CN116590392A - 一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在全基因组水平鉴定植物R‑loop位点的方法，包括如下主要步骤：利用核糖核酸酶H特异性地识别并消化R‑loop结构中DNA‑RNA杂合链，同时在DNA聚合酶I作用下，以DNA‑RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNaseH切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基；利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R‑loop位点。本发明的整个方法流程简单，所需DNA用量范围广(100ng‑8μg)，可视化效果强，理论上该方法适应于多种植物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在生理状态下，在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法。
背景技术
真核生物基因组中，除了典型的右手DNA双螺旋结构(又称为B型DNA)外，还存在一些非B型DNA的特殊二级结构，例如R-loop、G四联体(G4)和i-motif等结构。其中，R-loop是指基因组中，一条RNA链与其互补的DNA形成DNA-RNA杂合链，同时把另一条互补的DNA转换成单链状态，形成了一种类似于R字形的三链核酸结构，被称为R-loop结构。R-loop三链结构中，DNA-RNA杂合链的热稳定性远大于双链DNA或RNA(Roberts RW et al.,1992,Science,258(5087):1463-1466)。R-loop结构广泛分布于细菌、真菌、哺乳动物(如小鼠)、人类基因组以及高等植物(如拟南芥，水稻等)中。R-loop结构具有一系列的生物学功能。例如，导致人体基因组的不稳定、增加人类癌症风险、导致DNA双链断裂、影响基因转录、调控植物开花及根系的发育等。因此，人和动物植物基因组中，R-loop的鉴定及生物学功能研究已成为的一个新的研究热点。
目前在全基因组水平上捕获R-loop的方法主要有：基于S9.6抗体的DRIP-seq(DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)(Fang Y et al.,2019,GenomeResearch,29(8):1287-1297)和ssDRIP-seq(single-strand DNAligation-based libraryconstruction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)(Xu W etal.,2017,Nature Plants,3(9):704-714)以及基于核糖核酸酶H(RNaseH)的MapR(aNative and Antibody-Independent R-Loop Detection Strategy)(Qingqing Yan etal.,2019,Cell Rep,29(5):1369–1380)和R-ChIP(expressing a catalytically deadRNASEH1 followed by strand-specific amplification of immunoprecipitated(IPed)DNA)(Chen L et al.,2017,Molecular Cell,68(4):745-757)等。DRIP-seq和ssDRIP-seq鉴定R-loop的主要原理如下：首先使用S9.6抗体特异性地识别并富集DNA:RNA杂交链后，ssDRIP-seq采用单链DNA建库方法进行测序文库构建，而DRIP-seq先用核糖核酸酶H(RNaseH)消化结构中与DNA杂合的RNA链，最后合成杂合链DNA的第二链。在合成双链DNA过程中，胸腺嘧啶(T)碱基会被脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)替换，然后新的含有尿嘧啶(U)的DNA链会被尿嘧啶糖基化酶消化掉，最后构建成链特异的测序文库。通过Illumina测序平台测序，获得原始测序数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R-loop位点。理论上，DRIP能够特异性地识别基因组中RNase H敏感的R-loop，因此该方法通常采用RNase H预处理相同样本作为阴性对照。而MapR和R-ChIP是利用缺陷型RNaseH(只具有识别但不具有切割DNA-RNA杂合链的功能)特别性地识别并结合染色质上的R-loop结构，其中，MapR利用缺陷型RNaseH与微球菌核酸酶(MNase酶)的融合蛋白通过识别并切割R-loop附近的DNA片段，从而释放并捕获R-loop结构，用于建库测序，而R-ChIP则利用细胞系瞬时表达缺陷型RNaseH与一种Tag如GFP的融合蛋白，通过基于Tag的抗体来特异性的富集DNA-RNA杂合链，用于建库测序。经生物信息学分析，两种方法均可以在全基因组水平鉴定R-loop位点。
目前，植物中主要利用ssDRIP-seq和DRIP-seq的方法鉴定R-loop结构，该方法主要依赖单克隆S9.6抗体与DNA-RNA杂合体结合的特异性和亲和力，而不是对整个三链R-loop结构的识别。S9.6抗体与DNA-RNA杂交链具有高亲和力(Knig F et al.,2017,PLoSOne,12(6):e178875)，但对AT-rich的双链RNA(dsRNAs)也具有一定的亲和力(Hartono SRetal.,2018,Journal of Molecular Biology,430(3):272-284)，说明该方法存在潜在的特异性问题。由于S9.6抗体结合区域较大，可能会把R-loop核心区域附近的双链DNA(dsDNA)一起沉淀下来，从而影响DRIP-seq检测的精度。此外，超声波打断R-loop区域时，可能会导致RNA链的迁移甩出，使单链DNA(ssDNA)重新退火，与模板链恢复dsDNA的状态，会引起检测出的R-loop数量可能少于基因组中实际存在的R-loop数量。另外，该方法所需要的初始DNA量较多(5-8μg)。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法；该方法可以在植物生理状态下鉴定全基因组R-loop位点；该方法灵敏度高，可适用于起始DNA为100ng。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明保护一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法(简称In situ DR-seq，又称ISDR)，利用适量的核糖核酸酶H(RNase H)消化基因组DNA，同时结合DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ)及时修复切割位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基进行原位标记：
具体的，提取基因组DNA，利用适量的核糖核酸酶H(RNase H)特异性地识别并消化R-loop结构中DNA-RNA杂合链，同时在DNA聚合酶I(DNA polymeraseⅠ)作用下，以DNA-RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNase H切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基。利用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过IlluminaNovaSeq测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R-loop位点。
此外，本方法也可以直接利用细胞核进行反应。将提取的细胞核直接利用核糖核酸酶H(RNase H)消化R-loop结构中与DNA-RNA杂合链，同时利用DNA聚合酶I进行修补，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基进行原位标记，反应结束后将其片段化，利用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过Illumina NovaSeq测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R-loop位点。
本发明的方法为在生理状态下鉴定植物全基因组R-loop位点提供一种新方法，有利于后续进一步解析植物R-loop介导的相关分子机制。此外，该方法所鉴定的一些关键位点R-loop有望用于农作物分子育种，对基于R-loop的作物抗逆分子育种提供技术支持。
作为本申请的优选技术方案，所述在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的体外实验方法，主要包括如下步骤：
(1)提取并纯化植物材料的细胞核；
(2)提取基因组DNA；
(3)DNA片段化处理并检测片段化效果；具体为将DNA片段化至100-500bp，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果；
(4)酶切并原位标记R-loop位点；其中，原位标记反应液主要含有：步骤(3)的片段化DNA、RNaseH、DNA polymeraseⅠ、dNTP mix以及biotin-14-dATP和biotin-16-dCTP；在16℃条件下，酶切并原位标记R-loop位点；
(5)回收反应后含有biotin标记的新合成的DNA；
(6)利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成为单链DNA；
(7)利用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段；
(8)利用单链DNA文库试剂盒构建含有biotin标记的单链DNA测序文库，通过Illumina测序平台配对测序，获得测序原始数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R-loop位点。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中提取并纯化植物材料的细胞核的过程为：将植物材料用液氮充分研磨成粉末，向粉末中加入等体积的核提取缓冲液，充分搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃上清，得到细胞核沉淀；再加入细胞核清洗液重悬细胞核沉淀，再次离心，弃上清液，重复细胞核清洗过程直至细胞核颜色为白色或淡黄色，用RSB缓冲液重悬纯化后的细胞核，离心后弃尽上清；最后，保留沉淀，即纯化的细胞核。
优选的，所述核提取缓冲液(H1B)的配方为：20mM Tris-HCl，50mM EDTA，5mMSpermidine，0.15mM spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol。
优选的，所述细胞核清洗液(H1BW)的配方为：20mM Tris-HCl，50mM EDTA，5mMSpermidine，0.15mM Spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol，0.5％Triton X-100。
优选的，所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，10mM NaCl，3mM MgCl2。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中提取DNA片段方法为：向反应液中加入RNaseA，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入Proteinase K及SDS于55℃水浴中孵育2h；用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于50μl EB缓冲液。
优选的，所述EB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl,pH 8.0。
作为一种优选技术方案，步骤(3)中DNA片段化处理并检测片段化效果过程为：用EB缓冲液补齐DNA总体积在200μL，破碎前可加入SDS，用非接触式超声波破碎仪(参数设置为High能量，20s开启，40s停止为1个循环)于4℃处理DNA(3～15个循环)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果。如果经过片段化处理的DNA片段均匀分布在100～500bp，用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液并加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀，用75％酒精清洗干燥后，用20μl EB缓冲液溶解。
优选的，所述SDS终浓度为0.5％；
作为一种优选技术方案，步骤(4)中酶切并原位标记R-loop位点的过程为：将步骤(3)所得DNA充分重悬于1x NEBuffer2中，分别加入dNTP mix(dTTP，dGTP，dCTP，dATP)及生物素(biotin)标记的dCTP(biotin-16-dCTP,orb64049，biorbyt)，biotin标记的dATP(biotin-14-dATP,orb533181，biorbyt)，再加入DNA ploymeraseⅠ和RNase H以及DTT，于16℃反应3小时，期间每半小时轻轻混匀1次。
优选的，片段化DNA为8μg时，所述dNTP和酶的终浓度分别为：0.05mM dTTP和dGTP，0.025mM dCTP，0.035mM dATP及0.025mM biotin-16-dCTP，0.015mM biotin-14-dATP；50UDNA ploymeraseⅠ和25U的RNase H。
作为一种优选技术方案，步骤(5)中的回收DNA过程为：用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇以及10μg糖原，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于20μl EB缓冲液。
作为一种优选技术方案，步骤(6)中利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成为单链DNA过程为：取10μl步骤(5)所得的DNA于PCR管中，加入Low-EDTA TE稀释到总体积为15μl；放入PCR仪中，95℃孵育2min，立即置于冰水混合物中，静置至冷却。
作为一种优选技术方案，步骤(7)中利用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段的过程为：充分重悬于4℃冰箱保存的streptavidin磁珠，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xTWB Buffer重悬Beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xTWB Buffer重悬beads，将含有biotin-标记的DNA复合物与等量的2xBB buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不能与biotin结合的DNA片段。
优选的，所述1xTWB Buffer的配方为：0.5mM EDTA，5mM Tris-HCl,pH 7.5，1MNaCl，0.05％Tween 20。
所述2xBB buffer的配方为：1mM EDTA，10mM Tris-HCl,pH 7.5，2M NaCl。
作为一种优选技术方案，步骤(8)的具体过程为：将步骤(7)中与streptavidin结合含有biotin标记的单链DNA片段的beads直接用于构建单链DNA测序文库，分离纯化200-350bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序平台2x150配对测序，获得测序原始数据。
进一步优选的步骤(8)的详细过程为：根据具体单链建库试剂盒说明书，加入相应体积的Low-EDTA TE*缓冲液重悬beads，再直接加入建库所用试剂；根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads；按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂；文库扩增结束后；该上清经过纯化即为可用于测序的文库DNA，于IlluminaNovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
本发明还保护前文任一所述的一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法在农作物分子育种中的应用；优选的，所述植物为水稻、小麦、玉米或拟南芥中的一种或多种。
有益效果
与现有的方法相比，本发明提供的一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法具有以下优点：
(1)本发明的方法所需初始量细胞少，100ngDNA即可获得有效数据；
(2)目前已将本发明的方法用于在全基因组水平鉴定水稻正常生长下的R-loop位点。
附图说明
图1为本实验建立的In situ DR-seq(ISDR)体系的主要步骤流程图；
图2为经过超声波处理后的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果，左边条带为Marker，右边为目标条带；
图3构建的Illumina测序文库纯化后的DNA片段，左边条带为Marker，右边条带为目标条带；
图4为不同起始DNA用量所得R-loop位点的可视化的效果图；
其中，图2-图4为针对水稻日本晴叶片材料在正常生长14天条件下结果图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限于本发明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
本发明是一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法，主要步骤包括：提取和纯化实验材料细胞核，提取DNA并将其片段化，加入适量的RNase H、DNA polymerase I及biotin-14-dATP和biotin-16-dCTP，酶切并同时进行原位标记R-loop位点，提取新合成的含有生物素标记的基因组DNA，通过高温变性将双链DNA解链为单链用于后续构建文库，利用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠(65001，Life Technologies)结合含有biotin标记的新合成的DNA片段，用于建库测序，经生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定R-loop位点。
下文举例说明本发明优选的具体实施方式，但本发明不限于此。
实施例1
(1)提取并纯化细胞核
选取2-5g实验材料用液氮充分研磨成粉末，取2-3ml的粉末用于提取细胞核。向粉末中加入等体积核提取缓冲液(H1B)，搅拌成匀浆后将离心管平放于冰上60rpm摇晃6min。
将匀浆液用2层microcloth纱布过滤到1个新的50ml离心管中，4℃，1,000g离心10min。弃去上清得到细胞核沉淀，加入2ml H1B Washing Buffer(HIBW))，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用3ml HIBW冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同1个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀3至5次，4℃，1,000g离心10min，弃上清，重复该步骤3次，直到细胞核颜色为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。
用5ml的RSB缓冲液重新悬浮纯化的细胞核，4℃，1,000g离心10min，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。用400μl的RSB缓冲液重新悬浮细胞核，并将细胞核转移到1个新的1.5ml离心管中。
所述核提取缓冲液(H1B)的配方为：20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM EDTA，5mMSpermidine，0.15mM Spermine，40％(v/v)Glycerol，0.1％(v/v)Mercaptoethanol。
所述细胞核清洗液(H1BW)的配方为：20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM EDTA，5mMSpermidine，0.15mM Spermine，40％(v/v)Glycerol，0.1％(v/v)Mercaptoethanol，0.5％(v/v)Triton X-100。
所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl(pH＝7.4)，10mM NaCl，3mM MgCl2。
(2)提取基因组DNA
向反应液中加入5μl RNase A(10μg/μl)，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入5μlProteinase K(10μg/μl)和终浓度为0.5％SDS(w/v)于55℃水浴中孵育2h；用等体积的酚仿(1:1)抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于200μl EB缓冲液。
(3)对DNA进行片段化处理并检测片段化效果
用非接触式超声波破碎仪(参数设置为High能量，20s开启，40s停止为1个循环)在4℃条件下处理溶于EB缓冲液的DNA 3～15个循环，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果，最终获得片段化的DNA片段均匀分布在100～500bp。加入等体积的酚仿(1:1)，剧烈混匀后于12,000rpm，4℃，离心10min后，保留上清液于1个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，回收DNA沉淀，用75％酒精清洗回收的DNA沉淀2次，于空气中干燥5min，用20μl EB缓冲液溶解DNA并测量浓度；立即进行下一步反应或者将DNA放置在-20℃冰箱中保存待用。
(4)酶切并标记R-loop位点
取8μg片段化的DNA，加入20μl 10x NEBuffer2，再分别加入1μl 10mM dTTP，1μl10mM dGTP，0.5μl 10mM dCTP，0.7μl 10mM dATP及5μl 1mM biotin-dCTP、3μl 1mMbiotin-dATP，再加入5μl DNA ploymeraseⅠ(10U/μl)和10μl RNaseH(5U/μl)以及5μl100mM DTT，补H2O至200μl于16℃反应3小时，期间每半小时轻轻混匀一次。
(5)回收DNA片段
反应结束后补H2O至400μl，加入等体积的酚仿(1:1)抽提，剧烈混匀后于12,000rpm，4℃，离心10min，离心后保留上清液于1个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇以及10μg糖原，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗2次，空气中干燥后，溶解于20μl EB缓冲液，立即进行下一步反应或者将DNA放置在-20℃冰箱中保存待用。
(6)双链DNA变性成为单链DNA状态
取10μl回收后的DNA于PCR管中，加入Low-EDTA TE稀释到总体积为15μl。放入PCR仪中，95℃孵育2min，立即置于冰水混合物中，静置至冷却。
(7)用链霉抗生物素蛋白(Strepavidin)的磁珠富集含有生物素(biotin)标记的新合成的DNA片段
充分重悬于4℃冰箱保存的streptavidin的磁珠，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xTWB Buffer重悬Beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xTWB Buffer重悬beads，将含有biotin-标记的DNA复合物与等量的2xBB buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不能与biotin结合的DNA片段。
所述1xTWB Buffer的配方为：0.5mM EDTA，5mM Tris-HCl,pH 7.5，1M NaCl，0.05％Tween 20。
所述2xBB buffer的配方为：1mM EDTA，10mM Tris-HCl,pH 7.5，2M NaCl。
(8)将有Biotin标记的单链DNA用于构建Illumina测序文库并进行测序
根据具体单链建库试剂盒说明书，加入相应体积的Low-EDTA TE*缓冲液重悬beads，再直接加入建库所用试剂。根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads。按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂。文库扩增结束后。该上清经过纯化即为可用于测序的文库DNA，于IlluminaNovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
实验结果显示：
(1)本实验所建立的In situ DR-seq体系的主要步骤流程如图1所示；
(2)经过超声波处理后的DNA片段均匀分布在100～500bp范围内，如图2所示。
(3)取适量的DNA用于构建Illumina测序文库，回收并纯化DNA片段用于测序，文库构建检测如图3所示。
(4)通过生物信息学分析，鉴定R-loop位点，其可视化的效果图如图4所示，图示分别为8μg、5μg、3μg、1μg、500ng、250ng的两个重复起始DNA和100ng的起始DNA所得R-loop位点可视化。
图2-图4为针对在正常条件下，生长14天水稻日本晴叶片材料，利用100ng～8μg不同用量起始DNA进行实验，均可在全基因组水平鉴定R-loop位点。
相关技术术语的名词解释
核提取缓冲液(HIB):用于提取细胞核的缓冲溶液。
核清洗液(H1BW)：用于纯化细胞核的缓冲溶液。
DNA polymerase I：DNA聚合酶I，以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的酶。
Biotin：生物素
RNase H:核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。
RNase A：一种降解RNA的核糖核酸酶。
Proteinase K：蛋白酶K，主要降解蛋白质。
TWB：用于清洗beads的缓冲液。
BB：用于稀释DNA的缓冲液。
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷。。
EDTA：乙二胺四乙酸。
Illumina测序文库：基于第二代DNA测序技术而建立的DNA文库。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (10)
1.一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法，其特征在于，利用核糖核酸酶H特异性地识别并消化R-loop结构中DNA-RNA 杂合链，同时在DNA聚合酶I作用下，以DNA-RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNaseH切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基；利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R-loop位点；
优选的，该方法主要包括如下步骤：
(1)提取并纯化植物材料的细胞核；
(2)提取基因组DNA；
(3)将DNA片段化至100-500bp，并利用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果；
(4)酶切并原位标记R-loop位点；
(5)回收反应后含有biotin标记的新合成的DNA；
(6)利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成为单链DNA；
(7)利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段；
(8)利用单链DNA文库试剂盒构建含有biotin标记的单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R-loop位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中提取并纯化植物材料的细胞核的过程为：将植物材料用液氮充分研磨成粉末，向粉末中加入等体积的核提取缓冲液，充分搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃上清，得到细胞核沉淀；再加入细胞核清洗液重悬细胞核沉淀，再次离心，弃上清液，重复细胞核清洗过程直至细胞核颜色为白色或淡黄色，用RSB缓冲液重悬纯化后的细胞核，离心后弃尽上清；最后，保留沉淀，即纯化的细胞核；
优选的，所述核提取缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM EDTA，5mM Spermidine，0.15mM spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol；
优选的，所述细胞核清洗液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM EDTA，5mM Spermidine，0.15mM spermine，40％Glycerol，0.1％Mercaptoethanol，0.5％Triton X-100；
优选的，所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，10mM NaCl，3mM MgCl2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取DNA方法为：向反应液中加入RNase A，于37℃水浴中孵育0.5～1h后，再加入Proteinase K及SDS于55℃水浴中孵育2h；用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于50μl EB缓冲液；
优选的，所述EB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl,pH 8.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中DNA片段化过程为：用EB缓冲液补齐DNA总体积在200μL，用非接触式超声波破碎仪，于4℃条件下进行片段化；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果，用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液并加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀，用75％酒精清洗干燥后，用20μl EB缓冲液溶解；
优选的，破碎前可加入SDS，所述SDS终浓度为0.5％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中酶切并原位标记R-loop位点的过程为：将步骤(3)所得DNA充分重悬于1xNEBuffer2中，分别加入dNTP mix及生物素标记的dCTP，biotin标记的dATP，再加入DNA ploymeraseⅠ和RNase H以及DTT，于16℃反应3小时，期间每半小时轻轻混匀1次。
优选的，片段化DNA为8μg时，所述dNTP和酶的终浓度分别为：0.05mM dTTP和dGTP，0.025mM dCTP，0.035mM dATP及0.025mM biotin-16-dCTP，0.015mM biotin-14-dATP；50UDNA ploymeraseⅠ和25U的RNase H。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中的回收DNA过程为：用等体积的酚仿抽提，离心后保留上清液，并加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇以及10μg糖原，混匀后于-20℃放置0.5～1.5h后，离心回收DNA沉淀，回收的DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，溶解于20μl EB缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成单链DNA具体过程为：取10μl步骤(5)所得的DNA于PCR管中，加入Low-EDTATE稀释到总体积为15μl；放入PCR仪中，95℃孵育2min，立即置于冰水混合物中，静置至冷却。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段的过程为：充分重悬于4℃冰箱保存的streptavidin磁珠，分装beads到一个新的离心管中；用4℃预冷的1xTWB Buffer重悬Beads，静置1min后，用磁板回收beads，弃去上清；重复3次，最后1次尽量去除上清，加入1xTWB Buffer重悬beads，将含有biotin-标记的DNA复合物与等量的2xBB buffer混匀，再加入到清洗后的beads中，在混匀仪上于25～30℃，10rpm旋转0.5h；用磁板收集beads，弃去反应混合液，分离不含有biotin标记的DNA片段。
优选的，所述1xTWB Buffer的配方为：0.5mM EDTA，5mM Tris-HCl,pH 7.5，1M NaCl，0.05％Tween 20；
优选的，所述2xBB buffer的配方为：1mM EDTA，10mM Tris-HCl,pH 7.5，2M NaCl。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)的具体过程为：将步骤(7)中与streptavidin结合含有biotin标记的单链DNA片段的beads直接用于构建单链DNA测序文库，分离纯化200-350bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序平台2x150配对测序，获得测序原始数据。
优选的，所述步骤(8)的详细过程为：根据具体单链建库试剂盒说明书，加入相应体积的Low-EDTA TE*缓冲液重悬beads，再直接加入建库所用试剂。根据试剂盒说明书完成平末端修复和接头连接后，用磁板分离beads，保留上清，弃去beads。按照试剂盒说明书加入文库扩增所用试剂。文库扩增结束后。该上清经过纯化即为可用于Illumina测序的文库DNA，利用IlluminaNovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
10.权利要求1-9任一所述的一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法在农作物分子育种中的应用；优选的，所述植物为水稻、小麦、玉米或拟南芥中的一种或多种。
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