ES2884205T3 - Transposones Bella Durmiente mejorados, kits y procedimientos de transposición - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido o el polinucleótido complementario de este que comprende un transposón que comprende un ácido nucleico de carga flanqueado por una repetición invertida/repetición directa (IR/DR) a la izquierda y a la derecha, en el que (i) el transposón puede ser movilizado por una proteína transposasa Bella Durmiente; (ii) la IR/DR a la izquierda comprende un motivo de DR a la izquierda externa y un motivo de DR a la izquierda interna, en el que el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y el motivo de DR a la izquierda interna comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; y (iii) la IR/DR a la derecha comprende un motivo de DR a la derecha externa y un motivo de DR a la derecha interna, en el que el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y el motivo de DR a la derecha interna comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Transposones Bella Durmiente mejorados, kits y procedimientos de transposición

[0001] La presente invención se refiere a transposones mejorados de tipo Bella Durmiente y procedimientos de transposición. En particular, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende un ácido nucleico de carga flanqueado por una repetición invertida/repetición directa (IR/DR) a la izquierda y a la derecha, en el que las IR/DR, que tienen secuencias específicas, son reconocidas por una proteína transposasa Bella Durmiente y el polinucleótido es capaz de integrarse en el ADN de una célula. La invención también se refiere a un kit para transponer un ácido nucleico que comprende dicho polinucleótido, así como a componentes adicionales tales como cofactores de transposición definidos capaces de agotar un componente del complejo FACT (facilitador de la transcripción de cromatina), a saber, SSRP1 y/o SUPT16H/SPT16, o un inhibidor de catepsina seleccionado del grupo que comprende H, S, V y L; o un cofactor capaz de agotar o inhibir HSP90; o células en el que dicho componente del complejo FACT se agota; y/o dicha HSP90 se inactiva o dicha catepsina se inhibe. De manera alternativa o adicional, el kit puede comprender como un cofactor de transposición un agente capaz de aumentar la concentración y/o la señalización de ATR o una célula en el que la concentración y/o la señalización de ATR aumentan. La invención proporciona además procedimientos que utilizan dicho polinucleótido con transposón, así como células hospedadoras y composiciones farmacéuticas. También se refiere al uso de dichos cofactores de transposición o células específicas para mejorar las eficiencias de transposición, por ejemplo, para preparar células o ácidos nucleicos modificados genéticamente.

[0002] La recombinación de ADN implica inherentemente la rotura y unión de sitios de ADN distantes. Los mecanismos de recombinación mejor estudiados en eucariotas incluyen la recombinación V(D)J (un procedimiento similar a la transposición que genera el repertorio de inmunoglobulina del sistema inmunitario adaptativo en vertebrados) y la transposición de los elementos transponibles Mariner y Bella Durmiente. Estas reacciones de recombinación requieren dos componentes funcionales principales: una proteína recombinasa y sitios específicos de ADN en los que la recombinasa se une y ejecuta la recombinación. Un dominio catalítico altamente conservado, que contiene una firma de DDE (D = ácido aspártico, E = ácido glutámico), comúnmente caracteriza a muchas recombinasas. Esta superfamilia de DDE está extendida desde procariotas hasta humanos, incluidos los elementos IS bacterianos, la familia Tcl/Mariner de transposones de ADN, la integrasa del virus de inmunodeficiencia humana o la recombinasa RAG1 de la recombinación V(D)J. Nuestra comprensión de los mecanismos transposicionales en eucariotas mejora gradualmente debido al creciente número de estructuras cristalinas resueltas de varias recombinasas. Sin embargo, a pesar de las reacciones químicas compartidas realizadas por el dominio catalítico, hay diferencias importantes en la forma en que los diferentes elementos procesan la reacción. Mientras que todas las recombinasas DDE inician la reacción de recombinación con una muesca monocatenaria al final del transposón (Mizuuchi K, y col., 1992. J Biol Chem., 267: 21273-6; Hickman AB, y col., 2014. (Cell, 158: 353-67.), el procesamiento de la segunda cadena puede variar. La escisión de la segunda cadena a menudo se logra a través de un intermedio de horquilla, pero no en los elementos Mariner y Bella Durmiente (Dawson A y Finnegan DJ, 2003. Mol Cell. 11: 225­ 35; Izsvak Z, y col., 2004. Mol Cell, 13: 279-90.), donde la escisión de la cadena doble es el resultado de dos reacciones de hidrólisis secuenciales por la recombinasa (Richardson JM, y col., 2006. Embo J., 25: 1324-34; Richardson JM, y col., 2009. (Cell, 138: 1096-108.).

[0003] Los miembros de la superfamilia Tcl/Mariner, incluido el transposón Bella Durmiente (SB), son elementos eucariotas estudiados intensamente. SB se convirtió en una herramienta genética indispensable para manipular los genomas de los vertebrados. Tanto las transposiciones tipo Mariner como las tipo SB son sensibles al tamaño del transposón y los elementos grandes se transponen con frecuencias más bajas en comparación con el tipo salvaje. A pesar de estas similitudes, la transposición tipo Mariner y tipo SB parece tener diferencias significativas. La regulación, incluida la estrategia para hacer cumplir una sinapsis de los extremos del transposón, así como el requisito de dicha sinapsis, también varía entre las recombinasas. Mientras que los Mariners tienen TIR cortas con un sitio de unión al transposón en cada extremo del transposón (Rosenzweig B, y col., 1983. Nucleic Acids Res, 11: 4201-9; Tosi LR y Beverley SM, 2000. Nucleic Acids Res., 28: 784-90.), Bella Durmiente (SB) pertenece a la subfamilia de transposones de repetición indirecta/repetición directa (IR/DR), que posee dos sitios de unión a transposasa (representados por repeticiones directas) en cada extremo de transposón (Franz G y Savakis C, 1991. Nucleic Acids Res, 19: 6646; Izsvak Z, y col., 1995. Mol Gen Genet. 247: 312-22; Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10; Miskey C, y col., 2003. Nucleic Acids Res, 31: 6873-81; Plasterk RH, y col., 1999. Trends Genet, 15: 326-32) (Fig. 1A). La iR a la izquierda contiene un motivo adicional (HDR) que actúa como un potenciador en la transposición de SB (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.) A pesar de la observación de que la IR/DR es un requisito absoluto de la transposición de SB (Izsvak Z, y col., 2000. J Mol Biol, 302: 93-102.), nuestra comprensión de su papel en el proceso de transposición es enigmática.

[0004] En la técnica se conocen diferentes variantes de transposones SB (documentos WO 98/40510, US 8.227.432, Cui y col., 2002. Structure-function analysis of the inverted terminal repeats of the Sleeping Beauty transposon". J. Mol. Biol. 318 (5): 1221-1235; Izsvak y col. 2000. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J. Mol. Biol. 302 (1): 93-102). Se designan los plásmidos disponibles comercialmente que contienen transposones Bella Durmiente

pT (https://www.addgene.Org/26555/sequences/#depositor-partial),

pT2 (https://www.addgene.org/26557/sequences/#depositor-full) o

pT3 (Yant SR, y col. Mutational analysis of the N-terminal DNA-binding domain of sleeping beauty transposase: critical residues for DNA binding and hyperactivity in mammalian cells. Mol Cell Biol. octubre de 2004;24(20):9239-47.)

[0005] Aun así, existe la necesidad en la materia de que los transposones tengan una eficiencia mejorada y sistemas, kits y procedimientos de transposones mejorados. Este problema fue abordado por los presentes inventores. La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas y en la descripción.

[0006] En particular, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un transposón que comprende un ácido nucleico de carga flanqueado por una repetición invertida/repetición directa (IR/DR) a la izquierda y a la derecha, en el que

(i) el transposón puede ser movilizado por una proteína transposasa Bella Durmiente;

(ii) la IR/DR a la izquierda comprende un motivo de DR a la izquierda externa y un motivo de DR a la izquierda interna, en el que el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 y el motivo de DR a la izquierda interna comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; y

(iii) la IR/DR a la derecha comprende un motivo de DR a la derecha externa y un motivo de DR a la derecha interna, en el que el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 y el motivo de DR a la derecha interna comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

[0007] La invención también proporciona el polinucleótido complementario, en particular, si el polinucleótido es monocatenario.

[0008] Con el objetivo de descifrar el papel de la estructura de IR/DR de los transposones SB, los inventores han combinado estrategias in vivo, in vitro e in silico. Han encontrado una interrelación orquestada entre la estructura de IR/DR del transposón y las superficies de interacción ADN-proteína así como proteína-proteína de la transposasa que contribuyen a un conjunto estrictamente regulado y ordenado de complejos ADN-proteína en los extremos del transposón. Han demostrado que, en comparación con un transposón Mariner (Hsmarl), SB produce una frecuencia significativamente menor de eventos de transposición aberrantes de un solo extremo. Por lo tanto, la estructura compleja de IR/DR podría haber evolucionado para proteger tanto los elementos transponibles como los genomas de la célula hospedadora de reordenamientos al suprimir eventos de transposición aberrantes.

[0009] Los inventores diseccionaron tanto el transposón como la transposasa en dominios funcionales pequeños y abordaron su contribución al proceso de transposición de SB. Los experimentos respectivos se describen en la sección experimental a continuación. En el transcurso de estos experimentos, los inventores han desarrollado transposones que comprenden las nuevas secuencias de IR/DR mejoradas de la invención, en particular, nuevos motivos de DR, que conducen a mayores velocidades de transposición. En resumen, se identificaron secuencias que mejoran la unión al dominio PAI de la transposasa Bella Durmiente y se analizaron para determinar la eficiencia de transposición. Sorprendentemente, solo algunas de las secuencias que tienen una mayor afinidad de unión condujeron a un aumento en la eficiencia de transposición, en particular, las secuencias de los polinucleótidos de la invención descritos en esta invención.

[0010] Las DR externas (también designadas 14DR o 14DR externas) de la invención tienen una secuencia de SEQ ID NO: 1 (DR externa a la izquierda), o la secuencia invertida o complemento inverso de esta (DR externa a la derecha). Las dos posiciones variables en esta secuencia de consenso, en una realización preferida, difieren entre la DR externa a la izquierda y la DR externa a la derecha. Particularmente, en la DR externa a la izquierda, Y puede ser T y/o W puede ser A. Preferentemente, Y es T y W es A. Particularmente, en la DR externa a la derecha, Y puede ser C y/o W puede ser T. Preferentemente, Y es C y W es T. Por lo tanto, preferentemente, el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 y/o el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:4. Lo más preferentemente, el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 y el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:4.

Tabla 1: DR externas Las diferencias con la secuencia de US 8.227.432 SEQ ID NO: 3 o 4 se marcan en negrita, las posiciones novedosas se marcan en negrita y subrayan. Y = C/T; W = A/T

[0011] Las DR internas (también designadas 12DRs o 12DR internas) de la invención tienen una secuencia de SEQ ID NO: 2 (DR interna a la izquierda), o el complemento inverso de esta (DR interna a la derecha). Las tres posiciones variables en esta secuencia de consenso, en una realización preferida, difieren entre la DR interna a la izquierda y la DR interna a la derecha. Preferentemente, en la DR interna a la izquierda, Y es T y/o en la DR interna a la derecha, Y es C. Preferentemente, en la DR interna a la izquierda, Y es T y en la DR interna a la derecha, Y es C. V puede ser A, G o C, pero, preferentemente, V es C. K puede ser G o T, en el que, preferentemente, K es G. Por lo tanto, en una realización, en la DR interna a la izquierda, Y es T, V es C y K es G (SEQ ID NO: 5) y/o, en la DR interna a la derecha, Y es C, V es C y K es G (SEQ ID NO: 6). Más preferentemente, el motivo de DR a la izquierda interna comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5 y el motivo de DR a la derecha interna comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:6.

Tabla 2: DR internas Las diferencias con la secuencia de US 8.227.432 SEQ ID NO: 3 o 4 se marcan en negrita, las posiciones novedosas se marcan en negrita y subrayan. Y = C/T; M = A/C; R = A/G; V = A/G/C, en el que V preferentemente es C; K = G/T, en el que K preferentemente es G

[0012] Los inventores descubrieron además que la región de unión a PAI de las secuencias de DR de la invención también proporciona una región HDR mejorada. Por lo tanto, la invención también proporciona un polinucleótido que comprende un transposón de la invención, en el que la IR/DR a la izquierda comprende una región HDR capaz de funcionar como un potenciador que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:7 entre la DR externa y la DR interna. V puede ser A, G o C, en el que V preferentemente es C; y/o K puede ser G o T, en el que K preferentemente es G. Preferentemente, V es C y K es G. Opcionalmente, la ⁱR/DR a la derecha de dicho transposón comprende además un complemento inverso de dicha región HDR.

SEQ ID NO:7 HDR GTKTA CAKACASD

K=G/T,

S=C/G

D=A/T/G.

[0013] Esta HDR preferida corresponde a la región de unión a PAI de la DR interna.

[0014] En la técnica anterior se sabe que las secuencias que rodean las repeticiones directas también juegan un papel importante en la eficiencia de transposición de los transposones. Por ejemplo, el transposón se moviliza más eficientemente si la cantidad de nucleótidos entre la DR externa e interna es de aproximadamente 135-196, preferentemente, 155-176.

[0015] Las secuencias de región marco conservada adecuadas para la IR/DR de la invención pueden corresponder a las secuencias conocidas a partir de transposones pT, pT2 o pT3.

[0016] Los polinucleótidos de la invención, que comprenden todas las secuencias de SEQ ID NO: 1 y 2, como se describe en esta invención, comprenden preferentemente estas secuencias en el contexto de estas regiones marco conservadas conocidas, o regiones marco conservadas equivalentes.

[0017] Por lo tanto, la invención proporciona polinucleótidos, en los que la IR/DR a la izquierda comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en s Eq ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 o que tiene 90 % o más de identidad de secuencia con dicha secuencia, preferentemente, que tiene 95 % o más de identidad de secuencia con una de dichas secuencias o, lo más preferentemente, del grupo que comprende SEQ ID NO: 8 y 9.

[0018] La invención también proporciona polinucleótidos, en los que la IR/DR a la derecha comprende la secuencia de nucleótidos del complemento inverso que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, y secuencias que tienen 90 % o más de identidad de secuencia con una de dichas secuencias, preferentemente, que tienen 95 % o más de identidad de secuencia con dicha secuencia o, lo más preferentemente, del grupo que comprende SEQ ID NO: 10, 11, 12 y 13.

Lo más preferentemente, Y es T en las DR a la izquierda y C en las DR a la derecha; W es A en las DR a la izquierda y T en las DR a la derecha; V es C; S es C, D es G y K es G.

[0019] En una realización preferida del polinucleótido de la invención, la IR/DR a la izquierda comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 y la IR/DR a la derecha comprende la secuencia de nucleótidos del complemento inverso de la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12. En estos polinucleótidos, la región marco conservada corresponde a pT y el polinucleótido de la invención se denomina pT4.

[0020] En otra realización preferida, la IR/DR a la izquierda comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ

ID NO: 9 y la IR/DR a la derecha comprende la secuencia de nucleótidos del complemento inverso de la SEQ ID NO:

11 o la s Eq ID NO: 13. En estos polinucleótidos, la región marco conservada corresponde a pT2 y el polinucleótido de la invención se denomina pT5.

[0021] El transposón de la invención puede ser movilizado por una proteína transposasa Bella Durmiente. Por consiguiente, el transposón puede escindirse de un polipéptido donante, por ejemplo, un vector e integrarse en un sitio diana, por ejemplo, el ADN genómico o extracromosómico de una célula. Un polinucleótido de la invención puede ser ARN o ADN. Puede ser bicatenario o monocatenario, o una combinación de los mismos. Los polinucleótidos de la invención pueden ser monocatenarios, por ejemplo, si están integrados en un vector monocatenario, por ejemplo, vector retroviral. Típicamente, los polinucleótidos de la invención serán bicatenarios.

[0022] El polinucleótido de la presente invención puede ser lineal o circular. Preferentemente, es de forma circular. Se ha demostrado que las formas de plásmido superenrolladas tienen una eficiencia de transposición particularmente alta. En formas circulares, para una eficiencia óptima, el extremo 5' de la IR/DR a la izquierda está separado del extremo 3' de la IR/DR a la derecha por un espaciador, que puede comprender, por ejemplo, alrededor de 300 pb o más.

[0023] El polinucleótido puede ser un vector seleccionado del grupo que consiste en

(i) un vector viral seleccionado del grupo que consiste en un vector adenoviral, viral adenoasociado, lentiviral, retroviral, viral del herpes simple, baculovirus, viral de Epstein-Barr y poxvirus; o

(ii) un vector no viral que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un minicírculo, una construcción pFAR o un virosoma.

[0024] Los minicírculos son pequeños derivados de plásmidos circulares que se han liberado en gran medida o por completo de partes de vectores procariotas no esenciales. En particular, los minicírculos no contienen ADN que codifique genes bacterianos como la resistencia a los antibióticos o los ORI. El ADN en minicírculo de la invención se puede preparar según Kay y col., 2010, Nature Biotechnology 28, 1287-1289. Su estructura principal (es decir, sin carga) comprende preferentemente menos de 2 kb o menos de 1 kb, por ejemplo, alrededor de 540-580 pb, preferentemente, alrededor de 560 pb. El vector también puede ser un vector pFAR (plásmido libre de marcadores de resistencia a antibióticos), por ejemplo, según Marie y col, 2010, J Gen Med 12(4), 323-332).

[0025] Los vectores apropiados también se describen en Narayanavari y col., 2017, Crit Rev Biochem Mol Biol.

52(1): 18-44; Richter y col., 2016, Blood 128(18):2206-2217; Boehme, y col., 2016. Mol Ther Nucleic Acids 5, e337; o Yant y col., 2002, Nat Biotechnol 20, 999-1005.

[0026] El polinucleótido de la invención comprende un ácido nucleico de carga. Opcionalmente, el ácido nucleico de carga comprende un marco de lectura abierto unido operativamente a un promotor, en el que el marco de lectura abierto puede codificar, por ejemplo, una construcción de receptor de linfocitos T. De manera alternativa o adicional, el ácido nucleico de carga puede comprender secuencias que codifican al menos un miARN o ARNhc. El marco de lectura abierto puede codificar de manera alternativa o adicional un marcador, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos, una enzima o una proteína fluorescente. El transposón de la invención también puede ser adecuado para la mutagénesis por inserción.

[0027] La invención también proporciona un kit para la transposición de un ácido nucleico, en el que el kit comprende

(i) el polinucleótido de la invención;

(ii) (a) una proteína transposasa SB o (b) un ácido nucleico que codifica una proteína transposasa SB; y

(iii) opcionalmente, al menos un cofactor seleccionado del grupo que consiste en

(A) un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT que se selecciona del grupo que consiste en SSRP1 y SUPT16H/SPT16, en el que dicho cofactor se selecciona del grupo que consiste en ARNip, miARN

y un anticuerpo contra SSRP1 o SUPT16/H/SPT16;

(B) un inhibidor de catepsina que se selecciona del grupo que comprende F, H, L, S y V; en el que dicho inhibidor es E64D;

(C) un cofactor capaz de agotar o inhibir HSP90 (HSPAA1), donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en geldanamicina, radicicol o 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina;

(D) un agente capaz de aumentar la concentración y/o la señalización de ATR (ataxia telangiectasia y relacionada con Rad3) seleccionado del grupo que consiste en un polinucleótido que codifica ATR y una proteína ATR,

o una célula en la que

(AA) dicho componente del complejo FACT está agotado; y/o

(BB) dicha catepsina está inhibida; y/o

(CC) dicha HSP90 (HSPAA1) está inactivada; y/o

(DD) se aumenta la concentración y/o la señalización de ATR.

[0028] El polinucleótido que comprende el transposón y el ácido nucleico que codifica una proteína transposasa Sb puede estar ubicado en el mismo vector o en vectores diferentes, en particular, si el ácido nucleico que codifica la proteína transposasa SB es ADN. Si dicho ácido nucleico que codifica la proteína transposasa SB es ARN, el polinucleótido que comprende el transposón típicamente se encuentra en forma de ADN, preferentemente en una forma circular, lo más preferentemente superenrollada. A menudo, el polinucleótido que comprende el transposón estará en forma de ADN, preferentemente en forma circular, lo más preferentemente, superenrollada, y la transposasa SB estará en forma de proteína.

[0029] Opcionalmente, el kit comprende además tampones adecuados o medios de cultivo celular y/o instrucciones para transfectar células y/o producir ácidos nucleicos recombinantes. La transposición puede llevarse a cabo in vitro, por ejemplo, según el procedimiento enseñado por Goryshin y col., 1998, JBC 273, 7367-7374. Por lo general, sin embargo, la transposición ocurre en células, típicamente en cultivo celular o ex vivo. Es posible la microinyección de cigotos unicelulares seguida de la implantación en una hembra superovulada. Además, la transposición puede ocurrir in vivo junto con vectores virales SB híbridos (por ejemplo, SB-adeno híbrido como Zhang y col, 2013 PLoS One 8(10): e75344) o mediante electroporación o administración de nanopartículas.

[0030] En todas las realizaciones de la invención, la transposasa SB puede ser, por ejemplo, una transposasa Sb descrita en el documento US 8.227.432 B2 o SB10 (Ivics y col., 1997, Cell 91:501-510). Preferentemente, a lo largo de la invención, es la transposasa hiperactiva SB100X (Mates L1, y col. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. Junio de 2009;41(6):753-61).

[0031] Los inventores han descubierto además sorprendentemente que la eficiencia de la transposición aumenta significativamente si al menos un cofactor como se describe anteriormente está presente durante la transposición, en particular, (A) un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT como se define, o alternativamente, (B) un inhibidor de catepsina lisosomal seleccionado del grupo que comprende F, H, L, S y V que es E64D; (C) un cofactor capaz de agotar HSP90 como se define; o (D) un agente capaz de aumentar la concentración y/o la señalización de ATR como se define.

[0032] En las células de mamífero, SSRP1 y SUPT16H/SPT16 existen como un heterodímero y son componentes del complejo Facilitador de la transcripción de la cromatina (FACT). El complejo FACT está involucrado en varios procesos, como la replicación y reparación del ADN. El agotamiento del homólogo de FACT en Xenopus dio como resultado una replicación defectuosa (Orphanides y col., 1999, Nature 400:284-288) que indica un papel en la replicación. Además, también se ha demostrado que el complejo FACT puede interactuar con proteínas involucradas en procesos de reparación de daños en el ADN tales como PARP1 y RPA (Huang y col., 2006, Nucleic Acids Res.

34:2398-2407; VanDenmark y col., 2006, Mol Cell. 22:363-374; Solinger y col., 2002, Mol Cell. 10:1175-1188). Recientemente, se ha demostrado que el agotamiento de SSRP1 dio como resultado una actividad de recombinación homóloga mejorada y una mayor formación de focos H2AX y Rad51. Curiosamente, también se demostró que SSRP1 puede interactuar físicamente con Rad54 e inhibir funcionalmente la actividad de BM de HJ promovida por Rad54 in vitro (Kumari y col., 2009, J Cell Biochem. 108:508-518).

[0033] Por consiguiente, el al menos un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT es capaz de agotar SSRP1 y/o SUPT16H/SPT16. El agotamiento tiene la consecuencia de que el componente en cuestión, en particular, el componente del complejo FACT, ya no está disponible para la interacción con la transposasa y/o el transposón. Esto se puede lograr mediante la reducción de la concentración del componente agotado, por ejemplo, el componente del complejo FACT, por ejemplo, mediante reducción de expresión en una línea celular estable mediante interferencia por ARN, por ARNip o miARN, o mediante el secuestro del componente del complejo FACT, por ejemplo, con un anticuerpo adecuado contra SSRP1 o SUPT16H/SPT16.

[0034] El cofactor es un anticuerpo contra SSRP1 o SUPT16H/SPT16, ARNip y miARN. Por ejemplo, se puede usar el inhibidor de catepsina E64D. Se puede usar un inhibidor de HSP90, geldanamicina, radicicol o 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina de forma alternativa o adicional.

[0035] Los inventores podrían mostrar que el agotamiento de SUPT16H conduce al aumento más fuerte en la transposición y, por lo tanto, se prefiere.

[0036] Los cofactores capaces de agotar los componentes en cuestión, por ejemplo, SSRP1 y/o SUPT16H/SPT16 se pueden identificar, por ejemplo, mediante un ensayo de unión o un ensayo de transposición como se describe a continuación. El experto en la técnica puede preparar ARNip y miARN capaces de reducir la concentración de SSRP1 o SUPT16H/SPT16 y se encuentran disponibles comercialmente. Se obtuvieron ARNip (siGENOME, SMARTpool) prediseñados, comerciales, sintéticos (de Dharmacon, GE healthcare). Los ARNip que se dirigen a cualquiera de los genes suptl6H (cat. N.° M-009517-00-0005) y ssrpl (cat. N.° M-0l1783-01-0o05) se transfectaron en Hek293T utilizando el sistema de transfección jetPEITM. Se usó como ARNip de control negativo dirigido al gen de luciferasa de luciérnaga (cat. N.° D-001206-14-05). Para la reducción de expresión basada en miARN, los miARN dirigidos a los genes (Tabla 5) se sintetizaron (Eurofins) y finalmente se clonaron en el vector de miARN antes de la transfección.

[0037] Ambos componentes del complejo FACT pueden agotarse, pero los inventores podrían mostrar que el agotamiento de uno de los componentes ya es suficiente para aumentar la eficiencia de transposición significativamente, por ejemplo, por un factor de aproximadamente 50. Esto se aplica para la transposición utilizando, por ejemplo, SB 10 y SB100X no hiperactivos.

[0038] El agotamiento de al menos un componente del complejo FACT aumenta la eficiencia de transposición del transposón de la presente invención (por ejemplo, pT 4 o pT5) así como otros transposones, en particular transposones tipo Tcl/Mariner, por ejemplo, transposones Bella Durmiente tales como pT, pT2 o pT3.

[0039] Con el fin de supervisar los cambios transcripcionales activados por la transposasa, se realizó un estudio transcripcional de todo el genoma (HeLa, Affymetrix). El análisis del transcriptoma reveló que varios genes codificados por el huésped se regulan de manera diferente en presencia de la transposasa. La lista de proteínas reguladas por aumento incluye HSAP2 alias HSP70-2 y varios miembros de la familia de catepsinas (Fig. 6A). Si bien HSPA2, una variante de la proteína de choque térmico HSP70, es un miembro de la respuesta al estrés, las catepsinas son proteasas lisosomales y tienen un papel vital en el recambio celular de mamíferos. Los resultados preliminares sugieren que la modulación de la respuesta al estrés mediante la inhibición de HSP90 (HSP90AA1) o la inhibición de la actividad de catepsina (Fig. 6B) mejora la transposición de SB. Además, al mitigar la inducción de la respuesta al estrés celular de la señalización apoptótica se modera y se mejora la viabilidad celular.

[0040] Los inventores han demostrado además que la transposición a través de Bella Durmiente, por ejemplo, del transposón de la invención descrito en esta invención o transposones Bella Durmiente convencionales tales como pT2, requiere señalización de ATR (Ejemplo 2 y Fig. 7). Por consiguiente, un agente definido capaz de aumentar la concentración y/o la señalización, preferentemente, la concentración, de ATR puede, por lo tanto, comprenderse ventajosamente en un kit de la invención. Preferentemente, el agente aumenta la expresión de ATR. Dicho agente puede ser un polinucleótido que codifica ATR, por ejemplo, un ARNm. Un polinucleótido que codifica ATR también puede ser ADN, por ejemplo, en una forma adecuada para la integración en el genoma de una célula. Alternativamente, la ATR puede codificarse en el polinucleótido de la invención, preferentemente, fuera de la región flanqueada por la repetición invertida/repetición directa a la izquierda y a la derecha. El agente también puede ser ATR en forma de proteína. Una célula en el que se aumenta la concentración y/o la señalización de ATR comprende dicho agente. Preferentemente, se aumenta la expresión de ATR. Un aumento en este contexto se refiere a la comparación con una célula en el que la concentración o señalización de ATR no se ha visto influenciada por la adición de dicho agente.

[0041] Alternativamente, un agente capaz de disminuir la concentración y/o la señalización de ATR, preferentemente, la señalización, puede estar comprendido en un kit de la invención, si se desea la regulación de la actividad de Bella Durmiente, por ejemplo, como un control negativo en el que la actividad de Bella Durmiente está regulada negativamente. Un agente capaz de disminuir la concentración de ATR puede ser miARN. Un agente capaz de disminuir la señalización de ATR puede ser cafeína.

[0042] Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un polinucleótido recombinante o una célula recombinante que comprende un polinucleótido recombinante mediante la transposición de un transposón, preferentemente, un transposón Bella Durmiente, en el que al menos un cofactor o agente como se describió anteriormente, por ejemplo, un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT, está presente. El cofactor o agente se puede introducir en una célula, preferentemente, in vitro o ex vivo.

[0043] La invención también describe el uso de al menos un cofactor o agente como se describió anteriormente, por ejemplo, un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT, para preparar un polinucleótido recombinante o una célula recombinante que comprende un polinucleótido recombinante mediante la transposición de un transposón, preferentemente, un transposón Bella Durmiente, en el que la eficiencia de transposición aumenta significativamente en comparación con las mismas condiciones sin dicho cofactor o agente. Preferentemente, la transposición se incrementa por un factor de al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 30, al menos alrededor de 40 o al menos alrededor de 50.

[0044] La invención también describe células de reducción de expresión, por ejemplo, líneas celulares, para SSRP1 y/o SUPT16H/SPT16 (A SSRP1 o A SUPT16H/SPT16), por ejemplo, sobre la base de células HEK293T (HEK293^t A SSRP1 y HEK293T A SUPT16H/SPT16), y su uso para generar un polinucleótido recombinante o célula recombinante mediante transposición, preferentemente, transposición que emplea transposones Bella Durmiente tales como pT2. También se pueden usar líneas celulares de reducción de expresión para HSP90 y/o catepsina y/o células en el que se inhibe la ubiquitinación de PCNA y/o se detiene el ciclo celular en una de las etapas descritas anteriormente. Dichas líneas celulares pueden ser un componente de un kit de transposición, tal como el kit de la invención. Dichas líneas celulares se pueden usar para lograr altas eficiencias de transposición. Preferentemente, dichas células de reducción de expresión son líneas celulares estables.

[0045] Una línea celular de reducción de expresión de la invención puede ser una línea celular modificada para comprender una concentración reducida de un componente del complejo FACT. Dicha reducción puede ocurrir mediante modificación genética o mediante tratamiento con un reactivo tal como un oligonucleótido de ADN u ARN corto que tiene una secuencia complementaria a un gen o un transcrito de ARNm. Si se realiza la modificación genética del ADN, el resultado es una reducción de la expresión estable. Si el cambio en la expresión génica es causado por un oligonucleótido que se une a un ARNm o que se une temporalmente a un gen, esto conduce a un cambio temporal en la expresión génica que no modifica el ADN cromosómico, y el resultado se denomina reducción de expresión transitoria.

[0046] En una reducción de expresión transitoria, la unión de este oligonucleótido al gen activo o sus transcritos provoca una expresión disminuida a través de una variedad de procesos. La unión puede ocurrir ya sea a través del bloqueo de la transcripción (en el caso de la unión a genes), la degradación de la transcripción de ARNm (por ejemplo, mediante ARN de interferencia pequeño (ARNip) o antisentido dependiente de RNasa-H), o a través del bloqueo de la traducción de ARNm, sitios de corte y empalme de pre-ARNm, o sitios de escisión de nucleasa utilizados para la maduración de otros ARN funcionales, incluyendo miARN (por ejemplo, mediante oligos morfolinos u otro antisentido independiente de RNasa-H) (Wikipedia).

[0047] Un procedimiento de reducción de expresión preferido en la invención es la interferencia por ARN (iARN), es un medio para silenciar genes por medio de la degradación de ARNm. La atenuación génica mediante este procedimiento se logra mediante la introducción de ARN de interferencia pequeños (ARNip) bicatenarios en el citoplasma. Los ARN de interferencia pequeños se pueden originar desde el interior de la célula o se pueden introducir de forma exógena en la célula. Una vez introducidos en la célula, los ARNip exógenos son procesados por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El ARNip es complementario al ARNm diana que se silenciará, y el RISC utiliza el ARNip como una plantilla para ubicar el ARNm diana. Después de que el RISC se localice en el ARNm diana, el ARN es escindido por una ribonucleasa. El ARNip puede expresarse de forma constitutiva en la línea celular o introducirse al mismo tiempo que los otros componentes para transfección, por ejemplo, mediante electroporación.

[0048] Por lo tanto, dependiendo del procedimiento empleado para la reducción de expresión, la célula puede comprender un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT.

[0049] La invención también proporciona un procedimiento de producción de un ácido nucleico recombinante, que comprende poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende una secuencia de reconocimiento para una transposasa Bella Durmiente con los componentes del kit de la invención.

[0050] La invención también proporciona un procedimiento de producción de una célula transfectada, en el que el procedimiento comprende introducir en dicha célula los componentes del kit de la invención. Preferentemente, el procedimiento comprende electroporar las células. Los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo in vitro.

[0051] También se proporciona el polinucleótido o el kit de la invención para su uso en el procedimiento de terapia, en el que el procedimiento comprende introducir dicho polinucleótido o los componentes de dicho kit en una célula, y se produce una célula transfectada in vivo.

[0052] El polinucleótido y/o el kit de la invención también se pueden usar para la generación de grupos celulares (es decir, cultivos policlonales de células recombinantes) y líneas celulares clónales para la producción a gran escala de proteínas recombinantes usando, por ejemplo, células de ovario de hámster chino como hospedador. Las células de ovario de hámster chino (Cho) siguen siendo el hospedador más popular para la producción de fármacos biofarmacéuticos, particularmente anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos biespecíficos y proteínas de fusión Fc. Por consiguiente, la invención también proporciona un procedimiento para la producción de una proteína, por ejemplo, anticuerpos o derivados de estos tales como anticuerpos biespecíficos o proteínas de fusión Fc, que comprende etapas en el que se introduce un polinucleótido de la invención que codifica dicha proteína, por ejemplo, se electropora, en una célula hospedadora tal como una célula CHO, preferentemente, usando un kit de la invención, y en el que dicha proteína se aísla.

[0053] La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la invención que comprende un transposón. En una realización, la célula hospedadora es un linfocito T adecuado para la transferencia de linfocito T adoptivo que comprende un transposón de la invención, en el que el ácido nucleico de carga es una construcción de TCR transgénica y/o codifica al menos un miARN.

[0054] La invención describe además una composición farmacéutica que comprende una célula hospedadora de la invención. Por ejemplo, si la célula hospedadora expresa una construcción transgénica de linfocitos T reactiva con un antígeno tumoral, la composición farmacéutica puede usarse en un procedimiento para tratar el cáncer. En otra realización, las células hospedadoras de la invención son adecuadas para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, por ejemplo, viral o bacteriana (por ejemplo, porque son linfocitos T que expresan una construcción de TCR adecuada capaz de dirigirse a células infectadas).

[0055] La invención se ilustra y explica adicionalmente en los ejemplos adjuntos, que no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones. «Uno/a», a menos que se indique explícitamente lo contrario, debe entenderse como «al menos uno/a». «Alrededor de» significa /-10 %.

LEYENDAS DE FIGURAS

[0056]

Fig. 1 Estructura de los elementos transponibles Mariner/Tcl y Bella Durmiente.

A. En mariners, la secuencia codificante de la transposasa (cilindro gris) está flanqueada por repeticiones invertidas (IR) terminales simples, que contienen un único motivo de reconocimiento por IRs. B. En Bella Durmiente, los elementos de IR/DR poseen IR terminales más largas (flechas), con dos secuencias de señales de reconocimiento por IRs, repetidas dos veces en una forma directamente repetida (DRs). La IR a la izquierda también lleva un motivo (HDR) que está funcionando como un potenciador en la transposición.

Fig. 2 Selección de sitios de unión óptimos para la transposasa SB mediante CASTing.

A. Diagrama de flujo de la estrategia CASTing. B. Los oligonucleótidos seleccionados por seis ciclos de CASTing se secuenciaron y analizaron en un ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA) usando el dominio de unión al ADN completo (PAIRED) de la transposasa SB, N123 (Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10). Las afinidades de unión se compararon con el motivo 14DR de la IR a la izquierda de SB. Cpx - Complejo ADN-proteína, libre - posición de las sondas de ADN libres. (Panel derecho). C. Los complejos mostrados en la Fig. B se cuantificaron y se calcularon los valores relativos de afinidad de unión al sustrato. D. Alineación de secuencia de sitios de unión óptimos seleccionados por la estrategia CASTing. La región de unión para RED está en cursiva, los nucleótidos para la unión al gancho AT están en un recuadro y la región de unión para PAI está en mayúscula. Las secuencias se alinearon con los motivos de tipo salvaje de 12Dr (panel izquierdo) o 14DR (panel derecho) de la IR a la izquierda del transposón SB. Las puntuaciones de identidad se muestran a continuación. Los nucleótidos idénticos están en un fondo coloreado (negro - por encima del 50 %; gris - por debajo del 50 %). El 20 % y el 70 % de los motivos de tipo salvaje se recuperaron por el experimento CASTing del motivo de tipo salvaje para RED y PAI, respectivamente. Los sitios de unión óptimos seleccionados, utilizados en EMSA (Fig. 3A) se marcan con una estrella.

WT 12DR: SEQIDNO: 1414DR: SEQIDNO: 15

CAST-1 12DR: SEQIDNO: 1614DR: SEQIDNO: 17

CAST-2 12DR: SEQIDNO: 1814DR: SEQIDNO: 19

CAST-3 12DR: SEQ ID NO: 2014DR: SEQ ID NO: 21

CAST-4 12DR: SEQ ID NO: 2214DR: SEQ ID NO: 23

CAST-5 12DR: SEQ ID NO: 2414DR: SEQ ID NO: 25

CAST-6 12DR: SEQ ID NO: 2614DR: SEQ ID NO: 27

CAST-7 12DR: SEQ ID NO: 2814DR: SEQ ID NO: 29

CAST-8 12DR: SEQ ID NO: 3014DR: SEQ ID NO: 31

CAST-9 12DR: SEQ ID NO: 3214DR: SEQ ID NO: 33

CAST-10 12DR: SEQ ID NO: 3414DR: SEQ ID NO: 35

CAST-11 12DR: SEQ ID NO: 3614DR: SEQ ID NO: 37

CAST-12 12DR: SEQ ID NO: 3814DR: SEQ ID NO: 39

CAST-20 12DR: SEQ ID NO: 4014DR: SEQ ID NO: 31

Fig.3 La distinción entre 12 vs. 14 DR está mediada por el subdominio RED del dominio de unión al ADN de la transposasa SB. A. Alineación de la 14 DR (externa) (SEQ ID NO:32) y 12 DR (interna) (SEQ ID NO:33) de la repetición invertida (IR) a la izquierda. Los nucleótidos implicados en la interacción ADN-proteína, identificados por la huella (Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10), se muestran en mayúsculas, mientras que los nucleótidos no idénticos están en cursiva. Se indican los nucleótidos reconocidos por el subdominio PAI (círculo vacío) o RED (círculo negro), y el gancho AT (encuadrado) (Izsvak Z, y col., 2002. Chem, 277: 34581-8.) Los nucleótidos que se asemejan a los motivos «heptámero» y «nonámero» del RAG1 se resaltan en cajas negras (Hesse, JE y col., 1989. Genes Development, 3: 1053-61). La longitud del espaciador entre los motivos es 12, o 14 en la DR interna y externa, respectivamente. B. Las propiedades de unión al ADN de RED (N58-123, círculo negro), PAI (N1-57, círculo vacío) o el dominio de unión al ADN con extremo N-terminal completo (PAI+RED) se analizaron mediante EMSA. Paneles 3Ba y 3Bb: oligonucleótidos marcados correspondientes a 12DR (negro), 14DR (gris) o 12+AA DR (punteado, negro) se utilizaron como sustratos de ADN. Se representa el diagrama esquemático de los complejos de nucleoproteínas predichos. Los complejos formados con el dominio de unión al ADN con extremo N-terminal completo (PAIRED, N123) se utilizaron como marcadores de tamaño (~2xRED). Los complejos se separaron en geles nativos al 4 % (panel 3Ba) o al 6 % (paneles §Bb y 3Bc). C. Propiedades de oligomerización del subdominio RED en presencia de un reticulante químico, BS32 mM. Los complejos se separaron por SDS-PAGE al 15 %, seguido de transferencia Western, usando un anticuerpo policlonal contra transposasa SB. Las masas moleculares esperadas de los complejos (etiquetas de histidina inclusive) son las siguientes: - M (monómero de RED) 8,5 kDa; - D (dímero de RED) 17 kDa; - T (tetrámero de RED) 34 kDa.

Fig.4 La afinidad de unión mejorada en la DR interna mejora la transposición de Bella Durmiente. A la izquierda, se representan esquemas de varias construcciones de transposones mutados neomarcados. A la derecha, se muestran las actividades de transposición respectivas en comparación con el transposón de tipo salvaje (construcción 1), establecido como 100 %. A. Las DR compuestas se crearon cambiando los motivos de reconocimiento de PAI (caja negra) o RED (caja gris) en un sitio de unión de alta afinidad (CAST-5) seleccionado por el experimento CASTing (marcado con estrellas en el PAI y suprimido en los motivos de reconocimiento de RED). B. La secuencia CAST-5 (SEQ ID NO: 24 o 25) se utilizó para reemplazar solo el motivo de reconocimiento de PAI, mientras que el resto de la DR fue de tipo salvaje.

Fig. 5 Ensayo de transposición en líneas celulares de reducción de expresión estables, generadas por interferencia por ARN.

A. Enriquecimiento de células que tienen la construcción de reducción de expresión. Las células Hek293T no se transfectaron, se transdujeron con un vector retroviral MPSV-LTR - Intrón - hNGFR truncado - WPRE - miARN -LTR como se detalla adicionalmente en la parte experimental, en el que el miARN fue como sigue: la construcción que no se dirige a ningún gen hospedador se utiliza como control negativo (scramble), o las construcciones de miARN que tienen 21 nucleótidos (nt) que se dirigen específicamente a ssrp1 o supt16H. La expresión de NGFR en la superficie de células Hek293T transducidas se supervisó mediante citometría de flujo (después de la transducción), eje x. eje y: sin tinción. Para enriquecer la población celular que expresa miARN, las células se clasificaron por FACS y analizaron de nuevo (después de la clasificación). Los datos muestran una mayor expresión de NGFR cuando se encuentran presentes componentes que agotan miARN del complejo FACT.

B. La eficiencia de reducción de expresión del miARN se supervisó mediante qPCR de la población celular enriquecida con miARN. Los números mostrados entre paréntesis encima de las barras representan el % de reducción de expresión.

C. Ensayo de transposición en líneas celulares de reducción de expresión. Placas de Petri con colonias teñidas de células Hek293T resistentes a la puromicina que se transfectaron con pCMV-SB10 y pT2B-Puro o pCMV-LacZ y pT2B-Puro o pCMV-SB100x y pT2B-Puro.

D. Ensayo de transposición en células HEK293T utilizando transfección transitoria con ARNip. El ARNip se dirigió a ssrp1 o supt16H. El ARNip scrambled que no se dirige a ningún gen se utiliza como control negativo. Placas de Petri con colonias teñidas de células Hek293T resistentes a la puromicina que se han transfectado con pCMV-SB10 y pT2B-Puro o pCMV-LacZ y pT2B-Puro o pCMV-SB100x y pT2B-Puro.

Fig. 6 A. Efecto de E64D (un inhibidor de catepsinas, cisteínas proteasas y calpaína) en la transposición de SB. Ensayo de transposición, (20 pM, lado derecho; control, lado izquierdo). Se espera que la estrategia de iARN contra la(s) catepsina(s) produzca una mejora similar. B. Expresión diferencial de genes hospedadores en presencia de la transposasa (HeLa, Affymetrix). Genes de huésped regulados por disminución (lado derecho), genes de huésped regulados por aumento (lado izquierdo). Las catepsinas (CT) degradan los polipéptidos y se distinguen por las especificidades del sustrato (CTSH, CTSF, CTS2).

Fig. 7 A. El tratamiento con cafeína inhibe la transposición de SB. Las células HeLa se expusieron al tratamiento con cafeína del inhibidor de señalización de ATR (4 mM) en el momento de la transfección con plásmidos de transposón (250 ng de pT2B-Puro) y transposasa (25 ng de pCMV-SB100x) o transposasa D3 (25 ng de pCMV-SB100x catalíticamente inactivo). Las células se recogieron 24 horas después del tratamiento y se sometieron a un ensayo de formación de colonias, análisis del ciclo celular y transferencia Western. (i) Gráfico de barras que muestra los resultados del ensayo de formación de colonias, (ii) transferencia Western que muestra los niveles de expresión de la transposasa SB en células no tratadas y tratadas con cafeína. Los niveles de expresión de tubulina se muestran como controles de carga. * P>0,05 (considerado no significativo); *** P<0,001 (ANOVA unidireccional, comparaciones múltiples de Tukey-Kramer después de la prueba).

B. Las células comprometidas por ATR son defectuosas en la transposición de SB. La transposición de SB se supervisó en líneas celulares estables que expresan ATR o ATRkd (un alelo dominante negativo inactivo de quinasa de ATR) de manera inducible. Gráfico de barras que muestra los resultados del ensayo de formación de colonias a partir de células ATR de tipo salvaje y ATRkd. La transposición se vio gravemente afectada en las células desactivadas por ATR.

Ejemplos

Ejemplo 1

Resultados

El subdominio PAI de la transposasa SB media el contacto del sustrato primario

[0057] Las DR de la IR/DR tienen una estructura compuesta, reconocida por un dominio de unión al ADN compuesto. Los dominios de unión al ADN de la transposasa SB consisten en dos motivos de hélice-giro-hélice (HTH), denominados PAI y RED, en función de su semejanza con el dominio PAIRED, presente en la familia PAX de los factores de transcripción (Izsvak Z, y col., 2002J Biol Chem, 277: 34581-8.; Czerny T, y col., 1993. Genes Dev., 7: 2048-61.). Ambos subdominios están involucrados en la unión al ADN específica de la secuencia: PAI se une al 3'- y RED interactúa con la parte 5' - de los sitios de unión a transposasa bipartitos representados por las DR (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8). Además de la unión al ADN, se demostró previamente que PAI tiene una interfaz de interacción proteína-proteína (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.). Cabe destacar que las cuatro DR de SB no son idénticas, ya que las DR en los extremos de transposón (DR externas) son más largas en 2 pbs (14DR vs. 12DR en la Fig. 1A).

[0058] Aunque se ha determinado el sitio de unión ocupado por el dominio PAIRED de SB (Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10), el experimento de huella no es informativo con respecto a la dinámica de reconocimiento de sustrato. ¿Se reconocen al mismo tiempo los motivos de unión de PAI y RED? Para responder, los inventores han utilizado la estrategia CASTing que se desarrolló originalmente para identificar los sitios de unión óptimos para las proteínas de unión al ADN (Wright y col., 1991. Mol Cell Biol. 11:4104-10) (Fig. 2A). CASTing selecciona secuencias unidas preferentemente de bibliotecas complejas basadas en el enriquecimiento secuencial de secuencias de ADN por purificación de afinidad y amplificación de PCR. La estrategia CASTing se usa para (i) identificar sitios de unión de alta afinidad, y (ii) mapear motivos de secuencia que están involucrados preferentemente en el reconocimiento del sustrato primario por el dominio de unión al ADN compuesto. Basándose en datos de huella de unión a la transposasa SB (Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10), una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios de 35 pb se expuso a la transposasa de longitud completa en condiciones de unión. Los oligonucleótidos seleccionados después de seis ciclos de CASTing se secuenciaron y analizaron en un ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA) usando el dominio de unión al ADN completo (PAIRED) de la transposasa. Las secuencias seleccionadas del procedimiento CASTing se unieron hasta ocho veces de forma más fuerte en comparación con la secuencia 14DR de tipo salvaje (Figs. 2B y 2C). Curiosamente, los sitios de unión de alta afinidad seleccionados por CASTing tenían solo una similitud limitada con las DR de tipo salvaje, y la identidad se concentró principalmente en el motivo de reconocimiento de PAI (Fig. 2D). Por lo tanto, mientras que el subdominio PAI parece especificar el reconocimiento del sustrato primario (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8; Carpentier CE, y col., 2014. Prot Sci. 23:23-33), RED está marginalmente involucrado en este procedimiento. Las secuencias capturadas por la estrategia CASTing sugieren que las interacciones de ADN y PAI y RED tienen funciones distintas, y la interacción proteína-ADN por RED podría tener lugar en una etapa posterior, de la reacción. Además, las DR seleccionadas por CASTing no son de tipo 12DR ni 14DR, lo que sugiere que no hay una distinción significativa entre 12DR interna frente a 14DR externa (Fig. 2D) durante el «primer contacto» entre el transposón y la transposasa.

El subdominio RED de la transposasa SB media la distinción entre 12DR vs. 14DR

[0059] La secuencia reconocida por RED o PAI difiere entre 12 y 14DRs (Fig. 3A). Cabe destacar que la unión a RED se superpone con la diferencia de los dos pares de bases en la longitud de 12 vs. 14DRs (Izsvak Z, y col., 2002. Chem, 277: 34581-8.) (Fig. 3A), lo que sugiere que RED podría estar involucrado en la distinción entre DR ubicadas de forma distante (12DR) o proximalmente (14DR) al final del transposón. Para analizar esta suposición, los oligonucleótidos bicatenarios que representan las 12 y 14DRs se sometieron a EMSA, utilizando ya sea los subdominios PAI (1-57 aa) o los subdominios RED (58-123 aa) de la transposasa SB. Como se muestra en la Fig. 3B (carriles 3, 5 y 6), PAI se unió igualmente a ambas DR (Fig. 3B, carriles 2, 7, 8 y 13). Por el contrario, RED tenía una clara preferencia por 12DR (Fig. 3B, carriles 3, 5 y 6), y no se detectó unión significativa usando el sustrato de 14DR (Fig. 3B, carril 12). Por lo tanto, RED puede distinguir claramente entre 12 vs. 14DR que podrían producirse al reconocer la variación de la secuencia o la diferencia en la longitud. Con el fin de distinguir entre estas posibilidades, el EMSA se repitió con un oligonucleótido similar a 12DR relleno con 2 nucleótidos que tienen la misma longitud que 14DR. La incorporación de dos nucleótidos en la 12DR abolió la unión específica al ^a Dⁿ (Fig. 3B, parte inferior, carriles 6 y 7) por RED, pero no se vio afectada la unión por PAI (Fig. 3B, parte inferior, carril 8). Estos resultados indicaron claramente que RED distingue entre las DR internas y externas por longitud y no por secuencia. Los datos anteriores respaldan la hipótesis de que el reconocimiento selectivo de los sitios de unión a la transposasa internos (12Drs) frente a externos (14DR) se guía por la diferencia de longitud entre las 12 y 14DR, reconocidas por el subdominio RED de la transposasa SB. Curiosamente, RED reconoce la 14DR ubicada al final de la repetición invertida en esta configuración experimental.

Además de la distinción 12/14DR, RED está involucrado en las interacciones proteína-proteína

[0060] Aunque los subdominios PAI y RED son de tamaño similar (57 y 66 aminoácidos, respectivamente), sus complejos nucleoproteicos migran de manera diferente en EMSA (Fig. 3B). Basándose en la movilidad, PAI parece unir tanto las 12- como 14DRs como un monómero. Por el contrario, utilizando concentraciones similares, el complejo nucleoproteico dominante formado entre RED y 12DR migra más lento, consistente con el complejo que contiene dos moléculas de RED (Fig. 3B, carriles 3, 5 y 6). En particular, el complejo formado por un monómero de RED podría detectarse en una concentración de proteína reducida (20 veces menos) en la reacción de unión (Fig. 3B, carril 3). Esta observación sugiere que RED forma fácilmente dímeros al unirse a la 12DR, lo que sugiere que de manera similar a PAI, RED podría estar involucrado tanto en las interacciones proteína-ADN como proteína-proteína. Para evaluar si RED tiene una superficie de interacción proteína-proteína, el péptido de RED se sometió a reticulación química seguida de transferencia Western. Se identificaron bandas correspondientes a estructuras multiméricas, diméricas, tetraméricas e incluso de orden superior de RED, tanto en presencia (Fig. 3C) como en ausencia de sustrato de ADN (no mostrado). Estos resultados indican que de manera similar a PAI (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581­ 8.), el subdominio RED es capaz de homodimerizar. En resumen, aunque tanto los subdominios PAI (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.) como los subdominios RED tienen superficies de interacción proteína-proteína, solo que RED, pero no PAI forma dímeros al unirse a un único sustrato de ADN.

IR/DR rige un procedimiento de «ensamblaje ordenado»

[0061] Alterar la afinidad de los sitios de unión podría desafiar el procedimiento de ensamblaje ordenado que ocurre durante la transposición de un transposón SB. Por lo tanto, se construyeron una serie de versiones de transposón donde los motivos de 12DR y/o 14DR se reemplazaron por sitios de unión de alta afinidad seleccionados por CASTing (Fig. 4A), y las diversas construcciones se sometieron a ensayos de transposición. Sorprendentemente, la sustitución de motivos de tipo salvaje con la secuencia CAST-5 de alta afinidad no mejoró las frecuencias de transposición. Por el contrario, reemplazar 12DR o 14DR por el motivo CAST-5 dio como resultado un 65 % y un 3 % de actividades de tipo salvaje, respectivamente (Fig. 4A). De manera similar, cambiar las cuatro DR a CAST-5 afectó negativamente la transposición (2,2 %), lo que sugiere que una afinidad de unión al ADN mejorada en cualquier posición de DR podría comprometer la transposición de SB. Alternativamente, el efecto negativo de CAST-5 en la transposición podría, al menos parcialmente, explicarse por su selección preferencial para la unión a PAI, mientras que compromete su función en RED. De hecho, se predice que las secuencias de CAST son subóptimas para la interacción con RED, incluida la capacidad de distinguir entre posiciones internas frente a externas (Fig. 2). Para distinguir entre los dos escenarios, se generaron híbridos CAST-5/wt, donde CAST-5 reemplazaba solo PAI, de lo contrario se mantuvo el tipo salvaje (wt) de DR. Una vez más, se analizó el impacto de los motivos híbridos en la transposición en varias combinaciones. Los motivos híbridos CAST-5/wt de alta afinidad todavía afectaban negativamente la transposición en las posiciones externa y combinada interna/externa (Fig. 4B). Sin embargo, el motivo CAST-5/wt mejoró claramente la transposición (130 %), al reemplazar 12DR en las posiciones internas (Fig. 4B).

[0062] Los experimentos de «alta afinidad» revelaron las siguientes características de la transposición de SB. En primer lugar, aunque el EMSA no pudo detectar la interacción RED-14DR, fue esencial para la transposición, supuestamente en una fase posterior de la reacción de transposición. En segundo lugar, mejorar la actividad de unión en la parte externa o en las cuatro DR afecta negativamente la transposición, lo que indica que la afinidad de unión al ADN de las DR en las posiciones interna y externa no se puede cambiar libremente. El reconocimiento del sustrato parece ocurrir en etapas bien definidas en diferentes fases de la reacción, dirigidas por la estructura de IR/DR. Durante este procedimiento, se espera que los subdominios PAI y RED realicen múltiples tareas que involucran la interacción ADN-proteína y proteína-proteína.

[0063] Finalmente, la transposición podría mejorarse mejorando la afinidad de unión de PAI en las posiciones internas (12DRs). En particular, la mejora no es directamente proporcional con la afinidad de unión optimizada, lo que indica que la estructura de IR/DR rige un procedimiento delicadamente regulado que no tolera cambios drásticos. Sin embargo, el intento de descifrar el papel de la estructura de IR/DR en la combinación de estrategias evolutivas moleculares podría traducirse para mejorar significativamente la reacción de transposición de Bella Durmiente.

El agotamiento de los componentes del complejo FACT aumenta la eficiencia de la transposición

[0064] Se observó un enriquecimiento significativo en la transposición (que implica SB10) tras la reducción de expresión de SPT16 en células HEK293T de reducción de expresión estables generadas por interferencia por ARN. (véase la Fig. 5, columna izquierda). De manera similar, se observó aproximadamente un 50 % de enriquecimiento con SB100X (Fig. 5, columna derecha. La reducción de expresión de SUPT16H también condujo a un aumento de la transposición, mientras que el iARN scrambled correspondiente no condujo a ningún efecto significativo en la transposición. El agotamiento de SUPT16H conduce a los efectos más fuertes.

[0065] Un ensayo de transposición en células HEK293T que se transfectan transitoriamente con ARNip disponibles comercialmente para el agotamiento de SPT16 o SUPT16H confirmó los resultados obtenidos usando líneas celulares de reducción de expresión estables (Fig. 6).

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Construcciones de plásmidos

[0066] Los vectores procariotas pET-21a/N57, pET-21a/58-123 y pET-21a/N123 que expresan subdominios marcados con hexahistidina del dominio de unión al a Dn de SB, PAI, RED y N123 respectivamente, se han descrito anteriormente (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.). Para la expresión de la transposasa SB en células HeLa se ha utilizado un pCMV-SB10 (Ivics y col., 1997, Cell 91:501-510). y un pCMV-SBD3 (D3), un mutante catalítico (E278D) de SB. Como plásmidos donantes en ensayos in vivo, se han utilizado las siguientes construcciones: pT/neo descritas anteriormente (Ivics y col., 1997, Cell 91:501-510).

Expresión y purificación de proteínas

[0067] La expresión y purificación de los subdominios PAI y RED marcados con His se realizaron como se describe en (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.).

Ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA)

[0068] Los oligonucleótidos bicatenarios correspondientes a 12 o 14DR se marcaron en el extremo usando [a-32P]dCTP y un fragmento de Klenow. La sonda de ADN que contenía la IR a la izquierda fue un fragmento EcoRI del pT/neo, marcado en el extremo con [a-32P]dATP. Después de la reacción de Klenow, el ADN marcado se purificó en columnas MicroSpin G-25 como lo describe el fabricante. Las reacciones de unión se realizaron en HEPES 20 mM (pH 7,5), EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM en un volumen total de 10 pl de sonda de ADN marcada con 20000-50000 cpm y se agregaron varias concentraciones de las proteínas (como se observa en las Figuras) y se incubaron 10 min en hielo. Después de la adición de 3 pl de colorante de carga (que contiene 50 % de glicerol y azul de bromofenol), las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida al 4 % o 6 %. La electroforesis se llevó a cabo en tampón de trisglicina pH 8,3 a 25 mA durante 2-3 horas. Los geles se secaron durante 45 minutos usando el secador de gel de BIORAD. Después de la exposición nocturna, los geles se escanearon con Fujifilm FLA-3000 y se analizaron con el programa AIDA.

[0069] Secuencia de sondas utilizadas en los experimentos:

14DR:

S 5-ACATACACTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTTGG-37 {SEQ ID NO:79)

AS 5'-GACTCCAAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTGTATGT-3’(SEQ ID NO 80) 12DR:

S 5-ACATACATTAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGTTGG-37 (SEQ ID NO:81)

AS 5’-GACTCCAACAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAATGTATGT-3'(SEQ ID NO:82)

CAST-2 S 5’-acatacaccctggtgtatgtaaagatcggacggccggttgg-3’ (SEQ ID NO: 34)

AS 5’-gactccaaccggccgtccgatctttacatacaccagggtgtatgt-3' (SEQ ID NO: 35)

CAST-5 S 5’-acatacaggcgcgtgtatgtacacttggggtcgtcacttgg-3’ (SEQ ID NO: 36)

AS 5-gactccaagtgacgaccccaagtgtacatacacgcgcctgtatgt-3’ (SEQ ID NO: 37)

CAST-9 S 5’-acatacagcaccatgtacttaaatctctgacctgggcttgg-3’ (SEQ ID NO: 38)

AS 5’-gactccaagcccaggtcagagatttaagtacatggtgctgtatgt-3’ (SEQ ID NO: 39)

CAST-20 S 5 -acatacacgtaagtgtacatactgtgtacacaaagacttgg-3 (SEQ ID NQ: 40)

AS 5 -gactccaagtctttgtgtacacagtatgtacacttacgtgtatgt-3’ (SEQ ID NO: 41)

Reticulación química

[0070] Las reacciones se realizaron utilizando el sustrato bis(sulfosuccinimidilo) (BS3, Pierce Biotechnology, EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante. Las proteínas (3 ^j M) se incubaron en hielo en HEPES 20 mM (pH 7,5), MgCl²5 mM, NaCl 100 mM y BS32,5 mM en un volumen final de 15 j l durante 2 horas. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Tris-HCl pH 7,5 a una concentración final de 50 mM e incubación durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, se agregó el tampón Laemli (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS al 5%, pmercaptoetanol al 10 %, glicerol al 25 % y azul de bromofenol) y las muestras se cargaron en SDS-PAGE al 15 % y se analizaron mediante transferencia Western usando un anticuerpo policlonal anti-SB (R&D Systems, EE. UU.) e IgG anti-cabra (Pierce Biotechnology, EE. UU.).

Experimento con CASTing

[0071] El CASTing se realizó con base en el procedimiento descrito en Wright, Binder y col. (1991). Oligonucleótidos con núcleo largo de 35 pb aleatorio de SB-DOL: 5'- GCG GGA TCC ACT CCA GGC CGG ATG CT (N⁾³⁵ CAC CAG GGT GTA AGG CGG ^a T^c CCG C -3' (SEQ ID NO: 42) se sintetizaron y se hicieron bicatenarios en una reacción de PCR con cebadores complementarios a las secuencias que flanquean el núcleo. Los complejos nucleoproteicos formados durante 1 h de incubación de 2 mg de los oligonucleótidos con 0,15 mg de la transposasa SB marcada con His purificada (SBF1-6H) (Izsvak Z, y col., 2002. J Biol Chem, 277: 34581-8.) se recuperaron usando la resina Ni-NTA (QlAGEN). Los oligonucleótidos unidos se enriquecieron mediante etapas de lavado extensas. Los oligonucleótidos seleccionados se extrajeron y amplificaron mediante los cebadores A, 5'- GCG GGA TCC GCC TTA CAC CCT GGT G -3' (SEQ ID NO: 43) y B, 5'- GCG GGA TCC ACT CCA GGC CGG ATG CT -3' (SEQ ID NO: 44), y se sometieron a rondas adicionales del ciclo de CASTing para aumentar la especificidad del procedimiento. Los oligonucleótidos obtenidos de la 6a ronda se secuenciaron y analizaron en ensayos de unión y transposición.

Cultivo celular

[0072] Las células HeLa se cultivaron en DMEM (GIBCO BRL, Alemania) complementadas con 10 % de oro de suero bovino fetal (FCS Gold) (PAA, Alemania) y 1 % de antibiótico antimicótico (invitrogen, Alemania). Un día antes, se sembraron células de transfección en placas de seis pocillos. Las células se transfectaron con ADN purificado de Qiagen (Qiaprep spin miniprep kit, Qiagen) usando un reactivo de transfección jetPEI RGD (Polyplus Transfection, Francia). Las células se recogieron dos días después de la transfección para el ensayo de escisión y/o se colocaron en placas de 10 cm para su selección usando 1 mg/ml de G418 (Biochrom, Alemania). Después de 3 semanas de selección, las colonias se tiñeron y contaron como se describe en Ivics y col., Cell 1997.

Ensayo de escisión del transposón Bella Durmiente

[0073] Con el fin de determinar la eficiencia de la escisión durante la transposición del transposón Bella Durmiente de los plásmidos al genoma, se clonó un gen indicador basado en el transposón Bella Durmiente llamado pCMV(CAT)-GFP/T2neo. En detalle, en primer lugar, el marco de lectura abierto de GFP controlado por el promotor de CMV se clonó en el vector pcDNA3.1. A continuación, el transposón Bella Durmiente que contiene un gen neo de selección (estimulado por el promotor SV40) se clonó en el sitio «TA» en el ORF de GFP.

[0074] Para evaluar los efectos de la secuencia interna del transposón Bella Durmiente sobre la eficiencia de la escisión, se cortaron las secuencias de 977 pb y 1654 pb (que contienen SV40-neo parcial) del indicador de escisión original, respectivamente, para clonar dos indicadores de escisión alternativos con secuencias internas más cortas (1260 pb y 583 pb, respectivamente).

[0075] Las tres construcciones de transposón se purificaron usando el kit midi de plásmido Qiagen. El ADN del plásmido purificado

se transfectó en células HeLa con el plásmido pCMV(CAT) que expresa transposasa SB100X (Mates L, y col. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. junio de 2009;41(6):753-61.) utilizando jetPEI (transfección Polyplus, para células de mamíferos) según las instrucciones de fabricación. Tres días después, la cantidad de células GFP positivas fue estimada por FACS.

Clonación

[0076] Los extremos de transposón SB mutados se crearon por mutagénesis mediada por PCR. Las secuencias de cebadores y las estrategias de clonación se resumen en la Tabla 1.

Tabla 4.

El agotamiento de los componentes del complejo FACT aumenta la eficiencia de la transposición

[0077] Se generaron construcciones de miARN usando los microARN diana descritos en la Tabla 5. Para establecer líneas celulares de reducción de expresión estables, se transdujeron células Hek293T con dichas construcciones de microARN.

[0078] El vector basado en microARN (miARN) se utilizó para clines de células de reducción de expresión estables de ssrpl y supt16H, que comprenden los componentes

MPSV-LTR - Intrón - hNGFR truncado - WPRE - miARN - LTR

[0079] Virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV); Repetición terminal larga (LTR) de ratón; Receptor del factor de crecimiento nervioso humano truncado (NGFR); Elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck (WHP) (wPRE); Secuencia central de miR155 de ratón con secuencias de sentido y antisentido diana (ssrpl o suptWH).

[0080] La expresión del microARN se supervisó mediante tinción de las células con anticuerpo anti-NGFR. Para enriquecer la población celular con microARNs, las células se clasificaron mediante FACS y cultivaron. Para analizar la eficiencia de reducción de expresión, la población celular enriquecida se sometió a aislamiento de ARN seguido de síntesis de ADNc. El nivel de expresión de los genes diana se supervisó mediante qPCR con cebadores específicos del gen (como se enumera en la Tabla 6).

[0081] Se obtuvieron ARNip (siGENOME, SMARTpool) prediseñados, comerciales, sintéticos (de Dharmacon,GE healthcare). Los ARNip que se dirigen a cualquiera de los genes supt16H (cat. N.° M-009517-00-0005) y ssrpl (cat. N.° M-011783-01-0005) se transfectaron en Hek293T utilizando el sistema de transfección jetPEITM. Se usó como ARNip de control negativo dirigido al gen de luciferasa de luciérnaga (cat. N.° D-001206-14-05). 24 h después, las células se transfectaron con plásmidos respectivos para su transposición. Dos días después de la transfección; las células transfectadas se tripsinizaron, se contaron y se sometieron a la selección de puromicina. Después de una semana de selección, las colonias se fijaron con formaldehído al 10 % en PBS durante 15 minutos, se tiñeron con azul de metileno en PBS durante 30 minutos, se lavaron ampliamente con agua desionizada, se secaron al aire y se fotografiaron.

[0082] Se realizó un ensayo de transposición como se publicó anteriormente (Ivics Z, y col., 1997. (Cell, 91: 501-10), Los resultados se muestran en las Fig. 5 y 6.

Tabla 6: Cebadores

Ejemplo 2

[0083] Se ha demostrado previamente que tanto las actividades de ADN-PKcs como las de ATM son necesarias para una transposición de SB eficiente (Izsvak y col., 2004, Mol Cell 13(2):279-90). Al igual que el ADN-PKcs y la a Tm , la ATR también pertenece a la familia de la quinasa tipo fosfatidilinositol 3 quinasa (PIKK), involucrada en la señalización y reparación de puntos de control. ATR se activa específicamente por el daño del ADN durante la replicación (Lupardus y col., 2002, Genes Dev 16(18):2327-32). La cafeína es un inhibidor de ATM, ATR y mTOR (también un miembro de PIKK), pero no de ADN-PKCs (Sarkaria y col., 1999, Cancer Res. 59(17):4375-82). Los inventores examinaron la transposición de SB usando un ensayo de transposición estándar, bajo tratamiento con cafeína (4 mM).

[0084] La frecuencia de transposición disminuyó en aproximadamente un 50 % tras el tratamiento con cafeína con respecto al control (Fig. 7A). Para descifrar si la señalización de ATR es específicamente necesaria para una transposición de SB eficiente, se utilizaron líneas celulares inducibles por TET estables, donde se puede regular la función de ATR. La transposición de SB se supervisó en líneas celulares estables que expresan ATR (de tipo salvaje) o ATRkd (un alelo dominante negativo inactivo de quinasa de ATR) de manera inducible (Cliby y col., 1998, EMBO J.

17(1):159-69). La expresión de ATRkd, una versión catalíticamente muerta de ATR tiene como efecto negativo dominante que inhabilita la actividad de ATR (Cliby y col., 1998). En las células desactivadas con ATR, ATR no es capaz de iniciar la cascada de señalización que resolvería la detención de replicación. Se indujeron ATR y ATRkd, y las dos líneas se sometieron al ensayo de transposición genómica. Los resultados muestran que la transposición disminuyó en ~75 % en las células desactivadas con ATR, lo que indica que la ATR es esencial para la transposición de SB (Fig. 7B). Además, a pesar de la acumulación de horquillas de replicación estancadas en las células inducidas

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido o el polinucleótido complementario de este que comprende un transposón que comprende un ácido nucleico de carga flanqueado por una repetición invertida/repetición directa (IR/DR) a la izquierda y a la derecha, en el que

(i) el transposón puede ser movilizado por una proteína transposasa Bella Durmiente;

(ii) la IR/DR a la izquierda comprende un motivo de DR a la izquierda externa y un motivo de DR a la izquierda interna, en el que el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I^d NO: 1 y el motivo de DR a la izquierda interna comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; y

(iii) la IR/DR a la derecha comprende un motivo de DR a la derecha externa y un motivo de DR a la derecha interna, en el que el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y el motivo de DR a la derecha interna comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SeQ ID NO: 2.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el motivo de DR a la izquierda externa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y/o el motivo de DR a la derecha externa comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la s Eq ID NO: 4.

3. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el motivo de DR a la izquierda interna comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 y/o el motivo de DR a la derecha interna comprende un complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la IR/DR a la izquierda comprende una región HDR capaz de funcionar como un potenciador que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:7 entre la DR externa y la DR interna, en el que, opcionalmente, la IR/DR a la derecha también comprende el complemento inverso de dicha región HDR.

5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la IR/DR a la izquierda comprende la secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO:9.

6. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la IR/DR a la derecha comprende la secuencia de nucleótidos del complemento inverso que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

7. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico de carga comprende un marco de lectura abierto unido operativamente a un promotor, en el que el marco de lectura abierto codifica preferentemente una construcción de receptor de linfocitos T.

8. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polinucleótido es un vector que se selecciona del grupo que consiste en

(i) un vector viral seleccionado del grupo que consiste en un vector adenoviral, viral adenoasociado, lentiviral, retroviral, viral del herpes simple, baculovirus, viral de Epstein-Barr y poxvirus; o

(ii) un vector no viral que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un minicírculo, un vector pFAR o un virosoma.

9. Un kit para la transposición de un ácido nucleico, en el que el kit comprende

(i) el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

(ii) (a) una proteína transposasa Bella Durmiente o (b) un ácido nucleico que codifica una proteína transposasa Bella Durmiente; y

(iii) opcionalmente, al menos un cofactor seleccionado del grupo que consiste en

(A) un cofactor capaz de agotar un componente del complejo FACT que se selecciona del grupo que consiste en SSRP1 y SUPT16H/SPT16, en el que dicho cofactor se selecciona del grupo que consiste en ARNip, miARN y un anticuerpo contra SSRP1 o SUPT16/H/SPT16;

(B) un inhibidor de catepsina seleccionado del grupo que comprende H, S, V y L, en el que dicho inhibidor es E64D;

(C) un cofactor capaz de agotar o inhibir HSP90, en el que dicho cofactor se selecciona del grupo que consiste en geldanamicina, radicicol y 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, ARNip y miARN;

(D) un agente capaz de aumentar la concentración y/o la señalización de ATR que se selecciona del grupo que consiste en un polinucleótido que codifica ATR y una proteína ATR,

o una célula en la que

(AA) dicho componente del complejo FACT está agotado; y/o

(BB) dicha catepsina está inhibida; y/o

(CC) dicha HSP90 está inactivada; y/o

(DD) se aumenta la concentración y/o la señalización de ATR.

10. Un procedimiento de producción in vitro de un ácido nucleico recombinante, que comprende poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende una secuencia de reconocimiento para una transposasa Bella Durmiente con los componentes del kit de la reivindicación 9.

11. Un procedimiento de producción in vitro de una célula transfectada, en el que el procedimiento comprende introducir en dicha célula los componentes del kit de la reivindicación 9, en el que el procedimiento comprende preferentemente electroporar las células.

12. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el kit de la reivindicación 9 para su uso en un procedimiento de terapia, en el que el procedimiento comprende introducir dicho polinucleótido o los componentes de dicho kit en una célula, y se produce una célula transfectada in vivo.

13. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el kit de la reivindicación 9, el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-11 o el polinucleótido para su uso de la reivindicación 12, en el que la transposasa Bella Durmiente es una transposasa hiperactiva SB100X.

14. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que, preferentemente, la célula hospedadora es un linfocito T adecuado para la transferencia de linfocito T adoptivo que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7.

15. Una composición farmacéutica que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 14.