理论光谱在图2B中显示。在图2A-2C中，由箭头指示的峰对应于以上离子[(吗啡感受素)+(Ag)]⁺，两个箭头分别对应于两个Ag同位素(质量数：107，109)。由右侧箭头指示的峰是包括¹⁰⁹Ag的峰，其m/z数值大致与[(吗啡感受素)+(¹⁰⁹Ag)]+的理论值(630.15)匹配。获得使 用符合吗啡感受素母离子的这些次级离子可以获得由二维成像产生的图像(图2C)，该图像反映吗啡感受素的二维分布状态。 

实施例10 

肽对玻璃基板(绝缘基板)的点样和银离子处理 

在此使用的基板是尺寸为25.4mm×25.4mm×1mm的合成石英基板，将该基板依次采用丙酮和蒸馏水洗涤，然后干燥。使用去离子水制备购自Phoenix Pharmaceuticals Inc.的吗啡感受素(SEQ ID NO：2，C₂₈H₃₃N₄O₆(平均分子量：521.58；包括具有最高同位素比的元素的分子质量：521.24))的10μM水溶液。向其中加入小过量的硝酸银。将以上合成石英基板用此溶液以微量移液管点样。将以此方式生产的基板在冰箱中干燥，然后用于TOF-SIMS分析。 

实施例11 

实施例10中生产的芯片的TOF-SIMS分析 

将在实施例10中生产的芯片空气干燥，然后使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa⁺，2.4pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：10kHz(100μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约3μm 

测量场：200μm×200μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分时间：1200sec。 

正和负次级离子质谱在以上条件下测量。 

结果是，在正次级离子质谱，次级离子中可以检测到类似于实施例8和9中所示那些符合吗啡感受素母离子的那种情况。在图3中显示此谱图区域的放大视图。 

实施例12 

肽在Au/Si基板上的点样和钠离子处理 

在没有杂质的硅基板上形成100nm的Au膜。以下使用含有此连接有Au的硅基板。该基板在以下所述的合成肽点样即前生产。 

使用去离子水制备购自SIGMA Genosys日本的合成肽II(SEQ IDNO：3，C₈₄H₈₈N₁₀O₂₀S(平均分子量：1589.72；包括具有最高同位素比的元素的分子质量：1588.59))的10μM水溶液。向其中加入小过量的碳酸钠。将以上基板采用溶液由微量移液管点样。将这样生产的基板在冰箱中干燥，然后用于TOF-SIMS分析。 

实施例13 

实施例12中生产的芯片的TOF-SIMS分析 

将在实施例12中生产的芯片空气干燥，然后使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa+，1.6pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：7.5kHz(150μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约3μm 

测量场：200μm×200μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分数：64 

正和负次级离子质谱在以上条件下测量。结果是，在正次级离子质谱中，可以检测对应于含有加上Na的合成肽I母分子质量的次级离子。在图4A中显示此光谱区域的放大视图，根据同位素比例计算的理论光谱在图4B中显示。在图4A中，由箭头指示的峰对应于以上离子[(合成肽II)+(Na)]⁺，其m/z数值(1612.58)大致与[(合成肽II)+(Na)]⁺的理论值匹配。使用符合合成肽II母离子的这些次级离子可以获得由二维成像产生的图像，该图像反映合成肽II的二维分布状态(图4C)。 

对比例1 

肽在Au/Si基板的点样(没有化学改性处理)和TOF-SIMS分析 

在没有杂质的硅基板上形成100nm的Au膜。以下使用此连接有Au的硅基板。该基板在以下所述的合成肽点样即前生产。 

使用去离子水制备购自SIGMA Genosys日本的合成肽II(SEQ IDNO：3，C₈₄H₈₈N₁₀O₂₀S(平均分子量：1589.72；包括具有最高同位素比的元素的分子质量：1588.59))的10μM水溶液。将以上基板采用溶液由微量移液管点样。将这样生产的基板在冰箱中干燥，然后用于TOF-SIMS分析。正和负次级离子质谱在与实施例13相同的条件下测量。结果是，在正次级离子质谱中，没有观察到类似于实施例13中观察到的那个符合合成肽II母离子的峰(图5)。 

实施例14 

肽在硅基板上的点样和银离子处理 

在此使用的基板是没有杂质的硅基板，将该基板依次采用丙酮、异丙醇和去离子水以那个顺序洗涤，然后干燥。 

其后，将如下三种肽溶于去离子水： 

肽1：吗啡感受素(由Phoenix Pharmaceuticals Inc.制造；SEQID NO：2；平均分子量：521.58) 

肽2：生长激素释放肽(Ghrelin)(1-5)-NH2(脱-辛酰基3)(由Phoenix Pharmaceuticals Inc.制造；SEQ ID NO：4；平均分子量：508.10) 

肽3：合成肽I(由SIGMA Geno sys日本制造；SEQ ID NO：1；平均分子量：634.61) 

作为电离促进物质，将硝酸银类似地溶于去离子水。 

然后，将包含1wt％炔属醇(产品名：acetylenol EH，由KawakenFine Chemicals Co.，Ltd.制造)的水溶液制备并加入以上各含肽溶液和硝酸银溶液。调节每个溶液以达到40μmol/l的最终浓度。 

将这些溶液填充入用于Bubble Jet 打印机(产品名：BJF850；由Canon Inc.制造)的油墨罐，将罐安装在Bubble Jet 打印头上。在此使用的Bubble Jet 

打印机经过改造以能够打印到平板上。在点样时的排放速率是4pl/小滴，点样范围是在基板中心中的10mm×10mm 区域中的150dpi，即在169μm的节距下排放。 

随后，将以上硅基板安装在用于打印机平板的托盘上，将包含肽的流体点样到基板上。排放的小滴的数目是12小滴×12排＝144个小滴。将小滴以肽1(数字61)，肽2(数字62)，肽3(数字63)，肽1，肽2...的顺序排放以在基板上按顺序布置不同种类的肽。布置肽的每排使得它们以相同的方式排列(图6)。 

在室温下干燥这样生产的基板之后，将基板采用以上硝酸银溶液以与以上肽点相同的位置在覆盖肽点的条件下点样。将基板空气干燥，然后用于TOF-SIMS分析。 

实施例15 

实施例14中生产的芯片的TOF-SIMS分析 

将在实施例14中生产的芯片空气干燥，然后使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa⁺，2.4pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：10kHz 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约3μm 

测量场：300μm×300μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分时间：210sec。 

正和负次级离子质谱在以上条件下测量。结果是，在正次级离子质谱中，可以检测对应于含有加入的Ag的每个肽的母分子质量的次级离子。图7A-7C显示每个肽的此光谱区域的放大视图。在图7A-7C中，由箭头指示的峰对应于以上离子[(每个肽分子)+(Ag)]⁺，两个箭头分别对应于两个Ag同位素(质量数：107，109)。 

使用对应于含有加上Ag的每个肽的母分子质量的次级离子生成二维图像，因此获得图8所示的图像，该图像是所选择的次级离子的m/z数值。通过比较图像与打印机的打印文件，确认获得的相应于每 个肽的质量+Ag的图像是以打印机的点样顺序存在的。 

因此发现当分析多种蛋白质时，可以一次进行分析而不通过由使用Bubble Jet 

打印机的点样将多种蛋白质一起放置在一个基板上而将多种蛋白质混合在一起。 

实施例16 

肽和银离子混合溶液到硅基板上的点样 

制备采用与实施例14相同的方式处理的硅基板。也采用与实施例14相同的方式制备三种肽溶液和硝酸银溶液。 

将肽1溶液和硝酸银溶液，肽2溶液和硝酸银溶液，及肽3溶液和硝酸银溶液分别在填充入与用于实施例14相同Bubble Jet 打印机的油墨罐即前混合。然后采用与实施例14相同的方式进行点样以制备用于分析的基板。 

将这样生产的分析用基板采用与实施例15相同的方式分析，获得了相似的图像。 

实施例17 

肽和钠离子混合溶液到硅基板上的点样 

制备采用与实施例16相同的方式生产的基板，区别在于将电离促进剂从硝酸银溶液变成碳酸钠溶液。将此物质采用与实施例15相同的方式分析。 

使用对应于含有加上Na的每个肽的母分子质量的次级离子生成二维图像，由此获得所选择的次级离子的m/z数值的图像。通过比较这些图像与打印机的打印文件，确认获得的相应于每个肽的质量+Ag的图像是以打印机的点样顺序存在的。 

实施例18 

肽到玻璃基板的点样和银离子处理 

在采用洗涤剂清洁一英寸见方的合成石英基板并采用去离子水洗涤之后，将基板依次采用丙酮，异丙醇和乙酸丁酯洗涤，在120℃下干燥20min。 

将这样制备的基板采用与用于实施例14相同的三种肽溶液和硝 酸银点样。将溶液采用与实施例14相同的方式排列以生产具有相应点的基板。 

实施例19 

实施例18中生产的芯片的TOF-SIMS分析 

将在实施例18中生产的芯片空气干燥，然后使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置分析。测量条件概括如下。 

初级离子：25kVGa⁺，0.6pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：2.5kHz(400μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

初级离子束直径：大约3μm 

测量场：300μm×300μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分时间：1200sec。 

正和负次级离子质谱在以上条件下测量。结果是，在正次级离子质谱中，可以检测与实施例15中显示的那些相同的对应于每个肽母离子的次级离子。使用这些离子产生二维图像，因此获得根据每个肽的布置位置的图像。 

即，在绝缘基板上的效果与导电基板的效果相似。 

实施例20 

含有预处理腔的信息获取装置 

图9是根据此实施例的信息获取装置的简图。 

以下，使用根据本发明的装置描述分析样品41的实施例，在该样品上混合多个肽。根据本发明的装置是含有飞行时间质谱仪的分析装置，它使用Au离子枪作为初级束，通过包含在预处理腔中的放电装置施加小滴。用于测量的样品41是在合成石英基板上的含有处于混合状态的多个肽的样品。 

制备要放置在样品上的肽，向其中加入与用于实施例14相同种类的有机溶剂，将溶液填充入喷嘴42-45。在此实施例中，将如下四种 肽分别填充入不同的喷嘴。 

肽1-3：与实施例14的相同 

肽4：酪蛋白肽(casoxin)D(由Phoenix Pharmaceuticals Inc.制造；SEQ ID NO：5；平均分子量：866.03) 

此外，将硝酸银溶液填充入单独的喷嘴46，将用作正常Bubble Jet打印机用油墨的品红色油墨填充入另一个喷嘴47。 

其后，将硅基板48放入装置，采用各个肽和品红色油墨在200dpi.的节距下点样，随后仅在以上肽点上进行采用硝酸银溶液进一步点样。 

然后，在采用CCD 49确认各自位置的同时，采用相同的方式硝酸银溶液在测量用样品41上所需的位置。将点样的位置由控制计算机51记录为样品台50的位置信息。 

在预处理腔53中干燥这样生产的样品41和硅基板48之后，在引入腔54中进行初步抽真空，将样品41转移到测量腔55。其后，在如下条件下将硅基板48进行正和负次级离子质谱分析。 

初级离子：25kVAu³⁺，0.05pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：5kHz(200μs/s) 

初级离子脉冲宽度：大约1ns 

测量场：300μm×300μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分数：128 

结果是，在正次级离子质谱中，可以检测到对应于含有加上Ag的每个肽母分子质量的次级离子。 

使用每个这些离子，进行测量用样品41的成像分析。将台架移动到先前记录的位置以进行样品41的分析。结果是，在其中点样硝酸银的情况下，如图10的右边的“区域2”图像和左边的“区域1”图像所示，检测对应于含有加上Ag的肽1质量的次级离子(“区域2”图像)和对应于含有加上Ag的肽3质量的次级离子(“区域1”图像)。因此从由次级离子成像产生的图像确定用于测量的样品41是含有以 二维分布状态在其上存在的肽1和肽3的样品。 

实施例21 

在此实施例中，描述这样的情况，其中将包括来自活体的组织切片的样品连接到载玻片的平表面，将切片样品的表面采用敏化剂根据下述过程处理。 

作为要用作测量目标的蛋白质分子的例子，可以提及日本专利申请公开公报No.2004-77268等中公开的与癌组织相关的4N1K肽等。作为包括来自活体的组织的样品，该样品是分析对象，切下是癌组织的病变切片。当使用4N1K作为目标时，使用蛋白酶(基质金属蛋白酶3：MMP3)在从此病变切片制备的切片样品表面上进行消化处理。随后，将切片样品连接到具有平表面的基板，如玻璃基板，并固定在其上。 

其后，使用Bubble Jet 

方法等将硝酸银溶液施加到切片样品的表面上。作为用作包含敏化剂的溶液的硝酸银溶液，例如可以使用在0.5mmol/L的浓度下包含AgNO₃的水溶液。例如在0.5μl/cm²的涂布重量下将溶液施加到切片样品的表面。在表面由此AgNO₃溶液覆盖的情况下，将样品在室温下静置10min，以允许溶于溶液的溶质离子种对切片样品表面上存在的蛋白质组分作用。其后，通过采用纯水的洗涤除去覆盖表面的AgNO₃溶液。 

然后，在将样品连接到基板平表面的状态下，将采用敏化剂处理的切片样品在真空干燥器中干燥5min，然后在TOF-SIMS分析装置的初步抽真空腔中干燥。 

在TOF-SIMS分析中，作为源自4N1K肽的碎片离子，4N1K肽是TSP-1蛋白质(参与癌进展和癌组织中血管形成的蛋白质)的片段肽，可以使用包括SEQ ID NO：6的部分结构的阳离子种(包括敏化剂连接到其上的阳离子种)。在此，也可以在连接切片样品到基板表面以对其固定之后对于切片样品的表面进行蛋白酶消化处理的步骤。 

在来自活体的此类组织中，存在这样的情况，其中靶蛋白质分子的性能可由于组织中共同存在的酶蛋白质的生理活性而变化。因此，优选对于一系列操作将样品的温度保持在0℃或以下。 

当由TOF-SIMS进行在包括来自活体的组织切片的样品表面上存在的蛋白质组分的成像测量时，以下显示可以根据此实施例使用的TOF-SIMS分析条件的一个例子。在此，可以考虑切片样品自身的尺寸，或对于特定蛋白质分子公认的分布状态(定位部位等)适当地改变测量场的范围。 

[初级离子] 

初级离子：25keVGa⁺，0.1pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：10kHz(100μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：1ns(负荷比1/100,000) 

初级离子束直径：大约0.5μm 

电子轰击：脉冲电流10μA； 

脉冲宽度96μs 

[次级离子] 

次级离子检测模式：正 

提取次级离子的电压：2kV 

测量场：50μm×50μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分数：256 

夹具温度：0℃ 

在以上测量条件下，二维成像中的空间分辨率相当于1μm。 

此外，在以上初级离子辐射条件下，溅射深度对应于在从干燥的切片样品最外表面大约1nm的深度范围内。 

作为对比，对于仅经历真空干燥和不采用以上敏化剂处理的干燥的切片样品，通常，难以在高灵敏度下检测可区分靶蛋白质分子的质量(m/z)为500或更大的碎片离子。 

通过采用在此说明的方法，可以把握来自活体的组织的成分分布状态，和根据分布状态可以区分，例如用作测量目标的组织是否是恶性癌症或良性肿瘤。因此，能够实现疾病的诊断。 

实施例22 

在此实施例中，采用作为目标的固定在金表面上的牛血清白蛋白(BSA)确认由TOF-SIMS的二维分析能力。 

根据在日本专利申请公开公报No.2004-085546中公开的方法，将包含牛血清白蛋白(BSA)的水溶液由Bubble Jet 方法排放以在预先清洁的金基板上形成包括BSA的点。 

在此使用的BSA是市售产品(由Sigma Aldrich日本制造)，蛋白质在溶液中的浓度是大约1μM。每个点的排放体积是大约4pl，点的直径是50μm。施加的BSA在单分子层水平上在清洁的金基板表面上形成点。BSA包含半胱氨酸残基，因此希望由在半胱氨酸侧链的SH基团和表面上金原子之间的表面结合肽链到表面。 

在点形成之后，使基板空气干燥10min。在此，BSA在以上点中的表面浓度对应于0.05pmol/cm²。其后，使用由ION-TOF GmbH制造的TOF-SIMS IV装置进行TOF-SIMS分析。测量条件概括如下。 

[初级离子] 

初级离子：25keVGa⁺，0.1pA(脉冲电流值)， 

随机扫描模式 

初级离子的脉冲频率：10kHz(100μs/发射) 

初级离子脉冲宽度：1ns(负荷比1/100,000) 

初级离子束直径：大约0.5μm 

电子轰击：脉冲电流10μA； 

脉冲宽度96μs 

[次级离子] 

次级离子检测模式：正 

提取次级离子的电压：2kV 

测量场：50μm×50μm 

次级离子图像的像素数目：128×128 

积分数：256 

夹具温度：0℃ 

在以上条件下，TOF-SIMS分析在大约50μm直径的点切片上进行。其结果是，观察根据如下碎片离子等的峰： 

据认为衍生自Pro残基的碎片离子的C₄H₆N⁺(m/z＝68)和C₄H₈N⁺ (m/z＝50)； 

据认为衍生自Arg残基的碎片离子的CH₃N⁺(m/z＝29)，C₂H₇N₃ ⁺ (m/z＝73)，C₄H₁₀N₃ ⁺(m/z＝100)，C₄H₁₁N₃ ⁺(m/z＝101)，和C₅H₈N₃ ⁺(m/z＝110)； 

据认为衍生自Trp残基的碎片离子的C₉H₈N⁺(m/z＝130)，C₁₀H₁₁N⁺ (m/z＝145)和C₁₁H₈NO⁺(m/z＝170)；和 

据认为衍生自Cys残基的碎片离子的C₂H₆NS⁺(m/z＝76)和CHS⁺ (m/z＝45)。 

此外，由Bubble Jet 

方法形成的对应于大约50μm直径的点的轮廓可以从使用这些次级离子产生的二维分布图像确认。 

因此，当对于在清洁金表面上存在的单分子层水平BSA进行TOF-SIMS分析时，可用于区分BSA的氨基酸残基特征的碎片离子检测为次级离子。此外，通过将这些次级离子的离子强度二维作图，可以获得最高约1μm的空间分辨率的二维分布图像。 

此外，根据次级离子的测量的离子强度，预测允许根据以上测量条件的二维成像分析的蛋白质分子表面密度的下限相当于大约1pmol/cm²。 

在此，初级离子束的直径也可以聚焦到0.1μm的水平，因此可以通过采用测量条件获得更高分辨率的二维分布图像，该测量条件采用更小束直径和增加像素数目的初级离子。为产生对应于肽链部分片段的特征次级离子，该部分片段可用于区分BSA，在必要的情况下，可以将敏化剂对于肽链在TOF-SIMS分析之前提供。 

实施例23 

在此实施例中，描述如下情况：其中根据下述的过程，将包括来自活体的组织切片的样品与平金属表面接触和采用TOF-SIMS方法对于从切片样品表面转移到金属表面上的每种蛋白质分子进行二维分布分析。 

将来自活体的切除组织的切片表面上存在的蛋白质分子转移到金基板表面，使用TOF-SIMS分析每种蛋白质的二维分布的步骤概括如下。 

作为要用作测量目标的蛋白质分子的例子，可以提及日本专利申请公开公报No.2004-77268中公开的与癌组织相关的4N1K肽等。作为包括来自活体的组织的样品，该样品是分析对象，切除是癌组织的病变切片。当使用4N1K作为目标时，使用蛋白酶(基质金属蛋白酶3：MMP3)在从此病变切片制备的切片样品表面上进行消化处理。然后，将由蛋白酶消化的切片样品的切片表面与含有平金表面的基板顶部接触。其后，将样品在TOF-SIMS分析装置的初步抽真空腔中干燥，提供用于TOF-SIMS分析。 

为避免影响转移到基板表面上的蛋白质组分的二维分布，也可以在完成转移蛋白质组分到基板表面的步骤之后进行以上蛋白酶消化处理。更具体地，当转移到基板表面上的蛋白质组分的肽链结合到表面时，尽管其后进行蛋白酶消化处理，该二维分布状态自身得以保持。 

为产生可用于区分4N1K肽的肽链的氨基酸序列特征的次级离子，在必要的情况下，可以将敏化剂对于肽链在TOF-SIMS分析之前提供。 

在来自活体的此类组织中，存在这样的情况，其中靶蛋白质分子的性能可由于组织中共同存在的酶蛋白质的生理活性而变化。因此，优选对于一系列操作将样品的温度保持在0℃以下。 

用于此实施例的TOF-SIMS分析条件可以与以上实施例22中描述的条件相同，和可以在考虑为进行转移的切片样品尺寸，或是分析目标的蛋白质分子的公认分布状态(定位部位等)之后适当地调节测量场的范围。 

在此实施例中，作为衍生自4N1K肽的次级离子种，可以使用包括SEQ ID NO：6部分结构的阳离子种(包括敏化剂连接到其上的阳离子种)。 

通过采用以上说明的方法，可以把握来自活体的组织的成分分布 状态，根据分布状态可以区分，例如用作测量目标的组织是否是恶性癌症或良性肿瘤。因此，能够实现疾病的诊断。 

实施例24 

在此实施例中，描述来自实施例21中所述那个的开发的疾病诊断方法。 

在损伤切片到基板的连接之后采用蛋白酶进行消化处理中和在通过喷墨方法如气泡-喷射方法施加包含消化酶的小滴进行消化处理中，此实施例的方法不同于实施例21的方法。在由喷墨方法的施加中，可以将表面活性剂加入要排出的液体以获得稳定的排出。靶蛋白由消化酶的特异消化和促进TOF-SIMS分析中衍生自分解生成物的离子种电离的物质的施加两者都通过喷墨方法进行，使得可以获得反映蛋白质在损伤组织中初始分布的二维分布。对于规定仍然不通过分解生成物的离子种分解的蛋白质的目的，可以采用蛋白质组分析生成物的各种已知数据库。 

序列表自由正文 

<210>1 

<223>作为TOF-SIMS分析用样品的合成肽 

<210>2 

<223>作为TOF-SIMS分析用样品的合成肽 

<210>3 

<223>作为TOF-SIMS分析用样品的合成肽 

<210>4 

<223>作为TOF-SIMS分析用样品的合成肽。 

<210>5 

<223>作为TOF-SIMS分析用样品的合成肽 

<210>6 

<223>4N1K肽的部分结构 

Claims (4)

1.一种获取目标对象信息的信息获取方法，其特征在于它包括如下步骤：

采用银镜反应使目标对象和促进目标对象的电离的物质接触，然后在接触的部分上辐射初级离子；和

使用飞行时间次级离子质谱获取脱逸的目标对象的质量信息。

2.根据权利要求1的信息获取方法，其中目标对象是蛋白质。

3.根据权利要求1的信息获取方法，其中脱逸的目标对象是任何以下的物质：

(1)对应于目标对象母分子的离子；

(2)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加获得的质量的离子；

(3)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子；

(4)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的母分子的附加，进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子，和从其消除至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子；

(5)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加获得的质量的离子；

(6)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加，进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子；和

(7)对应于由具体金属元素的原子或簇向目标对象的部分结构的附加，和进一步向其附加至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子，和从其消除至少一种选自氢、碳、氮和氧的1-10的任意数目的原子获得的质量的离子。

4.根据权利要求1的信息获取方法，其中根据脱逸的目标对象的检测结果获取由初级离子的扫描获得的目标对象二维分布状态的信息。

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