CN109072257B

CN109072257B - 增强的睡美人转座子、试剂盒和转座方法

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Publication number: CN109072257B
Application number: CN201780014786.4A
Authority: CN
Inventors: 苏兹萨纳·伊日瓦克; 佐尔坦·伊维克斯; 克里斯托弗·考夫曼; 苏内尔·纳拉亚纳瓦里
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: EP3430149A1; KR102476276B1; US20190169638A1; JP2019509066A; CN109072257A; AU2022263525A1; EP3219803A1; JP7072897B2; ES2884205T3; KR20180127358A; AU2017232265A1; US11814643B2; CA3015139A1; AU2017232265B2; HK1258956A1; WO2017158029A1; EP3430149B1; DK3430149T3

Abstract

本发明涉及增强的睡美人型转座子和转座方法。具体地，本发明涉及包含侧接左和右反向重复序列/同向重复序列(IR/DR)的货物核酸的多核苷酸，其中具有特异性序列的IR/DR被睡美人转座酶蛋白识别并且该多核苷酸能够整合到细胞的DNA中。本发明还涉及用于转座核酸的试剂盒，包含所述多核苷酸以及进一步的组分，如能够消除FACT(促进染色质转录)复合物的组分，即SSRP1和/或SUPT16H/SPT16的转座辅因子，或选自包括H，S，V和L的组的组织蛋白酶的抑制剂；或能够消除或抑制HSP90的辅因子；或在细胞周期阶段G0/G1，G1/S或G2/M中暂时阻滞细胞周期的因子；或抑制PCNA的泛素化的因子，或者其中这些组分已被敲减或抑制，或细胞周期在任何所述阶段被阻滞的细胞。可替代地或另外地，试剂盒可以包含作为转座辅因子的能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂，或其中ATR的浓度和/或信号传导增加的细胞。本发明进一步提供了使用所述转座子多核苷酸以及宿主细胞和药物组合物的方法。其还涉及所述转座辅因子或特异性细胞用于增强转座效率，例如，用于制备遗传修饰的核酸或细胞的用途。

Description

增强的睡美人转座子、试剂盒和转座方法

技术领域

本发明涉及增强的睡美人型转座子(Sleeping Beauty-type transposon) 和转座的方法。具体而言，本发明涉及包含侧接左和右反向重复序列/同向重复序列(IR/DR)的货物核酸(cargo nucleic acid)的多核苷酸，其中具有特异性序列的IR/DR被睡美人转座酶蛋白识别并且该多核苷酸能够整合到细胞的DNA中。本发明还涉及用于核酸转座的试剂盒，包含所述多核苷酸及进一步的组分，如能够消除FACT(促染色质转录)复合物的组分的转座辅因子，即SSRP1和/或SUPT16H/SPT16，或选自包括H，S，V 和L的组的组织蛋白酶(cathepsin)的抑制剂；或能够消除或抑制HSP90 的辅因子；或在细胞周期阶段G0/G1，G1/S或G2/M中暂时阻滞细胞周期的因子；或抑制PCNA的泛素化的因子，或其中这些组分已被敲减或抑制，或细胞周期阻滞于任何所述阶段的细胞。可替换地或另外地，试剂盒可以包含作为转座辅因子的能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂或其中ATR浓度和/或信号传导增加的细胞。本发明进一步提供了使用所述转座子多核苷酸以及宿主细胞和药物组合物的方法。其还涉及所述转座的辅因子或特异性细胞用于增强转座效率，例如，用于制备遗传修饰的核酸或细胞的用途。

背景技术

DNA重组固有地涉及远端DNA位点的断裂和连接。在真核生物中最充分研究的重组机制包括V(D)J重组(在脊椎动物中产生适应性免疫系统的免疫球蛋白库的转座样过程)以及水手(marnier)和睡美人可转座组件的转座。这些重组反应需要两个主要的功能组分：重组酶蛋白和重组酶结合并执行重组的特异性DNA位点。含有DDE特征(D＝天冬氨酸，E＝谷氨酸)的高度保守的催化结构域，通常表征许多重组酶。这种DDE超家族从原核生物到人类广泛分布，包括细菌IS组件，DNA转座子的Tc1/ 水手家族，人免疫缺陷病毒整合酶或V(D)J重组的RAG1重组酶。由于各种重组酶被解析的晶体结构的数量增加，我们对真核生物中转座机制的理解逐渐改善。而且，尽管由催化结构域进行共同的化学反应，但不同组件如何处理反应仍存在重要差异。虽然所有DDE重组酶会在转座子末端引发与单链缺口的重组反应(Mizuuchi K,et al.,1992.J Biol Chem.,267: 21273-6；Hickman AB,et al.,2014.Cell,158:353-67.)，但是第二链的处理是可以变化的。第二链的剪切通常通过发夹中间体实现，但在水手组件和睡美人中却并非如此(Dawson A and Finnegan DJ,2003.MolCell.11: 225-35；Izsvak Z,et al.,2004.Mol Cell,13:279-90.)，其中双链剪切是通过重组酶的两个连续水解反应的结果(Richardson JM,et al.,2006.Embo J., 25:1324-34；Richardson JM,et al.,2009.Cell,138:1096-108.)

Tc1/水手超家族的成员，包括睡美人(SB)转座子，是深入研究的真核生物组件。SB成为操纵脊椎动物基因组不可或缺的遗传工具。水手和 SB转座都对与野生型相比以较低频率转座的转座子和大组件的尺寸敏感。尽管有这些相似性，但水手和SB转座似乎具有显著差异。调节，包括强制转座子末端联会(synapsis)的策略，以及对于这种联会的条件，在重组酶之中也是不同的。虽然水手在每个转座子末端具有含有一个转座子结合位点的短TIR(Rosenzweig B,et al.,1983.Nucleic Acids Res,11: 4201-9；Tosi LR andBeverley SM,2000.Nucleic Acids Res.,28:784-90.)，但睡美人(SB)却属于转座子的间接重复序列/同向重复序列(IR/DR)的亚家族，在每个转座子末端具有两个转座酶结合位点(由同向重复序列表示) (Franz G and Savakis C,1991.Nucleic Acids Res,19:6646；Izsvak Z,et al., 1995.Mol Gen Genet.247:312-22；Ivics Z,et al.,1997.Cell,91:501-10； Miskey C,et al.,2003.Nucleic Acids Res,31:6873-81；Plasterk RH,et al.,1999.Trends Genet,15:326-32)(图1A)。左IR含有在SB转座中起到增强子作用的另外的基序(HDR)(Izsvak Z，et al.，2002.J Biol Chem，277: 34581-8.)。尽管观察到IR/DR是SB转座的绝对条件(Izsvak Z，et al.， 2000.J Mol Biol，302:93-102.)，但我们对其在转座过程中的作用的理解仍是神秘的。

SB转座子的不同变体在本领域中是已知的(WO 98/40510；US 8,227,432；Cui etal.,2002.Structure-function analysis of the inverted terminal repeats of theSleeping Beauty transposon".J.Mol.Biol.318(5): 1221-1235；Izsvák etal.2000.Sleeping Beauty,a wide host-range transposon vector for genetictransformation in vertebrates.J.Mol.Biol.302(1): 93-102)。可商购的含睡美人转座子的质粒命名为以下

pT(https://www.addgene.org/26555/sequences/#depositor-partial),

pT2(https://www.addgene.org/26557/sequences/#depositor-full)或

pT3(Yant SR,et al.Mutational analysis of the N-terminal DNA-bindingdomain of sleeping beauty transposase:critical residues for DNA binding andhyperactivity in mammalian cells.Mol Cell Biol.2004Oct；24(20):9239-47.)

发明内容

本领域仍然存在对于具有增强的效率的转座子和增强的转座子系统，试剂盒和方法需要。本发明人解决了这个问题。本发明在所附权利要求和说明书中描述。

具体而言，本发明提供了包含含有由左和右反向重复序列/同向重复序列(IR/DR)侧接的货物核酸的转座子的多核苷酸，其中

(i)转座子能够由睡美人转座酶蛋白调动；

(ii)左IR/DR包含外部左DR基序和内部左DR基序，其中外部左 DR基序包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列，而内部左DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；并且

(iii)右IR/DR包含外部右DR基序和内部右DR基序，其中外部右 DR基序包含SEQID NO:1的核苷酸序列的反向互补，而内部右DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向互补。

具体地，如果多核苷酸是单链，本发明还提供了互补多核苷酸。

为了解释SB转座子的IR/DR结构的作用，本发明人结合了体内，体外和计算机方法。他们已经发现转座子的IR/DR结构与转座酶的DNA-蛋白以及蛋白-蛋白相互作用表面之间有助于转座子末端的DNA-蛋白质复合物的严格调节、有序的组装的协调相互作用。他们已经证明，与水手转座子(Hsmar1)相比，SB会产生显著较低频率的异常单端转座事件。因此，复合物IR/DR结构可能已经进化为通过抑制异常转座事件而保护可转座组件以及宿主细胞基因组免于重排。

本发明人将转座子和转座酶细分为小的功能结构域，并解决了它们对 SB的转座过程的贡献。各自的实验将在下面的实验部分中描述。在这些实验的过程中，本发明人开发了包含本发明的新的增强IR/DR序列的转座子，具体为导致更高的转座率的新的DR基序。简而言之，确定了增强与睡美人转座酶的PAI结构域的结合的序列并测试了转座效率。出乎意料的是，只有一些具有较高结合亲和力的序列，具体地本文描述的本发明的多核苷酸的序列会导致转座效率增加。

本发明的外部DR(也称为14DR或外部14DR)具有SEQ ID NO:1 (左外部DR)的序列，或其反向序列或反向互补序列(右外部DR)。在优选的实施方式中，该共有序列中的两个可变位置在左外部DR和右外部 DR之间是不同的。具体地，在左外部DR中，Y可以是T和/或W可以是A。优选地Y是T而W是A。具体地，在右外部DR中，Y可以是C 和/或W可以是T。优选地Y是C而W是T。因此，优选地左外部DR基序包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列和/或右外部DR基序包含SEQ ID NO:4 的核苷酸序列的反向互补序列。最优选地，左外部DR基序包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列，而右外部DR基序包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的反向互补序列。

表1：外部DR 与US 8,227,432的SEQ ID NO:3或4的序列的差异以粗体标记，新位置以粗体和下划线标记。Y＝C/T；W＝A/T

本发明的内部DR(也称为12DR或内部12DR)具有SEQ ID NO:2 (左内部DR)的序列，或其反向互补序列(内部右DR)。在优选的实施方式中，该共有序列中的三个可变位置在左内部DR和右内部DR之间是不同的。优选地，在左内部DR中，Y是T和/或在右内部DR中，Y是C。优选地在左内部DR中，Y是T而在右内部DR中，Y是C。V可以是A， G或C，但优选地V是C。K可以是G或T，其中优选地K是G。因此，在一个实施方式中，在左内部DR中，Y是T，V是C而K是G(SEQID NO:5)和/或在右内部DR中，Y是C，V是C而K是G(SEQ ID NO:6)。最优选地，左内部DR基序包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，而内部右 DR基序包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的反向互补。

表2：内部DR 与US 8,227,432的SEQ ID NO:3或4的序列的差异以粗体标记，新位置以粗体和下划线标记。Y＝C/T；M＝A/C；R＝A/G； V＝A/G/C，其中V优选是C；K＝G/T，其中K优选是G

本发明人进一步发现，本发明的DR序列的PAI结合区还提供了增强的HDR区。因此，本发明还提供了包含本发明的转座子的多核苷酸，其中左IR/DR包含能够作用为包含外DR和内部DR之间的SEQ ID NO:7的核苷酸序列的增强子的HDR区。V可以是A，G或C，其中V优选是C；和/或K可以是G或T，其中K优选是G。优选V是C而K是G。可选地，所述转座子的右IR/DR进一步包含HDR区的反向互补。

SEQ ID NO:7HDR GTKTA CAKACASD

K＝G/T，

S＝C/G.

D＝A/T/G。

该优选的HDR对应于内部DR的PAI结合区。

在现有技术中已知同向重复序列周围的序列也在转座子的转座效率中起到重要作用。例如，如果外部和内部DR之间的核苷酸数量为约 135-196，优选155-176，则转座子会被最有效地调动。

本发明的IR/DR的合适的框架序列可以对应于由pT，pT2或pT3-转座子已知的序列。

如本文描述的，本发明的多核苷酸均包含SEQ ID NO:1和2的序列，优选地在这些已知的框架区或同等同框架区的上下文中包含这些序列。

因此，本发明提供了多核苷酸，其中左IR/DR包含选自由SEQ ID NO:8 和SEQ IDNO:9组成的组的核苷酸序列或与所述序列具有90％或更多的序列同一性，优选地与所述序列之一具有95％或更多的序列同一性，或最优选地，选自包括SEQ ID NO:8和9的组的核苷酸序列。

本发明还提供了多核苷酸，其中右IR/DR包含选自由SEQ ID NO:10， SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13组成的组的反向互补核苷酸序列，和与所述序列之一具有90％或更多的序列同一性，优选与所述序列具有95％或更多的序列同一性，或最优选地选自包括SEQ ID NO:10， 11，12和13的组的序列。

表3优选的IR/DR序列

具有HDR的pT4的左IR/DR：

SEQ ID NO:8

TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCAT TAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAAT AGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGT CATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCAC TGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGT GTACATACACGVKCT

具有HDR的pT5的左IR/DR:

SEQ ID NO:9

TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTC ATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACA ATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAA GTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTC ACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAA GTGTACATACACGVKCT

无HDR的pT4的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：

SEQ ID NO:10

TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACAT TTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATT CCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGA AATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCT TTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAG TGTACATACACGVKCT

无HDR的pT5的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：

SEQ ID NO:11

TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATAC ATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAA TTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTG AAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTT CTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAA GTGTACATACACGVKCT

具有HDR的pT4的右IR/DR(右IR/DR包括给定序列的反向互补)：

SEQ ID NO:12

TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACAT TTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATT CCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGA AATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTT CAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCC AGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

具有HDR的pT5的右IR/DR(右IR/DR包含给定序列的反向互补)：

SEQ ID NO:13

TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATAC ATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAA TTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTG AAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATT TCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYC CAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

Y＝C/T，其中优选地Y在左DR中是T，而在右DR中是C；

W＝A/T，其中优选地W在左DR中是A，而在右DR中是T；

V＝A/G/C，其中V优选是C；

K＝G/T，其中K优选是G；

S＝C/G，

D＝A/T/G.

最优选地，Y在左DR中是T而在右DR中是C；W在左DR中是A，而在右DR中是T；V是C；S是C，D是G，而K是G。

在本发明的多核苷酸的优选实施方式中，左IR/DR包含SEQ ID NO:8 的核苷酸序列，而右IR/DR包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pT，而本发明的多核苷酸命名为pT4。

在另一个优选的实施方式中，左IR/DR包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，而右IR/DR包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pT2，而本发明的多核苷酸命名为pT5。

本发明的转座子能够被睡美人转座酶蛋白调动。因此，转座子能够从供体多肽，例如载体中切除并整合到靶位点，例如细胞的基因组或染色体外DNA中。本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA。其可以是双链或单链的，或其组合。如果整合于单链，例如逆转录病毒载体中，本发明的多核苷酸可以是单链的。通常，本发明的多核苷酸会是双链的。

本发明的多核苷酸可以是线性的或环状的。优选地其为环状的形式。已经证明超螺旋质粒形式具有特别高的转座效率。在环状形式中，为了最佳效率，左IR/DR的5'端与右IR/DR的3'端通过可以包含例如约300bp 或更大的间隔子分隔开。

多核苷酸可以是选自由以下组成的组的载体：

(i)选自包括腺病毒，腺相关病毒，慢病毒，逆转录病毒，单纯疱疹病毒，杆状病毒，埃巴病毒(Epstein-Barr viral)和痘病毒载体的组的病毒载体；或

(ii)选自包括质粒，微环，pFAR构建体或病毒体的组的非病毒载体。

微环是已经大部分或完全不含非必需原核载体部分的小环状质粒衍生物。具体地，微环不含有编码细菌基因如抗生素抗性或ORI的DNA。本发明的微环DNA可以根据Kay etal.,2010,Nature Biotechnology 28, 1287-1289制备。其主链(即，无货物)优选包含小于2kb或小于1kb，例如，约540-580bp，优选约560bp。载体也可以是pFAR载体(不含抗生素抗性标记的质粒)，例如，根据文献Marie et al,2010,J Gen Med 12(4), 323-332)。

合适的载体也描述于Narayanavari et al.,2017,Crit Rev Biochem MolBiol.52(1):18-44；Richter et al.,2016,Blood 128(18):2206-2217；Boehme,et al.,2016.Mol Ther Nucleic Acids 5,e337；或Yant et al.,2002,Nat Biotechnol 20,999-1005中。

本发明的多核苷酸包含货物核酸。可选地，货物核酸包含可操作地连接于启动子的开放阅读框，其中开放阅读框可以编码例如T细胞受体构建体或其片段。可替代地或另外地，货物核酸可以包含编码至少一个miRNA 或shRNA的序列。可替代地或另外地，开放阅读框可以编码标记，例如抗生素抗性基因，酶或荧光蛋白。本发明的转座子也可以适用于插入型诱变。

本发明还提供了用于转座核酸的试剂盒，其中试剂盒包含：

(i)本发明的多核苷酸；

(ii)(a)SB转座酶蛋白或(b)编码SB转座酶蛋白的核酸；和

(iii)可选地，至少一种选自由包括以下的组的辅因子：

(A)能够消除选自由SSRP1和SUPT16H/SPT16组成的组的FACT 复合物的组分的辅因子；

(B)选自包括F，H，L，S和V的组的组织蛋白酶的抑制剂；(例如，E64D)

(C)能够消除或抑制HSP90(HSPAA1)的辅因子，抑制剂选自包括格尔德霉素(geldanamycin)，根赤壳菌素(radicicol)或17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素的组；

(D)在细胞周期阶段G0/G1，G1/S或G2/M中暂时阻滞细胞的细胞周期的因子；和

(E)抑制PCNA(增殖细胞核抗原)的泛素化的因子，

(F)能够增加ATR(共济失调毛细血管扩张症(Ataxia telangiectasia) 和Rad3相关的)的浓度和/或信号传导的试剂，

其中所述辅因子选自包括小分子，siRNA和miRNA的组，

或细胞，其中：

(AA)所述FACT复合物的组分；和/或

(BB)所述组织蛋白酶；和/或

(CC)所述HSP90，(HSPAA1)被敲减；和/或

(DD)细胞周期在细胞周期阶段G0/G1，G1/S或G2/M中暂时被阻滞；和/或

(EE)PCNA的泛素化被抑制；和/或

(FF)ATR的浓度和/或信号传导被增加。

具体地，如果编码SB转座酶蛋白的核酸是DNA，包含转座子的多核苷酸和编码SB转座酶蛋白的核酸可以位于相同的载体上或不同的载体上。如果编码SB转座酶蛋白的所述核酸是RNA，则包含转座子的多核苷酸通常为DNA形式，优选为环状，最优选超螺旋形式。通常，包含转座子的多核苷酸为DNA的形式，优选为2环状，最优选超螺旋的形式，并且SB转座酶为蛋白的形式。

可选地，试剂盒进一步包含合适的缓冲液或细胞培养基，和/或用于转染细胞和/或产生重组核酸的说明书。转座可以在体外，例如，根据文献 Goryshin et al.,1998,JBC273,7367-7374所教导的方法进行。然而，通常转座发生于细胞中，通常在细胞培养物中或离体的细胞中。微注射单细胞受精卵然后植入超排卵的雌性中是可能的。另外，转座可以连同杂交SB- 病毒载体(例如，杂交SB-腺苷，如Zhang et al,2013 PLoS One 8(10):e75344)或通过电穿孔或纳米递送一起发生于体内。

在本发明的所有实施方式中，SB转座酶可以是例如US 8,227,432 B2 公开的SB转座酶，或SB10(Ivics et al.，1997，Cell 91：501-510)。优选地，在整个本发明中，其是高度活性的转座酶SB100X(Mátés L1,et al. Molecular evolution of a novel hyperactiveSleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer invertebrates.Nat Genet.2009 Jun；41(6):753-61)。

本发明人进一步出乎意料地发现，如果在转座期间存在如上描述的至少一种辅因子，具体地(A)能够消除FACT复合物的组分的辅因子，或可替代地，(B)选自包括F，H，L，S和V的组的溶酶体组织蛋白酶的抑制剂；(C)能够消除HSP90的辅因子；或(D)在细胞周期阶段G0/G1， G1/S或G2/M中暂时阻滞细胞的细胞周期的因子；或(E)抑制PCNA的泛素化的因子；或(F)能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂，则转座效率显著增加。

在哺乳动物细胞中，SSRP1和SUPT16H/SPT16作为异二聚体存在，并是促进染色质转录(FACT)复合物的组分。FACT复合物参与各种过程，如DNA复制和修复。非洲爪蟾(Xenopus)中的FACT同源物的消除会导致复制缺陷(Orphanides et al.,1999,Nature400:284-288)，表明其在复制中的作用。此外，还显示FACT复合物可以与涉及DNA损伤修复过程的蛋白如PARP1和RPA相互作用(Huang et al.,2006,Nucleic Acids Res. 34:2398-2407；VanDenmark et al.,2006,Mol Cell.22:363-374；Solinger et al., 2002,MolCell.10:1175-1188)。最近显示SSRP1的消除会导致同源重组活性增强以及H2AX和Rad51灶形成增加。有趣的是，还显示SSRP1可以与Rad54物理相互作用并在体外功能性地抑制由Rad54促进的HJ的BM 活性(Kumari et al.,2009,J Cell Biochem.108:508-518)。

因此，至少一种能够消除FACT复合物的组分的辅因子能够消除 SSRP1和/或SUPT16H/SPT16。消除具有所讨论的组分，特别是FACT复合物的组分，不再可用于与转座酶和/或转座子的相互作用的结果。这可以通过降低消除的组分，例如FACT复合物的组分的浓度，例如通过RNA 干扰，通过siRNA或miRNA在稳定细胞系中的敲减，或通过FACT复合物的组分，例如与SSRP1或SUPT16H/SPT16的合适抗体螯合而实现。

优选地，辅因子选自包括小分子，抗体，shRNA，siRNA和miRNA 的组。小分子可以是高达约800g/mol的活性剂。例如，可以使用组织蛋白酶抑制剂如E64D。可以可替代地或另外地使用HSP90抑制剂如格尔德霉素，根赤壳菌素或17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素。

本发明人能够证明SUPT16H的消除会导致转座最强烈地增加，而因此是优选的。

能够消除所关注的组分，例如，SSRP1和/或SUPT16H/SPT16的辅因子能够通过例如结合试验或如下描述的转座试验识别。能够降低SSRP1 或SUPT16H/SPT16浓度的siRNA和miRNA可以由技术人员制备，并且是可商购的。获取(来自Dharmacon，GE healthcare)预先设计的市售合成siRNA(siGENOME，SMARTpool)。使用jetPEITM转染系统将靶向的 supt16H基因(目录号M-009517-00-0005)和ssrp1(目录号 M-011783-01-0005)的siRNAs转染到Hek293T中。作为阴性对照，使用了靶向萤火虫荧光素酶基因的siRNA(目录号D-001206-14-05)。对于基于miRNA的敲减，合成了靶向基因(表5)的miRNA(Eurofins)并最终在转染前克隆到miRNA载体中。

FACT复合物的两种组分都可以被消除，但本发明人可以证明一种组分的消除已经足以显著增加转座效率，例如，约50倍。这二者都适用于使用例如非高度活性的SB10和SB100X的转座。

FACT复合物的至少一种组分的消除会增加本发明的转座子(例如， pT4或pT5)以及其他转座子，具体为Tc1/水手型转座子，例如睡美人转座子如pT，pT2或pT3的转座效率。

为了监测由转座酶激活的转录变化，进行全基因组转录研究(HeLa，Affymetrix)。转录组分析表明，在转座酶存在下，几种宿主编码的基因受到不同的调节。上调的蛋白列表包括HSAP2，别名HSP70-2，以及组织蛋白酶家族的几个成员(图6A)。虽然热休克蛋白HSP70的变体HSPA2是应激反应的一员，但组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶，并在哺乳动物细胞更新中起重要的作用。初步结果表明，通过抑制HSP90(HSP90AA1)或抑制组织蛋白酶活性(图6B)调节应激反应会改进SB转座。此外，通过减轻细胞应激反应，会缓和细胞凋亡信号的诱导，并改善细胞活力。

本发明人进一步证明，经由睡美人，例如本文描述的本发明的转座子或常规睡美人转座子如pT2的转座，需要ATR信号传导(实施例2和图7)。因此，能够增加ATR的浓度和/或信号传导，优选浓度的试剂可以有利地包含于本发明的试剂盒中。优选地，试剂会增加ATR的表达。这种试剂可以是，例如编码ATR的多核苷酸，例如mRNA。编码ATR的多核苷酸也可以是例如适于整合到细胞的基因组中的形式的DNA。可替换地，ATR 可以编码于本发明的多核苷酸上，优选为侧接左和右反向重复序列/同向重复序列的区域外侧。试剂也可以是以蛋白质形式的ATR。ATR的浓度和/ 或信号传导增加的细胞优选包含这种试剂。优选地增加ATR的表达。在这种环境中的增加会涉及与其中ATR的浓度或信号传导不受这种试剂的添加影响的细胞的比较。

可替换地，如果期望调节睡美人活性作为例如其中睡美人活性负向调节的阴性对照，则能够降低ATR的浓度和/或信号传导，优选信号传导的试剂可以包含于本发明的试剂盒中。能够降低ATR的浓度的试剂可以是 miRNA。能够降低ATR的信号传导的试剂可以是咖啡因。

因此，本发明提供了通过转座子，优选睡美人转座子的转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的方法，其中存在至少一种如上描述的辅因子或试剂，例如能够消除FACT复合物的组分的辅因子。辅因子或试剂可以引入细胞，优选体外或离体。

本发明还提供了如上描述的至少一种辅因子或试剂，例如能够消除 FACT复合物的组分的辅因子，用于通过转座子，优选睡美人转座子的转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的用途，其中与没有所述辅因子或试剂的相同条件相比，转座效率显著提高。优选地转座提高至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍或至少约50 倍。

本发明还提供基于例如HEK293T细胞(HEK293TΔ SSRP1和 HEK293TΔSUPT16H/SPT16)的对于SSRP1和/或SUPT16H/SPT16 (ΔSSRP1或ΔSUPT16H/SPT16)的敲减的细胞，例如细胞系，及其用于通过转座，优选使用睡美人转座子如pT2的转座而生成重组多核苷酸或重组细胞的用途。还可以使用对于HSP90和/或组织蛋白酶和/或其中PCNA 泛素化受抑制和/或细胞周期在上述阶段之一中受阻滞的细胞的敲减细胞系。此类细胞系可以是转座试剂盒如本发明的试剂盒的组分。这种细胞系可以用于实现高转座效率。优选这种敲减细胞是稳定的细胞系。

本发明的敲减细胞系可以是修饰为包含浓度降低的FACT复合物的组分的细胞系。所述降低可以通过遗传修饰或通过用试剂如具有与基因或 mRNA转录物互补的序列的短DNA或RNA寡核苷酸处理而发生。如果进行DNA的遗传修饰，则结果是稳定的敲减。如果基因表达的变化是由与mRNA结合或暂时与基因结合的寡核苷酸所致，这会导致基因表达中不修饰染色体组DNA的暂时变化，而结果称为瞬时敲减。

在瞬时敲减中，该寡核苷酸与活性基因或其转录物的结合会通过各种过程导致表达降低。结合可以通过阻断转录(在基因结合的情况下)， mRNA转录物的降解(例如，通过小干扰RNA(siRNA)或RNase-H依赖性反义序列)或通过阻断mRNA翻译，前mRNA剪接位点或用于其他功能性RNA，包括miRNA的成熟(例如，通过吗啉代寡核苷酸或其他 RNase-H非依赖性反义序列)的核酸酶切割位点(Wikipedia)而发生。

本发明中优选的敲减方法是RNA干扰(RNAi)，是通过mRNA降解而沉默基因的手段。通过这种方法的基因敲减通过将小的双链干扰RNA (siRNA)引入细胞质中而实现。小干扰RNA可以源自细胞内部或可以外源性引入细胞中。一旦引入细胞中，外源siRNA通过RNA诱导沉默复合物(RISC)加工。siRNA与待沉默的靶mRNA互补，并且RISC会使用siRNA作为用于定位靶mRNA的模板。在RISC定位于靶mRNA后， RNA会通过核糖核酸酶剪切。siRNA可以在细胞系中组成型表达或通过例如电穿孔与用于转染的其他组分同时引入。

因此，取决于用于敲减的方法，细胞可以包含能够消除FACT复合物的组分的辅因子。本发明还提供了通过转座子如睡美人转座子转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的方法，其中转座子优选是本文的本发明描述的转座子，包括在其中例如FACT复合物的组分通过例如将转座酶(以蛋白质或核酸形式)和转座子引入所述细胞中而敲减的细胞中诱导转座。本发明还提供了其中例如FACT复合物的组分被敲减的细胞用于通过转座子如睡美人转座子的转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的用途，其中转座子优选是本发明的转座子。

本发明还提供了包含本发明的敲减细胞的生物体(特别是非人类生物体如小鼠或大鼠)，及其通过睡美人转座子，优选pT4或pT5产生转染的生物体的用途。

本发明还提供了产生重组核酸的方法，包括使包含睡美人转座酶的识别序列的靶核酸与本发明的试剂盒的组分接触。

本发明还提供了产生转染的细胞的方法，其中该方法包括向所述细胞中引入本发明的试剂盒的组分。优选地，该方法包括电穿孔细胞。本发明的方法可以在体外或体内，优选体外进行。

本发明的多核苷酸和/或试剂盒还可以用于产生细胞库(即，重组细胞的多克隆培养物)和克隆细胞系，用于使用例如中国仓鼠卵巢细胞作为宿主大规模生产重组蛋白。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞仍然是用于生产生物制药药物，特别是单克隆抗体(mAbs)，双特异性抗体和Fc-融合蛋白最流行的宿主。因此，本发明还提供了用于生产蛋白，例如，抗体或其衍生物如双特异性抗体或Fc融合蛋白的方法，包括优选使用本发明的试剂盒将编码所述蛋白质的本发明的多核苷酸引入(例如，电穿孔)如CHO细胞的宿主细胞中的步骤，并且其中将所述蛋白分离。

本发明还提供了包含本发明的含有转座子的多核苷酸的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是适合过继性T细胞转移的T细胞，其包含本发明的转座子，其中货物核酸是转基因TCR构建体或其片段和/或编码至少一种miRNA。

本发明进一步提供了包含本发明宿主细胞的药物组合物。例如，如果宿主细胞表达与肿瘤抗原反应性的转基因T细胞构建体，则药物组合物可以用于治疗癌症的方法。在其他实施方式中，本发明的宿主细胞适用于治疗感染性，例如病毒或细菌性疾病(例如，因为它们是表达能够靶向受感染细胞的合适TCR构建体的T细胞)。

本发明在所附实施例中进一步说明和解释，其并非旨在限制权利要求的范围。本文引用的所有参考文献是完全并入的。除非另有明确说明，否则“一个”应理解为“至少一个”。“约”是指+/-10％。

附图说明

图1水手/Tc1和睡美人可转座元件的结构。

A.在水手中，转座酶编码序列(灰色圆柱)侧接简单的末端反向重复序列(IR)，每个IR包含单个识别基序。B.在睡美人中，IR/DR元件具有较长的末端IR(箭头)，每个IR具有两个识别信号序列，以同向重复的形式(DR)重复两次。左IR另外携带在转座中起到增强子作用的基序 (HDR)。

图2通过CASTing选择SB转座酶的最佳结合位点。

A.CASTing策略的流程图。B.对通过六个CASTing循环选择的寡核苷酸测序并使用SB转座酶N123的全(配对(PAIRED))DNA结合结构域在电泳迁移率试验(EMSA)中测试(IvicsZ,et al.,1997.Cell,91: 501-10)。将结合亲和力与SB左IR的14DR基序比较。Cpx—DNA-蛋白复合物，游离—游离DNA探针的位置。(右图)。C.对图B所示的复合物定量，并计算相对底物结合亲和力值。D.通过CASTing策略选择的最佳结合位点的序列比对。RED的结合区域为斜体，AT-hook结合的核苷酸加框，而PAI的结合区以大写表示。将序列与SB转座子的左IR的12DR(左图)或14DR(右图)的野生型基序比对。同一性分数如下所示。同一性的核苷酸为彩色背景(黑色—高于50％；灰色—低于50％)。通过RED和 PAI野生型基序的CASTing实验分别回收20％和70％的野生型基序。在 EMSA中使用的选择的的最佳结合位点(图3A)用星号标记。

WT 12DR：SEQ ID NO:14 14DR：SEQ ID NO:15

CAST-1 12DR：SEQ ID NO:16 14DR：SEQ ID NO:17

CAST-2 12DR：SEQ ID NO:18 14DR：SEQ ID NO:19

CAST-3 12DR：SEQ ID NO:20 14DR：SEQ ID NO:21

CAST-4 12DR：SEQ ID NO:22 14DR：SEQ ID NO:23

CAST-5 12DR：SEQ ID NO:24 14DR：SEQ ID NO:25

CAST-6 12DR：SEQ ID NO:26 14DR：SEQ ID NO:27

CAST-7 12DR：SEQ ID NO:28 14DR：SEQ ID NO:29

CAST-8 12DR：SEQ ID NO:30 14DR：SEQ ID NO:31

CAST-9 12DR：SEQ ID NO:32 14DR：SEQ ID NO:33

CAST-10 12DR：SEQ ID NO:34 14DR：SEQ ID NO:35

CAST-11 12DR：SEQ ID NO:36 14DR：SEQ ID NO:37

CAST-12 12DR：SEQ ID NO:38 14DR：SEQ ID NO:39

CAST-20 12DR：SEQ ID NO:40 14DR：SEQ ID NO:31

图3 12DR与14DR之间的区别由SB转座酶的DNA结合域的RED 亚结构域介导。A.左反向重复序列(IR)的14(外部)DR(SEQ ID NO:32) 和12(内部)DR(SEQ ID NO:33)的比对。通过足迹法识别参与DNA- 蛋白相互作用的核苷酸(Ivics Z,et al.,1997.Cell,91:501-10)，以大写字母表示，而非同一性核苷酸以斜体表示。指出由PAI(空心圆)或RED(黑圈)亚结构域识别的核苷酸，以及AT-hook(加框)(Izsvak Z，et al.，2002. Chem，277：34581-8.)。类似于RAG1的“七聚体”和“九聚体”的基序的核苷酸在黑框中突出显示(Hesse,JE etal.,1989.Genes Development,3: 1053-61)。基序之间的间隔子的长度在内和外DR中分别为12或14。B.通过EMSA测试RED(N58-123，黑圈)，PAI(N1-57，空心圆)或全N端 DNA结合域(PAI+RED)的DNA结合特性。图3Ba和3Bb：对应于12DR (黑色)，14DR(灰色)或12+AA DR(加点，黑色)的标记的寡核苷酸用作DNA底物。描绘了预测的核蛋白复合物的示意图。用全N端DNA 结合域(配对，N123)形成的复合物用作尺寸标记(～2xRED)。在4％(图 3Ba)或6％(图3Bb和3Bc)天然凝胶上分离复合物。C.在化学交联剂， 2mM BS3存在下RED亚结构域的寡聚性质。复合物通过15％SDS-PAGE 分离，随后是使用针对SB转座酶的多克隆抗体的免疫印迹(Western blotting)。复合物的预期分子量(包括组氨酸标签)如下：-M(RED单体)8.5kDa；-D(RED二聚体)17kDa；-T(RED三聚体)34kDa。

图4内部DR处增强的结合亲和力改进了睡美人转座。在左侧，描绘了各种新标记的突变的转座子构建体的示意图。在右侧，显示了与设定为100％的野生型转座子(构建体1)相比的各自的转座活性。A.复合物 DR通过将PAI(黑框)或RED(灰框)识别基序更改成由CASTing实验选择的高亲和性结合位点(CAST-5)(在PAI处以星号标记并在RED识别基序处剥离)而产生。B.CAST-5序列(SEQ ID NO:24或25)用于仅仅替换PAI识别基序，而DR的其余部分是野生型的。

图5通过RNA干扰产生的稳定敲减细胞系中的转座试验。

A.富集具有敲减构建体的细胞。Hek293T细胞未转染，用逆转录病毒载体MPSV-LTR-内含子截短hNGFR-WPRE-miRNA-LTR转导，如在实验部分进一步详述的，其中miRNA如下：未靶向任何宿主基因的构建体用作阴性对照(乱序序列(scramble))，或miRNA构建体，具有21个核苷酸(nt)，特异性靶向ssrp1或supt16H。通过流式细胞术(转导后)，监测转导的Hek293T细胞的表面NGFR表达，x轴。y轴：没有染色。为了富集表达miRNA的细胞群体，将细胞FACS分选并再次分析(分选后)。数据表明，当存在FACT复合物的miRNA消除组件时，NGFR的表达增加。

B.通过来自miRNA富集细胞群体的qPCR监测miRNA的敲减效率。条形图上方括号中所示的数字代表敲减％。

C.敲减细胞系中的转座试验。具有用pCMV-SB10和pT2B-Puro或者 pCMV-LacZ和pT2B-Puro或者pCMV-SB100x和pT2B-Puro转染的嘌呤霉素抗性Hek293T细胞的染色集落的培养皿。

D.使用采用siRNA的瞬时转染的HEK293T细胞中的转座试验。 siRNA靶向ssrp1或supt16H。不靶向任何基因的乱序riRNA用作阴性对照。培养皿具有用pCMV-SB10和pT2B-Puro或者pCMV-LacZ和pT2B-Puro 或者pCMV-SB100x和pT2B-Puro转染的嘌呤霉素抗性Hek293T细胞的染色集落。

图6 A.E64D(组织蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和钙蛋白酶的抑制剂) 对SB转座的影响。转座试验，(20μM，右侧；对照，左侧)。预期针对组织蛋白酶的RNAi方法会产生类似的改进。B.在转座酶(HeLa，Affymetrix) 存在下宿主基因的差异表达。下调的宿主基因(右侧)，上调的宿主基因 (左侧)。组织蛋白酶(CT)降解多肽并且通过底物特异性(CTSH，CTSF，CTS2)区分。

图7 A.咖啡因处理会抑制SB转座。在用转座子(250ng的 pT2B-Puro)和转座酶(25ng的pCMV-SB100x)或D3转座酶(25ng的非催化活性的pCMV-SB100x)质粒转染时，HeLa细胞暴露于ATR信号传导抑制剂咖啡因(4mM)处理。处理后24小时收获细胞，并进行集落形成试验，细胞周期分析和免疫印迹。(i)柱状图显示集落形成试验的结果。 (ii)免疫印迹显示未处理的和咖啡因处理的细胞中SB转座酶的表达水平。微管蛋白的表达水平显示为加载对照。*P>0.05(认为不显著)；*** P<0.001(单向ANOVA，Tukey-Kramer多重比较后测试)。

B.ATR受损的细胞在SB转座中是有缺陷的。SB转座在以可诱导方式表达ATR或ATRkd(ATR的显性阴性激酶失活等位基因)的稳定细胞系中监测。条形图显示来自ATR野生型和ATRkd细胞的集落形成试验的结果。转座在ATR失能细胞中受到严重影响。

具体实施方式

实施例

实施例1

结果

SB转座酶的PAI亚结构域介导初级底物接触

IR/DR的DR具有复合结构，由复合DNA-结合结构域识别。SB转座酶的DNA-结合结构域由两个螺旋-转角-螺旋(HTH)基序构成，称为PAI 和RED，基于其与配对(PAIRED)结构域的相似性，存在于转录因子的 PAX家族中(Izsvak Z,et al.,2002J Biol Chem,277:34581-8.；Czerny T,et al., 1993.Genes Dev.,7:2048-61.)。两个亚结构域都参与序列特异性DNA-结合：PAI结合由DR代表的二分转座酶结合位点的3'-部分而RED与其5' 部分相互作用(Izsvak Z,et al.,2002.J Biol Chem,277:34581-8)。除了DNA 结合之外，PAI先前已经显示具有蛋白-蛋白相互作用界面(Izsvak Z,et al., 2002.J Biol Chem,277:34581-8.)。值得注意的是，SB的四个DR不是一性的，因为转座子末端的DR(外部DR)长2bp(图1A，14DR相比于 12DR)。

尽管确定了由SB的配对(PAIRED)结构域占据的结合位点(Ivics Z, et al.,1997.Cell,91:501-10)，但足迹法实验并未提供关于底物识别的动力学的信息。PAI和RED的结合基序是否同时被识别？为了回答，本发明人使用了最初开发的CASTing方法而识别DNA-结合蛋白的最佳结合位点 (Wright et al.,1991.Mol Cell Biol.11:4104-10)(图2A)。基于通过亲和纯化和PCR扩增的DNA序列的顺序富集，CSTing从复合物库中选择出优先结合的序列。CASTing方法用于(i)识别高亲和性的结合位点，和(ii) 绘制优先参与通过复合DNA-结合结构域的初级底物识别的序列基序。基于SB转座酶结合的足迹法数据(IvicsZ,et al.,1997.Cell,91:501-10)，在结合条件下将35-bp的随机寡核苷酸库暴露于全长转座酶。对在六个 CASTing循环后选择的寡核苷酸测序，并使用转座酶的全部(配对(PAIRED))DNA-结合结构域在电泳迁移率试验(EMSA)中测试。与野生型14DR序列相比，CASTing方法选择的序列结合强至多八倍(图2B 和2C)。令人好奇地，CASTing选择的高亲和性结合位点与野生型DR仅具有有限的相似性，并且同一性主要集中于PAI识别基序(图2D)。因此，尽管PAI亚结构域似乎指定了初级底物识别(Izsvak Z,et al.,2002.J Biol Chem,277:34581-8；Carpentier CE,et al.,2014.Prot Sci.23:23-33)，RED在这个过程中也略有参与。通过CASTing策略捕获的序列表明，PAI和RED DNA-相互作用具有不同的功能，并且通过RED的蛋白-DNA相互作用或许在反应的后续步骤中发生。此外，CASTing选择的DR既不是12DR，也不是14DR类型，表明在转座子和转座酶之间的“第一次接触”期间，内部12DR和外部14DR之间(图2D)没有显著区别。

SB转座酶的RED亚结构域介导了12DR和14DR之间的区分

由RED或PAI识别的是序列在12DR和14DR之间是不同的(图3A)。值得注意的是，RED结合与12DR和14DR的长度中的两个碱基对的差异重叠(Izsvak Z,et al.,2002.Chem,277:34581-8)(图3A)，表明RED可能参与位于转座子末端的远侧(12DR)或近侧(14DR)的DR之间的区分。为了测试这个假设，使用SB转座酶的PAI(1-57aa)或RED(58-123aa) 亚结构域对代表12-和14DR的双链寡核苷酸进行EMSA。如图3B(泳道 3，5和6)所示，PAI同等地结合于两个DR(图3B，泳道2，7，8和13)。相反，RED明显偏向于12DR(图3B，泳道3，5和6)，并且使用14DR底物未检测到显著的结合(图3B，泳道12)。因此，RED可以通过序列差异或长度的不同的识别而在可能出现的12DR和14DR之间清晰区分。为了区分这些可能性，用填充有2个具有与14DR的相同长度的核苷酸的 12DR-样寡核苷酸重复EMSA。在12DR中引入两个核苷酸消除了通过 RED的特异性DNA结合(图3B，底部，泳道6和7)，但通过PAI的结合未受影响(图3B，底部，泳道8)。这些结果清楚地表明，RED通过长度而不是序列区分内部和外部DR。以上数据支持了内部(12DR)相对外部(14DR)转座酶结合位点的选择性识别由12-和14DR之间的长度差异引导，由SB转座酶的RED亚结构域识别的假设。令人好奇地，RED确实识别出位于该实验设置中的反向重复序列的末端的14DR。

除了12/14DR区分外，RED还参与蛋白-蛋白相互作用

尽管PAI和RED亚结构域具有相似的尺寸(分别为57和66个氨基酸)，但它们的核蛋白复合物在EMSA中的迁移是不同的(图3B)。基于迁移率，PAI似乎作为单体结合12-和14DR两者。相反，使用相似的浓度， RED和12DR之间形成的显性核蛋白复合物迁移较慢，与含有两个RED 分子的复合物一致(图3B，泳道3，5和6)。值得注意的是，由RED单体形成的复合物可以在结合反应中以降低的蛋白浓度(低20倍)检测到 (图3B，泳道3)。这个观察表明RED在与12DR结合时容易形成二聚体，表明与PAI类似，RED可能参与蛋白-DNA和蛋白-蛋白相互作用两者。为了测试RED是否具有蛋白-蛋白相互作用表面，对RED肽进行化学交联，然后进行免疫印迹。在存在(图3C)或不存在DNA底物(未显示) 的两种情况下识别对应于RED的二聚体，四聚体和甚至更高级的多聚体结构的条带。这些结果表明，与PAI类似((Izsvak Z,etal.,2002.J Biol Chem, 277:34581-8.)，RED亚结构域能够同源二聚化。总之，尽管PAI(Izsvak Z, et al.,2002.J Biol Chem,277:34581-8)和RED亚结构域都具有蛋白-蛋白相互作用表面，但只有RED而不是PAI在结合单个DNA底物时会形成二聚体。

IR/DR掌控“有序组装”过程

改变结合位点的亲和力可能会挑战SB转座子转座期间发生的有序组装过程。因此，构建了一系列转座子形式，其中12DR和/或14DR基序被 CASTing选择的高亲和性结合位点代替(图4A)，并且各种构建体都经受转座试验。出乎意料地，用高亲和性CAST-5序列代替野生型基序并未改进转座频率。相反，将12DR或14DR替换为CAST-5基序分别导致了65％和3％的野生型活性(图4A)。类似地，将所有四个DR改变为CAST-5 会负面影响转座(2.2％)，表明在任一DR位置的增强DNA-结合亲和性可能会损害SB转座。可替换地，CAST-5对转座的负面影响可能至少部分地归因于其对PAI结合的优先选择，而同时损害其RED功能。实际上，预测CAST序列对于RED相互作用是次优的，包括区分内部和外部位置的能力(图2)。为了区分这两种情况，我们生成了CAST-5/wt杂合体，其中CAST-5仅替代PAI，否则保持DR为野生型(wt)。而且，我们测试了杂合基序在各种组合中对转座的影响。高亲和性的CAST-5/wt杂合基序仍然在外部和组合的内部/外部位置负面地影响转座(图4B)。然而，当在内部位置替换12DR时，CAST-5/wt基序明显改改善转座(130％)(图4B)。

“高亲和性”实验揭示了SB转座的以下特征。首先，虽然通过EMSA 无法检测到RED-14DR相互作用，但假设在转座反应的后期阶段对于转座是必不可少的。其次，增强在外部DR或所有四种DR处的结合活性会对转座产生负面影响，表明DR在内部和外部位置的DNA-结合亲和性不能自由改变。底物识别似乎在反应的不同阶段以明确的步骤发生，由IR/DR 结构引导。在此过程中，PAI和RED子域预期将执行涉及DNA-蛋白和蛋白-蛋白相互作用的多个任务。

最后，通过增强PAI在内部位置(12DR)的结合亲和性可以改进转座。值得注意的是，增强不与优化的结合亲和力直接成正比，表明IR/DR 结构掌控着不能容忍剧烈变化的精细调节过程。然而，破译IR/DR结构在分子进化方法的组合中的作用的尝试可以被解释为显著改进睡美人转座子的转座反应。

FACT复合物的组分的消除会增加转座效率

在通过RNA干扰产生的稳定敲减HEK293T细胞中敲减SPT16后，观察到了转座(涉及SB10)的显著富集。(参见图5，左栏)。类似地，采用SB100X观察到约50％的富集(图5，右栏。SUPT16H的敲减也导致了转座增加，而相应的乱序RNAi却未导致对转座的任何显著影响。SUPT16H的消除会导致最强的影响。

在用可商购的siRNA瞬时转染的HEK293T细胞中对于SPT16或 SUPT16H消除的转座试验证实了使用稳定敲减细胞系获得的结果(图6)。

材料和方法

质粒构建体

先前已经描述了分别表达SB DNA-结合结构域、PAI、RED和N123 的六组氨酸标记的亚结构域的原核载体pET-21a/N57，pET-21a/58-123和 pET-21a/N123(Izsvak Z,etal.,2002.J Biol Chem,277:34581-8)。为了在 HeLa细胞中表达SB转座酶，使用了pCMV-SB10(Ivics et al.,1997,Cell 91:501-510)，以及pCMV-SBD3(D3)，SB的催化突变体(E278D)。作为体内试验中的供体质粒，使用了以下构建体：先前描述的pT/neo(Ivics etal.,1997,Cell 91:501-510)。

蛋白表达和纯化

His标记的PAI和RED亚结构域的表达和纯化如(Izsvak Z,et al.,2002. J BiolChem,277:34581-8)中描述的进行。

电泳迁移率试验(EMSA)

使用[α-³²P]dCTP和Klenow片段对对应于12或14DR的双链寡核苷酸末端标记。含有左IR的DNA探针是pT/neo的EcoRI片段，用[α-³²P]dATP 末端标记。在Klenow反应后，如制造商描述的，在MicroSpin G-25柱上纯化标记的DNA。结合反应在总体积为10μl的20mM HEPES(pH 7.5)， 0.1mM EDTA，1mM DTT中进行，加入20,000-50,000cpm标记的DNA 探针和各种浓度的蛋白(如图中所示)，并在冰上温育10分钟。加入3μl 加载染料(含有50％甘油和溴酚蓝)后，将样品加载到4％或6％聚丙烯酰胺凝胶上。在Tris-甘氨酸缓冲液pH 8.3中以25mA进行电泳2-3小时。使用来自BIO-RAD的凝胶干燥器将凝胶干燥45分钟。在过夜暴露后，用Fujifilm FLA-3000扫描凝胶并用AIDA程序分析。

实验中使用的探针的序列：

14DR：

S 5'-ACATACACTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTTGG-3' (SEQ ID NO:79)

AS

5'-GACTCCAAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTGTATG T-3'(SEQ ID NO:80)

12DR：

S 5'-ACATACATTAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGTTGG-3' (SEQ ID NO:81)

AS

5'-GACTCCAACAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAATGTATGT-3' (SEQ ID NO:82)

CAST-2 S 5'-acatacaccctggtgtatgtaaagatcggacggccggttgg-3'(SEQ ID NO:34)

AS 5'-gactccaaccggccgtccgatctttacatacaccagggtgtatgt-3'(SEQ ID NO:35)

CAST-5 S 5'-acatacaggcgcgtgtatgtacacttggggtcgtcacttgg-3'(SEQ ID NO:36)

AS 5'-gactccaagtgacgaccccaagtgtacatacacgcgcctgtatgt-3'(SEQ ID NO:37)

CAST-9 S 5'-acatacagcaccatgtacttaaatctctgacctgggcttgg-3'(SEQ ID NO:38)

AS 5'-gactccaagcccaggtcagagatttaagtacatggtgctgtatgt-3'(SEQ ID NO:39)

CAST-20 S 5'-acatacacgtaagtgtacatactgtgtacacaaagacttgg-3'(SEQ ID NO:40)

AS 5'-gactccaagtctttgtgtacacagtatgtacacttacgtgtatgt-3'(SEQ ID NO:41)

化学交联

根据制造商的推荐，使用双(磺基琥珀酰亚胺基)底物(BS³，PierceBiotechnology，USA)进行反应。将蛋白(3μM)在终体积为15μl的20mM HEPES(pH 7.5)，5mMMgCl₂，100mM NaCl和2.5mM BS³中在冰上温育 2小时。通过加入pH 7.5的Tris-HCl至终浓度50mM并在室温下温育10min 而终止反应。然后加入Laemli缓冲液(125mM Tris-HCl pH6.8，5％SDS， 10％β-巯基乙醇，25％甘油和溴酚蓝)并将样品加载到15％SDS-PAGE上并使用多克隆抗-SB抗体(R&D Systems，USA)和抗山羊IgG(Pierce Biotechnology，USA)通过免疫印迹法分析。

CASTing实验

CASTing基于文献Wright,Binder et al.(1991)中描述的方法进行。合成具有随机的35bp长的核心SB-DOL的寡核苷酸：5'-GCG GGA TCC ACT CCA GGC CGG ATG CT(N)₃₅CACCAG GGT GTA AGG CGG ATC CCG C-3'(SEQ ID NO:42)并用与侧接核心的序列互补的引物在PCR反应中使其双链化。在2μg寡核苷酸与0.15μg的纯化His-标记SB转座酶(SBF1-6H) 的1小时温育期间形成的核蛋白复合物(Izsvak Z,et al.,2002.J Biol Chem, 277:34581-8)使用Ni-NTA树脂(QIAGEN)回收。通过大量洗涤步骤富集结合的寡核苷酸。通过引物A，5'-GCG GGA TCC GCC TTA CAC CCT GGT G-3'(SEQ ID NO:43)和B，5'-GCG GGA TCC ACTCCAGGC CGG ATG CT-3'(SEQ ID NO:44)提取和扩增选择的寡核苷酸，并进行额外轮次的CASTing循环而增加方法的特异性。对第6轮获得的寡核苷酸测序并在结合和转座试验中测试。

细胞培养物

HeLa细胞生长于补充有10％小牛血清金(Fecal Calf Serum Gold) (FCS Gold)(PAA，Germany)和1％抗真菌抗生素(Invitrogen，Germany) 的DMEM(GIBCO BRL，Germany)中。在转染前一天，将细胞接种到六孔板上。使用jetPEI RGD转染试剂(PolyplusTransfection，France)，用Qiagen纯化的DNA(Qiaprep spin miniprep试剂盒，Qiagen)转染这些细胞。转染后两天收获细胞用于剪切试验和/或在10cm孔板上铺板而使用 1mg/mlG418(Biochrom，Germany)筛选。筛择3周后，按照文献Ivics et al.,Cell 1997中描述的对群落染色和计数。

睡美人转座子切除试验

为了确定从质粒到基因组的睡眠美转座子转座期间的切除效率，我们克隆了称为pCMV(CAT)-GFP/T2neo的基于睡美人转座子的报告子。详细地，首先将由CMV启动子控制的GFP的开放阅读框克隆到pcDNA3.1载体中。然后，将含有选择基因neo(由SV40启动子驱动)的睡美人转座子克隆到GFP ORF中的“TA”位点。

为了评价睡美人转座子的内部序列对剪切效率的影响，分别从原始剪切报告子中剪切977-bp和1654-bp的序列(含有部分SV40-neo)，以克隆两个具有较短内部序列的替代剪切报告子(分别为1260bp和583bp)。

使用Qiagen质粒midi试剂盒纯化三个转座子构建体。根据制造商说明书使用jetPEI(Polyplus转染，用于哺乳动物细胞)，将纯化的质粒DNA 用转座酶表达质粒pCMV(CAT)SB100X转染到HeLa细胞中(Mátés L, et al.Molecular evolution of a novelhyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transferin vertebrates.Nat Genet.2009 Jun；41(6):753-61)。三天后，通过FACS估计GFP阳性细胞的数量。

克隆

通过PCR介导的诱变产生突变的SB转座子末端。引物序列和克隆策略总结于表1中。

表4

FACT复合物的组分的消除提高了转座效率

使用表5中描述的靶微-RNA产生miRNA构建体。为了建立稳定的敲减细胞系，采用所述微-RNA构建体转导Hek293T细胞。

将基于微RNA(miRNA)的载体用于ssrp1和supt16H的稳定敲减细胞系，其包含组分

MPSV-LTR-内含子-截短hNGFR-WPRE-miRNA-LTR

骨髓增生性肉瘤病毒(Myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV)；小鼠的长末端重复序列(LTR)；截短人神经生长因子受体(NGFR)；土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(wPRE)；具有靶(ssrp1或supt16H) 有义和反义序列的小鼠miR155的核心序列。

通过用抗-NGFR抗体染色细胞而监测微RNA的表达。为了用微RNA 富集细胞群，将这些细胞FACS分选和培养。为了分析敲减效率，将富集的细胞群进行RNA分离，然后cDNA合成。靶基因的表达水平通过qPCR 用基因特异性引物(如表6中所列)监测。

获取预先设计的市售合成siRNA(siGENOME，SMARTpool)(来自 Dharmacon，GEhealthcare)。使用jetPEITM转染体系将靶向supt16H基因 (目录号M-009517-00-0005)或ssrp1(目录号M-011783-01-0005)的siRNA 转染到Hek293T中。作为阴性对照，使用靶向萤火虫荧光素酶基因(目录号D-001206-14-05)的siRNA。24小时后，用各自的质粒转染这些细胞用于转座。转染后两天；将转染的细胞胰蛋白酶化，计数并进行嘌呤霉素筛选。筛选一周后，将集落用10％甲醛P在BS中固定15min，用亚甲蓝在 PBS中染色30min，用去离子水充分洗涤，空气干燥并拍照。

如先前发表的进行转座试验(Ivics Z,et al.,1997.Cell,91:501-10)，结果显示于图5和6中。

表5.用于敲减的miRNA序列

表6:引物

实施例2

先前已经证明，DNA-PKcs和ATM活性两者是有效的SB转座所必需的(Izsvák etal.,2004,Mol Cell 13(2):279-90)。与DNA-PKc和ATM类似， ATR也属于磷脂酰肌醇3激酶样激酶(PIKK)家族，参与检查点信号传导和修复。ATR特异性地在复制期间被DNA损伤激活(Lupardus et al., 2002,Genes Dev 16(18):2327-32)。咖啡因是ATM，ATR和mTOR(也是PIKK成员)的抑制剂，但不是DNA-PKC的抑制剂(Sarkaria et al.,1999, Cancer Res.59(17):4375-82)。本发明人在咖啡因处理(4mM)下使用标准转座试验检测了SB转座。

相对于对照物，咖啡因处理后转座频率降低了约50％(图7A)。为了解释ATR信号传导是否特别需要有效的SB转座，使用了其中ATR功能可以被调控的稳定的TET诱导细胞系。在以可诱导方式表达ATR(野生型)或ATRkd(ATR的显性失活激酶-非活性等位基因)的稳定细胞系中监测SB转座(Cliby et al.,1998,EMBO J.17(1):159-69)。ATRkd(催化死亡形式的ATR)的表达具有使ATR失去活性的显性失活效应(Cliby et al., 1998)。在ATR失能的细胞中，ATR无法启动解决复制阻滞的信号级联。诱导ATR和ATRkd，并使这两种细胞系经受基因组转座试验。结果表明在ATR失能的细胞中转座降低～75％，表明ATR对于SB转座是必需的(图 7B)。此外，尽管在ATRkd诱导的细胞中复制叉积累停滞，但并未观察到转座的诱导，表明可能需要完整ATR信号传导以触发转座。

Claims

1.一种多核苷酸或其互补多核苷酸，包含含有由左和右反向重复序列/同向重复序列(IR/DR)侧接的货物核酸的转座子，其中

(i)所述转座子能够由睡美人转座酶蛋白调动；

(ii)左IR/DR包含外部左DR基序和内部左DR基序，其中所述外部左DR基序包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列，并且所述内部左DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；和

(iii)右IR/DR包含外部右DR基序和内部右DR基序，其中所述外部右DR基序包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列的反向互补序列，并且所述内部右DR基序包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向互补序列。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述外部左DR基序包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列和/或所述外部右DR基序包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的反向互补序列。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述内部左DR基序包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列和/或所述内部右DR基序包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列的反向互补序列。

4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，左IR/DR包含能够作用为增强子的在外部DR和内部DR之间包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的HDR区，其中，可选地，右IR/DR还包括所述HDR区的反向互补序列。

5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，左IR/DR包含选自由SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9组成的组的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，右IR/DR包含选自由SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13组成的组的反向互补核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述货物核酸包含可操作地连接至启动子的开放阅读框。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中，所述开放阅读框编码T-细胞受体构建体或其片段。

9.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是选自由以下组成的组的载体

(i)选自包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、杆状病毒、埃巴病毒和痘病毒载体的组的病毒载体；或

(ii)选自包括质粒、微环、pFAR载体或病毒体的组的非病毒载体。

10.一种用于转座核酸的试剂盒，其中，所述试剂盒包含

(i)前述权利要求中任一项所述的多核苷酸；

(ii)(a)睡美人转座酶蛋白或(b)编码睡美人转座酶蛋白的核酸；和

(iii)可选地，至少一种选自包括以下的组的辅因子

(A)能够消除选自由SSRP1和SUPT16H/SPT16组成的组的FACT复合物的组分的辅因子；

(B)选自包括H、S、V和L的组的组织蛋白酶的抑制剂；

(C)能够消除或抑制HSP90的辅因子；

(D)在细胞周期阶段G0/G1、G1/S或G2/M中暂时阻滞细胞的细胞周期的因子；和

(E)抑制PCNA的泛素化的因子；

(F)能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂，

其中所述辅因子选自包括小分子、siRNA和miRNA的组，

或以下的细胞，其中

(AA)所述FACT复合物的组分；和/或

(BB)所述组织蛋白酶；和/或

(CC)所述HSP90被敲减；和/或

(DD)所述细胞周期在细胞周期阶段G0/G1、G1/S或G2/M暂时被阻滞；和/或

(EE)PCNA的泛素化被抑制；和/或

(FF)ATR的浓度和/或信号传导增加。

11.一种产生重组核酸的方法，包括使包含睡美人转座酶的识别序列的靶核酸与权利要求10所述的试剂盒的组分接触。

12.一种产生转染的细胞的方法，其中，所述方法包括将权利要求10所述的试剂盒的组分引入所述细胞中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述方法包括对所述细胞电穿孔。

14.根据权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸，根据权利要求10所述的试剂盒或根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述睡美人转座酶是高度活性的转座酶SB100X。

15.一种包含权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸的宿主细胞。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是适合过继性T细胞转移的包含权利要求7-8中任一项所述的多核苷酸的T-细胞。

17.一种包含权利要求15-16中任一项所述的宿主细胞的药物组合物。

18.至少一种选自由以下组成的组的辅因子或试剂

(B)选自包括F、H、L、S和V的组的组织蛋白酶的抑制剂；

(C)能够消除或抑制HSP90的辅因子；

(E)抑制PCNA的泛素化的因子；以及

(F)能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂；

其中所述辅因子选自包括小分子、抗体、siRNA和miRNA的组，或者

以下的细胞，其中

(AA)所述FACT复合物的组分；

(BB)所述组织蛋白酶；和/或

(CC)所述HSP90被敲减；和/或

(DD)所述细胞周期在细胞周期阶段G0/G1、G1/S或G2/M被暂时阻滞，和/或

(EE)PCNA的泛素化被抑制；和/或

(FF)ATR的浓度和/或信号传导增加；

用于通过转座子的转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的用途，其中所述转座子是权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸。

19.一种用于通过转座子的转座而制备重组多核苷酸或包含重组多核苷酸的重组细胞的方法，其中所述转座子是权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸，包括将选自由以下组成的组的辅因子引入细胞并在所述细胞中诱导转座：

(B)选自包括H、S、V和L的组的组织蛋白酶的抑制剂；

(C)能够消除或抑制HSP90的辅因子；

(E)抑制PCNA的泛素化的因子；以及

(F)能够增加ATR的浓度和/或信号传导的试剂；

其中所述辅因子选自包括小分子、抗体、siRNA和miRNA的组，

或包括在细胞或者其中

(AA)所述FACT复合物的组分；和/或

(BB)所述组织蛋白酶；和/或

(CC)所述HSP90被敲减；和/或

(DD)所述细胞周期在细胞周期阶段G0/G1、G1/S或G2/M中被暂时阻滞；和/或

(EE)PCNA的泛素化被抑制；和/或

(FF)ATR的浓度和/或信号传导增加

的细胞中诱导转座。