具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作,如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
如本公开所使用的,“PIE系统”又称permuted introns and exons,是利用I类内含子(Group I Intron)的自我剪切系统,连接形成环状RNA的方法。
如本公开所使用的,I类内含子是指“Group I Intron”,其具有在GTP和Mg2+存在的条件下进行自我剪切成环的系统(self-splicing system)。
I类内含子是一类超大的可以发生自身剪切反应的核酶,通常广泛的存在于很多物种中,主要参与催化切除mRNA,tRNA,rRNA的前体。其核心二级结构通常包括九个配对区域(P1-P9)以及相应的loop区域(L1-L9)(图14),Group I Intron的剪接通过两个连续的酯交换反应进行。外源鸟苷或鸟苷核苷酸(G)首先停靠在位于P7的活性G结合位点上,其3'-OH对齐以攻击位于P1的5'剪接位点的磷酸二酯键,从而产生一个游离的3'-OH基团位于上游外显子,外源的G连接到内含子的5'端。然后内含子的末端G(omega G)交换外援G,占据G结合位点,组织第二次酯转移反应:P1上游外显子的3'-OH基团对齐攻击3'剪接P10位点,导致相邻的上游和下游外显子连接并释放催化内含子。Group I内含子通常包括如图14所示的结构特征(来源于Burke J M,Belfort M,Cech T R,et al.Structural conventions forgroup I introns[J].Nucleic acids research,1987,15(18):7217-7221)。
如本公开所使用的,内部引导序列(Internal guide sequence)通常指group Iintron中的一段通过Watson-Crick配对或者wobble配对与对应外显子序列相互配对的核苷酸序列,通常group I intron中P1 stem中。
如本公开所使用的,“核酶”又称ribozyme,用于描述具有催化活性的RNA。在一些实施方式中,本公开中的核酶识别位点是指当RNA形成具有催化功能的核酶分子时,能够被核酶识别,内部发生磷酸二酯键断裂的多核苷酸序列。
如本公开所使用的,术语“环状核酸分子”是指呈封闭环形的核酸分子。在一些具体的实施方式中,环状核酸分子为环状RNA分子。更具体地,环状核酸分子为环状mRNA分子。
如本公开所使用的,术语“线状RNA”是指能够通过环化反应形成环状RNA的环状RNA前体,其一般由线状的DNA分子(例如,包含重组核酸分子的载体等)转录形成。
如本公开所使用的,术语“IRES”(Internal ribosome entry site,IRES)又称内部核糖体进入位点,“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列,通常位于所关注基因的5’端,并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位,以使得mRNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于mRNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。
如本公开所使用的,术语“翻译起始元件”是指能够招募核糖体,起始RNA分子的翻译过程的任意的序列元件。示例性的,翻译起始元件为IRES元件、m6A修饰序列,或滚环翻译的起始序列等等。
术语“编码区”(Coding Region)是指能够转录信使RNA,并最终翻译为目标多肽、蛋白的基因序列。
术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用,指包含抗原结合位点的蛋白质,涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体,包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。通常情况下,这样的片段将包括抗原结合片段。
如本公开所使用的,术语“杂交”指一条核酸链上的碱基通过碱基配对与另一条核酸链上的互补碱基结合的过程。杂交反应可以是选择性的,使得特定目的序列以低浓度存在时也能从样品中选择该序列。杂交条件的严紧性(例如高度严紧、中度严紧、严紧)可以由例如预杂交溶液和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度、或杂交温度等来调整,例如,可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度增加严紧性。一般而言,严紧条件包括在约25℃至约42℃的温度,在至少约0%到至少约15%v/v甲酰胺和至少约1M到至少约2M盐中杂交,和至少约1M到至少约2M盐中洗涤;中度严紧条件包括在约25℃至约65℃的温度,在至少约16%到至少约30%v/v甲酰胺和至少约0.5M盐到至少约0.9M盐中杂交,和至少约0.5M到至少约0.9M盐中洗涤;高度严紧条件包括在约至少65℃的温度,在至少约31%到至少约50%v/v甲酰胺和至少约0.01M到至少约0.15M盐中杂交,和至少约0.01M到至少约0.15M盐中洗涤;甲酰胺在这些杂交条件中是可任选的。其它合适的杂交缓冲液和条件是本领域技术人员众所周知的,并且描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.(1989);和Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley&Sons(1999).
本公开上下文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用载体的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物,还在于提供一种方法,以便在为受试者施用药物之后,活性成分能够以所期望的速率溶出,或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的载体可以是具有惰性的填充剂,也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的载体的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
如本公开所使用的,术语“互补的”或“杂交的”用于指与碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(它们是可互换的术语,指的是核苷酸序列)。例如,序列“CAGT”与序列“GTCA”互补。互补或杂交可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补或杂交是指一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则错配,核酸之间的“全部”或“完全”互补或杂交是指每个核酸碱基在碱基配对下均与另一个碱基匹配规则。核酸链之间的互补或杂交程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中,且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。
术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括,例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合,例如启动子和增强子;ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列;以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要,并可以使用任何载体,包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列,例如病毒质粒、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体,来自如慢病毒、逆转录病毒、牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞,包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统,包括真核细胞,例如,哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞;和原核细胞,例如,大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞,也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。术语“重组宿主细胞”涵盖导入重组核酸分子、重组表达载体、环状RNA后不同于亲本细胞的宿主细胞,重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,只要是能够导入本公开的重组核酸分子、重组表达载体、环状RNA等的细胞即可。
如本公开所使用的,术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于,家养动物(例如,牛,羊,猫,狗和马),灵长类动物(例如,人和非人灵长类动物如猴),兔,以及啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)。
如本公开所使用的,术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思,即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法,这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
如本公开所使用的,“治疗”是指:在罹患疾病之后,使受试者接触(例如给药)本发明的环状RNA、环化前体RNA、组合物等,从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻,并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指:身体出现了疾病症状。
如本公开所使用的,“预防”是指:在罹患疾病之前,通过使受试者接触(例如给药)本发明的环状RNA、组合物等,从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状,并不意味着必需完全抑制患病。
如本公开所使用的,术语“有效量”指本发明的重组核酸分子、重组表达载体、环化前体RNA、环状RNA、疫苗或组合物的这样的量或剂量,其以单一或多次剂量施用患者后,在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定:诸如哺乳动物的物种;它的大小、年龄和一般健康;涉及的具体疾病;疾病的程度或严重性;个体患者的应答;施用的具体抗体;施用模式;施用制剂的生物利用率特征;选择的给药方案;和任何伴随疗法的使用。
如本公开所使用的,术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于,家养动物(例如,牛,羊,猫,狗和马),灵长类动物(例如,人和非人灵长类动物如猴),兔,以及啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)。
除非另外定义或由背景清楚指示,否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
Clean PIE系统
传统PIE系统连接形成环状RNA的过程如图18所示,其中线状RNA包括顺次连接的如下元件:3’内含子(3’intron)、第二外显子E2(Exon2)、外源片段、第一外显子E1(Exon2)和5’内含子(5’intron)。当环境中存在GTP和Mg2+,GTP攻击E1与5’内含子的连接位置,产生5’剪切位点(5’splicing site,5ss)断裂,释放5’内含子;然后E1的3’-OH端攻击3’内含子与E2的连接位置,产生3’剪切位点(3’splicing site,3ss)断裂,释放3’内含子;最后连接形成目标的环状RNA。
但是,应用传统PIE系统会导致环状RNA中存在额外的E1、E2的外显子序列,降低环状RNA的序列精确度,导致环状RNA的天然免疫原性增加,在细胞内易发生降解。
为解决上述问题,本公开提供了一种结构新颖的Clean PIE系统,Clean PIE系统可以通过在不改变蛋白表达序列的基础上,利用PIE系统的自我剪切制备环状RNA,具有高的成环效率;并且成环后的环状RNA中无需引入额外的E1、E2序列,不仅简化了环状RNA的结构,降低各种可能发生的安全隐患;还提高了环状RNA的序列精确度,降低环状RNA天然的免疫原性,提高其在细胞内的稳定性,适合作为基因治疗载体、表达治疗性蛋白、作为核酸疫苗等临床应用领域,具有广阔的应用前景。
在本公开中,Clean PIE系统包括但不限于用于制备环状RNA的DNA构建体、包括DNA构建体的重组表达载体、利用重组表达载体外转录得到的环化前体RNA分子等等。
在一些实施方式中,本公开提供了一种用于制备环状RNA的重组核酸分子。示例性的,重组核酸分子可以是上述用于制备环状RNA的DNA构建体、环化前体RNA分子等。
在一些实施方式中,重组核酸分子的结构如图2A所示,沿5’向3’的方向,包括按如下顺序排列的元件:内含子片段II,翻译起始元件截断片段II,编码至少一个目标多肽的编码元件,翻译起始元件截断片段I,内含子片段I。
其中,所述翻译起始元件截断片段I的3’末端包含核酶识别位点I,所述核酶识别位点I由位于所述翻译起始元件截断片段I的3’末端的第一预设数量的核苷酸组成;所述翻译起始元件截断片段II的5’末端包含核酶识别位点II,所述核酶识别位点II由位于所述翻译起始元件截断片段II的5’末端的第二预设数量的核苷酸组成。
所述翻译起始元件截断片段I的核苷酸序列与所述翻译起始元件截断片段II的核苷酸序列沿5’向3’的方向用于形成翻译起始元件序列;所述翻译起始元件截断片段I的核苷酸序列对应所述翻译起始元件序列中靠近5’方向的部分序列,所述翻译起始元件截断片段II的核苷酸序列对应所述翻译起始元件序列中靠近3’方向的其余部分序列;
所述内含子片段I的核苷酸序列与所述内含子片段II的核苷酸序列沿5’向3’的方向形成内含子序列;所述内含子片段I的核苷酸序列包含所述内含子序列中靠近5’方向的部分序列,所述内含子片段II的核苷酸序列包含所述内含子序列中靠近3’方向的其余部分序列。
也即,翻译起始元件截断片段I的核苷酸序列与翻译起始元件截断片段II的核苷酸序列连接可以得到翻译起始元件序列,内含子片段I的核苷酸序列与内含子片段II的核苷酸序列连接可以得到内含子序列。当具有上述结构的重组核酸分子在制备环状RNA时,核酶识别位点I与内含子片段I连接位置首先产生断裂,释放内含子片段I;然后核酶识别位点II与内含子片段II连接位置产生断裂,释放内含子片段II。翻译起始元件截断片段I的3’末端与翻译起始元件截断片段II的5’末端连接成环状分子。本公开中在不改变编码区编码的目标多肽序列、且无需额外引入E1、E2序列的基础上,实现自剪切得到编码目标蛋白的环状RNA,具有高的序列精确度、稳定性,以及低的免疫原性。
同时,由于核酶识别位点I和核酶识别位点II设置于翻译起始元件截断片段的内部,体外成环后的环状RNA中未引入额外的E1、E2序列,具有序列精准、结构简单、免疫原性低等优势,适合大规模的体外生产制备、在核酸疫苗、表达治疗性蛋白、临床免疫治疗等领域具有应用优势。
翻译起始元件
在本公开中,翻译起始元件可以是能够起始目标多肽翻译的任意类型的元件。在一些实施方式中,翻译起始元件是包含如下任意的一种或两种以上所示序列的元件:IRES序列、5’UTR序列、Kozak序列、包含m6A修饰(N(6)甲基腺苷修饰)的序列、核糖体18S rRNA的互补序列。在另外一些实施方式中,翻译起始元件还可以是其他任意类型的具有非帽依赖的翻译起始元件(cap-independent translation)。
在一些实施方式中,翻译起始元件为IRES元件,IRES元件的来源包括但不限于病毒、哺乳动物、果蝇等。在一些可选的实施方式中,IRES元件来源于病毒。示例性的,IRES元件包含来自于小RNA病毒的IRES序列。进一步地,IRES元件包括但不限于来源于Echovirus、Human poliovirus、Human Enterovirus、Coxsackievirus、Human rhinovirus、Caninepicornavirus、Turdivirus 3、Hepatovirus、Passerivirus、Picornaviridae、TremovirusA、Feline kobuvirus、Murine kobuvirus、Kobuvirus sewage Kathmandu、Ferretkobuvirus、Marmot kobuvirus、Human parechovirus、Chicken picornavirus、Falconpicornavirus、Feline picornavirus、French Guiana picornavirus等等的IRES序列。
在一些可选的实施方式中,本公开提供的重组核酸分子,沿5’向3’的方向,由如下所示元件组成:内含子片段II,翻译起始元件截断片段II,编码至少一个目标多肽的编码元件,翻译起始元件截断片段I,内含子片段I。在另外一些可选的实施方式中,重组核酸分子中还可以包括其他任意的一种或两种以上的元件。例如,用于调控转录水平的转录调控元件,用于调控翻译水平的翻译调控元件,用于纯化制备环状RNA的纯化元件等等。
内含子片段
本公开中的内含子片段来源于I类内含子,I类内含子具有发生自剪切反应的核酶活性,广泛存在于各类物种中。示例性的,I类内含子包括但不限于T4噬菌体td基因、鱼腥藻属tRNALeu、TpaCOX2、Ptu等等。
在一些实施方式中,内含子片段I和内含子片段II来源于I类内含子,并分别包含组成I类内含子的靠近5’方向的部分序列,和靠近3’方向的部分序列。核酶识别位点I来源于I类内含子5’端连接的外显子序列(Exon 1,E1),核酶识别位点II来源于I类内含子3’端连接的外显子序列(Exon 2,E2)。内含子片段I连接核酶识别位点I,内含子片段II连接核酶识别位点II,构成能够自我剪切的PIE系统。
在一些可选的实施方式中,核酶识别位点I由3-100个核苷酸组成,优选3-50个核苷酸,更优选3-10个核苷酸。也即,位于翻译起始元件截断片段I的3’末端的第一预设数量的核苷酸为3-100个核苷酸,优选3-50个核苷酸,更优选3-10个核苷酸。示例性的,第一预设数量为3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300,以及它们任意两者之间的任意整数值。
在一些可选的实施方式中,核酶识别位点II由1-100个核苷酸组成,优选1-50个核苷酸,更优选1-10个核苷酸。也即,位于翻译起始元件截断片段II的5’末端的第二预设数量的核苷酸为1-100个核苷酸,优选1-50个核苷酸,更优选1-10个核苷酸。示例性的,第一预设数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100,以及它们任意两者之间的任意整数值。
在一些优选的实施方式中,第一预设数量与第二预设数量的和不等于3y,y≥1且y为整数。也即,第一预设数量与第二预设数量的和不等于3的整数。当两者的和不为3的整数值,能够增加在编码区内部设置核酶识别位点的自由度,实现环状RNA的有效成环。
在一些可选的实施方式中,I类内含子是来源于T4噬菌体td基因的T4 td intron,其intron二级结构如图15所示。T4 td intron中用于成环的核酶识别位点的核苷酸序列为“5’-TTGGGTCT-3’”,其中成环位置位于T与C之间。因此,核酶识别位点I的核苷酸序列为“5’-TTGGGT-3’”,核酶识别位点II的核苷酸序列为“5’-CT-3’”。
需要说明的是,在保证成环位置的碱基不变的条件下,存在少量碱基突变的核酶识别位点同样能够用于环状RNA的体外。示例性的,本公开发现“5’-TTGGGTCT-3’”中存在如下的一种或两种以上突变时,核酶识别位点及其连接的内含子片段保留有成环活性:第2位的碱基T突变为C,第三位的碱基G突变为A,第8位的碱基T突变为A。
在一些可选的实施方式中,来源于T4 td intron的内含子片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示,或与SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
在一些可选的实施方式中,来源于T4 td intron的内含子片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示,或与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
在一些可选的实施方式中,I类内含子为TpaCOX2 intron,TpaCOX2 intron为T.papilionaceus粒体细胞色素氧化酶亚基(cytochrome xoidase)cox2基因的内含子序列,其intron二级结构如图16所示。TpaCOX2 intron中用于成环的核酶识别位点的核苷酸序列为“5’-ACGTCTTAACCAA-3’”,其中成环位置位于T与A之间。因此,核酶识别位点I的核苷酸序列为“5’-ACGTCTT-3’”,核酶识别位点II的核苷酸序列为“5’-AACCAA-3’”。
在一些可选的实施方式中,I类内含子为Ptu intron,其intron二级结构如图17所示。Ptu为pedinomonas tuberculata中叶绿体核糖体大亚基RNA(rrnL)的前体RNA.pedinomonas tuberculata是假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的一种绿藻(greenalgae)。Ptu intron中用于成环的核酶识别位点的核苷酸序列为“5’-AGGGATCA-3’”,其中成环位置位于T与C之间。因此,核酶识别位点I的核苷酸序列为“5’-AGGGAT-3’”,核酶识别位点II的核苷酸序列为“5’-CA-3’”。
需要说明的是,本公开对核酶识别位点、内含子片段的序列不进行限制性限定,只要其来源于I类内含子,能够有效成环,在体外制备得到环状RNA即可。
包含插入元件的重组核酸分子
在一些实施方式中,重组核酸分子包括插入元件,插入元件可以用于调控重组核酸分子的转录,用于调控环状RNA的翻译,实现环状RNA在不同组织之间的特异性表达,或者用于纯化环状RNA等等。示例性的,如图2B所示,插入元件位于编码元件和翻译起始元件截断片段I之间。
在一些实施方式,插入元件选自如下(i)-(iii)组成组中的至少一项:(i)转录水平调控元件,(ii)翻译水平调控元件,(iii)纯化元件。示例性的,插入元件包含如下的一种或任意两种以上的组合的序列:非翻译区(untranslated region,UTR)序列,polyN序列,适配体序列,核糖开关序列,结合转录调控因子的序列;所述polyN序列中,N选自A、T、G、C中的至少一种。
在一些可选的实施方式中,翻译调控元件包含非翻译区序列,非翻译区序列可用于调控环状RNA的稳定性、免疫原性,以及环状RNA表达目标多肽的效率等性能。本公开对于非翻译区序列不进行具体限定,其可以选自本领域中具有调控环状RNA转录、翻译、细胞内稳定性、免疫原性等性能的任意类型的序列。进一步的,非翻译区序列也不限制于5’UTR序列或3’UTR序列。
在一些可选的实施方式中,非翻译区序列中包含一个或多个的miRNA识别序列,例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等等。通过加入一个或多个miRNA识别序列,可实现环状RNA在不同组织、细胞之中的特异性表达,实现环状RNA分子的靶向递送。
在一些可选的实施方式中,翻译调控元件包含polyN序列,其中的N可以是A、T、G、C中的至少一种。通过增加包含polyN序列的翻译调控元件,以改善环状RNA表达目标多肽的效率、改善免疫原性、稳定性等,或用于环状RNA的纯化。本公开对于polyN序列的长度,polyN序列中N的选择种类以及组成方式不进行具体限定,只要其有利于实现对环状RNA性能的改善即可。示例性的,polyN序列为polyA序列,polyAC序列等等。
在一些可选的实施方式中,翻译调控元件包含核糖开关序列。核糖开关(Riboswitch)序列是一类对RNA的转录、翻译具有调控功能的非翻译序列。本公开中,核糖开关序列可以影响环状RNA的表达,包括但不限于转录终止、翻译起始抑制、mRNA自裂解、以及在真核生物中剪接途径的改变。此外,核糖开关序列还可以通过触发分子的结合或去除来控制环状RNA的表达。示例性的,核糖开关序列为钴胺素核糖开关(也称B12-元件)、FMN核糖开关(也称RFN元件)、glmS核糖开关、SAM核糖开关、SAH核糖开关、四氢叶酸核糖开关、Moco核糖开关等等,本公开对于核糖开关序列的类型和序列不进行限制性限定,只要其能实现对环状RNA表达目标多肽的转录、翻译水平的调控即可。
在一些可选的实施方式中,翻译调控元件包含适配体序列。在本公开中,适配体序列可用于调控环状RNA的转录、翻译,或用于环状RNA的体外纯化制备。
包含同源臂的重组核酸分子
在一些实施方式中,重组核酸分子中包括同源臂,具体的,同源臂包括位于重组核酸分子的5’末端的5’同源臂,以及位于重组核酸分子的3’末端的3’同源臂,5’同源臂的核酸序列与3’同源臂的核苷酸序列杂交。
在一些实施方式中,如图2C所示,在重组核酸分子中,5’同源臂连接于所述内含子片段II的5’端,3’同源臂连接于所述内含子片段I的3’端。5’同源臂与3’同源臂的序列杂交,使内含子片段I、内含子片段II相互靠近,在核酶识别位点I与内含子片段I的连接位置断裂后,有利于核酶识别位点I的3’-OH进一步攻击核酶识别位点II与内含子片段II的连接的磷酸二酯键,释放内含子片段II。
目标多肽
本公开对于目标多肽的种类不进行限制性限定,其可以是人源蛋白或非人源蛋白。示例性的,目标多肽包含但不限于抗原、抗体、抗原结合片段、荧光蛋白、具有疾病治疗活性的蛋白、具有基因编辑活性的蛋白等。
在本公开中,术语“抗体”以最广意义使用,指包含抗原结合位点的蛋白质,涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
在本公开中,术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段,其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2;双抗体;线性抗体;单链抗体(例如scFv);单域抗体;双价或双特异性抗体或其片段;骆驼科抗体(重链抗体);和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
在本公开中,具有疾病治疗活性的蛋白可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如,影响对免疫反应/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如,细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分等。
包含串联的编码区的编码元件
在一些实施方式中,重组核酸分子中的编码元件包含所述编码元件包含至少一个编码区。示例性的,编码元件包含1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个等等。在一些可选的实施方式中可选地,所述编码元件包含至少两个编码区,每个编码区彼此独立地编码任意类型的目标多肽。
在一些可选的实施方式中,编码元件包含2个或2个以上的编码区。如图3A和图3B所示,重组核酸分子包括沿5’向3’方向按如下顺序排列的元件:内含子片段II、翻译起始元件截断片段II、至少2个编码区、翻译起始元件截断片段I、内含子片段I。在另外一些可选的实施方式中,重组核酸分子由上述顺序排列的元件组成。
在一些优选的实施方式中,编码元件还包括位于任意两个相邻的编码区之间的连接子。利用连接子将相邻的编码区间隔开,使重组核酸分子制备的环状RNA能够实现对2个或以上的目标多肽的表达。
在本公开中,连接子可以是编码2A肽的多核苷酸,或是其他类型的用于编码间隔目标多肽的连接肽的多核苷酸。其中,2A肽是来源于病毒的短肽(~18-25个氨基酸),它们通常被称为“自我剪切”肽,能使一条转录产物产生多种蛋白。示例性的,2A肽为P2A、T2A、E2A、F2A等等。
在本公开中,编码元件包含的每个编码区彼此独立地编码任意类型的目标多肽。其中,任意两个编码区所编码的目标多肽可以是相同的或不同的。
包含至少1个翻译起始元件的编码元件
在一些实施方式中,编码元件包含至少两个编码区,其中,任意相邻的两个编码区之间连接有翻译起始元件。示例性的,编码元件包含1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个等等。并且,在编码元件内部,任意相邻的两个编码区之间设置有翻译起始元件。通过上述方式,可以在重组核酸分子体外制备的环状RNA中的每个编码区上游连接一个翻译起始元件,实现对2个或以上目标多肽的表达。
在一些可选的实施方式中,编码元件包含2个或2个以上的编码区。如图4A和图4B所示,重组核酸分子包括沿5’向3’方向按如下顺序排列的元件:内含子片段II、翻译起始元件截断片段II、至少2个编码区、翻译起始元件截断片段I、内含子片段I。其中,在任意相邻的2个编码区之间连接有翻译起始元件。在另外一些可选的实施方式中,重组核酸分子由上述顺序排列的元件组成。
在本公开中,翻译起始元件可以是能够起始目标多肽翻译的任意类型的元件。在一些实施方式中,翻译起始元件是包含如下任意的一种或两种以上所示序列的元件:IRES序列、5’UTR序列、Kozak序列、包含m6A修饰(N(6)甲基腺苷修饰)的序列、核糖体18S rRNA的互补序列。在另外一些实施方式中,翻译起始元件还可以是其他任意类型的具有非帽依赖的翻译起始元件(cap-independent translation)。
在本公开中,编码元件包含的每个编码区彼此独立地编码任意类型的目标多肽。其中,任意两个编码区所编码的目标多肽可以是相同的或不同的。
利用上述的重组核酸分子制备的环状RNA中,每个编码区的5’端对应连接一个翻译起始元件,通过多个翻译起始元件串联多个编码区,实现对至少2个目标多肽的表达。
包含重组核酸分子的重组表达载体
在一些实施方式中,重组核酸分子作为用于制备环状RNA的重组表达载体的一部分存在。在体外经过转录、环化过程中,可制备得到表达目标多肽的环状RNA。
在另外一些实施方式中,重组核酸分子还可以作为重组表达载体在线性化处理、转录反应后得到的环化前体RNA分子或其一部分存在。也即,重组核酸分子仅需要经过环化反应,即可得到表达目标多肽的环状RNA。
在一些实施方式中,体外制备环状RNA的步骤包括:
转录步骤:如本公开所述的重组核酸分子或根据本公开所述的重组表达载体转录形成环化前体核酸分子;
环化步骤:所述环化前体核酸发生环化反应,得到环状RNA。
在一些可选的实施方式中,所述方法还包括,纯化所述环状RNA的步骤。
环状RNA
在一些实施方式中,本公开中的环状RNA应用本公开提供的Clean PIE系统制备得到,沿5’向3’方向,其包含按如下顺序排列的元件:翻译起始元件,用于编码至少一个目标多肽的编码元件。
与图5B所示的传统PIE系统制备的环状RNA相比,通过采用本公开中的clean PIE系统制备环状RNA,在保证蛋白编码序列的完整性的条件下,不引入额外的E1、E2序列(图5A),以保证环状RNA序列及二级结构的准确性,降低环状RNA天然的免疫原性,提高其在细胞内的稳定性,适合作为基因治疗载体、表达治疗性蛋白、作为核酸疫苗等临床应用领域,具有广阔的应用前景。
在一些实施方式中,环状RNA的编码元件包含至少一个编码区,每个编码区彼此独立地编码任意类型的目标多肽,环状RNA能够串联地编码一个或多个目标多肽。示例性的,环状RNA表达1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个等等数量的目标多肽。
作为优选的实施方式,任意相邻的两个编码区由连接子相连,利用连接子编码的连接肽将相邻的编码区编码的目标多肽间隔开,使同一环状RNA能够串联地表达2个或以上的目标多肽。
在一些可选的实施方式中,环状RNA的编码元件2个或以上的编码区。示例性的,如图6A和6B所示,沿5’向3’方向,环状RNA中包含翻译起始元件、包含至少2个编码区的编码元件。其中,编码元件中任意相邻的2个编码区之间连接有连接子。连接子将相邻的2个编码区间隔开,使环状RNA可以在细胞内可以串联地表达至少2个目标多肽。在另外一些可选的实施方式中,环状RNA由按上述顺序排列的元件组成。
在一些实施方式中,环状RNA的编码元件包含至少2个编码区,其中任意相邻的2个编码区之间连接有翻译起始元件。示例性的,编码元件中包含编码区的个数为1、2、3、4、5、10、15、20、25等等。在每个编码区5’端连接的翻译起始元件,起始不同编码区的转录,使同一环状RNA能够用于能够编码2个或以上的目标多肽。
在一些可选的实施方式中,如图7A和图7B所示,沿5’向3’方向,环状RNA中包含翻译起始元件、至少2个编码区,以及连接于任意相邻的2个编码区之间的翻译起始元件。因此,环状RNA中包含至少2个翻译起始元件,以分别起始各编码区的翻译过程,实现对2个目标多肽的串联表达。在另外一些可选的实施方式中,环状RNA由按上述顺序排列的元件组成。
在本公开中,每个编码区彼此独立的编码任意类型的目标多肽。其中,任意两个编码区所编码的目标多肽可以是相同或不同。
在一些可选的实施方式中,环状RNA中包括插入元件。其中,所述插入元件连接于任意的翻译起始元件的5’末端。
编辑翻译起始元件序列的方法及系统
在一些实施方式中,本公开提供了编码翻译起始元件的方法,包括如下步骤:
S1,根据翻译起始元件序列,确定翻译起始元件的二级结构;
具体的,由RNA结构预测软件接收输入的翻译起始元件序列,然后输出翻译起始元件序列对应的二级结构。本公开对得到翻译起始元件的二级结构的软件不进行具体限定,其可以是能够根据输入序列得到RNA二级结构的任意类型的RNA结构预测软件。示例性的,RNA结构预测软件可以是如下的至少一种:RNAfold、Mfold、RNAfoldweerver、Vienna RNA。
S2,根据所述二级结构,确定所述翻译起始元件序列中的待编辑区;
在本公开中,待编辑区为二级结构中发夹结构较少、自由能小,易于成环的位置。在一些实施方式中,所述待编辑区的上游100bp与下游100bp的范围内不具有大于20bp的发夹结构。
对上述位置处的待编辑区的碱基进行突变,可以在不影响翻译起始元件的序列活性的条件下,将核酸识别位点插入翻译起始元件元件。并且,上述位置处的待编辑区的碱基位点突变后,可以实现环状RNA的有效成环。
S3,对所述待编辑区中的任意一个或两个以上位置处的碱基进行替换,得到包含核酶识别位点的编辑区。
在本公开中,所述核酶识别位点序列由核酶识别位点I的核苷酸序列和核酶识别位点II的核苷酸序列连接组成。
对待编辑区中的任意一个或两个以上位置处的碱基进行替换,使待编辑区中对应形成核酶识别位点序列。示例性的,核酶识别位点序列包括但不限于“5’-TTGGGTCT-3’”、“5’-ACGTCTTAACCAA-3’”、“5’-AGGGATCA-3’”等等。
进一步的,将编辑后的翻译起始元件序列在核酶识别位点的位置进行截断,可对应得到用于构建Clean PIE系统的翻译起始元件截断片段I与翻译起始元件截断片段II。具体的,对编辑后的翻译起始元件序列进行截断的位置,是核酶识别位点中由核酶识别位点I连接核酶识别位点II的两个碱基之间。例如,当核酶识别位点序列为“5’-TTGGGTCT-3’”时,截断位置位于碱基TC之间。
用于编辑翻译起始元件的系统
在一些实施方式中,本公开提供了用于编辑翻译起始元件序列的系统,其中,所述系统包括:
二级结构建立模块:用于根据翻译起始元件序列,确定翻译起始元件的二级结构;
待编辑区筛选模块:用于根据所述二级结构,确定所述翻译起始元件序列中的待编辑区;
碱基替换模块:用于对所述待编辑区中的任意一个或两个以上位置处的碱基进行替换,得到包含核酶识别位点的编辑区。
在本公开中,所述核酶识别位点序列由核酶识别位点I的核苷酸序列和核酶识别位点II的核苷酸序列连接组成。
在本公开中,待编辑区为二级结构中发夹结构较少、自由能小,易于成环的位置。在一些实施方式中,所述待编辑区的上游100bp与下游100bp的范围内不具有大于20bp的发夹结构。
此外,本公开还公开了一种用于筛选包含核酶识别位点的目标编码区序列的处理装置,包括:
存储器,用于存储计算机程序;
处理器,用于执行计算机程序以实现如前述的用于编辑翻译起始元件序列的方法。
另外,本公开还公开了一种计算机可读存储介质,计算机可读存储介质上存储有计算机程序,计算机程序被处理器执行时实现如前述的用于编辑翻译起始元件序列的方法。
本领域人员还可以进一步意识到,结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤,能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现,为了清楚地说明硬件和软件的可互换性,在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行,取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能,但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法,例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
实施例1
(1)选取前期实验验证过具有蛋白高表达的翻译起始元件序列seq1(EnterovirusA90IRES)、seq2(Caprine kobuvirus IRES)、seq3(Echovirus E29 IRES)。
(2)使用软件RNAfold分别对seq1、seq2与seq3进行二级结构预测,对应图8,9,10。
(3)根据二级结构选择发夹结构较少(自由能小易于成环)的位置作为待编辑区。具体地,待编辑区的上游100bp与下游100bp的范围内不具有大于20bp的发夹结构。对待编辑区进行点突变,seq1(Enterovirus A90 IRES)序列第15位A突变为T、第20位T突变为C、第21位G突变为T得到突变序列seq4。seq1(Enterovirus A90 IRES)序列第677位T突变为G、第679位T突变为C得到突变序列seq5。seq2(Caprine kobuvirus IRES)序列第80位G突变为T、第81位A突变为C、第82位G突变为T得到突变序列seq6。seq3(Echovirus E29 IRES)第13位G突变为T、第19位T突变为C、第20位G突变为T得到突变序列seq7。
(4)成环中间体的组装,由内含子片段II、翻译起始元件截断片段II、编码区、翻译起始元件截断片段I、内含子片段I依次组成;其中内含子片段II为seq9,内含子片段I为seq8,编码区序列为人白细胞介素-12序列(seq10)。由seq4截断得到的翻译起始元件截断片段II为seq12,翻译起始元件截断片段I为seq11。由seq5截断得到的翻译起始元件截断片段II为seq14,翻译起始元件截断片段I为seq13。由seq6截断得到的翻译起始元件截断片段II为seq16,翻译起始元件截断片段I为seq15。由seq7截断得到的翻译起始元件截断片段II为seq18,翻译起始元件截断片段I为seq17。其中seq9、seq12、seq10、seq11、seq8依次组成的成环中间体命名为p3049,seq9、seq14、seq10、seq13、seq8依次组成的成环中间体命名为p3051,seq9、seq16、seq10、seq15、seq8依次组成的成环中间体命名为p3052,seq9、seq18、seq10、seq17、seq8依次组成的成环中间体命名为p3046。
本实施例涉及的序列如下表所示:
表1
实施例2
(1)基因合成
P3049、p3051、p3052与P3046委托金唯智合成与克隆。所得基因片段连接到pUC57载体。
(2)线性质粒模板制备
1)质粒抽提
①将外部合成的穿刺菌活化,条件37℃/220rpm/3~4h
②取活化菌液扩大培养,培养条件:37℃/220rpm/过夜
③质粒抽提(天根无内毒素小量中提试剂盒),测定OD值
2)质粒酶切
采取XbaI单酶切的方法酶切上述步骤1)中制备的质粒,酶切体系如下表所示:
表2
试剂 |
体积 |
质粒 |
10μg |
酶(1000units) |
5μl |
10x cutsmart buffer |
50μl |
Nuclease free,H<sub>2</sub>O |
Total 500μl |
37℃酶切过夜。采用通用型DNA胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物,测定OD值并采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。纯化的线性质粒模板用于体外转录。
(3)体外转录制备线性mRNA
1)体外转录
采用T7体外转录试剂盒(APE×BIO T7 High Yield RNA Synthesis Kit)合成mRNA,转录体系如下表所示:
表3
试剂 |
体积 |
10×Reaction Buffer |
2μl |
ATP(20mM) |
2μl |
CTP(20mM) |
2μl |
UTP(20mM) |
2μl |
GTP(20mM) |
2μl |
线性化DNA模板 |
1μg |
T7 RNA Polymerase Mix |
2μl |
RNA Nuclease free,H<sub>2</sub>O |
Total 20μl |
37℃孵育2.5h,然后用DNase I消化线性DNA模板。消化条件:37℃消化15min。
2)线性mRNA纯化
将上述1)所得转录产物,使用硅膜离心柱法纯化(Thermo,GeneJET RNAPurification Kit),测定OD值及1%变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小。
3)线性mRNA纯化
将上述1)所得转录产物,使用硅膜离心柱法纯化(Thermo,GeneJET RNAPurification Kit),测定OD值及1%变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小。
1%变性琼脂糖凝胶配制方法如下:
1)称取1g琼脂糖,至72ml nuclease-free,H2O中,微波炉加热溶解;
2)上述琼脂糖冷却至55~60℃时,在通风橱加0.1%的gel red,10ml 10×MOPS,18ml甲醛,灌胶;
3)变性琼脂糖凝胶电泳流程如下:取等体积样本RNA与2xLoading buffer,65~70℃变性5~10min。上样,采用100V/30min条件进行电泳,其后采用凝胶成像系统拍照。
(4)mRNA环化
1)环化试剂:
GTP Buffer:50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT,pH 7.5左右。
2)环化体系与条件:
表4
溶液 |
体积 |
mRNA |
25μg mRNA |
GTP solution(20mM) |
50μl |
GTP buffer |
补足至500μl |
将上述溶液于55℃加热15min,之后置于冰上,环化RNA产物使用硅膜离心柱法纯化(Thermo,GeneJET RNA Purification Kit),测定OD值及1%变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小。
3)环状RNA 1%变性琼脂糖凝胶鉴定
试剂配制:1g琼脂糖粉加入72ml无核酸酶水中,加热将琼脂塘融化,加入10ml10×MOPS缓冲液。然后在通风柜中加入18ml新鲜37%甲醛,充分混合,将凝胶倒入槽中。
mRNA检测:取500ng左右mRNA溶液,加入等体积的2×RNA loading buffer混匀,65℃加热5min,进行琼脂糖凝胶检测。
本公开中利用E1E2 Clean PIE系统制备环状RNA的成环过程及工艺不需要任何额外的改动,通过琼脂糖凝胶电泳检测发现成环效率与经典PIE系统相似,成环效果明显,未发现明显差异(图11)。
实施例3:成环后免疫原性的检测
对经典PIE系统及本公开中E1E2 Clean PIE系统制备的环状mRNA p3049、p3051、p3052与p3046在A549细胞中诱导免疫相应因子的表达情况。具体如下:
将经典PIE以及通过本公开中E1E2 Clean PIE成环后环状mRNA p3049、p3051、p3052与p3046经过RNaseR消化后HPLC纯化,所得纯化后的环状mRNA通过LipofectamineMessenger Max(Invitrogen)转染至A549细胞中,具体实施过程如下:
A549接种于含有10%胎牛血清,1%双抗的DMEM高糖培养基中,于37℃,5%CO2培养箱中培养。细胞每隔2-3天进行传代培养。
(1)细胞转染:
转染前将A549细胞以1×105个/孔接种于24孔板中,于37℃,5%CO2培养箱中培养。待细胞达到70-90%融合度后,使用Lipofectamine MessengerMax(Invitrogen)转染试剂将mRNA以500ng/孔量转染293T细胞,具体操作如下:
1)稀释Messenger MAXTM Reagent,稀释体系如下表所示:
表5
试剂 |
体积/孔 |
MEM无血清培养基 |
25μl |
Messenger MAX<sup>TM</sup> Reagent |
0.75μl |
稀释混合后,室温静置孵育10min。
2)稀释mRNA,稀释体系如下表所示:
表6
试剂 |
体积/孔 |
mRNA |
1μg |
MEM无血清培养基 |
补足至25μl |
3)取混合稀释后的Messenger MAXTM Reagent和mRNA(1:1)
表7
试剂 |
体积/孔 |
稀释的Messenger MAX<sup>TM</sup> Reagent |
25μl |
稀释的mRNA |
25μl |
稀释混合后,室温静置孵育5min。
(2)吸取上述混合液50μl贴壁缓缓加入24孔板中,37℃、5%CO2培养箱中孵育培养。
(3)裂解表达8小时后的细胞,通过荧光定量PCR验证免疫响应蛋白表达水平。
荧光定量PCR使用的引物序列如下所示:
IFNb-F:TGGGAGGATTCTGCATTACC(SEQ ID NO:21)
IFNb-R:CAGCATCGCTGGTTGAGA(SEQ ID NO:22)
RIG-1-F:CTCCCGGCACAGAAGTGTAT(SEQ ID NO:23)
RIG-1-R:CTTCCTCTGCCTCTGGTTTG(SEQ ID NO:24)
IFNa-F:CCATCTCTGTCCTCCATGAG(SEQ ID NO:25)
IFNa-R:ATTTCTGCTCTGACAACCTC(SEQ ID NO:26)
PKR-F:TGCAAAATGGGACAGAAAGA(SEQ ID NO:27)
PKR-R:TGATTCAGAAGCGAGTGTGC(SEQ ID NO:28)
MDA5-F:ACCAAATACAGGAGCCATGC(SEQ ID NO:29)
MDA5-R:GCGATTTCCTTCTTTTGCAG(SEQ ID NO:30)
TNFa-F:CGTCTCCTACCAGACCAAGG(SEQ ID NO:31)
TNFa-R:CCAAAGTAGACCTGCCCAGA(SEQ ID NO:32)
IL-6-F:TACCCCCAGGAGAAGATTCC(SEQ ID NO:33)
IL-6-R:GCCATCTTTGGAAGGTTCAG(SEQ ID NO:34)
图12示出了利用Clean PIE系统以及利用经典PIE系统制备环状mRNA诱导免疫因子的表达情况。
结果显示:
经典PIE经过RNase R消化及HPLC纯化后虽然INFb依然可以引起免疫反应,而通过本公开中Clean PIE成环系统制备环状mRNA相较经典PIE有明显的下降,从而证明具有更精确序列的环状mRNA可以减少免疫原性的诱发。
实施例4:通过本公开方法体外合成的环状mRNA在体外表达的验证
本实施例将实施例2中制备的环状mRNA转染至293T细胞中,吸取上清使用abcamab-213791-human IL-12(p70)Elisa kit试剂盒检测蛋白表达量,与经典PIE成环方法制备的环状mRNA相比,本公开中Clean PIE制备的环状mRNA在293T转染细胞中蛋白表达量增强(图13),说明本公开中Clean PIE制备环状mRNA由于未引入额外的外显子序列,从而未引起较强的免疫原性,使环状mRNA在细胞中的稳定性提高。同时Elisa检测数据也显示本公开中Clean PIE制备的环状mRNA在体外表达较经典PIE制备的环状mRNA出现这种意想不到的表达水平的提高。综合以上结果表明本公开中Clean PIE系统在获得更精确的环状mRNA的基础上,会使环状mRNA的表达水平提升。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例,而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司
<120> 基于翻译起始元件点突变的重组核酸分子及其在制备环状RNA中的应用
<130> 6A23-2223139IP-SU
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 748
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of IRES
<400> 1
tttaaaacag ctctagggtt gttcccaccc tagaggccca agtggcggct agcactctgg 60
tattacggta cctttgtgcg cctgttttat atcccttccc ccatgtaact tagaagatat 120
taaacaaagt tcaataggag ggggtacaaa ccagtgccac cacgaacaaa cacttctgtt 180
tccccggtga agctacatag actgttccca cggttgaaag tggcagatcc gttatccgct 240
ttggtacttc gagaaaccta gtaccacctt ggaatcttcg atgcgttgcg ctcagcactc 300
aaccccagag tgtagcttag gtcgatgagt ctggacgatc ctcactggcg acagtggtcc 360
aggctgcgtt ggcggcctac ctgtggcgaa agccacagga cgctagttgt gaacaaggtg 420
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catacctgtt tgttggtttt actaaactag atatagttac atttaaaact cttctttata 720
tcatacagtt gaatagtaga aagagaaa 748
<210> 2
<211> 665
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of IRES
<400> 2
gcccgtcccc ctcaccctct tttccggtgg ccacgcccgg gccaccgata cttcccttca 60
ctccctcggg actgttgggg aggaacacaa cagggctccc ctgtatttcc tcttcccatt 120
ccccctttcc taaccccaac cgccgtatct ggtggcggta agacacacgg gtctttccct 180
ctaaagcaca attgtgtgtg tgtcccaggt cctcctgcgt tcggtgcggg agtgctccca 240
cccaactgtt gtaagcctgt ccaacgtgtc gtcctggcaa gactatgacg tcgcatgttc 300
cgctgtggat gccgaccggg taaccggttc cccagtgtgt gtagtgcgat cttccaggtt 360
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ctgaccggag gctaattgtc tacgggtggt gtttccattt tctttttcac acaacttcat 540
tgctgacaac tcactgacta atcacttgct ctcttgtgcc tttctgctct ggttcaagtt 600
ccttgattgt ttgtttgatt gcttttcact gctttcttcc cacaatcctt gctcagttca 660
aagtc 665
<210> 3
<211> 742
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of IRES
<400> 3
ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcccac tgggcgctag cactctggta 60
tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatac ttcctccccc aactgcaact tagaagtaac 120
acaaaccgat caacagtcag cgtggcacac cagccacgtt ttgatcaaac acttctgtta 180
ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaaacgt tcgttatccg 240
gccaactact tcgagaaacc tagtaacgcc atggaagttg tggagtgttt cgctcagcac 300
taccccagtg tagatcaggt tgatgagtca ccgcattccc cacgggtgac cgtggcggtg 360
gctgcgttgg cggcctgccc atggggaaac ccatgggacg ctcttataca gacatggtgc 420
gaagagtcta ttgagctagt tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaactg 480
cggagcatac actctcaagc cagagggtag tgtgtcgtaa tgggcaactc tgcagcggaa 540
ccgactactt tgggtgtccg tgtttcattt tattcctata ctggctgctt atggtgacaa 600
ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagctatta 660
tatatctttt tgttgggttt ataccactta gcttgaaaga ggttaaaact ctacattaca 720
ttttaatact gaacaccgca aa 742
<210> 4
<211> 748
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of edited IRES
<400> 4
tttaaaacag ctcttgggtc tttcccaccc tagaggccca agtggcggct agcactctgg 60
tattacggta cctttgtgcg cctgttttat atcccttccc ccatgtaact tagaagatat 120
taaacaaagt tcaataggag ggggtacaaa ccagtgccac cacgaacaaa cacttctgtt 180
tccccggtga agctacatag actgttccca cggttgaaag tggcagatcc gttatccgct 240
ttggtacttc gagaaaccta gtaccacctt ggaatcttcg atgcgttgcg ctcagcactc 300
aaccccagag tgtagcttag gtcgatgagt ctggacgatc ctcactggcg acagtggtcc 360
aggctgcgtt ggcggcctac ctgtggcgaa agccacagga cgctagttgt gaacaaggtg 420
tgaagagtct attgagctac caaagagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcccaacc 480
acggagcaag tgcccacaaa ccagtgggtg gcttgtcgta atgcgtaagt ctgtggcgga 540
accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatttttat catggctgct tatggtgaca 600
atctaagatt gttatcatat agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagatcttg 660
catacctgtt tgttggtttt actaaactag atatagttac atttaaaact cttctttata 720
tcatacagtt gaatagtaga aagagaaa 748
<210> 5
<211> 748
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of edited IRES
<400> 5
tttaaaacag ctctagggtt gttcccaccc tagaggccca agtggcggct agcactctgg 60
tattacggta cctttgtgcg cctgttttat atcccttccc ccatgtaact tagaagatat 120
taaacaaagt tcaataggag ggggtacaaa ccagtgccac cacgaacaaa cacttctgtt 180
tccccggtga agctacatag actgttccca cggttgaaag tggcagatcc gttatccgct 240
ttggtacttc gagaaaccta gtaccacctt ggaatcttcg atgcgttgcg ctcagcactc 300
aaccccagag tgtagcttag gtcgatgagt ctggacgatc ctcactggcg acagtggtcc 360
aggctgcgtt ggcggcctac ctgtggcgaa agccacagga cgctagttgt gaacaaggtg 420
tgaagagtct attgagctac caaagagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcccaacc 480
acggagcaag tgcccacaaa ccagtgggtg gcttgtcgta atgcgtaagt ctgtggcgga 540
accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatttttat catggctgct tatggtgaca 600
atctaagatt gttatcatat agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagatcttg 660
catacctgtt tgttgggtct actaaactag atatagttac atttaaaact cttctttata 720
tcatacagtt gaatagtaga aagagaaa 748
<210> 6
<211> 665
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of edited IRES
<400> 6
gcccgtcccc ctcaccctct tttccggtgg ccacgcccgg gccaccgata cttcccttca 60
ctccctcggg actgttgggt ctgaacacaa cagggctccc ctgtatttcc tcttcccatt 120
ccccctttcc taaccccaac cgccgtatct ggtggcggta agacacacgg gtctttccct 180
ctaaagcaca attgtgtgtg tgtcccaggt cctcctgcgt tcggtgcggg agtgctccca 240
cccaactgtt gtaagcctgt ccaacgtgtc gtcctggcaa gactatgacg tcgcatgttc 300
cgctgtggat gccgaccggg taaccggttc cccagtgtgt gtagtgcgat cttccaggtt 360
ctcctggttg gcgttgtcca gaaactgctt cgggtaagtg gggtgtgccc aatccctaca 420
agggttgatt ctttcaccac cttaggaatg ctccggaggt accccagcaa cagctgggat 480
ctgaccggag gctaattgtc tacgggtggt gtttccattt tctttttcac acaacttcat 540
tgctgacaac tcactgacta atcacttgct ctcttgtgcc tttctgctct ggttcaagtt 600
ccttgattgt ttgtttgatt gcttttcact gctttcttcc cacaatcctt gctcagttca 660
aagtc 665
<210> 7
<211> 742
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of edited IRES
<400> 7
ttaaaacagc ctttgggtct atcccaccca cagggcccac tgggcgctag cactctggta 60
tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatac ttcctccccc aactgcaact tagaagtaac 120
acaaaccgat caacagtcag cgtggcacac cagccacgtt ttgatcaaac acttctgtta 180
ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaaacgt tcgttatccg 240
gccaactact tcgagaaacc tagtaacgcc atggaagttg tggagtgttt cgctcagcac 300
taccccagtg tagatcaggt tgatgagtca ccgcattccc cacgggtgac cgtggcggtg 360
gctgcgttgg cggcctgccc atggggaaac ccatgggacg ctcttataca gacatggtgc 420
gaagagtcta ttgagctagt tggtagtcct ccggcccctg aatgcggcta atcccaactg 480
cggagcatac actctcaagc cagagggtag tgtgtcgtaa tgggcaactc tgcagcggaa 540
ccgactactt tgggtgtccg tgtttcattt tattcctata ctggctgctt atggtgacaa 600
ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagctatta 660
tatatctttt tgttgggttt ataccactta gcttgaaaga ggttaaaact ctacattaca 720
ttttaatact gaacaccgca aa 742
<210> 8
<211> 128
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of intron region I
<400> 8
taattgaggc ctgagtataa ggtgacttat acttgtaatc tatctaaacg gggaacctct 60
ctagtagaca atcccgtgct aaattgtagg actaccgtca gttgctcact gtgcatcaga 120
tttctaga 128
<210> 9
<211> 222
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of intron region II
<400> 9
ggatcctaat acgactcact atagggagac cctcgcacag tgagcaactg acggaggttc 60
tacataaatg cctaacgact atccctttgg ggagtagggt caagtgactc gaaacgatag 120
acaacttgct ttaacaagtt ggagatatag tctgctctgc atggtgacat gcagctggat 180
ataattccgg ggtaagatta acgaccttat ctgaacataa tg 222
<210> 10
<211> 1626
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of coding region
<400> 10
atgtgccacc agcagctggt gatcagctgg ttcagcctgg tgttcctggc cagccccctg 60
gtggccatct gggagctgaa gaaggacgtg tacgtggtgg agctggactg gtaccccgac 120
gcccccggcg agatggtggt gctgacctgc gacacccccg aggaggacgg catcacctgg 180
accctggacc agagcagcga ggtgctgggc agcggcaaga ccctgaccat ccaggtgaag 240
gagttcggcg acgccggcca gtacacctgc cacaagggcg gcgaggtgct gagccacagc 300
ctgctgctgc tccacaagaa ggaggacggc atctggagca ccgacatcct gaaggaccag 360
aaggagccca agaacaagac cttcctgagg tgcgaggcca agaactacag cggcaggttc 420
acctgctggt ggctgaccac catcagcacc gacctgacct tcagcgtgaa gagcagcagg 480
ggcagcagcg acccccaggg cgtgacctgc ggcgctgcca cattgtctgc tgaaagggtt 540
agaggcgaca acaaggagta cgaatacagc gtggagtgcc aggaggacag cgcctgcccc 600
gccgccgagg agagcctgcc catcgaggtg atggtggacg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca agcccgaccc tcccaagaac 720
ctgcagctga agcccctgaa gaacagcagg caggtggagg tgagctggga gtaccccgac 780
acctggagca cccctcacag ctacttcagc ctgaccttct gcgtgcaggt ccagggcaag 840
agcaagcggg agaagaagga cagggtgttc accgacaaga ccagcgccac cgtgatctgc 900
aggaagaacg ccagcatcag cgtgagggcc caggacaggt actacagcag cagctggagc 960
gagtgggcca gcgtgccctg cagcggcagc agcggcggcg ggggcagccc cggcggcggc 1020
agcagcagga acctgcccgt ggccacccct gatcccggaa tgttcccttg cctgcaccac 1080
agccagaacc tgctgagggc cgtgagcaac atgctgcaga aggccaggca gaccctggag 1140
ttctacccct gcaccagcga ggagatcgac cacgaggaca tcaccaagga caagaccagc 1200
accgtggagg cctgtctgcc cttggagctg accaagaacg agagctgcct gaacagcagg 1260
gaaaccagct tcatcaccaa cggcagctgc ctggccagca ggaagaccag cttcatgatg 1320
gccctgtgcc tgagcagcat ctacgaggac ctgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 1380
atgaacgcca agctgctgat ggaccccaag aggcagatct tcctggacca gaacatgctg 1440
gccgtgatcg acgagctgat gcaggccctg aacttcaaca gcgaaaccgt gccccagaag 1500
agcagcctgg aggagcccga cttctacaag accaagatca agctgtgcat cctgctgcac 1560
gccttcagga tcagagccgt gaccatcgac agggtgatga gctacctgaa cgccagctga 1620
tgatga 1626
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region I from translation Initiation
element
<400> 11
tttaaaacag ctcttgggt 19
<210> 12
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region II from translation Initiation
element
<400> 12
ctttcccacc ctagaggccc aagtggcggc tagcactctg gtattacggt acctttgtgc 60
gcctgtttta tatcccttcc cccatgtaac ttagaagata ttaaacaaag ttcaatagga 120
gggggtacaa accagtgcca ccacgaacaa acacttctgt ttccccggtg aagctacata 180
gactgttccc acggttgaaa gtggcagatc cgttatccgc tttggtactt cgagaaacct 240
agtaccacct tggaatcttc gatgcgttgc gctcagcact caaccccaga gtgtagctta 300
ggtcgatgag tctggacgat cctcactggc gacagtggtc caggctgcgt tggcggccta 360
cctgtggcga aagccacagg acgctagttg tgaacaaggt gtgaagagtc tattgagcta 420
ccaaagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac cacggagcaa gtgcccacaa 480
accagtgggt ggcttgtcgt aatgcgtaag tctgtggcgg aaccgactac tttgggtgtc 540
cgtgtttcct tttattttta tcatggctgc ttatggtgac aatctaagat tgttatcata 600
tagctattgg attggccatc cggtgactaa cagagatctt gcatacctgt ttgttggttt 660
tactaaacta gatatagtta catttaaaac tcttctttat atcatacagt tgaatagtag 720
aaagagaaa 729
<210> 13
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region I from translation Initiation
element
<400> 13
tttaaaacag ctctagggtt gttcccaccc tagaggccca agtggcggct agcactctgg 60
tattacggta cctttgtgcg cctgttttat atcccttccc ccatgtaact tagaagatat 120
taaacaaagt tcaataggag ggggtacaaa ccagtgccac cacgaacaaa cacttctgtt 180
tccccggtga agctacatag actgttccca cggttgaaag tggcagatcc gttatccgct 240
ttggtacttc gagaaaccta gtaccacctt ggaatcttcg atgcgttgcg ctcagcactc 300
aaccccagag tgtagcttag gtcgatgagt ctggacgatc ctcactggcg acagtggtcc 360
aggctgcgtt ggcggcctac ctgtggcgaa agccacagga cgctagttgt gaacaaggtg 420
tgaagagtct attgagctac caaagagtcc tccggcccct gaatgcggct aatcccaacc 480
acggagcaag tgcccacaaa ccagtgggtg gcttgtcgta atgcgtaagt ctgtggcgga 540
accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatttttat catggctgct tatggtgaca 600
atctaagatt gttatcatat agctattgga ttggccatcc ggtgactaac agagatcttg 660
catacctgtt tgttgggt 678
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region II from translation Initiation
element
<400> 14
ctactaaact agatatagtt acatttaaaa ctcttcttta tatcatacag ttgaatagta 60
gaaagagaaa 70
<210> 15
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region I from translation Initiation
element
<400> 15
gcccgtcccc ctcaccctct tttccggtgg ccacgcccgg gccaccgata cttcccttca 60
ctccctcggg actgttgggt 80
<210> 16
<211> 585
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region II from translation Initiation
element
<400> 16
ctgaacacaa cagggctccc ctgtatttcc tcttcccatt ccccctttcc taaccccaac 60
cgccgtatct ggtggcggta agacacacgg gtctttccct ctaaagcaca attgtgtgtg 120
tgtcccaggt cctcctgcgt tcggtgcggg agtgctccca cccaactgtt gtaagcctgt 180
ccaacgtgtc gtcctggcaa gactatgacg tcgcatgttc cgctgtggat gccgaccggg 240
taaccggttc cccagtgtgt gtagtgcgat cttccaggtt ctcctggttg gcgttgtcca 300
gaaactgctt cgggtaagtg gggtgtgccc aatccctaca agggttgatt ctttcaccac 360
cttaggaatg ctccggaggt accccagcaa cagctgggat ctgaccggag gctaattgtc 420
tacgggtggt gtttccattt tctttttcac acaacttcat tgctgacaac tcactgacta 480
atcacttgct ctcttgtgcc tttctgctct ggttcaagtt ccttgattgt ttgtttgatt 540
gcttttcact gctttcttcc cacaatcctt gctcagttca aagtc 585
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region I from translation Initiation
element
<400> 17
ttaaaacagc ctttgggt 18
<210> 18
<211> 724
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of truncated region II from translation Initiation
element
<400> 18
ctatcccacc cacagggccc actgggcgct agcactctgg tatcacggta cctttgtgcg 60
cctgttttat acttcctccc ccaactgcaa cttagaagta acacaaaccg atcaacagtc 120
agcgtggcac accagccacg ttttgatcaa acacttctgt taccccggac tgagtatcaa 180
tagactgctc acgcggttga aggagaaaac gttcgttatc cggccaacta cttcgagaaa 240
cctagtaacg ccatggaagt tgtggagtgt ttcgctcagc actaccccag tgtagatcag 300
gttgatgagt caccgcattc cccacgggtg accgtggcgg tggctgcgtt ggcggcctgc 360
ccatggggaa acccatggga cgctcttata cagacatggt gcgaagagtc tattgagcta 420
gttggtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac tgcggagcat acactctcaa 480
gccagagggt agtgtgtcgt aatgggcaac tctgcagcgg aaccgactac tttgggtgtc 540
cgtgtttcat tttattccta tactggctgc ttatggtgac aattgagaga ttgttaccat 600
atagctattg gattggccat ccggtgacta acagagctat tatatatctt tttgttgggt 660
ttataccact tagcttgaaa gaggttaaaa ctctacatta cattttaata ctgaacaccg 720
caaa 724
<210> 19
<211> 163
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of intron region II
<400> 19
ctacataaat gcctaacgac tatccctttg gggagtaggg tcaagtgact cgaaacgata 60
gacaacttgc tttaacaagt tggagatata gtctgctctg catggtgaca tgcagctgga 120
tataattccg gggtaagatt aacgacctta tctgaacata atg 163
<210> 20
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of intron region I
<400> 20
taattgaggc ctgagtataa ggtgacttat acttgtaatc tatctaaacg gggaacctct 60
ctagtagaca atcccgtgct aaattgtagg act 93
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 21
tgggaggatt ctgcattacc 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 22
cagcatcgct ggttgaga 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 23
ctcccggcac agaagtgtat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 24
cttcctctgc ctctggtttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 25
ccatctctgt cctccatgag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 26
atttctgctc tgacaacctc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 27
tgcaaaatgg gacagaaaga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 28
tgattcagaa gcgagtgtgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 29
accaaataca ggagccatgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 30
gcgatttcct tcttttgcag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 31
cgtctcctac cagaccaagg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 32
ccaaagtaga cctgcccaga 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 33
tacccccagg agaagattcc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sequence
<400> 34
gccatctttg gaaggttcag 20