JP2017528151A - 干渉性分子のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、発現または発現された遺伝子配列の活性を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、− スクリーニングすべき前記干渉性核酸と相補的である第2の配列と、また、場合によっては、− 少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、を含むハイブリッド核酸分子を細胞内に導入するステップを含み、前記第1の配列が修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、少なくとも10%低減されるようになっている、方法に関する。
Description
本発明は、干渉性分子のスクリーニング方法に関する。
RNA干渉(RNAi)として公知の現象は、低分子リボ核酸がメセンジャーRNAと相互作用できるという事実に基づく。多くの酵素によって制御される複雑な機序が、メセンジャーRNAの分解を導き、こうして前記メセンジャーRNAをコードする遺伝子の発現を阻害し、ひいてはそれに由来するタンパク質の発現を阻害する。
低分子干渉性RNAの中では、RNAの複数の種、特にマイクロRNA、ヘヤピンRNAが識別されており、これらは、遺伝子、ひいてはそれに由来するタンパク質の発現を類似の機序によって阻害する能力を有する。
現在、RNA干渉による阻害が探求されている目的遺伝子の各々について試験すること、企図されている遺伝子の各々について各干渉性RNAを個別に試験することが極めて広く当然のこととして認められている。このような方法は、企図された各々の干渉性RNAが標的遺伝子の発現に対しその阻害効果を充分に及ぼすことを確認することが必要であるため、時間および費用のかかるものである。その上、適切な阻害効果を及ぼすものとみなされる干渉性RNAの各々が、さらに当初標的とされたもの以外の1つ以上の遺伝子の発現も同様に遮断することによる「寄生的」阻害効果を及ぼさないことを確認する必要がある。
米国特許第8252535号明細書は、公知の干渉性RNAの配列と相補的な標的にすべき配列を含む人工的配列の使用について記載している。この方法は、その上、異なる標的遺伝子をコードするRNAを同時に阻害することを可能にする。しかしながら、このような方法はなお不完全なものであり、特に天然標的に特異的な干渉性RNAを効果的にスクリーニングすることができない。
さらに、遺伝子の発現にプラスの効果を有する核酸分子の技術的現状も知られている。
例えば、Voutilaら、Molecular Therapy、2012−08−01は、細胞多分化能に関与する遺伝子を活性化するために使用されるsiRNAについて記載している。国際公開第2006/113246A2号は、特にプロモータ領域に固定されて遺伝子の発現を活性化するsRNAについて記載している。しかしながら、これらの分子は、調節配列を標的化する効果を有するが、遺伝子のコード配列を特異的に標的化するものではない。
Voutilaら、Molecular Thera py、2012−08−01
したがって、本発明は、これらの欠点を改善することを目的とする。
本発明の1つの目的は、より感度の高い干渉性分子スクリーニング方法を提供することにある。
本発明の1つの目的は、より感度の高い干渉性分子スクリーニング方法を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、技術的現状から公知であるものよりも感度が高い、干渉性分子のスクリーニング方法を実施できるようにするハイブリッド核酸に関する。
本発明のさらにもう1つの目的は、上述の方法を容易かつ効果的に実施できるようにする手段を提供することにある。
したがって本発明は、
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸つまりRNAの活性、
を増大させる干渉性核酸の特にインビトロでのスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
前記第1の配列が、特に少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、方法に関する。
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸つまりRNAの活性、
を増大させる干渉性核酸の特にインビトロでのスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
前記第1の配列が、特に少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、方法に関する。
本発明は、修飾された翻訳開始配列(非最適)を有する核酸分子を用いて選択された場合に、遺伝子の発現を増大させることのできる干渉性分子をスクリーニングすることが可能であるということを意外にも当該発明者らが確認したことに基づいている。
したがって当該発明者らは、技術的現状において広く説明され認められてきたものとは相反する特性、すなわちRNA干渉機序の公知の発現阻害特性を有する干渉性RNAを初めて識別した。
本発明においては、野生の真核生物に認めることのできるような前記配列(すなわち前記翻訳開始配列レベルで突然変異を有していないもの)とは異なる非天然の第1の翻訳開始配列を含む核酸分子を入手することが最も重要である。
本発明において、翻訳開始配列なる用語は、遺伝子内およびそれに由来するメセンジャーRNA内に存在し、開始コドンATGを取り囲む核酸配列を意味する。この配列は、より一般的にはコザック配列と呼ばれる。
本発明において、「最適」なる用語は、所与の細胞型においてかつ所与の培養条件下で決定される、1つの遺伝子を操作する最大限の翻訳レベルを意味する。最適翻訳レベルは、メチオニンイニシエータ転移RNAによって移入された第1のアミノ酸の負荷が行なわれる前記翻訳開始部位に依存下でのRNAによるタンパク質の最大産生レベルである。細胞は、天然の生理学的状態では所与のRNAについてその最適レベルより多くのタンパク質を産生する能力がないものとして理解される。
本発明において、「遺伝子発現を増大させる」なる文言は、修飾無しで得られるタンパク質の量よりも多い前記遺伝子によりコードされたタンパク質の量を得る結果をもたらす全ての修飾を意味する。同様に、本発明に係る干渉性核酸の存在下では、(前記干渉性核酸により標的化される)遺伝子のタンパク質産物は、前記遺伝子を標的化する干渉性核酸の不在下または別の遺伝子を標的化する干渉性核酸の存在下での同じ遺伝子のタンパク質産物よりも豊富なものとなるであろう。「遺伝子発現を増大させる」なる用語のこの定義は、当業者が従来より用いている定義である。
同様に、たとえタンパク質のこの増大が関与する分子機序が転写後の機序(RNAの安定化、転写の増大)であるとしても、やはりそれは遺伝子発現の増大である。
本発明において、「遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸つまりRNAの活性の増大」は、上述の通り、遺伝子の発現の増大、すなわち前記遺伝子によりコードされるタンパク質産物の増大を導く機序の1つに対応する。
本発明において、干渉性分子なる用語は、RNA干渉により遺伝子発現を調節する能力を有する核酸分子を意味する。したがって、本発明によって網羅される干渉性分子の一例は、低分子干渉性RNA(Small interfering RNAを略してsiRNA)、マイクロRNA(「micro RNA」を略してmiRNA)、または低分子ヘヤピンRNA(「short hairpin RNA」を略してshRNA)である。
siRNAは、21〜24個のヌクレオチドの2本鎖低分子RNAである。2本鎖状態の低分子干渉性RNAは、RISC(RNA induce silencing complexの略)複合体と命名されたタンパク質複合体により細胞の細胞質内で認識される。この複合体は、RNAの相補鎖またはセンス鎖を放出することによって活性化される。この活性化された複合体は、その標的転写物、メセンジャーRNAを核酸塩基の相補性により認識する。この認識系が、この機序の高い特異性を保証する。ひとたび標的が結合されると、RISC複合体の一部を成すアルゴノート(Argonaute)タンパク質は、認識部位のレベルで転写物を切断できる。したがって、Agoは、エンドヌクレアーゼとして作用し得る。Agoにより分割された転写物の2片は、エキソヌクレアーゼによりその末端を介して急速に分解される。
miRNAは、2本鎖構造を基本対合によって形成する能力を有する1本鎖RNAである。RISCの形成中に、2本鎖miRNAは1本鎖miRNAへと移行する。miRNAの標的メセンジャーRNAの特異的鎖のみが、複合体の内部に保存される。このとき、標的mRNAは、RISC複合体の内部に負荷される。この場合、複合体がタンパク質Ago2を含む場合の標的mRNAの分解か、または複合体がタンパク質Ago1を含む
のこの標的mRNAの翻訳抑制という2つの阻害方法が考えられる。
のこの標的mRNAの翻訳抑制という2つの阻害方法が考えられる。
shRNAは、RNAによる干渉現象に関与し得るロッドおよびループ構造を採用するRNAである。RISC複合体による取込みの後、センス鎖は分解される。アンチセンス鎖は、RISC複合体を、相補的配列を有するmRNAへと導く。このとき、分解機序は、siRNAにより操作されるものと類似である。
本発明の枠内では、或る種の干渉性分子が遺伝子の発現を増大させる能力の機序は、まだ解明されていない。しかしながら、当該発明者らは、本発明に係る方法を用いて、技術的現状においてメセンジャーRNAの翻訳を阻害するかまたはメセンジャーRNAを不安定化するものとして一般的にみなされている一部の分子が、実際には、前記メセンジャーRNAの発現または安定性を増大させる能力を有することを示した。
本発明において、「少なくとも部分的に前記遺伝子または前記RNAとの配列相補性を有する前記干渉性核酸」なる文言は、スクリーニングすべき干渉性核酸が、一方では、一遺伝子またはそれがコードするメセンジャーRNAの配列と少なくとも部分的に相補的となるように予め選択され、スクリーニングが特異的なものとなるようにされていることを意味する。その上、当業者であれば、干渉性核酸が、標的化される遺伝子のものよりもヌクレオチド数で小さいサイズを有するかぎりにおいて、これらの干渉性核酸が標的化する遺伝子の配列と完全に相補的とはなり得ないことを理解するであろう。
本発明において、ハイブリッド核酸分子なる用語は、自然界では隣接していない少なくとも2つの核酸フラグメントで構成されたハイブリッド核酸分子を意味する。したがって、このハイブリッド分子は、天然には存在しない。
上述の通りの前記ハイブリッド核酸分子は、少なくとも以下の3つの配列を含む:
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列、またはより一般的には翻訳開始配列と呼ばれる配列。この配列は修飾されている、すなわち、一般的集団において見られる同じ配列との関係において異なる少なくとも1つのヌクレオチドを有する。
− 1つまたは複数の干渉性核酸の標的配列に対応する、スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列、および、
− 免疫原性ラベルまたはタグ、さらには酵素活性を有する機能タンパク質または発光または蛍光特性を有するタンパク質に対応し得る少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列。
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列、またはより一般的には翻訳開始配列と呼ばれる配列。この配列は修飾されている、すなわち、一般的集団において見られる同じ配列との関係において異なる少なくとも1つのヌクレオチドを有する。
− 1つまたは複数の干渉性核酸の標的配列に対応する、スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列、および、
− 免疫原性ラベルまたはタグ、さらには酵素活性を有する機能タンパク質または発光または蛍光特性を有するタンパク質に対応し得る少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列。
本発明においては、第2の配列が第3の配列内に含まれていることが可能である。このことはすなわち、前記少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3の配列が、スクリーニングすべき前記干渉性核酸と少なくとも部分的に相補的であるその配列の一部分を含んでいることを意味する。このことは、一方では、第2の配列が第3の配列の一部分に対応し、2つとも既定のペプチドの一部分をコードしていること、また他方では、既定のペプチドが「ハイブリッド」であること、すなわちそれが、外因性配列(第2の配列)が中に導入されている1つの配列によってコードされていることを意味することができる。この第2の場合において、既定のペプチドは、天然には前記既定のペプチドの配列内に含まれていないその核酸配列の一部分を含む。
本発明においては、第2および第3の配列が同一であることも同様に可能である。既定のペプチドをコードする配列が同様に全面的に、スクリーニングすべき干渉性核酸と部分相補性または完全相補性を有する場合がそれである。特に、FLAGラベルをコードする配列の場合がそれである。ラベルの発現を増大させる干渉性分子が探求されている場合、FLAGラベルをコードする核酸配列は第1の配列の下流側に置かれ、このときハイブリッド核酸分子は3つの配列(実際には2つの配列しか表わさない)で構成され、第2および第3の配列は完全に一体になっているかまたは同一である。ハイブリッド核酸分子においては、第1の配列による第3の配列の機能的制御が存在し、この制御はシスで実施され、このことは、2つの配列が
同じ分子によって担持される場合に制御が行なわれるということを意味している。
同じ分子によって担持される場合に制御が行なわれるということを意味している。
ハイブリッド分子の第1の配列は、前記少なくとも1つのペプチドの翻訳が、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるような形で修飾される。換言すると、干渉性核酸の不在下では、修飾された第1の配列を有していないハイブリッド核酸分子を含む真核細胞は、前記修飾された第1の配列を有するハイブリッド核酸分子を含む同じ真核細胞に比べて少なくとも10%多い(第3の配列によりコードされている)既定のペプチドを発現する。
ハイブリッド核酸分子とスクリーニングすべき干渉性核酸との間の相互作用を可能にするためには、干渉性核酸の配列およびハイブリッド核酸分子の第2の配列が、当業者にとって周知である塩基A−T/A−UおよびG−Cの相補性に応じて、少なくとも部分的に相補的である必要がある。
本発明において、「少なくとも部分的に相補的」なる文言は、スクリーニングすべき干渉性核酸を構成する大部分のヌクレオチドが、ハイブリッド核酸分子の第2の配列を定義するヌクレオチドと相補的であることを意味する。詳細には、スクリーニングすべき干渉性核酸のヌクレオチドおよびハイブリッド核酸分子の第2の配列を構成するヌクレオチドが、90%超、有利には95%超、特に99%超、詳細には100%の相補性を示すこと、または換言すると、2つの分子が、10%未満、5%未満、特に1%未満、詳細には0%のミスマッチを有することが有利である。干渉性核酸分子の第2の配列が、約20個のヌクレオチドで構成されている場合、相補性が完全であることが極めて有利である。
本発明は、実際には、翻訳開始配列の修飾が、マーカーとして役立つ既定のペプチドのより小さい発現を可能にし、したがって干渉性核酸の効能が試験される場合に発現変動、特に発現増大をより正確に視覚化することを可能にする。
本発明に係る方法は、有利には、以下のステップを含む:
− ハイブリッド核酸分子のトランスフェクションという技術的現状で周知の技術によりRNA干渉を実現することのできる真核細胞の形質転換で構成される第1のステップ。これは特に電気穿孔法、リン酸カルシウムでの形質転換、リポフェクション、ウイルス感染さらにはヌクレオフェクションである得る。真核細胞の形質転換のこれらの例が、例示目的で提供されるが、本発明の範囲を限定することはできない。
− ハイブリッド核酸分子のトランスフェクションという技術的現状で周知の技術によりRNA干渉を実現することのできる真核細胞の形質転換で構成される第1のステップ。これは特に電気穿孔法、リン酸カルシウムでの形質転換、リポフェクション、ウイルス感染さらにはヌクレオフェクションである得る。真核細胞の形質転換のこれらの例が、例示目的で提供されるが、本発明の範囲を限定することはできない。
一時的または安定した形でひとたび形質転換されると、上述の細胞は、干渉性核酸のスクリーニングのためにいつでも利用可能な状態となる。つねに形質転換された同じ細胞を単なる細胞培養により使用できるように、安定した形で形質転換された細胞(すなわち前記ハイブリッド核酸分子をそのゲノム内に組込んだ細胞)を入手することが有利であり得る。
− 第2のステップでは、先のステップで形質転換された1つまたは複数の細胞は、前記スクリーニングすべき干渉性核酸を前記細胞内に導入するために、当業者にとって周知の従来の手段によってもう一度形質転換される。
− 一方ではハイブリッド核酸分子およびスクリーニングすべき干渉性核酸の集団でこのように形質転換された細胞は、当業者が自らのRNA干渉についての一般的知識を用いて、利用される細胞のタイプに応じて容易に決定することのできる既定の時間の間、RNA干渉プロセスを実施できるようにするため、第3のステップにおいて培養される。
− 前記既定の時間が終了すると、細胞は、このとき第4のステップにおいて、前記ハイブリッド核酸分子によりコードされた前記既定のペプチドの発現率、すなわち存在、不在または数量を測定するために分析される。既定のペプチドのこの存在、不在または数量は、前記ハイブリッド核酸分子で形質転換されたもののスクリーニングすべき干渉性核酸を用いては形質転換されていない、またはハイブリッド核酸分子内に標的(すなわち相補的配列)を有していない干渉性核酸でトランスフェクトされた前記細胞により発現される、前記同じ既定のペプチドの数量と比較して評価される。
干渉性核酸で形質転換された細胞内の既定のペプチドの数量が、どの干渉性核酸でも形質転換されなかった細胞またはハイブリッド核酸分子内に標的(すなわち相補的配列)を有していない干渉性核酸でトランスフェクトされた細胞内のペプチドの数量以下であるまたは10%未満しかそれを上回っていない場合、前記干渉性核酸は考慮されないであろう。反対に、干渉性核酸で形質転換された細胞内の既定のペプチドの数量が、どの干渉性核酸でも形質転換されなかった細胞またはハイブリッド核酸分子内に標的(すなわち相補的な配列)を有していない干渉性核酸でトランスフェクトされた細胞内のペプチドの数量を少なくとも10%上回っている場合には、前記干渉性核酸は、それが標的化する遺伝子の発現または活性の活性化効果を及ぼすことから考慮されるであろう。
少なくとも10%の発現レベル差を測定するためには、化学発光または蛍光による検出を用いて発出された光放射を定量的に検出することのできる従来の免疫検出技術を使用することが可能である。
例えば、ウエスタンブロット技術により目的ペプチドの免疫マーキングを実施し、化学発光によりその数量を測定することができる。同様にして、ペプチドに対して導かれた抗体が、蛍光マーカーに結合される場合、適切な波長での励起の後に発出された蛍光放射を測定することによりその数量を測定することが可能である。
ペプチド自体が、自家蛍光特性を備えている場合には、特にフローサイトメトリにより、生きた細胞から直接その数量を測定することが可能である。
ハイブリッド核酸分子が、蛍光分子またはFRET間のエネルギー伝達を実施することのできる少なくとも2つのペプチドを、第3の配列を介しコードすることが同様に有利であり得る。第3の配列が、FRETを実施できる少なくとも2つのペプチドをコードする特殊な場合においては、発現されたペプチドの数量、ひいては干渉性核酸の効果を、エネルギー伝達の結果である蛍光発出を測定することによって、干渉性核酸により形質転換されたまたはされていないハイブリッド核酸分子で形質転換された生きた細胞上で直接測定することができる。
要約すると、本発明に係る方法は、
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
1− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップであって、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっているステップと、
2− 干渉性核酸を先行するステップで得た真核細胞内に導入するステップと、
3− 前記少なくとも1つのペプチドの発現を測定するステップと、
を含む方法、である。
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
1− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップであって、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっているステップと、
2− 干渉性核酸を先行するステップで得た真核細胞内に導入するステップと、
3− 前記少なくとも1つのペプチドの発現を測定するステップと、
を含む方法、である。
この方法により、前記少なくとも1つのペプチドの発現レベルが、ステップ1で得られた、ただし、いかなる干渉性核酸でも、または前記ハイブリッド核酸分子の第2の配列といかなる配列相補性も有していない干渉性核酸でも形質転換されていない真核細胞により発現された前記ペプチドの発現レベルよりも10%上回っている場合、10%超のこの発現増大を可能にした干渉性核酸は、本発明に係る目的干渉性核酸である、との結論を下すことが可能になる。
逆の場合、試験された干渉性核酸は、標的化された遺伝子の発現または活性の増大特性を有していないことから保存されない。
ここで、本発明において、ハイブリッド核酸分子は、リボ核酸(RNA)、または1本鎖または2本鎖のデオキシリボ核酸(1本鎖DNAまたは2本鎖DNA)である点に留意されたい。有利には、ハイブリッド核酸分子は、デオキシリボ核酸分子である。
有利には、本発明は、前記第1の配列が、リボソーム内部進入部位つまりIRES、またはRNAキャップ(5’CAP)の下流側の翻訳開始コザック配列である、上述の方法に関する。
翻訳の開始は、コザック配列の存在によって発生する。しかしながら、翻訳開始を可能にするためには、リボソームおよび翻訳装置全体がメセンジャーRNA上に「負荷されて」いる必要がある。このような「負荷」は、RNAキャップ(5’CAP)を用いてかまたはリボソーム進入内部配列つまりIRESを用いて操作される。これらの配列(5’CAP/IRES)は、同様に、それらが負荷されているメセンジャーRNAを安定化させ、さらにはメセンジャーRNAをそれらの翻訳部位に向かって移出する能力をも有している。
RNAキャップ(5’CAP)は、真核細胞内でメセンジャーRNAの5’末端に見出される修飾されたヌクレオチドである。これは、核内に局在化した複数の酵素の連続的作用によって導入される転写後修飾である。キャップは、トリホスフェート5−5’結合により転写されたメセンジャーRNAの第1のヌクレオチドに連結されたN7位でメチル化されたグアノシンで構成される。
IRESは、キャップの存在および走査機序とは無関係に、開始コドンレベルでリボソームを直接動員することを可能にする。IRESは、リボソームまたは翻訳開始因子と直接相互作用するmRNAの構造化された領域である。
有利な一実施形態において、本発明は、核酸分子が前記第3の配列の上流側または5’位に位置づけされた前記第1の配列を含んでいる、以上で定義された方法に関する。
第3の配列のシス調節をコーディネートするためには、ハイブリッド核酸分子の第1の配列が、既定のペプチドをコードする第3の配列の上流側に位置づけされることが有利である。こうして、第1および第3の配列は、直接結合されるか隣接することができるが、同様に、第2の配列または他のあらゆる配列のいずれであろうと、別の配列により分離されていることも可能である。
別の有利な実施形態によると、本発明は、前記第2の配列が、
− 前記第1の配列の5’位、または
− 前記第1の配列の3’位および前記第3の配列の5’位、または、
− 前記第3の配列の3’位、
に位置づけされるか、または
− 前記第3の配列内に含まれている、
上述の方法に関する。
− 前記第1の配列の5’位、または
− 前記第1の配列の3’位および前記第3の配列の5’位、または、
− 前記第3の配列の3’位、
に位置づけされるか、または
− 前記第3の配列内に含まれている、
上述の方法に関する。
ハイブリッド核酸分子の配列の異なるシークエンシングの可能性が図1によって例示されている。
別の有利な実施形態においては、本発明は、前記核酸分子が、場合によって1つのベクター内に含まれる特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子、または特に1本鎖のリボ核酸分子である、以上で記載された通りの方法に関する。
先に言及した通り、ハイブリッド核酸分子は真核細胞内に導入される。このハイブリッド核酸分子は、前記真核細胞内に以下のような異なる形態で導入することができる:
− 前記第3の配列によりコードされた前記少なくとも1つのペプチドを翻訳するため、真核細胞の翻訳装置により取込まれる、1本鎖のリボ核酸またはRNAの形態、
− その後真核細胞の細胞機構によってRNAに転写され次に翻訳されなければならない、特に2本鎖のデオキシリボ核酸すなわちDNAの形態。この場合、ハイブリッド核酸分子が上述の3つの配列の他に、RNAの転写を可能にする配列を含むことが重要であろう。
− 前記ハイブリッド核酸配列を含むDNAベクターの形態。このベクターは、ハイブリッド核酸分子の転写を可能にする手段、特にプロモータおよび付随的には転写を増大する配列(エンハンサー)を含む。このとき、ベクターは、自律的に複製できるように真核生物またはウイルスの複製起点を含み得る円形ベクター、または真核細胞内へのその組込みを刺激するように線形ベクターであり得る。その上、前記ベクターが、例えば非限定的に、
・ ピューロマイシン、ネオマイシン/G148、ブラスチシジンさらにはゼオシンなどの一定の抗生物質に対する耐性を可能にするペプチドをコードする配列、
・ 緑色蛍光タンパク質などの自家蛍光タンパク質のコード配列、または
・ 例えばチミジン・キナーゼなどの、発現する細胞上で負の選択を行なうタンパク質をコードする配列、
など、前記ベクターを自らのゲノム内に組込んだ細胞を選択できるようにするタンパク質をコードする1つ以上の配列を含むことが有利である。
− 前記第3の配列によりコードされた前記少なくとも1つのペプチドを翻訳するため、真核細胞の翻訳装置により取込まれる、1本鎖のリボ核酸またはRNAの形態、
− その後真核細胞の細胞機構によってRNAに転写され次に翻訳されなければならない、特に2本鎖のデオキシリボ核酸すなわちDNAの形態。この場合、ハイブリッド核酸分子が上述の3つの配列の他に、RNAの転写を可能にする配列を含むことが重要であろう。
− 前記ハイブリッド核酸配列を含むDNAベクターの形態。このベクターは、ハイブリッド核酸分子の転写を可能にする手段、特にプロモータおよび付随的には転写を増大する配列(エンハンサー)を含む。このとき、ベクターは、自律的に複製できるように真核生物またはウイルスの複製起点を含み得る円形ベクター、または真核細胞内へのその組込みを刺激するように線形ベクターであり得る。その上、前記ベクターが、例えば非限定的に、
・ ピューロマイシン、ネオマイシン/G148、ブラスチシジンさらにはゼオシンなどの一定の抗生物質に対する耐性を可能にするペプチドをコードする配列、
・ 緑色蛍光タンパク質などの自家蛍光タンパク質のコード配列、または
・ 例えばチミジン・キナーゼなどの、発現する細胞上で負の選択を行なうタンパク質をコードする配列、
など、前記ベクターを自らのゲノム内に組込んだ細胞を選択できるようにするタンパク質をコードする1つ以上の配列を含むことが有利である。
さらに一層有利には、本発明は、前記第1の配列が、その未修飾バージョンにおいて下記配列、
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしている上述の方法に関する。
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしている上述の方法に関する。
ここで問題となっているのは、少なくとも1つのヌクレオチドの削除、または欠失または挿入によって修飾されなければならないハイブリッド核酸分子の第1の配列に対応するこの配列番号1の配列である。
さらに別の実施形態において、本発明は、
− ハイブリッド核酸分子が特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子である場合、その未修飾バージョンにおける前記第1の配列は、
という配列によって表わされるか、あるいは、
− ハイブリッド核酸分子が特に1本鎖リボ核酸分子である場合、その未修飾バージョンにおける前記第1の配列は、
という配列によって表わされる、
以上で定義された方法に関する。
− ハイブリッド核酸分子が特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子である場合、その未修飾バージョンにおける前記第1の配列は、
という配列によって表わされるか、あるいは、
− ハイブリッド核酸分子が特に1本鎖リボ核酸分子である場合、その未修飾バージョンにおける前記第1の配列は、
という配列によって表わされる、
以上で定義された方法に関する。
当該発明者らは、意外なことに、コザック配列の翻訳開始コドンの前にダブレットA(T/U)を挿入すること、またはコザック配列の翻訳開始コドンの後でGをTへ置換することが、突然変異したこれらのコザック配列の制御下での全配列の翻訳効率に対して一定の効果を有していることを確認した。
さらに一層有利には、本発明は、前記第1の配列がその修飾バージョンにおいて、
− ハイブリッド核酸分子が、特に2本鎖のデオキシリボ核酸である場合には、下記配列のいずれか1つ:
かつ
− ハイブリッド核酸分子が、特に1本鎖のリボ核酸である場合には、下記配列のいずれか1つ:
を含むかまたはこれにより構成されているコザック配列である、上述の方法に関する。
− ハイブリッド核酸分子が、特に2本鎖のデオキシリボ核酸である場合には、下記配列のいずれか1つ:
かつ
− ハイブリッド核酸分子が、特に1本鎖のリボ核酸である場合には、下記配列のいずれか1つ:
を含むかまたはこれにより構成されているコザック配列である、上述の方法に関する。
さらに一層有利には、本発明は、前記第1の配列が、その修飾バージョンにおいて、配列番号38〜101の配列のいずれか1つを含むまたはそれにより構成されるコザック配列である、上述の方法に関する。
なお一層有利には、本発明は、前記第1の配列が、その修飾バージョンにおいて、配列番号43、配列番号46、配列番号52、配列番号59、配列番号62、配列番号68、配列番号75、配列番号78、配列番号84、配列番号91、配列番号94および配列番号100の配列のいずれか1つを含むかまたはそれにより構成されるコザック配列である、上述の方法に関する。
本発明は、こうして、有利には、
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 配列番号1を含むかまたは配列番号1で構成され、修飾されている、翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
修飾された前記第1の配列が、配列番号38〜101、特に配列番号43、配列番号46、配列番号52、配列番号59、配列番号62、配列番号68、配列番号75、配列番号78、配列番号84、配列番号91、配列番号94および配列番号100の配列のいずれか1つを含むかまたはそれにより構成される方法に関する。
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 配列番号1を含むかまたは配列番号1で構成され、修飾されている、翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
修飾された前記第1の配列が、配列番号38〜101、特に配列番号43、配列番号46、配列番号52、配列番号59、配列番号62、配列番号68、配列番号75、配列番号78、配列番号84、配列番号91、配列番号94および配列番号100の配列のいずれか1つを含むかまたはそれにより構成される方法に関する。
前述の定義は、変更すべきところは変更して適用される。
こうして、有利には、本発明は、
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
修飾された前記第1の配列が、配列番号38〜101、特に、配列番号43、配列番号46、配列番号52、配列番号59、配列番号62、配列番号68、配列番号75、配列番号78、配列番号84、配列番号91、配列番号94および配列番号100の配列のいずれか1つを含むかまたはそれにより構成される方法に関する。
− 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
修飾された前記第1の配列が、配列番号38〜101、特に、配列番号43、配列番号46、配列番号52、配列番号59、配列番号62、配列番号68、配列番号75、配列番号78、配列番号84、配列番号91、配列番号94および配列番号100の配列のいずれか1つを含むかまたはそれにより構成される方法に関する。
本発明は、さらに一層有利には、前記第2の配列が、スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である18〜10000個のヌクレオチド、特に18〜1000個、詳細には18〜500個、より詳細には18〜100個のスクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である連続するヌクレオチドを含んでいる、上述の方法に関する。
本発明に係る干渉性核酸をスクリーニングする可能性を増加させるためには、低分子干渉性RNAの最小サイズであるヌクレオチド18個未満には決してならない大きいサイズの第3の配列を有するハイブリッド核酸分子を入手することが望ましい。
有利には、本発明は、前記少なくとも1つのペプチドが、ラベル付けされているまたはされていない天然または組換え型のタンパク質、特に自家蛍光タンパク質である、以上で定義された方法に関する。
したがって、第3の配列は、1つ以上のペプチド、特に、ラベル(またはタグ)FLAG、HA、V5、MYC、HISなどの免疫原性ペプチドを用いてラベル付けされ得るか、またはGFP、CFP、RFP、mCherryなどの蛍光タンパク質でラベル付けされ得る1つ以上のタンパク質をコードする。このリストは限定的なものではなく、本発明の範囲を制限することはできない。
より有利には、使用されるペプチドは、配列番号102の配列によりコードされるeGFP、配列番号103の配列によりコードされるマウスサイクリンD1(CD1)、配列番号104の配列によりコードされるマウスHrasタンパク質、または配列番号105の配列によりコードされるエクスポーチン1(XPO)である。有利なラベルは、以下の通りである:配列番号106の配列によりコードされるFLAG(Flag)ラベル、配列番号107の配列によりコードされるHAラベル、配列番号108の配列によりコードされるNtagラベル、配列番号109の配列によりコードされるV5ラベル、配列番号110の配列によりコードされるMycラベル、あるいは配列番号111の配列によりコードされるCtagラベルである。
同様に、本発明の枠内で使用可能なラベル付けされたペプチドは、特に、配列番号112の配列によりコードされるMyc−XPO、配列番号113の配列によりコードされるXPO−V5、配列番号114の配列によりコードされるMyc−XPO−V5、配列番号115の配列によりコードされるHa−CD1である。
本発明は、さらに、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 少なくとも1つの干渉性核酸と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、ハイブリッド核酸分子に関する。
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 少なくとも1つの干渉性核酸と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、ハイブリッド核酸分子に関する。
このようなハイブリッド核酸分子は新規であり、由来およびゲノム局在性が異なる分子のフラグメントで構成された人工的分子であるため、天然には存在しない。
有利には、本発明は、前記第1の配列が、リボソーム内部進入部位つまりIRESまたはキャップ(5’cap)の下流側の、コザックタイプの転写開始配列である、以上で定義されている通りのハイブリッド核酸分子に関する。
別の有利な実施形態において、本発明は、前記第1の配列が、その未修飾バージョンにおいて下記配列、
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしている、上述のハイブリッド核酸分子に関する。
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしている、上述のハイブリッド核酸分子に関する。
有利には、本発明は、前記第1の配列が、その未修飾バージョンにおいて、配列番号4〜配列番号35の配列の1つを含むかまたはそれにより構成されているコザック配列である、上述のハイブリッド核酸分子に関する。
別の有利な実施形態において、本発明は、修飾された前記第1の配列が、
− ハイブリッド核酸分子が、特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子である場合には、配列番号38〜69の配列のいずれか1つ、
− ハイブリッド核酸分子が、特に1本鎖のリボ核酸分子である場合には、配列番号70〜101の配列のいずれか1つ、
の中から選択される、以上で定義された通りのハイブリッド核酸分子に関する。
− ハイブリッド核酸分子が、特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子である場合には、配列番号38〜69の配列のいずれか1つ、
− ハイブリッド核酸分子が、特に1本鎖のリボ核酸分子である場合には、配列番号70〜101の配列のいずれか1つ、
の中から選択される、以上で定義された通りのハイブリッド核酸分子に関する。
さらに一層有利には、本発明は、前記核酸分子が配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127および配列番号128の配列分子の中から選択される、以上で定義されたハイブリッド核酸分子に関する。
上記表中、突然変異したバージョンでの第1の配列は、枠に囲まれて示されている。
ハイブリッド核酸分子のこれらの例は、非限定的に、本発明により網羅されている異なる可能性を例示しており、例えば:
− 配列番号128の配列中、第1の配列は枠で囲まれ、第2の配列は第1の配列の3’にあり、第3の配列は、第1の配列の5’にある。このハイブリッド核酸分子は、理想的には、ペプチドFLAGの発現を増大させる核酸を選択することを可能にする。
− 配列番号126または125の配列中、第1の配列は枠で囲まれ、第2の配列は第1の配列の3’にあり、第3の配列は、第2の配列の3’にある。このハイブリッド核酸分子は、理想的には、それぞれペプチドHAまたはFLAGの発現を増大させる核酸を選択することを可能にする。
− 配列番号128の配列中、第1の配列は枠で囲まれ、第2の配列は第1の配列の3’にあり、第3の配列は、第1の配列の5’にある。このハイブリッド核酸分子は、理想的には、ペプチドFLAGの発現を増大させる核酸を選択することを可能にする。
− 配列番号126または125の配列中、第1の配列は枠で囲まれ、第2の配列は第1の配列の3’にあり、第3の配列は、第2の配列の3’にある。このハイブリッド核酸分子は、理想的には、それぞれペプチドHAまたはFLAGの発現を増大させる核酸を選択することを可能にする。
当然のことながら、以上で言及されている通り、第2および第3の配列は重ね合わされてよい。すなわち、第2の配列の一部分は、第3の配列に対応する。したがって、同様に、配列番号116〜128の配列により例示されるハイブリッド核酸分子は、マウスまたはヒトのサイクリンD1タンパク質さらにはRasタンパク質に対する干渉性核酸を選択することを可能にする。
上述の配列の各々は、(配列番号の下の)その名称中でSTOP(配列番号125および126の配列中で強調されているコドン)と記載されていない場合には、終止コドンTAG、TAAまたはTGAによって終結される。
塩基の相補性のため、当業者は、RNAについての上述の配列の対応を決定することができる。
有利には、上述のハイブリッド核酸分子は、ベクター内、特に真核生物ベクター内に含まれる。
より有利には、ベクターは本質的に、以下の配列で構成される:特に配列番号129または130の配列の1つにより表わされるpBABE、または特に配列番号131の配列によって表わされるMSCV。
その上、本発明は、以上で定義された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子を含む真核細胞に関する。本発明は同様に、以上で定義された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子を含む動物、特に哺乳動物、詳細にはゲッ歯類にも関する。
本発明は、RNA干渉能力を有するあらゆるタイプの真核細胞を包含する。当業者であれば、インビトロで培養された真核細胞についての自らの一般的知識を用いて、適切な細胞を容易に識別し、それに対し以上に定義された核酸分子を導入するための形質転換またはトランスフェクション方法を決定することができる。
本発明はさらに、
− 先に定義された通りの、翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 先に定義された通りの、第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
さらに、干渉性核酸と相補的な配列を有する核酸分子の挿入を可能にする、制限酵素による少なくとも1つの切断部位と、
を含む中間ハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、中間ハイブリッド核酸分子に関する。
− 先に定義された通りの、翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 先に定義された通りの、第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
さらに、干渉性核酸と相補的な配列を有する核酸分子の挿入を可能にする、制限酵素による少なくとも1つの切断部位と、
を含む中間ハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、中間ハイブリッド核酸分子に関する。
有利には、本発明は、前記第1の配列が、その未修飾バージョンにおいて下記配列、
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしており、かつ特に前記第1の配列が、その修飾バージョンにおいて配列番号4または配列番号5の配列の1つを含む、またはそれにより構成されるコザック配列である、上述の分子に関する。
により表わされるコザック配列であり、ここでRはプリン、sはGまたはC、mはA/UまたはCを表わしており、かつ特に前記第1の配列が、その修飾バージョンにおいて配列番号4または配列番号5の配列の1つを含む、またはそれにより構成されるコザック配列である、上述の分子に関する。
この中間ハイブリッド核酸分子は、実際には、上述のハイブリッド核酸分子の基本構造であり、前記制限酵素による少なくとも1つの切断部位は、前記遺伝子の発現および/または前記遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性を増大させる干渉性核酸をスクリーニングすることが望ましい遺伝子に応じて、前記第2の配列のクローニングを可能にする。
本発明は同様に、遺伝子の発現および/または遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性を増大させる干渉性核酸の、特にインビトロでのスクリーニングのための、先に定義された通りの少なくとも1つの核酸分子の使用に関する。
その上、本発明は、
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
− 少なくとも1つの真核細胞と、
を含むキットまたはパッケージにも関する。
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
− 少なくとも1つの真核細胞と、
を含むキットまたはパッケージにも関する。
本発明に係るパッケージまたはキットは同様に、
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
− 前記ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換手段と、
を含むこともできる。
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
− 前記ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換手段と、
を含むこともできる。
本発明に係るパッケージまたはキットは同様に、
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
○前記ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換手段および/または
○RNA干渉能力を有する少なくとも1つの真核細胞と、
を含むこともできる。
− 先に説明された通りの少なくとも1つのハイブリッド核酸分子と、
○前記ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換手段および/または
○RNA干渉能力を有する少なくとも1つの真核細胞と、
を含むこともできる。
使用される形質転換手段は、リン酸カルシウムでの細胞の形質転換手段、リポゾームでの形質転換手段、ポリカチオン性作用物質での形質転換手段、さらにはエレクトロロケーションまたはヌクレオフェクションによる形質転換手段であり得る。
本発明は同様に、
− 真核細胞内に含まれている、以上で定義された通りの少なくとも1つの核酸分子と、
− 干渉性核酸による前記細胞の形質転換手段と、
を含むキットまたはパッケージにも関する。
− 真核細胞内に含まれている、以上で定義された通りの少なくとも1つの核酸分子と、
− 干渉性核酸による前記細胞の形質転換手段と、
を含むキットまたはパッケージにも関する。
以上の記述全体において、細胞の「形質転換」なる用語は、考慮対象の真核細胞内への外因性核酸分子の導入の意味で使用されている。したがって、当業者であれば、この形質転換なる概念が、技術的現状において一般的に使用されている「トランスフェクション」の概念に対応していることを理解するものであろう。
本発明は、以下で説明する図および実施例に照らして、より良く理解することができる。
実施例1:配列番号37の第1の配列(AT挿入)を含むハイブリッド核酸分子の構築体の例
配列番号36の配列により表わされる突然変異した第1の配列を含む構築体を得るために、当該発明者らは、GeneArt(登録商標)(Life technology)キットを使用し、供給業者の使用説明書にしたがって、PCRによりジヌクレオチドATを配列番号9のコザック配列内に導入することで、定方向突然変異誘発戦略を利用した。
配列番号36の配列により表わされる突然変異した第1の配列を含む構築体を得るために、当該発明者らは、GeneArt(登録商標)(Life technology)キットを使用し、供給業者の使用説明書にしたがって、PCRによりジヌクレオチドATを配列番号9のコザック配列内に導入することで、定方向突然変異誘発戦略を利用した。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、以下の条件で行なわれる:
ステップ1: マトリックス・プラスミドのメチル化:37℃で20分間
ステップ2: PCR/突然変異誘発
a 95℃で2分間のサイクル1回
b 95℃で30秒間のサイクル1回
60℃で30秒間のサイクル1回
68℃で4分間のサイクル1回
c bへの戻り、35回
d 68℃で5分間のサイクル1回
e 反応産物を保存するため、4℃で不定の時間にわたるサイクル1回
ステップ1: マトリックス・プラスミドのメチル化:37℃で20分間
ステップ2: PCR/突然変異誘発
a 95℃で2分間のサイクル1回
b 95℃で30秒間のサイクル1回
60℃で30秒間のサイクル1回
68℃で4分間のサイクル1回
c bへの戻り、35回
d 68℃で5分間のサイクル1回
e 反応産物を保存するため、4℃で不定の時間にわたるサイクル1回
このようにして得たPCR産物はこのとき配列決定され、配列番号59の配列を含むベクターが選択される。
図2は、配列決定の結果を示す。
実施例2:配列番号36の第1の配列(GからTへの置換)を含むハイブリッド核酸分子の構築体例
ATG直後に位置するGをTに置換することにより突然変異した第1の配列を含むハイブリッド核酸分子を得るためには:
1. Gに代ってT(例えばFlagに代ってHA)で始まるタグをもってくることによりタグを置き換えること、または
2. Tから始まるコドンによりコードされたアミノ酸を付加するためにトリプレット(1コドン)の挿入を行なうこと。後続するレポーター・ペプチドの翻訳のリーディング・フレームを保つためには、3個(または3の倍数個)の塩基を付加しなければならない。
ATG直後に位置するGをTに置換することにより突然変異した第1の配列を含むハイブリッド核酸分子を得るためには:
1. Gに代ってT(例えばFlagに代ってHA)で始まるタグをもってくることによりタグを置き換えること、または
2. Tから始まるコドンによりコードされたアミノ酸を付加するためにトリプレット(1コドン)の挿入を行なうこと。後続するレポーター・ペプチドの翻訳のリーディング・フレームを保つためには、3個(または3の倍数個)の塩基を付加しなければならない。
実施例3:ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換例
行なうべき実験に応じて、以下のような複数のトランスフェクション技術を用いることができる:
a. リポフェクタミン(登録商標)3000(Invitrogen)でのトランスフェクション:
この方法は、ハイブリッド核酸構築体を用いて一時的に細胞を急速にトランスフェクトすることを可能にする。トランスフェクションは供給業者の使用説明書にしたがって実施される。
b. 有利な構築体を含むウイルスの産生後のウイルス感染:
本発明に係るハイブリッド核酸分子を安定した形で発現する細胞を得るために、当該発明者らは、ウイルス感染を利用した。
行なうべき実験に応じて、以下のような複数のトランスフェクション技術を用いることができる:
a. リポフェクタミン(登録商標)3000(Invitrogen)でのトランスフェクション:
この方法は、ハイブリッド核酸構築体を用いて一時的に細胞を急速にトランスフェクトすることを可能にする。トランスフェクションは供給業者の使用説明書にしたがって実施される。
b. 有利な構築体を含むウイルスの産生後のウイルス感染:
本発明に係るハイブリッド核酸分子を安定した形で発現する細胞を得るために、当該発明者らは、ウイルス感染を利用した。
使用されるプロトコルは以下の通りである:
1日目:指数関数的成長中の3×106個の293T細胞を、10mLの完全培地(DMEM、ウシ胎児血清10%、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびL−グルタミン)の入った100mm入りのボックス内に播種し、一晩中37℃でインキュベートする。
1日目:指数関数的成長中の3×106個の293T細胞を、10mLの完全培地(DMEM、ウシ胎児血清10%、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびL−グルタミン)の入った100mm入りのボックス内に播種し、一晩中37℃でインキュベートする。
2日目:トランスフェクションの2〜3時間前に、培地を交換してpH変動を制限する。
管内に、以下のプラスミドを順番に添加する:
− ハイブリッド核酸分子を含むMSCVベクターまたはレトロウイルスベクター、12μg、
− Gag−polプラスミド、6μg、
− Ecoプラスミド(GMO操作に関連する安全上の理由で使用される、マウス細胞に特異的なウイルス認識タンパク質)、2μg。
− ハイブリッド核酸分子を含むMSCVベクターまたはレトロウイルスベクター、12μg、
− Gag−polプラスミド、6μg、
− Ecoプラスミド(GMO操作に関連する安全上の理由で使用される、マウス細胞に特異的なウイルス認識タンパク質)、2μg。
その後、500μLの滅菌水をベクターに添加する。次に500μLの2×HBS緩衝液を添加し、全体を撹拌するが、それでもヴォルテックス撹拌は行わない。最後に、pH5.5のCaCl2溶液50μLを添加し、混合物を撹拌するが、それでもヴォルテックス撹拌は行わない。HSB2×培地は、以下のように調製する:すなわち0.8gのNaCl、0.027gのNa2HP04・2H2Oおよび1.2gのHEPESを90mlの体積の精製水中に溶解させる。0.5NのNaOHを用いてpHを7.05に調製し、精製水で体積を100mLに調整する。0.22μmの孔を有するフィルターを通してろ過することによって溶液を滅菌し、溶液を5mLのアリコートにしてから、最長1年間にわたり−20℃で凍結させる。
混合物を、随時穏やかに撹拌しながら、周囲温度で20〜30分間放置する。
その後、混合物を培地に添加し、細胞を一晩中37℃でインキュベートする。
3日目:3日目の朝、培地の約半分を交換する。その後、培地を4℃で保存する。この作業を6時間おきに繰り返し、上清を4℃で保存する。夜間に上清を混合し、場合によって一晩中、10000rpmで遠心分離する。
4日目:ウイルスを回収し、培地を昼間3回交換して、ウイルスを感染性のまま維持する。
5日目:0.45μmのフィルター上でウイルスをろ過し、8μg/mLのポリブレンを含む1.5〜2mLの体積内で1〜2時間NIH3T3細胞を感染させるために使用する。次に、10mLの培地を添加し、細胞を一晩中インキュベートする。
6日目:10mLの新鮮培地で、培地を交換する。
8日目および9日目:このとき、蛍光タンパク質の発現を試験するためにフローサイトメトリによって細胞を分析する。
このとき、細胞は分子によって感染させられている。
実施例4:遺伝子の発現および/または遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性を増大させる干渉性核酸分子のスクリーニング例
1−プロトコル
− 細胞の培養
○ ハイブリッド核酸構築体を発現する安定した細胞を、CO2が5%のインキュベータ内において37℃でサブコンフルエント培養状態に維持する。
1−プロトコル
− 細胞の培養
○ ハイブリッド核酸構築体を発現する安定した細胞を、CO2が5%のインキュベータ内において37℃でサブコンフルエント培養状態に維持する。
− プレート固定
スクリーニングすべきsiRNAのトランスフェクションの朝に、ハイブリッド構築体を発現するストック細胞をトリプシンで処理して、培養支持体から剥離させ、24ウェルプレートの形に播種して、夜に40〜80%の付着細胞コンフルエンシーを達成する。
スクリーニングすべきsiRNAのトランスフェクションの朝に、ハイブリッド構築体を発現するストック細胞をトリプシンで処理して、培養支持体から剥離させ、24ウェルプレートの形に播種して、夜に40〜80%の付着細胞コンフルエンシーを達成する。
− siRNAの調製およびトランスフェクション
試験すべきsiRNAを、リポフェクタミン(登録商標)RNAiMAX試薬(Life technologies)プロトコルにしたがって調製する。簡潔には、25μLのOPTI−MEM(登録商標)培地中に1.5μLのリポフェクタミン(登録商標)を希釈する。並行して、0.5μLの滅菌水中の5pmolのsiRNAを25μLのOPTI−MEM(登録商標)培地中に希釈する。その後、OPTI−MEM(登録商標)の2つの溶液を混合し、5分間周囲温度でインキュベートする。
試験すべきsiRNAを、リポフェクタミン(登録商標)RNAiMAX試薬(Life technologies)プロトコルにしたがって調製する。簡潔には、25μLのOPTI−MEM(登録商標)培地中に1.5μLのリポフェクタミン(登録商標)を希釈する。並行して、0.5μLの滅菌水中の5pmolのsiRNAを25μLのOPTI−MEM(登録商標)培地中に希釈する。その後、OPTI−MEM(登録商標)の2つの溶液を混合し、5分間周囲温度でインキュベートする。
その後、50μLの先行する混合物を各ウェル内に添加する。細胞を翌日まで37℃でインキュベートする。
− 結果の分析
翌日、細胞をPBSで清浄し、次に溶解緩衝液(TRIS 10mM pH=8、EDTA 1mM、NP−40 0.05%、+/−プロテアーゼ阻害剤−ROCHE−cOmplete)および15秒間の活発な音波処理(器具の最大出力)とそれに続く15秒間の休止で構成される5サイクルのバイオラプタ(Dlagenode)音波処理の割合での音波処理ステップを用いて細胞を溶解させて、細胞内タンパク質、特にハイブリッド配列によって産生される融合タンパク質を回収する。その後、試験された異なる条件のタンパク質溶解物を、DNAまたはタンパク質の定量化を用いて正規化して、異なる処理条件に由来する材料の等価総量を比較する。その後、正規化された溶解物を、ハイブリッド構築体の翻訳産物の特異的抗体を用いたウエスタンブロット法で、またはハイブリッド構築体の翻訳産物が許容する場合にはFRETまたは蛍光測定で分析する。
翌日、細胞をPBSで清浄し、次に溶解緩衝液(TRIS 10mM pH=8、EDTA 1mM、NP−40 0.05%、+/−プロテアーゼ阻害剤−ROCHE−cOmplete)および15秒間の活発な音波処理(器具の最大出力)とそれに続く15秒間の休止で構成される5サイクルのバイオラプタ(Dlagenode)音波処理の割合での音波処理ステップを用いて細胞を溶解させて、細胞内タンパク質、特にハイブリッド配列によって産生される融合タンパク質を回収する。その後、試験された異なる条件のタンパク質溶解物を、DNAまたはタンパク質の定量化を用いて正規化して、異なる処理条件に由来する材料の等価総量を比較する。その後、正規化された溶解物を、ハイブリッド構築体の翻訳産物の特異的抗体を用いたウエスタンブロット法で、またはハイブリッド構築体の翻訳産物が許容する場合にはFRETまたは蛍光測定で分析する。
2− 結果
a− AT挿入による突然変異
最初の一連の実験において、当該発明者らは、配列番号220のハイブリッド核酸分子を使用することによって、本発明に係る干渉性分子のスクリーニングを実施した。この分子中で、第1の配列は、
であり、
第2の配列は、
であり、FLAG−インターカラント−HA−インターカラントの連鎖に対応し、
第3の配列は、以下のものである:
a− AT挿入による突然変異
最初の一連の実験において、当該発明者らは、配列番号220のハイブリッド核酸分子を使用することによって、本発明に係る干渉性分子のスクリーニングを実施した。この分子中で、第1の配列は、
であり、
第2の配列は、
であり、FLAG−インターカラント−HA−インターカラントの連鎖に対応し、
第3の配列は、以下のものである:
読み易さのために、図3は、試験される異なる干渉性核酸(siRNA)が配列番号120の分子配列上にあるアラインメントを表わしている。
ウエスタンブロット法により得た結果は、図4に表わされている。
この図から、試験された異なるsiRNAのうち、siRNA Flag M(配列番号154)が、非関連対照で観察されたレベルよりも高いマーカーペプチドCD1の発現レベルの検出を可能にすることが確認できる。
第3の配列の位置が、発現を増大させる干渉性核酸のスクリーニングに対して影響を及ぼさないことを確認するために、当該発明者らは、配列番号118のハイブリッド核酸分子を使用した。
ウエスタンブロット法により得た結果は、図5に表わされている。
この図から、試験された異なるsiRNAのうち、siRNA Flag N(配列番号146)およびsiRNA HA−CT(配列番号145)が、非関連対照で観察されたレベルよりも高いマーカーペプチドCD1の発現レベルの検出を可能にすることが確認できる。
最後に、当該発明者は、突然変異を受けていない第1の配列(配列番号136)を有するハイブリッド核酸分子の存在下での干渉性核酸の効果を比較することによって突然変異した第1の配列を有するハイブリッド核酸分子のみが、干渉性核酸分子のスクリーニングを可能にすることを確認した。
ウエスタンブロット法によって得た結果は、図6Aおよび6Bに表わされている。
この実験から、siRNA FLAG M(配列番号154)は、ハイブリッド核酸分子がその第1の配列内に突然変異を含んでいる場合のみにCD1の発現レベルの増大を検出でき(図6A)、第1の配列が突然変異していない場合にはこれを検出できない(図6B)こと、が確認される。
b− GからTへの置換による突然変異
第2の一連の実験において、当該発明者らは、配列番号121のハイブリッド核酸分子を使用することによって、本発明に係る干渉性分子のスクリーニングを実施した。この分子中で、第1の配列は、
である。
第2の一連の実験において、当該発明者らは、配列番号121のハイブリッド核酸分子を使用することによって、本発明に係る干渉性分子のスクリーニングを実施した。この分子中で、第1の配列は、
である。
ウエスタンブロット法により得た結果は、図8に表わされている。
この図から、試験された異なるsiRNAのうち、siRNA Flag M(配列番号154)が、非関連対照で観察されたレベルよりも高いマーカーペプチドCD1の発現レベルの検出を可能にすることが確認できる。したがって、配列番号120のハイブリッド核酸分子について得られたものと同じ結果が観察される。
当該発明者らは、突然変異を受けていない第1の配列(配列番号136)を有するハイブリッド核酸分子の存在下での干渉性核酸の効果を比較することによって突然変異した第1の配列を有するハイブリッド核酸分子のみが、干渉性核酸分子のスクリーニングを可能にすることを確認した。
ウエスタンブロット法によって得た結果は、図9に表わされている。
この実験から、siRNA FLAG M(配列番号154)は、ハイブリッド核酸分子がその第1の配列内に突然変異を含んでいる場合のみにCD1の発現レベルの増大を検出できることが確認される。
結論として、特にGからTへの置換またはATジヌクレオチドATの挿入による突然変異した第1の配列を含むハイブリッド核酸分子のみが、発現を増大させる干渉性核酸分子スクリーニングを可能にする。
実施例5:検出手段としてFRETを用いたスクリーニングの例
夜間にsiRNAでのトランスフェクションの60%のコンフルエンスを達成するように、朝方24ウェルプレートに、配列番号120の構築体を安定した形で発現する細胞を播種した。夜間に、ウェルあたり10mMのsiRNAの割合で、細胞をリポフェクタミン(RNAimax−供給業者の手順)でトランスフェクトした。異なるsiRNA(実施例4を参照)を試験して、目的トランス遺伝子の発現に対するそれぞれの影響を評価した。翌朝、細胞を、PBSで1回洗浄し、緩衝液(TRIS 10mM pH=8、EDTA 1mM、0.05% NP−40、+プロテアーゼ阻害剤)100マイクロリットル中に溶解させ、エッペンドルフ型管内に収集し、その後Diagenodeブランドの浴型音波処理器内において、15秒間の活発な音波処理(最大出力)とそれに続く15秒間の休止で構成される5サイクルの割合での音波処理に付した。次に、細胞溶解物を4℃、15000rcfで5分間遠心分離する。
夜間にsiRNAでのトランスフェクションの60%のコンフルエンスを達成するように、朝方24ウェルプレートに、配列番号120の構築体を安定した形で発現する細胞を播種した。夜間に、ウェルあたり10mMのsiRNAの割合で、細胞をリポフェクタミン(RNAimax−供給業者の手順)でトランスフェクトした。異なるsiRNA(実施例4を参照)を試験して、目的トランス遺伝子の発現に対するそれぞれの影響を評価した。翌朝、細胞を、PBSで1回洗浄し、緩衝液(TRIS 10mM pH=8、EDTA 1mM、0.05% NP−40、+プロテアーゼ阻害剤)100マイクロリットル中に溶解させ、エッペンドルフ型管内に収集し、その後Diagenodeブランドの浴型音波処理器内において、15秒間の活発な音波処理(最大出力)とそれに続く15秒間の休止で構成される5サイクルの割合での音波処理に付した。次に、細胞溶解物を4℃、15000rcfで5分間遠心分離する。
上清を回収し、1リットルにつき100マイクログラムのDNAの割合で(ナノドロップでの定量によるDNA濃度の測定またはBredford方法によるタンパク質濃度の測定の後に)各試料のDNA(および/またはタンパク質)の類似の濃度での調整の後、1ウェルあたり5マイクロリットルを、384ウェルのボックス(Greiner−#784076)にトリプリケートで入れる。5マイクロリットルのドナー抗体(CISBIO−#610HATAB)およびアクセプタ抗体(CISBIO−#61FG2XLB)の、供給業者(CISBIO)の使用説明書にしたがった混合物を、各ウェルに添加し、それに続いて遮光状態において、周囲温度で1時間インキュベートする。目的トランス遺伝子により産生されたTAGに対して向けられたドナーとアクセプタの間のFRET(FlagおよびHA)に由来する蛍光の読取りを、供給業者の使用説明書にしたがってHTRF装置(PHERAstar FS−BMG LABTECH)を用いて実施する。FRETを有していない対照群(FRETシグナルを生成する能力を有するTAGを含んでいない溶解物)との関係におけるデータの正規化の後、対照群のsiRNA(T.)と比べたシグナルの10%の増大が、目的トランス遺伝子の発現の増大のために有意であるとみなされる。
結果は、図7に標示されている。
FRETの定量的結果は、干渉性核酸分子F−N(配列番号148;B)、Flag(配列番号148および149;DおよびE)、FLAG Cter(配列番号156;J)、F−M(配列番号154;L)およびHA3(配列番号140;P)が発現を増大させることを示している。
これらのデータ全体は、本発明に係る方法により遺伝子の発現を増大させる干渉性核酸分子スクリーニングが可能になることを示している。
実施例6:根本的機序の決定
上述の通り、遺伝子発現を増大させる干渉性核酸分子のスクリーニングには、既定の突然変異を有するコザック配列の使用が必要であることが確認される。このようなコザック配列は、それが制御する遺伝子の発現を削減する、すなわちタンパク質の翻訳を削減する効果を有する。
上述の通り、遺伝子発現を増大させる干渉性核酸分子のスクリーニングには、既定の突然変異を有するコザック配列の使用が必要であることが確認される。このようなコザック配列は、それが制御する遺伝子の発現を削減する、すなわちタンパク質の翻訳を削減する効果を有する。
したがって、最初、当該発明者らは、
− 特に配列番号12により表わされる、サイクリンD1のマウスコザック配列(mKoz)、
− 配列番号9により表わされる、本発明に係るAT挿入を有するサイクリンD1のマウスコザック配列(mKozAT)、および
− 配列番号62の配列の、最適化されたサイクリンD1のコザック配列(KozOPT)
によりそのタンパク質発現が制御されるサイクリンD1タンパク質のタンパク質発現レベルを比較した。
− 特に配列番号12により表わされる、サイクリンD1のマウスコザック配列(mKoz)、
− 配列番号9により表わされる、本発明に係るAT挿入を有するサイクリンD1のマウスコザック配列(mKozAT)、および
− 配列番号62の配列の、最適化されたサイクリンD1のコザック配列(KozOPT)
によりそのタンパク質発現が制御されるサイクリンD1タンパク質のタンパク質発現レベルを比較した。
サイクリンD1の内因性遺伝子(Ccnd1−/−)が備わっておらず、かつmKoz−Ntag−CycD1またはmKozAT−Ntag−CycD1(配列番号120)またはKozOPT−Ntag−CycD1を安定した形で発現するマウス線維芽細胞の細胞系統を、1日目の朝に播種し、5%で安定した率のCO2と共に37℃のインキュベータ内で培養して、翌日およそ80%の細胞コンフルエンスに達するようにした。この段階で、当該系統を収集して、そこからタンパク質(溶解緩衝液=Tris 10mM、EDTA1mMおよびNP−40、0.05%)または全RNAをトリゾールで抽出した。
タンパク質溶解物を次に、Bradford方法により総タンパク質等価濃度で正規化し、その後、アクチンまたはサイクリンD1に対してウエスタンブロット法で分析した。これらの試料を、実施例5に記載のタンデム−HTRF方法によっても分析した。
得られた結果は、図10および図11に提示されている。
結果は、野生型mKoz配列に比べた、または人工的配列KozOPTに比べた、mKozAT由来の発現の低減を示している。したがって、これは、突然変異したコザック配列がタンパク質発現を減少させる効果を有することを意味している。
逆転写により相補的DNA(cDNA)を生成するためにメセンジャーRNAを使用し、次にこれらのcDNAを定量的PCR(qPCR)で分析した。mKoz−Ntag−CycD1またはmKozAT−Ntag−CycD1またはKozOPT−Ntag−CycD1由来のメセンジャーRNAの比率を、ハウスキーピング遺伝子(Hprt、B2M、Trfr1、TubbおよびGapdh)を用いることによって、正規化の後のqPCRにしたがって評価した。
結果は、図12に提示されている。
Ntag−CycD1についてのメセンジャーRNAの比率は、mKoz−Ntag−CycD1またはmKozAT−Ntag−CycD1またはKozOPT−Ntag−CycD1系統間において匹敵するものである(スチューデント検定によるグループ間の偏差は有意なものではない)と思われる。
したがって、発現レベルも同様に翻訳レベルに変調される。
実施例7:本発明のsiRNAのスクリーニングの枠内でのコザック配列の比較
突然変異したコザック配列の重要性を確認するために、当該発明者らは、最後に、以下の異なる構築体から、異なるsiRNAの効果(発現の増大または減少)を試験した:
− マウスコザックの制御下でN末端において、AT挿入を有するサイクリンD1(Ntag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でN末端において、サイクリンD1(Ntag−mKoz)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でC末端において、サイクリンD1 AT(Ctag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でC末端において、AT挿入を有するサイクリンD1(Ctag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、および
− マウスコザックの制御下でN末端において、発現を増大させるために最適化されたサイクリンD1(Ntag−KozOPT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体。
突然変異したコザック配列の重要性を確認するために、当該発明者らは、最後に、以下の異なる構築体から、異なるsiRNAの効果(発現の増大または減少)を試験した:
− マウスコザックの制御下でN末端において、AT挿入を有するサイクリンD1(Ntag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でN末端において、サイクリンD1(Ntag−mKoz)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でC末端において、サイクリンD1 AT(Ctag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、
− マウスコザックの制御下でC末端において、AT挿入を有するサイクリンD1(Ctag−mKozAT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体、および
− マウスコザックの制御下でN末端において、発現を増大させるために最適化されたサイクリンD1(Ntag−KozOPT)を用いてサイクリンD1ラベル付けされた構築体。
図7で試験した複数のsiRNA、すなわち配列番号149/150、配列番号155、配列番号154および配列番号142を使用した。
比較試験は、図13に提示されている。
これらのデータは、コザック配列の如何に関わらず、発現を減少させるsiRNAがつねに、そのようなものとして同定されることを示している。これに対し発現を増大させるsiRNAは、レポーターが、(ここではAT挿入を有する)突然変異したコザック配列の制御下に置かれた場合に、一貫して同定される。
これらの結果全体は、本発明に係る遺伝子の発現を増大させるsiRNAのスクリーニングにおけるレポーターの翻訳を調節する領域の重要性を確認するものである。
本発明は、提示された実施形態に限定されず、当業者には、他の実施形態が明確に現われるものである。
Claims (12)
- − 遺伝子の発現および/または、
− 遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性、
を増大させる干渉性核酸のスクリーニング方法において、
前記干渉性核酸が、少なくとも部分的に、前記遺伝子または前記RNAと配列相補性を有する方法であって、
− 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− スクリーニングすべき前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子を、特にRNAに対する干渉を行なうことのできる真核細胞内に導入するステップを含み、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、方法。 - ハイブリッド核酸分子が、前記第3の配列の上流側に位置づけされた前記第1の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子が、場合によって1つのベクター内に含まれる特に2本鎖のデオキシリボ核酸分子、または特に1本鎖のリボ核酸分子である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1の配列が、その修飾バージョンにおいて配列番号4または配列番号5の配列の1つを含む、またはそれにより構成されるコザック配列である、請求項1、2または3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記第2の配列が、前記干渉性核酸の配列と少なくとも部分的に相補的である18〜10000個のヌクレオチドを含む、請求項1から5のいずれか1つに記載の方法。
- − 翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 少なくとも1つの干渉性核酸と少なくとも部分的に相補的である第2の配列と、
− 第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
を含むハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、ハイブリッド核酸分子。 - 前記核酸分子が、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127および配列番号128の配列の分子の中から選択される、請求項7に記載のハイブリッド核酸分子。
- 請求項7または請求項8に記載の少なくとも1つのハイブリッド核酸分子を含む真核細胞。
- − 請求項7または請求項8に記載の少なくとも1つの核酸分子と、
− 少なくとも1つの真核細胞および/または前記ハイブリッド核酸分子による真核細胞の形質転換手段と、
を含むキット。 - − 請求項1に記載の、翻訳を開始することを目的とする第1の非コード配列と、
− 請求項1に記載の、第1の配列のシス翻訳制御下にあり、少なくとも1つの既定のペプチドをコードする第3のヌクレオチド配列と、
− 干渉性核酸と相補的な配列を有する核酸分子の挿入を可能にする、制限酵素による少なくとも1つの切断部位と、
を含む中間ハイブリッド核酸分子において、
前記第1の配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失または付加により修飾され、こうして前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルが、特に最適なその未修飾バージョンにおける前記第1の配列の制御下での前記少なくとも1つのペプチドの翻訳レベルに比べて少なくとも10%低減されるようになっている、中間ハイブリッド核酸分子。 - 遺伝子の発現および/または遺伝子および/または前記遺伝子の転写リボ核酸の活性を増大させる干渉性核酸のスクリーニングのための、請求項7または請求項8、または請求項11に記載の少なくとも1つの核酸分子の使用。
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