CN111073943A - 一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法。该方法包括：将非离子表面活性剂溶液喷洒到生物组织切片表面，孵育；然后，将蛋白酶溶液喷洒到生物组织切片表面，进行原位酶切。本发明通过非离子表面活性剂的使用，可以使蛋白质更容易被蛋白酶切断，从而大大提高酶切效率。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备。

Description

一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域。更具体地，涉及一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法。
背景技术
生物大分子蛋白质的成像一般用免疫组化，随着质谱技术的发展，目前已有少量关于蛋白质的质谱成像技术研究进展的报道。质谱成像技术通过数据处理将扫描产生的离子信号与图像重建技术相结合，从而确定生物组织不同部位的大量多肽和小蛋白及其在组织中的分布位置和相对含量。然而，由于目前质谱仪技术的局限性，目前质谱仪快速检测和解离的最佳m/z范围小于2000，将蛋白质酶切成肽段、再拼成蛋白的所谓bottom-up的技术被广泛应用于蛋白质组学。在蛋白质质谱成像中，最好的方法是先用蛋白酶或化学试剂原位切割组织表面，识别肽的空间分布，然后将肽的空间分布与蛋白质进行匹配。采用蛋白酶酶切方法，由于蛋白质深埋于组织，蛋白酶只能部分接触蛋白，导致酶切不充分，酶切效率较低，只能检测少数蛋白的分布，影响蛋白质质谱成像的数量。因此寻找一种能够提高组织切片表面蛋白酶切效率的方法，再进行蛋白质谱成像检测，是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种简单可操作的在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种基于蛋白质原位酶切的方法的蛋白质鉴定及质谱成像的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法，该方法包括：
(1)将非离子表面活性剂溶液喷洒到生物组织切片表面，孵育；
(2)将蛋白酶溶液喷洒到生物组织切片表面，进行原位酶切。
本发明采用非离子表面活性剂溶液作用于生物组织切片样本表面，一方面，当非离子表面活性剂吸附在界面上时，蛋白质与非离子通过疏水作用力相互作用，使蛋白质从界面上“站起来”；另一方面，由于蛋白质分子复合结构体积的增大，降低了界面膜的密闭性，降低了界面膜的强度，从而大大提高组织切片表面蛋白质谱成像的数量，见图1。该方法可以使蛋白质更容易被蛋白酶切断，从而提高酶切效率。
可选的，所述非离子表面活性剂包括曲拉通(例如曲拉通X-100、曲拉通X-114、曲拉通X-102等)、土温(例如土温80、吐温60、吐温20等)、壬基酚聚醚(例如壬基酚聚醚-10)、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯-20)、椰油酰胺DEA等中的一种或几种。
可选的，所述非离子表面活性剂溶液的质量浓度为0.00001％-5％，例如为0.0001％、0.001％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％或在任何这些质量浓度之间的任何范围。
可选的，步骤(1)中，孵育时间为0h-24h，且不包括0。
可选的，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、梭菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白内切酶中的一种或几种。
可选的，步骤(2)中，酶切的时间0h-18h，且不包括0。
可选的，该方法还包括制备生物组织切片的步骤，具体包括：用冰冻切片的方法将生物组织切片制成冰冻切片，然后将冰冻切片转移到载玻片上，依次用不同浓度的乙醇溶液润洗切片表面，干燥。
可选的，制备生物组织切片时，依次用70％，100％的乙醇溶液润洗切片表面。
为了避免各种处理试剂的相互影响，优选的，步骤(1)使用非离子表面活性剂溶液对组织切片孵育后，需要将非离子表面活性剂溶液移除，获得干燥样本，采用的方法可以是本领域常用的干燥方法，例如真空抽干。同样地，步骤(2)使用蛋白酶溶液进行原位酶切后，也需要将蛋白酶溶液移除，获得干燥样本。本发明方法制备的样本可适用于蛋白质原位质谱成像。
本发明还提供一种蛋白质鉴定及质谱成像的方法，该方法包括：
(1)基于上述方法在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切；
(2)将CHCA基质溶液喷洒在生物组织切片上，待基质干燥后进行质谱检测。
可选的，所述方法还包括将扫描采集的质荷比结果导入成像软件中，通过图像重构技术处理，并与肽段-蛋白质组对应的蛋白质组库一一对应，选择合适的肽段得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。
本发明的有益效果如下：
本发明通过非离子表面活性剂的使用，可以使蛋白质更容易被蛋白酶切断，从而大大提高酶切效率。该方法适用于生物组织切片表面蛋白质原位质谱成像的样本制备。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出非离子表面活性剂辅助蛋白酶消化组织切片表面蛋白质的原理。
图2示出吐温80辅助原位酶切后的组织切片表面蛋白质谱成像实验结果；A为不同浓度吐温80辅助消化后得到的肽段数量统计图，横坐标表示表面活性剂浓度，纵坐标表示肽段数量；B为吐温80辅助酶切与单纯不加非离子表面活性剂对照组的结果对比。
图3示出两种非离子表面活性剂混合物和不同浓度的曲拉通X-100辅助原位酶切后的组织切片表面蛋白质谱成像实验结果，横坐标表示表面活性剂浓度，纵坐标表示肽段数量。
图4示出非离子表面活性剂辅助原位酶切后的组织切片表面蛋白质谱成像图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
(A)准备组织切片，用冰冻切片的方法制备冰冻切片，组织切片转移到载玻片上，依次用70％、100％乙醇溶液润洗切片表面，用于洗掉脂类等非氨基酸小分子，真空干燥；
(B)组织切片表面喷洒不同浓度的曲拉通X-100表面活性剂溶液，孵育16h，有助于切片表面蛋白暴露在外，真空抽干5min；
(C)组织切片表面均匀喷洒500ul 0.01mg/ml胰蛋白酶溶液，湿润环境下37℃反应2h，通过介面张力的作用，大大提高组织切片表面蛋白的酶与蛋白的酶切效率，真空抽干15min；
(D)组织切片表面均匀喷洒250ul 10mg/ml CHCA基质，真空抽干30min，质谱检测。平行实验对比没有喷洒表面活性剂(图中为simple列)的蛋白酶切结果，可以看到酶切后质谱成像的肽段数量都显著增加，如图3和图4。
实施例2
(A)准备组织切片，用冰冻切片的方法制备冰冻切片，组织切片转移到载玻片上，依次用70％、100％乙醇溶液润洗切片表面，用于洗掉脂类等非氨基酸小分子，真空干燥；
(B)组织切片表面喷洒不同浓度的土温80表面活性剂溶液，孵育16h，有助于切片表面蛋白暴露在外，真空抽干5min；
(C)组织切片表面均匀喷洒500ul 0.01mg/ml胰蛋白酶，湿润环境下37℃反应2h，通过介面张力的作用，大大提高组织切片表面蛋白的酶与蛋白的酶切效率，真空抽干15min；
(D)组织切片表面均匀喷洒250ul 10mg/ml CHCA基质，真空抽干30min，质谱检测。平行实验对比没有喷洒表面活性剂(图中为simple列)的蛋白酶切结果，可以看到酶切后质谱成像的肽段数量都显著增加，如图2和图3。
实施例3
(A)准备组织切片，用冰冻切片的方法制备冰冻切片，组织切片转移到载玻片上，依次用70％、100％乙醇溶液润洗切片表面，用于洗掉脂类等非氨基酸小分子，真空干燥；
(B)组织切片表面喷洒不同比例的曲拉通X-100/土温80表面活性剂溶液混合物(曲拉通X-100与土温80的质量比为：2:1，1:1，1:2，1:3)，孵育16h，有助于切片表面蛋白暴露在外，真空抽干5min；
(C)组织切片表面均匀喷洒500ul 0.01mg/ml胰蛋白酶，湿润环境下37℃反应2h，通过介面张力的作用，大大提高组织切片表面蛋白的酶与蛋白的酶切效率，真空抽干15min；
(D)组织切片表面均匀喷洒250ul 10mg/ml CHCA基质，真空抽干30min，质谱检测。平行实验对比没有喷洒表面活性剂的蛋白酶切结果，可以看到酶切后质谱成像的肽段数量都显著增加，如图3和图4。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将非离子表面活性剂溶液喷洒到生物组织切片表面，孵育；
(2)将蛋白酶溶液喷洒到生物组织切片表面，进行原位酶切。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂包括曲拉通、土温、壬基酚聚醚、聚山梨醇酯或椰油酰胺DEA中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂溶液的浓度为0.00001％-5％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，孵育时间为0h-24h，且不包括0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、梭菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白内切酶中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切的时间0h-18h，且不包括0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括制备生物组织切片的步骤，具体包括：用冰冻切片的方法将生物组织切片制成冰冻切片，然后将冰冻切片转移到载玻片上，依次用不同浓度的乙醇溶液润洗切片表面，干燥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，依次用70％，100％的乙醇溶液润洗切片表面。
9.一种蛋白质鉴定及质谱成像的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)基于权利要求1-8任一权利要求所述的方法在生物组织切片表面进行蛋白质原位酶切；
(2)将CHCA基质溶液喷洒在生物组织切片上，待基质干燥后进行质谱检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将扫描采集的质荷比结果导入成像软件中，通过图像重构技术处理，并与肽段-蛋白质组对应的蛋白质组库一一对应，选择合适的肽段得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。
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