CN108103090B - 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向mRNA的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6‑甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸。同时，本发明还公开了靶向mRNA的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统的制备方法及其应用。采用本发明的6‑甲基腺嘌呤修饰载体系统，可以对RNA 6‑甲基腺嘌呤修饰异常引起的疾病进行靶向修饰6‑甲基腺嘌呤，准确而高效，可以从根本上治疗RNA修饰缺陷引起的疾病。

Description

靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及RNA编辑技术领域，尤其是靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用。
背景技术
腺嘌呤6-甲基化(即m6A)是mRNA和长链非编码RNA中最为常见的修饰，研究证实m6A修饰发生在细胞核内，由甲基转移酶METTL3、METTL14、结合亚基WTAP及RBM15(m6A‘Writer’，m6A编码器)和去甲基转移酶FTO、ALKBH5(m6A‘Eraser’，m6A消码器)动态催化调节。m6A可以通过结合YTH结构域蛋白(m6A‘Writer’，m6A读码器)发挥其生物学作用。
CDCP1是一种重要的跨膜蛋白，由836个氨基酸组成，包括一个含29个氨基酸残基的氨基端信号肤及分别由636、21、150个氨基酸组成的胞外段、跨膜段和胞内段。研究证实CDCP1作为Src、EGFR、HER2等信号通路的关键节点在多种肿瘤发生发展中起重要作用。我们前期研究发现促癌基因CDCP1的3'UTR存在m6A甲基化修饰。
靶向RNA Cas9(RCas9)技术是Doudna实验室首先研究报道的，其作用原理是除设计sgRNA外，还通过提供包含PAM与靶RNA杂交的寡核苷酸(PAMmer)，利用依赖于PAM序列的Cas9靶向mRNA机制，在PAMmer/RNA杂交中存在错配的PAM序列，使得Cas9特异靶向RNA而不是基因组DNA(如图14所示)。Doudna实验室研究发现Cas9在PAMmer和sgRNA介导下在体外强烈和特异性结合和随后切割ssRNA。新近的研究揭示将dCas9(Cas9活性位点经过两个不同位置的定点突变：D10A、H841A，而丧失核酸内切酶活性)特异靶向mRNA，即通过RCas9技术可识别内源性mRNA，并能用于靶向的mRNA示踪。
发明内容
基于上述背景技术，为了寻找治疗RNA修饰异常引起的疾病的新思路，我们首次将m6A修饰酶的酶活性功能域连接到dCas9的C端，通过设计PAMmer和sgRNA，将其特异靶向mRNA上，从而对特异位点进行m6A修饰(如图15所示)；我们通过工程RNA修饰酶特异靶向底物以改变RNA修饰这一策略，为RNA修饰异常引起的人类疾病防治提供了新的途径。应当说明的是，此处的RNA修饰异常包括5-甲基胞嘧啶修饰，1-甲基腺嘌呤修饰等。
作为本发明的第一个方面，本发明提供了靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸。
应当说明的是，本文中的Cas9即核酸酶；3’UTR指信使RNA(mRNA)分子3’端的非编码片段；sgRNA指小向导RNA(small guide RNA)；此处的寡核苷酸指PAM序列(protospaceradjacent motifs)。其中，sgRNA表达载体可以靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中一个位点、两个位点、或者三个位点，甚至更多位点，可以根据需要进行选择。
优选地，所述6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区域对应的核苷酸序列与核酸酶失活的Cas9对应的核苷酸序列的C端连接，由此，表达的融合蛋白(即失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区对应的蛋白质)可在sgRNA以及PAMer的引导下对特定的RNA进行6-甲基腺嘌呤修饰。
优选地，所述6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区域为METTL3酶活性区域序列。
优选地，所述核糖核酸为环状的DNA，所述环状的DNA包括真核表达载体及插入所述真核表达载体的核定位序列和METTL3酶活性区域序列。由此，METTL3表达的酶可以对特殊基序—RRACU中的腺嘌呤进行甲基催化，即本申请中的腺嘌呤6-甲基(即m6A)修饰。
优选地，所述真核表达载体还包括EGFP序列。
优选地，所述表达载体包括pBlueScript II SK(-)质粒以及插入所述质粒中的人U6聚合酶Ⅲ启动子序列和sgRNA支架序列。
优选地，所述表达载体包括Lentiguide-puro载体以及插入所述Lentiguide-puro载体中的带有两个BsmBI酶切位点的sgRNA支架序列。
优选地，所述寡核苷酸包括PAM序列，所述PAM序列的5’端具有与靶序列互补的8个碱基。需要说明的是，此处的靶序列指CDCP1mRNA的3’UTR序列。
更优选地，所述寡核苷酸(即PAMmer)包括混合在一起的2'甲氧基修饰的RNA和不形成RNase H底物的DNA；其中，2'甲氧基修饰的RNA可以增加寡核苷酸的稳定性；RNase H即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)从载体pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry(addgene#60954)扩增出dCas9-2×NLS序列，从HUVEC细胞中扩增出METTL3酶活性区域序列，从载体pLKO.3G扩增出EGFP序列，通过PCR扩增、酶切、连接、转化，将dCas9-2×NLS序列，METTL3活性区域序列以及EGFP序列连接至pcDNA3.1V5HisTOPO载体，得到失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体；
(2)构建包括酶切位点序列和sgRNA支架序列的sgRNA支架结构；合成基于靶点序列的sgRNA；将所述sgRNA支架结构和基于靶点序列的sgRNA克隆至表达载体中，得到包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体；
(3)合成基于靶点序列、并与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸；
所述靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统包括所述失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、所述寡核苷酸以及所述包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体。其中，酶切位点序列可以是5'端带有两个BbsI酶切位点的sgRNA支架序列，还可以是5'端带有两个BsmBI酶切位点的sgRNA支架序列；启动子序列可以是人U6聚合酶III启动子序列；所述靶点可以是1个靶点、2个靶点、或者3个靶点序列，也可以是更多个靶点序列。
更优选地，所述与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO.14所示；所述sgRNA支架序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示。
优选地，所述步骤(2)中的表达载体为pBlueScript II SK(-)质粒或Lentiguide-puro载体。其中，Lentiguide-puro载体(addgene#52963)是一个不包含Cas9基因的sgRNA表达载体，对其进行改造，使其可以表达靶向RNA的sgRNA，该载体本身具有人U6聚合酶III启动子。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了上述载体系统在制备治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物中的应用。
作为本发明的第四个方面，本发明提供了一种治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物，所述药物包含上述载体系统。其中，RNA修饰异常引起的疾病对应的患者可以是人，也可以是动物、植物等，优选为人。
综上所述，本发明的有益效果为：
采用本发明的载体系统可以对RNA修饰异常引起的疾病进行靶向修饰6-甲基腺嘌呤，准确而高效，可以从根本上治疗RNA修饰缺陷引起的疾病。
附图说明
图1为pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3 activity region-EGFP的载体图谱；
图2为Lentidcas9-2×NLS-Mettl3-EGFP的载体图谱；
图3为pBluescriptSKII(-)-hU6 promoter-2×BbSI-sgRNA scafflod的载体图谱；
图4为pBlueScript II SK(-)-2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts的载体图谱；
图5为lentiGuide-hU6 promoter-2×BsmBI-sgRNA scafflod的载体图谱；
图6为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA的载体图谱；
图7为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-173 sgRNA的载体图谱；
图8为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA的载体图谱；
图9为lentiGuide-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA的载体图谱；
图10为lentiGuide-CDCP1 3’UTR-173 sgRNA的载体图谱；
图11为lentiGuide-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA的载体图谱；
图12为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155/173/212 sgRNA的载体图谱；
图13为PCJ214-CDCP1 3’UTR-155/173/212 sgRNA的载体图谱；
图14为RCas9的作用示意图；RNA-靶向Cas9(RCas9)依赖于称为PAMmer的短寡核苷酸以提供PAM基序，通过利用错配的PAMmer，实现RCas9对RNA的特异性修饰，同时避免编辑DNA；PAMmer还携带5'突出端，从而保持由sgRNA赋予的靶特异性；
图15为RCas9融合m6A修饰酶靶向修饰mRNA m6A位点的示意图；
图16为针对m6A修饰的CDCP1mRNA的免疫沉淀试验结果；
图17为海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值，其中，用spss3.0软件分析，实验组共转染CDCP1-3’UTR-check2，pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3 activityregion-EGFP质粒，pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155-sgRNA以及CDCP1-155-sgRNA-PAMmer、空载pcDNA3.1对照组及其他各组，均具有显著性差异，p<0.05。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 构建靶向RNA的dCas9-2×NLS、METTL3activity region以及EGFP融合表达载体pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-METTL3-EGFP以及Lentidcas9-2×NLS-METTL3-EGFP
1、引物设计
从载体pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry(addgene#60954)中扩增dCas9-2×NLS序列，dCas9-2×NLS序列如SEQ ID NO.1所示。
METTL3-activity region扩增于HUVEC细胞，METTL3-activity region序列如SEQID NO.2所示。
EGFP序列扩增于载体pLKO.3G(addgene#14748)，EGFP序列如SEQ ID NO.3所示。
利用无缝克隆引物设计工具(http://123.56.75.195/)设计三段序列的PCR引物，引物序列由广州艾基生物公司进行合成。引物序列如下表1：
表1 引物序列
Figure BDA0001503799990000051
2、PCR扩增相关基因序列
PCR反应体系，总计50ul：
Figure BDA0001503799990000052
PCR扩增条件：
Figure BDA0001503799990000053
Figure BDA0001503799990000061
3、PCR产物回收
1)PCR产物经电泳后，在紫外条件下，手术刀切取含目的片段的凝胶条带至干净1.5mlEP管中，按100mg凝胶对应100ul溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。
2)55℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。
3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000g离心1min，弃滤液。4)向柱上加入500ul溶液PE，室温12000g离心1min，弃滤液。
5)重复上一操作步骤。
6)空柱12000g离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。
7)将柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30μl洗脱液，12000g离心1min以洗脱出DNA。
4、双酶切pcDNA3.1V5HisTOPO载体；
1)双酶切体系如下：
在1个无菌的1.5mlEP管中分别配制双酶切体系，总计50μl：
Figure BDA0001503799990000062
37℃酶切2h。
2)载体酶切产物回收(同实施例1第3步)
5、目的片段与载体连接
将两端携带有同源臂的三个PCR片段利用Gibson技术克隆至用BamHI/xhoI双酶切后的pcDNA3.1V5HisTOPO载体中，操作步骤同NEB公司的NEBuilder HiFi DNA AssemblyCloning Kit(NEB#E5520S)试剂盒说明书。
冰上配制以下连接体系：
Figure BDA0001503799990000063
6、连接产物的转化
1)将连接产物分别加入50μl DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。2)42℃水浴热击90s,快速将EP管转移至冰浴中，冰浴5min。
3)加入500μl LB液体培养基，混匀，37℃、200r/min振荡培养50min。
4)3000rpm离心5min,去上清,留100ul上清吹打混匀菌沉淀,将100ul菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/ml)的LB平板表面，室温下放置，至液体吸收。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。
7、菌落PCR鉴定阳性克隆；
分别从平板上面挑取5个菌落于800ul含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220r/min，振荡培养4h后当作菌液PCR的模板。
PCR反应体系如下:
Figure BDA0001503799990000071
PCR反应条件如下:
Figure BDA0001503799990000072
PCR产物以含溴化乙锭(EB)替代物的1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。
8、对PCR鉴定大小正确的菌落溶液送广州艾基生物公司进行测序。
9、对测序正确的菌液进行扩大培养，提取无内毒素质粒。
10、测序正确的载体命名为pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3-EGFP，载体图谱如图1所示。
11、用上述同样的方法构建慢病毒表达载体Lentidcas9-2×NLS-METTL3-EGFP(载体图谱如图2所示)，其中骨架载体addgene#60954利用MluI/NotI进行双酶切。三段插入序列的引物见引物序列表1。
实施例2 构建靶向RNA的sgRNA表达载体
1、构建sgRNA真核细胞表达载体pBluescriptSKII(-)-hU6 promoter-2×BbSI-sgRNA scafflod
将人U6聚合酶III启动子以及5'端带有两个BbsI酶切位点的sgRNA支架序列，在广州艾基生物公司进行基因合成，序列(SEQ ID NO.12)如下：
Figure BDA0001503799990000073
Figure BDA0001503799990000081
其中，下划线序列为human U6 promoter；斜体加粗序列为BbsI酶切位点；下划线且加粗的序列为sgRNA scaffold序列。
然后运用Gibson技术将序列(SEQ ID NO.12)克隆至pBlueScript II SK(-)质粒中，构建sgRNA表达载体，构建好的载体(载体图谱如图3所示)大小为3307bp,抗性为Amp，为高拷贝载体，所合成的基因片段位于多克隆位点BamHI和NotI之间。
2、构建sgRNA慢病毒表达载体lentiGuide-hU6 promoter-2×BsmBI-sgRNAscafflod
Lentiguide-puro载体(addgene#52963)是一个不包含Cas9基因的sgRNA表达载体，对其进行改造，使其可以表达靶向RNA的sgRNA，该载体本身具有人U6聚合酶III启动子，所以将5'端带有两个BsmBI酶切位点的sgRNA支架序列以及cppt/cts序列在广州艾基生物进行基因合成，并运用Gibson技术克隆至通用载体pBlueScript II SK(-)质粒中，克隆正确的载体命名为pBlueScript II SK(-)-2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts。然后利用该载体作为模板，通过PCR技术扩增2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts序列，并运用Gibson技术克隆至双酶切后的Lentiguide-puro载体，构建sgRNA表达载体。
1)pBlueScript II SK(-)-2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts载体构建
2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts序列(SEQ ID NO.13)如下：
Figure BDA0001503799990000082
Figure BDA0001503799990000083
其中倾斜且下划线的序列为BsmBI酶切位点；加粗且下划线的序列为sgRNA scaffold序列；倾斜且加粗的序列为cPPT/cts序列。构建好的载体(载体图谱如图4所示)大小为3270bp,抗性为Amp，为高拷贝载体，所合成的基因片段位于多克隆位点BamHI和NotI之间。
2)lentiGuide-hU6 promoter-2×BsmBI-sgRNA scafflod载体构建
利用pBlueScript II SK(-)-2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts载体作为模板，设计引物，使引物两端带有与lentiguide-puro载体同源的20bp同源序列，同时使用KOD-plus-neo酶扩增2xBsmBI-sgRNA scaffold-cppt/cts的片段，PCR片段纯化后，利用Gibson技术连接至用BsmBI和PspXI双酶切后的lentiguide-puro载体，连接，转化，涂板，测序，具体方法同前，PCR引物序列见表3。测序正确的载体命名为lentiGuide-hU6 promoter-2×BsmBI-sgRNA scafflod，其载体图谱如图5所示。
实施例3 构建靶向CDCP1 mRNA 3’UTR区的sgRNA表达载体
1、设计sgRNA以及PAMer
1)基于反义寡核苷酸序列设计工具以及基因芯片探针设计工具Picky和OligoWiz软件综合选择靶点序列。设计的PAMmers有8个碱基在PAM序列的5'端，且具有高可信度位点。为了避免RNA的降解，PAMmer由混合的2'甲氧基修饰的RNA和不形成RNase H底物的DNA组成(表2是以CDCP1 3'UTR 155位点为例设计的PAMmer和sgRNA序列)。
表2 PAMer和sgRNA序列
Figure BDA0001503799990000091
Figure BDA0001503799990000101
其中，NTC(No Template Control，无模板对照)是阴性对照。
2)sgRNA oligos由广州艾基生物公司合成，在sgRNA反义链的5’端加上CACC，正义链的5’端加上AAAC；PAMer基序由上海生工公司合成。合成的sgRNA oligo见表3：
表3 合成的sgRNA oligo
Figure BDA0001503799990000102
2、靶向CDCP1 3'UTR 155位点的sgRNA载体构建
1)载体酶切
利用BbsI内切酶对质粒pBluescriptSKII(-)-hU6 promoter-2×BbSI-sgRNAscafflod进行酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0001503799990000103
37℃酶切2h后回收纯化(同实施例1第3步)
2)磷酸化并退火sgRNA oligos：
Figure BDA0001503799990000104
3)PCR仪器进行退火程序：
37℃30min
95℃维持5min，每分钟降低5℃直至25℃
4)将退火形成的oligo双链稀释200倍后和酶切后的载体pBluescriptSKII(-)-hU6 promoter-2×BbSI-sgRNA scafflod进行连接；
5)将连接后的质粒转化至感受态细胞Stbl3中，方法同实施例1第6步。
6)挑取单菌落扩大培养并送测序(广州艾基生物公司)，测序正确质粒命名为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA(载体图谱如图6所示)。
7)用同样的方法，将CDCP1 3’UTR区155位点、173位点和212位点的sgRNA分别插入到载体pBluescriptSKII(-)-hU6 promoter-2×BbSI-sgRNA scafflod和lentiGuide-hU6promoter-2×BsmBI-sgRNA scafflod中，测序正确的载体分别命名为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-173 sgRNA，pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA，lentiGuide-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA，lentiGuide-CDCP13’UTR-173 sgRNA，lentiGuide-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA，其载体图谱分别如图7～11所示。
实施例4 构建同时靶向CDCP1 3'UTR区155位点、173位点和212位点的sgRNA表达载体
1、同时靶向三个位点的真核细胞sgRNA表达载体构建
采用pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-173 sgRNA为PCR模板，扩增包括人U6聚合酶III启动子、CDCP1 3’UTR-173 sgRNA以及sgRNA支架结构在内的360bp片段，插入到pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA的多克隆位点HindIII/BamHI之间，克隆方法同前。测序正确的载体命名为pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-173/212 sgRNA。再采用pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA载体为模板，按同样方法扩增包括人U6聚合酶III启动子、CDCP1 3’UTR-155 sgRNA以及sgRNA支架结构在内的360bp片段，插入到pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-173/212 sgRNA的多克隆位点Acc651/XhoI之间，测序正确的载体命名为pBluescriptSKII(-)-CDCP13’UTR-155/173/212 sgRNA，其载体图谱如图12所示。
2、同时靶向三个位点的sgRNA慢病毒表达载体构建
1)设计引物
在引物的5’端添加3个保护性碱基“ACG”，一个BsmBI酶切位点“CGTCTC”，一个间隔碱基“A”以及互补配对序列。第一个正向引物必须携带“GATA”，最后一个反向引物必须携带“TTGT”，其他引物可以使用不相同的任何配对序列。正向引物起始于U6启动子之前，反向引物起始于sgRNA scaffold之后，可扩增包括人U6聚合酶III启动子、CDCP1 3’UTR-173sgRNA以及sgRNA scaffold在内的650bp片段。其中引物序列见表4。
表4 引物序列
Figure BDA0001503799990000111
Figure BDA0001503799990000121
2)分别用lentiGuide-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA，lentiGuide-CDCP1 3’UTR-173sgRNA和lentiGuide-CDCP1 3’UTR-212 sgRNA为模板，扩增包括人U6聚合酶III启动子、CDCP1 3’UTR sgRNA以及sgRNA scaffold在内的650bp片段。
3)利用BsmBI内切酶酶切PCR产物以及载体PCJ214，跑琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切产物。
4)同时将酶切后的三段PCR产物以及PCJ214载体加入连接体系，进行连接。5)连接产物转化感受态细胞Stbl3后，涂板，37℃过夜培养。
6)挑取单菌落，扩大培养，提取质粒。
7)利用NotI和XhoI进行双酶切鉴定。PCJ214空载体酶切后片段大小分别为5906bp，2161bp和1060bp。正确插入sgRNA表达框的PCJ214载体酶切后片段大小分别为5906bp，1060bp，636×n+701(n＝sgRNA表达框的个数)。
8)酶切正确的载体送测序，测序正确的载体命名为PCJ214-CDCP1 3’UTR-155/173/212 sgRNA，其载体图谱如图13所示。
实施例5 靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统
本发明的靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统的一种实施例，包括pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3-EGFP，载体图谱如图1所示；PAMmer，如SEQ ID NO.14所示；pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155 sgRNA，载体图谱如图6所示。
实施例6 RNA甲基化免疫共沉淀技术(MeRIP)和QPCR
为了验证实施例5的载体系统的修饰效果，我们进行了RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)和QPCR实验，具体包括以下试验：
1、瞬时转染细胞
(1)培养293T细胞，并分别接种适量细胞于9个直径为100mm的大皿，过夜培养使其汇合度达到80％。
(2)将实验分为3组命名为A,B,C。A组按1：5共转染质粒pcDNA3.1-dcas9-M3-EGFP及pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155-sgRNA，其中质粒pcDNA3.1-dcas9-M3-EGFP 6μg，B组瞬转6μg质粒pcDNA3.1-dcas9-M3-EGFP，C组瞬转6μg质粒pcDNA3.1(+)。按invitrogen公司LipofectaminTM3000 Reagent操作说明进行转染。
(3)共转染上述质粒后A组按LipofectaminTMRNAiMAX Reagent操作说明转染CDCP1-155-sgRNA-PAMmer。
(4)转染后的细胞培养48h后，用PBS洗细胞一遍。
2、Trizol法提取总RNA
(1)加入3mlTrizol吹打细胞，移入2ml离心管中，慢速震荡20s,室温静置5min。
每管加入0.3ml氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min。
(2)4℃，12000rmp离心15min，取上层水相(约800ul)转移到新的2ml离心管中。
(3)在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，中速震荡10s混匀，室温静置30min。
(4)4℃，12000rmp离心10min，弃上清。
加入1.5ml 75％乙醇中速震荡10s洗涤沉淀，4℃，12000rmp离心10min，弃上清，吸尽残液，晾干2-3分钟。
(5)加入30-100ul RNase-free水(加热至60℃)吹打溶解RNA，测浓度，-80℃保存。
3、从总RNA中提取mRNA(采用sigma公司的MRN10)
(1)取450～500ug总RNA至1.5ml离心管中，加入RNase-free水调整总体积至250ul，加入250ul 2X Binding Solution，短暂震荡混匀。
(2)加入15ul Oligo(dT)beads震荡混匀，70℃水浴3min。
(3)取出样品，室温静置10min，4℃14000rmp离心2min得到mRNA复合物，小心移除上清，并保留50ul上清液避免移除沉淀。
(4)第一次漂洗：加入500ul Wash Solution重悬沉淀吹打、震荡，将溶液移至GenElute spin filter/collection组装管中，4℃，14000rmp离心2min，弃滤过液。
(5)第二次漂洗：再次加入500ul Wash Solution，4℃，14000rmp离心2min，弃滤过。
(6)转移spin filter至一个新的1.5ml离心管中，加入50ul 70℃RNase-free水，70℃金属浴5分钟，14000rmp离心2min。
(7)再次洗脱：加入上步所得50ul RNase-free水，70℃金属浴5分钟，14000rmp离心2min；测浓度，记录定量。
4、片段化mRNA
(1)将取7～8ug mRNA用PCR管分装(5管)，每管9ul,各加入1ul FragmentationReagent(Ambion cat：AM8740),94℃水浴5min，冰上终止，各加入1ul Stop solution，混匀。
(2)纯化片段化的mRNA按试剂盒ZYMO:Oligo Clean&ConcentratorTM zymo D4061进行操作。
(3)留取约100ng片段化的RNA作为Input，其余用于做免疫沉淀。
5、免疫沉淀
(1)提前准备抗体-珠子结合物，冰上操作。磁珠：吸取25ulProtein A磁珠，用1ml1x IP buffer在磁铁上洗涤2次。抗体：m6A抗体(0.5ug/ul)吸取6ul加入200ul IP buffer。
(2)将抗体加入磁珠中，置4℃翻转孵育3h(室温1.5h)，IP buffer洗磁珠(与抗体结合物)4次。
(3)加入片段化的mRNA(加IP buffer至总体积100ul)后再次置4℃翻转孵育3h。
(4)IP buffer洗磁珠(与抗体和mRNA片段结合物)3次。留下洗涤液(含mRNA)用于质控。
(5)加入100ul Elution buffer(注意：提前配制Elution buffer 200ul/样数备用)置于4℃震荡1h。收集洗脱液上清(含m6A-mRNA片段)。
(6)用IP buffer100ul洗涤一次，收集上清。
(7)重复步骤⑥
(8)在以上四次洗脱所得上清400ul中，加入十分之一体积3M PH 5.2乙酸钠,2.5倍体积无水乙醇，混匀，-80℃过夜。
(9)4℃12000rmp，30min，晾干15分钟，13ul无酶水重悬沉淀，测浓度，冻存。
6、RT-QPCR
(1)按TaKaRa公司逆转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent kit with gDNAEraser对上述所得RNA及input进行逆转录。
(2)将上述所得cDNA稀释6倍。
(3)用Thermo Fisher Scientific公司Fast SYBRTM Green Master Mix说明配制QPCR反应体系，如下：
Figure BDA0001503799990000141
其中的引物序列见表5。
表5 RT-QPCR中的引物序列
引物名称 引物序列
SON-F CCCTTGTGGTATCATCAGAGACA(SEQ ID NO.36)
SON-R CGATGGTACGTCTACAGGCTG(SEQ ID NO.37)
HPRTI-F TGACACTGGCAAAACAATGCA(SEQ ID NO.38)
HPRTI-R GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT(SEQ ID NO.39)
CDCP1 3’UTR-F CCGCCAACTTCACATTGCTC(SEQ ID NO.40)
CDCP1 3’UTR-F CGCACAGCCTAAGTTGAGGA(SEQ ID NO.41)
(4)将上述反应体系加入life technologies公司Micro AmpR Fast Optical 96-well Reaction plate with Barcode96孔板中，每个样3个复孔。加好样的96孔板放入ABIstep oneTM softwareQPCR仪进行检测。
(5)对所得数据进行分析。
7、实验结果分析：如图16所示，共转染pcDNA3.1-dcas9-M3-EGFP，155位点的sgRNA质粒以及155位点PAMer的实验组，通过MeIP实验后，所富集的m6A修饰的CDCP1 mRNA明显高于其他对照组(p<0.05)；其中HPRTI是阴性对照基因，SON是阳性对照基因；该实验结果说明我们所构建的实施例5的Rcas9载体系统可以有效地对CDCP1特异位点(155)进行m6A修饰。
实施例7 应用实施例5的载体系统检测双荧光素酶报告基因
检测方法，包括如下步骤：
(1)将包含155/173/212三个甲基化修饰位点CDCP1-3’UTR片段插入到荧光素酶报告基因质粒check2中，命名为CDCP1-3’UTR-check2。
(2)筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
(3)扩增pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3 activity region-EGFP质粒，pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155-sgRNA质粒提纯备用。同时准备相应的空载质粒pcDNA3.1对照，提纯备用。
(4)培养293T细胞，并接种1.5×105细胞于24孔板中，每组3个复孔，过夜培养使其汇合度达到80％。
(5)将报告基因质粒CDCP1-3’UTR-check2与pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-Mettl3activity region-EGFP质粒，pBluescriptSKII(-)-CDCP1 3’UTR-155-sgRNA质粒按1：2：10共转染293T细胞，其中质粒CDCP1-3’UTR-check2 100ng。按invitrogen公司LipofectaminTM3000 Reagent操作说明进行转染。
(6)共转染上述质粒后按LipofectaminTMRNAiMAX Reagent操作说明转染CDCP1-155-sgRNA-PAMmer。
(7)转染后的细胞培养48h后，用PBS洗细胞一遍。
(8)按promega公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行双荧光素酶活性的检测，于24孔板中每孔加入100μl 1×PLB裂解液，放入摇床充分震荡15min。
(9)于上述24孔板中每孔取20μl细胞裂解产物加入检测板中，然后加入80μl萤火虫荧光素酶底物，检测仪上进行检测，读取萤火虫荧光素酶活性值，再加入80μl海肾荧光素酶底物，读取海肾荧光素酶活性值。
(10)计算海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值，进行实验分析，比较实验组与对照组海肾荧光素酶活性与萤火虫荧光素酶活性的比值。
结果分析：如图17所示，在具有Mettl3甲基化酶活性的293T细胞中，CDCP1-155sgRNA和155-PAMer同时存在时，萤光素酶活性最高，与其他对照组相比具有显著差异，表明在293T细胞中CDCP1-155 sgRNA和155-PAMer可以有效地引导dCas9-M3与CDCP1 3’UTR区155位点结合，从而实现对该位点的甲基化修饰。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<110> 中山大学附属第一医院
<120> 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4239
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120
cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggaga aacagccgag 180
gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240
tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360
aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420
aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480
atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660
cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggcaac 720
ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780
gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020
cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080
ggctacatcg atggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260
gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320
gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380
agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440
gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500
aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560
tacaacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620
agcggcgagc agaaaaaagc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680
gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740
tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860
ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920
cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980
aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040
gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160
cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220
gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280
atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340
atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400
gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460
gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggacgct 2520
atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgata acaaagtgct gactcggagc 2580
gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctgct gaatgccaag ctgattaccc agaggaagtt cgacaatctg 2700
accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760
ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820
actaagtacg acgagaacga caaactgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880
aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000
taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060
atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120
aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180
cctctgatcg agacaaacgg cgaaacaggc gagatcgtgt gggataaggg ccgggacttt 3240
gccaccgtgc ggaaagtgct gtctatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300
cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga caagctgatc 3360
gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420
tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480
aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540
tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600
tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660
cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720
cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780
cagcacaaac actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840
atcctggccg acgctaatct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca cagagacaag 3900
cctatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960
cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020
gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080
gacctgtctc agctgggagg cgacgcctat ccctatgacg tgcccgatta tgccagcctg 4140
ggcagcggct cccccaagaa aaaacgcaag gtggaagatc ctaagaaaaa gcggaaagtg 4200
gacggcattg gtagtgggag caacggcagc agcggatcc 4239
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagagtgtcg gaggtgattc cagtgcagac cgactcttcc cacctcagtg gatctgttgt 60
gatatccgct acctggacgt cagtatcttg ggcaagtttg cagttgtgat ggctgaccca 120
ccctgggata ttcacatgga actgccctat gggaccctga cagatgatga gatgcgcagg 180
ctcaacatac ccgtactaca ggatgatggc tttctcttcc tctgggtcac aggcagggcc 240
atggagttgg ggagagaatg tctaaatctc tgggggtatg aacgggtaga tgaaattatt 300
tgggtgaaga caaatcaact gcaacgcatc attcggacag gccgtacagg tcactggttg 360
aaccatggga aggaacactg cttggttggt gtcaaaggaa atccccaagg cttcaaccag 420
ggtctggatt gtgatgtgat cgtagctgag gttcgttcca ccagtcataa accagatgaa 480
atctatggca tgattgaaag actatctcct ggcactcgca agattgagtt atttggacga 540
ccacacaatg tgcaacccaa ctggatcacc cttggaaacc aactggatgg gatccaccta 600
ctagacccag atgtggttgc acggttcaag caaaggtacc cagatggtat catctctaaa 660
cctaagaatt ta 672
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims (5)

1.靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统，其特征在于，所述载体系统包括失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白的表达载体、靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区中至少一个位点的sgRNA表达载体以及与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸；
所述失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白的表达载体为pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-METTL3 活性区域 -EGFP载体，所述pcDNA3.1-dcas9-2×NLS-METTL3 活性区域 -EGFP载体构成为：(a)dCas9-2×NLS序列如SEQ ID NO.1所示、(b)METTL3 活性区域 序列如SEQ ID NO.2所示、(c)EGFP序列如SEQ ID NO.3所示；
所述sgRNA表达载体靶向CDCP1的mRNA的3’UTR区155位点或173位点或212位点；所述sgRNA表达载体的序列分别对应如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.14所示。
2.靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从载体pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry扩增出dCas9-2×NLS序列，从HUVEC细胞中扩增出METTL3酶活性区域序列，从载体pLKO.3G扩增出EGFP序列，通过PCR扩增、酶切、连接、转化，将dCas9-2×NLS序列，METTL3活性区域序列以及EGFP序列连接至pcDNA3.1V5HisTOPO载体，得到失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体；所述dCas9-2×NLS序列如SEQ ID NO.1所示；所述METTL3 活性区域 序列如SEQ ID NO.2所示；所述EGFP序列如SEQ ID NO.3所示；
2)构建包括酶切位点序列和sgRNA支架序列的sgRNA支架结构；合成基于靶点序列的sgRNA；将所述sgRNA支架结构和基于靶点序列的sgRNA克隆至表达载体中，得到包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体，所述基于靶点序列的sgRNA分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；
3)合成基于靶点序列、并与作为标靶的mRNA错配的寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.14所示；
所述靶向mRNA的6-甲基腺嘌呤修饰载体系统包括所述失活的Cas9核酸酶融合6-甲基腺嘌呤修饰酶的酶活性功能区的蛋白表达载体、所述寡核苷酸以及所述包括启动子序列、基于靶点序列的sgRNA、sgRNA支架序列和酶切位点序列的表达载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的表达载体为pBlueScript II SK(-)质粒或Lentiguide-puro载体。
4.权利要求1所述的载体系统在制备治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物中的应用。
5.一种治疗RNA修饰异常引起的疾病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的载体系统。
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