CN111893119A - 利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法 - Google Patents
利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。体外转录获得CRISPR/Cas9系统，采用两个sgRNA共同打靶同一目的基因的原则进行山羊受精卵显微注射；奶山羊进行同期发情与超数排卵处理后，在母羊最后一次接受交配后的8‑12小时，即发情开始后约46‑50小时进行冲胚，获得原核期受精卵，并置于含有10％胎牛血清的M199培养液中进行显微注射；本发明提高了SCD1基因编辑山羊胚胎的发育率及基因编辑效率，具有良好的推广应用前景和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和遗传修饰领域，涉及利用CRISPR/Cas9系统与显微注射技术建立的山羊胚胎高效基因编辑方法。
背景技术
奶山羊产业是现代奶业的重要组成部分，山羊乳制品营养含量高，富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸，具有独特的营养价值和保健功能(Clark and Garcia,2017)，因此，优化羊乳脂肪酸组成和含量十分必要(Mahdi et al.,2018)。硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)基因可催化饱和脂肪酸生成羊乳脂肪酸的重要组成部分，即单不饱和脂肪酸(Bernard et al.2005)。通过获得SCD1基因敲除山羊胚胎，可为活体动物实验奠定基础，为研究SCD1基因对羊乳脂肪酸的调控作用提供试验动物材料，具有重要意义。
CRISPR/Cas9技术已成为实现转基因动物生产及分子育种的主要手段，可以高效并精确地对基因组特定位点进行缺失、插入、修复等(Watakabe et al.,2018)编辑，为定向精准改变遗传物质、调控动物遗传性状提供了有效途径。目前，CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术已被广泛应用于构建基因敲除小鼠和大鼠等动物模型，并且利用该基因编辑技术成功获得了抗结核转基因牛、抗蓝耳病猪、瘦肉猪和基因敲除绒山羊等(Gao et al.,2017；Wang et al.,2015；吴添文等.,2017)。
将显微注射技术应用于CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑，可显著提高基因编辑效率(Qin et al.,2015)，在果蝇胚胎中编辑效率可高达100％(Yu et al.，2013)，而在哺乳动物胚胎中的编辑效率则较低。为了提高编辑效率，中国专利CN106148416A将经显微注射针对Cyp基因不同亚型的sgRNA及Cas9 mRNA的受精卵体外培养，并选择存活的受精卵移入受体大鼠，利用生产的大鼠后代进行交配(与野生型大鼠杂交后自交)，从而获得目的亚型敲除的纯合体大鼠，但针对繁殖周期长、繁殖力相对不足的山羊而言，由于个体差异大，难以获得足够数量的同质性高、质量佳的受精卵。同样为了提高编辑效率，中国专利CN106957857A将针对山羊MSTN基因和FGF5基因各自不同或相同外显子区设计的两个sgRNA及Cas9 mRNA进行原核注射以降低脱靶率，但哺乳动物胚胎发育时期的基因表达调控通路复杂，而打靶位点的增加，使得利用CRISPR/Cas9系统与显微注射生产转基因动物变得更加困难，主要存在的问题为：基因编辑胚胎发育率低，以及由此导致的后代出生率低。
哺乳动物(以小鼠为例)受精卵的发育可被定义为不同的原核(PN)阶段，即PN1到PN5。在PN1和PN2期间，预复制的原核较小，在受精后定位于胚胎外围，并在G1期(受精后10h)开始向胚胎中心迁移；在PN3和PN4期间，原核进行DNA复制，在S期(受精后10-16h)进一步向中心迁移并彼此靠近；在PN5时，胚胎几乎处于G2期。基因编辑效率、注射后受精卵的损伤程度与显微注射选择的原核(PN)阶段密切相关，有研究报道小鼠胚胎在处于细胞周期的S期时，利用显微注射技术导入Cas9 mRNA与sgRNA的复合物，约3h后基因编辑开始并持续12h至24h。但对于山羊而言，由于受精卵数量有限，显微注射中注入液体对受精卵产生冲击，以及注入液体量的控制难度较大等制约胚胎的存活及后期发育的因素更为突出。
目前，尚无利用CRISPR/Cas9系统与显微注射对山羊胚胎进行SCD1基因编辑的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，包括以下步骤：
1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA以及用于共打靶山羊SCD1基因的两个sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；
2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或将经过注射的原核期受精卵置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。
优选的，所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。
优选的，所述sgRNA识别的靶序列(即sgRNA的编码序列，sgRNA序列)为：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’(山羊SCD1基因CDS的第6-25bp)
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’(山羊SCD1基因CDS的第339-358bp)。
优选的，所述步骤1)还包括以下步骤：利用体外切割试验检测sgRNA的活性。
优选的，所述步骤2)中，将母羊进行同期发情及超数排卵处理，然后将发情母羊与公羊交配，在发情母羊最后一次接受交配后8-12小时(即发情开始后约46-50小时)收集受精卵；利用与显微注射仪相连的显微注射针对该受精卵进行体外注射。
优选的，所述显微注射仪的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa(百帕)，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-50hPa。
优选的，所述显微注射针利用拉针仪拉制而成，拉制参数设置为：heat＝786-846，pull＝90-110，velocity＝140-160，time＝190-210。
优选的，所述Cas9 mRNA的浓度为50-100ng/μL，sgRNA的浓度为25-50ng/μL。
一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，该试剂盒包括上述sgRNA的体外转录模板(构建于相应的克隆载体中)以及Cas9 mRNA体外转录模板。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用体外转录获得的针对山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的sgRNA进行显微注射，不仅可以提供数量更多的SCD1基因编辑胚胎(囊胚)以提高后代的出生率，而且为加快产乳性能优良的奶山羊的育种进程提供了可靠的技术依据，具有很好的推广应用前景和经济价值。
进一步的，本发明对获得的处于一定原核阶段的山羊胚胎按照优化的显微注射参数进行注射，并利用拉针仪制成的显微注射针(其口径不超过1μm)精确控制(根据注射参数)受精卵的液体注入量(1-2pL)，从而可最大限度地保证注射后胚胎的存活率。
进一步的，本发明将针对山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子的sgRNA与Cas9基因的体外转录产物一并进行显微注射，可获得较高的山羊胚胎SCD1基因编辑效率和基因编辑胚胎(囊胚)的发育率。
附图说明
图1为定位于山羊26号染色体的(Chr.26)SCD1基因(SCD1 locus)sgRNA设计示意图。
图2为山羊sgRNA体外转录电泳图；其中：9代表sgRNA9的泳道，16代表sgRNA16的泳道。
图3为Cas9 mRNA体外转录电泳图。
图4为体外切割活性检测结果；其中：9代表sgRNA9的泳道，16代表sgRNA16的泳道。
图5为山羊受精卵显微注射示意图。
图6为山羊胚胎SCD1基因sgRNA打靶前、后的基因组序列比对结果；其中：WT表示打靶前山羊基因组SCD1基因部分测序结果(与参考序列比对后确定其严格保守)，+表示插入，-表示缺失，m表示点突变，#表示实验受精卵编号。
图7为本发明实施例中建立基于显微注射的奶山羊胚胎基因高效编辑方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)sgRNA的设计
参见图1，根据在线网站CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)合成含有靶向山羊SCD1基因第一外显子E1、第三外显子E3的sgRNA寡核苷酸序列和反向互补序列的退火引物(对应sgRNA序列sgRNA9、sgRNA16如表1所示)，其中，各寡核苷酸序列末端分别添加有BsaⅠ酶切位点序列。将合成的单链引物进行DNA退火复性(参见表2、表3)，形成具有黏性末端的sgRNA双链寡核苷酸。
表1.山羊SCD1基因sgRNA序列及退火引物
注：sgRNA在SCD1基因CDS中(GenBank:GU947654.1)的位置分别为：sgRNA9在第6-25bp，sgRNA16在第339-358bp；退火引物中只保留了靶序列，不包含靶位点的PAM序列。
表2.sgRNA退火体系
表3.sgRNA退火程序
(二)sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录
将sgRNA体外转录用载体pUC57-sgRNA expression vector(Addgene 51132)经BsaⅠ于37℃过夜酶切(表4)，回收酶切后得到的线性化载体，利用T4 DNA连接酶，将sgRNA双链寡核苷酸与线性化载体于16℃过夜连接(表5)，之后转化Top10大肠杆菌感受态(CB104，天根北京)，经卡那霉素抗性筛选，单菌落于LB培养基过夜培养并提取质粒，测序得到正确构建的山羊SCD1基因sgRNA体外转录模板克隆载体pUC57-sgRNA(根据sgRNA序列，具体分为pUC57-sgRNA9、pUC57-sgRNA16)。
表4.载体酶切体系
表5.sgRNA与线性化载体的连接体系
以测序正确的pUC57-sgRNA载体为模板，通过PCR得到sgRNA体外转录模板，引物序列如表6所示：
表6.扩增体外转录模板T7-sgRNA的PCR引物
PCR反应体系及程序如表7所示：
表7.扩增体外转录模板T7-sgRNA的PCR反应体系及程序
PCR获得的T7-sgRNA9包括：T7启动子、sgRNA9序列及sgRNA scaffold；
PCR获得的T7-sgRNA16包括：T7启动子、sgRNA16序列及sgRNA scaffold；
其中，T7启动子序列为5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’；sgRNA scaffold序列为5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3’。
PCR产物经电泳后切胶回收，使用Axygen胶回收试剂盒回收体外转录模板DNA，在回收后的DNA体系中，按1:25的比例加入RNAsecure Reagent，60℃金属浴10min，使用Axygen PCR clean-up回收试剂盒在无酶环境中再次回收PCR产物，去除模板中的RNA酶。
以纯化回收的DNA作为sgRNA体外转录模板，测定回收的DNA浓度，按照MEGAshortscriptTM Kit说明书进行体外转录，模板DNA用量为800ng，37℃反应4h，转录后按照说明书加入DNaseⅠ，去除模板DNA，再按照MEGAclearTM Kit说明书纯化sgRNA。纯化后的sgRNA经180V、2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量(参见图2，体外转录获得的sgRNA，条带清晰无拖尾，表明纯度较高，可用于受精卵显微注射)，测定RNA浓度后分装并保存于-80℃。
将Cas9表达质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(Addgene 44758)经限制性内切酶AgeⅠ于37℃过夜酶切(表8-1)。
表8-1.载体酶切体系
在酶切后的反应液中按1:25的比例加入RNAsecure Reagent，60℃金属浴10min，使用PCR Purification Kit回收试剂盒在无酶环境中回收线性化载体并去除RNA酶，作为Cas9 mRNA体外转录模板，模板DNA用量为800ng。利用Cas9体外转录试剂盒MmessageMmachineTM T7 Ultra Kit进行体外转录，按照试剂盒说明进行加尾(参见表8-2)，并利用RNeasy Mini Kit试剂盒纯化回收获得加尾后的Cas9 mRNA。
表8-2.Cas9 mRNA加尾体系
注：体系组分轻柔混匀，置于37℃，孵育30-45min，结束后置于冰中。
参见图3，体外转录获得的Cas9 mRNA加尾后条带大于加尾前条带，表明mRNA成功加A尾，可用于翻译形成Cas9蛋白。
(三)体外切割活性实验
为了验证体外转录的sgRNA可以与Cas9蛋白正确结合并对靶序列进行切割，利用转录出的sgRNA与包含sgRNA靶位点的DNA片段及Cas9蛋白进行孵育，具体说明如下。
首先，以野生型基因组DNA为模板，利用SCD1基因不同外显子区的扩增引物(表9)，通过PCR得到包含sgRNA靶位点的DNA。PCR的反应体系和程序可参照表7。
表9.山羊SCD1基因外显子扩增引物
其次，PCR产物加入RNA secure Reagent后，60℃金属浴10min，除去RNA酶，使用PCR Purification Kit回收试剂盒在无酶环境中回收。利用体外切割试验体系(表10)，检测转录出的sgRNA的活性，以确定用于显微注射的sgRNA。
表10.体外切割试验体系
体外切割试验中，按照以上试验体系配制的混合样品于37℃孵育30min，使用DNA回收试剂盒回收DNA，以去除蛋白和buffer等其他杂质。1％琼脂糖凝胶电泳检测试验sgRNA导引下Cas9蛋白(即Cas9核酸酶)对靶DNA片段(即包含sgRNA靶位点的DNA)的体外切割情况。
参见图4，经T7-sgRNA9、T7-sgRNA16体外转录后得到的相应sgRNA，可在体外与Cas9蛋白形成复合物，并共同结合在靶DNA片段上进行切割，切割后的DNA断裂为小片段，证明sgRNA9、sgRNA16具有活性，可用于显微注射。
(四)受精卵显微注射
参见图7，本发明建立基于显微注射的奶山羊胚胎基因高效编辑方法的流程，具体如下。
1、基因编辑注射液
将两个sgRNA(具体指经T7-sgRNA9、T7-sgRNA16体外转录产物)共同与加尾后的Cas9 mRNA于无核酸酶水中混合后用于注射。混合所得的注射液中，Cas9 mRNA的浓度为50ng/μL，每个sgRNA的浓度为25ng/μL。
2、受试奶山羊采集
试验所用奶山羊为陕西杨凌示范区西北农林科技大学萨能奶山羊原种场的西农萨能奶山羊，试验进行时间为2019年9月。
3、同期发情与超数排卵
供体母羊与受体母羊在同一天放置阴道CIDR栓。
对供体母羊进行同期发情与超数排卵处理：供体母羊在放置CIDR栓的第12天19:00PM注射4mL的FSH，接下来三天每天7:00AM与19:00PM注射FSH，剂量分别为3mL、2mL、2mL、1.5mL、1mL、1mL，最后一次注射FSH的同时注射0.1mg PG，撤栓。发情母羊即可进行交配。
对受体母羊进行同期发情处理：受体母羊在放置CIDR栓的第12天19:00PM注射330单位的PMSG，并在第15天7:00AM撤栓，并同时注射0.1mg PG。
4、交配及收集受精卵
发情母羊与公羊本交后根据发情开始和结束时间确定冲胚时间。在母羊最后一次接受交配后(接受交配，表示处于发情状态；不接受交配，表示发情结束)的8-12小时(即发情开始后约46-50小时)，进行输卵管冲胚获得奶山羊受精卵。受精卵置于含有5％胎牛血清的M199培养液中，检胚结果表明，获得的受精卵均处于原核期。
5、奶山羊受精卵显微注射
参见图5，利用FemtoJet显微注射仪，在含有10％胎牛血清的M199培养液中进行显微注射。
注射前，利用Micropipette Puller P-97型拉针仪拉制出适合山羊受精卵的显微注射针，拉针仪参数设置为：heat＝816，pull＝100，velocity＝150，time＝200。确定最佳的注射参数为：注射压强pi＝400hPa，注射时间ti＝0.3s，维持压强pc＝30hPa。
显微注射结束后在显微镜下对受精卵进行观察，统计由于显微注射后导致的胚胎死亡数目，经过与注射前受精卵总数进行比较，结果表明胚胎存活率可达82.7±2.9％。
6、奶山羊胚胎SCD1基因编辑效率检测
在最佳注射参数下将针对奶山羊基因组SCD1基因两个外显子的sgRNA与加尾后的Cas9 mRNA共同注射入山羊受精卵，注射后的受精卵置于37℃培养箱培养半小时，存活的受精卵快速运至胚胎移植手术室，移植到受体母羊的输卵管。移植后的母羊正常饲养管理，并监测健康情况。同时为了便于观察胚胎发育情况，保留了部分存活受精卵继续体外培养，在胚胎发育至囊胚期时收取单枚胚胎，利用单细胞基因组扩增试剂盒REPLI-gSingle CellKit(Qiagen，150343)进行基因组提取，随后对基因编辑位点进行PCR扩增并测序，并据此分析计算相应sgRNA在奶山羊胚胎水平的基因编辑效率。
体外培养：将存活的受精卵中的一部分移入G1胚胎培养液中清洗三次后置于25μL液滴中进行培养(表面覆盖石蜡油，每个液滴中10-15枚胚胎)。体外培养24小时后，胚胎发育至二细胞期，将胚胎移入葡萄糖丰富的G2胚胎培养液中继续培养至第7天，统计发育到囊胚期的胚胎。结果表明，各液滴中发育到囊胚期的奶山羊胚胎平均为7枚。
参见图6，本发明注射入受精卵的sgRNA/Cas9 mRNA，发挥了对奶山羊胚胎中目的基因(SCD1基因)进行高效编辑的作用，同时显微注射两个sgRNA后得到的胚胎(囊胚)基因编辑效率为35％(7/20)，其中，sgRNA9基因编辑效率为20％(4/20)，sgRNA16基因编辑效率为30％(6/20)。因此，共同注射两种sgRNA可提高受精卵的基因编辑效率。
(五)实验对照和补充说明
1、关于sgRNA的设计说明
本发明依据卵母细胞水平基因编辑结果筛选到效率最高的sgRNA(sgRNA9、sgRNA16)，然后用于山羊受精卵。
2、关于确定原核期受精卵的收集时间
本发明在观察到母羊发情后，每隔8小时对母羊进行试情，24小时内监测3次发情情况，准确掌握母羊发情开始和结束时间。综合考虑两个方面，也就是同时监测发情开始和结束时间，并确定在母羊最后一次接受交配后8-12小时(即发情开始后约46-50小时)进行原核期受精卵的收集，与现有技术一般根据发情开始时间确定原核期受精卵的收集时间相比更为准确(特别对于确定注射时间而言)。
3、关于注射对胚胎发育的影响
已有文献报道中，小鼠受精卵显微注射后囊胚发育率可达到24.78％(28/113；许文豪，2018)。本发明中经显微注射后奶山羊胚胎的囊胚发育率可达到70％(7/10)。
总之，本发明在利用CRISPR/Cas9系统与显微注射进行山羊胚胎基因编辑中，通过对SCD1基因靶位点、显微注射时间、参数的控制与优化，提高了注射后受精卵的存活率，并获得了较高的胚胎发育率。
<110>西北农林科技大学
<120> 利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法
<160> 14
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213> sgRNA9
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ggcccacttg ctgcaagagg 20
<210>2
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<212>DNA
<213> sgRNA16
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<213> F9
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<212>DNA
<213> IVT-F
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<213> E1-F
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<213> E1-R
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cagaaggcta ccggcaggac c 21
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<213> E3-F
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atcaaggtat ccctggagtt c 21
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<213> E3-R
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ctgggtgata acagaggtgc a 21
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<212>DNA
<213> T7启动子
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taatacgact cactatagg 19
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<212>DNA
<213> sgRNA scaffold
<400>14
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
Claims (10)
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；
2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列为：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
及
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。
4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述步骤2)中，对发情母羊最后一次接受交配后8-12小时或发情开始后46-50小时收集的受精卵进行体外注射。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-50hPa。
6.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射采用的显微注射针利用拉针仪拉制而成，拉制参数设置为：heat＝786-846，pull＝90-110，velocity＝140-160，time＝190-210。
7.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
8.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括sgRNA体外转录模板，所述体外转录模板含有用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA的编码序列；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
9.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括sgRNA体外转录模板克隆载体，所述克隆载体中的sgRNA体外转录模板含有用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA的编码序列；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
10.一种用于共打靶山羊SCD1基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列选自以下序列中的一个或两个：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。
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