CN107219292A - 一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于利用蛋白质组学分析技术研究蛋白质微观构象的研究领域,涉及一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,具体为一种结合活性共价化学标记和质谱技术来检测蛋白质构象变化的方法,在整体蛋白质层次上对赖氨酸残基进行活性化学标记,随后进行蛋白质变性、酶解并用质谱进行检测,通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。该方法快速简单、稳定高效,能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化,在标记过程中蛋白质活性保持不变,不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制,能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下的构象。
Description
技术领域
本发明属于利用蛋白质组学分析技术研究蛋白质微观构象的研究领域,具体涉及一种活性共价化学标记和质谱检测技术相结合的方法,考察蛋白质构象以及赖氨酸在活性蛋白质中的局部结构微环境变化。
背景技术
质谱技术在提供蛋白质结构信息方面有着巨大优势,和其他技术如X射线晶体衍射和核磁共振相比,它不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制(文献1.Aebersold R,Mann M.Mass spectrometry-based proteomics.Nature,2003,422(6928):198-207)。在应用质谱技术考察蛋白质结构时,通常需要对蛋白质进行化学标记处理,而氢氘交换和共价化学标记是最常用的标记策略(文献2.Konermann L,Vahidi S,Sowole M A.Massspectrometry methods for studying structure and dynamics ofbiological macromolecules.Analytical chemistry,2013,86(1):213-232)。氢氘交换是一种活性标记的方法,不会改变蛋白质的生物活性。但是,氘氢的“回交(back exchange)”效应在很大程度上影响了这种方法的准确性(文献3.Scholten A,Visser N F C,van den Heuvel R H H,et al.Analysis of protein-protein interaction surfaces using acombination of efficient lysine acetylation and nanoLC-MALDI-MS/MSapplied to the E9:Im9bacteriotoxin-immunity protein complex.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2006,17(7):983-994)。相比之下,稳定共价标记策略通常是修饰具有高反应活性的氨基酸残基侧链,例如赖氨酸残基的侧链伯胺基团。然而,大多数共价标记方法为了确保较高标记效率需要使用高反应活性的酰胺化反应试剂,如N-acetyl-succinimide,sulfosuccinimidyl acetate和S-methylthioacetimidate,这些试剂会中和赖氨酸侧链的正电荷,影响蛋白质中的静电相互作用,从而导致标记后蛋白质结构的改变以及活性的丧失(文献4.Kvaratskhelia M,Miller J T,Budihas S R,et al.Identification of specific HIV-1reverse transcriptase contacts tothe viral RNA:tRNA complex by mass spectrometry and a primaryamine selective reagent.Proceedings of the National Academy ofSciences,2002,99(25):15988-15993)。结合活性共价化学标记和质谱检测技术研究蛋白质构象至今尚未有报道。
通过甲醛CH2O和氰基硼氢化钠NaBH3CN对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应(文献6.Boersema P J,Raijmakers R,Lemeer S,etal.Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling forquantitative proteomics.Nature protocols,2009,4(4):484-494)是一种高效稳定的共价化学标记方法,在核磁共振和X射线晶体衍射的研究中,已经证实这种方法不会改变蛋白质的结构与活性(文献7.(a)Gerken T A,Jentoft J E,Jentoft N,et al.Intramolecular interactions ofamino groups in 13C reductively methylated hen egg-white lysozyme.Journal of Biological Chemistry,1982,257(6):2894-2900(b)Walter T S,Meier C,Assenberg R,et al.Lysine methylation as aroutine rescue strategy for protein crystallization.Structure,2006,14(11):1617-1622)。此外,二甲基化标记后赖氨酸残基的带电状态不改变,因此这种方法也几乎不会引入人为的蛋白-蛋白相互作用(文献8.Huque M E,Vogel H J.Carbon-13NMR studies of the lysine sidechains of calmodulin and its proteolytic fragments.Journal ofprotein chemistry,1993,12(6):695-707)。迄今为止,活性二甲基化标记反应尚未与质谱检测技术结合用于研究蛋白质结构和相互作用。
发明内容
本发明旨在开发一种结合活性共价化学标记和质谱技术研究蛋白质构象变化的方法,将整体蛋白质活性二甲基化标记方法与质谱技术相结合,基于位于蛋白质表面的赖氨酸残基比掩埋在内部或有相互作用的赖氨酸残基更容易接近和标记,揭示蛋白质构象及赖氨酸局部结构微环境的相关信息。
本发明提供一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,具体为一种结合活性共价化学标记和质谱技术来检测蛋白质构象变化的方法:通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应,再用质谱技术检测赖氨酸残基的标记效率。
本发明提供的方法是利用在整体蛋白质层次上对赖氨酸残基进行活性化学标记,随后进行蛋白质变性、酶解并用质谱进行检测,通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。
具体的,对于构象发生变化的同种蛋白或蛋白复合物,分别在蛋白层次上通过甲醛和氰基硼氢化钠进行还原二甲基化标记反应,随后进行蛋白质溶液的变性和酶解得到肽段溶液,用色谱对肽段溶液进行分离再用质谱进行检测,通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。计算后若同一赖氨酸残基的标记效率相差25%以上,则视为蛋白质构象发生变化。所述蛋白质构象变化是指蛋白质原本紧密有序的空间结构变得松散,甚至部分氨基酸序列发生脱落。该方法快速简单、稳定高效,能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化,在标记过程中蛋白质活性保持不变,不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制,能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下的构象。
本发明提供但不限制于下述质谱技术检测蛋白质构象变化的方法:
(1)取蛋白质样品,溶于pH 7.0-8.0的HEPES溶液中,得到蛋白质溶液;
(2)向上述步骤(1)得到的蛋白质溶液中加入甲醛(CH2O)和氰基硼氢化钠(NaBH3CN);
(3)向上述步骤(2)得到的溶液中加入碳酸氢铵(NH4HCO3);
(4)将上述步骤(3)得到的溶液煮沸,使蛋白变性,然后加入蛋白酶,20-40℃水浴中酶解得到肽段溶液;
(5)对上述步骤(4)得到的酶解肽段溶液酸化处理,进行液相色谱分离和质谱检测;
(6)将上述步骤(5)得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算各个赖氨酸残基的标记效率。
本发明采用有机溶剂、紫外光照、高温加热等处理得到发生构象变化的蛋白质。
步骤(1)所述的标准蛋白质溶液的浓度为0.01-10μg/μL,较低的蛋白质浓度使得进行活性标记反应时速度较缓慢。
步骤(2)所述的CH2O和NaBH3CN的终浓度为0.01-100mmol/L,反应温度为4-40℃,反应时间为5-200min,保证蛋白保持活性,且能够体现位于蛋白质不同位置的赖氨酸残基的标记效率差异。
步骤(2)中甲醛和氰基硼氢化钠的摩尔浓度比的范围为1-10;
步骤(3)中碳酸氢铵与甲醛的摩尔浓度比的范围为10-100;
步骤(4)中煮沸温度控制在90-100℃范围内。
步骤(5)中所述液相色谱分离的具体步骤和参数条件为:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长);
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
步骤(5)中所述质谱检测的具体步骤和参数条件为:
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 400-2000);
分辨率:60000;
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s。
所有样品均按上述的液相色谱和质谱条件进行检测。
所述赖氨酸残基标记效率的计算方法是:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数;
或,L赖氨酸=(A1/A2)×100%
式中,L赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率,A1为质谱鉴定到的标记肽段的质谱检测峰面积,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总峰面积。
本发明的优点:
通过赖氨酸活性条件下共价化学标记的效率体现蛋白质构象的变化,赖氨酸标记效率通过质谱检测得到。该方法快速简单、稳定高效,能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化,在标记过程中蛋白质活性保持不变,不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制,能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下的构象。
附图说明
图1为本方法的示意图,在整体蛋白质层次上对赖氨酸残基进行活性化学标记,随后进行蛋白质变性、酶解并用质谱进行检测,通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。
图2为实施例1肌红蛋白和脱辅基肌红蛋白的紫外-可见光谱图,横坐标为测定波长,纵坐标为吸光度。
图3为实施例1肌红蛋白的结构图,来源于PDB文件1YMB。(1)Lys-46局部结构的微环境。(2)Lys-78局部结构的微环境。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1蛋白质样品的活性共价化学标记和质谱检测
选取肌红蛋白(Myoglobin,Mb)和脱辅基肌红蛋白(Apomyoglobin,ApoMb)为蛋白质样品。ApoMb是Mb脱去辅基血红素后的产物,二者的结构十分相近,除了ApoMb的EF、F和FG区结构变得松散(Eliezer D,Wright PE.Is apomyoglobin a molten globule?Structural characterizationby NMR.Journal of molecular biology,1996,263(4):531-538)。
(1)取Mb和ApoMb,质量分别为100μg,溶于1mL的20mmol/L pH7.0的HEPES溶液中,使溶液中蛋白质的浓度为0.1μg/μL;
(2)向上述步骤(1)得到的蛋白质溶液中加入3.2μL 4%CH2O和3.2μL 0.6mol/L NaBH3CN,使NaBH3CN的终浓度为2mmol/L,室温下反应30min;
(3)向上述步骤(2)得到的溶液中加入50μL 1mol/L NH4HCO3,至NH4HCO3的终浓度为50mmol/L,室温下反应20min;
(4)将上述步骤(3)得到的溶液在100℃煮沸3min,使蛋白变性,然后加入糜蛋白酶(Chymotrypsin),糜蛋白酶与蛋白质的质量比为1:25,37℃水浴中酶解5-6h,得到肽段溶液;
(5)对上述步骤(4)得到的酶解肽段溶液酸化处理,进行液相色谱分离和质谱检测,检测条件如下:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长);
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%B;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 400-2000);
分辨率:60000;
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s;
(6)将上述步骤(5)得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算各个赖氨酸残基的标记效率,计算方法如下:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的谱图数。
表1为Mb和ApoMb中赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数,L赖 氨酸为赖氨酸残基的标记效率。
根据表1可得出,大部分赖氨酸残基标记效率在Mb和ApoMb中一致(标记效率相差25%以上视为变化),这一结果与已知结论相符,即Mb和ApoMb的构象十分相近,除了ApoMb的EF、F和FG区结构变得松散。从表1中也可看出,极少数赖氨酸残基的标记效率在两种蛋白质中不一致,例如,Lys-46在Mb中标记效率为49%,而在ApoMb中为99%。还有Lys-78,在Mb中标记效率为69%,而在ApoMb中为95%。
表1
图2所示为Mb溶液和ApoMb溶液的紫外-可见光谱图。A410/A280小于5%时,可视为溶液中不含血红素,其中A410为血红素在410nm的吸收峰,A280为蛋白在280nm的吸收峰。根据图2所示,A410/A280,证明实验所制备的ApoMb较纯净,不含血红素。
图3所示为Mb的结构图,来源于PDB文件1YMB。由图3(1)可看出,在Mb中,Lys-46侧链的氨基与血红素的羰基形成氢键,因此标记效率较低;而在ApoMb中血红素被脱去后,这种相互作用不存在,因此Lys-46几乎被完全标记。由图3(2)可看出,在Mb中,Lys-78侧链的氨基与Glu-19侧链的羰基形成氢键,而Lys-78非常接近EF区,因此在ApoMb中这种相互作用被破坏,导致Lys-78的标记效率明显不同。前文已提及,Mb和ApoMb的构象十分相近,除了ApoMb的EF、F和FG区结构变得松散,Lys-46和Lys-78在Mb和ApoMb中标记效率的变化正体现了ApoMb相较于Mb在结构上的细微变化,说明这种结合活性共价化学标记和质谱技术研究蛋白质构象变化的方法是切实可行的,这种方法综合了化学标记和质谱技术在提供蛋白质结构信息上的优点,并且首次将还原性二甲基标记反应应用于蛋白质结构领域。
本发明涉及一种结合活性共价化学标记和质谱技术研究蛋白质构象变化的方法。该方法快速简单、稳定高效,赖氨酸残基标记效率的变化(25%以上)反应了蛋白质构象的变化,该方法能够用于考察蛋白质结构的细微构象变化,在标记过程中蛋白质活性保持不变,不受蛋白质大小、溶解度、纯度等限制,能够更加真实的反应蛋白质在生理活性状态下的构象。
Claims (10)
1.一种质谱技术检测蛋白质构象变化的方法,具体为一种结合活性共价化学标记和质谱技术来检测蛋白质构象变化的方法,其特征在于:在蛋白层次上,通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应,再用质谱技术检测赖氨酸残基的标记效率。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:将甲醛和氰基硼氢化钠加入蛋白质溶液中,随后进行蛋白质溶液的变性和酶解得到肽段溶液,用色谱对肽段溶液进行分离再用质谱进行检测,通过质谱的鉴定结果计算赖氨酸残基的标记效率。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:对于构象发生变化的同种蛋白或蛋白复合物,分别在蛋白层次上通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链上的伯胺进行还原二甲基化标记反应。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:
包括以下步骤:
(1)取蛋白质样品,溶于pH 7.0-8.0的HEPES溶液中,得到蛋白质溶液;
(2)向上述步骤(1)得到的蛋白质溶液中加入甲醛(CH2O)和氰基硼氢化钠(NaBH3CN);
(3)向上述步骤(2)得到的溶液中加入碳酸氢铵(NH4HCO3);
(4)将上述步骤(3)得到的溶液煮沸,使蛋白变性,然后加入蛋白酶,20-40℃水浴中酶解得到肽段溶液;
(5)对上述步骤(4)得到的酶解肽段溶液酸化处理,进行液相色谱分离和质谱检测;
(6)将上述步骤(5)得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算各个赖氨酸残基的标记效率。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:采用有机溶剂、紫外光照、高温加热的处理方式得到发生构象变化的蛋白质。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述蛋白质溶液的浓度为0.01-10μg/μL;
步骤(2)所述的CH2O和NaBH3CN的终浓度均为0.01-100mmol/L,反应温度为4-40℃,反应时间为5-200min。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)中甲醛和氰基硼氢化钠的摩尔浓度比的范围为1-10;
步骤(3)中碳酸氢铵与甲醛的摩尔浓度比的范围为10-100;
步骤(4)中煮沸温度控制在90-100℃范围内。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(5)中所述液相色谱分离的具体步骤和参数条件为:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱;
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%B;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
步骤(5)中所述质谱检测的具体步骤和参数条件为:
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 400-2000);
分辨率:60000;
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s;
所有样品均按上述的液相色谱和质谱条件进行检测。
9.根据权利要求1、2或4所述的方法,其特征在于:所述赖氨酸残基标记效率的计算方法是:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数;
或
L赖氨酸=(A1/A2)×100%
式中,L赖氨酸为赖氨酸残基的标记效率,A1为质谱鉴定到的标记肽段的质谱检测峰面积,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总峰面积。
10.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:所述蛋白质构象变化是指蛋白质原本紧密有序的空间结构变得松散,甚至部分氨基酸序列发生脱落。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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