CN116024305A - 生物组织裂解液和直接pcr扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于PCR扩增技术领域，尤其涉及生物组织裂解液和直接PCR扩增试剂盒及其应用。所述生物组织裂解液包括以下终浓度组分：10‑200mM Tris‑HCl、1‑8mM EDTA、0‑800mM NaCl、50‑400μg/mL蛋白酶K、0‑4mM CaCl₂和体积比0‑0.5％十二烷基硫酸钠。本发明的生物组织裂解液用于预处理鼠尾生物组织样本，裂解方法较为温和，提取得到的基因组DNA浓度大、质量高、稳定性好，而且为后续直接PCR扩增搭建了良好稳定的内环境，扩增效率高达90％以上。此外，蛋白酶K与其它裂解试剂直接混合保存，在室温保存具有高稳定性，室温存放1个月以上仍能有效进行鼠尾及组织裂解，且裂解后的样本可以存放达4周以上，仍能进行稳定检测。

Description

生物组织裂解液和直接PCR扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及PCR扩增技术领域，特别涉及生物组织裂解液和直接PCR扩增试剂盒及其应用。

背景技术

小鼠是重要的模式动物，在基础生命科学、医学、药学等研究领域，经常会用到小鼠模型，比如各种突变体、转基因品系、近交系、回交系等小鼠材料，而这些材料的创制过程中需要对其基因型进行鉴定，具体来讲，在小鼠出生3-7d后，取小鼠尾部组织(或者耳朵和脚趾)，提取纯化基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定。相对来说，提取纯化的基因组DNA质量越高，PCR成功率越高，特别针对是一些困难引物如含有高GC、高重复或长片段的引物。但是提取纯化步骤通常较为繁琐，需要花费大量的时间，而且在基因组的提取与纯化过程中又会额外使用多种有害试剂与其他耗材，即污染了环境又浪费了资源。直接PCR(Direct PCR)是一种直接用未纯化的生物样本进行PCR扩增，不经核酸纯化步骤的技术，与常规PCR的主要区别在于，样本可不经过核酸抽提，直接进行PCR扩增反应，操作更简单，实验周期很快，并且对于一般的PCR(扩增片段2kb以内)，裂解后直扩具有非常大的优势，是目前分子生物学领域的热门技术之一。

目前已经发展出多种适用于直接PCR扩增的试剂盒，通常包含两个功能，一个是裂解功能，通过组织裂解液实现，一个是扩增功能，通过PCR扩增混合液实现。现有的组织裂解液的裂解功能主要由两种方法实现，碱性裂解法和蛋白酶K消化法，两者提取时间基本一致，大概时间为2-3小时，处理后取一定量的DNA直接进行扩增即可。但是碱性裂解法容易破坏动物组织基因组，同时裂解性能不稳定，提取的DNA质量不太好，容易造成鼠尾组织裂解不完全，且碱性裂解法裂解的鼠尾样本对于PCR反应有较强的抑制作用，易导致PCR扩增失败，无法进行基因型鉴定工作。相较碱性裂解法，用蛋白酶K消化法进行裂解，更加温和，对基因组DNA损伤较小，但是商品化的蛋白酶K裂解试剂盒成本价高，且蛋白酶K需要单独存放，现用现配，增加了实验操作次数；若将蛋白酶K和裂解缓冲液简单混合在一起作为母液储存，则会导致混合物不稳定、不利于保存，严重甚至会使扩增实验结果不准确甚至实验失败。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了生物组织裂解液，并提供了含有该生物组织裂解液的直接PCR扩增试剂盒，以及该试剂盒在PCR扩增中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种生物组织裂解液，包括以下终浓度组分：10-200mMTris-HCl、1-8mM EDTA、0-800mM NaCl、50-400μg/mL蛋白酶K、0-4mM CaCl₂和体积比0-0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)。

采用上述的生物组织裂解液用于预处理鼠尾生物组织样本，裂解方法较为温和，其中Tris-HCl主要作用为细胞裂解提供稳定的pH环境，EDTA用于结合裂解液中的镁离子，SDS用于破坏细胞膜，NaCl中的Na⁺与DNA的磷酸盐基团结合，使其在水溶液中更稳定，蛋白酶K主要分解蛋白，CaCl₂的作用一是加强蛋白的降解，二是有助于DNA的稳定性，与Na⁺具有协同作用，经过前述组分处理后，能保证鼠尾样本能够充分裂解并释放其中的DNA，提取得到的基因组DNA质量高，提取性能稳定性好，而且能够去除可能抑制PCR扩增反应的多余蛋白等杂质，为后续PCR扩增搭建稳定的内环境，扩增后的样品有明显的基因组条带，至少有11对引物均有稳定的目的条带产生，扩增效率高达90％以上，与精提基因组的扩增效果基本一致。同时，预处理过程时间只需要数分钟到最多半小时即可完成，用于替代现有的繁琐裂解和提纯过程，可节省大量的实验时间，提高实验效率。此外，本发明将蛋白酶K与其它裂解试剂直接混合保存，无需另外进行蛋白酶K单独储存，有利于缩短操作时间、简化存储条件，前述混合液能够保存在室温，具有高稳定性，稳定性在室温存放1个月以上仍能有效进行鼠尾及组织裂解，裂解性能基本不受影响，且裂解后的样本可以存放达4周以上，仍能进行稳定检测。

进一步地，所述生物组织裂解液包括以下终浓度组分：50-200mM Tris-HCl、1-5mMEDTA、100-400mM NaCl、100-400μg/mL蛋白酶K、0-2mM CaCl₂和体积比0.1-0.3％十二烷基硫酸钠。

更进一步地，所述生物组织裂解液包括以下终浓度组分：100-200mM Tris-HCl、3-5mM EDTA、100mM-200mM NaCl、100-200μg/mL蛋白酶K、1-2mM CaCl₂和体积比0.1-0.2％十二烷基硫酸钠。

进一步，所述生物组织包括小鼠尾巴、小鼠脚趾或小鼠耳朵组织。

本发明的第二方面提供了一种直接PCR扩增试剂盒，包括如上所述的生物组织裂解液。

所述直接PCR扩增试剂盒相对于现有技术的优势与如上所述的生物组织裂解液相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

进一步地，所述直接PCR扩增试剂盒还包括PCR扩增混合液，所述PCR扩增混合液包括10-100mM KCl、10-150mM Tris-HCl、10-30mM(NH₄)₂SO₄、1-5mM MgCl₂、1-5ng/μL DNA聚合酶和200-400μM dNTP。

进一步地，所述PCR扩增混合液还包括增强子，所述增强子包括体积比1-10％二甲基亚砜(DMSO)、20-40μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5-3M甜菜碱(Betain)、30-300mM四甲基氯化铵(TMAC)。加入增强子有利于提升高GC片段和多重片段的扩增成功率。

具体地，2×PCR扩增混合液包括：50mM KCl、20mM Tris-HCl、20mM(NH₄)₂SO₄、1mMMgCl₂、1ng/μL DNA聚合酶、400μM dNTP、10％二甲基亚砜(DMSO)、20μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5M甜菜碱(Betain)和30mM四甲基氯化铵(TMAC)。

本发明的第三方面提供了如上所述的生物组织裂解液或者如上所述的直接PCR扩增试剂盒在PCR扩增中的应用。

所述生物组织裂解液或者直接PCR扩增试剂盒在PCR扩增中的应用相对于现有技术的优势与如上所述的生物组织裂解液相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

本发明的第四方面提供了一种生物组织直接PCR扩增的方法，包括以下步骤：

S1、将生物组织浸没在如上所述的生物组织裂解液中，40-90℃孵育5-30min；

S2、取步骤S1的上清液作为模板，加入PCR扩增混合液和引物，进行PCR扩增。

在本发明中，取生物组织样本，用生物组织裂解液进行裂解，得到裂解产物，作为模板加入PCR扩增反应体系中，进行直接扩增即可，不需要基因组DNA的提取纯化，并且生物组织裂解液与PCR扩增混合液兼容，省去了繁琐的组织DNA提取和纯化步骤即可释放组织DNA，节省了时间与成本，减少了样本损失，有利于实现高通量快速检测。

本发明的优点及积极效果为：

本发明的生物组织裂解液用于预处理鼠尾生物组织样本，裂解方法较为温和，提取得到的基因组DNA浓度大、质量高、稳定性好，而且生物组织裂解液与PCR扩增混合液兼容，为后续直接PCR扩增搭建了良好稳定的内环境，扩增效率高达90％以上。此外，蛋白酶K与其它裂解试剂直接混合保存，有利于缩短操作时间、简化存储条件，其在室温保存具有高稳定性，室温存放1个月以上仍能有效进行鼠尾及组织裂解，且裂解后的样本可以存放达4周以上，仍能进行稳定检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1采用不同组别的生物组织裂解液裂解之后进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例2小鼠不同组织经生物组织裂解液裂解之后进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3不同储存条件下的生物组织裂解液裂解之后进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1生物组织裂解液的组分选择及浓度优化

本实施例使用单一因素优化试验，探索含不同浓度Tris-HCl、EDTA、NaCl、蛋白酶K、CaCl₂和SDS的生物组织裂解液对小鼠尾巴的裂解和扩增效率的影响，首先配置相应浓度的母液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为2M，EDTA的摩尔浓度为500mM，NaCl的摩尔浓度为5M，蛋白酶K的质量体积浓度为20mg/mL，CaCl₂的摩尔浓度为1M，SDS的体积比(v/v)为10％，之后按照表1所示的体积用量配置不同终浓度的生物组织裂解液，总体积为1000μL，余量不足用水补足至1000μL，表1中所示浓度为生物组织裂解液的各组分在使用时中的终浓度。

表1生物组织裂解液的分组信息及各组分浓度

取新鲜或冻存的小鼠尾巴，剪取0.2-0.4cm的小鼠尾尖置于上述配制好的200μL生物组织裂解液中，需确保小鼠尾尖完全浸没在溶液中，之后将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于55℃水浴或PCR仪，孵育15min和30min，或者将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于80℃水浴或PCR仪，孵育30min。

孵育完成之后，取上清液1μL进行PCR扩增反应，反应体系和反应程序分别见表2-3。其中2×PCR Mix的配方包括：50mM KCl、20mM Tris-HCl、20mM(NH₄)₂SO₄、1mM MgCl₂、1ng/μL DNA聚合酶、400μM dNTP、10％二甲基亚砜(DMSO)、20μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、0.5M甜菜碱(Betain)和30mM四甲基氯化铵(TMAC)。

表2小鼠不同组织裂解测试的PCR反应体系

反应试剂	μL/个
		<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]>	10.5
2×PCR Mix	12.5
		模板	1
引物F(10μM)	0.5
		引物R(10μM)	0.5
总量	25

表3小鼠不同组织裂解测试的PCR反应程序

PCR扩增完成之后，加入2×Loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，其中最左侧泳道为maker，其余泳道对应组别C0-C22，C01及C02为组别C0的平行重复，15号和16号分别指代采用引物M15和M16进行扩增，Mus15和Mus16指代不同引物，其核苷酸序列如下所示：

Mus15-F：GCGGGTCTTAGCATTTCCCT(见SEQ ID NO：1)；

Mus15-R：TCCATAGAACGGGGGCTACA(见SEQ ID NO：2)；

Mus16-F：gAAggAgCTCCAgCAACAgCCTTgCTCCTCAC(见SEQ ID NO：3)；

Mus16-R：CCCAAgCTTgCAgTgTCgCCTTCAgTAgCAg(见SEQ ID NO：4)。

从图1中可以看出，C0-C22不同组别均有明显的基因条带，说明裂解效果较好，裂解产物直接可以用于PCR扩增。当Tris-HCl浓度为50-200mM，EDTA浓度为1-5mM，NaCl浓度为100-400mM，蛋白酶K浓度为100-400μg/mL，CaCl₂浓度为0-2mM，SDS体积比为0.1-0.3％时，提取的基因组DNA更为完整，拖带较少，基因组DNA浓度高，且产生的蛋白类杂质较少。同时，2对引物的扩增效果最佳。更优地，生物组织裂解液包括以下终浓度组分：100-200mM Tris-HCl、3-5mM EDTA、100mM-200mM NaCl、100-200μg/mL蛋白酶K、1-2mM CaCl₂和体积比0.1-0.2％十二烷基硫酸钠。

实施例2小鼠不同组织裂解测试

以表1组别C8和C5的生物组织裂解液为例，将裂解后的小鼠不同组织样本进行PCR扩增实验，以验证其对不同组织的裂解性能。具体操作如下：

取新鲜或冻存的小鼠尾巴、耳朵和脚趾，剪取0.2-0.4cm的各部位组织置于配制好的200μL生物组织裂解液中，需确保小鼠尾巴完全浸没在溶液中，之后将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于55℃水浴或PCR仪，孵育15min或30min，或者将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于80℃水浴或PCR仪，孵育30min。

孵育完成之后，取上清液1μL进行PCR扩增反应，PCR反应体系和反应程序设置同实施例1，区别在于引物为Mus15、Mus17和Mus29。

PCR扩增完成之后，取反应液10μL，加入2×Loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，其中最左侧泳道为maker，其余泳道对应小鼠不同组织，裂解液I和裂解液II分别指代表1中组别C8和C5，即裂解液1配为：100mM Tris-HCl(pH8.5)、5mMEDTA(pH7.5)、100mM NaCl、100μg/mL蛋白酶K、1mM CaCl₂和体积比0.2％ SDS；裂解液II配方为：100mM Tris-HCl(pH8.5)、3mM EDTA(pH7.5)、200mM NaCl、100μg/mL蛋白酶K、1mMCaCl₂和体积比0.2％ SDS；Mus15、Mus17和Mus29指代不同引物，Mus17和Mus29的核苷酸序列如下所示：

Mus17-F：gAAggAgCTCgTggCTgAggCAgTTgCCAgAT(见SEQ ID NO：5)；

Mus17-R：CCCAAgCTTgCAgTgTCgCCTTCAgTAgCAg(见SEQ ID NO：6)；

Mus29-F：CAATAGCATAGCCGTGTTCTTCTGTA(见SEQ ID NO：7)；

Mus29-R：ACTCGACTCTTAGTGGGATGTCTTC(见SEQ ID NO：8)。

由图2可知，本发明的生物组织裂解液对不同的生物组织样本均具有良好的裂解效果，适用性广泛。

实施例3生物组织裂解液稳定性测试

将配制好的2种优选生物组织裂解液放置在4℃和25℃1-4周，再用于预处理小鼠生物组织。具体操作如下：取新鲜或冻存的小鼠尾巴、耳朵和脚趾，剪取0.2-0.4cm的各部位组织置于200μL生物组织裂解液中，需确保小鼠尾巴完全浸没在溶液中，之后将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于55℃水浴或PCR仪，孵育15min，或者将小鼠尾尖的含有生物组织裂解液置于80℃水浴或PCR仪，孵育30min。孵育完成之后，取上清液1μL进行PCR扩增反应，PCR反应体系和反应程序设置同实施例1。

PCR扩增完成之后，取反应液10μL，加入2×Loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，其中最左侧泳道为maker，标注1-4W的泳道为在不同温度下放置相应周数的生物组织裂解液，泳道阳表示-20℃放置的生物组织裂解液作为对照，裂解液I和裂解液II分别位表1中组别C16和C20，Mus15和Mus17指代两对不同的引物。

从图3可以看出，4℃和25℃放置1-4周，对生物组织裂解液的裂解性能无影响，裂解得到的基因组DNA均能被有效扩增，扩增成功率高，说明本发明的生物组织裂解液稳定性能良好，耐室温和低温存储。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种生物组织裂解液，其特征在于，包括以下终浓度组分：10-200mM Tris-HCl、1-8mMEDTA、0-800mM NaCl、50-400μg/mL蛋白酶K、0-4mM CaCl₂和体积比0-0.5％十二烷基硫酸钠。

2.根据权利要求1所述的生物组织裂解液，其特征在于，包括以下终浓度组分：50-200mMTris-HCl、1-5mM EDTA、100-400mM NaCl、100-400μg/mL蛋白酶K、0-2mM CaCl₂和体积比0.1-0.3％十二烷基硫酸钠。

3.根据权利要求1所述的生物组织裂解液，其特征在于，包括以下终浓度组分：100-200mM Tris-HCl、3-5mM EDTA、100mM-200mM NaCl、100-200μg/mL蛋白酶K、1-2mMCaCl₂和体积比0.1-0.2％十二烷基硫酸钠。

4.根据权利要求1所述的生物组织裂解液，其特征在于，所述生物组织包括小鼠尾巴、小鼠脚趾或小鼠耳朵组织。

5.一种直接PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的生物组织裂解液。

6.根据权利要求5所述的直接PCR扩增试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增混合液，所述PCR扩增混合液包括10-100 mM KCl、10-150mM Tris-HCl、10-30mM(NH₄)₂SO₄、1-5mMMgCl₂、1-5ng/μL DNA聚合酶和200-400μM dNTP。

7.根据权利要求6所述的直接PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增混合液还包括增强子，所述增强子包括体积比1-10％二甲基亚砜、20-40μg/mL牛血清白蛋白、0.5-3M甜菜碱和30-300mM四甲基氯化铵。

8.如权利要求1-4任一项所述的生物组织裂解液在PCR扩增中的应用。

9.一种生物组织直接PCR扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将生物组织浸没在如权利要求1-4任一项所述的生物组织裂解液中，40-90℃孵育5-30min；

S2、取步骤S1的上清液作为模板，加入PCR扩增混合液和引物，进行PCR扩增。

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