CN100349917C

CN100349917C - 一种检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法

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Publication number: CN100349917C
Application number: CNB031420559A
Authority: CN
Inventors: 吕元; 关明; 刘维薇; 张万忠; 吴忠; 张元芳
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2003-08-04
Filing date: 2003-08-04
Publication date: 2007-11-21
Anticipated expiration: 2023-08-04
Also published as: CN1483742A

Abstract

本发明属生物学和医学检验领域，具体涉及一种膀胱癌相关蛋白及其检测方法。本发明采用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术，联合应用蛋白质芯片技术和Biomarker Patterns Software软件建立树状分析模式，检测分析尿液标本中具有差异表达的膀胱癌相关的特异蛋白。本发明方法检测尿液标本取材方便、无创伤性，所测膀胱癌相关蛋白灵敏度达84%，特异性达91%，并且可以长期追踪，用于临床检测或对高危人群的监测，为膀胱癌的早期发现、早期诊断和早期治疗提供了依据。

Description

一种检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法

技术领域

本发明属生物学和医学检验领域，涉及一种肿瘤生物标志物及其检测方法，具体涉及一种膀胱癌相关蛋白及其检测方法。

背景技术

近年来，随着基因组学研究和蛋白组学的快速发展，科学家认识到基因组学的研究需要通过蛋白质水平的研究资料进行补充。有报道，一种研究蛋白质方法(蛋白组模式诊断)，采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)的蛋白质芯片系统分析蛋白质，该方法克服了传统蛋白分析的局限性，使之能够在小量粗提样品中，对血液尿液等各种体液，细胞或组织的所有蛋白质的质量和功能特性进行快速分析。SELDI是一种基于亲和技术的质谱技术，蛋白质与表面被化学修饰过的蛋白芯片选择性的结合(Ciphergen ProteinChip @Array)，而未结合的蛋白质则被缓冲液所冲洗掉，再通过加入能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules，EAM)后，送入阅读机，蛋白质在激光作用下解吸咐和离子化，通过真空飞行管到达检测器而被检测到，从而得到蛋白质图谱。该系统可以检测到结合在芯片上的所有蛋白质，系统通过测定被分析物分子的“飞行时间”，计算出化合物的质荷比，再通过群体分析找到在两种条件下的差异蛋白质群。

表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)的基本组成包括下述四部分：(一)SELDI，也是蛋白质芯片(ProteinChip Arrays)的核心技术；(二)飞行时间质谱仪(TOF-MS)，也称为芯片阅读仪(ProteinChip Reader)；(三)蛋白质芯片系统专用软件(Ciphergen Proteinchip Software)；(四)高级树状模型分析软件(Biomarker Patterns Software，)，可以根据研究者的需要选择不同的参数配置，处理已经得到的数以百计的蛋白质的峰形图谱，寻找出最佳的分析模式。

现今社会肿瘤是人类最大的杀手之一，但人们在面对肿瘤时常常无法做到早期发现、早期诊断和早期治疗，往往会延误治疗的最佳时机。膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的3％，发病年龄以50-70岁最为多见，男女之比约为4∶1，居男性泌尿生殖系统肿瘤首位，且极易复发。在膀胱肿瘤中膀胱癌占极大多数，其中86％以上来源于移行上皮细胞，而未分化癌、鳞癌及腺癌等则少见。长期以来，膀胱癌的诊断缺乏行之有效的方法。尿脱落细胞学和膀胱镜检查一直作为泌尿系统疾病，特别是膀胱癌诊断和检测复发的金标准。但是尿液脱落细胞学敏感度低，大约只有60％左右，尤其是低级别的肿瘤敏感度则更低，并具有主观性的干扰，因此，其临床价值受限。而膀胱镜检查具有创伤性，会给病人带来极大的痛苦。所以寻找早期诊断膀胱癌的无创性、且简便而有高敏感度、高特异性的新的肿瘤标志物具有重大的临床意义。

发明内容

本发明目的是提供一种高敏感度、高特异性的新的膀胱肿瘤生物标志物及其检测方法，具体涉及一种膀胱癌相关蛋白及其检测方法，为膀胱癌的早期诊断提供依据。

本发明采用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，联合应用蛋白质芯片技术和Biomarker Patterns Software软件建立树状分析模式，检测分析尿液标本中具有差异表达的膀胱癌相关的特异蛋白。

本发明所述的具有差异表达的膀胱癌相关的特异蛋白，包括下述的一组5种蛋白质，其分子量分别为3891-3901Da，4972-4982Da，9633-9643Da，15098-15108Da和15504-15514Da，分别命名为蛋白质HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。

本发明方法检测尿液标本取材方便、无创伤性，所测膀胱癌相关的生物标志物即膀胱癌相关蛋白，敏感度、特异性高，并且可以长期追踪。

本发明的技术方案通过下述步骤实现：

1.标本准备

新鲜的尿液标本离心后分装-80℃保存，备用。

2.相关蛋白质图谱分析

采用美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)的金属亲和吸附芯片(Immobilized Metal Affinity Capture，IMAC类)。将标本置入美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)蛋白质生物系统PBS II，用特定参数组合分析样品尿液蛋白质组图谱。

对比分析膀胱癌患者和对照组尿液标本的蛋白质图谱，结合使用分析软件Ciphergen ProteinChip Software(Ciphergen Biosystems，Inc.)和树状模式分析软件Biomarker Patterns Software(Ciphergen Biosystems，Inc.)获得膀胱癌患者与对照组有差异的蛋白质峰。

3.联合应用树状分析模式作出判断依据。

上述方法采用盲法进行筛选试验，确定判断标准的灵敏度、特异度指标。

本发明为一种灵敏度高、特异性强、快速、小样本高通量的检测方法，为膀胱癌的早期发现、早期诊断和早期治疗提供了依据。本发明具有较大的实际临床价值，能有效的对膀胱癌作出早期判断，可用于临床检测或对高危人群的监测。本发明方法经济合理，每检测一人标本成本为90元人民币，明显降低患者医疗开支，有利于促进医疗保险制度的改革。

具体实施方式

实施例1

1)制备尿液

取3组新鲜尿液标本，分别为临床病理确诊为膀胱癌的患者尿液标本组(46例)，泌尿系统其他良性疾病(如前列腺增生、泌尿系统的炎症、输尿管结石等疾病)的患者尿液标本组(32例)以及健康志愿者的尿液标本组(40例)，后两组为对照组(共72例)，标本离心后分装-80℃，备用。

2)制备芯片

(1)芯片前处理：

每个加样点加CuSO4 100Mm(Sigma公司)溶液10μl，放入湿盒10分钟后，取出甩干。重复操作一次。将芯片放入去离子水试管，振荡，取出甩干。每个加样点加10μl的醋酸钠50mM pH4(Sigma公司)溶液10ml，放入湿盒5分钟后，取出甩干，放入去离子水试管，振荡，取出甩干。装入加样器，备用。

(2)芯片预平衡：

每孔加缓冲液PBS含250Mm NaCl(Sigma公司)100μl。放摇床5分钟后，弃去孔中液，重复操作一次。

(3)加样：

采用BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检测尿样蛋白浓度(上海博彩生物科技有限公司)，根据浓度的不同用加样缓冲液稀释尿液样本，调整至2mg/ml，取稀释后的尿液100μl上样，放入4℃摇床，1小时。

(4)洗脱：

弃去尿液样品后，每孔加缓冲液(PBS含250Mm NaCl)100μl。放摇床2分钟后弃孔中液体，重复操作一次。加入去离子水100μl，甩干。

(5)加能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules，EAM)：

取出芯片后，微干，每孔加SPA(Sinapinic acid，Ciphergen公司)0.5μl，所述SPA溶于500ml/L乙晴(Sigma公司)和5ml/L三氟乙酸(Sigma公司)，干后重复一次。

3.获得尿液蛋白质组图谱

将上述芯片放入阅读机，检测结合到芯片上的所有蛋白质，得每个加样点的所有蛋白质图谱。

调节设立主要参数：检测分子量范围0-50,000道尔顿，激光强度200，检测敏感度9，检测点20-80。

4.尿液蛋白质组图谱分析

采用蛋白质芯片系统专用软件Ciphergen Proteinchip Software(Ciphergen公司)处理已整合的数据，选择参数，如调整基线为4(fitting width4)，将所有的蛋白质图谱标准化到相同的总的离子流(total in current)，用Biomarker wizard(Ciphergen Proteinchip Software功能)功能对上述蛋白质图谱进行检测，选择S/N参数为5；最小峰参数为5％。结果显示，经上述蛋白质芯片系统检测到P＜0.05？的蛋白质一百余例。

5.获得膀胱癌患者尿液差异表达蛋白质峰

采用Biomarker Patterns Software树状模型分析软件处理上述蛋白质数据，选择特定的参数配置，建立树状分析模式，命名为HS-BL-329。所述参数设置为：母节点包括至少2例(parent nodes must have at least 2 cases)；矢量倍数交叉验证12(V-Fold cross-validation 12)；方法选择Gini 1.0(Method Gini 1.0)。

所述树状分析模式是根据蛋白质的存在或缺失或在图谱上表达量的差异划分标本组。

通过上述树状分析模式分析，得到一组具有差异表达的蛋白质峰，其中包括5个在膀胱癌组和对照组中具有差异表达的蛋白质，联合应用其间差异可将膀胱癌组和对照组有效区分，检测的灵敏度为84％，特异性为91％。

上述一组5种蛋白质的分子量范围分别为3891-3901Da，4972-4982Da，9633-9643Da，15098-15108Da和15504-15514Da，在树状分析模式中分别取平均数3896Da，4977Da，9638Da，15103Da和15507Da来表示，分别命名为蛋白质HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。

实施例2

树状分析模式HS-BL-329的盲筛应用

采用3组155例尿液标本，其中包括建立Pattern的118例标本以及另外的37例尿液标本。其中膀胱癌患者组61例，其他泌尿系统良性疾病患者组42例，健康志愿者组共53例。所述37例尿液标本中，膀胱癌患者组共14例，其他泌尿系统良性疾病的患者组共10例，健康志愿者组共13例。采用实施例1相同的实验条件，相同的软件处理参数，得到的蛋白质图谱应用HS-BL-329树状模型分析软件进行筛选，结果表明，上述树状分析模式检测155例标本的灵敏度为80.3％，特异性可达到86.3％。并可将所述第2组泌尿系统的其他良性疾病与膀胱癌进行区分。

上述树状分析模式根据蛋白质的存在或缺失或在图谱上表达量的差异划分标本组。附图6显示，根据一个标本蛋白质3896在图谱上的表达的强度是否≤0.488，将1组标本划分为2组标本，小于等于强度0.488的标本划分为左下一组，大于强度0.488的标本划分为右下一组。上述划分一直进行下去，直到最终的分组产生。图中“3896≤0.488”，表示分子量为3896Da的蛋白质在图谱质的强度是小于等于0.488，回答“是”则继续进入分子量为9638Da的蛋白质的比较，回答“否”则继续进入分子量为4977Da的蛋白质的比较，以此类推，直至进行到最后的分组。本实施例最终分组6组，其中第1组标本13个，其中肿瘤1个和对照12个，第2组标本19个，其中肿瘤14个和对照5个，第3组标本20个，其中肿瘤19个和对照1个，第4组标本28个，其中肿瘤6个和对照22个，第5组标本6个，其中肿瘤6个和对照0个，第6组标本32个，其中肿瘤0个和对照32个。

附图说明：

图1是蛋白质HS-BL-1峰形图

其中标记的为该蛋白质的分子量，对照中的表达高于肿瘤的表达。

图2是蛋白质HS-BL-2峰形图

图3是蛋白质HS-BL-3峰形图

其中标记的为该蛋白质的分子量，肿瘤中的表达高于对照的表达。

图4是蛋白质HS-BL-4峰形图

图5是蛋白质HS-BL-5峰形图

图6是树状分析模式HS-BL-329示意图

其中：“3896≤0.488”，表示分子量为3896Da的蛋白质在图谱质的强度是否小

于等于0.488，回答“是”则继续进入分子量为9638Da的蛋白质的比较，回答“否”则继续进入分子量为4977Da的蛋白质的比较，以此类推，至最后的分组。

N表示每一组中标本的具体的个数。

N1：最终分组第1组，

N2：最终分组第2组，

N3：最终分组第3组，

N4：最终分组第4组，

N5：最终分组第5组，

N6：最终分组第6组。

Claims

1、一种检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于采用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术，联合应用蛋白质芯片技术和分子标志物模式软件建立树状分析模式，检测分析尿液标本中的相关蛋白的差异表达，包括下述步骤，

1)标本准备

新鲜的尿液标本离心后分装-80℃保存，备用；

2)相关蛋白质图谱分析

蛋白质芯片系统中选择特定参数组合，获得尿液标本蛋白质组图谱；

3)联合应用树状分析模式获得有差异的蛋白质峰；

所述的相关蛋白是一组5种蛋白质，其分子量分别为3891-3901Da，4972-4982Da，9633-9643Da，15098-15108Da和15504-15514Da；

所述步骤2的特定参数组合是蛋白质图谱的获得参数、P＜0.05蛋白质图谱的获得参数和相关蛋白质图谱的获得参数；

所述树状分析模式是根据蛋白质的存在或缺失或在图谱上表达量的差异划分标本组，命名为HS-BL-329。

2、按权利要求1所述的检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于所述的一组5种蛋白质分别命名为蛋白质HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。

3、按权利要求1所述的检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于所述的特定参数组合的蛋白质图谱的获得参数是：

检测分子量范围为0-50000道尔顿

激光强度为200

检测敏感度为9

检测点为20-80。

4、按权利要求1所述的检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于所述特定参数组合P＜0.05蛋白质图谱的获得参数是：

基线为4

蛋白质图谱标准化：相同总离子流

S/N为5

最小峰为5％。

5、按权利要求1所述的检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于所述特定参组合中相关蛋白质图谱的获得参数为：

母节点至少2例，

矢量倍数交叉验证12，

方法选择Gini 1.0。

6、按权利要求1所述的检测尿液标本中差异表达的相关蛋白的方法，其特征在于所述一组5种蛋白质分子量的平均数分别是3896Da，4977Da，9638Da，15103Da和15507Da。