WO2005021752A1 - 機能的ヌクレオチド分子の検索方法 - Google Patents

機能的ヌクレオチド分子の検索方法 Download PDF

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WO2005021752A1
WO2005021752A1 PCT/JP2004/012172 JP2004012172W WO2005021752A1 WO 2005021752 A1 WO2005021752 A1 WO 2005021752A1 JP 2004012172 W JP2004012172 W JP 2004012172W WO 2005021752 A1 WO2005021752 A1 WO 2005021752A1
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rna
protein
nucleotide
sequence
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PCT/JP2004/012172
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Takashi Ueno
Masashige Tanabe
Risa Sumioka
Eiji Kobayashi
Nobuto Koyama
Hiroaki Sagawa
Junichi Mineno
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a universal search method for nucleic acids that can effectively suppress gene expression. Further, the present invention relates to a nucleic acid construct and a vector used in the method, and a kit for the method.
  • the expression level of a protein is controlled by various methods. For example, by controlling the transcription of mRNA into gene power by transcription factors, controlling the translation of mRNA into amino acid sequence, and controlling the stability of mRNA against degradation of mRNA by nuclease, cells always maintain the target expression level. I control it.
  • Methods for artificially suppressing the expression level of a protein at the mRNA stage include suppression of mRNA by antisense RNA, degradation of mRNA by ribozyme, RNAi (RNA interference), and the like.
  • RNAi RNA interference
  • the inhibitory effects thereof differ significantly depending on which region of the nucleic acid sequence encoding the protein and the surrounding nucleic acid sequence is targeted (for example, Non-Patent Document 1).
  • a method of confirming the expression level of a protein a fusion protein of a target protein and a reporter protein is usually synthesized, and the expression level of the protein is estimated using the reporter protein as an index.
  • the reporter gene is in a translatable form, and the nucleic acid sequence encoding the adjacent target protein is not translated, and the linked DNA is known.
  • Nils en TW et al. Constructed a DNA that expresses a fusion protein in which a target protein and a reporter protein were fused downstream thereof, and examined the expression of the reporter protein to determine the expression of the target nucleic acid sequence.
  • the search for ribozymes and the like that can be effectively suppressed is being conducted (for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it is not easy to express a functional fusion protein, and it is unlikely that the fusion protein will lose its function as a protein due to fusion. Not lost.
  • Patent Document 1 US Patent Application Publication No. 2002/0002278
  • Non-Patent Document 1 Nature Medicine Vol. 9 No. 3 p. 347 (2003)
  • An object of the present invention is to provide a method for searching for a functional nucleotide molecule that changes the expression of a target gene and that can universally correspond to more nucleic acid sequences.
  • the present inventors have conducted intensive research and search and have found that the nucleic acid construct has one promoter sequence, at least two gene sequences, and a poly A signal sequence,
  • the gene sequence is transcribed as a single molecule of RNA, at least
  • nucleic acid construct By constructing a nucleic acid construct in which one gene sequence is in a translatable form and at least one gene sequence is encoded in a substantially untranslated form, it can universally accommodate more nucleic acid sequences, and It has been found that it is possible to search for a molecule that can change the expression of a S-encoding protein that cannot be translated by altering its stability. Furthermore, they have found that the above-described nucleic acid construct can universally cope with more nucleic acid sequences, and have completed the present invention.
  • the first invention of the present invention comprises a promoter sequence, a nucleotide sequence 1J encoding at least one protein translatably linked to the sequence, and poly A A nucleic acid construct having a signal sequence,
  • the nucleic acid construct contains an untranslated nucleotide sequence between the promoter sequence and the polyA signal sequence that differs from the nucleotide sequence encoding the polypeptide.
  • a nucleotide sequence encoding a protein that is translatably linked to a promoter sequence and a nucleotide sequence that is different from the nucleotide sequence that is not translated are linked so as to be transcribed as one molecule of RNA from the nucleic acid construct.
  • nucleic acid construct is characterized in that the nucleotide sequence is not selected from the following:
  • the nucleic acid construct may be a nucleic acid construct located downstream of a nucleotide sequence encoding a protein translatably linked to a non-translated nucleotide sequence promoter sequence.
  • Non-translated nucleotide sequence S promoter
  • the nucleic acid construct may be a nucleic acid construct located upstream of a nucleotide sequence encoding a protein translatably linked to one sequence.
  • the nucleic acid construct may be a nucleic acid construct in which a nucleotide sequence encoding a protein translatably linked to a promoter sequence encodes a reporter protein.
  • the second invention of the present invention relates to a vector containing the nucleic acid construct of the first invention of the present invention.
  • a third invention of the present invention relates to an RNA comprising a nucleotide sequence encoding at least one protein in a translatable form and an RNA which is different from the nucleotide sequence and contains a nucleotide sequence which is not translated,
  • An RNA wherein the nucleotide sequence is selected from the following:
  • a fourth invention of the present invention is a method for detecting an action of changing the expression of a target gene by a functional nucleotide molecule, comprising the following steps:
  • nucleotide sequence IJ encoding a protein in the target gene as a nucleotide sequence, a part of the nucleotide sequence, 5 ′ side or 3 ′ side of the nucleotide sequence encoding the protein in the target gene
  • step (C) detecting the RNA of step (B) or a translation product translated from the RNA
  • step (D) detecting the effect of changing the expression of the target gene by the functional nucleotide molecule based on the amount of the RNA detected in step (C) or the translation product translated from the RNA;
  • a fifth invention of the present invention is a method for detecting an effect of changing the expression of a target gene by a functional nucleotide molecule, comprising the following steps:
  • (B) a step of detecting the RNA of (A) or a translation product translated from the RNA
  • a method for detecting an action that alters the expression of a target gene comprising detecting an action of altering the expression of the target gene by a functional nucleotide.
  • a method for detecting the effect of changing the expression of a target gene by a functional nucleotide molecule in which a nucleotide molecule is brought into contact with RNA in a cell or a cell-free protein synthesis system may be used.
  • a sixth invention of the present invention is a method for searching for a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule, comprising the following steps:
  • nucleotide sequence 1J encoding a protein in any gene as a nucleotide sequence, part of the nucleotide sequence, located on the 5 ′ side or 3 ′ side of the nucleotide sequence encoding the protein
  • step (D) a step of identifying a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule based on the amount of RNA detected in step (C) or a translation product translated from the RNA,
  • a seventh invention of the present invention is a method for searching for a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule, comprising the following steps:
  • nucleotide sequence 1J encoding a protein in any gene as a nucleotide sequence, part of the nucleotide sequence, located on the 5 ′ side or 3 ′ side of the nucleotide sequence encoding the protein
  • RNA of the third invention of the present invention having a nucleotide sequence selected from an untranslated region
  • (B) a step of detecting the RNA of (A) or a translation product translated from the RNA
  • step (C) identifying a functional nucleotide molecule that changes the expression of the target gene based on the amount of the RNA detected in step (B) or a translation product translated from the RNA. Search for genes whose expression changes depending on the characteristic nucleotide molecule About the method.
  • FIG. 1 is a view showing a result of a search by a method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing a result of a search by a method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a result of a search by a method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing a result of a search by a method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention.
  • a nucleic acid construct is a construct composed of DNA and / or RNA.
  • the nucleic acid construct may be composed of the above-mentioned DNA and RNA analogs or modified compounds, or may be contained in a part thereof.
  • target gene refers to a nucleic acid sequence encoding a target protein desired to cause a change in expression, and a nucleic acid sequence at or around Z, and is transcribed from the nucleic acid construct or vector of the present invention. Indicates the sequence that can be performed.
  • target nucleic acid sequence or “target nucleic acid sequence” may be used.
  • the target gene may be a nucleotide sequence encoding the full length of the target protein or a part thereof, and may be a 5 'UTR (Untranslated Region) or a 3' UTR before or after it. ,. Although it is not particularly limited, for example, in subjects where expression is desired to be suppressed by RNAi action.
  • a functional nucleotide molecule such as a base sequence encoding a certain protein and sequences before and after the same (siRNA), and refers to a nucleic acid sequence to be subjected to sequence-specific mRNA degradation via the nucleotide molecule.
  • a system IJ corresponding to the exon of the gene and a system J 'modified so as not to contain a sequence functioning as an initiation codon can also be suitably used.
  • the target gene may be any of a sequence derived from a eukaryotic organism, a sequence derived from a virus, and a sequence derived from a prokaryotic organism.
  • a target gene derived from a virus is useful for searching for a functional nucleotide molecule involved in degradation of the virus genome, replication of the virus, and suppression of growth.
  • coding region means a region in a gene consisting of a genetic code that directly defines the amino acid sequence of a protein.
  • the term "instability of mRNA” means an increase in the degradation reaction of mRNA.
  • the amount of accumulated mRNA is determined by two reactions, synthesis and degradation, but mRNA is destabilized when the balance between the synthesis reaction and the degradation reaction leans toward the degradation reaction.
  • the degradation of mRNA is not particularly limited as long as it is degradation of mRNA containing a nucleic acid sequence derived from a target gene, and includes both endless degradation and exolytic degradation.
  • a nucleotide molecule refers to a nucleoside phosphate compound.
  • the nucleotide molecule may be a ribonucleotide, a deoxyribonucleotide or a chimeric molecule thereof, and may include analogs and modified nucleotides.
  • a complex may be formed with proteins, carbohydrates, and the like.
  • a functional nucleotide molecule refers to a nucleotide molecule that changes the expression of a protein.
  • Functional nucleotide molecules include those that inhibit the expression of the target protein, those that are not translated in the RNA of the invention, those that act sequence-specifically on the nucleotide sequence and ultimately destabilize the entire RNA, Also included are molecules that sequence-specifically degrade untranslated nucleotide sequences in RNA and ultimately destabilize the entire RNA.
  • Functional nucleotide molecules may form complexes with proteins, carbohydrates and the like.
  • a translatable nucleotide sequence is a nucleotide sequence arranged so that protein synthesis is performed under appropriate conditions and environment. Translation is performed by the cooperation of a number of factors, including the translation initiation signal (translation activator) and translation.
  • a form containing a minimum necessary factor for translation such as a translation start codon and a translation stop codon, means a translatable form.
  • the term "untranslated nucleotide sequence” refers to a nucleotide sequence which is designed so as not to be theoretically translated, and has a negligible amount even if translated. In other words, it indicates that it is not substantially translated. Even if a very small amount of translation is confirmed, it is equivalent to substantially no translation unless the amount is such as to disregard the feature of the present invention that the effect of the fusion protein can be eliminated. That is, an untranslated nucleotide sequence is a sequence in which the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the translatable nucleotide sequence are not translated as a fusion protein. An untranslated form of a nucleotide sequence is a sequence that is not translated due to the lack of minimal translational factors.
  • upstream and downstream indicate the positional relationship with respect to the direction in which RNA is transcribed from the promoter of the nucleic acid construct of the present invention.
  • one closer to the promoter sequence is upstream, and one closer to the polyA signal sequence is downstream.
  • the nucleic acid construct of the present invention is a nucleic acid construct having a promoter sequence, a nucleotide sequence 1J encoding at least one protein translatably linked to the sequence, and a poly A signal sequence,
  • the nucleic acid construct contains an untranslated nucleotide sequence different from the nucleotide sequence encoding the polypeptide, between the promoter sequence and the polyA signal sequence,
  • a nucleotide sequence encoding a protein that is translatably linked to a promoter sequence and a nucleotide sequence that is different from the nucleotide sequence that is not translated are linked so as to be transcribed as one molecule of RNA from the nucleic acid construct.
  • nucleic acid construct is characterized in that the nucleotide sequence not translated is selected from the following.
  • a promoter sequence, a poly (A) signal sequence, and a molecule inserted between the promoter sequence and the poly (A) signal sequence are transcribed as one molecule of RNA by the action of the promoter.
  • the untranslated nucleotide sequence IJ is derived from a gene different from the translatable nucleotide sequence.
  • the nucleic acid construct of the present invention include, but are not limited to, a promoter sequence, a reporter gene sequence, a regulatory IJ functioning as a stop codon, a nontranslated gene, a nucleotide sequence 1J, and a poly A signal sequence. It may be a nucleic acid construct arranged in order.
  • a nucleic acid construct may be a nucleic acid construct in which a promoter sequence, a non-translated sequence, a nucleotide sequence, a regulatory IJ functioning as an initiation codon, a reporter gene sequence, and a poly A signal sequence are arranged in this order.
  • the untranslated nucleotide sequence (for example, the control gene J derived from the target gene) exists as a UTR of RNA transcribed from the nucleic acid construct and is not translated.
  • Nucleotide sequences encoding a translatably linked protein eg, a gene sequence encoding a reporter protein
  • a translatably linked protein eg, a gene sequence encoding a reporter protein
  • a nucleotide molecule that degrades the region encoding the untranslated nucleotide sequence in the RNA e.g., a ribozyme
  • the overall RNA becomes unstable, resulting in reduced expression of the protein encoded by the translatable linked nucleotide sequence. Therefore, by tracking changes in RNA transcribed from the nucleic acid construct of the present invention or a translation product from the RNA, it is possible to universally and easily search for a molecule capable of effectively suppressing the expression of an untranslated nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence is not translated and the nucleotide sequence is not substantially translated, it may be upstream or downstream of the nucleotide sequence encoding the translatably linked protein. Les ,.
  • nucleotide sequence which is not translated may be a sequence derived from a gene different from the nucleotide sequence encoding the protein linked in a translatable form.
  • the nucleic acid construct of the present invention is positioned so that the untranslated nucleotide sequence is not translated. It is not particularly limited as long as it does not include a translation start codon (for example, ATG), or it cannot be translated by selecting a specific region, and functions as a start codon that can be used as a form of IJ. If there is a sequence that has the possibility of performing the above, the codon may be modified by performing substitution, addition, deletion, or insertion of base to make the sequence untranslated.
  • a translation start codon for example, ATG
  • the codon may be modified by performing substitution, addition, deletion, or insertion of base to make the sequence untranslated.
  • the nucleic acid construct of the present invention is positioned so that the untranslated nucleotide sequence is not translated. If it is, there is no particular limitation.
  • a system 1J (TAA, TAG, TGA) that functions as a stop codon may be arranged between a nucleotide sequence encoding a protein that is linked in a translatable form and a nucleotide sequence that is not translated.
  • RNA three consecutive base reading frames (codons) from the start codon of the nucleotide sequence encoding the translatably linked protein define the stop codon, and this stop codon allows translation of RNA. Stop at a protein that is linked in an unusual manner, and the downstream untranslated nucleotide sequence is not translated.
  • a translatablely linked protein that is not translated into a nucleotide sequence encoding a translatably linked protein and that does not produce a fusion protein of the protein encoded by the nucleotide sequence.
  • the translation product of the nucleotide sequence encoding the Park protein can be expected to be expressed while reflecting the stability of the m RNA.
  • the nucleic acid construct of the present invention can be used in a method for detecting a change in gene expression due to a functional nucleotide molecule.
  • the promoter sequence contained in the nucleic acid construct of the present invention may be a sequence having an activity related to the transcription initiation reaction of RNA in an eukaryotic cell or an environment similar thereto (eg, a cell-free protein expression system).
  • Promoter sequences derived from eukaryotic organisms eg, ⁇ -actin promoter, U6 promoter
  • promoter sequences derived from viruses that have a promoter activity in eukaryotic cells eg, CMV (cytomegalovirus) Promoter
  • CMV cytomegalovirus
  • a promoter sequence derived from a eukaryotic organism or a virus as well as a promoter sequence derived from a virus, or a phage derived from a phage such as ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 7 A promoter sequence may be selected.
  • a promoter that constantly expresses strongly when searching for a functional nucleotide molecule that suppresses protein expression, a promoter that constantly expresses strongly can be preferably used so that the extent of the suppression can be clearly determined.
  • the nucleotide sequence encoding the translatably linked protein contained in the nucleic acid construct of the present invention includes a reporter gene sequence.
  • the reporter gene sequence is not limited as long as it is a nucleic acid sequence of a gene encoding any protein that can be detected directly and / or indirectly.
  • the protein encoded by the reporter gene is not particularly limited, but may be an enzyme that produces a specifically detectable substance such as j3-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, or an enzyme that is directly detected. Examples of such proteins are:
  • the reporter gene may be used by selecting only a part of the reporter gene within a range that retains its useful characteristics.
  • a combination of a plurality of reporter genes may be used.
  • Methods for direct protein detection include detection using a specific antibody that recognizes the reporter protein, and reporter proteins that generate a fluorescent signal, such as green fluorescent protein (GFP). Examples include a method for detecting fluorescence, and a selectable marker protein that confers a drug resistance trait. Cells can be sorted by these reporter proteins. For example, in the case of a reporter protein that generates a fluorescent signal, cells expressing the protein can be selected by FACS (fluorescence activated cell sorting) method, which is useful.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the untranslated nucleotide sequence contained in the nucleic acid construct of the present invention may be a region of a target gene of interest (for which it is desired to change the expression), or may be a region of deviation, and may encode a target protein.
  • the region, a part of the coding region, the 3 ′ UTR, and the 5 ′ UTR can all be selected as nucleotide sequences without translation.
  • the nucleotide sequence which is not translated may be a sequence derived from a plurality of genes.
  • nucleic acid (s) generated from genomic libraries, cDNA libraries, cDNA libraries expressed at specific organs, and stages derived from the organism of interest can be used as untranslated nucleotide sequences. .
  • the nucleic acid construct of the present invention can be used in a host cell or a transcription reaction solution into which the nucleic acid construct has been introduced.
  • RNA may be destabilized by a functional nucleotide molecule.
  • a functional nucleotide molecule includes a molecule that recognizes and acts on a nucleotide sequence region of RNA that has not been translated and that recognizes the base sequence of the region, thereby destabilizing the entire RNA.
  • dsRNA for example, dsRNA, siRNA, shRNA, nuclease complex (RISC) in the RNAi mechanism, stRNA (small temporal RNA) which is thought to be involved in the developmental stage of organisms, and MiRNA (microRNA), protein complex containing miRNA, miRNP, ribozyme, maxizim, hammerhead ribozyme, antisense RNA, EGS (External Guide Sequence), and tamper containing these nucleotide molecules.
  • RISC nuclease complex
  • miRNA small temporal RNA
  • MiRNA microRNA
  • protein complex containing miRNA miRNP
  • ribozyme protein complex containing miRNA
  • maxizim miRNA
  • hammerhead ribozyme maxizim
  • antisense RNA EGS (External Guide Sequence)
  • EGS Extra Guide Sequence
  • tamper containing these nucleotide molecules.
  • RNA transcribed from the nucleic acid construct of the present invention a nucleotide sequence encoding a translatably linked protein such as a reporter protein is not converted into a fusion protein, but in a state close to nature as a single protein. Stably expressed. Therefore, in the method for detecting gene expression of the present invention, for example, the reporter protein When expression is suppressed, it is possible that this phenomenon may be caused by a change in the original function of the reporter protein due to the fusion of the protein encoded by the target gene and the reporter protein. Can be eliminated. In addition, functional nucleotide molecules are not translated, and the nucleotide sequence acts to inhibit the translation mechanism, eliminating the possibility that this is a phenomenon caused by a change in the original function of the reporter protein. be able to.
  • nucleic acid construct of the present invention does not have to match the reading frame such as selecting an appropriate restriction enzyme recognition site or inserting or deleting a base, so that the nucleic acid construct is translatably linked to an untranslated nucleotide sequence. Nucleotide sequences encoding the encoded proteins are easily linked.
  • a nucleic acid construct having a nucleotide sequence encoding a translatably linked protein and a restriction enzyme recognition cleavage site adjacent thereto is not translated into the restriction enzyme recognition cleavage site.
  • the nucleotide sequence encoding the protein which is linked in a translatable manner is not translated from the nucleic acid construct, and the nucleotide sequence is substantially translated.
  • Nucleic acid constructs in which the encoded RNA is transcribed are also included in the nucleic acid constructs of the present invention. The nucleic acid construct is useful because the target gene sequence can be freely inserted according to the purpose when used.
  • the restriction enzyme recognition cleavage site may be any sequence convenient for inserting the target gene sequence of interest. Although not particularly limited, for example, a sequence in which one or more restriction enzyme sites called a cloning site and a multiple cloning site are arranged, and a sequence widely used in commercially available vectors, linkers, and the like are preferable. Can be used for
  • the poly A signal sequence is a sequence that causes a poly A addition reaction at the 3 'end of mRNA.
  • the poly A signal sequence is not particularly limited as long as it is a sequence that causes a poly A addition reaction.
  • the AAUAAA nucleotide sequence which is highly conserved in higher eukaryotic mRNAs and is usually located 11 to 30 bases upstream of the polyA-added site, is No.
  • one terminator sequence may be arranged downstream of the poly A signal sequence.
  • the terminator sequence may be any sequence as long as it has a function of terminating transcription of mRNA by RNA polymerase. Without limitation, in higher eukaryotes, RNA polymerase terminates RNA synthesis at multiple sites within a terminator sequence.
  • the poly A signal sequence and terminator sequence contained in the nucleic acid construct of the present invention can be appropriately selected according to the environment in which the RNA transcription reaction is performed.
  • a large number of protein expression vectors are commercially available depending on the host, and the nucleic acid construct of the present invention may be prepared based on these vectors or by combining them.
  • a PGH-derived BGHpolyA signal distribution IJ and a terminator sequence can be used.
  • the vector of the present invention is a vector containing the nucleic acid construct of the present invention.
  • a translatably linked protein represented by a reporter gene sequence is linked. Any vector may be used as long as it encodes the nucleotide system 1J, the untranslated gene represented by the target gene sequence, the nucleotide system IJ, and the RNA containing the polyA signal sequence in the same molecule. Further, a vector used for producing the vector of the present invention is also included in the vector of the present invention as long as it contains the nucleic acid construct of the present invention.
  • the vector of the present invention may be any of a plasmid vector, a phage vector, a vector capable of autonomous replication, a virus vector, a vector integrated into a host chromosome, and a vector which is transiently or transiently expressed. It is preferable to select a suitable species-derived vector and host depending on the promoter sequence, gene sequence, and functional nucleotide molecule contained in the nucleic acid construct of the present invention. At present, many host vector systems are commercially available and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the RNA of the present invention is an RNA containing a nucleotide sequence encoding at least one protein in a translatable form and a nucleotide sequence different from the nucleotide sequence, which is different from the nucleotide sequence.
  • RN characterized in that the nucleotide sequence is selected from: A;
  • RNA of the present invention can be prepared by transcribing the nucleic acid construct of the present invention in vivo or in vivo.
  • RNA of the present invention can be used in the method of searching for a functional nucleotide molecule that changes the expression of the target gene of the present invention, and the method of searching for a gene whose expression changes depending on the nucleotide molecule.
  • the method for detecting the action of the functional nucleotide molecule of the present invention to alter the expression of a target gene comprises the following steps:
  • step (C) detecting the RNA of step (B) or a translation product translated from the RNA
  • step (D) detecting the effect of changing the expression of the target gene by the functional nucleotide molecule based on the amount of the RNA detected in step (C) or the translation product translated from the RNA;
  • a method for detecting an action that alters the expression of a target gene, characterized by comprising is there.
  • One embodiment of the method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention includes a method for searching for a functional nucleotide molecule, which includes the following steps.
  • the nucleic acid construct or vector of the present invention namely, the promoter system 1J, the poly-A signal sequence, and the transcription inserted as one molecule of RNA by the action of the promoter inserted between the promoter sequence and the poly-A signal sequence
  • a nucleic acid construct having the DNA sequence to be prepared or a vector containing the nucleic acid construct is prepared.
  • the DNA sequence is a DNA sequence having an untranslated nucleotide sequence connected to the reporter gene sequence, and the reporter gene product is in a translatable form and the nucleotide sequence is not translated from the DNA.
  • the DNA sequence from which the encoded RNA is transcribed.
  • RNA is transcribed using the nucleic acid construct or vector of (A).
  • a series of a nucleotide sequence 1J encoding a protein translatably linked by using the nucleic acid construct of the present invention or a vector containing the nucleic acid construct, a sequence that is not translated, a nucleotide sequence, and a polyA signal sequence RNA containing the above sequence is transcribed, or RNA of the present invention is prepared, and this RNA is brought into contact with a nucleotide molecule to form a portion corresponding to a nucleotide sequence encoding a protein which is linked in a translatable form of RNA.
  • translated proteins can be detected and compared to detect the effect of the functional nucleotide molecule on the expression of the target gene.
  • the nucleotide causing the change is a functional nucleotide.
  • the transcription of the RNA, the contact with the nucleotide molecule, and the expression of the protein may be performed in a cell or outside the cell, or may be performed in parallel or sequentially.
  • the method for searching for a functional nucleotide molecule is not particularly limited.
  • a nucleic acid construct of the present invention or a vector of the present invention is introduced into a host cell with a functional nucleotide molecule and ligated in a translatable form.
  • the expression of the nucleotide sequence encoding the protein may be confirmed.
  • the functional nucleotide molecule is designed to be produced in a host cell which can be chemically synthesized or biosynthesized based on the target nucleic acid sequence IJ or a part thereof.
  • the product may be a product obtained by introducing a vector into a host cell and expressing it in the cell.
  • the functional nucleotide molecule may be of a plurality of types, and may be a plurality of nucleotides derived from a genomic library, a cDNA library, or an organ'stage-specific cDNA library. By using such a library, a functional nucleotide molecule that changes the expression of the target gene can be screened.
  • a nucleotide molecule is contacted with RNA transcribed from the nucleic acid construct or vector of the present invention or the RNA of the present invention, and the RNA after the contact is directly detected or a translation product of the RNA is detected.
  • RNA transcribed from the nucleic acid construct or vector of the present invention or the RNA of the present invention is directly detected or a translation product of the RNA is detected.
  • Many methods have been reported for directly detecting RNA, but any method that can qualitatively or quantitatively detect RNA can be used.
  • concentration measurement concentration measurement, gel electrophoresis, PCR (Polymerase Cham Reaction), l> zo'noretam PT-PCR, TA3 ⁇ 4 (Transcription-based Amplification System), 3SR (Self- sustained Sequence Replication), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, Qi3 replicase method, and TMA (Transcription Mediated Amplification) method.
  • a method for introducing a nucleic acid construct capable of producing the nucleic acid construct of the present invention, the vector of the present invention, a functional nucleotide molecule, or a functional oligonucleotide molecule into a host cell is a suitable method depending on the nucleic acid construct and the vector. There is no particular limitation as long as it is selected, but it may be directly introduced physically or chemically, or may be introduced by infection.
  • the method for searching for a gene whose expression is changed by the nucleotide molecule of the present invention comprises the following steps:
  • A a nucleotide sequence encoding a protein in any gene as a nucleotide sequence which is not translated, a part of the nucleotide sequence, located on the 5 ′ side or 3 ′ side of the nucleotide sequence encoding the protein R from the nucleic acid construct of the first invention of the present invention or the vector of the second invention of the present invention having a nucleotide sequence selected from the untranslated region.
  • step (D) identifying a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule based on the amount of RNA detected in step (C) or a translation product translated from the RNA,
  • a method for searching for a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule characterized by comprising:
  • a method in which a plurality of target sequences derived from a genomic library, a cDNA library, or an organ stage-specific cDNA library are prepared as untranslated nucleotide sequences A nucleic acid construct or a vector of the present invention is prepared, a plurality of RNAs including a plurality of untranslated RNAs or nucleotide sequences are transcribed, or a plurality of RNAs of the present invention are prepared, and a functional nucleotide is added to the RNA.
  • a gene whose expression is altered by the functional nucleotide molecule can be screened.
  • the function of the functional nucleotide molecule can be searched.
  • the method includes a promoter system IJ, a poly A signal system IJ, and a nucleic acid having a DNA sequence inserted between the promoter sequence and the poly A signal sequence and transcribed as one molecule of RNA by the action of the promoter. Constructs can be suitably used.
  • the DNA sequence is a DNA sequence having a reporter gene sequence and a restriction enzyme recognition and cleavage site adjacent thereto, and when the target gene sequence is inserted into the restriction enzyme recognition and cleavage site, a reporter gene is generated from the DNA.
  • the product derived from the target gene sequence is a DNA sequence from which the encoded RNA is transcribed in a translatable form and the product derived from the target gene sequence is not translated.
  • the present invention provides a kit for use in the method for searching for a functional nucleotide molecule of the present invention exemplified in the above (4) and (5), and the method for searching for a gene whose expression is changed by a nucleotide molecule. .
  • the nucleic acid construct of the present invention in packaged form, as set forth in (1) above, or no translation in the nucleic acid construct.
  • the kit of the present invention also includes a kit containing a nucleic acid construct that allows a user to insert a sequence derived from a desired target gene by replacing the gene sequence with a cloning site instead of the cloning site. Further, the kit of the present invention may include an instruction.
  • the "instructions” are printed materials that describe how to use the kit, for example, how to prepare a reagent solution, recommended reaction conditions, and the like. Includes those attached to the attached label and the package containing the kit. It also includes information disclosed and provided through electronic media such as the Internet.
  • the kit of the present invention includes a kit containing the vector shown in the above (2) and the RNA shown in the above (3).
  • the cells were aerobically cultured at 37 ° C using an LB-ampicillin plate to which agar was added and solidified.
  • the cells were cultured using Dulbecco's modified Eagle's medium (Bio-Itakane earth) plus 10% fetal serum (Bio-Wita) as a medium, and inoculated into a Petri dish for cell culture (Iwaki Glass).
  • the test was performed in the incubator. Use of the kit and handling of various devices were performed according to the attached instruction manual.
  • Plasmid PQBI25 (manufactured by Wako Chemicals USA) has CMV promoter, rsGF red shredded Green Fluoresence Protem, and BGHpolyA, and expresses rsGFP efficiently in Itoda cells. Restriction enzyme between rsGFP gene and BGHpolyA The sites BamHI and EcoRI are present.
  • DsDNA (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) with restriction enzymes BamHI and EcoRI cohesive ends added to both ends of the sequence from the 75 bases downstream of the start codon of the mouse Fas gene (GenBank Accession: M83649) to the stop codon, BamHI of PQBI25,
  • the target plasmid pTargetFas was constructed by inserting into the EcoRI site.
  • the target plasmid transcribes RNA containing the rsGFP gene sequence and a partial sequence of the Fas gene in the cell.
  • RNA2-1 SEQ ID NO: 2
  • RNA2-2 SEQ ID NO: 3
  • RNA3-1 SEQ ID NO: 4
  • RNA3-2 SEQ ID NO: 5
  • RNA3, RNA4-1 Anneal RNA4, RNA5-1 (SEQ ID NO: 8) and RNA5-2 (SEQ ID NO: 9)
  • RNA5 Anneal RNA4
  • RNA4-2 Anneal RNA5-1 (SEQ ID NO: 8)
  • RNA5-2 SEQ ID NO: 9
  • RNA6 SEQ ID NO: 10
  • RNA6-2 SEQ ID NO: 11
  • dsRNA was introduced into 293 cells (ATCC No: CRL_1573) together with pTargetFas. Gene transfer was carried out using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and Ribojuice (Takara Bio Inc.). After culturing the cells for 2 days, the cells were detached from the petri dish using trypsin, and the fluorescence intensity of the cells was measured using MoFlo (manufactured by Takara Bio Inc.). The results are shown in Figure 1.
  • FIG. 1 shows relative values when the fluorescence intensity of cells into which RNA was not introduced was set to 100 as a control. Cells into which RNA2 and pTarget Fas were introduced had the lowest fluorescence intensity, and thus it was determined that RNA2 was siRNA that effectively suppressed the expression of the Fas gene.
  • RNA2, RNA3, RNA4, RNA5 and RNA6 were introduced into NIH3T3 cells (ATCC No: CRL_1658) expressing Fas using Ribojuice (Takara Bio Inc.). Two days later, these cellular RNAs were extracted, and Fas mRNA was quantified by real-time RT-PCR. As a control, cells into which RNA had not been introduced were used, and a rat for housekeeping gene GAPD H (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) was used to perform a negative reaction.
  • GAPD H Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Real-time RT-PCR is a real-time RT-PCR core kit (Takara Bio Inc.) Using the Smart Cycler System (manufactured by Takara Bio Inc.), oligo DNAs of SEQ ID NOS: 12 and 13 as Fas primers and Real time R T-PCR primer (manufactured by Takara Bio Inc.) as primers for GAPDH ) Were used. The result is shown in figure 2.
  • FIG. 2 shows a relative value when the amount of mRNA of a cell into which no RNA was introduced was set to 100 as a control. The decrease in the amount of Fas mRNA was consistent with the decrease in the fluorescence intensity of rsGFP obtained in Example 2, confirming that the screening method was useful.
  • rsGFP-1 SEQ ID NO: 14
  • rsGFP_2 SEQ ID NO: 15
  • a fragment SEQ ID NO: 16
  • This DNA fragment was treated with the restriction enzymes Xbal and Nhel, and a DNA fragment of about 720 bp was inserted into the restriction enzyme site Xbal between the firefly luciferase gene of the plasmid pGL3control (Promega) and SV4 OpolyA.
  • the target plasmid pGL3_3 ′ was constructed.
  • RNA7-1 Toshimi column No. 17
  • RNA7-2 SEQ ID NO: 18
  • RNA8-1 SEQ ID NO: 19
  • RNA8-2 SEQ ID NO: 20
  • RNA9 RNA9 RNA10-1
  • RNA10-2 SEQ ID NO: 24
  • dsRNAs were introduced into 293 cells (ATCC No: CRL_1573) together with pGL3-3 '(GFP) and pRL_TK (Promega) expressing P. mushroom luciferase as an internal control.
  • Gene transfer was performed using TransIT293 (manufactured by Takara Bio Inc.) and TransIT-TKO (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the siRNA concentration was determined so that the final concentration was 1.25-160 nM. After culturing the cells for 24 hours, the culture supernatant was removed, and the cells were washed once with PBS, and lysed with 5X Passive Lysis Buffer (Promega) diluted 5-fold with deionized water.
  • the horizontal axis represents the siRNA concentration at the time of transfection
  • the vertical axis represents the force without RNA transfection as a control
  • FIG. 3 shows that the relative values of the relative luminescence intensities show lower values in the order of RNA8, RNA10, RNA9, and RNA7. From this, it was determined that the siRNA was a siRNA that effectively suppressed the expression of the rsGFP gene in the order of RNA8, RNA10, RNA9, and RNA7.
  • siRNA7-10 and rsGFP expression plasmid (pQBI25) was introduced into 293 Itoda vesicles using TransIT 293 and TransIT-TKO. Two days later, the cell strength and RNA were extracted, and rsGFP mRNA was quantified by real-time RT-PCR. As a control, cells transfected with pQBI25 alone were used, and the data were corrected using the neomycin resistance gene on pQBI25.
  • Real-time RT-PCR was performed using a real-time RT-PCR core kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and a smart cycler system (manufactured by Takara Bio Inc.), and GFP_B_F (SEQ ID NO: 25) and GFP_B_R (SEQ ID NO: 26) were used as primers for rsGFP.
  • GFP_B_F SEQ ID NO: 25
  • GFP_B_R SEQ ID NO: 26
  • Fig. 4 shows the results. In FIG.
  • the horizontal axis represents the name of the siRNA used, and the vertical axis represents the relative value when the amount of mRNA of cells into which only pQBI25 was introduced as 100 was taken as a control.
  • the siRNA search method described in Examples 45 is useful. Was confirmed.
  • the present invention provides a method for searching for a nucleotide molecule that can universally cope with a larger number of target genes and suppresses the expression of target genes by destabilizing RNA. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 2 Chimeric oligonucleotide designed as RNA2—1. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides "
  • SEQ ID N ⁇ : 3 Chimeric oligonucleotide designed as RNA2-2. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID NO: 4 Chimeric oligonucleotide designed as RNA3-1. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID N ⁇ : 5 Chimeric oligonucleotide designed as RNA3-2. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID N ⁇ : 6 Chimeric oligonucleotide designed as RNA 4-1. “Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
  • SEQ ID NO: 7 Chimeric oligonucleotide designed as RNA4-2. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID N ⁇ : 8 Chimeric oligonucleotide designed as RNA 5-1. “Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
  • SEQ ID N ⁇ : 9 Chimeric oligonucleotide designed as RNA5—2. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID N ⁇ : 10 Chimeric oligonucleotide designed as RNA6-1. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
  • SEQ ID N ⁇ : l l Chimeric oligonucleotide designed as RNA6-2.
  • Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
  • SEQ ID NO: 12 Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
  • SEQ ID N ⁇ : 13 Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
  • SEQ ID N ⁇ : 14 Designed PCR primer rsGFP-l to amplify a portion of rsGFP gene.
  • SEQ ID N ⁇ : 15 Designed PCR primer rsGFP-2 to amplify a portion of rsGFP gene.
  • SEQ ID NO: 16 rsGFP gene
  • SEQ ID NO: 17 Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-1.
  • Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID N ⁇ : 18 Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-2.
  • Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID N ⁇ : 19 Chimeric oligonucleotide designed as RNA8-1. "Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 20 Chimeric oligonucleotide designed as RNA8-2.
  • ⁇ nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 21 Chimeric oligonucleotide designed as RNA9-1.nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 22 Chimeric oligonucleotide designed as RNA9-2.nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 23 Chimeric oligonucleotide designed as RNAlO-l.
  • Nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 24 Chimeric oligonucleotide designed as RNA10-2.nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides ⁇
  • SEQ ID NO: 25 Designed PCR primer GFP—B—F to amplify a portion of rsGFP gens.
  • SEQ ID NO: 26 Designed PCR primer GFP—B—R to amplify a portion of rsGFP gens.
  • SEQ ID NO: 27 Designed PCR primer Neo_F to amplify a portion of neomycin resistant gene.
  • SEQ ID NO: 28 Designed PCR primer Neo-R to amplify a portion of neomycin resistant gene.

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Description

明 細 書
機能的ヌクレオチド分子の検索方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸の普遍的検索法に関する。さ らに、該方法に使用する核酸構築物、ベクター、該方法のためのキットに関する。
^景技術
[0002] タンパク質の発現量は多様な方法で制御されている。例えば、転写因子による遺伝 子力 mRNAへの転写制御、 mRNAからアミノ酸配列への翻訳の制御、ヌクレア一 ゼによる mRNA分解に対する mRNAの安定性の制御などにより、細胞は常に目的 の発現量を保つよう制御してレ、る。
[0003] タンパク質の発現量を mRNAの段階で人工的に抑制する方法として、 mRNAに対 するアンチセンス RNAによる抑制、リボザィムによる mRNAの分解、 RNAi (RNA i nterference)などが挙げられる。これらの方法においては、タンパク質をコードする 核酸配列、およびその周辺の核酸配列のどの領域を標的とするかにより、その抑制 効果が著しく異なることが知られている（例えば、非特許文献 1)。タンパク質の発現 量を確認する方法として、通常、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タン パク質を合成し、そのレポータータンパク質を指標にタンパク質の発現量を推測して いる。そして、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タンパク質の全長が翻 訳されているかを確認するために、標的のタンパク質の下流にレポータータンパク質 を融合させる方法が通常用いられている。従って、レポーター遺伝子が翻訳可能な 形で、これに隣接する標的のタンパク質をコードする核酸配列が翻訳されなレ、形で 連結された DNAは知られてレ、なレ、。
[0004] 例えば、 Nils en TWらは、標的のタンパク質とその下流にレポータータンパク質を 融合させた融合タンパク質を発現する DNAを構築し、レポータータンパク質の発現 を調べることにより、標的の核酸配列の発現を効果的に抑制できるリボザィム等の検 索を行なっている（例えば、特許文献 1)。し力 ながら、機能を持つ融合タンパクを 発現することは容易ではなぐ融合したためにタンパク質としての機能を失うことは少 なくない。従って、レポータータンパク質が検出されなかったとしても、 mRNAの分解 による mRNAの不安定化によるもの力、 mRNAの立体構造の変化によるもの力、翻 訳機構の阻害によるもの力、レポータータンパク質としての機能を失ったのカ さらな る詳細な検証が必要となる。このような、融合タンパク質、キメラタンパク質を生じるこ となぐ標的遺伝子由来の配列に作用する分子の検索方法は知られていない。
[0005] 従って、より多くの核酸配列に普遍的に対応でき、 mRNAの安定性を変化させるこ とにより発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法が求められていた。
[0006] 特許文献 1：米国特許出願公開第 2002/0002278号明細書
非特許文献 1 : Nature Medicine Vol. 9 No. 3 347頁（2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、より多くの核酸配列に普遍的に対応できる、標的遺伝子の発現 を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記の事情を鑑み、鋭意研究及び探索を行った結果、プロモータ 一配列、少なくとも 2つの遺伝子配列及びポリ Aシグナル配列を有する核酸構築物で あって、前記少なくとも 2つの遺伝子配列は 1分子の RNAとして転写され、少なくとも
1つの遺伝子配列が翻訳可能な形であり、少なくとも 1つの遺伝子配列が実質的に 翻訳されない形でコードされる核酸構築物を構築することにより、より多くの核酸配列 に普遍的に対応でき、 mRNAの安定性を変化させて翻訳されなレ、形の遺伝子配列 力 Sコードするタンパク質の発現を変化させることができる分子を検索できることを見出 した。さらに、上記の核酸構築物がより多くの核酸配列に普遍的に対応できることを 見出し、本発明を完成するに至った。
[0009] 本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、プロモーター配列、該配列に翻訳 可能な形で連結された、少なくとも 1つのタンパク質をコードするヌクレオチド配歹 1J、お よびポリ Aシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間には前記のポリぺプ チドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を含有 し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列と該配列とは異なる翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は該核酸構築物より 1分子 の RNAとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする 核酸構築物に関する；
(A)タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードす るヌクレオチド酉己列、および
(B)天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5 '側もしくは 3'側に位 置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
[0010] 本発明の第 1の発明において、翻訳されないヌクレオチド配列力 プロモーター配 列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位 置している核酸構築物であってもよぐ翻訳されないヌクレオチド配列力 S、プロモータ 一配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流 に位置している核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列に翻訳可能な形 で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列がレポータータンパク質をコー ドするものである核酸構築物であってもよい。
[0011] 本発明の第 2の発明は、本発明の第 1の発明の核酸構築物を含有するベクターに 関する。
[0012] 本発明の第 3の発明は、翻訳可能な形の少なくとも 1つのタンパク質をコードするヌ クレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を含有する RNA であって、前記の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴と する RNAに関する；
(A)前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質 をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド 配列、および
(B)天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異 なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳 領域のヌクレオチド配列。
[0013] 本発明の第 4の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化さ せる作用を検出する方法であって、下記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌク レオチド配歹 IJ、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオ チド配列を有する本発明の第 1の発明の核酸構築物もしくは本発明の第 2の発明の ベクターより RNAを転写させる工程、
(B)工程 (A)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(C)工程（B)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(D)工程（C)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する 工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に 関する。
[0014] 本発明の第 5の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化さ せる作用を検出する方法であって、下記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌク レオチド配歹 I」、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオ チド配列を有する本発明の第 3の発明の RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程
(B)工程 (A)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(C)工程（B)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する 工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に 関する。 [0015] 本発明の第 4、 5の発明において、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を 変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能 的ヌクレオチド分子の検索方法であってもよぐ細胞内もしくは無細胞タンパク質合成 系でヌクレオチド分子の RNAへの接触が行われる機能的ヌクレオチド分子による標 的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であってもよい。
[0016] 本発明の第 6の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索す る方法であって、下記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配歹 1J、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有 する本発明の第 1の発明の核酸構築物もしくは本発明の第 2の発明のベクターより R NAを転写させる工程、
(B)工程 (A)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(C)工程 ）の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(D)工程（C)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索 方法に関する。
[0017] 本発明の第 7の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索す る方法であって、下記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配歹 1J、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有 する本発明の第 3の発明の RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(B)工程 (A)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(C)工程（B)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ レ、て標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、 を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索 方法に関する。
[0018] 本発明の第 6、 7の発明において、細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレ ォチド分子の RNAへの接触が行われるヌクレオチド分子によって発現が変化する遺 伝子の検索方法であってもよレ、。
発明の効果
[0019] 本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、 RNAを不安定化させる ことにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。 図面の簡単な説明
[0020] [図 1]本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図であ る。
[図 2]本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図であ る。
[図 3]本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図であ る。
[図 4]本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図であ る。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明に関して具体的に説明する。
[0022] 本明細書において、核酸構築物は DNAおよび/または RNAで構成された構築 物である。核酸構築物は、上記 DNA、 RNAのアナログや修飾化合物から構成され ていてもよぐまた、その一部に含んでいても良い。
本明細書において、標的遺伝子とは、発現の変化を起こすことが望まれる標的タン パク質をコードする核酸配列、および Zまたは、その前後の核酸配列であり、本発明 の核酸構築物又はベクターから転写されうる配列のことを示す。本明細書にぉレ、て は、 目的の核酸配列、標的核酸配列と記載することもある。標的遺伝子は標的タンパ ク質の全長又はその一部をコードするヌクレオチド配列であっても良ぐさらにその前 後の 5 ' UTR (Untranslated Region:非翻訳領域）、 3 ' UTRであっても良レ、。特 に限定はされないが例えば、 RNAi作用により発現を抑制することが望まれる対象で あるタンパク質をコードする塩基配列及びその前後の配列（siRNA)のような機能的 ヌクレオチド分子のことであり、ヌクレオチド分子を介した配列特異的 mRNAの分解 の対象となる核酸配列をいう。遺伝子のェキソンに相当する配歹 IJ、開始コドンとして 機能する配列を含有しないように改変された配歹' Jも好適に使用できる。標的遺伝子 は、真核細胞生物由来の配列、ウィルス由来の配列、原核細胞生物由来の配列の いずれであってもよレ、。ウィルス由来の標的遺伝子は、該ウィルスゲノムの分解、ウイ ノレスの複製、増殖の抑制にかかわる機能的ヌクレオチド分子の検索に有用である。
[0023] 本明細書にぉレ、て、コード領域とは、タンパク質のアミノ酸配列を直接規定する遺 伝暗号からなる遺伝子内の領域を意味する。
[0024] 本明細書にぉレ、て、 mRNAの不安定化とは、 mRNAの分解反応の増大を意味す る。 mRNAは、合成と分解の 2つの反応によりその蓄積量が決定されるが、合成反応 と分解反応のバランスが分解反応に傾いた場合に mRNAが不安定化されるという。 mRNAの分解は、標的遺伝子由来の核酸配列を含む mRNAの分解であれば特に 限定はなぐエンド的な分解、ェキソ的な分解のどちらも含まれる。
[0025] 本明細書において、ヌクレオチド分子とは、ヌクレオシドのリン酸エステル化合物を 示す。ヌクレオチド分子は、リボヌクレオチド、デォキシリボヌクレオチドまたはそれら のキメラ分子であってよぐアナログや修飾されたヌクレオチドもヌクレオチド分子に含 まれる。また、タンパク質、糖質などと共に複合体を形成していてもよい。
[0026] 本明細書において、機能的ヌクレオチド分子とは、タンパク質の発現を変化させる ヌクレオチド分子のことをいう。機能的ヌクレオチド分子には、標的タンパク質の発現 を阻害する分子、本発明の RNAの中の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列に配列特異 的に作用し、最終的に RNA全体を不安定化させる分子、 RNAの中の翻訳されない ヌクレオチド配列を配列特異的に分解し、最終的に RN A全体を不安定化させる分子 も含まれる。機能的なヌクレオチド分子は、タンパク質や糖質などとともに複合体を形 成していてもよい。
[0027] 本発明において、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは、適切な条件、環境下にお いて、タンパク質の合成が行われるように配置されたヌクレオチド配列である。翻訳は 多数の因子の協働によりなされるが、翻訳開始シグナル (翻訳ァクチべ一ター）、翻 訳開始コドン、翻訳終止コドンなど、翻訳に最低限必要な因子を含む形態であれば 本発明では翻訳可能な形であることを意味する。
[0028] 本発明において、翻訳されない形のヌクレオチド配列とは、理論上翻訳されることの 無いように設計された形態であり、翻訳された場合でもその存在が無視できる程度に 微量であること、言い換えれば実質的に翻訳されないことを示す。ごく微量の翻訳が 確認されたとしても、融合タンパク質による影響を排除できるという本発明の特徴を否 定する量でなければ、実質的に翻訳されないのと同等である。つまり、翻訳されない 形のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と、翻訳可能 な形のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列とが、融合タンパク質として翻訳さ れることのない配列のことである。翻訳されない形のヌクレオチド配列は、翻訳に最低 限必要な因子を欠くことにより翻訳されない配列である。
[0029] 本明細書において、上流および下流とは、本発明の核酸構築物のプロモーターか ら RNAが転写される方向に対する位置関係を示す。本発明の核酸構築物において は、プロモーター配列に近い方が上流であり、ポリ Aシグナル配列に近い方が下流と なる。
[0030] ( 1 )本発明の核酸構築物
本発明の核酸構築物は、プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された 、少なくとも 1つのタンパク質をコードするヌクレオチド配歹 1J、およびポリ Aシグナル配 列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間には前記のポリぺプ チドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を含有 し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列と該配列とは異なる翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は該核酸構築物より 1分子 の RNAとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする 核酸構築物である。
(A)タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードす るヌクレオチド配歹 |J、および
(B)天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5 '側もしくは 3'側に位 置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
また、本発明の核酸構築物の 1つの態様として、プロモーター配列、ポリ Aシグナノレ 配列、およびプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間に挿入された、前記プロモ 一ターの作用により 1分子の RNAとして転写される DNA配列を有する核酸構築物 であって、前記 DNA配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物が例示 される。
(A)レポーター遺伝子配列に接続された翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を有する DN A配列であって、当該 DNAからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌク レオチド配列は翻訳されなレ、形でコードされる RNAが転写される DNA配歹 IJ、および
(B)レポーター遺伝子配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有する DNA 配列であって、前記制限酵素認識切断部位にヌクレオチド配列が挿入された場合、 当該 DNAからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつヌクレオチド配列 は翻訳されない形でコードされる RNAが転写される DNA配列。
[0031] 本発明を特に限定するものではないが、通常、前記の翻訳されないヌクレオチド配 歹 IJは、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは異なる遺伝子に由来する。本発明の核 酸構築物としては、特に限定はされないが例えば、プロモーター配列、レポーター遺 伝子配列、終止コドンとして機能する配歹 IJ、翻訳されなレ、ヌクレオチド配歹 1J、ポリ Aシ グナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列、翻訳 されなレ、ヌクレオチド配歹 lj、開始コドンとして機能する配歹 IJ、レポーター遺伝子配列、 ポリ Aシグナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。
[0032] 本発明の核酸構築物において、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列（例えば標的遺伝 子由来の配歹' J)は該核酸構築物から転写される RNAの UTRとして存在し、翻訳され ないため、融合タンパク質が生じることなぐ翻訳可能な形で連結されたタンパク質を コードするヌクレオチド配列（例えばレポータータンパク質をコードする遺伝子配列） 力 は前記タンパク質が機能を保った形で発現される。前記 RNA中の翻訳されない ヌクレオチド配列をコードする領域を分解するようなヌクレオチド分子、例えばリボザィ ムゃ siRNAが存在すると、 RNA全体が不安定となり、この結果翻訳可能な形で連結 されたヌクレオチド配列にコードされたタンパク質の発現が減少する。したがって、本 発明の核酸構築物から転写される RNAまたは該 RNAからの翻訳産物の変化を追 跡することにより、翻訳されないヌクレオチド配列の発現を効果的に抑制できる分子 を普遍的かつ容易に検索できる。
[0033] 翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない配列であれば、翻訳可能 な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にあってもよぐ下 流にあってもよレ、。また、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は翻訳可能な形で連結され たタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる遺伝子由来の配列であっても良 レ、。
[0034] 翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードす るヌクレオチド配列の上流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオ チド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はないが、例えば翻訳の開 始コドン (例えば ATG)を含まなレ、ように特定の領域を選択して翻訳されなレ、形の配 歹 IJとしても良ぐ開始コドンとして機能する可能性を有する配列があれば、塩基の置 換、付カロ、欠失、挿入を行うことにより前記コドンを改変し、翻訳されない配列としても 良い。
[0035] 翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードす るヌクレオチド配列の下流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオ チド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はない。例えば翻訳可能な 形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されないヌクレオチド 配列の間に終止コドンとして機能する配歹 1J (TAA、 TAG, TGA)を配置すれば良い 。この場合、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 開始コドンから連続する 3塩基ずつの読み枠 (コドン）が終止コドンを規定し、この終 止コドンにより RNAの翻訳が翻訳可能な形で連結されたタンパク質でストップし、下 流の翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されなレ、。従って、翻訳可能な形で連結さ れたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されなレ、ヌクレオチド配列がコー ドするタンパク質の融合タンパク質が生じることなぐ翻訳可能な形で連結されたタン パク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物が mRNAの安定性を反映しながら 発現することが期待できる。
[0036] 本発明の核酸構築物は、機能的ヌクレオチド分子による遺伝子発現の変化を検出 する方法に用いることができる。
[0037] 本発明の核酸構築物に含まれるプロモーター配列は、真核細胞内またはそれに類 似した環境 (例えば、無細胞タンパク質発現系）において RNAの転写開始反応に関 与する活性を有する配列であれば何でもよぐ真核細胞生物由来のプロモーター配 列（例えば、 βァクチンプロモーター、 U6プロモーター）、真核細胞内でプロモータ 一活性を有するウィルス由来のプロモーター配列（例えば、 CMV (サイトメガロウィル ス）プロモーター）のいずれもが使用できる。また、転写反応が行われる環境（生物個 体、培養細胞、無細胞タンパク質合成系、等）に応じて適切なプロモーターを選択す ること力 Sできる。例えば、無細胞タンパク質合成系の場合には、使用される RNAポリメ ラーゼに対応するものを選択すればよぐ上記真核細胞生物由来、ウィルス由来の プロモーター配列のほか、 Τ7ファージなどのファージ由来のプロモーター配列を選 択しても良い。特に限定はされないが、タンパク質の発現を抑制する機能的ヌクレオ チド分子を検索する場合は、明確にその抑制の程度を判断できるように、恒常的に 強く発現するプロモーターが好適に使用できる。
[0038] 本発明の核酸構築物に含まれる翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードす るヌクレオチド配列として、レポーター遺伝子配列が挙げられる。レポーター遺伝子 配列は、直接的及び/又は間接的に検出しうる任意のタンパク質をコードする遺伝 子の核酸配列であれば限定は無レ、。レポーター遺伝子がコードするタンパク質（レポ 一タータンパク質）としては、特に限定はされないが、 j3 -ガラクトシダーゼ、ルシフエ ラーゼ、アルカリフォスファターゼなどの特異的に検出可能な物質を生産する酵素、 ならびに直接的に検出されうるタンパク質が例示される。前記レポーター遺伝子は、 その有用な特徴を保持する範囲において、その一部のみを選択して使用してもよぐ 複数のレポーター遺伝子を組み合わせても良レ、。直接的にタンパク質を検出する方 法としては、レポータータンパク質を認識する特異抗体の使用により検出する方法、 蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質 (GFP)の 蛍光を検出する方法、及び薬剤耐性形質を付与するような選択マーカータンパク質 が例示される。これらのレポータータンパク質により細胞を sortingすることができる。 例えば蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質の場合は、そのタンパク質を発現 する細胞を F ACS (fluorescence activated cell sorting)法により選択すること ができ有用である。
[0039] 本発明の核酸構築物に含まれる翻訳されないヌクレオチド配列は、興味の対象で ある（発現を変化させることが望まれる）標的遺伝子のレ、ずれの領域であつてよく、標 的タンパク質のコード領域、コード領域の一部、 3 ' UTR、 5 ' UTRのいずれもが翻訳 されなレ、ヌクレオチド配列として選択できる。また、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は 複数の遺伝子由来の配列が並んでいてもよレ、。さらに興味の対象である生物由来の ゲノムライブラリー、 cDNAライブラリー、特定の器官、時期で発現している cDNAラ イブラリーなどから作製された核酸 (群）を、翻訳されないヌクレオチド配列としてもよ レ、。
[0040] 本発明の核酸構築物は、導入された宿主細胞中もしくは転写反応液中において、
1分子の RNAとして転写される。該 RNAは、機能的ヌクレオチド分子により不安定化 されうる。例えば、機能的ヌクレオチド分子として、 RNAの翻訳されなレ、ヌクレオチド 配列領域に、該領域の塩基配列を認識して作用し、結果的に RNA全体を不安定化 させる分子が挙げられる。例えば、 RNAi機構における dsRNA、 siRNA、 shRNA、 ヌクレアーゼ複合体（RISC : RNA_induced silencing complex)、生物の発生 段階に関与しているとされる stRNA (small temporal RNA)、広範な生命現象に 関与してレ、ると思われる miRNA (micro RNA)、 miRNAを含むタンパク質複合体 miRNP、リボザィム、マキシザィム、ハンマーヘッドリボザィム、アンチセンス RNA、 E GS (External Guide Sequence)、およびこれらのヌクレオチド分子を含むタンパ ク質複合体などについて、本発明の方法によりその作用を調べることができる。
[0041] 本発明の核酸構築物より転写された RNAから、レポータータンパク質などの翻訳 可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列力 融合タンパク質と なることなく、単独のタンパク質として自然に近い状態で安定的に発現する。したがつ て、本発明の遺伝子発現の検出方法においては、例えば、レポータータンパク質の 発現が抑制された場合、この現象が標的遺伝子にコードされるタンパク質とレポータ 一タンパク質が融合タンパク質となったために、レポータータンパク質の本来の機能 に変化を生じたことに起因する現象である可能性を排除することができる。また、機能 的なヌクレオチド分子が翻訳されなレ、ヌクレオチド配列に翻訳機構を阻害するように 作用して、レポータータンパク質の本来の機能に変化を生じたことに起因する現象で ある可能性を排除することができる。
さらに、翻訳されないヌクレオチド配列はタンパク質に翻訳する必要がないため、翻 訳されなレ、ヌクレオチド配列の読み枠 (コドン:それぞれのアミノ酸に対応する 3塩基 連鎖）を合わせる必要がなレ、。従って、本発明の核酸構築物は、適切な制限酵素認 識部位を選択する、塩基を挿入もしくは削除するなどの読み枠を合わせる必要がな レ、ため、翻訳されないヌクレオチド配列と翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコ ードするヌクレオチド配列の連結が容易である。
[0042] 本発明においては、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有する核酸構築物であって、前記 制限酵素認識切断部位に翻訳されないヌクレオチド配列が挿入された場合、当該核 酸構築物からは、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配 列が翻訳可能な形で、かつ翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない 形でコードされる RNAが転写される核酸構築物も本発明の核酸構築物に含まれる。 該核酸構築物は、使用する際に目的に応じて自由に標的遺伝子配列を挿入するこ とができ有用である。制限酵素認識切断部位は、興味の対象である標的遺伝子配列 を挿入するのに都合のよい配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、例え ばクローニングサイト、マルチクローニングサイトと呼ばれる 1つもしくは複数の制限酵 素サイトが並んだ配列が挙げられ、市販のベクター、リンカ一などで広く一般に使用 されている配列が好適に使用できる。
[0043] 本発明の核酸構築物にぉレ、て、ポリ Aシグナル配列は mRNAの 3 '末端にポリ A付 加反応を生じさせる配列である。ポリ Aシグナル配列は、ポリ A付加反応を生じさせる 配列であれば特に限定はない。例えば、高等真核生物の mRNAに高度に保存され ていて、通常ポリ A付カ卩部位の 11一 30塩基上流に存在する AAUAAA塩基配列が 挙げられる。
[0044] 本発明の核酸構築物において、ポリ Aシグナル配列の下流にターミネータ一配列 を配置してもよい。ターミネータ一配列は、 RNAポリメラーゼによる mRNAの転写を 終結させる機能を有する配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、高等真 核生物においては、 RNAポリメラーゼはターミネータ一配列内の複数の部位で RN Aの合成を終結する。
[0045] 本発明の核酸構築物に含まれるポリ Aシグナル配歹 lj、ターミネータ一配列は、 RN Aの転写反応を行う環境に合わせて適宜選択することができる。タンパク質の発現べ クタ一が宿主に合わせて多数市販されており、これらのベクターを基に、又は組み合 わせることにより、本発明の核酸構築物を作成してもよい。特に限定はされないが、 例えば、ゥシ由来の BGHpolyAシグナル配歹 IJ、ターミネータ一配列が使用できる。
[0046] (2)本発明のベクター
本発明のベクターは、本発明の核酸構築物を含有するベクターであり、適当な宿主 細胞中やその環境に類似した反応溶液中においてレポーター遺伝子配列に代表さ れる翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配歹 1J、標的遺伝 子配列に代表される翻訳されなレ、ヌクレオチド配歹 IJ、ポリ Aシグナル配列を同一分子 内に含有する RNAが転写されるベクターであれば何でもよい。また、本発明のベクタ 一を作製するために使用するベクターも、本発明の核酸構築物を含有していれば本 発明のベクターに含まれる。本発明のベクターは、プラスミドベクター、ファージベクタ 一、自立複製しうるベクター、ウィルスベクター、宿主の染色体に組み込まれるベクタ 一、一時的、一過的に発現するベクターのいずれであってもよい。本発明の核酸構 築物に含まれるプロモーター配列、遺伝子配列、機能的ヌクレオチド分子に応じて、 適合する種由来のベクター、宿主を選択することが好ましい。現在、多くの宿主一べク ター系が市販されており、 目的に応じて適宜選択することができる。
[0047] (3)本発明の RNA
本発明の RNAは、翻訳可能な形の少なくとも 1つのタンパク質をコードするヌクレオ チド配列と該配列とは異なる、翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を含有する RNAであつ て、前記の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする RN Aである；
(A)前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質 をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド 配列、および
(B)天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異 なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳 領域のヌクレオチド配列。
[0048] 本発明の RNAは、本発明の核酸構築物をインビボ、インビト口において、転写する ことにより作製することができる。また、本発明の RNAを構成する各構成成分である R
NAを連結して作製することができる。
[0049] 本発明の RNAは、本発明の標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分 子を検索する方法、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方 法に使用することができる。
[0050] (4)本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用 の検出方法
本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検 出する方法は、下記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌク レオチド配歹 I」、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオ チド配列を有する（1)記載の核酸構築物もしくは（2)記載のベクターより RNAを転写 させる工程、
(B)工程 (A)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(C)工程（B)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(D)工程（C)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する 工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法で ある。
[0051] また、本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索する方法の 1つの態様として、以下 の工程を包含する機能的ヌクレオチド分子の検索方法が挙げられる。
(A)本発明の核酸構築物もしくはベクター、つまりプロモーター配歹 1J、ポリ Aシグナノレ 配列、およびプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間に挿入された、前記プロモ 一ターの作用により 1分子の RNAとして転写される DNA配列を有する核酸構築物も しくは該核酸構築物を含有するベクターを用意する。ここで前記 DNA配列はレポ一 ター遺伝子配列に接続された翻訳されないヌクレオチド配列を有する DNA配列であ つて、当該 DNAからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌクレオチド配 列は翻訳されない形でコードされる RNAが転写される DNA配列である。
(B) (A)の核酸構築物もしくはベクターを用いて RNAを転写させる。
(C) (B)の RNAにヌクレオチド分子を接触させる。
(D) RNAのレポーター遺伝子領域またはレポータータンパク質を検出する。
[0052] 本発明の核酸構築物又は該核酸構築物を含有するベクターを用いて翻訳可能な 形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配歹 1J、翻訳されなレ、ヌクレオチド 配列、ポリ Aシグナル配列の一連の配列を含む RNAを転写し、もしくは本発明の RN Aを用意し、この RNAとヌクレオチド分子と接触させて、 RNAの翻訳可能な形で連 結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相当する部分や翻訳されたタン パク質を検出、比較し、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させ る作用を検出することができる。上記検出の結果、変化を生じるヌクレオチドが機能 的なヌクレオチドであると判断することができる。また、本発明においては、上記検出 方法を用いて、複数のヌクレオチド分子の中力 標的遺伝子の発現を変化させる機 能的なヌクレオチド分子を検索 (スクリーニング)することが可能である。上記 RNAの 転写、ヌクレオチド分子との接触、タンパク質の発現は、細胞内、細胞外のいずれで 行われてもよぐ並行して、もしくは順に行われてもよい。機能的ヌクレオチド分子を 検索する方法に特に限定はないが、例えば、本発明の核酸構築物又は本発明のベ クタ一と、機能的ヌクレオチド分子を宿主細胞に導入し、翻訳可能な形で連結された タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を確認すればよい。 [0053] 機能的ヌクレオチド分子は、標的とする核酸配歹 IJもしくはその一部を基に化学的に 合成してもよぐ生合成してもよぐ宿主細胞で生産されるように設計されたベクターを 宿主細胞に導入して細胞中で発現した生産物であってもよい。また、機能的ヌクレオ チド分子は複数の種類であっても良ぐゲノムライブラリー、 cDNAライブラリー、器官 '時期特異的 cDNAライブラリー由来の複数のヌクレオチドであってもよい。このよう なライブラリーを用いることにより、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチ ド分子をスクリーニングすることができる。
[0054] 本発明の方法においては、本発明の核酸構築物、ベクターから転写された RNAや 本発明の RNAにヌクレオチド分子を接触させ、接触後の RNAを直接検出もしくは該 RNAの翻訳産物を検出することができる。 RNAを直接検出する方法は、多くの方法 が報告されてレ、るが、 RNAの定性的または定量的な検出が可能な方法であれば何 でもよレ、。特に限定はされないが、例えば濃度の測定、ゲル電気泳動法、 PCR (Pol ymerase Cham Reaction)法、 l>ゾ'ノレタ ム PT— PCR法、 TA¾ (Transcription —based Amplification System)法、 3SR (Self— sustained Sequence Repl ication)、 NASBA (Nucleic Acid Sequence— Based Amplification)法、 Q i3レプリカーゼ法、 TMA (Transcription Mediated Amplification)法、が挙げ られる。
[0055] 宿主細胞に本発明の核酸構築物、本発明のベクター、機能的ヌクレオチド分子、 機能的オリゴヌクレオチド分子を生産しうる核酸構築物を導入する方法は、核酸構築 物、ベクターに応じて適切な方法を選択すればよぐ特に限定はされないが、物理的 、化学的に直接導入してもよぐ感染により導入してもよい。
[0056] (5)本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法
本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法は、下 記工程；
(A)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配歹 lj、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有 する本発明の第 1の発明の核酸構築物もしくは本発明の第 2の発明のベクターより R NAを転写させる工程、
(B)工程 (A)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(C)工程 ）の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(D)工程（C)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ レ、てヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索 方法である。
[0057] 本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法においては 、ゲノムライブラリー、 cDNAライブラリー、器官時期特異的 cDNAライブラリー由来 の複数の標的配列を翻訳されないヌクレオチド配列として作製した本発明の核酸構 築物又はベクターを用意し、複数種の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列を含む複数種 の RNAを転写しもしくは複数種の本発明の RNAを用意し、該 RNAに機能的ヌクレ ォチド分子を接触させ、 RNAの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードする ヌクレオチド配列に相当する部分又は翻訳されたタンパク質を検出することにより、該 機能的ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子をスクリーニングでき、該機 能的ヌクレオチド分子の作用を検索することもできる。この方法には、プロモーター配 歹 IJ、ポリ Aシグナル配歹 IJ、およびプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間に挿入 された、前記プロモーターの作用により 1分子の RNAとして転写される DNA配列を 有する核酸構築物が好適に使用できる。ここで前記 DNA配列はレポーター遺伝子 配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有する DNA配列であって、前記制 限酵素認識切断部位に標的遺伝子配列が挿入された場合、当該 DNAからは、レポ 一ター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつ標的遺伝子配列由来の産物は翻訳され ない形でコードされる RNAが転写される DNA配列である。
[0058] (6)本発明のキット
本発明は、前述の（4)、（5)で例示した本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索す る方法や、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法に使用 されるキットを提供する。 1つの実施態様において、パッケージされた形態において、 前出の（1)で示した本発明の核酸構築物、もしくは、該核酸構築物中の翻訳されな い形の遺伝子配列の代わりにクローニングサイトに置き換え、使用者が好みの標的 遺伝子由来の配列を挿入できる核酸構築物を含有するキットも本発明のキットに含ま れる。また本発明のキットには、指示書が含まれていてもよい。
[0059] 上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば試薬液の調製方法、推奨される 反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い 説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載さ れたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情 報も含まれる。
[0060] さらに、前述の（2)で示したベクター、 (3)で示した RNAを包含したキットも本発明 のキットに含まれる。
実施例
[0061] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミド DNAの 調製、制限酵素消化などの基本的な操作にてついては上記のモレキュラー 'クロー ニング：ァ 'ラボラトリー 'マニュアル第 2版に記載の方法によった。さらに、以下に示す 大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌 JM109を宿主と して使用した。また、形質転換された大腸菌は 100 x g/mlのアンピシリンを含む LB 培地（1 % トリプトン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% NaCl、 pH7. 0)、あるいは上記 培地に 1. 5%の寒天を加え固化させた LB—アンピシリンプレートを用いて 37°Cで好 気的に培養した。細胞の培養は、培地としてダルベッコ改変イーグル培地 (バイオゥ イタカネ土製）に 10%ゥシ胎児血清 (バイオウイタカ社製）を加えたものを使用し、細胞 培養用シャーレ (イワキガラス社製）に接種し、 37°C、 5% COの条件で湿潤培養ィ
2
ンキュベータ一内において行なった。キットの使用および各種機器の取り扱いは添付 の操作説明書に従つて行なつた
[0062] 実施例 1 マウス Fas遺伝子配列を持つ標的プラスミドの構築
プラスミド PQBI25 (Wako Chemicals USA社製）は CMVプロモーター、 rsGF P red shnted Green Fluoresence Protem)遺 is十、 BGHpolyAを持 、糸田 胞内で効率よく rsGFPを発現する。 rsGFP遺伝子と BGHpolyAの間には制限酵素 部位 BamHIおよび EcoRIが存在する。マウス Fas遺伝子（GenBank Accession : M83649)の開始コドンの 75塩基下流から終止コドンまでの配列の両端に制限酵素 BamHIおよび EcoRI cohesive末端が付加された dsDNA (配列表の配列番号 1) を PQBI25の BamHI、 EcoRIサイトに揷入することにより標的プラスミド pTargetFas を構築した。標的プラスミドは細胞内で rsGFP遺伝子配列と Fas遺伝子の部分配列 をもつ RN Aを転写する。
[0063] 実施例 2 効果的に Fas遺伝子の発現を抑制する siRNAの検索
マウス Fas遺伝子の部分配列を持つ 21bpの 5種の dsRNAを準備した。 RNA2—1 (配列番号 2)と RNA2—2 (配列番号 3)をァニールして RNA2、 RNA3—1 (配列番号 4)と RNA3—2 (配列番号 5)をァニールして RNA3、 RNA4—1 (配列番号 6)と RNA 4-2 (配列番号 7)をァニールして RNA4、 RNA5—1 (配列番号 8)と RNA5—2 (配列 番号 9)をァニールして RNA5、 RNA6-1 (配列番号 10)と RNA6—2 (配列番号 11) をァニールして RNA6を調製した。これらの dsRNAをそれぞれ pTargetFasと共に 2 93細胞（ATCC No : CRL_1573)に導入した。遺伝子導入はリポフエクタミン 200 0 (Invitrogen社製）と Ribojuice (タカラバイオ社製）を用いて行なった。細胞を 2日 間培養したのち、トリプシンを用いてシャーレから剥がし、 MoFlo (タカラバイオ社製） により細胞の蛍光強度を測定した。結果を図 1に示す。図 1は、対照として RNAを導 入しなかった細胞の蛍光強度を 100とした場合の相対値を示す。 RNA2と pTarget Fasとを導入した細胞は最も蛍光強度が弱いことから、 RNA2を効果的に Fas遺伝子 の発現を抑制する siRNAであると判断した。
[0064] 実施例 3 実施例 2の結果の確認
実施例 2で得られた siRNAが有効である確認を次のようにして行なった。 Fasを発 現している NIH3T3細胞（ATCC No : CRL_1658)に RNA2、 RNA3、 RNA4、 RNA5、 RNA6をそれぞれ Ribojuice (タカラバイオ社製）で導入した。 2日後にこれ らの細胞力 RNAを抽出し、リアルタイム RT—PCRにより、 Fas mRNAを定量した 。対照として RNAを導入していない細胞を使用し、ハウスキーピング遺伝子 GAPD H (Glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase) 用レヽてァータのネ闬 i£を 行なった。リアルタイム RT—PCRはリアルタイム RT—PCRコアキット（タカラバイオ社 製）、スマートサイクラ一システム（タカラバイオ社製）を用いて行レ、、 Fasのプライマー として配列番号 12、 13のオリゴ DNAを、 GAPDHのプライマーとして Real time R T-PCR primer (タカラバイオ社製）のプライマーをそれぞれ使用した。結果を図 2 に示す。図 2は、対照として RNAを導入しなかった細胞の mRNA量を 100とした場 合の相対値を示す。 Fas mRNA量の減少は実施例 2で得られた rsGFPの蛍光強 度の減少と一致することから、本スクリーニング法が有用であることが確認できた。
[0065] 実施例 4 rsGFP (red shifted Green Fluoresence Protein)遺伝子配列を 持つ標的プラスミドの構築
rsGFP-1 (配列番号 14)と rsGFP_2 (配列番号 15)をプライマーとし、 pQBI25を 铸型として、 PCRにより rsGFP遺伝子の開始コドンから終止コドン付近までを含み両 端に制限酵素 Xbalおよび Nhelを有する DNA断片（配列番号 16)を調製した。この DNA断片を制限酵素 Xbalおよび Nhelで処理して得られた、約 720bpの DNA断 片をプラスミド pGL3control (Promega社製）のホタルルシフェラーゼ遺伝子と SV4 OpolyAの間に存在する制限酵素部位 Xbalに挿入し、標的プラスミド pGL3_3' (GF P)を構築した。
[0066] 実施例 5 効果的に rsGFP遺伝子の発現を抑制する siRNAの検索
rsGFP遺伝子の部分配列を持つ 21bpの 5種の dsRNAを準備した。 RNA7—1 (酉己 列番号 17)と RNA7— 2 (配列番号 18)をァニールして RNA7、 RNA8— 1 (配列番号 19)と RNA8— 2 (配列番号 20)をァニールして RNA8、 RNA9— 1 (配列番号 21)と R NA9-2 (配列番号 22)をァニールして RNA9、 RNA10—1 (配列番号 23)と RNA1 0-2 (配列番号 24)をァニールして RNA10を調製した。これらの dsRNAをそれぞれ pGL3-3' (GFP)、さらにインターナルコントロールとしてゥミシィタケルシフェラーゼ を発現する pRL_TK (Promega社製）と共に 293細胞（ATCC No : CRL_1573) に導入した。遺伝子導入は TransIT293 (タカラバイオ社製）と TransIT-TKO (タカ ラバイオ社製）を用いて行なった。 siRNA濃度は終濃度が 1. 25— 160nMとなるよう に決定した。細胞を 24時間培養したのち、培養上清を除去した後 PBSで一度洗浄し 、脱イオン水で 5倍希釈した 5 X Passive Lysis Buffer (Promega社製）により糸田 胞を溶解した。この溶解液 10 より Dual Luciferase Assay Svstem (Promeg a社製）のプロトコールに従レ、、発光プレートリーダーである Mithras940 (Berthold 社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ発光値とゥミシィタケルシフェラーゼ発光値を測 定した。得られた発光値をもとに (相対発光強度） = (ホタルルシフェラーゼ発光値） / (ゥミシィタケルシフェラーゼ発光値)を算出した。結果を図 3に示す。図 3において 、横軸は導入時の siRNA濃度、縦軸は対照として RNAを導入しな力、つた細胞の（相 対発光強度）を 100%とした場合の各サンプルの相対発光強度の相対値を示す。図 3力、ら RNA8、 RNA10、 RNA9、 RNA7の順に相対発光強度の相対値が低い値を 示すことが分かった。このことから、 RNA8、 RNA10、 RNA9、 RNA7の順に効果的 に rsGFP遺伝子の発現を抑制する siRNAであると判断した。
[0067] 実施例 6 リアルタイム RT— PCRによる RNAi効果の比較
293糸田胞に、各 siRNA7— 10および rsGFP発現プラスミド (pQBI25)を、 TransIT 293および TransIT— TKOを用いて導入した。 2日後にこれらの細胞力、ら RNAを抽 出し、リアルタイム RT—PCRにより、 rsGFP mRNAを定量した。対照として pQBI25 のみを導入した細胞を使用し、 pQBI25に乗っているネオマイシン耐性遺伝子を用 いてデータの補正を行なった。リアルタイム RT— PCRはリアルタイム RT— PCRコアキ ット（タカラバイオ社製）、スマートサイクラ一システム（タカラバイオ社製）を用いて行い 、 rsGFPのプライマーとして GFP_B_F (配列番号 25)、 GFP_B_R (配列番号 26) を、ネオマイシン耐性遺伝子のプライマーとして Neo_F (配列番号 27)、 Neo— R (配 列番号 28)のオリゴ DNAをそれぞれ使用した。結果を図 4に示す。図 4において、横 軸は使用した siRNA名、縦軸は対照として pQBI25のみを導入した細胞の mRNA 量を 100とした場合の相対値を示す。図 4において rsGFP mRNA量の減少は実施 例 5で得られたホタルノレシフェラーゼの相対発光強度の相対値の減少と一致すること から、実施例 4一 5記載の siRNA検索法が有用であることが確認できた。
産業上の利用可能性
[0068] 本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、 RNAを不安定化させる ことにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。 配列表フリーテキスト
[0069] SEQ ID NO:2: Chimeric oligonucleotide designed as RNA2—1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：3: Chimeric oligonucleotide designed as RNA2-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO :4: Chimeric oligonucleotide designed as RNA3-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：5: Chimeric oligonucleotide designed as RNA3-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：6: Chimeric oligonucleotide designed as RNA4—1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO:7: Chimeric oligonucleotide designed as RNA4-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：8: Chimeric oligonucleotide designed as RNA5—1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：9: Chimeric oligonucleotide designed as RNA5—2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：10: Chimeric oligonucleotide designed as RNA6-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID N〇：l l : Chimeric oligonucleotide designed as RNA6-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides"
SEQ ID NO: 12: Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
SEQ ID N〇：13: Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
SEQ ID N〇：14: Designed PCR primer rsGFP-l to amplify a portion of rsGFP gene.
SEQ ID N〇：15: Designed PCR primer rsGFP-2 to amplify a portion of rsGFP gene.
SEQ ID NO: 16: rsGFP gene
SEQ ID NO: 17: Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^ SEQ ID N〇：18: Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID N〇：19: Chimeric oligonucleotide designed as RNA8-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO:20: Chimeric oligonucleotide designed as RNA8 - 2. ^ nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO:21 : Chimeric oligonucleotide designed as RNA9-1. nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO:22: Chimeric oligonucleotide designed as RNA9 - 2. nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO:23: Chimeric oligonucleotide designed as RNAlO-l. nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO :24: Chimeric oligonucleotide designed as RNA10-2. nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides^
SEQ ID NO:25: Designed PCR primer GFP—B—F to amplify a portion of rsGFP gens.
SEQ ID NO:26: Designed PCR primer GFP—B—R to amplify a portion of rsGFP gens.
SEQ ID NO:27: Designed PCR primer Neo_F to amplify a portion of neomycin resistant gene.
SEQ ID NO:28: Designed PCR primer Neo-R to amplify a portion of neomycin resistant gene.

Claims

請求の範囲 [1] プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも 1つのタンパク 質をコードするヌクレオチド配歹 |J、およびポリ Aシグナル配列を有する核酸構築物で あって、 該核酸構築物はプロモーター配列とポリ Aシグナル配列の間に前記のポリペプチド をコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列をさらに含 有し、 プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列と該配列とは異なる翻訳されなレ、ヌクレオチド配列は該核酸構築物より 1分子 の RNAとして転写されるように連結されており、 さらに前記の翻訳されなレ、ヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする 核酸構築物；
(1)タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードす るヌクレオチド配歹 IJ、および
(2)天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位 置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
[2] 翻訳されなレ、ヌクレオチド配列力 プロモーター配列に翻訳可能な形で連結された タンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置している請求項 1記載の核酸
[3] 翻訳されなレ、ヌクレオチド配列力 プロモーター配列に翻訳可能な形で連結された タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置している請求項 1記載の核酸
[4] プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列がレポータータンパク質をコードするものである請求項 1記載の核酸構築物。
[5] 請求項 1記載の核酸構築物を含有するベクター。
[6] 翻訳可能な形の少なくとも 1つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列 とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有する RNAであって、前記の翻訳さ れないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする RNA; (1)前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質 をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド 配列、および
(2)天然におレ、て前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異 なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳 領域のヌクレオチド配列。
[7] 機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方 法であって、下記工程；
(1)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌク レオチド配歹 IJ、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオ チド配列を有する請求項 1記載の核酸構築物もしくは請求項 5記載のベクターより R NAを転写させる工程、
(2)工程（1)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(3)工程（2)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(4)工程（3)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する 工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
[8] 機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方 法であって、下記工程；
(1)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌク レオチド配歹 IJ、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードする ヌクレオチド配列の 5'側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオ チド配列を有する請求項 6記載の RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(2)工程（1)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(3)工程（2)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する 工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
[9] 請求項 7又は 8記載の方法により、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を 変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能 的ヌクレオチド分子の検索方法。
[10] 細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子の RNAへの接触が行 われる請求項 7または 8記載の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変 ィ匕させる作用を検出する方法。
[11] ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記ェ 程；
(1)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌ クレオチド配歹 1J、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有 する請求項 1記載の核酸構築物もしくは請求項 8記載のベクターより RNAを転写さ せる工程、
(2)工程（1)で転写された RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(3)工程（2)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
(4)工程（3)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ いてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索 方法。
[12] ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記ェ 程；
(1)翻訳されなレ、ヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌ クレオチド配歹 1J、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の 5 '側もしくは 3 '側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有 する請求項 6記載の RNAにヌクレオチド分子を接触させる工程、
(2)工程（1)の RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および (3)工程（2)で検出された RNAまたは該 RNAより翻訳される翻訳産物の量に基づ レ、て標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、 を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索 方法。
[13] 細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子の RNAへの接触が行 われる請求項 11または 12記載のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子 の検索方法。
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