CN110873766A - 筛选药物引起结构和相互作用变化蛋白质的质谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明专利涉及一种从复杂细胞或组织裂解蛋白质样品中快速筛选药物分子引起结构和相互作用变化的特定蛋白质的质谱分析方法。具体为一种“活性‑变性两步稳定同位素共价化学标记方法”，两步标记中使用的是同位素质量差异标记试剂，药物小分子引起了结构和相互作用变化的蛋白质在第一步活性标记过程中会引起变化区域标记效率的变化，从而在最终质谱定量结果中表现出同位素峰的差异。本方法为快速筛选复杂体系中药物分子结合而引起结构和相互作用变化的靶标蛋白质提供了一种全新的高通量质谱分析方法。

Description

筛选药物引起结构和相互作用变化蛋白质的质谱分析方法
技术领域
本发明属于一种快速筛选复杂体系中药物引起结构和相互作用变化蛋白质的质谱分析方法领域，具体涉及一种从复杂细胞或组织裂解蛋白质样品中快速筛选药物分子引起结构和相互作用变化的特定蛋白质的质谱分析新方法。
背景技术
蛋白质作为生命活动的执行者，几乎参与并控制生物体内所有生命活动。药物与蛋白质的结合会引起蛋白质结构的改变，如何有效地检测药物与蛋白质的相互作用在生物化学研究和药物开发中具有重要的作用。近年来，基于质谱技术的药物和蛋白质相互作用的分析方法逐渐发展起来。相比于其他技术如X射线晶体衍射和核磁共振，它不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制，并且能够达到高通量分析(文献1.Aebersold R,Mann M.Massspectrometry-based proteomics.Nature,2003,422(6928):198-207)。但是这些方法通常需要较为严苛的条件，例如限制性蛋白酶解技术需要严格控制酶解条件(文献2.Piazza I；Kochanowski K；Cappelletti V；et al.A Map of Protein-Metabolite InteractionsReveals Principles of Chemical Communication.Cell 2018,172(1-2),358-372)，交联质谱技术面临数据处理的困难(文献3.Ferber M,Kosinski J,Ori A,et al.Automatedstructure modeling of large protein assemblies using crosslinks as distancerestraints.Nature methods,2016,13(6):515-520)，基于活性分子探针的化学蛋白质组学技术需要设计与合成探针才能使其精准到达蛋白质结合区域(文献4.Bachovchin D A,Brown S J,Rosen H,et al.Identification of selective inhibitors ofuncharacterized enzymes by high-throughput screening with fluorescentactivity-based probes.Nature biotechnology,2009,27(4):387-394)。
还原二甲基化标记反应(文献5.Boersema P J,Raijmakers R,Lemeer S,etal.Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitativeproteomics.Nature protocols,2009,4(4):484-494)是一种高效稳定的共价化学标记方法，二甲基化标记不会改变赖氨酸残基的带电状态，使蛋白质能够保持原有蛋白质的结构与活性(文献6.(a)Huque M E,Vogel H J.Carbon-13NMR studies of the lysine sidechains of calmodulin and its proteolytic fragments.Journal of proteinchemistry,1993,12(6):695-707(b)Gerken T A,Jentoft J E,Jentoft N,etal.Intramolecular interactions of amino groups in 13C reductively methylatedhen egg-white lysozyme.Journal of Biological Chemistry,1982,257(6):2894-2900(c)Walter T S,Meier C,Assenberg R,et al.Lysine methylation as a routinerescue strategy for protein crystallization.Structure,2006,14(11):1617-1622)。本方法为一种“活性-变性两步稳定同位素共价化学标记方法”，即在保持蛋白质活性的条件下分别对细胞裂解蛋白质样品和添加了药物小分子并进行孵育的细胞裂解蛋白质样品进行第一步活性共价化学标记；标记完成后对两种样品分别进行蛋白质变性，再分别进行第二步变性共价化学标记。两步标记中使用的是同位素质量差异标记试剂，药物小分子引起了结构和相互作用变化的蛋白质在第一步活性标记过程中会引起变化区域标记效率的变化，从而在最终质谱定量结果中表现出同位素峰的差异。通过比较药物孵育前后蛋白质上赖氨酸位点的化学标记效率变化情况确定药物结合区域和结合蛋白的筛选，降低了分析难度并实现了高通量检测。
发明内容
本发明旨在提出一种从复杂细胞或组织裂解蛋白质样品中快速筛选药物分子引起结构和相互作用变化的特定蛋白质的质谱分析新方法，设计一种“活性-变性两步稳定同位素共价化学标记方法”，对孵育和未孵育药物分子的细胞或组织裂解活性蛋白质样品分别进行稳定同位素共价化学标记，通过质谱检测药物作用前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况确定药物相互作用的靶标蛋白质并确定其相互作用的区域。
该方法稳定高效、快速简便。具体的，采用活性-变性两步稳定同位素共价化学标记方法，对孵育和未孵育药物的蛋白质分别进行共价化学标记，在完成标记后，通过液相色谱-质谱联用分析得到含有赖氨酸的酶解肽段，分析得到特定标记多肽的标记效率。对孵育和未孵育药物条件下得到的标记效率，变化值≥10％，同时T检验得到的P值≤0.05时，则该赖氨酸所处区域与药物有显著相互作用；其他情况下，则该赖氨酸所在区域未与药物有明显相互作用。本方法为快速筛选复杂体系中药物分子结合而引起结构和相互作用变化的靶标蛋白质提供了一种全新的高通量质谱分析方法。
具体步骤如下：
(1)将蛋白质分散在pH为5.0～9.0，浓度为5～500mmol/L的HEPES缓冲液中，蛋白质浓度保持在0.01～10μg/mL之间；将蛋白质溶液和药物进行孵育，得到药物-蛋白质溶液；
(2)将上述步骤(1)中得到的蛋白质溶液或药物-蛋白质溶液中分别加入二甲基标记试剂1,在4～30℃下反应1～50min；
(3)对上述步骤(2)中的蛋白质溶液进行变性处理，然后再分别向体系中加入二甲基标记试剂2,在30～60℃下反应50～200min；
(4)向上述步骤(3)得到的溶液中加入100～1000mmol/L的NH4HCO3，终止标记反应。
(5)向上述步骤(4)得到的溶液加入Glu-C对蛋白质进行酶解处理，蛋白质与酶的比例保持在1：25～100之间，酶解温度控制20～37℃，酶解时间8～20h；
(6)对上述步骤(5)得到的溶液加入甲酸，使其pH为2～3，进行液相色谱分离和质谱检测；
(7)对上述步骤(6)得到的质谱数据进行数据库检索，根据赖氨酸所在多肽的峰面积或质谱鉴定谱图数计算得到该赖氨酸位点的标记效率；
步骤(1)所述的蛋白质为复杂生物样品中提取的蛋白质，包括各种组织、细胞、细菌、生物基质等；
步骤(2)所述的标记试剂1为NaBD3CN和13CD2O，浓度为0.01～100mmol/L；
步骤(3)所述的标记试剂2NaBH3CN和CH2O，浓度为0.01～100mmol/L；
步骤(3)所述的的变性处理包括但不限于加入有机溶剂、紫外光照、高温加热等。
本发明具有稳定高效、快速简便的优点，对结合和未结合药物的蛋白质分别进行活性-变性两步稳定同位素共价化学标记，通过质谱检测药物相互作用前后蛋白质上赖氨酸位点的化学标记效率变化情况确定药物结合区域和结合蛋白的筛选，降低了分析难度并实现了高通量检测。将该方法应用于复杂生物样品中达沙替尼结合蛋白质的分析，鉴定到未被文献报道过的沙替尼结合蛋白质，表明本发明中所提出的方法为快速筛选复杂体系中药物分子结合而引起结构和相互作用变化的靶标蛋白质提供了一种全新的高通量质谱分析方法。
附图说明
图1为本方法的示意图，对结合和未结合药物的蛋白质分别进行活性-变性两步稳定同位素共价化学标记。
图2为实例1中复杂生物样品中鉴定到的蛋白质的火山图，对比孵育和未孵育达沙替尼条件下赖氨酸的标记效率对应的蛋白质，横坐标为实验组与对照组标记效率的差值，纵坐标为-log10(p值)，黑色圆圈代表激酶。
具体实施方式
实施例1
复杂生物样品中达沙替尼结合蛋白质的筛选
取K562细胞(107个)，在活性状态下裂解细胞得到蛋白质溶液，使其浓度为1μg/μL，平均分成对照组和实验组，每组为3个样品。在实验组中加入25μmol/L的达沙替尼，将对照组和实验组均置于25℃恒温震荡混匀仪上，孵育30min。在上述样品中加入终浓度10mmol/L 13CD2O和20mmol/L NaBD3CN进行活性状态下的标记反应，在25℃反应30min。反应后迅速加入5倍体积的蛋白沉淀液(乙醇/丙酮/乙酸＝500/500/1，体积比)，在-20℃冰箱中过夜沉淀。用高速离心机在4℃，25,000g转速下分离沉淀的蛋白质，并用终浓度6mol/L盐酸胍和20mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.8)溶解。然后，在上述样品中分别加入终浓度40mmol/LCH2O和40mmol/L NaBH3CN进行变性状态下的标记反应，在25反应2h。将样品加入10,000NMWL离心过滤器中，并用终浓度6mol/L盐酸胍和100mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)洗涤两次。然后，加入5mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)将蛋白质在室温下还原20min，接着在室温避光下用终浓度10mmol/L IAA烷基化30分钟。再用100mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)洗涤蛋白质三次，加入Glu-C进行酶解，以酶与蛋白质质量比为1/25的比例在37℃下反应12小时。酶解得到的肽段样品中加入甲酸，使其pH为2～3，通过RPLC-MS/MS进行分析，得到的质谱数据进行谱图搜索和数据处理，从而得到蛋白质中赖氨酸在活性状态下的标记效率，进而筛选得到复杂生物样品中达沙替尼结合的蛋白质。
数据库检索得到代表赖氨酸所在标记肽段的峰面积或质谱鉴定谱图数的强度，标记试剂13CD2O和NaBD3CN对应的强度为IH，标记试剂CH2O和NaBH3CN对应的强度为IL，该肽段的总强度为IT，该赖氨酸位点的标记效率计算方法为1-IL/IT。
与对照组相比，实验组中测定的赖氨酸标记效率变化差值≥20％，同时T检验得到的P值≤0.05时，则认为该赖氨酸所处区域与达沙替尼有显著相互作用。结果表明，在总鉴定到的9250个赖氨酸位点，2372个蛋白中，与达沙替尼有显著相互作用的有225个赖氨酸位点，169个蛋白，其中，有56个蛋白是激酶(图2)。这169个蛋白均为未被报道过的达沙替尼作用蛋白，表明本发明中所提出的方法可以帮助在复杂体系中筛选到新的药物结合蛋白，同时确定作用位点。

Claims (10)

1.筛选药物引起结构和相互作用变化蛋白质的质谱分析方法，其特征在于：对孵育和未孵育药物分子的复杂生物样品裂解活性蛋白质样品分别进行稳定同位素共价化学标记，通过质谱检测药物作用前后蛋白质上赖氨酸位点的化学标记效率变化情况确定药物相互作用的靶标蛋白质并确定其相互作用的区域。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述的稳定同位素共价化学标记为一种“活性-变性两步稳定同位素共价化学标记方法”，即在保持蛋白质活性的条件下分别对复杂生物样品裂解蛋白质样品和添加了药物分子并进行孵育的复杂生物样品裂解蛋白质样品进行第一步活性共价化学标记；标记完成后对两种样品分别进行蛋白质变性，再分别进行第二步变性共价化学标记；两步标记中使用的是同位素质量差异标记试剂。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于：所述的复杂生物样品包括各种组织、细胞、细菌、生物基质等中的一种或二种以上。
4.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于：
(1)将复杂生物样品蛋白质样品分散在pH为5.0～9.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEAB)或磷酸盐缓冲液中，蛋白质浓度保持在0.01～10μg/μL之间；将蛋白质溶液分成二份；一份为蛋白质溶液，另一份中加入药物分子，将蛋白质溶液和添加药物分子的蛋白质溶液分别进行孵育，得到药物-蛋白质溶液、蛋白质溶液；
(2)将上述步骤(1)中得到的蛋白质溶液和药物-蛋白质溶液中分别加入同位素标记试剂1,在4～30℃下反应1～50min；
(3)对上述步骤(2)中的蛋白质溶液和药物-蛋白质溶液分别进行蛋白变性处理，然后再分别向体系中加入同位素标记试剂2,在30～60℃下反应50～200min；
(4)向上述步骤(3)得到的溶液中分别加入100～1000mmol/L的碳酸氢铵溶液，终止标记反应；
(5)向上述步骤(4)得到的溶液中分别加入蛋白酶酶解，在10～60℃下酶解4～40h；
(6)对上述步骤(5)得到的溶液中分别加入甲酸，使其pH为2～3，分别进行液相色谱分离和质谱检测；
(7)对上述步骤(6)得到的质谱数据进行数据库检索，根据赖氨酸所在标记肽段的峰面积或质谱鉴定谱图数计算得到该赖氨酸位点的标记效率。
5.根据权利要求1-3所述的稳定同位素共价化学标记试剂，其特征在于：所述标记试剂1为氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)和碳13氘代甲醛(13CD2O)；所述的标记试剂2为氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和甲醛(CH2O)；添加后于体系中的终浓度均为0.01～100mmol/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的变性处理包括加入有机溶剂、紫外光照、高温加热等中的一种或二种以上。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的蛋白酶为Glu-C、Trypsin、Chymotrypsin、Lys-C中的一种或二种以上。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：数据库检索得到代表赖氨酸所在标记肽段的峰面积或质谱鉴定谱图数的强度，标记试剂1对应的强度为IH，标记试剂2对应的强度为IL，该肽段的总强度为IT，该赖氨酸位点的标记效率计算方法为1-IL/IT。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：对比加入或不加入药物条件下分别得到的标记效率，两者变化差值≥10％，同时T检验得到的P值≤0.05时，则该赖氨酸所处区域与药物有显著相互作用；其他情况下，则该赖氨酸所在区域未与药物有明显相互作用。
10.根据权利要求1或4所述的分析方法，其特征在于：所述药物分子为化学合成药物，相对分子量小于1000的有机化合物；药物分子于药物-蛋白质溶液中的终浓度为1μmol/L～100mmol/L。
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