CN118130592A - 一种基于光敏酶激活的靶向标记rna结合蛋白质的分析方法 - Google Patents

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CN118130592A CN202211540253.9A CN202211540253A CN118130592A CN 118130592 A CN118130592 A CN 118130592A CN 202211540253 A CN202211540253 A CN 202211540253A CN 118130592 A CN118130592 A CN 118130592A
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Abstract

本发明涉及一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法，实现RNA‑蛋白质复合物在特定亚细胞器中的靶向标记，从而进行亚细胞器靶向的RNA‑蛋白质复合物原位分析。该方法可在细胞原位水平上，实现活细胞中靶向亚细胞器内RBP的靶向捕获和富集，从而进行亚细胞器时空分辨的RNA结合蛋白质的动态变化精准解析。

Description

一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法
技术领域
本发明涉及一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法。
背景技术
RNA结合蛋白质(RBP)与细胞发育、分化等生物学过程密切相关，具有高度的空间异质性和动态性，分析亚细胞器RBP及结合位点的动态变化对于揭示其生物功能及重大疾病发生机制具有重要意义。
近年来，基于双水相萃取(参考文献：1.Trendel,J.；Schwarzl,T.；Horos,R.；Prakash,A.；Bateman,A.；Hentze,M.W.；Krijgsveld,J.,The Human RNA-BindingProteome and Its Dynamics during Translational Arrest.Cell2019,176(1-2),391-403.)、同位素代谢标记(参考文献：2.Bao,X.C.；Guo,X.P.；Yin,M.H.；Tariq,M.；Lai,Y.W.；Kanwal,S.；Zhou,J.J.；Li,N.；Lv,Y.；Pulido-Quetglas,C.；Wang,X.W.；Ji,L.；Khan,M.J.；Zhu,X.H.；Luo,Z.W.；Shao,C.W.；Lim,D.H.；Liu,X.；Li,N.；Wang,W.；He,M.H.；Liu,Y.L.；Ward,C.；Wang,T.；Zhang,G.；Wang,D.Y.；Yang,J.H.；Chen,Y.W.；Zhang,C.L.；Jauch,R.；Yang,Y.G.；Wang,Y.M.；Qin,B.M.；Anko,M.L.；Hutchins,A.P.；Sun,H.；Wang,H.T.；Fu,X.D.；Zhang,B.L.；Esteban,M.A.,Capturing the interactome of newly transcribedRNA.Nat.Methods 2018,15(3),213-220.)和RNA小分子探针(参考文献：3.Zhang,Z.；Liu,T.；Dong,H.Y.；Li,J.；Sun,H.F.；Qian,X.H.；Qin,W.J.,An RNA tagging approach forsystem-wide RNA-binding proteome profiling and dynamics investigation upontranscription inhibition.Nucleic Acids Res.2021,49(11),e65.)等RNA结合蛋白质富集技术被提出。利用这些技术，目前已获得涉及mRNA、rRNA、lincRNA等多种RNA类型的5000多个RNA结合蛋白质的规模化解析，包含3000个以上的非编码RNA结合蛋白质，为揭示RNA结合蛋白质的生物功能提供了重要的技术手段(参考文献：4.Zhao,D.；Wang,C.；Yan,S.；Chen,R.,Advances in the identification of long non-coding RNA bindingproteins.Anal.biochem.2022,639,114520.)。然而，RNA结合蛋白质在不同亚细胞器中存在广泛的功能异质性。现有的靶标RNA结合蛋白质生物学研究发现，在线粒体中，RNA结合蛋白质往往与转录翻译、多种代谢过程以及线粒体自噬有关；在细胞核中，往往与RNA的加工、剪切、转录、翻译相关；而在细胞质中，往往广泛参与了参与细胞识别，活化和信号转导通路的激活和开启以及基因表达的调控等生命过程(参考文献：5.Diaz-Munoz,M.D.；Osma-Garcia,I.C.,The RNA regulatory programs that govern lymphocyte developmentand function.WIRES RNA 2022,13(1),e1683.)。上述技术仅能在整体细胞水平上捕获RNA结合蛋白质，无法实现亚细胞器空间靶向的RNA结合蛋白质分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法。本发明通过发展一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法，实现在特定亚细胞器中或目标区域范围内的RNA结合蛋白质的捕获，从而进行亚细胞器时空分辨的RNA结合蛋白质的动态变化精准解析。
为了克服现有技术仅能在整体细胞水平上捕获RNA结合蛋白质，无法实现亚细胞器空间靶向的RNA结合蛋白质分析的问题。本发明通过发展一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法，实现活细胞中靶向亚细胞器内RBP的靶向捕获和富集，从而进行亚细胞器时空分辨的RNA结合蛋白质的动态变化精准解析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)构建生物兼容性的光敏酶系统；
2)将靶向探针用非质子极性溶剂、有机醇类、有机酸类中的一种或二种以上的有机溶剂配制成浓度为1mM-1M的溶液，加入至pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上细胞缓冲溶液中，使得标记探针终浓度为1mM-1M；
3)将细胞缓冲溶液加入细菌中共孵育1-60min后，通过波长为300nm-600nm的光照1光照1min-60min，利用光敏酶激活探针靶向标记RNA结合蛋白质；
4)用波长为200-300nm，能量为10-10000mj/cm2的光照2光照10s-5min引发RNA-蛋白质复合物交联反应；
5)靶向标记和交联反应完成后，用pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上的缓冲液清洗细菌；
6)用细胞刮消化或胰酶消化从而离心收集得到的细胞样品；
7)通过有机试剂裂解、机械裂解或反复冻融法等裂解方法中的一种或二种以上进行细胞的裂解；
8)加入两端具有不同活性基团的富集试剂，一端活性基团为叠氮或炔基基团，用于结合RNA-蛋白质复合物，另一端活性基团为磷酸根、生物素基团，用于富集RNA-蛋白质复合物；
9)采用异丙醇沉淀、丙酮沉淀或甲醇氯仿沉淀法进行RNA-蛋白质复合物沉淀，以去除多余未反应的富集试剂；
10)采用含有10mM-10M的十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍或者离子液体的一种或二种以上的中性或碱性缓冲液进行RNA-蛋白质复合物的溶解；其中，中性或碱性缓冲液为pH为7.0-10且浓度为10mM-10M的磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
11)将溶解的RNA-蛋白质复合物加入基质为琼脂糖凝胶球、磁球、PEG聚合物球等有机/无机材料中的一种或二种以上的富集材料；
12)使用浓度为0.5-10M的钠盐溶液、0.5-10M的钾盐溶液、10-1000mM的磷酸盐缓冲溶液、1-8M的尿素溶液、1-6M的盐酸胍溶液、1％-50％乙腈水溶液、1％-30％甲醇水溶液、1％-10％十二烷基磺酸钠溶液等中的一种或二种以上的盐溶液、有机溶剂或表面活性剂洗去富集材料上非特异性吸附的RNA-蛋白质复合物；
13)使用RNase A、RNase T1、RNase A I或者RNase Phy等中的一种或二种以上的RNA结合蛋白质洗脱溶液将富集材料上结合的靶向标记的RNA结合蛋白质释放出来；
14)60-100℃水浴下孵育1min-10h将蛋白质变性后，加入最终摩尔浓度为1-500mM的二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的一种或二种进行蛋白质样品的还原；
15)加入最终摩尔浓度为1-500mM的烷基化试剂碘代乙酸或碘乙酰胺对RNA结合蛋白质样品进行烷基化反应；
16)向靶向标记的RNA结合蛋白质样品中加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，进行蛋白酶解，蛋白质与蛋白酶的质量比为200:1–1:1，得到肽段；
17)对肽段进行除盐，冻干并复溶，进行质谱鉴定和数据检索。
该方法可在细胞原位水平上，实现活细胞中靶向亚细胞器内RBP的靶向捕获和富集，从而进行亚细胞器时空分辨的RNA结合蛋白质的动态变化精准解析。
本发明所述方法具有如下的优点：
1)反应原位：基于生物酶系统的亚细胞器靶向的RNA结合蛋白质分析方法，可实现活细胞中所有类型RNA结合蛋白质的原位标记和富集，保持了RNA-蛋白质复合物在生理状态下的状态及相互作用，对于弱相互作用及易解离的相互作用具有重要意义，从而提高RNA结合蛋白质的分析覆盖度；
2)反应具有时间特异性：基于生物酶系统的亚细胞器靶向的RNA结合蛋白质分析方法，通过两次光照实现了反应的可控性，反应随光照的进行而开展，光照停止反应立刻结束；
3)反应具有空间特异性：基于生物酶系统的亚细胞器靶向的RNA结合蛋白质分析方法，可在靶向亚细胞器或特定区域中实现RNA结合蛋白质的高效捕获和富集，从而实现空间分辨的RBP的规模化分析；
附图说明
图1为荧光图谱，标记探针标记成功的表征。
图2为探针标记结果，光敏酶细胞核特异性表达的荧光共聚焦表征。
具体实施方式
本发明提供下述实施例用于说明本发明，但并不限制本发明的保护范围，尽管参照所述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
MiniSOG序列为：
MEKSFVITDPRLPDNPIIFASDGFLELTEYSREEILGRNGRFLQGPETDQATVQKIRDAI RDQREITVQLINYTKSGKKFWNLLHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDG
SOPP2序列为：
MEKSFVITDPRLPDNPIIFASDGFLELTEYSREEILGRNGRFLQGPETDQATVQKIRDAI RDQREITVQLINYTKSGKKFLNLLHLQPMRDQKGELQYFIGVVLDG
GFP序列为：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK
实施例1
1)细胞株构建：将miniSOG基因(参考文献6.Wang,P.；Tang,W.；Li,Z.；Zou,Z.；Zhou,Y.；Li,R.；Xiong,T.；Wang,J.；Zou,P.,Mapping spatial transcriptome withlight-activated proximity-dependent RNA labeling.Nat Chem Biol 2019,15(11),1110-1119.参考文献7.Zhai,Y.；Huang,X.；Zhang,K.；Huang,Y.；Jiang,Y.；Cui,J.；Zhang,Z.；Chiu,C.K.C.；Zhong,W.；Li,G.,Spatiotemporal-resolved protein networksprofiling with photoactivation dependent proximity labeling.Nat Commun 2022,13(1),
4906.)通过pET21a载体转染进入HEK 293T细胞的细胞核中，进行细胞培养，培养至80％-90％密度；
2)探针标记：将靶向探针炔丙胺用DMSO配制成浓度为1M的溶液，用PBS缓冲盐溶液将标记探针稀释至终浓度为15mM，得细胞缓冲液；
将10ml细胞缓冲溶液加入1E7细胞中共孵育30min后，通过波长为300nm-600nm的光照1条件光照10min，利用光敏酶激活探针靶向标记RNA结合蛋白质，标记结果如图1所示；
3)RNA-蛋白质复合物交联：用波长为254nm，能量为250mj/cm2的光照2条件的紫外光照射细胞1min，引发细胞中RNA-蛋白质复合物交联反应；
4)细胞收获:靶向标记和交联反应完成后，用PBS缓冲盐溶液清洗细胞，离心收集得到的细胞，细胞数量为1E7；
5)RNA-蛋白质复合物提取：依次加入细胞体积5倍的PBS缓冲盐溶液，将细胞混匀，加入细胞体积3倍的甲苯，细胞体积2倍的氯仿后充分混合1min，将细胞裂解，通过16000g离心10min将细胞裂解液分为三层，取最上层的部分为RNA-蛋白质复合物；
6)点击反应：向提取的RNA-蛋白质复合物中加入20mM生物素-叠氮，终浓度为200μM；加入20mM CuSO4、160mM三(3-羟丙基三氮基甲基)胺以及500mM维生素C使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，60℃反应2h。
7)RNA-蛋白质复合物沉淀：向步骤6获得混合物中加入采用1ml异丙醇进行RNA-蛋白质复合物沉淀，-20度静置20min，离心沉淀为RNA-蛋白质复合物；
8)RNA-蛋白质复合物复溶：1E7细胞所获得的RNA-蛋白质复合物用1ml含有1M尿素的磷酸盐缓冲液溶解；
9)富集：将溶解的RNA-蛋白质复合物加入预先用PBS清洗的50μL键合有链霉亲和素的琼脂糖凝胶球(GE Healthcare，17-5113-01)的富集材料；
使用浓度为1M的钠盐溶液、1M的尿素溶液、10％乙腈水溶液清洗富集材料各1遍，再用水清洗3遍，每次清洗的体积为1ml，以洗去上非特异性吸附的RNA-蛋白质复合物；
10)洗脱：使用50ul 0.1ug/ml的RNase A将50μL富集材料上结合的靶向标记的RNA结合蛋白质释放出来；
11)蛋白质变性、还原、烷基化：90℃水浴下孵育30min将蛋白质变性后，加入最终摩尔浓度为8mM的二硫苏糖醇进行蛋白质样品的还原，室温1h；加入最终摩尔浓度为32mM的碘乙酰胺对RNA结合蛋白质样品进行烷基化反应，避光30min；
12)蛋白质酶解：向(11)步骤的溶液中加入蛋白质与蛋白酶的质量比为50:1的胰蛋白酶，在37℃下酶解12h，得到肽段；
13)对肽段进行除盐，冻干并0.1％FA复溶，进行质谱鉴定和数据检索。14)鉴定结果：鉴定到1305个RNA结合蛋白质，其中90％的被靶向标记到的蛋白质是位于细胞核的RNA结合蛋白质，鉴定结果如图2所示；。
实施例2
1)细胞株构建：将SOPP2基因通过pET21a载体转染进入HEK 293T细胞的细胞质中，进行细胞培养，培养至80％-90％密度；
2)探针标记：将靶向探针炔丙胺用DMSO配制成浓度为1M的溶液，用PBS缓冲盐溶液将标记探针稀释至终浓度为15mM，得细胞缓冲液；
a)将10ml细胞缓冲溶液加入1E7细胞中共孵育30min后，通过波长为300nm-600nm的光照1条件光照10min，利用光敏酶激活探针靶向标记RNA结合蛋白质；
3)RNA-蛋白质复合物交联：用波长为254nm，能量为250mj/cm2的光照2条件的紫外光照射细胞1min，引发细胞中RNA-蛋白质复合物交联反应；
4)细胞收获:靶向标记和交联反应完成后，用PBS缓冲盐溶液清洗细胞，离心收集得到的细胞，细胞数量为1E7；
5)RNA-蛋白质复合物提取：依次加入细胞体积5倍的PBS缓冲盐溶液，将细胞混匀，加入细胞体积3倍的甲苯，细胞体积2倍的氯仿后充分混合1min，将细胞裂解，通过16000g离心10min将细胞裂解液分为三层，取最上层的部分为RNA-蛋白质复合物；
6)点击反应：向提取的RNA-蛋白质复合物中加入20mM Biotin-Azide，终浓度为200μM；加入20mM CuSO4、160mM三(3-羟丙基三氮基甲基)胺以及500mM维生素C使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，60℃
反应2h。
7)RNA-蛋白质复合物沉淀：向步骤6中加入采用1ml异丙醇进行RNA-蛋白质复合物沉淀，-20度静置20min，离心沉淀为RNA-蛋白质复合物；
8)RNA-蛋白质复合物复溶：1E7细胞所获得的RNA-蛋白质复合物用1ml含有1M尿素的磷酸盐缓冲液溶解；
9)富集：将溶解的RNA-蛋白质复合物加入预先用PBS清洗的50μL键合有链霉亲和素的琼脂糖凝胶球(GE Healthcare，17-5113-01)的富集材料；使用浓度为1M的钠盐溶液、1M的尿素溶液、10％乙腈水溶液清洗富集材料各1遍，再用水清洗3遍，每次清洗的体积为1ml，以洗去上非特异性吸附的RNA-蛋白质复合物；
10)洗脱：使用50ul 0.1ug/ml的RNase A将50μL富集材料上结合的靶向标记的RNA结合蛋白质释放出来；
11)蛋白质变性、还原、烷基化：90℃水浴下孵育30min将蛋白质变性后，加入最终摩尔浓度为8mM的二硫苏糖醇进行蛋白质样品的还原，室温1h；加入最终摩尔浓度为32mM的碘乙酰胺对RNA结合蛋白质样品进行烷基化反应，避光30min；
12)蛋白质酶解：向(11)步骤的溶液中加入蛋白质与蛋白酶的质量比为50:1的胰蛋白酶，在37℃下酶解12h，得到肽段；
13)对肽段进行除盐，冻干并0.1％FA复溶，进行质谱鉴定和数据检索。14)鉴定结果：鉴定到1379个RNA结合蛋白质，其中82％的被靶向标记到的蛋白质是位于细胞质的RNA结合蛋白质。
实施例3
1)细胞株构建：将miniSOG基因通过pET21a载体转染进入HEK 293T细胞的线粒体中，进行细胞培养，培养至80％-90％密度；
2)探针标记：将靶向探针炔丙胺用DMSO配制成浓度为1M的溶液，用PBS缓冲盐溶液将标记探针稀释至终浓度为15mM，得细胞缓冲液；
a)将10ml细胞缓冲溶液加入1E7细胞中共孵育30min后，通过波长为300nm-600nm的光照1条件光照10min，利用光敏酶激活探针靶向标记RNA结合蛋白质；
3)RNA-蛋白质复合物交联：用波长为254nm，能量为250mj/cm2的光照2条件的紫外光照射细胞1min，引发细胞中RNA-蛋白质复合物交联反应；
4)细胞收获:靶向标记和交联反应完成后，用PBS缓冲盐溶液清洗细胞，离心收集得到的细胞，细胞数量为1E7；
5)RNA-蛋白质复合物提取：依次加入细胞体积5倍的PBS缓冲盐溶液，将细胞混匀，加入细胞体积3倍的甲苯，细胞体积2倍的氯仿后充分混合1min，将细胞裂解，通过16000g离心10min将细胞裂解液分为三层，取最上层的部分为RNA-蛋白质复合物；
6)点击反应：向提取的RNA-蛋白质复合物中加入20mM Biotin-Azide，终浓度为200μM；加入20mM CuSO4、160mM三(3-羟丙基三氮基甲基)胺以及500mM维生素C使其终浓度分别为100μM、800μM和2.5mM，60℃
反应2h。
7)RNA-蛋白质复合物沉淀：向步骤6中加入采用1ml异丙醇进行RNA-蛋白质复合物沉淀，-20度静置20min，离心沉淀为RNA-蛋白质复合物；
8)RNA-蛋白质复合物复溶：1E7细胞所获得的RNA-蛋白质复合物用1ml含有1M尿素的磷酸盐缓冲液溶解；
9)富集：将溶解的RNA-蛋白质复合物加入预先用PBS清洗的50μL键合有链霉亲和素的琼脂糖凝胶球(GE Healthcare，17-5113-01)的富集材料；使用浓度为1M的钠盐溶液、1M的尿素溶液、10％乙腈水溶液清洗富集材料各1遍，再用水清洗3遍，每次清洗的体积为1ml，以洗去上非特异性吸附的RNA-蛋白质复合物；
10)洗脱：使用50ul 0.1ug/ml的RNase A将50μL富集材料上结合的靶向标记的RNA结合蛋白质释放出来；
11)蛋白质变性、还原、烷基化：90℃水浴下孵育30min将蛋白质变性后，加入最终摩尔浓度为8mM的二硫苏糖醇进行蛋白质样品的还原，室温1h；加入最终摩尔浓度为32mM的碘乙酰胺对RNA结合蛋白质样品进行烷基化反应，避光30min；
12)蛋白质酶解：向(11)步骤的溶液中加入蛋白质与蛋白酶的质量比为50:1的胰蛋白酶，在37℃下酶解12h，得到肽段；
13)对肽段进行除盐，冻干并0.1％FA复溶，进行质谱鉴定和数据检索。鉴定结果：鉴定到335个RNA结合蛋白质，其中95％的被靶向标记到的蛋白质是位于线粒体的RNA结合蛋白质。

Claims (8)

1.一种基于光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析方法，其特征在于：
在光敏酶激活的靶向标记RNA结合蛋白质的分析中，通过使用光敏酶激活靶向探针炔丙胺的方式，使探针标记特定亚细胞器或特定区域的RNA结合蛋白质，通过富集的方式将靶向标记的RNA结合蛋白质从全蛋白质组中提取出来，再进行质谱鉴定，实现特定亚细胞器或特定区域的RNA结合蛋白质分析。
2.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：
1)取能够稳定表达光敏酶的稳转细胞株；
2)将靶向探针炔丙胺用有机溶剂配成溶液，加入至其中转染有miniSOG、SOPP2或者GFP等生物酶基因的细胞缓冲溶液中，将细胞缓冲溶液加入细胞中共孵育后，通过光照利用光敏酶激活探针靶向标记RNA结合蛋白质；
3)接着通过光照引发RNA-蛋白质复合物交联反应；
4)靶向标记和交联反应完成后，用缓冲液清洗细胞，收集细胞，进行细胞的裂解和RNA-蛋白质复合物的提取；
5)加入富集试剂，使RNA-蛋白质复合物修饰上可富集基团；进行RNA-蛋白质复合物沉淀，以去除多余未反应的富集试剂；
6)采用中性或碱性缓冲液或水配置的溶解液来溶解RNA-蛋白质复合物；
7)将溶解的RNA-蛋白质复合物加入富集材料，使用盐溶液、有机溶剂或表面活性剂中的一种或二种以上洗去富集材料上非特异性吸附的RNA-蛋白质复合物，使用RNA结合蛋白质洗脱溶液将富集材料上结合的靶向标记的RNA结合蛋白质释放出来；
8)高温孵育后，加入还原剂，以进行蛋白质样品的变性及还原，接着加入烷基化试剂对RNA结合蛋白质样品进行烷基化反应后，向靶向标记的RNA结合蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行蛋白酶解，得到肽段，对肽段进行除盐，冻干并复溶，进行质谱鉴定和数据检索。
3.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤(1)过程为，所述的生物兼容性光敏酶为miniSOG、SOPP2或者GFP等生物酶基因；将生物酶基因通过pET21a载体转染进入HEK293T细胞进行培养，得到能够稳定表达生物酶的稳转细胞株。
4.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的有机溶剂，为非质子极性溶剂、有机醇、有机酸中的一种或二种以上，靶向探针炔丙胺浓度为1mM-1M；
步骤(2)中所述的其中转染有miniSOG、SOPP2或者GFP等基因的细胞缓冲溶液为常用缓冲溶液如为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；靶向标记试剂的终浓度为1mM-1M；孵育1-60min；光照的波长为300nm-600nm，光照时间为1min-60min；
步骤(3)中所述的激发RNA-蛋白质复合物交联反应光照所需波长，为200-300nm；光照处理能量为10-10000mj/cm2，处理时间为10s-5min。
5.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤(4)中所述的细胞缓冲溶液为常用缓冲溶液如为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
步骤(4)中所述收集细胞的过程为细胞刮消化或胰酶消化从而离心收集得到的细胞样品；
步骤(4)中所述细胞裂解的方法，裂解方法为有机试剂裂解、机械裂解或反复冻融法等裂解方法中的一种或二种以上；上述有机试剂裂解方法，于细胞中加入缓冲溶液即PBS、HEPES、HBS等中的一种或多种混匀后,加入有机试剂如甲苯、氯仿、甲醛等的一种或多种后再次混匀，结合离心方法对细胞进行裂解，同时使不同类型的生物大分子分离；
步骤(5)中所述的富集试剂二端具有不同的活性基团，一端活性基团为叠氮和/或炔基基团，用于结合RNA-蛋白质复合物，另一端活性基团为磷酸根和/或生物素基团，用于富集RNA-蛋白质复合物；
步骤(5)中所述的RNA-蛋白质复合物沉淀方法包括异丙醇沉淀、丙酮沉淀或甲醇氯仿沉淀法。
6.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：
步骤(6)中所述用于溶解RNA-蛋白质复合物溶解液为含有10mM-10M的十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍或者离子液体的一种或二种以上的中性或碱性缓冲液；
其中，中性或碱性缓冲液为pH为7.0-10且浓度为10mM-10M的磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；
步骤(7)中所述的富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、磁球、PEG聚合物球等有机/无机材料中的一种或二种以上；
步骤(7)中所述的非特异性吸附清洗溶液为浓度为0.5-10M的钠盐溶液、0.5-10M的钾盐溶液、10-1000mM的磷酸盐缓冲溶液、1-8M的尿素溶液、1-6M的盐酸胍溶液、1％-50％乙腈水溶液、1％-30％甲醇水溶液、1％-10％十二烷基磺酸钠溶液等中的一种或二种以上；
步骤(7)中所述的RNA结合蛋白质释放溶液为RNA酶中RNase A、RNase T1、RNase A I或者RNase Phy等中的一种或二种以上。
7.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤(8)中所述的高温孵育法，为将RNA结合蛋白质在60-100℃水浴下孵育1min-10h。
步骤(8)中所述的蛋白质还原试剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇中的一种或二种，溶解后最终摩尔浓度为1-500mM；
步骤(8)中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶解后最终摩尔浓度为1-500mM；
步骤(8)中所述的蛋白酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，蛋白质与蛋白酶的质量比为200:1–1:1。
8.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于，
所述细胞为通过构建克隆的方法将过氧化物酶与细胞器靶向肽或其中蛋白融合的细胞系中的一种；通过使用光敏酶激活靶向探针的方式，使探针标记特定亚细胞器或特定区域的RNA结合蛋白质，通过富集的方式将靶向标记的RNA结合蛋白质从全蛋白质组中提取出来，再进行质谱鉴定，实现更为丰富和全面的特定区域的RNA结合蛋白质分析。
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