CN115197300B - 一种对rna具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申请构建的HARD蛋白可有效的对RNA及其结合蛋白进行分离纯化，且具有非特异、高亲和性的结合活性，未表现出偏好性，可用于各种类型RNA及其结合蛋白的纯化。

Description

一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用。
背景技术
中心法则的确定大大推进了现代分子生物学的发展。RNA作为中心法则中最关键的要素之一，一直受到学术界的高度关注。RNA发挥功能的过程中，与靶分子的结合是关键一步。如何鉴定到真实的RNA与蛋白的相互作用是探索RNA结合蛋白功能的关键。
最初，人们认为RNA主要是作为mRNA的模板，或者是在蛋白质合成过程中由tRNA和核糖体RNA提供的衔接子或结构成分。随着催化性RNA和大量非编码RNA(ncRNA)物种的发现，人们认识到RNA是一种高度通用的分子，可通过充当识别RNA序列基序的指导在细胞中执行许多调节功能或它们的目标RNA中存在的RNA识别元件，或通过充当脚手架和装配平台来募集蛋白质以协同作用。瞬时或稳定地与RNA相互作用的蛋白质的表征是解析RNA调节过程的先决条件。
RNA结合蛋白(RBPs)能与RNA分子相互作用，影响RNA分子稳定性，剪接，细胞核输出以及靶标转录序列的翻译。因此找到RBP-RNA是如何相互作用，对于了解基因表达，细胞功能等具有重要意义由于RNA结合蛋白(RBPs)显著的生物学功能，它们的表达情况和活性状态能否提供细胞系统的诸多信息。
RNA结合蛋白(RBP)和核糖核蛋白可协调RNA加工和转录后调控。已经有许多方法用于研究mRNA相互作用蛋白，例如采用全基因组矩阵和荧光RNA探针对酵母RBPs进行系统的鉴定，采用固定化的RNA探针作为诱饵，在体外捕获特定的RBPs，然后在对其进行质谱检测。然而，这些方法不能区分活细胞中发生的RBPs和非生理状态下的RNA-蛋白结合体。大规模定量方法的最新发展，尤其是下一代测序和现代蛋白质质谱法，促进了全基因组范围内对RBPs，其蛋白辅因子及其RNA靶标的鉴定。
转录后基因调控(PTGR)对于维持细胞代谢，协调所有类型的RNA的成熟、转运、稳定性和降解至关重要。从机制上讲，这些事件中的每一个都受不同的核糖核蛋白(RNP)复合物的形成调控，这些复合物在其核心处具有RNA结合蛋白(RBP)。使用RBP的免疫沉淀，有或没有体内RNA-蛋白质交联的深度测序方法(分别进行交联和免疫沉淀，然后测序(CLIP-seq)和RNA免疫沉淀和测序(RIP-seq)以及体外进化方法揭示了RBP的结合范围，并表明许多RBP在定义的结合位点与细胞中的数千个转录物结合。
尽管有关RBP的数据收集越来越多，但仍有许多问题需要解答。目前的方法学进展允许鉴定越来越多的RNA结合蛋白(RBP)及其RNA结合位点。但是这些方法大多数都依赖于捕获与聚腺苷酸化RNA相关的蛋白质，而忽略了与非腺苷酸化RNA类(tRNA，rRNA，pre-mRNA)结合的RBP以及绝大多数在其mRNA中缺乏聚A尾巴的物种(包括所有古细菌和细菌)。polyA尾巴仅在其加工为成熟形式时才添加到新转录的RNA中，而一些成熟的mRNA为non-polyA或是双态的。通常，细菌和古细菌中缺少poly-A尾巴的mRNA也有相同的限制。因此，科学家发明了使用点击化学的RNA相互作用方法(RICK和CARIC)，RBR-ID，RICK和CARIC都依赖于使用4SU或5-乙炔基尿苷(EU)进行RNA标记以及随后的紫外线照射，其中用4SU或5-乙炔基尿苷(5-EU)标记的RNA与UV交联的相互作用蛋白以不依赖Poly A的方式纯化。然而，该方法需要对RNA进行有效的细胞内标记，这导致对于RNA代谢缓慢的RNA无法实现有效标记，同时由于标记试剂的毒性问题，无法对活体动物尤其是人类样本进行标记。
此外，还开发了利用RNA与蛋白共价交联后，用有机试剂例如苯酚、氯仿等处理分层后，分层差异进行纯化。该方法不依赖特定的RNA序列来分离交联的核糖核蛋白(RNP)，而是完全基于其理化特性对其进行纯化。从全细胞裂解物中纯化RNA的常用方法是一步法，也称为“Trizol”。但是这种方法在特异性方面不足，有特殊修饰的蛋白(例如糖基化修饰)也会与RNP处于相同的分离层，导致较高的假阳性。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用，本发明构建了HARD蛋白(High Affinity RNA binding Domainprotein,HARD)，其对于RNA具有非特异且高亲和性的结合活性，未表现出偏好性，可用于各种类型RNA及其结合蛋白的纯化。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。具体如下：
KVGNLKPNMESVNVTVRVLEASEARQIQTKNGVRTISEAIVGDETGRVKLTLWGKHAGSIKEGQVVKIENAWTTAFKGQVQLNAGSKTKIAEASEDGFPESSQIGGGGSAGGGGSAGGGGSADQKRNSSRHIIIRTSNALNKDRILKAVREKGQVTYKGKPIRITPDFSPETMKARRAWTDVIQTLREHKLQPRLLYPAKLSIIIEGETKVFHDKTKFTHYLSTNPALQRIITEKNQYKNGNNALEKTRR
进一步地，还可以是与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有相同功能的蛋白。
一种用于对RNA及其结合蛋白分离纯化的试剂，包括上述蛋白。
一种对RNA及其结合蛋白分离纯化的方法，在纯化过程中使用上述蛋白。
一种载体，其包括上述蛋白。
进一步地，载体还包括荧光标记基因。
进一步地，荧光标记基因为EGFP基因。
一种工程菌，其包括上述载体。
一种试剂盒，包括上述蛋白。
本发明的有益效果：
1、HARD蛋白对于RNA具有非特异且高亲和性的结合活性，未表现出偏好性，可用于各种类型RNA及其结合蛋白的纯化。
2、不需要对样本进行标记处理，因而对于代谢缓慢无法整合新的修饰的RNA更高效，对于无法标记的动物及人体样品具有更广泛的适用性。
3、特异结合RNA，因而与利用有机相分离的方法相比具有更高的特异性效率高，5×106细胞即可分离得到3000个左右RBPs。
附图说明
图1为HARD蛋白电泳检测结果；
图2为HARD蛋白对于HEK293细胞中各种类型RNA的富集结果，图中显示的是通过逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)测定经HARD蛋白富集的各种RNA与富集前的对应RNA的含量的比例；RNA表示核糖体RNA，PolyA mRNA表示多腺苷酸化信使RNA，Non-polyA mRNA表示非腺苷酸化信使RNA，lncRNA表示长链非编码RNA，snRNA表示小核RNA；
图3为各组样品通过转录组测序检测到的不同类型基因所编码的RNA的比例
图4为各组样品通过转录组测序检测到的不同类型小非编码RNA的比例
图5为HARD蛋白-琼脂糖凝胶洗脱得到的蛋白的银染检测结果；
图6为HARD蛋白-琼脂糖凝胶洗脱得到的蛋白的免疫印迹实验(WB)检测结果；
图7为HARD蛋白-琼脂糖凝胶洗脱得到的蛋白的通过蛋白质质谱鉴定道德多肽及蛋白；
图8为质谱鉴定的蛋白的Gene Ontology富集分析。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1 HARD蛋白的表达与分离纯化
1、克隆HARD蛋白质表达载体
将合成的HARD蛋白与EGFP基因克隆至pET28a表达载体，克隆过程为本领域常规过程。
2、蛋白原核表达
将质粒通过化学转化方法转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单个克隆至10mL LB培养基，37℃培养过夜。将37℃过夜培养的菌液10mL接种到1L LB培养基，在37℃培养至OD600～0.8。之后添加IPTG至1mM。继续培养20～24小时后通过离心收集菌体。
3、蛋白纯化
(1)细胞破碎
用含有20mM咪唑的缓冲液A(1×PBS)重悬细胞，每克菌体加10mL缓冲液A。重悬菌液通过超声波进行破碎。超声完毕后4℃，12000rmp离心30分钟。
(2)HRAD蛋白纯化
将HARD菌体蛋白裂解液与3mL Ni-NTA琼脂糖凝胶于4℃孵育1小时，之后用120mL含40mM咪唑的缓冲液A洗涤填料，用6mL含500mM咪唑的BufferA洗脱得到HARD蛋白(见图1)。
实施例2HARD蛋白-琼脂糖凝胶制备
将HARD蛋白溶液用偶联缓冲液(100mM磷酸缓冲液pH 7.0，150mM NaCl)稀释至1mg/mL，之后与等体积NHS-琼脂糖凝胶于室温孵育过夜。反应停止后用5倍体积偶联缓冲液洗琼脂糖凝胶两次，加入20倍体积封闭液室温封闭2h，用10倍体积偶联缓冲液洗2次。最后用原体积保存液(1×PBS)重悬HARD蛋白-琼脂糖凝胶，保存于4度。
实施例3对RNA进行分离纯化
将RNA混合物用结合缓冲液(1×PBS+5mM MgCl2)稀释至20μg/mL，与实施例2制备的15μL HARD凝胶于室温孵育1小时。进而用wash缓冲液(1×PBS，500mM NaCl,0.1％Tween-20)洗涤2次。用100μL Digestion buffer(1×PBS，0.5％SDS)和2μL蛋白酶K重悬HARD凝胶，55℃孵育30min。加入100μL 1-溴3-氯丙烷，旋涡30秒后，13000rpm离心15分钟。然后将上清转移到新的1.5mL管中，再加入300μL 100％乙醇，涡旋10秒混匀，再置于-20℃过夜沉淀。
沉淀完成后，于4℃，13000rpm离心15min，弃上清。加入1mL80％乙醇，涡旋充分混匀，再于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，最后用25μL H2O重悬RNA沉淀，并对其进行RT-qPCR和转录组测序检测，其结果见图2～4。
如图2～4所示，RT-qPCR检测结果显示，本申请构建的HARD蛋白对各类RNA都有30％左右的结合效率；转录组测序结果显示HARD对各类RNA的亲和性未表现出偏好性，表明其对RNA具有非特异、高亲和性的结合活性。
实施例4分离纯化RNA结合蛋白
以sigma DMEM基础培养基，加入新生牛血清NBS，非必需氨基酸，谷氨酰胺，丙酮酸钠及双抗，然后将HEK293细胞培养至细胞覆盖率约80％。将细胞培养基吸干后，用1×PBS清洗，吸干PBS后，用256nm紫外交联。在紫外线条件下，RNA特异与其结合蛋白形成共价交联。交联后细胞用1mL细胞裂解液(1×PBS+5mM MgCl2+0.5M CaCl2+1％tritonx-100)重悬，其中1mL裂解液中加50μL RNA酶抑制剂，40μL蛋白酶抑制剂。裂解后细胞13000rpm离心10分钟，将上清转移至新的管中。
细胞裂解液与250μL HARD凝胶于室温孵育2小时，之后分别用Wash Buffer1(20mMTris pH7.4,500mM NaCl,0.1％Tween-20)和Wash Buffer L(20mM Tris pH7.4,50mMNaCl,0.1％Tween-20)交替清洗3次。清洗完成后，每个样品用600ul 8M尿素溶液将蛋白洗脱，然后对洗脱蛋白进行检测。
如图5所示，银染结果显示HARD凝胶能够有效地从细胞裂解液中富集蛋白，并且RNA酶处理后富集蛋白消失，表明这些蛋白与HARD凝胶的结合依赖于RNA。
如图6所示，Western Blot结果显示对RNA结合蛋白蛋白PTBP1、PSPC1、NONO、GAPDH都具有显著的富集，对非RNA结合蛋白H3、DNMT1无结合。
如图7和图8所示，对样品利用定量质谱分析鉴定到3000左右蛋白，GO富集分析发现其中1000左右蛋白为已知的RBPs。
结合上述检测结果可知，本申请构建的HARD蛋白可有效的对RNA及其结合蛋白进行分离纯化，且具有非特异、高亲和性的结合活性。
序列表
<110> 四川大学华西第二医院
<120> 一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Val Gly Asn Leu Lys Pro Asn Met Glu Ser Val Asn Val Thr Val
1               5                   10                  15
Arg Val Leu Glu Ala Ser Glu Ala Arg Gln Ile Gln Thr Lys Asn Gly
            20                  25                  30
Val Arg Thr Ile Ser Glu Ala Ile Val Gly Asp Glu Thr Gly Arg Val
        35                  40                  45
Lys Leu Thr Leu Trp Gly Lys His Ala Gly Ser Ile Lys Glu Gly Gln
    50                  55                  60
Val Val Lys Ile Glu Asn Ala Trp Thr Thr Ala Phe Lys Gly Gln Val
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ala Gly Ser Lys Thr Lys Ile Ala Glu Ala Ser Glu Asp
                85                  90                  95
Gly Phe Pro Glu Ser Ser Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Gln Lys Arg Asn Ser
        115                 120                 125
Ser Arg His Ile Ile Ile Arg Thr Ser Asn Ala Leu Asn Lys Asp Arg
    130                 135                 140
Ile Leu Lys Ala Val Arg Glu Lys Gly Gln Val Thr Tyr Lys Gly Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ile Arg Ile Thr Pro Asp Phe Ser Pro Glu Thr Met Lys Ala Arg
                165                 170                 175
Arg Ala Trp Thr Asp Val Ile Gln Thr Leu Arg Glu His Lys Leu Gln
            180                 185                 190
Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Ile Ile Ile Glu Gly Glu
        195                 200                 205
Thr Lys Val Phe His Asp Lys Thr Lys Phe Thr His Tyr Leu Ser Thr
    210                 215                 220
Asn Pro Ala Leu Gln Arg Ile Ile Thr Glu Lys Asn Gln Tyr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gly Asn Asn Ala Leu Glu Lys Thr Arg Arg
                245                 250

Claims (6)

1.一种对RNA具有非序列特异性且高度亲和力的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种用于对RNA及其结合蛋白分离纯化的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白。
3.一种对RNA及其结合蛋白分离纯化的方法，其特征在于，在纯化过程中使用权利要求1所述的蛋白。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1所述蛋白。
5.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌包括权利要求4所述载体。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的蛋白。
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