CN108977438A - 一种配种动物dna的提取方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种配种动物的DNA提取方法及试剂盒。所述方法包括：(1)取育种用动物精液3μL至10μL；(2)将动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:50至1:180混匀；(3)裂解完成后加结合液和异丙醇；(4)加入结合液以及异丙醇混匀；(5)将结合反应体系加入磁珠吸附；(6)吸附有DNA的磁珠经漂洗处理后进行洗脱。本发明提供的试剂盒，包括裂解液、蛋白酶K溶液、结合液、第一至第三洗涤液、洗脱液、以及磁珠。本发明样本为微量精液，为育种动物所必然会采集的组织样本，采用本发明的提取方法，以微量精液为样本，不会影响育种动物的正常生活，也不会增加分子育种的采样环节，不会带入不确定因素和风险。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，涉及一种配种动物DNA的提取方法及试剂盒。
背景技术
分子育种是将分子生物学技术应用于育种中，在分子水平上进行育种。通常包括：分子标记辅助育种和遗传修饰育种(转基因育种)。随着分子生物学、分子遗传学、基因组学的不断发展，分子育种的意义越来越重大。
基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA的提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容。我们通常需要大量高质量的动物基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。不同于植物育种中的采样过程，动物分子育种的活体采样对待配种动物的活体采样具有一定的损伤，会影响配种动物的正常生活甚至生命周期，从而导致待配种动物的品质下降或者不确定。因此目前的动物分子育种过程，不利于产生具有稳定遗传形状的配种动物。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种配种动物DNA的提取方法及试剂盒，其目的在于通过对微量精液的DNA，提供一种高效率高纯度提取方法及试剂盒，由此解决现有的配种动物DNA提取过程影响配种动物的正常生活的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种配种动物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取育种用动物精液3μL至10μL；
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:50至1:180混匀，获得裂解反应体系；
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系60℃至70℃裂解0.5小时至1小时，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入300μL至400μL的结合液、以及350μL至450μL的异丙醇混匀，获得结合反应体系；
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入10μL至20μL磁珠，混匀后，吸附8分钟至12分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其步骤(1)所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵、以及15mmol/L至25mmol/L的β-巯基乙醇。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其步骤(1)所述裂解液含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、质量分数在3％至8％的表面活性剂。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其步骤(1)所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其步骤(1)所述裂解液为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其所述离液剂为盐酸胍；所述金属螯合剂为EDTA，所述表面活性剂为Triton。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其步骤(6)所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠分散液加入450μL至500μL的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入550μL至650μL的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入550μL至650μL的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠；
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入50μL至100μL洗脱液，60℃至70℃孵育5分钟至10分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
优选地，所述配种动物DNA的提取方法，其所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/l Tris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精；所述洗脱液含有10mmol/L Tris-hcl、以及1mmol/L EDTA。
按照本发明的另一个方面，提供了一种配种动物DNA的提取试剂盒，按照体积份数包括：90至110份的裂解液、1至4份的蛋白酶K溶液的蛋白酶K溶液、50至70份的结合液、90至110份的第一洗涤液、110至130份的第二洗涤液、110至130份的第三洗涤液、以及10至20份的洗脱液；还包括以浓缩形式或者分散液形式存在的磁珠，每100μL结合液对应1mg磁珠；
所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵、以及15mmol/L至25mmol/L的β巯基乙醇。
优选地，所述配种动物DNA的提取试剂盒，其所述裂解液含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、以及质量分数在3％至8％的表面活性剂；所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L，为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L；所述离液剂优选盐酸胍；所述金属螯合剂优选EDTA，所述表面活性剂优选Triton；
所述蛋白酶K溶液，浓度在10mg/ml至20mg/ml之间；
所述浓缩形式存在的磁珠即磁珠浓缩液，浓度在80mg/ml至100mg/ml之间；所述分散形式存在的磁珠即磁珠分散液，浓度在3mg/ml至6mg/ml之间；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明采用的DNA提取方法样本为微量精液，为育种动物所必然会采集的组织样本，采用本发明的提取方法，以微量精液为样本，不会影响育种动物的正常生活，也不会增加分子育种的采样环节，不会带入不确定因素和风险。
本发明提供的配种动物DNA的提取方法，无需对精液进行预处理，与核酸提取仪结合使用减少人为操作、节省人力，可实现批量化、微量化、自动化的DNA提取，适合配种动物高通量的DNA提取。
本发明提供的试剂盒，不含有有毒的有机溶剂、安全，适合长期、大量存放。
附图说明
图1是本发明实施例1配种动物提取的DNA电泳结果图；
图2是本发明实施例2配种动物提取的DNA电泳结果图；
图3是本发明实施例3配种动物提取的DNA电泳结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的配种动物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取育种用动物精液3μL至10μL；
育种动物能提供的生物样本的种类和重量都十分有限，目前传统动物DNA检测最常用的样品是血液，其他常用样本例如肌肉、肝脏，采样过程对于育种动物都会产生不同程度的影响，使得育种过程增加不确定因素，影响育种动物的正常生活；同时，随着分子育种技术的不断发展，需要高通量的进行DNA检测，生物样本的采集带来大量的工作量。
因此本发明对于分子育种过程中的DNA检测的样本选择动物精液，由于动物精液是分子育种过程中必然会采集的生物样本，因此DNA检测样本的获取，不会增加育种过程的不确定因素，也不会增加采样工作量，分子育种过程的高通量检测。
另外本发明的检测方法，精液样本用量极少，对于正常的育种工作几乎无影响。
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:50至1:180混匀，获得裂解反应体系；所述裂解反应体系中蛋白酶K含量为100-300ug；所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、以及15mmol/L至25mmol/L的β巯基乙醇(DTT)，优选还含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、质量分数在3％至8％的表面活性剂；所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L，为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L。所述离液剂优选盐酸胍；所述金属螯合剂优选EDTA，所述表面活性剂优选Triton。
动物精液中含有高浓度的蛋白质，精子细胞膜较厚，同时含有大量种类复杂的多糖类，一般的裂解方法难以使其破裂，释放基因组，并且精子中含有大量精胺和亚精胺，这是一类小分子阳离子，与DNA结合后导致DNA溶解性下降。因此，提取高纯度的精子基因组DNA比较困难，而高浓度、密度的精子，提取其DNA更为困难。本发明针对以上问题，在裂解液中添加了CTAB，与多糖类无知共沉淀，出去精液中的杂质，配合离液剂能对细胞膜起到降解作用，降低裂解难度，促进基因组释放。另外添加DTT提供乎案源环境，利于出去杂质，减少精胺和亚精胺与DNA的结合，从而提高DNA的溶解度。针对本发明样本量极少的前提条件，充分裂解以释放基因组，提高DNA溶解度对于提取效果至关重要。
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系60℃至70℃裂解0.5小时至1小时，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入300μL至400μL的结合液、以及350μL至450μL的异丙醇混匀，获得结合反应体系。所述结合液含有3mol/L至6mol/L的盐酸胍、以及1-2％triton。
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入10μL至20μL磁珠，混匀后，吸附8分钟至12分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
同样由于样本量极少，相较于传统的酚氯仿抽提法，采用磁珠法吸附富集DNA效果较好。
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠分散液加入450μL至500μL的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/l Tris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入550μL至650μL的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入550μL至650μL的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠。所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入50μL至100μL洗脱液，60℃至70℃孵育5分钟至10分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
所述洗脱液，优选含有10mmol/L Tris-hcl、以及1mmol/L EDTA。
本发明提供的配种动物DNA的提取试剂盒，按照体积份数包括：90至110份的裂解液、1至4份的蛋白酶K溶液、50至70份的结合液、90至110份的第一洗涤液、110至130份的第二洗涤液、110至130份的第三洗涤液、以及10至20份的洗脱液；还包括以浓缩形式或者分散液形式存在的磁珠，即磁珠浓缩液或磁珠分散液，每100μL结合液对应1mg磁珠。
所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、以及15mmol/L至25mmol/L的β巯基乙醇(DTT)，优选还含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、质量分数在3％至8％的表面活性剂；所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L，为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L。所述离液剂优选盐酸胍；所述金属螯合剂优选EDTA，所述表面活性剂优选Triton。
所述蛋白酶K溶液，浓度在10mg/ml至20mg/ml之间；
所述结合液含有3mol/L至6mol/L的盐酸胍、以及1-2％triton。
所述磁珠浓缩液，浓度在80mg/ml至100mg/ml之间；所述磁珠分散液，浓度在3mg/ml至6mg/ml之间；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
以下为实施例：
实施例1(手动提取)
一种种猪DNA的提取试剂盒，包括：450μL的裂解液、5μL的蛋白酶K溶液、250μL的结合液、10μL磁珠浓缩液、450μL的第一洗涤液、550μL的第二洗涤液、550μL的第三洗涤液、50μL份的洗脱液；
所述裂解液含有质量分数1％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、以及15mmol/L的β巯基乙醇(DTT)、3mol/L离液剂、10mmol/L的金属螯合剂、质量分数为3％的表面活性剂；所述裂解液含有氯化钠150mmol/L，为pH值7的Tris缓冲溶液，其中Tris含量为3mol/L。所述离液剂为盐酸胍；所述金属螯合剂为EDTA，所述表面活性剂为Triton。
所述蛋白酶K溶液，浓度为10mg/ml；
所述结合液含有3mol/L的盐酸胍、以及1％triton。
所述磁珠浓缩液，浓度为80mg/ml；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数1％Triton，质量分数0.4％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
一种种猪DNA的提取方法，采用本实施例提供的试剂盒，包括以下步骤：
(1)取种猪精液3μL；
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:50混匀，获得裂解反应体系；所述裂解反应体系中蛋白酶K含量为100ug。
所述裂解液为本实施例试剂盒提供的裂解液；所述蛋白酶K溶液为本实施例试剂盒提供的蛋白酶K溶液。
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系60℃裂解1小时，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入300μL的结合液、以及350异丙醇混匀，获得结合反应体系；
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入10μLμL磁珠，混匀后吸附8分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
同样由于样本量极少，相较于传统的酚氯仿抽提法，采用磁珠法吸附富集DNA效果较好。
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠加入450μL本实施例试剂盒提供的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入550μL，本实施例试剂盒提供的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入550、μL本实施例试剂盒提供的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠。
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入50μL本实施例试剂盒提供的洗脱液，60℃孵育10分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
提取的DNA，电泳结果如图1所述，可以看到提取的DNA条带清晰、亮度一直，说明DNA提取完整、几乎没有降解。
实施例2(自动提取)
一种种猪DNA的提取试剂盒，包括：500μL的裂解液、20μL的蛋白酶K溶液、300μL的结合液、(500μL*96)磁珠分散液、(500μL*96)的第一洗涤液、(600μL*96)的第二洗涤液、(600μL*96)的第三洗涤液、以及(100μL*96)份的洗脱液；
所述裂解液含有质量分数2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、以及20mmol/L的β巯基乙醇(DTT)、4mol/L离液剂、15mmol/L的金属螯合剂、质量分数为5％的表面活性剂；所述裂解液含有氯化钠200mmol/L，为pH值8的Tris缓冲溶液，其中Tris含量为3mol/L。所述离液剂为盐酸胍；所述金属螯合剂为EDTA，所述表面活性剂为Triton。
所述蛋白酶K溶液，浓度为15mg/ml；
所述结合液含有5mol/L的盐酸胍、以及1.5％triton。
所述磁珠分散液，浓度为4mg/ml；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数3％Triton，质量分数0.5％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
一种种猪DNA的提取方法，采用本实施例提供的试剂盒，包括以下步骤：
(1)取种猪精液5μL；
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:100混匀，获得裂解反应体系；所述裂解反应体系中蛋白酶K含量为200ug。
所述裂解液为本实施例试剂盒提供的裂解液；所述蛋白酶K溶液为本实施例试剂盒提供的蛋白酶K溶液。
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系65℃裂解45分钟，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入300μL的结合液、以及400异丙醇混匀，获得结合反应体系；
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入500μL磁珠，混匀后吸附10分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
同样由于样本量极少，相较于传统的酚氯仿抽提法，采用磁珠法吸附富集DNA效果较好。
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠加入500μL本实施例试剂盒提供的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入600μL本实施例试剂盒提供的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入600μL本实施例试剂盒提供的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠。
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入100μL本实施例试剂盒提供的洗脱液，65℃孵育10分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
步骤(5)～(6-3)在核酸提取仪上自动完成，参数设置如下：
将装有上清、结合液及异丙醇的深孔板，置于核酸提取仪工位1上，将装有磁珠、第一洗涤液、第二洗涤液和第三洗涤液以及洗脱液的深孔板分别置于工位2～6上。打开仪器电源，待仪器完成自检后，按如下表所示，设置仪器参数。
裂解温度：65℃；洗脱温度：65℃；4℃保存：30min
运行程序，程序结束后，仪器会自动停止，并且工位6会进入4℃保存程序，暂时保存样品。
DNA样品可以直接用于下游实验，或封装后4℃短暂保存数日，若要长时间保存，可以封装或转移至新的容器中，置于-20℃冰箱中长期保存。
提取的DNA，电泳结果如图2所示，可以看到提取的DNA条带清晰、亮度一直，说明DNA提取完整、几乎没有降解。
实施例3(手动提取)
一种种猪DNA的提取试剂盒，包括：550的裂解液、15μL的蛋白酶K溶液、350份的结合液、15μL磁珠浓缩液、550μL的第一洗涤液、650μL份的第二洗涤液、650μL的第三洗涤液、80μL的洗脱液；
所述裂解液含有质量分数3％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、以及25mmol/L的β巯基乙醇(DTT)、6mol/L离液剂、20mmol/L的金属螯合剂、质量分数为8％的表面活性剂；所述裂解液含有氯化钠300mmol/L，为pH值9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量为3mol/L。所述离液剂为盐酸胍；所述金属螯合剂为EDTA，所述表面活性剂为Triton。
所述蛋白酶K溶液，浓度为20mg/ml；
所述结合液含有6mol/L的盐酸胍、以及2％triton。
所述磁珠凝缩液，浓度为100mg/ml；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/lTris，质量分数4％Triton，质量分数2％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
一种种猪DNA的提取方法，采用本实施例提供的试剂盒，包括以下步骤：
(1)取种猪精液10μL；
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:180混匀，获得裂解反应体系；所述裂解反应体系中蛋白酶K含量为300ug。
所述裂解液为本实施例试剂盒提供的裂解液；所述蛋白酶K溶液为本实施例试剂盒提供的蛋白酶K溶液。
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系70℃裂解0.5小时，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入400μL的结合液、以及450异丙醇混匀，获得结合反应体系；
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入15μL磁珠，混匀后吸附12分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
同样由于样本量极少，相较于传统的酚氯仿抽提法，采用磁珠法吸附富集DNA效果较好。
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠加入550μL本实施例试剂盒提供的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入650μL本实施例试剂盒提供的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入650μL本实施例试剂盒提供的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠。
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入80μL本实施例试剂盒提供的洗脱液，70℃孵育8分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
提取的DNA，电泳结果如图3所示，可以看到提取的DNA条带清晰、亮度一直，说明DNA提取完整、几乎没有降解。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种配种动物DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取育种用动物精液3μL至10μL；
(2)将步骤(1)中获得的动物精液与预混有蛋白酶K的裂解液按照体积比1:50至1:180混匀，获得裂解反应体系；
(3)将步骤(2)中获得的理解反应体系60℃至70℃裂解0.5小时至1小时，裂解完成后获得经裂解的反应体系；
(4)将步骤(3)获得的经裂解的反应体系加入300μL至400μL的结合液、以及350μL至450μL的异丙醇混匀，获得结合反应体系；
(5)将步骤(4)中获得的结合反应体系加入10μL至20μL磁珠，混匀后，吸附8分钟至12分钟，获得吸附有DNA的磁珠，吸附期间维持磁珠均匀分散状态；
(6)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠，经漂洗处理后进行洗脱，固液分离后获得洗脱液，即为DNA样品。
2.如权利要求1所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵、以及15mmol/L至25mmol/L的β-巯基乙醇。
3.如权利要求2所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述裂解液含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、质量分数在3％至8％的表面活性剂。
4.如权利要求3所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L。
5.如权利要求4所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述裂解液为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L。
6.如权利要求5所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，所述离液剂为盐酸胍；所述金属螯合剂为EDTA，所述表面活性剂为Triton。
7.如权利要求1所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，步骤(6)所述漂洗处理具体如下：
(6-1)将步骤(5)中获得的吸附有DNA的磁珠分散液加入450μL至500μL的第一洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第一次漂洗处理后的磁珠；
(6-2)将步骤(6-1)中获得的经第一次漂洗处理后的磁珠加入550μL至650μL的第二洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经第二次漂洗处理后的磁珠；
(6-3)将步骤(6-2)中获得的经第二次漂洗处理后的磁珠，加入550μL至650μL的第三洗涤液，混合均匀，充分反应后静置分层，移去上层液体，获得经漂洗处理后的磁珠；
所述洗脱操作具体如下：
将步骤(6-3)中获得的经漂洗处理后的磁珠，加入50μL至100μL洗脱液，60℃至70℃孵育5分钟至10分钟，孵育期间振荡混匀，静置分层，吸取上层的洗脱液，即为DNA样品。
8.如权利要求1所述的配种动物DNA的提取方法，其特征在于，所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/l Tris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精；所述洗脱液含有10mmol/LTris-hcl、以及1mmol/L EDTA。
9.一种配种动物DNA的提取试剂盒，其特征在于，按照体积份数包括：90至110份的裂解液、1至4份的蛋白酶K溶液的蛋白酶K溶液、50至70份的结合液、90至110份的第一洗涤液、110至130份的第二洗涤液、110至130份的第三洗涤液、以及10至20份的洗脱液；还包括以浓缩形式或者分散液形式存在的磁珠，每100μL结合液对应1mg磁珠；
所述裂解液含有质量分数1％至3％的十六烷基三甲基溴化铵、以及15mmol/L至25mmol/L的β巯基乙醇。
10.如权利要求9所述的配种动物DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有3mol/L至6mol/L离液剂、10mmol/L至20mmol/L的金属螯合剂、以及质量分数在3％至8％的表面活性剂；所述裂解液钠离子含量大于或等于150mmol/L，优选300mmol/L，为pH值7至9的Tris缓冲溶液，其中Tris含量优选3mol/L；所述离液剂优选盐酸胍；所述金属螯合剂优选EDTA，所述表面活性剂优选Triton；
所述蛋白酶K溶液，浓度在10mg/ml至20mg/ml之间；
所述浓缩形式存在的磁珠即磁珠浓缩液，浓度在80mg/ml至100mg/ml之间；所述分散形式存在的磁珠即磁珠分散液，浓度在3mg/ml至6mg/ml之间；
所述第一洗涤液，pH值为8.0，含有200mmol/L NaCl、10mmol/l EDTA、25mmol/l Tris，质量分数1-4％Triton，质量分数0.4-2％的SDS；
所述第二洗涤液含有200mmol/L NaCl、以及质量分数75％酒精；
所述第三洗涤液pH值为7.5，含有10mmol/L Tris、以及质量分数75％酒精。
所述洗脱液含有10mmol/L Tris-HCl、以及1mmol/L EDTA。
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