CN114350653B - 一种动物组织裂解与直接pcr扩增的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物组织裂解与直接PCR扩增的方法。裂解液成分包括：10～200mM Tris(pH 8.0)、5～10mM EDTA、质量浓度0.1％～0.25％SDS、质量浓度1％～5％DTT和100～500μg/mL蛋白酶K组成的混合液，采用10～200mM KCl作为裂解终止液，终止裂解液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5。还提供了一种与裂解液配套的PCR增强剂：1～5M甜菜碱、1％～10％DMSO和0.001％～0.15％明胶，提高PCR扩增效率。本发明使组织裂解产物直接作为PCR反应模板，省去繁琐步骤，节省时间与成本，减少样本损失，实现高通量快速检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种动物组织裂解与直接PCR扩增的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)技术是现代分子生物学的核心技术，现阶段PCR技术的应用十分广泛，已经涉及到了对研究的目的基因的各种检测，遗传病、肿瘤的诊断，法医鉴定等分子领域。动物作为一种最为广泛的研究对象，通常情况下需要首先进行基因组的提取与纯化，有试剂盒提取法和CTAB提取法，对于科学研究者来讲，往往在提取组织基因组上会花费大量的时间，而且在基因组的提取与纯化过程中又会额外使用多种有害试剂与其他耗材，即污染了环境又浪费了资源，同时还需要保证基因组不被交叉污染。所以，利用动物组织直接进行PCR扩增，将会是PCR技术开发的另一新领域。
以动物组织为样本，用组织裂解液进行裂解后，以裂解后的液体作为模板进行PCR扩增时，裂解液中存在的SDS使组织中的细胞膜蛋白更好的变性，释放出核酸，EDTA对各种核酸酶活性有高度抑制作用，可以保持核酸的完整性，但是它们又都属于PCR抑制剂，同时动物组织的胶原质、肝素、血红素、胆酸和尿素等物质都会对PCR产生抑制效果，所以在进行PCR反应时，如何抵抗这些抑制剂的抑制效果，提高PCR反应效率又是另一个亟待解决的难题。
目前，研究最多的动物学的方向包括哺乳类、禽类、鱼类和昆虫等。在对这些样本进行不同组织提取DNA时发现，样本中存在较容易裂解的组织，如脾、肺、肾和肌肉等，这些组织中存在较少的PCR抑制剂，裂解后核酸释放完全；还有一部分不易裂解的组织，包括：心脏、胰脏、肝脏、肺、胫骨、尾巴和指甲等，这些组织比较难裂解，裂解后的核酸产量比较低，而且存在大量PCR抑制剂，即使可以释放较多的核酸也需要将样本量加倍或者需要较多的裂解时间。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种动物组织裂解液，用于组织直接PCR扩增。裂解液成分包括：10～200mM Tris(pH 8.0～8.5)，5～25mM EDTA，质量浓度0.1％～0.25％SDS，质量浓度1％～5％DTT，100～500μg/mL蛋白酶K组成的混合液，用10～200mM KCl作为裂解终止液，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5。将动物组织与裂解液预混，在45～50℃条件下反应10～15min进行裂解释放DNA，95～98℃条件下反应5～10min使蛋白酶K失活，添加10～200mM KCl终止反应。得到裂解产物，作为模板加入PCR反应体系中，进行直接扩增，由于反应液中存在多种PCR抑制剂，因此本发明又提供了一种与裂解液配套的PCR增强剂：1～5M甜菜碱、质量浓度1％～10％DMSO和质量浓度0.001％～0.15％明胶，用来提高PCR的扩增效率。
本发明的第一个目的是提供一种用于动物组织直接PCR扩增的裂解液。
本发明的第二个目的是提供一种PCR增强剂。
本发明的第三个目的是提供一种用于动物组织直接PCR扩增的裂解终止液。
本发明的第四个目的是提供一种组合物。
本发明的第五个目的是提供一种组合物在制备动物组织直接PCR扩增的试剂盒中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种试剂盒。
本发明的第七个目的是提供一种试剂盒在建立动物组织裂解与动物组织直接PCR扩增方法中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种动物组织裂解与直接PCR扩增的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种用于动物组织直接PCR扩增的裂解液，所述裂解液含有10～200mM Tris、5～25mM EDTA、质量浓度0.1％～0.25％SDS、质量浓度1％～5％DTT和100～500μg/mL蛋白酶K，所述10～200mM Tris的pH值为8.0～8.5。
优选地，所述裂解液含有100～200mM Tris、5～10mM EDTA、质量浓度0.1％～0.2％SDS、质量浓度1％～2％DTT和100～300μg/mL蛋白酶K，所述100～200mM Tris的pH值为8。
更优选地，所述裂解液含有100mM Tris、5mM EDTA、质量浓度0.15％SDS、质量浓度2％DTT和300μg/mL蛋白酶K，所述100mM Tris的pH值为8。
一种PCR增强剂，所述增强剂含有1～5M甜菜碱、质量浓度1～10％DMSO和质量浓度0.001～0.15％明胶。
优选地，所述PCR增强剂含有5M甜菜碱、质量浓度5％DMSO和质量浓度0.005％明胶。
一种组合物，所述组合物含有所述的裂解液和裂解终止液，所述裂解液终止液为10～200mM KCl。
优选地，所述裂解终止液为100～200mMKCl。
更优选地，所述裂解终止液为100mMKCl。
最优选地，所述组合物还含有所述的PCR增强剂。
所述的裂解液、所述的PCR增强剂或所述的组合物在制备动物组织直接PCR扩增的试剂盒或建立动物组织裂解与动物组织直接PCR扩增方法中的应用。
一种试剂盒，所述试剂盒含有所述的组合物，或其中的裂解液、裂解液终止液和所述的PCR增强剂中的至少2种。
所述的试剂盒在建立动物组织裂解与动物组织直接PCR扩增方法中的应用。
一种动物组织裂解与直接PCR扩增方法，取动物组织，用所述的裂解液进行裂解，添加所述的裂解终止液终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5，得到裂解产物，作为模板进行PCR扩增。
优选地，取动物组织，用所述的裂解液进行裂解，添加所述的裂解终止液终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5，再加入所述的PCR增强剂后，得到裂解产物，作为模板进行PCR扩增。
更优选地，取动物组织10～20mg，用所述的裂解液进行裂解，添加所述的裂解终止液室温25～37℃终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5，再加入所述的PCR增强剂至终体积为20μL后，得到裂解产物，作为模板，进行PCR扩增。
更优选地，取动物组织10～20mg，用所述的裂解液在45～50℃下裂解动物组织10～15min，95～98℃变性5～10min，再添加100～200mM KCl 25～37℃终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5，10000～12000rpm离心1～2min，再加入所述的PCR增强剂至终体积为20μL后，得到裂解产物，作为模板，进行PCR扩增。
更优选地，取动物组织15mg，用所述的裂解液在50℃下裂解动物组织10min，95℃变性5min，再添加100mM KCl室温25℃终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1：1，12000rpm离心1min，再加入所述的PCR增强剂至终体积为20μL后，得到裂解产物，作为模板，进行PCR扩增。
更优选地，所述PCR扩增体系为：10mM Tris-SO4，40mM NH4SO4，质量浓度0.1％TritonX-100，0.5mM dNTPs，2.5mM MgSO4，2.5U DNA polymerase，0.5mM正向扩增引物，0.5mM反向扩增引物，1μL裂解产物。
更优选地，所述PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃预变性15s，55～60℃退火20s，72℃延伸30s，72℃完全延伸5min，35～40个循环。
最优选地，所述PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃预变性15s，55～60℃退火20s，72℃延伸30s，72℃完全延伸5min，35个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的动物组织裂解与直接PCR扩增方法是一种简便的DNA检测技术，不需要基因组DNA的提取纯化，组织裂解产物可直接作为PCR反应模板，裂解终止液可将裂解液中PCR抑制剂析出，并且与PCR反应Buffer兼容。省去了繁琐的组织DNA提取和纯化步骤即可释放组织DNA，节省了时间与成本，减少了样本损失，实现了高通量快速检测。为下游做基因鉴定、基因分型、基因敲除检测和转基因鉴定等高通量工作提供了可靠并且快速的技术支持。
附图说明
图1所示为不同Tris浓度的裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图，其中，M为：DNAMarker 8K；1为：10mM Tris；为2：30mM Tris；3为50mM Tris；4为：70mM Tris；5为：100mMTris；6为130mM Tris；7为150mM Tris；8为：170mM Tris；9为：200mM Tris。
图2所示为不同EDTA浓度的裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图，每个浓度做两个重复，其中，M为：DNA Marker 8K；1为：0mM EDTA；2为：5mM EDTA；3为：10mM EDTA；4为：15mM EDTA；5为：20mM EDTA；6为：25mM EDTA。
图3所示为不同SDS质量浓度的裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图，其中，M为：DNA Marker 8K；1为：0％SDS；2为：005％SDS；3为：0.1％SDS；4为：0.15％SDS；5为：0.2％SDS；6为：0.25％SDS。
图4所示为不同离子型去污剂不同质量浓度的裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图。其中，M为：DNA Marker 8K；1为：0％；2为：005％；3为：0.1％；4为：0.15％；5为：0.2％；6为：0.25％。
图5所示为分别含有质量浓度1.5％TritonX-100、1.5％Tween 20、1.5％SDS和1.5％NP-40裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图，其中，1为：0.15％TritonX-100；2为：0.15％Tween 20；3为：0.15％SDS；4为：0.15％NP-40。
图6所示为不同质量浓度DTT的裂解液裂解组织后进行PCR扩增的效果图，其中，M为：DNA Marker 8K；1为：1％；2为：2％；3为：2.5％；4为：3％；5为：4％；6为：5％。
图7所示为不同蛋白酶K浓度的裂解液裂解组织后进行PCR扩增效果图，其中M为：DNA Marker 8K；1为：100μg/mL；2为200μg/mL；3为：300μg/mL；4为：400μg/mL；5为：500μg/mL。
图8所示为不同浓度NaCl和KCl的裂解终止液，终止液裂组织反应后进行PCR扩增效果图，其中，M为：DNA Marker 8K；1为0mM；2为：50mM；3为：100mM；4为：150mM；5为：200mM。
图9所示为不同小鼠组织液裂反应后进行PCR扩增效果图，其中，M为：DNA Marker8K；1为：心；2为：肝；3为：脾；4为：肺；5为：肾；6为：肠。
图10所示为组织液裂液裂解小鼠肠组织后，添加PCR增强剂，进行PCR扩增效果图，其中，M为DNA Marker 8K；
四甲基氯化铵中，1为：10mM；2为：20mM；3为：30mM；4为：40mM；5为：50mM；6为：60mM；
甜菜碱中，1为：1M；2为：2M；3为：3M；4为：4M；5为：5M；6为：6M；
海藻糖中：1为：1M；2为：2M；3为：3M；4为：4M；5为：5M；6为：6M；
甲酰胺中：1为：0.05％；2为：0.1％；3为：0.15％；4为：0.2％；5为：0.25％；6为：0.3％质量浓度的甲酰胺；
5M甜菜碱、5％DMSO(二甲基亚砜)和明胶中，1为：0.001％；2为：0.005％；3为：0.01％；4为：0.05％；5为：0.1％；6为：0.15％质量浓度的明胶；
DMSO中：1为：1％；2为：3％；3为：5％；4为：7％；5为：9％；6为：10％质量浓度的DMSO。
图11所示为本申请裂解液+裂解终止反应液+PCR增强剂与竞品A和竞品B裂解组织后的PCR扩增效果图，其中自研：1为25℃裂解10min，95℃3min，2为55℃裂解10min，95℃3min；竞品A：1为25℃裂解10min，95℃3min，2为25℃裂解10min，95℃3min后稀释10倍最为模板，3为55℃裂解10min，95℃3min，4为5℃裂解10min，95℃3min后稀释10倍最为模板；竞品B：1为25℃裂解10min，95℃3min，2为25℃裂解10min，95℃3min后稀释10倍最为模板，3为55℃裂解10min，95℃3min，4为5℃裂解10min，95℃3min后稀释10倍最为模板。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明提到的PCR反应体系与程序为：10mM Tris-SO4，40mM NH4SO4，质量浓度0.1％TritonX-100，0.5mM dNTPs，2.5mM MgSO4，0.25U DNA polymerase，0.5mM正向扩增引物，0.5mM反向扩增引物，1μL裂解产物，PCR增强剂加H2O至20μL；95℃预变性10min，95℃预变性15s，55～60℃退火20s，72℃延伸30s，72℃完全延伸5min，35个循环。
实施例中采用的各种动物组织均为新鲜取样的冷冻组织。
实施例1裂解液中Tris浓度对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考察裂解液中的Tris浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同浓度的pH8.0Tris(10mM、30mM、50mM、70mM、100mM、130mM、150mM、170mM、200mM)的裂解液，其他组分的用量均为：2mM EDTA(乙二胺四乙酸)、质量浓度0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)、质量浓度1％DTT(二硫苏糖醇)和200μg/mL蛋白酶K。
浓度梯度的Tris，初始选用的EDTA与SDS的浓度是其对PCR产生抑制的最小作用值，分别为2mM EDTA与质量浓度0.1％的SDS。
2、小鼠肝脏组织的裂解
取9份15mg小鼠肝脏组织，处理方式为：50μL含有不同浓度的Tris的组织裂解液与15mg冻存的动物组织混合，50℃裂解10min，95℃变性5min，加入50mM KCl室温终止反应。裂解完成后12000rpm离心1min，将残骸收集至离心管底部，作为后续PCR扩增的模板。
3、PCR扩增
扩增的小鼠基因为APOE基因序列，NCBI登录号为NM_009696.4。正向扩增引物序列：CAGCTCCTGCTCTTCTGCTT(SEQ ID NO:1)，反向扩增引物序列AGTTTGGATGCCTTGTGACC(SEQID NO:2)。
扩增体系为：10mM Tris-SO4，40mM NH4SO4，质量浓度0.1％TritonX-100，0.5mMdNTPs，2.5mM MgSO4，0.25U DNA polymerase，0.5mM正向扩增引物，0.5mM反向扩增引物，1μL裂解产物加ddH2O至20μL，每个反应做两个重复。
反应程序：95℃预变性10min，95℃预变性15s，55～60℃退火20s，72℃延伸30s，72℃完全延伸5min，35个循环。
扩增结束后取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现，100mM、130mM、150mM、170mM和200mM的Tris浓度扩增效率高于10mM、30mM、50mM和70mM的Tris(图1)，本着尽量减少无机盐离子浓度对后续PCR结果的干扰的目的，最终选择100mM的Tris浓度作为裂解液的缓冲体系。
实施例2裂解液中EDTA浓度对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考察裂解液中的EDTA浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同浓度的EDTA(0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM)的裂解液，其他组分的用量均为：100mM Tris(pH 8.0)、质量浓度0.1％SDS、质量浓度1％DTT、200μg/mL蛋白酶K。
2、小鼠肝脏组织的裂解
称取6个15mg小鼠肝脏为样本，裂解体系与程序同实施例1。
3、PCR扩增
扩增基因为小鼠p53基因(NCBI登录号为NC_000077.7)的889bp片段。引物序列：F-ATGGTAAGCCCTCAACACCG(SEQ ID NO:3)，R-GTCCAGTTACAGGAACCCCG(SEQ ID NO:4)，扩增体系与程序同实施例1，取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现，裂解液中最佳EDTA浓度为5mM，浓度超过10mM后完全抑制PCR扩增(图2)。
实施例3裂解液中SDS浓度对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考察裂解液中的SDS浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同质量浓度的SDS(0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％)的裂解液，其他组分的用量均为：100mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA、质量浓度1％DTT、200μg/mL蛋白酶K。
2、小鼠肝脏组织的裂解
取冻存10mg小鼠肝脏为样本，裂解体系与程序同实施例1。
3、PCR扩增
扩增基因为小鼠p53基因(NCBI登录号为NC_000077.7)的2022bp片段。引物序列：F-CTCCCTGATTACCTGTTCCTTG(SEQ ID NO:5)，R-AGAGAGGAGAGAGAACGGAGGT(SEQ ID NO:6)，扩增体系与程序同实施例1，取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现，裂解液中最佳SDS质量浓度为0.15％，超过0.15％后就会对PCR扩增产生抑制作用，低于0.15％裂解效果不佳(图3)。
实施例4裂解液中不同去污剂对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考虑到SDS对DNA聚合酶的抑制作用，将SDS非离子性去污剂换为TritonX-100、Tween 20或NP-40离子型去污剂，考察裂解液中的不同去污剂及其浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同去污剂不同质量浓度的TritonX-100(0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％和0.25％)、Tween 20(0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％)或NP-40(0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％)的裂解液，其他组分的用量均为：100mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA、质量浓度1％DTT、200μg/mL蛋白酶K。
2、小鼠肝脏组织的裂解
裂解样本、体系与程序同实施例3。
3、PCR扩增
扩增基因、引物、体系与程序同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
再将分别含有质量浓度1.5％TritonX-100、质量浓度1.5％Tween 20、质量浓度0.15％SDS和质量浓度1.5％NP-40裂解液4，对15mg小鼠肝脏进行裂解，裂解体系和程序以及PCR扩增体系与程序同实施例3。扩增结束后，取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现裂解液中的TritonX-100、Tween 20和NP-40无论哪种浓度裂解组织，将裂解产物作为模板扩增都会出现严重的非特异扩增(图4)。
同时，0.15％SDS的裂解效果优于质量浓度1.5％TritonX-100、质量浓度1.5％Tween 20和质量浓度1.5％NP-40的裂解液，表明SDS的裂解效果优于其他非离子型去污剂，对PCR扩增的抑制作用也小于其他(图5)，所以TritonX-100、Tween 20和NP-40不适合作为动物组织裂解液的有效成分。
实施例5裂解液中DTT浓度对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考察裂解液中的DTT浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同质量浓度的DTT(1％、2％、2.5％、3％、4％、5％)的裂解液，其他组分的用量均为：100mM Tris(pH 8.0)、5mMEDTA、质量浓度1.5％SDS、200μg/mL蛋白酶K。
2、小鼠肝脏组织的裂解
取冻存10mg小鼠肝脏为样本，裂解体系与程序同实施例1。
3、PCR扩增
扩增基因为小鼠p53基因(NCBI登录号为NC_000077.7)的2022bp片段。引物序列：F-CTCCCTGATTACCTGTTCCTTG(SEQ ID NO:5)，R-AGAGAGGAGAGAGAACGGAGGT(SEQ ID NO:6)，扩增体系与程序同实施例1，取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现，裂解液中最佳DTT质量浓度为2％，在此浓度下扩增产量最高，特异性最强，超过2％后就会对PCR扩增产生抑制作用(图6)。
实施例6裂解液中蛋白酶K浓度对裂解效果的影响
一、实验方法
1、裂解液的配置
考察裂解液中的蛋白酶K浓度对裂解效果的影响，分别配置含有不同浓度的蛋白酶K(100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL)的裂解液，其他组分的用量均为：100mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA、质量浓度0.15％SDS、质量浓度2％DTT。
2、小鼠肝脏组织的裂解
裂解样本、体系与程序同实施例3。
3、PCR扩增
扩增基因、引物和体系与程序同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现裂解液中添加300μg/mL的蛋白酶K裂解效果好于其他浓度，当超过300μg/mL时PCR的扩增效率逐渐降低(图7)。
最终的组织裂解液的组成为：100mM Tris(pH 8.0)，5mM EDTA，质量浓度0.15％SDS，质量浓度2％DTT，300μg/mL蛋白酶K。
实施例7裂解终止液种类和浓度对裂解终止反应效果的影响
一、实验方法
1、裂解液终止液的配置
考察裂解液终止液的种类和浓度对裂解效果的影响，分别配置不同浓度的NaCl溶液(0mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM)作为裂解终止液，同时选择不同浓度的KCl溶液(0mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM)作为裂解终止液。
2、小鼠肝脏组织的裂解终止反应
取50μL实施例6得到的最终的组织裂解反应液和15mg小鼠肝脏组织混合，50℃孵育10min，95℃孵育5min。分别用用不同浓度的NaCl和KCl进行终止反应，配置情况见步骤1的裂解终止液，裂解液与裂解终止反应液的体积比为1：1。裂解完成后12000rpm，离心1min，将沉淀和组织残骸收集于管底。
3、PCR扩增
取步骤3离心后1μL的上清作为PCR反应的模板，扩增体系与程序同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现100mM KCl更容易将裂解液中的SDS析出，并且扩增产物条带比NaCl单一，所以最适的裂解终止反应液为100mM KCl(图8)。
随着盐离子浓度的升高，去污剂的临界胶束浓度下降，所以在低温并且盐离子存在的情况下SDS会发生沉淀，这种情况发生在KCl溶液中更明显，利用SDS的这种特性可将溶液中的SDS去除。
实施例8裂解液裂解动物不同组织的情况
一、实验方法
1、小鼠组织的裂解
取50μL实施例6得到的最终的组织裂解反应液分别和15mg小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠组织混合，50℃孵育10min，95℃孵育5min，添加50μL 100mM KCl在室温条件下终止裂解反应，12000rpm，离心1min，将沉淀和组织残骸收集于管底，
2、PCR扩增
取步骤1离心后1μL的上清作为PCR反应的模板，扩增体系与程序同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现只有肠组织无扩增结果无目的条带，可能肠组织的裂解产物中存在更多的PCR抑制剂(图9)。
实施例9PCR增强剂对PCR扩增的影响
一、实验方法
1、PCR增强剂的配置
考察PCR增强剂的种类和浓度对PCR扩增的影响，分别配置不同浓度的以下溶液作为PCR增强剂：
配置PCR增强剂1-1～1-6，分别为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM和60mM的四甲基氯化铵；
配置PCR增强剂2-1～2-6，分别为1M、2M、3M、4M、5M和6M的甜菜碱；
配置PCR增强剂3-1～3-6，分别为1M、2M、3M、4M、5M和6M的海藻糖；
配置PCR增强剂4-1～4-6，分别为质量浓度0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.3％的甲酰胺；
配置PCR增强剂5-1～5-6，5M甜菜碱和质量浓度5％DMSO(二甲基亚砜)，明胶质量浓度分别为0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％和0.15％；
配置PCR增强剂6-1～6-6，分别为质量浓度1％、3％、5％、7％、9％和10％的DMSO。
2、小鼠组织的裂解
取15mg小鼠肠组织与组织裂解液混合，裂解体系与程序同实施例7。扩增体系与扩增程序同实施例3，扩增体系中需要分别添加步骤1配置的PCR增强剂至终体积为20μL。
3、PCR扩增
扩增引物序列为同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
经分析发现添加PCR增强剂之后，仅以四甲基氯化铵、甜菜碱或DMSO作为PCR增强剂对肠组织裂解液扩增无效果；仅以海藻糖或甲酰胺作为增强剂只有微弱的结果；用PCR增强剂5-1～5-6时，都有明显的效果，其中用PCR增强剂5-2时，扩增条带背景更弱，所以最适的PCR增强剂组分为5M甜菜碱、质量浓度5％DMSO和质量浓度0.005％明胶(图10)。
对比例1
一、实验方法
1、小鼠组织的裂解
取50μL实施例6得到的最终的组织裂解反应液分别和15mg小鼠肝、脾、肺、肠混合，50℃孵育10min，95℃孵育5min，添加50μL 100mM KCl在室温条件下终止裂解反应，12000rpm，离心1min，将沉淀和组织残骸收集于管底。
分别采用市场上常见的裂解液竞品A和竞品B按照上述相同的方法裂解小鼠组织，竞品A和竞品B无裂解终止反应液，得到裂解产物，作为模板直接进行下一步PCR扩增。
2、PCR扩增
取步骤1离心后1μL的上清作为PCR反应的模板，PCR反应液包含实施例9中的PCR增强剂：5M甜菜碱、质量浓度5％DMSO和质量浓度0.005％明胶。扩增体系与程序同实施例3。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
二、实验结果
结果如图11所示，经分析发现竞品A虽然扩增产物量较高，但是非特异扩增也同时提高；竞品B几乎无目的条带出现；而本申请裂解液+裂解终止反应液+PCR增强剂可扩增出高产量目的条带，并且目的条带单一，无非特异扩增。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉赛维尔生物科技有限公司
<120> 一种动物组织裂解与直接PCR扩增的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctcctgc tcttctgctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtttggatg ccttgtgacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtaagcc ctcaacaccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccagttac aggaaccccg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctccctgatt acctgttcct tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agagaggaga gagaacggag gt 22
Claims (6)
1.一种组合物在建立动物组织裂解与动物组织直接PCR扩增方法中的应用，其特征在于，所述组合物含有裂解液和裂解终止液以及PCR增强剂，所述裂解液含有100～200mMTris、5～10mM EDTA、质量浓度0.1％～0.15％ SDS、质量浓度1％～2％ DTT和100～300μg/mL蛋白酶K，所述100～200mM Tris的pH值为8.0，所述终止液为10～200mM KCl，所述PCR增强剂含有1～5M甜菜碱、质量浓度1％～10％ DMSO和质量浓度0.001％～0.15％明胶。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂解液含有100mM Tris、5mM EDTA、质量浓度0.15％SDS、质量浓度2％DTT和300μg/mL蛋白酶K，所述100mM Tris的pH值为8.0。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR增强剂含有5M甜菜碱、质量浓度5％DMSO和质量浓度0.005％明胶。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中的组合物。
5.权利要求4所述的试剂盒在建立动物组织裂解与动物组织直接PCR扩增方法中的应用。
6.一种动物组织裂解与直接PCR扩增方法，其特征在于，取动物组织，用权利要求1或2所述的裂解液进行裂解，添加所述的裂解终止液终止反应，裂解终止液与裂解液之间的体积比为1～2：1～1.5，再加入所述的PCR增强剂后，得到裂解产物，作为模板进行PCR扩增。
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Citations (6)
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2021
- 2021-12-29 CN CN202111648074.2A patent/CN114350653B/zh active Active
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| 快速提取肉类基因组DNA的裂解液的研究;李婷婷;张桂兰;王之莹;陈爱亮;;食品安全质量检测学报(第17期);摘要 * |
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