KR20060065693A - 기능적 뉴클레오티드 분자 검출 방법 - Google Patents
기능적 뉴클레오티드 분자 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
유전자 발현을 효과적으로 저해시킬 수 있는 핵산 검사법; 상기 방법에 사용되는 핵산 작제물; 벡터; 및 상기 방법을 위한 키트. 프로모터 서열, 적어도 2개의 유전자 서열 및 폴리 A 시그날 서열을 갖고, 상기 기술된 적어도 2개의 유전자 서열은 싱글 분자 RNA로 전사되고 적어도 하나의 유전자 서열은 해독가능한 상태인 반면, 적어도 하나의 유전자 서열은 실질적으로 해독불가능한 상태로 코딩되는 핵산 작제물을 특징으로 하는 상기 방법을 수행한다.
Description
본 발명은 유전자 발현을 효율적으로 억제시킬 수 있는 핵산을 선별하는 일반적인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 방법에 사용하는 핵산 작제물 및 벡터, 및 상기 방법용 키트에 관한 것이다.
단백질 발현 수준은 다양한 방법으로 조절된다. 세포는 예를 들면, 전사 인자를 사용하여 유전자로부터 mRNAs로의 전사, mRNAs로부터 아미노산 서열로의 해독, 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 mRNAs의 안정성을 조절하여 원하는 발현 수준을 항상 유지한다.
mRNA 수준으로 단백질의 발현을 인공적으로 억제시키는 방법으로서 mRNA에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 억제, 리보자임을 사용한 mRNA의 분해, RNA 간섭(RNAi)을 포함한다. 상기 방법의 억제 효과는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 영역 또는 표적으로서 선택되는 주변 핵산 서열에 따라 현저히 다를 수 있다고 공지되어 있다.(예: 비특허 문헌 1). 단백질의 발현 수준을 측정하는 통상의 방법에 따라 표적 단백질 및 리포터 단백질의 융합 단백질을 합성하고 상기 단백질의 발현 수준은 인덱스로서 리포터 단백질을 사용하여 예측한다. 상기 방법에서, 일반적으로 리포 터 단백질을 표적 단백질의 하류에서 융합시켜 표적 단백질 및 리포터 단백질의 전체 융합 단백질이 해독되는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 해독가능한 상태의 리포터 유전자가 해독불가능한 상태로 표적 단백질을 코딩하는 인접 핵산 서열에 연결된 DNA는 공지된 바 없다.
예를 들면, Nilsen, T.W. 등은 표적 단백질, 및 표적 단백질의 하류에 융합된 리포터 단백질의 융합 단백질을 발현시키기 위한 DNA를 작제하고, 리포터 단백질의 발현을 조사하여 표적 핵산 서열의 발현을 효율적으로 억제시킬 수 있는 리보자임 등을 선별하였다(예: 특허 문헌 1). 그러나, 기능적 융합 단백질을 발현시키기는 쉽지 않다. 다수의 경우에서 단백질이 융합되면 그의 기능적은 상실된다. 따라서, 리포터 단백질이 검출되지 않는다면, 이는 분해에 의해 유발된 mRNA의 불안정화에 기인하는지, mRNA의 구조 변화에 기인하는지, 해독 수단의 저해에 기인하는지, 또는 리포터 단백질로서의 작용 상실에 기인하는지에 대하여 추가적으로 상세히 확인할 필요가 있다. 융합 단백질 또는 키메라 단백질을 형성하지 않으면서 표적 유전자로부터 유로된 서열에 작용하는 분자를 선별하는 방법은 공지되어 있지 않다.
따라서, 다수의 핵산 서열에 통상적으로 적용시킬 수 있는, mRNA의 안정성을 변화시켜 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법이 바람직하였다.
특허 문헌 1: United States Patent Publication No. 2002/0002278
비특허 문헌 1: Nature Medicine, Vol.9, No.3, pp.347 (2003)
발명의 개시
본 발명에 의해 해결하고자 하는 과제
본 발명의 주된 목적은 다수의 핵산 서열에 통상적으로 적용시킬 수 있는, 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
문제 해결 수단
본 발명자들은 상기 언급한 상황과 관련하여 연구 및 조사를 집중적으로 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 하기를 발견하게 되었다. 프로모터 서열, 적어도 2개의 유전자 서열 및 폴리 A 시그날 서열을 갖는 핵산 작제물을 작제하였다. 적어도 2개의 유전자 서열은 싱글 RNA 분자로 전사된다. 유전자 서열중 적어도 하나는 해독가능한 상태에 있고, 유전자 서열중 적어도 하나는 실질적으로 해독불가능한 상태로 코딩된다. 이로써, mRNA의 안정성을 변화시켜 해독불가능한 유전자 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 변화시킬 수 있는 분자를 선별할 수 있고, 상기 방법은 다수의 핵산 서열에 통상적으로 적용될 수 있다. 본 발명자들은 추가로 상기 언급한 핵산 작제물이 다수의 핵산 서열에 통상적으로 적용될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
본 발명을 하기와 같이 요약한다. 본 발명의 제 1면은 프로모터 서열, 해독가능한 상태로 상기 프로모터 서열에 연결된 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 폴리 A 시그날 서열을 갖는 핵산 작제물에 관한 것으로,
추가로 프로모터 서열과 폴리 A 시그날 서열 사이에 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
해독가능한 상태로 상기 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 함께 연결됨으로써, 핵산 작제물로부터 싱글 RNA 분자로 전사되도록 하고,
해독불가능한 뉴클레오티드 서열은
(A) 단백질 또는 상기 단백질의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(B) 자연발생적으로 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제 1면에 따른 핵산 작제물에서, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 해독가능한 상태로 상기 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치할 수 있다. 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 해독가능한 상태로 상기 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치할 수 있다. 추가로, 핵산 작제물에서 해독가능한 상태로 상기 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열은 리포터 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 제 2면은 제 1면의 핵산 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 제 3면은 해독가능한 상태의 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은
(A) 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질, 또는 상기 단백질의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(B) 자연발생적으로 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 측상에 위치하는 비해독 부위의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 RNA에 관한 것이다.
본 발명의 제 4면은
(A) 제 1면 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 2면의 벡터로부터 RNA를 전사시키고;
(B) 단계 (A)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(C) 단계 (B)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(D) 단계 (C)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 5면은
(A) 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서, 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 표적 유전자에서 단백 질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 3면의 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(B) 단계 (A)의 RNA 및 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(C) 단계 (B)에서 검출된 RNA 또는 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 기능적 뉴클레오티드에 의한 표적의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.
표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법은 제 4 또는 제 5면에 따른 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 제 4 또는 제 5면에 따른 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법에서 뉴클레오티드 분자를 세포 또는 무세포 단백질 합성 시스템에서 RNA와 접촉시킬 수 있다.
본 발명의 제 6면은
(A) 제 1면의 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 임의의 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 2 면의 벡터로부터 RNA를 전사시키고;
(B) 단계 (A)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(C) 단계 (B)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(D) 단계 (C)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 7면은
(A) 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서, 임의 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 3면의 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(B) 단계 (A)의 RNA 및 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(C) 단계 (B)에서 RNA 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법에 관한 것이다.
제 6면 또는 제 7면에 따른 뉴클레오티드 분자에 의해 그의 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법에서, 뉴클레오티드 분자를 세포에서 또는 무세포 단백질 시스템에서 RNA와 접촉시킬 수 있다.
발명의 효과
본 발명은 다수의 표적 유전자에 통상적으로 적용시킬 수 있는, RNA를 불안정화시켜 표적 유전자의 발현을 억제시키는 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법에 따른 선별 결과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법에 따른 선별 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법에 따른 선별 결과를 도시한다.
도 4는 본 발명의 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법에 따른 선별 결과를 도시한다.
본 발명을 수행하는 최선의 모드
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
본 발명에 따라, 핵산 작제물은 DNA 및/또는 RNA로 구성된 작제물이다. 핵산 작제물은 DNA 및/또는 RNA의 일부, 유사체 또는 변형된 화합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 표적 유전자는 발현이 변형되는 것이 바람직한 표적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및/또는 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터로부터 전사될 수 있는 것의 전후의 핵산 서열을 언급한다. 본 명세서에서의 표적 핵산 서열 또는 관심의 대상이 되는 핵산 서열로서도 언급될 수 있다. 표적 유전자는 전체 표적 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그 전후의 5' UTR (비해독 영역) 또는 3' UTR일 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 발현이 RNAi 작용에 의해 억제되는 것이 바람직한, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 전후의 서열(siRNA)과 같은 기능적 뉴클레오티드 분자이고, 뉴클레오티드 분자에 의해 매개되는 서열-특이성 mRNA 분해되는 핵산 서열이다. 또한, 유전자중 엑손에 상응하는 서열, 또는 개시 코돈으로서 작용하는 서열을 포함하지 않도록 변형된 서열이 바람직하게 사용될 수 있다. 표적 유전자는 진핵생물로부터 유래된 서열, 바이러스로부터 유래된 서열, 또는 원핵생물로부터 유래된 서열일 수 있다. 바이러스로부터 유래된 서열이 바이러스 게놈 분해, 또는 바이러스의 복제 또는 증식에 관여하는 기능적 뉴클레오티드 분자의 선별에 유용하다.
본 명세서에서 사용되는 바, 코딩 영역은 단백질의 아미노산 서열을 직접 정의하는 유전자 코드로 구성된 유전자에 영역을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, mRNA의 불안정화는 mRNA 분해 반응이 증가되었음을 의미한다. 축적되는 mRNA의 양은 두개의 반응, 즉, 합성 및 분해에 의존하게 된다. 합성 반응 및 분해 반응 사이의 균형이 분해 반응쪽으로 기울어질 때 mRNA는 불안정화된다고 언급된다. 표적 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 mRNA가 분해되는 한, mRNA 분해와 관련하여 특별하게 제한하지 않는다. 엔도형 또는 엑소형 분해일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 뉴클레오티드 분자는 뉴클레오시드의 포스포에스테르 화합물을 언급한다. 뉴클레오티드 분자는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있꺼나 그들로 구성된 키메라 분자일 수 있다. 뉴클레오티드 분자는 또한 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 단백질, 당 등과 컴플렉스를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 기능적 뉴클레오티드 분자는 단백질의 발현을 변화시키는 뉴클레오티드 분자를 언급한다. 기능적 뉴클레오티드 분자는 표적 단백질의 발현을 저해하는 분자, 서열-특이적 방식으로 본 발명의 RNA중의 해독불가능한 뉴클레오티드 서열에 작용하여 최종적으로는 전체 RNA를 불안정화시키는 분자, 및 서열-특이적 방식으로 본 발명의 RNA중의 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 분해하여 최종적으로는 전체 RNA를 불안정화시키는 분자를 포함한다. 기능적 뉴클레오티드 분자는 단백질, 당 등과 컴플렉스를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, 해독가능한 상태로 뉴클레오티드 서열은 적절한 조건 또는 환경하에서 단백질이 합성되도록 놓여진 뉴클레오티드 서열이다. 다수의 인자가 협조적으로 해독에 관여하지만 본 발명에 따른 해독가능한 상태는 뉴클레오티드 서열이 해독 개시 시그날 (해독 작용자), 해독 개시 코돈 및 해독 종결 코돈과 같이 해독에 필요한 최소한의 인자만을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 따라, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열이 이론상 해독되지 못하도록, 또한 극미량의 수준으로 해독되도록 디자인된 형태인 것, 즉, 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 해독되지 않는 것을 의미한다. 융합 단백질의 형성에 기인하는 영향이 제거될 수 있다는 본 발명의 특성이 상기 수준으로 회손되지 않는다면 미량 수준의 해독은 해독이 결여된 것과 실질적으로 동일하다. 즉, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 해독가능한 상태로 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서 해독되지 않는다. 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 해독에 필요한 최소한의 인자가 부족하기 때문에 해독되지 않는 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 상류 및 하류는 본 발명의 핵산 작제물에서 프로모터로부터 RNA의 전사 방향에 상대적인 위치를 나타낸다. 본 발명의 핵산 작제물에서, 프로모터 서열에 가까운 위치는 상류이며, 폴리 A 시그날 서열에 가까운 위치는 하류이다.
(1) 본 발명의 핵산 작제물
본 발명의 핵산 작제물은 프로모터 서열, 해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 폴리 A 시그날 서열을 갖는 핵산 작제물이고,
여기에서, 핵산 작제물은 추가로 프로모터 서열 및 폴리 A 시그날 서열 사이에 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 함께 연결되어 핵산 작제물로부터 싱글 RNA 분자로 전사되고,
해독불가능한 뉴클레오티드 서열은
(A) 단백질 또는 단백질 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(B) 자연발생적으로 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 핵산 작제물의 일례는 프로모터 서열, 폴리 A 시그날 서열, 및 상기 프로모터의 작용에 의해 싱글 RNA 분자로 전사되는, 프로모터 서열 및 폴리 A 시그날 서열 사이에 삽입된 DNA 서열을 갖는 핵산 작제물이고, 상기 DNA 서열은
(A) 리포터 유전자 서열에 연결된 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 갖는, DNA로부터 전사된 RNA는 해독가능한 상태로는 리포터 유전자 산물을 코딩하고 해독불가능한 상태로는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 DNA 서열;
(B) 리포터 유전자 서열 및 그에 인접한 제한 효소 인식/절단 부위를 갖고, DNA로부터 전사된 RNA는 해독가능한 상태로는 리포터 유전자 산물을 코딩하고 해독불가능한 상태로는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 DNA 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 통상 해독가능한 상태의 뉴클레오티드 서열과 상이한 유전자로부터 유래된다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 예를 들면, 본 발명의 핵산 작제물은 프로모터 서열, 리포터 유전자 서열, 종결 코돈으로 작용하는 서열, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열 및 폴리 A 시그날 서열이 상기 순서대로 배열되어 있는 핵산 작제물일 수 있다. 다르게는, 프로모터 서열, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열, 개시 코돈으로서 작용하는 서열, 리포터 유전자 서열 및 폴리 A 시그날 서열이 상기 순서대로 배열되어 있는 핵산 작제물일 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물중 해독불가능한 뉴클레오티드 서열(예, 표적 유전자로부터 유래된 서열)은 해독되지 않는 핵산 작제물로부터 전사되는 RNA중 UTR로서 존재한다. 따라서, 융합 단백질은 형성되지 않고, 그의 작용을 보유하고 있는 단백질이 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 (예, 리포터 단백질을 코딩하는 유전자 서열)로부터 발현된다. RNA에서 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 영역(예, 리보자임 또는 siRNA)을 분해하는 뉴클레오티드 분자의 존재하에서 전체 RNA를 불안정화시켜 해독가능한 상태로 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시킨다. 이어서, 본 발명의 핵산 작제물로부터 전사된 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 산물의 변화를 기록하여 해독불가능한 뉴클레오티드 서열의 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있는 분자를 일반적이고 용이하게 선별할 수 있다.
해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 해독되지 않는 서열인 경우에 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 유전자로부터 유래될 수 있다.
해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치하는 경우, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 위치하여 해독되지 않는 한 본 발명의 핵산 작제물과 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 특정 영역은 해독불가능한 상태로 서열을 만드는 해독 개시 코돈(예, ATG)를 포함하지 않도록 선택될 수 있다. 개시 코돈으로서 작용할 수 있는 가능성을 갖는 서열이 존재하는 경우, 상기 코돈은 뉴클레오티드의 치환, 부가, 결실 또는 삽입에 의해 변형시켜 서열을 해독불가능한 상태로 만들 수 있다.
해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 경우, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 위치하여 해독되지 않는 한 본 발명의 핵산 작제물과 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 종결 코돈으로서 작용하는 서열(TAA, TAG, TGA)은 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 해독불가능한 뉴클레오티드 서열 사이에 위치할 수 있다. 이 경우, 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에서 개시 코돈으로부터 출발하는 3개의 일련의 뉴클레오티드의 리딩 프레임(코돈)은 종결 코돈을 규정하고, 종결 코돈은 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 끝에서 RNA의 해독을 종결시키고, 하류의 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 해독되지 않는다. 따라서, 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 및 해독불가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 융합 단백질은 형성되지 않고, 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 해독 산물은 mRNA의 안정성을 반영하면서 발현되는 것으로 예측된다.
본 발명의 핵산 작제물을 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 유전자 발현의 변형을 검출하는 방법에 사용할 수 있다. 프로모터 서열이 진핵 세포 또는 그와 유사한 환경(예, 무세포 단백질 발현 시스템)에서 RNA 전사 개시 반응에 관여하는 작용을 갖는 서열인 경우, 프로모터 서열은 본 발명의 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 진핵생물로부터 유래된 프로모터 서열(예, β-액틴 프로모터, U6 프로모터) 또는 진핵 세포에서 프로모터 작용을 갖는 바이러스로부터 유래된 프로모터 서열(예, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터)를 사용할 수 있다. 추가로, 전사 반응이 수행되는 환경(생물학적 개체, 배양 세포, 무세포 단백질 합성 시스템 등)에 적절한 프로모터를 선택할 수 있다. 예를 들면, 무세포 단백질 합성 시스템의 경우 사용하고자 하는 RNA 폴리머라제에 상응하는 것을 선택할 수 있다. 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래된 상기 언급한 프로모터 서열외에도, T7 파지와 같은 파지로부터 유래된 프로모터 서열을 선택할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 단백질 발현을 억제시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 서열하는 경우, 억제 정도를 명확하게 판단하기 위하여 구성상의 강력한 발현 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물에 포함된 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열이 리포터 유전자 서열에 의해 예시화된다. 직접 및/또느 간접적으로 검출될 수 있는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자의 핵산 서열인 경우 리포터 유전자 서열과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 리포터 유전자에 의해 코딩되는 단백질(리포터 단백질)과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 그의 예로서, 특이적으로 검출될 수 있는 물질을 생산하는 효소(β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리성 포스포타아제 등) 및 직접 검출될 수 있는 단백질을 포함한다. 유용한 성질을 유지하는 한 사용될 수 있는 한 리포터 유전자중 일부만이 선택될 수 있고, 사용될 수 있다. 복수개의 리포터 유전자가 조합되어 사용될 수 있다. 단백질을 직접 검출하는 방법의 예로서, 리포터 단백질을 인지하는 특이적 항체를 사용하여 수행하는 검출 방법, 형광 시그날을 방사하는 리포터 단백질(예: 녹색 형광 단백질(GFP))로부터의 형광을 검출하는 방법, 및 약물 내성 성질을 제공하는 것과 같은 선별성 마커 단백질의 사용을 포함한다. 리포터 단백질을 사용하여 세포를 분류할 수 있다. 예를 들면, 형광 시그날을 방사하는 리포터 단백질은 상기 단백질을 발현시키는 세포를 FACS (형광표지세포분리) 방법을 사용하여 선별할 수 있기 때문에 이는 유용하다.
본 발명의 핵산 작제물에 포함된 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 관심의 대상이 되는 표적 유전자 (또는 그의 발현이 변화되는 것이 바람직한 것)의 영역일 수 있다. 표적 단백질에 대한 코딩 부위, 코딩 부위의 일부, 3' UTR 또는 5' UTR이 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 선택될 수 있다. 추가로, 복수개의 유전자로부터 유래된 서열은 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로 배열될 수 있다. 추가로, 게놈 라이브러리로부터 제조된 핵산(군집), 또는 특정 장기 또는 특정 단계 등에서 발현을 나타내는, 관심의 대상이 되는 유기체로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물은 그가 전이되는 숙수 세포 또는 전사 반응 혼합물에서 싱글 RNA 분자로 전사된다. 기능적 뉴클레오티드 분자로 RNA를 불안정화시킬 수 있다. 기능적 뉴클레오티드 분자는 RNA에서 해독불가능한 뉴클레오티드 서열의 영역의 뉴클레오티드 서열을 인지하고 그에 작용하여 전체 RNA를 불안정화시키는 분자로서 예시된다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 사용하여 하기의 작용을 연구할 수 있다: dsRNA, siRNA, shRNA 및 RNAi 메커니즘에서 뉴클레아제 컴플렉스(RNA-유도성 사일런싱 컴플렉스(RISC)), 유기체의 발생 단계에 관여하는 것으로 사료되는 stRNA (작은 일시적인 RNA), 다양한 생물학적 이벤트에 관여하는 것으로 사료되는 miRNA (마이크로 RNA), miRNA를 포함하는 단백질 컴플렉스 miRNP, 리보자임, 맥시자임(maxizyme), 해머헤드(hammerhead) 리보자임, 안티센스 RNA, EGS (외부 가이드 서열) 및 뉴클레오티드 분자를 포함하는 단백질 컴플렉스.
해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 (예, 리포터 단백질)은 거의 자연 상태로 융합 단백질을 형성하지 않고, 개체 단백질로서 본 발명의 핵산 작제물로부터 전사된 RNA로부터 발현된다. 예를 들면, 리포터 단백질의 발현이 억제될 경우, 표적 유전자에 의해 코딩된 단백질 및 리포터 단백질의 융합 단백질이 형성된 결과로서 리포터 유전자의 고유 작용의 변화에 의해 상기 현상이 유발될 수 있다는 가능성이 존재한다. 본 발명의 유전자 발현을 검출하는 방법에 따라 상기 가능성을 제거할 수 있다. 또한, 해독 메커니즘을 저해하기 위하여 기능적 뉴클레오티드 분자의 해독불가능한 뉴클레오티드 서열에 대한 작용 결과로서 결과로서 리포터 유전자의 고유 작용의 변화에 의해 상기 현상이 유발될 수 있다는 가능성이 존재한다.
또한, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 단백질로 해독될 필요가 없기 때문에 해독불가능한 뉴클레오티드 서열의 리딩 프레임(코돈; 각 아미노산에 상응하는 3개의 뉴클레오티드 쇄)을 피팅할 필요가 없다. 따라서, 예를 들면 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실에 의해 리딩 프레임을 피팅하거나 적절한 제한 효소 인지 부위를 선택할 필요가 없기 때문에 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 핵산 작제물중 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 용이하게 연결될 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물은 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 그에 인접한 제한 효소 인지/절단 부위를 갖는 핵산 작제물을 포함하고, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 제한 효소 인지/절단 부위로 삽입되는 경우, 핵산 작제물로부터 전사된 RNA는 해독될 수 있는 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 코딩하고, 실질적으로 해독되지 않는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 코딩한다. 임의의 목적에 따라 사용할 때 표적 유전자 서열을 삽입할 수 있기 때문에 핵산 작제물이 유용하다. 제한 효소 인지/절단 부위는 관심의 대상이 되는 표적 유전자 서열의 삽입에 용이한 서열인 경우 사용될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 예를 들면, 하나 또는 복수개의 제한 효소 부위(들)이 배열되어 있는 하나의 클로닝 부위 또는 복수개의 클로닝 부위로 명명되는 서열을 사용할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 벡터 또는 링커로 광범위하고 보편적으로 사용되는 서열을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물에서 폴리 A 시그날 서열은 mRNA의 3' 말단에서 폴리 A 첨가 반응을 일으키는 서열이다. 폴리 A 시그날 서열이 폴리 A 첨가 반응을 일으키는 서열인 경우 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 고등 진핵생물로부터의 mRNAs에서 고도로 보존적이고, 통상 폴리 A 첨가 부위 상류에 11 내지 30개의 뉴클레오티드로 존재하는 뉴클레오티드 서열 AAUAAA가 사용될 수 있다.
종결자 서열은 본 발명의 핵산 작제물에서 폴리 A 시그날 서열 하류에 존재할 수 있다. 종결자 서열은 RNA 폴리머라제에 의한 mRNA의 전사를 종결시키는 작용을 갖는 서열인 경우 사용할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, RNA 폴리머라제는 진핵생물 종결자 서열내 여러 부위에서 RNA 합성을 종결시킨다.
본 발명의 핵산 작제물에 포함된 폴리 A 시그날 서열 및 종결자 서열은 RNA 전사 반응이 수행되는 환경에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 숙주에 적합화된 다수의 단백질 발현 벡터는 상업적으로 이용할 수 있다. 본 발명의 핵산 작제물은 상기 벡터에 기초하거나 그를 조합하여 제조할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 예를 들면, 송아지-유도 BGH 폴리 A 시그날 서열 및 종결자 서열을 사용할 있다.
(2) 본 발명의 벡터
본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 벡터이다. 동일한 분자내 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 (예, 리포터 유전자 서열), 해독불가능한 뉴클레오티드 서열(예, 표적 유전자 서열) 및 폴리 A 시그날 서열을 포함하는 RNA가 적절한 숙주 세포 또는 숙주 세포의 환경과 유사한 반응 혼합물에서 전사되는 벡터일 수 있다. 본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산 작제물을 포함하는 한 본 발명의 벡터를 작제하기 위해 사용되는 벡터를 포함한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 자가 복제가능한 벡터, 바이러스 벡터, 숙주 염색체내로 통합된 벡터, 또는 일시 또는 일과적 발현을 위한 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 작제물에 포함된 프로모터 서열, 유전자 서열 및 기능적 뉴클레오티드 분자에 따라 적합한 종의 숙주 또는 벡터를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 다수의 현재 상업적으로 이용가능한 숙주-벡터 시스켐으로부터 목적에 적절한 것을 선택할 수 있다.
(3) 본 발명의 RNA
본 발명의 RNA는 해독가능한 상태의 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이하고,
(A) 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질, 또는 상기 단백질의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(B) 자연발생적으로 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA이다.
본 발명의 RNA는 생체내 또는 시험관내에서의 본 발명의 핵산 작제물 전사에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 RNA를 구성하는 성분으로서 RNAs를 연결시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 RNA는 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법, 또는 그의 발현이 본 발명에 따른 뉴클레오티드 분자에 의해 변화되는 유전자를 선별하는 방법에 사용될 수 있다.
(4) 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법
본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법은
(A) (1)에 기술된 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, (2)에 기술된 벡터로부터 RNA를 전사시키고;
(B) 단계 (A)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(C) 단계 (B)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(D) 단계 (C)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함한다.
일면에서, 본 발명의 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법은
(A) 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터를 제조하고(즉, 핵산 작제물은 프로모터 서열, 폴리 A 시그날 서열, 및 상기 프로모터의 작용에 의해 싱글 RNA 분자로 전사되는, 프로모터 서열 및 폴리 A 시그날 서열 사이에 삽입된 DNA 서열을 갖는 핵산 작제물이고, 상기 DNA 서열은 리포터 유전자에 연결된 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 갖는, DNA로부터 전사된 RNA는 해독가능한 상태로는 리포터 유전자 산물을 코딩하고 해독불가능한 상태로는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 DNA 서열이다);
(B) 단계 (A)에서의 벡터 또는 핵산 작제물로부터 RNA를 전사시키고;
(C) 단계 (B)에서의 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(D) RNA에서의 리포터 유전자 영역 또는 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함한다.
기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용은 본 발명의 핵산 작제물 또는 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 사용하여 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열 및 폴리 A 시그날 서열을 포함하는 일련의 서열을 포함하는 RNA를 전사시키거나, 본 발명의 RNA를 제조하고; RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고; 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA 일부 또는 해독된 단백질을 검출하고 비교하여 검출할 수 있다. 상기 언급한 검출 결과, 변화를 초래하는 뉴클레오티드는 기능적 뉴클레오티드라는 것을 판단할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라, 상기 언급한 검출 방법을 사용하여 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드에 대한 복수개의 뉴클레오티드 분자를 선별할 수 있다. RNA의 전사, 뉴클레오티드 분자와의 접촉, 단백질 발현은 세포내 또는 세포외에서 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 기능적 뉴클레오티드를 선별하는 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 작제물 또는 본 발명의 벡터 및 기능적 뉴클레오티드 분자를 숙주 세포로 전이시키고 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 발현을 조사한다.
기능적 뉴클레오티드 분자는 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 기초하여 화학적으로 합성되거나, 생체 합성에 의해 생산될 수 있다. 다르게는, 숙주 세포에서 생산되도록 하기 위하여 디자인된 전이된 벡터를 갖는 숙주 세포에서 발현된 산물일 수 있다. 추가로, 복수개의 기능적 뉴클레오티드 분자, 예로서, 게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리 또는 장기/단계-특이성 cDNA 라이브러리로부터 유래된 복수개의 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 라이브러리를 사용하여 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별할 수 있다 .
본 발명의 방법에 따라, RNA를 직접 검출할 수 있거나, 본 발명의 벡터 또는 핵산 작제물로부터 전사된 RNA이거나 본 발명의 RNA인 RNA와 뉴클레오티드를 검촉시킨 후 RNA로부터 해독 산물을 검출할 수 있다. RNA를 양적으로 또는 질적으로 검출할 수 있는 한, 보고된 RNA를 직접 검출하는 다수의 방법이 사용될 수 있다. 그의 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 농도 측정, 겔 전기 영동 방법, PCR (중합효소 연쇄반응) 방법, 실시간 PT-PCR 방법, TAS(전사-기초 증폭 시스템) 방법, 3SR (자가 서열 복제(Self-Sustained Sequence Replication)), NASBA (핵산 서열-기초 증폭(Nucleic acid-Based Amplification) 방법, Qβ-리플리카제 방법 및 TMA (전사 매개 증폭(Transcription Mediated Amplification)) 방법을 포함한다.
본 발명의 핵산 작제물, 본 발명의 벡터, 기능적 올리고뉴클레오티드 분자를 생산할 수 있는 기능적 뉴클레오티드 분자 또는 핵산 작제물을 숙주 세포내로 전이시키는 방법은 핵산 작제물 또는 벡터에 적절하도록 선택될 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 물리 또는 화학적 수단을 사용한 직접 전이 또는 감염에 의한 전이를 사용할 수 있다.
(5) 본 발명의 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법
본 발명의 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법은
(A) 제 1면의 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 임의의 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 2면의 벡터로부터 RNA를 전사시키고;
(B) 단계 (A)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;
(C) 단계 (B)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;
(D) 단계 (C)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법에 따라, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별할 수 있거나, 게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리 또는 장기/단계-특이성 cDNA 라이브러리로부터의 복수개의 표적 서열을 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 생산하여 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터를 제조하고; 복수개의 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복수개의 RNA를 전사시키거나, 본 발명의 RNA를 제조하고; RNA와 기능적 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고; 해독가능한 상태로 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA 일부 또는 해독된 단백질을 검출하여 상기 기능적 뉴클레오티드의 작용을 선별할 수 있다. 프로모터 서열, 폴리 A 시그날 서열, 및 상기 프로모터의 작용에 의해 싱글 RNA 분자로 전사되는, 프로모터 서열 및 폴리 A 시그날 서열 사이에 삽입된 DNA 서열을 갖는 핵산 작제물이 본 발명에 바람직하게 사용될 수 있다. DNA 서열은 리포터 유전자 및 그에 인접한 제한 효소 인식/절단 부위를 갖고, 표적 유전자 서열이 제한 효소 인지/절단 부위에 삽입된 경우, DNA 서열로부터 전사된 RNA는 산물이 해독될 수 있도록 리포터 유전자를 코딩하고, 산물이 해독되지 못하도록 표적 유전자 서열을 코딩하는 DNA 서열이다.
(6) 본 발명의 키트
본 발명은 상기 (4) 또는 (5)에 기술된 본 발명에 따라 기능적 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법 또는 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법에 사용되는 키트를 제공한다.
일면에서, 본 발명의 키트는 상기 (1)에 기술된 바와 같은 본 발명의 핵산 작제물 또는 상기 언급한 핵산 작제물에서 해독불가능한 유전자 서열 대신 클로닝 사이트를 포함하는 핵산 작제물을 포함하고, 사용자는 관심의 대상이 되는 표적 유전자로부터 유래된 서열을 그에 삽입할 수 있는, 패킹 형태의 키트이다.
"지시서"는 키트를 사용하는 방법, 예로서, 시약 용액 제조 방법, 권장 반응 조건 등이 기재된 인쇄물이다. 지시서는 팜플렛 또는 리플릿, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지 표면상의 설명서 형태의 지시서 매뉴얼을 포함한다. 지시서는 또한 인터넷과 같은 전자 매체를 통해 제공되거나 개시되는 정보를 포함한다.
추가로, 본 발명의 키트는 (2)에 기술된 벡터 또는 (3)에 기술된 RNA를 포함하는 키트를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세힌 설명하지만, 그의 범위로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에 기술된 방법중, 플라스미드 DNAs 및 제한 효소 분해를 포함하는 기본 공정은 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed]에 기술되어 있다. 달리 언급하지 않는 한, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109를 Escherichia coli를 사용하는 플라스미드의 작제를 위한 숙주로서 사용하였다. 형질전환된 Escherichia coli 세포를 100μg/ml의 앰피실린을 포함하는 LB 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0) 또는 농도 1.5%의 아가를 상기 언급된 배지에 가하고 생성된 혼합물을 고형화시켜 제조된 LB-앰피실린 플레이트를 사용하여 37℃에서 호기 배양하였다. 습윤화된 배양 인큐베이터에서 5% CO2 존재하에 37℃에서 세포 배양 디쉬(Iwaki Glass)중 10% 우태아 혈청(Bio Whittaker)으로 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지를 배지로서 사용하여 세포를 배양하였다. 키트를 사용하고 다양한 장치는 첨부된 지시서에 따라 조작하였다.
실시예 1: 마우스 Fas 유전자 서열을 갖는 표적 플라스미드의 작제
플라스미드 pQBI25 (Wako Chemicals USA)는 CMV 프로모터, rsGFP (레드 쉬프트 그린 형광 단백질) 유전자 및 BGH 폴리 A를 갖고, 세포내에서 rsGFP를 효과적으로 발현시킨다. 제한 효소 BamHI 및 EcoRI에 대한 사이트는 rsGFP 유전자 및 BGH 폴리 A 사이에 존재한다. 말단에 첨가된 제한 효소 BamHI 및 EcoRI에 대한 점착말단과 함께 개시 코돈 하류의 75개의 뉴클레오티드로부터 마우스 Fas 유전자(GenBank Accession: M83649)의 종결 코돈까지의 서열을 갖는 dsDNA (서열 번호:1)를 pQBI25중 BamHI 및 EcoRI 사이트 사이에 삽입시켜 표적 플라스미드 pTargetFas를 작제하였다. 표적 플라스미드를 세포에서 rsGFP 유전자 서열 및 Fas 유전자의 부분 서열을 갖는 RNA로 전사시켰다.
실시예 2: Fas 유전자의 발현을 효과적으로 억제시키는 siRNA 선별
각각 마우스 Fas 유전자의 부분 서열을 갖는 5개의 21-bp의 dsRNAs를 제조하였다. 각각 RNA2-1 (서열 번호:2)과 RNA2-2 (서열 번호:3), RNA3-1 (서열 번호:4)과 RNA3-2 (서열 번호:5), RNA4-1 (서열 번호:6)과 RNA4-2 (서열 번호:7), RNA5-1 (서열 번호:8)과 RNA5-2 (서열 번호:9), 및 RNA6-1 (서열 번호:10)과 RNA6-2 (서열 번호:11)를 어닐링하여 RNA2, RNA3, RNA4, RNA5 및 RNA6을 제조하였다. 각 dsRNA를 pTargetFas와 함께 293개의 세포 (ATCC No. CRL-1573)로 전이시켰다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 및 Ribojuice (Takara Bio)을 사용하여 유전자 전이를 수행하였다. 세포를 2일동안 배양하고, 트립신을 사용하여 디쉬로부터 분리시키고 MoFlo (Takara Bio)를 사용하여 세포의 형광 강도를 측정하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 RNA 전이가 없는 대조 세포의 형광 강도를 100으로서 정의한 상대치이다. RNA2 및 pTargetFas가 정이된 세포에서 가장 약한 형광 강도가 관찰되었다. 따라서, RNA2가 Fas 유전자의 발현을 효과적으로 억제시키는 siRNA라고 판단되었다.
실시예 3: 실시예 2의 결과 확인
실시예 2에서 관찰된 siRNA의 효능을 하기와 같이 확인하였다. 리보juice (Takara Bio)를 사용하여 RNA2, RNA3, RNA4, RNA5 또는 RNA6를 Fas를 발현시키는 NIH3T3 세포 (ATCC No. CRL-1658)내로 전이시켰다. 2일 후, 세포로부터 RNAs를 수출하고 실시간 RT-PCR을 사용하여 Fas mRNAs를 측량하였다. RNA가 전이되지 않은 세포를 대조군으로서 사용하고, 하우스-키핑 유전자 GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제)를 사용하여 데이타를 보정하였다. Real Time RT-PCR Core Kit (Takara Bio) 및 Smart Cycler System (Takara Bio), 및 Fas에 대한 프라이머로서 서열 번호:12 및 13의 올리고 DNAs 또는 GAPDH에 대항 프라이머로서 Real Time RT-PCR Primer (Takara Bio)의 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 RNA 전이가 없는 대조 세포의 형광 강도를 100으로서 정의한 상대치를 나타낸다. Fas mRNA 양의 감소는 실시예 2에서 관찰 된 rsGFP 형광 강도의 감소와 일치하였다. 따라서, 상기 선별 방법은 유용하다는 것이 확인되었다.
실시예 4: rsGFP (레드 쉬프트 그린 형광 단백질) 유전자 서열을 갖는 표적 플라스미드의 작제
rsGFP 유전자에서 개시 코돈으로부터 종결 코돈 주변 부위까지의 영역을 포함하고, 말단에 제한 효소 XbaI 및 NheI에 대한 사이트를 갖는 DNA 단편(서열 번호:16)을 프라이머로서 rsGFP-1 (서열 번호:14) 및 rsGFP-2 (서열 번호:15), 및 주형으로서 pQBI25을 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. DNA 단편을 제한 효소 XbaI 및 NheI으로 처리하여 약 720-bp DNA 단편을 수득하였다. 약 720-bp DNA 단편을 플라스미드 pGL3control중 개똥벌레 루시퍼라아제 유전자 및 SV40 폴리 A 상이에 존재하는 제한 효소 XbaI에 대한 사이트에 삽입하여 표적 플라스미드 pGL3-3'(GFP)를 작제하였다.
실시예 5: rsGFP 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 siRNA의 선별
각각 rsGFP 유전자의 부분 서열을 갖는 5개의 21-bp dsRNAs를 제조하였다. RNA7-1 (서열 번호:17)과 RNA7-2 (서열 번호:18), RNA8-1 (서열 번호:19)과 RNA8-2 (서열 번호:20), RNA9-1 (서열 번호:21)과 RNA9-2 (서열 번호:22), 및 RNA10-1 (서열 번호:23)과 RNA10-2 (서열 번호:24)를 각각 어닐링시켜 RNA7, RNA8, RNA9 및 RNA10을 제조하였다. Renilla 루시퍼라아제를 발현시키는 대조군으로서 pGL3-3'(GFP) 및 pRL-TK (Promega)와 함께 각 dsRNA를 293개의 세포(ATCC No. CRL-1573)내로 전이시켰다. 유전자 전이는 TransIT293 (Takara Bio) 및 TransIT-TKO (Takara Bio)를 사용하여 수행하였다. siRNA 농도는 최종 농도가 1.25 내지 160 nM가 되도록 세팅하였다. 세포를 24시간동안 배양하였다. 배양 상등액을 제거한 후 세포를 PBS로 1회 세척하고, 탈이온수중 5 x Passive Lysis Buffer (Promega)의 5배 희석액으로 분해시켰다. 개똥벌레 루시퍼라아제 및 Renilla 루시퍼라아제로부터의 발광치를 발광 플레이트 판독기 Mithras 940 (Berthold)를 사용하여 Dual 루시퍼라아제 Assay System (Promega)의 프로토콜에 따라 10㎕의 분해물에 대하여 측정하였다.
상데 발광 강도 (= 개똥벌레 루시퍼라아제로부터의 발광치/Renilla 루시퍼라아제로부터의 발광치)를 수득한 발광치에 기초하여 산출하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서, 가로출은 전이시의 siRNA 농도를 나타내고, 세포축은 RNA 전이가 없는 대조 세포의 형광 강도를 100으로서 정의한 각 샘플에 대한 상대 발광 강도 상대치를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 더욱 낮은 상대 발광 강도 상대치는 RNA8, RNA10, RNA9 및 RNA7 순으로 관찰되었다. 따라서, rsGFP 유전자의 발현은 siRNAs, RNA8, RNA10, RNA9 및 RNA7의 순서대로 더욱 효과적으로 억제된다고 판단되었다.
실시예 6: 실시간 RT-PCR을 사용하여 RNAi 비교
각각의 siRNAs (RNA7-10) 및 rsGFP 발현플라스미드 (pQBI25)를 TransIT293 및 TransIT-TKO를 사용하여 293개의 세포로 전이시켰다. 2일 후 RNAs를 세포로부터 추출하고, 실시간 RT-PCR을 사용하여 rsGFP mRNAs을 측량하였다. 단지 pQBI25만이 전이된 세포를 대조군으로 사용하고 pQBI25에서 네오마이신 내성 유전자를 사용하여 데이타를 보정하였다. Real Time RT-PCR Core Kit (Takara Bio) 및 Smart Cycler System (Takara Bio), rsGFP에 대한 프라이머로서 GFP-B-F(서열 번호:25) 및 GFP-B-R (서열 번호:26) 또는 네오마이신 내성 유전자에 대한 프라이머로서 올리고 DNAs Neo-F (서열 번호:27) 및 Neo-R (서열 번호:28)를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서, 가로축은 사용된 siRNAs의 명칭이고, 세로축은 pQBI25만이 전이된 대조군 세포에 대한 mRNA 양을 100으로 정의한 상대치를 나타낸다. 도 4에서 나타낸 rsGFP mRNA 양의 감소는 실시예 5에서 관찰된 개똥벌레 루시퍼라아제로부터의 상대 발광 강도의 상대치의 감소와 일치하였다. 따라서, 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 siRNA 선별 방법이 유용하다는 것이 확인되었다.
산업상 이용가능성
본 발명은 다수의 표적 유전자에 통상적으로 적용될 수 있는, RNA를 불안정화시켜 표적 유전자의 발현을 억제시키는 뉴클레오티드 분자를 선별하는 방법을 제공한다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 번호:2: RNA2-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:3: RNA2-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:4: RNA3-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:5: RNA3-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:6:RNA4-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:7: RNA4-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:8: RNA5-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:9: RNA5-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:10: RNA6-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티 드이다"
서열 번호:11: RNA6-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:12: 마우스 Fas 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머.
서열 번호:13: 마우스 Fas 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머.
서열 번호:14: rsGFP 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머 rsGFP-1.
서열 번호:15: rsGFP 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머 rsGFP-2.
서열 번호:16: rsGFP 유전자
서열 번호:17: RNA7-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:18: RNA7-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:19: RNA8-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티 드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:20: RNA8-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:21: RNA9-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:22: RNA9-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:23: RNA10-1로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:24: RNA10-2로 명명되는 키메라 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 1 내지 19는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열 번호:25: rsGFP 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머 GFP-B-F.
서열 번호:26: rsGFP 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이 머 GFP-B-R.
서열 번호:27: 네오마이신 내성 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 디자인된 PCR 프라이머 Neo-F.
SEQUENCE LISTING
<110> TAKARA BIO INC.
<120> Method of screening functional nucleotide molecule
<130> 664687
<150> JP 2003-307624
<151> 2003-08-29
<160> 28
<210> 1
<211> 907
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
tagcatctcc gagagtttaa agctgaggag gcgggttcat gaaactgata aaaactgctc 60
agaaggatta tatcaaggag gcccattttg ctgtcaacca tgccaacctg gtaaaaaaaa 120
agttgaggac tgcaaaatga atgggggtac accaacctgt gccccatgca cagaagggaa 180
ggagtacatg gacaagaacc attatgctga taaatgcaga agatgcacac tctgcgatga 240
agagcatggt ttagaagtgg aaacaaactg caccctgacc cagaatacca agtgcaagtg 300
caaaccagac ttctactgcg attctcctgg ctgtgaacac tgtgttcgct gcgcctcgtg 360
tgaacatgga acccttgagc catgcacagc aaccagcaat acaaactgca ggaaacaaag 420
tcccagaaat cgcctatggt tgttgaccat ccttgttttg ttaattccac ttgtatttat 480
atatcgaaag taccggaaaa gaaagtgctg gaaaaggaga caggatgacc ctgaatctag 540
aacctccagt cgtgaaacca taccaatgaa tgcctcaaat cttagcttga gtaaatacat 600
cccgagaatt gctgaagaca tgacaatcca ggaagctaaa aaatttgctc gagaaaataa 660
catcaaggag ggcaagatag atgagatcat gcatgacagc atccaagaca cagctgagca 720
gaaagtccag ctgctcctgt gctggtacca atctcatggg aagagtgatg catatcaaga 780
tttaatcaag ggtctcaaaa aagccgaatg tcgcagaacc ttagataaat ttcaggacat 840
ggtccagaag gaccttggaa aatcaacccc agacactgga aatgaaaatg aaggacaatg 900
tctggag 907
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA2-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
<400> 2
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<211> 21
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other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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gucugguuug cacuugcact t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA3-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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agccgaaugu cgcagaacct t 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
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other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<211> 21
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<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA4-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA4-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
<400> 7
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA5-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
<400> 8
ggauuauauc aaggaggcct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<212> DNA
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<220>
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other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
<400> 12
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer to amplify a portion of mouse Fas gene.
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<213> Artificial Sequence
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<223> Designed PCR primer rsGFP-1 to amplify a portion of rsGFP gene.
<400> 14
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<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer rsGFP-2 to amplify a portion of rsGFP gene.
<400> 15
cagtcacgac gctagcagtt gtacagttca tccatgcc 38
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<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rsGFP gene
<400> 16
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attagatggt gatgttaacg gccacaagtt ctctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc 120
aacatacgga aaacttaccc tgaagttcat ctgcactact ggcaaactgc ctgttccatg 180
gccaacacta gtcactactc tgtgctatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccggatca 240
tatgaaacgg catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaaggac 300
catcttcttc aaagatgacg gcaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga 360
tacccttgtt aatagaatcg agttaaaagg tattgacttc aaggaagatg gcaacattct 420
gggacacaaa ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca 480
aaagaatgga atcaaagtga acttcaagac ccgccacaac attgaagatg gaagcgttca 540
actagcagac cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga 600
caaccattac ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca 660
catggtcctt cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactgta 720
caactgctag cgtcgtgact g 741
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA7-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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ggaccaugug gucucucuut t 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA8-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA8-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
<400> 20
uggucugcua guugaacgct t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA9-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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agagagacca caugguccut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA9-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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aggaccaugu ggucucucut t 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA10-1. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
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guucucuguc aguggagagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric oligonucleotide designed as RNA10-2. "nucleotides 1 to 19 are ribonucleotides-
other nucleotides are deoxyribonucleotides"
<400> 24
cucuccacug acagagaact t 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer GFP-B-F to amplify a portion of rsGFP gene.
<400> 25
gccacaacat tgaagatgga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer GFP-B-R to amplify a portion of rsGFP gene.
<400> 26
gaaagggcag attgtgtgga 20
<210> 27
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed PCR primer Neo-F to amplify a portion of neomycin resistant gene.
<400> 27
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<220>
<223> Designed PCR primer Neo-R to amplify a portion of neomycin resistant gene.
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gaaggcgata gaaggcgatg 20
Claims (13)
- 프로모터 서열, 해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 폴리 A 시그날 서열을 갖되,추가로 프로모터 서열 및 폴리 A 시그날 서열 사이에 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하며,해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 해독불가능한 뉴클레오티드 서열은 함께 연결되어 핵산 작제물로부터 싱글 RNA 분자로 전사되고,해독불가능한 뉴클레오티드 서열은(1) 단백질 또는 단백질 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및(2) 자연발생적으로 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 핵산 작제물.
- 제 1항에 있어서, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 핵산 작제물.
- 제 1항에 있어서, 해독불가능한 뉴클레오티드 서열이 해독가능한 상태로 프 로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치하는 핵산 작제물.
- 제 1항에 있어서, 해독가능한 상태로 프로모터 서열에 연결된 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열이 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 작제물.
- 제 1항의 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
- 해독가능한 상태의 적어도 하나의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이하고,(1) 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질, 또는 상기 단백질의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및(2) 자연발생적으로 해독가능한 상태의 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열과 상이한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA.
- (1) 제 1항의 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 5항의 벡터로부터 RNA를 전사시키고;(2) 단계 (1)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;(3) 단계 (2)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;(4) 단계 (3)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법.
- (1) 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서, 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 표적 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 6항의 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;(2) 단계 (1)의 RNA 및 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;(3) 단계 (2)에서 검출된 RNA 또는 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 기능적 뉴클레오티드에 의한 표적의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 단계를 포함하는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법.
- 제 7항 또는 제 8항의 방법에 따라 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 변화시키는 기능적 뉴클레오티드 분자의 선별 방법.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 뉴클레오티드 분자를 세포 또는 무세포 단백질 합성 시스템에서 RNA와 접촉시키는, 기능적 뉴클레오티드 분자에 의한 표적 유전자의 발현을 변화시키는 작용을 검출하는 방법.
- (1) 제 1항의 핵산 작제물, 또는 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서 임의의 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제 2항의 벡터로부터 RNA를 전사시키고;(2) 단계 (1)에서 전사된 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;(3) 단계 (2)에서의 RNA 또는 상기 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;(4) 단계 (3)에서 RNA 또는 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변화되는 유전자를 선별하는 방법.
- (1) 해독불가능한 뉴클레오티드 서열로서, 임의 유전자에서 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열의 일부, 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3'측상에 위치하는 해독불가능한 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 제 6항의 RNA와 뉴클레오티드 분자를 접촉시키고;(2) 단계 (1)의 RNA 및 RNA로부터 해독된 해독 산물을 검출하고;(3) 단계 (2)에서 RNA 검출된 RNA로부터 해독된 해독 산물의 양에 기초하여 표적 유전자의 발현을 변경시키는 기능적 뉴클레오티드 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 분자에 의해 발현이 변경되는 유전자를 선별하는 방법.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 뉴클레오티드 분자를 세포 또는 무세포 단백질 합성 시스템에서 RNA와 접촉시키는, 뉴클레오티드 분자에 의해 그의 발현이 변경되는 유전자를 선별하는 방법.
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