CN110567788B - 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法 - Google Patents

一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110567788B
CN110567788B CN201910890560.1A CN201910890560A CN110567788B CN 110567788 B CN110567788 B CN 110567788B CN 201910890560 A CN201910890560 A CN 201910890560A CN 110567788 B CN110567788 B CN 110567788B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
protein
enrichment
reagent
protein complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910890560.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110567788A (zh
Inventor
秦伟捷
张万军
钱小红
张铮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy of military medicine, PLA Academy of Military Sciences
BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Original Assignee
BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER filed Critical BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Priority to CN201910890560.1A priority Critical patent/CN110567788B/zh
Publication of CN110567788A publication Critical patent/CN110567788A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110567788B publication Critical patent/CN110567788B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/08—Preparation using an enricher
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了一种RNA‑蛋白质复合物富集鉴定方法。所用PB试剂如式I所示，其在365nm波长紫外光照下可与RNA‑蛋白复合物中RNA的嘧啶碱基发生共价反应，从而实现RNA‑蛋白复合物的特异性富集。该富集方法具有如下优势：(1)能够无偏性的对各种不同类型的RNA及其蛋白复合物进行标记和富集，特别是对非编码RNA‑蛋白质复合物的富集鉴定在表观遗传研究领域具有重要意义；(2)PB试剂富集无需代谢标记，对细胞的正常生理状态扰动更少，而且标记效率更高；(3)可应用于组织样本中各种RNA‑蛋白质复合物的全面性研究，(4)乙二醇重复单元作为PB试剂中连接补骨脂素和生物素的连接臂，可有效降低空间位阻，提高链霉素修饰磁珠对RNA‑蛋白质复合物的富集效率。
Figure DDA0002208621770000011

Description

一种RNA-蛋白质复合物的富集和鉴定方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种RNA-蛋白质复合物的富集和鉴定方法。
背景技术
哺乳动物体内存在超过1000余种RNA结合蛋白(RNA Binding Proteins，RBPs)，其可与mRNA、非编码RNA等形成种类繁多、功能各异的复合物，调控着包括pre-mRNA剪切与编辑、RNA转运和定位，以及RNA的翻译和降解等一系列关键细胞功能。对该复合物中RNA与蛋白质的种类及含量进行规模化鉴定分析，对生理学和病理学研究具有十分重要的意义。尽管如此，由于内源性RNA-蛋白质复合物丰度非常低，并且缺乏共性特征，因此难以对特定生理、病理条件下动态变化的复合物实现准确全面的富集鉴定。近年广泛采用的方法是，在254nm波长紫外线照射下交联RNA和蛋白质后，利用寡聚脱氧胸苷[oligo(dT)]来富集带有poly(A)尾巴的信使RNA(mRNA)。但该方法存在较大局限，只能富集mRNA-蛋白质复合物，无法应用于缺乏poly(A)尾巴并在表观遗传调控中发挥关键作用的非编码RNA(non-coding-RNA)-蛋白质复合物研究。针对以上问题，近年来文献报道了基于核苷酸代谢标记在RNA上引入炔基标签，并通过“点击化学”反应进行全面的RNA-蛋白质富集的研究策略。在一定程度上突破了规模化非编码RNA-蛋白质复合物研究的技术瓶颈，但仍存在代谢标记效率有限(小于5％)，富集鉴定覆盖深度偏低、试剂成本高昂、无法应用于组织样本等一系列技术局限。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生理条件下RNA-蛋白质复合物的广谱性富集和鉴定新方法。
该方法通过补骨脂素基团对各种序列RNA的无偏性共价结合，实现PB试剂对紫外交联的RNA-蛋白质复合物的大规模富集。后续结合RNA测序和蛋白质组质谱分析，可以在细胞或组织样本水平实现RNA-蛋白质复合物的全面解析。
所述PB试剂包括三个组成部分，分别是补骨脂素基团、生物素基团以及连接所述补骨脂素基团和生物素基团的连接臂。
具体地，所述化合物的结构式如下述式I所示：
Figure BDA0002208621750000021
上述式I所示化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：使式II所示化合物与式III所示化合物进行酰胺化反应，得到式I所示化合物。
Figure BDA0002208621750000022
上述方法中，所述式II所示化合物与式III所示化合物的投料摩尔比可为1：1-2，具体可为1：1.5。
所述酰胺化反应在三乙胺(TEA)作为催化剂的条件下进行；所述三乙胺与式II所示化合物投料摩尔比为1：0.5-1.5，具体可为1：1。
所述酰胺化反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。
所述酰胺化反应的具体操作为：先将式III所示化合物和三乙胺(TEA)溶解于二氯甲烷(DCM)中，然后再加入式II所示化合物，室温过夜反应即可。
上述方法中，式II所示化合物可通过包括下述步骤的方法制备得到：
以羧基化的补骨脂素(式Ⅳ所示化合物)为起始原料，通过与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)的反应形成NHS酯化的补骨脂素，即式II所示化合物。
Figure BDA0002208621750000023
上述方法中，羧基化的补骨脂素与NHS、EDCI的摩尔比可为1：1-2：1-2，具体可为1：1.5：1.5。
所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。
所述反应的具体操作为：先将羧基化的补骨脂素和EDCI溶解于DCM中，反应10-20min后，再加入NHS，室温过夜反应即可。
本发明提供的方法流程(见图1)和原理如下：
培养皿中的细胞于254nm波长紫外光照射条件下，可使得相互作用的RNA和蛋白质形成共价交联复合物。细胞裂解后，交联的RNA-蛋白质复合物仍能保持其天然组成不变，加入PB试剂孵育后，使用365nm波长紫外光照射，促使PB试剂中的补骨脂素基团与RNA中的嘧啶碱基形成共价键，从而实现RNA-蛋白复合物的生物素化。然后将所得复合物样品与链霉亲和素修饰磁珠孵育，清洗除去非特异性吸附的蛋白与其他分子，即可实现RNA-蛋白质复合物的特异性富集。
后续如需进行蛋白质组学质谱分析，则可通过加入RNase A将复合物中的RNA水解为片段从而将RNA结合蛋白从磁珠上释放。
如需进行RNA测序，则可通过使用洗脱液洗脱复合物，并进一步使用蛋白酶K完全降解RNA结合蛋白后再进行测序分析。
为获得更为准确可靠的RNA结合蛋白鉴定结果，我们对对照组样品采用完全相同的实验条件，即254nm波长紫外光交联RNA-蛋白质，加入PB孵育后使用365nm波长紫外光交联PB与RNA，之后使用链霉亲和素修饰磁珠富集RNA-蛋白质复合物。但与实验组不同的是，对照组在清洗步骤中加入RNase A，从而水解RNA并将RNA结合蛋白从磁珠上去除。因此在后续洗脱中所得产物中将不再包含RNA结合蛋白，只包含与磁珠非特异性吸附的非RNA结合蛋白。在此基础上将实验组与对照组样品使用胰蛋白酶酶解为肽段后，再使用包含不同同位素的甲醛试剂对其分别进行同位素标记，将二者混合后进行质谱分析。从而可以通过实验组和对照组中鉴定蛋白质种类和含量的差异获得更为准确的RNA结合蛋白鉴定结果(对照组中未鉴定到或含量明显低于实验组的蛋白质则可认为是高可信的RNA结合蛋白)。
组织中的RNA-蛋白质复合物富集鉴定，以小鼠肝脏为例。选取6-8周雄性C57BL/6N小鼠，解刨后获取其肝组织，液氮冷冻，-80℃保存备用。在冷冻包埋模具中放入冷冻的组织进行包埋。将冷冻包埋的组织样品转入切片机，调整切片厚度为8μm，进行切片。将组织切片转移至培养皿中并置于冰上进行紫外交联。完成后将组织样品转移至离心管中，加入裂解液并匀浆进行蛋白质提取。在所提取的蛋白质中加入PB试剂，采用与细胞实验中相同的条件进行孵育和365nm紫外光交联。
上述方法中，所用254nm波长紫外交联功率为40W，照射时间为0.5-2min，具体可为1min。裂解细胞后，PB试剂工作浓度为20-100μM，具体可为50μM。PB试剂孵育时间为10-30min，具体可为20min；PB试剂孵育的温度为4℃。365nm波长紫外交联功率为150W，照射时间为1-5min，具体可为4min。所述复合物样品与链霉亲和素修饰磁珠孵育完成后，可通过磁性分离收集磁珠并弃去上清液，磁珠依次分别用200μL0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 8M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液各清洗一次。通过磁分离弃去上清液，获得捕获了RNA-蛋白质复合物的磁珠。
所用试剂都应采用RNase-free的溶液进行配置，所用离心管均采用RNase-free规格。后续如进行蛋白质组分析，则可加入20μL 0.01μg/μL RNase A(PBS)，于37℃孵育1h，通过水解RNA的方式释放所富集的RNA结合蛋白并进行质谱分析。后续如进行RNA测序，则先使用洗脱液将纯化后的RNA-蛋白质复合物从磁珠洗脱，加入蛋白酶K水解蛋白质，即可得到RNA。进行cDNA文库构建后并纯化文库后即可进行RNA测序分析。所采用的洗脱液具体组成如下：12.5mM生物素，75mM NaCl，7.5mMTris·HCl(pH 7.5)，1.5mM EDTA，0.15％SDS，0.075％十二烷基肌氨酸钠及0.02％脱氧胆酸钠。
本发明提供了一种基于PB化学标记的RNA-蛋白质复合物富集鉴定新方法。所用PB试剂一端为生物素基团，可以特异性地与商业化的链霉亲和素磁珠结合；另一端为补骨脂素基团，在365nm紫外光照下可与RNA-蛋白复合物中RNA的嘧啶碱基发生共价反应，从而实现RNA-蛋白复合物的特异性富集。
与现有的富集方法相比，本发明的方法具有四大优势：
(1)相较于经典的利用mRNA的poly(A)序列的富集方法，基于PB试剂标记的策略能够无偏性的对各种不同类型的RNA及其蛋白复合物进行标记和富集，获得的信息更加全面，特别是对非编码RNA-蛋白质复合物的富集鉴定在表观遗传研究领域具有重要意义。
(2)相比于通过代谢标记在RNA上引入炔基基团的富集策略，PB试剂富集无需代谢标记，对细胞的正常生理状态扰动更少，而且标记效率更高。
(3)该策略可应用于组织样本中各种RNA-蛋白质复合物的全面性研究，这是现有富集鉴定方法难以实现的。
(4)乙二醇重复单元作为PB试剂中连接补骨脂素和生物素的连接臂，可有效降低空间位阻，提高链霉素修饰磁珠对RNA-蛋白质复合物的富集效率。
附图说明
图1为本发明RNA-蛋白质富集方法的实验流程图。
图2为所合成PB试剂的核磁共振氢谱。
图3为本发明方法对HeLa细胞中RNA-蛋白质复合物富集产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中图3A中对照组为实验过程中未加入254nm紫外照射或未加入PB试剂处理，图3B中对照组为实验清洗步骤中加入RNaseA处理或洗脱步骤中不加入RNaseA处理。
图4为本发明方法对HeLa细胞中RNA-蛋白质复合物的RNA富集并测序分析得到的RNA种类分布图。
图5为本发明方法对HeLa细胞中RNA-蛋白质复合物的RNA结合蛋白进行富集和质谱鉴定的实验流程图。
图6A为本发明方法鉴定的HeLa细胞中RNA结合蛋白的火山图(实验组与对照组蛋白质定量差异图)；图6B为对所鉴定符合卡值标准的RNA结合蛋白的GOMolecular Function分析，得到的最富集的10个条目。
图7为本发明方法三次技术重复组所得RNA结合蛋白的定量重现性评价图；右上部分方框内的数字表示相应两组技术重复所鉴定RNA结合蛋白，其各自富集比例(实验组比对照组)之间的Pearson相关系数。
图8为本发明方法所鉴定的RNA结合蛋白与其他文献报道的mRNA结合蛋白数据库的重叠维恩图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、PB试剂富集细胞中RNA-蛋白质复合物的效果评价
培养在15-cm培养皿中的HeLa细胞在大约80％覆板率时，除去培养皿中的培养基，使用PBS润洗细胞3次(每次5mL)。将培养皿中的溶液吸干后将培养皿置于冰上进行紫外光交联。紫外光波长为254nm，功率为40W，照射时间为1min。加入冰PBS溶液，使用细胞刮刀收集细胞于2mL RNase-free离心管中，1,000g离心3min，弃去上清液。加入250μL裂解液I[PBS,0.5％(w/v)SDS,EDTA-free protease inhibitormixture(Thermo),ribonucleosidevanadyl complex(NEB)]后，将离心管置于冰上，用带有细针头(～0.7mm)的注射器进行充分匀浆，静置20min。加入1mL裂解液II(PBS,0.1％triton-100,EDTA-free proteaseinhibitor mixture,ribonucleoside vanadyl complex)，置于冰上，用带有细针头(～0.7mm)的注射器进行充分匀浆，静置20min。将裂解后的细胞于10,000离心10min，上清液转移至15mL Rnase-free离心管中。加入PB试剂(终浓度为50μM)，于4℃孵育20min，然后置于冰上，进行紫外光交联。紫外光波长为365nm，功率为150W，照射时间为4min。采用AmiconUltra-15超滤离心管(截留分子量10kDa，Millipore)将上述溶液浓缩至100μL，用500μL冰PBS溶液清洗三次。然后加入2M尿素使得总体积大约为500μL。加入100μL链霉亲和素固载磁珠(Thermo)，于4℃孵育1h。通过磁性分离弃去上清液，磁珠依次分别用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 8M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液各清洗一次。通过磁分离弃去上清液，加入含有20μL 0.01μg/μL RNase A的PBS溶液，于37℃孵育1h。加入5μL 5×NuPAGE LDS上样缓冲液，95o变性10min，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。所用试剂都应采用RNase-free的溶液进行配置，所用离心管均采用RNase-free规格。
如图3A所示，与实验组相比，未加入PB试剂的对照组蛋白条带明显较少，证明PB试剂在RNA-蛋白质复合物的富集中起到关键作用。此外，实验过程中没有254nm紫外光照的对照组蛋白条带也相对较少，是因为没有254nm紫外交联RNA-蛋白质无法形成稳定的复合物，而仅仅依靠二者的生理性弱相互作用无法承受细胞裂解、磁珠富集和反复清洗的扰动，造成复合物中的蛋白质丢失。同时也证明PB与RNA偶联时所用的365nm紫外光无法交联RNA与蛋白质，不会引入假阳性结果。
如图3B所示，与实验组相比，清洗步骤中加入RNase A处理、并弃去清洗液的对照组蛋白条带明显减少。这是由于磁珠捕获的RNA-蛋白质复合物在RNase A处理下RNA发生水解，蛋白质脱落，大部分蛋白质在清洗中被去除，仅有少量非特异性吸附在磁珠上。以上实验证明了PB试剂对于RNA结合蛋白具有很好的选择性以及富集效果。
实施例2、PB试剂富集细胞中RNA-蛋白质复合物的RNA测序分析
采用与实施例1中相同的实验条件，通过磁珠捕获RNA-蛋白质复合物后，通过磁性分离弃去上清液，磁珠依次分别用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 8M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液各清洗一次。加入400μL洗脱液[12.5mM生物素，75mM NaCl，7.5mMTris·HCl(pH 7.5)，1.5mM EDTA，0.15％SDS，0.075％十二烷基肌氨酸钠及0.02％脱氧胆酸钠]，在室温涡旋20分钟(800rpm)。然后在恒温涡旋仪上65℃涡旋10分钟(800rpm)。洗脱过一次的微珠再加入新的400μl洗脱液重复上述洗脱步骤。合并两次洗脱液得到总共800μl溶液。加入2mg/mL蛋白酶K在55℃酶切1小时。将复合物中的蛋白质完全降解之后用TRIzol溶液进一步提取RNA。每组实验各设置3个独立的生物学重复，每次重复实验中取用1.5μg提纯的RNA。使用
Figure BDA0002208621750000061
UltraTM RNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002208621750000062
(NEB)进行cDNA文库构建。文库用AMPure XP磁珠(Beckman)纯化后利用Bioanalyzer 2100system(Agilent)进行质检。文库测序在Illumina Hiseq 4000平台上进行，测序模式为150bp双端测序。
如图4所示，本发明提供方法所富集的RNA不仅包含编码RNA(mRNA)，同时也包括各种不同类型的非编码RNA。证明相较于利用mRNA的poly(A)尾序列进行mRNA-蛋白质复合物富集的经典方法，本发明提供的方法能够对不同类型的RNA-蛋白质复合物进行富集，从而获得更加全面的RNA和蛋白质信息。
实施例3、PB试剂富集细胞中RNA-蛋白质复合物的蛋白质组质谱分析
实验流程如图5所示。
实验组：采用与实施例1中相同的实验条件，通过磁珠捕获获得纯化的RNA-蛋白质复合物后，通过磁性分离弃去上清液，磁珠依次分别用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 8M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液、200μL 50mM NH4HCO3各清洗一次。通过磁分离弃去上清液，加入20μL 0.01μg/μL RNase A(50mM NH4HCO3)，于37℃孵育1h。然后进行胰蛋白酶酶解，具体操作如下：加入10mM(终浓度)二硫苏糖醇56℃水浴中还原1小时，之后加入50mM(终浓度)碘乙酰胺于暗处放置30min进行烷基化处理，取变性后的蛋白加入0.02μg胰蛋白酶，放置于37℃水浴孵育12小时，通过磁性分离弃去磁珠后获取上清液及其中的酶解产物。酶解产物肽段经过C18Zip-Tips脱盐小柱脱盐，洗脱液冷冻干燥后备用。
对照组：取与实验组等量的细胞，除了磁珠捕获RNA-蛋白质复合物后的清洗步骤外其他操作与实验组完全相同。在清洗步骤中，磁珠用200μL PBS溶液清洗两次。通过磁性分离弃去上清液，加入100μL 0.01μg/μL RNase A(PBS)，于37℃孵育1h。通过磁性分离弃去上清液，磁珠依次分别用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL8M尿素的PBS溶液、200μLPBS溶液、200μL 50mM NH4HCO3各清洗一次。
干燥后的肽段使用200μL的100mM三乙基碳酸氢铵(triethyl ammoniumbicarbonate，TEAB，pH 8.5)溶液溶解。溶解后的肽段进行稳定同位素二甲基化标记。实验组的肽段与对照组的肽段按照实验设计分别进行重同位素标记(重标)或轻同位素标记(轻标)。其中需要轻标的肽段中加入8μL 4％CH2O及8μL 0.6M的氰基硼氢化钠。需要重标的肽段中加入8μL 4％CD2O及8μL 0.6M的氰基硼氢化钠。所有标记肽段在室温下反应1小时。反应完成后先后加入32μL 1％氨水及16μL甲酸淬灭反应。将实验组和对照组样品按照肽段质量比1:1混合后，经过C18Zip-Tips脱盐小柱脱盐，洗脱液冷冻干燥后，使用0.1％甲酸溶液重溶，进行蛋白组学质谱分析。
质谱分析：使用纳升液相色谱(EASY-nLC 1000)与生物质谱(Orbitrap FusionLumos Tribrid)联用对样本进行质谱分析。其中，液相色谱使用C18反向色谱填料装填的柱(填料直径1.9μm,色谱柱内径150μm)，并以600nL/min的流速来实现样品的分离。一级质谱分析的扫描范围设置为300-1400m/z，分辨率为120，000。二级质谱分析选择数据依赖性扫描模式，高能碰撞解离(HCD)碎裂模式的能量设置为35％。
质谱数据分析：质谱原始数据使用MaxQuant软件进行搜库解析。蛋白酶切模式设置为“胰蛋白/P”，并允许每个肽段中最多含有2个漏切(missed cleavage)，每个肽段最少含有6个氨基酸残基。脲甲基修饰半胱氨酸(carbamidomethyl cycteine，即被碘乙酰胺封闭的半胱氨酸)被设为固定修饰，氧化甲硫氨酸和N端乙酰修饰被设为可变修饰。对于蛋白质鉴定，FDR上限设为0.01，并且每个蛋白质需要鉴定到至少两条独有的肽段才认为是可靠的鉴定结果。我们筛选了实验组中在三次重复中，至少鉴定到两次的蛋白质与对照组中的对应蛋白质定量比较进行差异分析。差异分析使用的软件是Perseus，通过计算蛋白质在实验组与对照组中的平均Log2(富集比例)以及P值实现差异蛋白质筛选。将P值小于0.01、且富集比例大于等于2的蛋白质认为是高置信的RNA结合蛋白。如图6所示，本发明提供的方法鉴定出2622个高置信的RNA结合蛋白。对这些蛋白进行GO功能分析，结果表明最富集的条目中绝大部分都是与RNA相关，进一步证明了该方法的可靠性和选择性。我们进一步将三次技术重复所得RNA结合蛋白在实验组和对照组中的富集比例两两之间进行相关性分析，结果如图7所示。各次技术重复之间的相关性可达0.7以上，证明该技术的实验重复性良好，可信度高。如图8所示，本发明所提供方法鉴定到的RNA结合蛋白种类有效覆盖了文献报道的，利用mRNA的poly(A)尾进行RNA-蛋白质复合物富集所得的RNA结合蛋白，并且新发现了1800种RNA结合蛋白，进一步证明该方法在RNA-蛋白质复合物规模化富集方面的高选择性和广谱型。
实施例4、PB试剂富集组织中RNA-蛋白质复合物的蛋白质组质谱分析
以小鼠肝脏为例。选取6-8周雄性C57BL/6N小鼠，解剖后获取其肝组织，液氮冷冻，-80℃保存备用。在冷冻包埋模具中涂覆一层包埋剂(包含10.24％聚乙烯醇和4.26％聚乙二醇的水溶液)后将组织块放入，冷冻后使用包埋剂将组织块包埋。将包埋后的组织块转入切片机并调整切片厚度为8μm，进行切片。收集100片组织切片转移至培养皿中并置于冰上进行紫外交联，紫外光波长为254nm，功率为40W，照射时间为1min。完成后加入少量PBS溶液并将样品转移至50mL离心管中，10000g 4℃离心，去除上清。使用1mL PBS溶液将沉淀重溶并转移至2mL离心管中，离心去除上清后，加入250μL裂解液I(PBS,0.5％(w/v)SDS,EDTA-free protease inhibitor mixture(Thermo)，ribonucleoside vanadyl complex(NEB))，并使用1mL注射器反复抽吸8-9次使其均质，冰上裂解20min；再加入1mL裂解液II(PBS,0.1％triton-100,EDTA-free protease inhibitor mixture,ribonucleoside vanadylcomplex)，使用1mL注射器反复抽吸8-9次使其均质，冰上裂解20min。16000g 4℃离心15min，取上清转移到新的离心管中后加入PB试剂(终浓度为50μM)，采用与细胞实验中相同的条件进行孵育和365nm紫外光交联。后续RNA-蛋白质复合物富集、蛋白质酶解、质谱分析条件、数据处理方法以及对照组设计等均与实施例3所述相同。在三次重复实验中我们共计获得了1222个高可信的小鼠肝脏RNA结合蛋白，进一步证明了该发明在组织样本中的应用潜力。

Claims (9)

1.PB试剂在RNA-蛋白质复合物富集中的应用；
所述PB试剂包括三个组成部分，分别是补骨脂素基团、生物素基团以及连接所述补骨脂素基团和生物素基团的连接臂；
所述PB试剂的结构式如式I所示：
Figure 42675DEST_PATH_IMAGE001
（式I）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述RNA-蛋白质复合物包括mRNA-蛋白质复合物和非编码RNA-蛋白质复合物；
或，所述RNA-蛋白质复合物为细胞或组织样品中的RNA-蛋白质复合物。
3.一种RNA-蛋白质复合物的富集方法，包括下述步骤：
1）先采用254nm波长紫外光照射细胞或组织，使其中的RNA和蛋白质形成共价交联的RNA-蛋白质复合物；
2）使所述细胞或组织进行裂解，并在得到的上清液中加入权利要求1中所述PB试剂进行孵育，然后再在365nm波长紫外光照下使所述PB试剂与所述RNA-蛋白质复合物中的RNA发生共价偶联，得到复合物样品；
3）将所述复合物样品与链霉亲和素修饰磁珠孵育，孵育结束后收集磁珠并清洗，获得捕获了RNA-蛋白质复合物的磁珠，即实现RNA-蛋白质复合物的特异性富集。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述254nm波长紫外光照射的功率为40W，照射时间为0.5-2min；
所述步骤2）中，所述PB试剂的工作浓度为20-100μM；所述PB试剂的孵育的时间为10-30min，孵育的温度为4oC；所述365nm波长紫外光照的功率为150W，照射时间为1-5min；
所述步骤3）中，所述磁珠通过磁性分离收集；
所述清洗的方法如下：依次分别用200μL 0.2% (w/v) SDS的PBS溶液、200μL 8M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液各清洗一次。
5.权利要求1所述的PB试剂在RNA-蛋白质复合物富集和RNA结合蛋白质谱鉴定中的应用。
6.一种对RNA-蛋白质复合物中RNA结合蛋白进行蛋白质组学质谱分析的方法，包括下述步骤：
a1)采用权利要求3或4的方法对细胞或组织中的RNA-蛋白质复合物进行富集，得到捕获了RNA-蛋白质复合物的磁珠；
b1)在所述RNA-蛋白质复合物的磁珠中加入RNA酶，通过水解RNA的方式释放所富集的RNA结合蛋白并进行质谱分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括设置对照组的步骤，具体如下：在步骤a1）所述富集结束后，在对RNA-蛋白质复合物的磁珠清洗步骤中加入RNA酶去除RNA结合蛋白，从而在对照组中只保留非特异性吸附的非RNA结合蛋白；通过质谱分析比较实验组和对照组所鉴定蛋白的定量差异，卡值扣除非特异性吸附的非RNA结合蛋白后，即可得到高置信度的RNA结合蛋白。
8.权利要求1所述的PB试剂在RNA-蛋白质复合物富集和RNA测序分析中的应用。
9.一种对RNA-蛋白质复合物中的RNA进行测序分析的方法，包括下述步骤：
a2)采用权利要求3或4的方法对细胞或组织中的RNA-蛋白质复合物进行富集，得到捕获了RNA-蛋白质复合物的磁珠；
b2)采用洗脱液对所述RNA-蛋白质复合物的磁珠进行洗脱，收集洗脱后的溶液并在其中加入蛋白酶K以降解复合物中的RNA结合蛋白，完全降解之后用TRIzol溶液进一步提取得到RNA，然后再进行测序分析。
CN201910890560.1A 2019-09-20 2019-09-20 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法 Active CN110567788B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910890560.1A CN110567788B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910890560.1A CN110567788B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110567788A CN110567788A (zh) 2019-12-13
CN110567788B true CN110567788B (zh) 2022-02-11

Family

ID=68781428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910890560.1A Active CN110567788B (zh) 2019-09-20 2019-09-20 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110567788B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113121636B (zh) * 2021-04-08 2022-04-22 山东大丰园农业有限公司 用于富集正三十醇结合物的复合体及其制备方法与应用
CN114324286B (zh) * 2022-01-07 2022-08-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种光敏交联剂及其应用
CN115896098A (zh) * 2023-01-03 2023-04-04 苏州复优谱仪器科技有限公司 一种线粒体rna提取试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434561A (zh) * 2010-09-03 2017-02-22 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 细胞亚群的鉴定和富集
WO2017196264A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Agency For Science, Technology And Research Ribonucleic acid (rna) interactions

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050227251A1 (en) * 2003-10-23 2005-10-13 Robert Darnell Method of purifying RNA binding protein-RNA complexes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434561A (zh) * 2010-09-03 2017-02-22 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 细胞亚群的鉴定和富集
WO2017196264A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Agency For Science, Technology And Research Ribonucleic acid (rna) interactions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于RNA亲和与新型固定化酶的蛋白质组研究新策略;张倩;《中国硕士学位论文全文数据库基础科学专辑》;20170215(第2期);A006-427 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110567788A (zh) 2019-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110567788B (zh) 一种rna-蛋白质复合物的富集和鉴定方法
Kramer et al. Photo-cross-linking and high-resolution mass spectrometry for assignment of RNA-binding sites in RNA-binding proteins
Zaringhalam et al. Pseudouridylation meets next-generation sequencing
Barra et al. Probing long non-coding RNA-protein interactions
WO2018059088A1 (zh) Dna编码分子库及化合物筛选方法
Li et al. Single-cell multi-omics in the medicinal plant Catharanthus roseus
US20200190574A1 (en) Rna-stitch sequencing: an assay for direct mapping of rna : rna interactions in cells
Goyon et al. On-line sequencing of CRISPR guide RNAs and their impurities via the use of immobilized ribonuclease cartridges attached to a 2D/3D-LC–MS system
Stadlmeier et al. A click‐chemistry‐based enrichable crosslinker for structural and protein interaction analysis by mass spectrometry
Fan et al. A new tandem enrichment strategy for the simultaneous profiling of O-GlcNAcylation and phosphorylation in RNA-binding proteome
CN111521774A (zh) 基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法
Ledvinová et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones
Lo et al. Halo‐seq: An RNA Proximity Labeling Method for the Isolation and Analysis of Subcellular RNA Populations
Badonyi et al. Hallmarks and evolutionary drivers of cotranslational protein complex assembly
CN112941634B (zh) 通过dna编码化合物库筛选同时结合多个生物靶标的化合物的方法
Jorge et al. Identification of novel protein-coding sequences in Eucalyptus grandis plants by high-resolution mass spectrometry
CN104774923A (zh) 一种测定转录调控复合体的方法
CN113801915B (zh) 获取目标rna结合蛋白靶rna的方法
CN114106109B (zh) 一种细胞质靶向的rna结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用
Liu et al. Genome-wide identification of protein binding sites on RNAs in mammalian cells
Tsang et al. The characteristics of CTCF binding sequences contribute to enhancer blocking activity
CN115197300B (zh) 一种对rna具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用
Osorio Franco et al. p‐Chloropropynyl Phenylalanine, a Versatile Non‐Canonical Amino Acid for Co‐Translational Peptide Macrocyclization and Side Chain Diversification
Kim et al. Recent methodological advances towards single-cell proteomics
Balzarini et al. A widely applicable and cost-effective method for specific RNA–protein complex isolation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220310

Address after: 102206 No. 38, Life Science Park Road, Changping District, Beijing

Patentee after: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER

Patentee after: Academy of military medicine, PLA Academy of Military Sciences

Address before: No. 38, shengshengyuan Road, Zhongguancun Life Science Park, Haidian District, Beijing 102206

Patentee before: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER