CN111378686A - 一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法。本发明提供的过表达载体pCircleVG，由在CAG启动子的下游加入了反向互补的序列和内含子，之后是5’的剪接受体和编码GFP C端的DNA序列，之后是一段polyA的信号序列，然后是翻译起始的kozak序列，和编码GFP N端的DNA序列，最后是3’的剪接供体，内含子和反向互补序列。本发明提供的过表达载体pCircleVG，通过加强RNA分子的反向剪切，提高了外源表达环状RNA的效率与水平。

Description

一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法。

背景技术

环状RNA是一类新发现的RNA。与线性的RNA不同，环状RNA首尾通过磷酸酯键连接形成闭合的环状。大多数的环状RNA都是由于外显子的反向剪接而形成的。随着高通量测序技术的广泛应用，大量的环状RNA被发现存在于真核生物的转录组中。由于环状RNA的特殊结构，一般认为，环状RNA具有不易降解的特性。环状RNA被认为具有很多潜在的功能，例如：它们可以与细胞内的microRNA结合，从而阻止microRNA与其目标RNA的结合，从而调节microRNA的功能；环状RNA也被报道有帮助RNA蛋白复合体组装的功能；其它可能的功能也可能包括基因表达调控，RNA剪接等。这些基本的生物学功能，使得环状RNA在胚胎发育，神经退行性疾病，癌症的发生与转移过程中都起到非常重要的作用。

虽然环状RNA的潜在功能非常广泛，但对于它的生成机理，分子特性，以及功能的研究才刚刚开始。阻碍这方面研究进展的一个关键就在于没有一个有效地模仿细胞内环境，可以高效地，可重复地，稳定生成环状RNA的过表达系统。一般认为，环状RNA的形成是由于RNA的反向剪接而形成的。真核生物的RNA前体(preRNA)通常包含有外显子(Exon)和内含子(Intron)，只有在细胞核内，RNA剪接复合体识别外显子3’端剪接供体与下一个外显子5’端的剪接受体，通过一系列的反应而除内含子，将多个外显子连接起来才能形成有功能的成熟的mRNA.并转运到细胞核外进行翻译。而反向剪接的具体的机理可能是由于具有环化可能的外显子两端的内含子中存在有可以形成互补结合结构的序列，从而将位于外显子5’端的剪接受体与同一外显子3’端的剪接供体在空间上拉近，从而使得反向剪接成为可能。与顺式剪切的高效性不同，反向剪切的效率是比较低的。目前广泛使用的过表达系统模仿了细胞内的反向剪切，但为了提高效率，通常是通过延长内含子中形成互补结构的序列来实现的。但较长的互补序列导致了过表达的RNA与细胞内其他RNA的非特异性结合，而且即使在这样的条件下，RNA的环化效率仍然很低。这样的表达体系，约20-40％的表达的RNA会形成环状RNA。所以构建一种具有短的，高度特异性的互补结合序列，而且有高的剪切效率的过表达系统将会极大地促进环状RNA的机理与功能研究。

在各种生物系统中，病毒的基因组是最高效地组合在一起的。病毒利用各种的RNA转录，剪切，和翻译调控来达到在有限的基因组中编码多种蛋白，以满足病毒转录，复制，翻译和形成新的病毒颗粒的需求。相比其他细胞体系，病毒在各个方面都是非常高效的。在分子生物学中我们常用的一些真核生物的表达控制元件都来自于病毒。如启动子有CMV，RSV，SV40等。我们因此试图在病毒中找到一种类似于反向剪接的体系，但很遗憾的是尚未有这方面的报道。似乎环状RNA是真核生物特有的。但我们知道病毒中的剪接元件是非常高效的。而且在某些真核生物病毒具有一种特异的剪接方式，反式剪接(Trans Splicing)。反式剪接(Trans Splicing)与反向剪接(Reverse Splicing)有很多类似性。反式剪接发生在两个RNA分子之间。它的发生也需要有内含子中的反向互补结构的形成连接，将要剪接的两个RNA分子在空间上拉近，从而实现一个RNA分子的外显子的3’剪接供体与另一个RNA分子的外显子的5’剪接受体之间发生剪接。有关顺式剪接的结构如图1所示，反式剪接的结构如图2所示，反向剪接的结构如图3所示。

发明内容

本发明基于病毒RNA的剪接顺式元件，内含子，以及反式剪接的反向互补序列构建了一种高效地过表达环状RNA的载体。本发明提供的载体，可以高效表达环状RNA，提高了外源表达环状RNA的效率与水平。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG，所述过表达载体的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示。

GGTACCTTGGACAAACTACTGTGCTTATTTAAAGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAGCGATCGCCGGCGCGCCCGGACCGACGCGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGGACAGCTTTAAATAAGCACAGTAGTTTGTCCAACTCGAG(SEQID NO.1)

优选地，所述核苷酸序列信息包括：序列A，内含子序列+5’剪接受体SA，编码GFP C端的DNA序列，poly A信号序列，翻译起始的Kozak序列，编码GFP N端的DNA序列，3’剪接供体SD+内含子，序列B。

优选地，所述序列A即CAG启动子下游的反向互补序列；核苷酸序列信息如SEQ IDNO.2所示；所述内含子序列+SA序列的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示；所述编码GFP C端的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述polyA信号序列即SV40PA，核苷酸序列信息如SEQ IDNO.5所示；所述Kozak序列的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.6所示；所述编码GFP N端的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述SD+内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述序列B即反向互补序列，核苷酸序列信息如SEQ ID NO.9所示。

TTGGACAAACTACTGTGCTTATTTAAAGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(SEQID NO.2)；

CTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(SEQID NO.3)；

D-GAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ IDNO.4)；

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA(SEQ ID NO.5)；

GCCACC(SEQ ID NO.6)；

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAG(SEQ IDNO.7)；

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATA(SEQ ID NO.8)；

ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGGACAGCTTTAAATAAGCACAGTAGTTTGTCCAA(SEQ ID NO.9)；

本发明还提供了所述高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG的构建方法，包括如下步骤：

S1、将SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列进行全基因合成，得circGFP序列；

S2、将步骤S1所得circGFP序列通过分子克隆构建过程插入维真pAV-CAG载体中，得含外源序列的载体；

S3、将步骤S2所得含外源序列的载体进行测序，筛选，即得。

优选地，步骤S1所述全基因合成的过程是直接在生物公司进行合成的。

优选地，步骤S2所述分子克隆过程插入维真pAV-CAG载体的具体操作为：

(1)用kpnI、XhoI限制性内切酶双酶切circGFP序列以及维真载体pAV-CAG载体，酶切体系如下：

反应液成分	体积
		DNA序列/0.1μg/μL	10μL
KpnI	1μL
		XhoI	1μL
ddH<sub>2</sub>O	14μL
		Total	30μL

所述DNA序列为circGFP序列或维真载体pAV-CAG；

(2)回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接体系如下：

成分	体积
		目的片段	5μL
载体片段	3μL
		10×T4 Buffer	1μL
T4 DNA连接酶(10U/μL)	1μL
		Total	10μL

于22℃连接2h；

(3)转化：将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含AMP的LB平板上进行筛选；

(4)测序验证：将构建好的克隆先经sgfI、MluI双酶切验证，将验证正确的克隆进行全长测序，筛选，即得。

本发明还提供了一种利用所述过表达载体pCircleVG进行环化RNA筛选的系统。

本发明建立了一种高效的形成环状RNA的过表达载体，基于常用的多种病毒的RNA剪接信号，内含子序列，以及发表过的在反式剪接中的反向互补序列，我们构建了一系列基于上面描述过的分拆的GFP筛选系统的载体。并在转染HEK293细胞后进行了筛选。如图4的结果所示，我们得到了一种高效的形成环状RNA的过表达载体。新的环状RNA过表达的载体(pCircleVG)转染HEK293细胞，48小时后收取细胞，提取总的RNA，经逆转录过程得到cDNA，利用qPCR方法测定RNA含量，总的RNA量由不跨间接连接点处的引物序列扩增定量，而环状的RNA量由跨过剪切位点的引物PCR扩增定量。我们的结果显示pCircleVG过表达后约80％以上是RNA都形成了环状RNA。

大多数的环状RNA都是有一个或多个外显子形成，所以有文献猜测，环状RNA可以翻译成某些蛋白，而且由于环状RNA不容易降解，因而蛋白表达量会比较高。我们基于这种猜想，在目前已有的环状RNA过表达载体中构建了只有RNA环化后才能翻译GFP的表达载体。具体载体构建如图4所示。在CAG启动子的下游加入了反向互补的序列和内含子，之后是5’的剪接受体和编码GFP C端的DNA序列。之后是一段polyA的信号序列，然后是翻译起始的kozak序列，和编码GFP N端的DNA序列，最后是3’的剪接供体，内含子和反向互补序列。在细胞内，当RNA转录后，只有当反向剪接发生，形成了环状RNA，编码GFP序列才能形成可翻译的完整序列。我们的实验结果(图5)表明，环状RNA表达蛋白的能力很低。猜测可能的原因在于在环状RNA中缺少成熟mRNA的5’帽子结构，所以翻译起始的效率很低。为此我们在编码N端GFP的序列的5’端插入了IRES(Internal Ribosomal Entry Site)来代替正常mRNA的5’帽子结构。我们的结果证明这样的元件有助于环状RNA中编码蛋白的表达，但其表达效果仍然较低(图6)。我们的结果说明虽然有外显子形成的环状RNA可以翻译成蛋白，但在没有翻译起始序列的帮助下，其翻译效率是非常差的。同时也说明我们的加入了IRES的GFP的报告系统是能反映细胞内RNA的成环效率的。我们可以基于这一体系进行过表达环状RNA的效率的筛选的。

本发明证明在我们的过表达载体系统中环状RNA的形成的效率远远高于反式RNA剪切的效率。有关环状RNA的检测方法，主流的有两种，一是通过q-PCR检测环化后形成的新序列。二是检测抗核酸酶的RNA。q-PCR方法简单，比较准确。但很多文献报道怀疑q-PCR的方法检测到的环状RNA中含有大量的非环状的通过反式剪接形成的在序列上有相似的RNA。如图1所显示的反向与反式剪切形成的产物图片。而抗核酸酶，也有文献表明似乎并不是所有环状RNA的特性。因为我们的过表达体系可以稳定高效地表达并形成环状RNA。我们利用pCircleVG对q-PCR检测RNA成环效率进行了验证。如果在同一个环状RNA的过表达载体中5’的反向互补序列(序列A)，剪接内含子(SA)与载体中3’的反向互补序列(序列B)，剪接内含子(SD)不同时存在一个载体中，反向剪接就无法实现。但如果将分别具有一半序列的载体同时转染细胞，虽然反向剪接不会发生，但反式剪接是可以发生的。如图7所示，我们比较了pCircle单独转染，与具有一半剪接元件的的载体的共同转染后，由剪接形成的RNA在总过表达RNA中的比率。我们的结果表明，在总的过表达的RNA水平类似的情况下，反向剪接形成环状RNA的比率在80-90％，而反式剪接的效率仅有2％左右。我们的结果表面，用pCircleVG载体来过表达环状RNA，qPCR可以非常有效地估算环状RNA形成的效率，而不必考虑其中由反式剪接的贡献。

本发明证明我们的过表达载体系统中经q-PCR检测到的环状RNA的主要来源于RNA环化，而不是来源于反式剪接。为了进一步证明q-PCR检测的有效性，我们再次应用了前面所述的环化GFP报告系统。我们知道在没有翻译起始信号的帮助的情况下，环状RNA翻译蛋白的效率是非常低的。我们重复了上面图7的实验，在我们能够重复q-PCR的情况下，我们对GFP的表达情况进行了观察。如图8-9结果显示，虽然q-PCR显示形成了大量的环状RNA，但GFP表达却很弱。同时虽然反式剪接形成的可翻译的RNA效率很低，却有非常好的GFP的表达。这进一步证实了q-PCR检测环状RNA形成的可靠性。

与现有技术相比，本发明提供的过表达载体pCircleVG具有如下优势：

(1)本发明提供的过表达载体pCircleVG，可以形成大量的环状RNA，通过加强RNA分子的反向剪切功能，提高了外源表达环状RNA的效率与水平；

(2)本发明提供的过表达载体pCircleVG，还可以成功筛选环化RNA，并利用q-PCR技术进一步验证所得RNA为环化RNA，并非是剪切RNA；

(3)本发明提供的过表达载体pCircleVG，双重验证了本发明提供的RNA为环状RNA，结果可靠，且加入了荧光分子，结果便于观察，为后续应用提供有力支持。

附图说明

图1为顺式剪接过程示意图；

图2为反式剪接过程示意图；

图3为反向剪接过程示意图；

图4为pCircleVG载体结构示意图；

图5为pCircleVG质粒转染293细胞荧光图；

图6为pCircleVG-IRES-GFP质粒转染293荧光图；

图7为不同载体成环率检测结果图；

图8为pCircleVG质粒转染293细胞荧光图；

图9为pCircleVG-delSA+pCircleVG-delSD质粒转染荧光图。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步的详细说明本发明，需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制，本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1pCircleVG(pAV-CAG-circGFP)载体构建

所述pCircleVG载体结构如图4所示，构建过程为：

S1、将SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列(序列A+内含子序列+SA+C-GFP+polyA+N-GFP+SD+内含子序列+序列B)进行全基因合成，得circGFP序列；所述全基因合成的过程通过生工生物工程(上海)股份有限公司完成；

S2、将步骤S1所得circGFP序列通过分子克隆构建过程插入维真pAV-CAG载体中，得含外源序列的载体；所述分子克隆过程插入维真pAV-CAG载体的具体操作为：

(1)用kpnI、XhoI限制性内切酶双酶切circGFP序列以及维真载体pAV-CAG载体，酶切体系如下：

反应液成分	体积
		DNA序列/0.1μg/μL	10μL
KpnI	1μL
		XhoI	1μL
ddH<sub>2</sub>O	14μL
		Total	30μL

所述DNA序列为circGFP序列或维真载体pAV-CAG；

(2)回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接体系如下：

成分	体积
		目的片段	5μL
载体片段	3μL
		10×T4 Buffer	1μL
T4 DNA连接酶(10U/μL)	1μL
		Total	10μL

于22℃连接2h；

(3)转化：将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含AMP的LB平板上进行筛选；

(4)测序验证：将构建好的克隆先经kpnI、MluI双酶切验证，将验证正确的克隆进行全长测序，筛选，即得。

S3、将步骤S2所得含外源序列的载体进行测序，筛选，即得。

实施例2pCircleVG-delSA(pAV-CAG-N-GFP-SD)载体构建

所述pCircleVG-delSA(pAV-CAG-N-GFP-SD)载体构建过程为：

(1)用实施例1合成的circGFP序列为模板，PCR获得N-GFP+SD+内含子序列+序列B的全长序列，得PCR产物；

具体操作过程为：设计用于扩增N-GFP+SD+内含子序列+序列B的全长序列的引物：

pCircleVG-delSA-F：GCGTGGTACCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG

pCircleVG-delSA-R：GCGTCTCGAGTTGGACAAACTACTGTGC

配制30μL的PCR体系：各组分的用量如表1所述：

表1 30μL的PCR体系中各组分含量

成分	用量/μL
		DMSO	0.9
dNTP(10μM)	0.6
		5×buffer(Mg<sup>2+</sup>)	6
Enzyme(5U/μL)	0.3
		Primer-F(10μM)	1.5
Primer-R(10μM)	1.5
		Template	1
H<sub>2</sub>O	18.2
		Total	30

扩增程序如表2所示：

(2)将步骤(1)得到的PCR产物通过分子克隆过程插入维真pAV-CAG载体中，得含外源序列的载体；克隆过程与实施例1类似；

(3)将步骤(2)所得载体通过测序验证，即得。

实施例3pCircleVG-delSD(pAV-CAG-SA-C-GFP)载体构建

(1)用实施例1合成的circGFP序列为模板，PCR获得序列A+内含子序列+SA+C-GFP的全长序列，得PCR产物；具体操作过程为：设计扩增序列A+内含子序列+SA+C-GFP的全长序列的引物：

pCircleVG-delSD-F：GCGTGGTACCTTGGACAAACTACTGTGCTTA

pCircleVG-delSD-R：GCGTCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG；其他过程与实施例2类似；

(2)将步骤(1)得到的PCR产物通过分子克隆过程插入维真pAV-CAG载体中，得含外源序列的载体；具体过程与实施例1类似；

(3)将步骤(2)所得载体通过测序验证，得到pCircleVG-delSD载体。

实施例4pCircleVG-IRES-GFP载体构建

所述IRES序列信息如下：

CCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC

所述pCircleVG-IRES-GFP载体构建的过程为：

(1)设计IRES PCR引物

IRES-AsisI-F：GCGTGCGATCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTG；

IRES-MluI-R：GCGTACGCGTGGTTGTGGCCATATTATCATC；

(2)以维真pAV-CMV-IRES-GFP载体为模板，扩增PCR IRES序列，配制PCR体系如下：

(3)先对PCR产物进行纯化，然后用AsisI、MluI酶切位点酶切PCR产物及pCircleVG载体，酶切体系为：

反应液成分	体积
		DNA序列/0.1μg/μL	10μL
KpnI	1μL
		XhoI	1μL
ddH<sub>2</sub>O	14μL
		Total	30μL

(4)回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接体系如下：

于22℃连接2h；

(5)转化：将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含AMP的LB平板上进行筛选；

(6)测序验证：将构建好的克隆先经sgfI、MluI双酶切验证，将验证正确的克隆进行全长测序，筛选，即得。

实施例5GFP表达水平检测

在六孔板中均匀接种293细胞，于37℃，5％CO₂培养箱中培养使细胞贴壁，待1个10cm培养皿长满，可拆分为2个六孔板，4小时后用于转染。

转染时，按照2μg/质粒/孔的量转染质粒，质粒：PEI转染液的质量比为1:3；分别用pCircleVG质粒及pCircleVG-IRES-GFP质粒进行转染。

转染48h后，观察荧光并拍照，结果如图5、图6所示，由此可知，环状RNA本身表达蛋白的能力很低，而本发明加入IRES元件有助于环状RNA中编码蛋白的表达，但其表达效果仍然较低。

实施例6成环率检测

(1)按照实施例4所述的方式，转染48h后，收集细胞，得293转染细胞

(2)提取步骤(1)所得293转染细胞中的总RNA，得RNA全序列；

RNA提取过程为：

(1)将细胞板中的DMEM细胞培养基吸净，用室温的PBS轻轻洗两遍，加入1mLTrizol(6孔板中加1mlTrizol，24孔板中加0.5mL Trizol)裂解细胞，用加样器反复吹打，并转移至RNase free的1.5mL EP管中，室温静置5min；

(2)加入0.2mL三氯甲烷(6孔板中加0.2mL、24孔板中加0.1mL，剧烈振荡15s，在室温放置15min，于4℃离心，12000rpm，20min；

(3)离心后取上层水相，加入等体积异丙醇，室温放置10min，4℃离心，12000rpm，15min；

(4)离心后弃掉上清，可见离心管底部有胶冻样白色沉淀，加入1mL 75％乙醇混匀，4℃离心，8000rpm，7min。

(5)弃去上清，将EP管倒置在吸水纸上5min，吸去管壁和管底残留液体，通风厨中干燥5min，待沉淀变为透明胶状时加入70μL的RNA溶解液溶解RNA；

(6)取2μLRNA于NanoDrop 2000分光光度计测定提取RNA的浓度和纯度；

(7)去除基因组DNA，配制10μL体系，具体组分及用量如下表。

表3不同组分的用量

10×DNase I Buffer	1μL
		RNA	1μg
DNase I	0.5μl(2Unit/μL)
		RNase inhibitor	0.3μL
RNase Free水	补至10μL

于37℃下处理30min，加入0.5μL，200mM的EDTA，于65℃下反应10min，终止反应。

(3)将步骤(2)所得RNA全序列逆转录，得全基因组cDNA

逆转录过程为：

(1)在去除DNA后的PCR小管中加入1μl逆转录引物oligo-dT(1μM)或0.5μL oligodT与0.5μL随机引物的混合物或特异逆转录引物，混匀后于12000rpm的转速下离心10min，70℃处理5min，立即冰浴30s

(2)然后加入以下试剂：10×RT-Buffer 2μL，M-MLV-RTase 1μL，RNase inhibitor0.5μL，dNTP(10mM eatch)0.5μL，DEPC水5μL，混匀，于42℃下逆转录60min；

(3)逆转录完毕后将样品72℃ 15min，灭活逆转录酶；

(4)将步骤(3)所得全基因组cDNA进行qPCR检测。具体检测过程为：配制qPCR体系，采用Syber green法相对定量PCR：

扩增条件为：

95℃预变性3min；

95℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸15s，收集荧光，40次循环。

引物有两对，分别为不跨剪接点处的引物，以及跨剪接点处的引物。

跨剪接点处引物为：

GFP_qPCR-trans-F1：CAGTGCTTCAGCCGCTACCC

GFP_qPCR-trans-R1：GCTCGATGCGGTTCACCAG

不跨剪接点处引物为：

GFP_qPCR_nontrans_F1：CAAGATCCGCCACAACATCG

GFP_qPCR_nontrans_R1：GACTGGGTGCTCAGGTAGTG

分别用这两对引物按qPCR体系进行PCR，得出跨剪接点处Ct值及不跨剪接点处Ct值

qPCR检测结果如图7及表4所示。

表4不同载体成环率检测结果

由此可知，pCircleVG单独转染时，与具有一半剪接元件的的载体的共同转染后，由剪接形成的RNA在总过表达RNA中的比率。结果表明，在总的过表达的RNA水平类似的情况下，反向剪接形成环状RNA的比率在80-90％，而反式剪接的效率仅有2％左右；而只有一半剪接元件的质粒，其RNA成环率大大降低。用pCircleVG载体来过表达环状RNA，qPCR可以非常有效地估算环状RNA形成的效率，而不必考虑其中由反式剪接的贡献。

实施例7成环验证试验

采用实施例5所述的qPCR方法，对GFP的表达情况进行观察，结果如图8-9所示，由此可知，虽然q-PCR显示形成了大量的环状RNA，但GFP表达却很弱。同时虽然反式剪接形成的可翻译的RNA效率很低，却有非常好的GFP的表达。这进一步证实了q-PCR检测环状RNA形成的可靠性。

最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 山东维真生物科技有限公司

<120> 一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法

<130> 2020.4.13

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 过表达载体的核苷酸序列信息(Nucleotide sequence information ofoverexpression vector)

<400> 1

ggtaccttgg acaaactact gtgcttattt aaagctataa cttcgtatag catacattat 60

acgaagttat ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc 120

ctttctctcc acaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 180

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 240

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 300

tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 360

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 420

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 480

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 540

ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaaa acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 600

aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 660

gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt agcgatcgcc ggcgcgcccg gaccgacgcg 720

tgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 780

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 840

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 900

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 960

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggtaagtat 1020

caaggttaca agacaggttt aaggagacca ataataactt cgtatagcat acattatacg 1080

aagttatcgg acagctttaa ataagcacag tagtttgtcc aactcgag 1128

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 序列A(Sequence A)

<400> 2

ttggacaaac tactgtgctt atttaaagct ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 60

ttat 64

<210> 3

<211> 64

<212> DNA

<213> 内含子序列+SA序列(Intron sequence and SA sequence)

<400> 3

ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 60

acag 64

<210> 4

<211> 435

<212> DNA

<213> 编码GFP C端的DNA序列(DNA sequence encoding the C-terminus of GFP)

<400> 4

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 60

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 120

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 180

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 240

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 300

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 360

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 420

gagctgtaca agtaa 435

<210> 5

<211> 122

<212> DNA

<213> SV40PA序列(Sequence SV40PA)

<400> 5

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 6

<211> 6

<212> DNA

<213> Kozak序列(Sequence Kozak)

<400> 6

gccacc 6

<210> 7

<211> 285

<212> DNA

<213> 编码GFP N端的DNA序列(DNA sequence encoding the N-terminus of GFP)

<400> 7

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccag 285

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> SD+内含子的核苷酸序列(Nucleotide sequence of SD and intron)

<400> 8

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat a 41

<210> 9

<211> 69

<212> DNA

<213> 序列B(Sequence B)

<400> 9

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcggaca gctttaaata agcacagtag 60

tttgtccaa 69

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> pCircleVG-delSA-F

<400> 10

gcgtggtacc gccaccatgg tgagcaaggg cg 32

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> pCircleVG-delSA-R

<400> 11

gcgtctcgag ttggacaaac tactgtgc 28

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> pCircleVG-delSD-F

<400> 12

gcgtggtacc ttggacaaac tactgtgctt a 31

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> pCircleVG-delSD-R

<400> 13

gcgtctcgag ttacttgtac agctcgtcca tg 32

<210> 14

<211> 576

<212> DNA

<213> IRES序列(Sequence IRES)

<400> 14

cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct 60

atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc 120

ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc 180

tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg 240

tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa 300

agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt 360

ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg 420

atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta 480

catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt 540

tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc acaacc 576

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> IRES-AsisI-F

<400> 15

gcgtgcgatc gccccccccc cctaacgtta ctg 33

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> IRES-MluI-R

<400> 16

gcgtacgcgt ggttgtggcc atattatcat c 31

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> GFP_qPCR-trans-F1

<400> 17

cagtgcttca gccgctaccc 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> GFP_qPCR-trans-R1

<400> 18

gctcgatgcg gttcaccag 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> GFP_qPCR_nontrans_F1

<400> 19

caagatccgc cacaacatcg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> GFP_qPCR_nontrans_R1

<400> 20

gactgggtgc tcaggtagtg 20

Claims (7)

1.一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG，其特征在于，所述过表达载体的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述过表达载体pCircleVG，其特征在于，所述核苷酸序列信息包括：序列A，内含子序列+5’剪接受体SA，编码GFPC端的DNA序列，poly A信号序列，翻译起始的Kozak序列，编码GFP N端的DNA序列，3’剪接供体SD+内含子，序列B。

3.如权利要求2所述过表达载体pCircleVG，其特征在于，所述序列A即CAG启动子下游的反向互补序列；核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示；所述内含子序列+SA序列的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示；所述编码GFPC端的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述polyA信号序列的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.5所示；所述Kozak序列的核苷酸序列信息如SEQID NO.6所示；所述编码GFP N端的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述SD+内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述序列B即反向互补序列，核苷酸序列信息如SEQ ID NO.9所示。

4.一种如权利要求1-5任一项所述高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列进行全基因合成，得circGFP序列；

S2、将步骤S1所得circGFP序列通过分子克隆构建过程插入维真pAV-CAG载体中，得含外源序列的载体；

S3、将步骤S2所得含外源序列的载体进行测序，筛选，即得。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S1所述全基因合成是直接在生物公司进行合成的。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S2所述分子克隆过程插入维真pAV-CAG载体的具体操作为：

(1)用kpnI、XhoI限制性内切酶双酶切circGFP序列以及维真载体pAV-CAG载体，酶切体系如下：

所述DNA序列为circGFP序列或维真载体pAV-CAG；

(2)回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接体系如下：

成分 体积 目的片段 5μL 载体片段 3μL 10×T4 Buffer 1μL T4 DNA连接酶(10U/μL) 1μL Total 10μL

于22℃连接2h；

(3)转化：将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含AMP的LB平板上进行筛选；

(4)测序验证：将构建好的克隆先经sgfI、MluI双酶切验证，将验证正确的克隆进行全长测序，筛选，即得。

7.一种利用权利要求1所述过表达载体pCircleVG进行环化RNA筛选的系统。

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