DE10053879A1 - Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen - Google Patents
Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen ZellenInfo
- Publication number
- DE10053879A1 DE10053879A1 DE10053879A DE10053879A DE10053879A1 DE 10053879 A1 DE10053879 A1 DE 10053879A1 DE 10053879 A DE10053879 A DE 10053879A DE 10053879 A DE10053879 A DE 10053879A DE 10053879 A1 DE10053879 A1 DE 10053879A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- acid sequence
- seq
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft spezifische, regulatorische Sequenzbereiche des alpha Smooth Muscle Aktin-Gens (alpha-SMA-Gens), Funsionskonstrukte, in denen solche regulatorische Sequenzbereiche des alpha-SMA-Gens mit weiteren funktionellen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft sind, sowie die Verwendung solcher regulatorischer Sequenzbereiche zur zelltyp- und differenzierungsspezifischen Reporterexpression, zur zelltyp- und differenzierungsspezifischen Genveränderungen (Alteration, Mutation) und zu Genexpressionsveränderungen in Zellen und Organismen.
Description
Die Erfindung betrifft spezifische, regulatorische Sequenzbereiche des al
pha Smooth Muscle Aktin-Gens (α-SMA-Gens), Fusionskonstrukte, in de
nen solche regulatorische Sequenzbereiche des α-SMA-Gens mit weiteren
funktionellen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft sind, sowie die
Verwendung solcher regulatorischer Sequenzbereiche zur zelltyp- und dif
ferenzierungspezifischen Reporterexpression, zur zelltyp- und differenzie
rungsspezifischen Genveränderungen (Alteration, Mutation) und zur
Genexpressionsveränderungen in Zellen und Organismen.
Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung Fusionskonstrukte, in de
nen der genannte spezifische Sequenzbereich, der im wesentlichen aus
Sequenzen besteht, die sich im 5'-terminalen Bereich des α-SMA-Gens
befinden, mit einer weiteren funktionellen Nukleinsäuresequenz, vor
zugsweise mit peptid- oder proteinkodierenden Nukleinsäuresequenzen,
regulatorischen DNA-Sequenzen oder funktionellen RNA-kodierenden Se
quenzen operativ verknüpft ist; ein Verfahren, in dem die oben genannten
Fusionskonstrukte in einen Vektor operativ inseriert werden und das
Vektorkonstrukt in eukaryontische Zellen eingebracht wird; ein Verfahren,
in dem die mit dem Vektorkonstrukt transient oder stabil transfizierten,
transformierten oder infizierten Zellen, einen Reporter unter Kontrolle der
genannten regulatorischen Sequenzen des α-SMA-Gens exprimieren und
die Reporterexpression zur Isolierung oder zur Sichtung von Glatten Mus
kelzellen, Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem
Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Orga
nismus genutzt wird; sowie ein Verfahren, bei dem mittels der genannten
Fusionskonstrukte (die regulatorische Sequenzen des α-SMA-Gens und
peptid- oder proteinkodierende bzw. RNA-kodierende Sequenzen enthal
ten) die Genexpression bzw. die Zellfunktion von Glatten Muskelzellen
oder Myofibroblasten in Organismen bzw. in Organen unter Nutzung
transgener oder knock-out/-in Technologie oder gentherapeutischer Fu
sionsvektorapplikation manipuliert werden.
Das α-SMA-Gen ist ein Mitglied der Aktin-Multigenfamilie, die für verschie
dene Isoformen der zytoskeletalen Aktine kodiert (gesamte Sequenz des
α-SMA-Gens ggf. im Sequenzlisting oder in Figuren angeben). Die Expres
sion der verschiedenen Aktine ist in hohem Grade zelltypspezifisch und
differenzierungsabhängig reguliert. So wird adult das skelettale α-Aktin in
der Skelettmuskulatur, das cardiale α-Aktin in der Herzmuskulatur und
das α-SMA in der glatten Muskulatur exprimiert. Die transkriptionelle Re
gulation des α-SMA-Gens wird durch ein Zusammenspiel von positiv und
negativ wirkenden regulatorischen Elementen des 5'-Bereiches vermittelt
(Blank, R. S. et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992); Carrol, S. L. et
al., J. Biol. Chem. 261: 8955-8976 (1986); Carrol, S. L. et al., Mol. Cell.
Biol. 8: 241-250 (1988); Nakano, Y. et al., Gene. 99: 275-289 (1991)).
Der 5'-Bereich des α-SMA-Gens enthält verschiedene konservierte cis-
Elemente wie zwei CArG-Elemente (CArG-A und B) (Carrol, S. L. et al.,
Mol. Cell. Biol. 8: 241-250 (1988) und Blank, R. S. et al., J. Biol. Chem.
267: 984-989 (1992)). Die CArG-Motive bestehen aus einem A/T Repeat,
das von CC/GG flankiert wird, und werden als maßgebliche Elemente der
muskelspezifischen Genregulation diskutiert (Chow, K. L., Schwartz, R. J.,
Mol. Cell. Biol., 10, 528-538 (1990)). Reporterstudien an trangenen
Reportermäusen zeigten, daß eine weitere CArG-Box (0) im ersten Intron
des α-SMA-Gens für eine in vivo Expression von α-SMA in glatten
Muskelzellen notwendig ist (Mack, C. P., Owens, G. K., Circ. Res., 84: 852-861
(1999)).
Der 5'-Bereich des α-SMA-Gens enthält ebenfalls zwei E-Box
Konsensussequenzen (CA NN TG); potentielle Bindestellen basic helix
loop-hefix Transkriptionsfaktoren (Johnson, A. D., Owens, G. K., Am. J.
Physiol., 276, C1420-C1431 (1999)) und weitere Konsensussequenzen
(Hautmann, M. B. et al., J. Biol. Chem., 272: 10948-10956 (1997) und
McNamara, C. A. et al., Am. J. Physiol., 268: C1259-C1266 (1995)), deren
Bedeutung im einzelnen nicht geklärt ist.
Neben der zelltypspezifischen Expression in glatten Muskelzellen
(Vanderkerckhove J. and Weber K., Differentiation 14: 123-133 (1979)
Skalli, O. et al., J. Cell. Biol., 103: 2787-2796 (1986) und idem, J.
Histochem. Cytochem., 37: 315-321 (1989)) wird α-SMA transient in der
Embryogenese während der Differenzierung von skeletalen und cardialen
Muskelzellen (Ruzicka, D. L. et al., J. Cell Biol., 107: 25775-25786
(1988); Woodcock-Mitchell, J., Mitchell, J. J., Differentiation 39: 161-166
(1988)), aber auch in Myofibroblasten während der Wundheilung sowie
nach myofibroblastischen Veränderungen verschiedener Zelltypen in
Vernarbungs- und Gewebeumstrukturierungsprozessen nach chronischer
Organschädigung exprimiert (Desmouliere A. et al., Exp. Nephrol. 3: 134-
139 (1995); Gabbiani G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548 (1998); idem,
Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J. Pathol. 83: 457-474
(1976)).
Myofibroblasten sind Zelltypen mesodermalen Ursprungs, die sich durch
eine ausgeprägte Matrixproduktion, ein heterogenes Intermediatfilament
muster mit Desmin oder Vimentin auszeichnen und durch die α-SMA-Ex
pression die Fähigkeit zur Kontraktilität besitzen (Desmouliere, A. et al.,
Exp. Nephrol. 3: 134-139 (1995); Gabbiani, G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548
(1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J.
Pathol. 83: 457-474 (1976)). Sie treten temporär bei der Wundheilung
auf, während persistierende Myofibroblasten bei chronischen
Vernarbungsprozessen an der Bindegewebs- und der Orga
numstrukturierung beteiligt sind. In verschiedenen Fibroseerkrankungen
aufgrund chronischer Organschädigung wie der Hepatitis, der Glomerulo
nephritis oder fibrosierenden Lungenerkrankungen sind Myofbroblasten die
Hauptmatrixproduzenten (Friedman, S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828-35
(1993); Gressner, A. M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996); MacPherson, B. R.
et al., Hum. Pathol., 24: 710-716 (1993); Alpers, C. E. et al., Kidney
Int. 41: 1134-1142 (1992); Johnson, R. J. et al., J. Clin. Invest. 87: 847-858
(1991); Kapanci, Y. et al., Mod. Pathol. 10: 1134-42 (1997)). Daher
wurden Myofibroblasten auch als modulierte Fibroblasten bezeichnet; ihre
Vorläuferzelltypen sind jedoch abhängig vom Organtyp sehr unterschied
lich. Chronische Nierenschädigungen führen zu einer Transdifferenzierung
von Mesangialzellen zu myofibroblastischen Zellen (Johnson R. J. et al., J.
Clin. Invest. 87: 841-858 (1991); MacPherson B. R. et al., Hum. Pathol.
24: 710-716 (1993)). In der Leber kommt es nach chronischer
Schädigung unabhängig, ob die Ursache chronischer Alkoholabusus, virate
Hepatitis B oder C-Infektionen oder andere chronische Schädigungen sind,
zur Leberfibrose, in der Hepatische Sternzellen (HSC) zu Myofibroblasten
transdifferenzieren (Friedman S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828-35
(1993); Gressner A. M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996); Ramadori G. et al.,
(Ito) cells Virch. Arch. [B] 59: 349-357 (1990)). Hepatische Sternzellen
besitzen perizytäre Eigenschaften und speichern im ruhenden Zustand 80%
des körpereigenen Vitamin A (Friedman S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828-35
(1993)). Nach myofibroblastischer Transdifferenzierung, die ne
ben der Matrixproduktion und der α-SMA-Expression vermittelten Kon
traktilität durch eine einsetzende Proliferation, Vitamin A-Verlust und ein
verändertes Wachstumsfaktorenprofil gekennzeichnet ist, sind sie maß
geblich an der Aufrechterhaltung und dem Fortlauf der Leberfibrose betei
ligt (Friedman, S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828-35 (1993); Gressner,
A. M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996)).
Beim Übergang von in situ Karzinomen in invasive Karzinome treten
ebenfalls Myofibroblasten mit den typischen Eigenschaften von induzierter
extrazellulärer Matrixproduktion und Kontraktilität auf (Cintorino, M. et al.,
Int. J. Cancer 47: 832-836 (1984); Gabbiani, G. et al., Am. J. Pathol.
83: 457-474 (1976)).
Gentherapeutische Ansätze für chronische Fibroseerkrankungen: Da Myo
fibroblasten die zentralen Zelltypen in vielen sklerosierenden Erkrankun
gen sind, sind sie ideale Zielzellen der Therapie, auch der Gentherapie.
Durch eine zelltypspezifische, differenzierungsabhängige Kontrolle der Ex
pression
- a) von Genen kodierend für z. B. intrazellulären Signalmediatoren (Walther, W.; Stein, U., Mol. Biotechnol. 13(1): 21-28 (1999)) oder
- b) RNA-kodierenden Sequenzbereiche, die durch Anlagerung die Transkription oder die Translation bestimmter Gene beinflussen (Bai, J. et al., Mol. Ther. 1(3): 244-254 (2000)) oder
- c) eines Enzyms für eine zyklische Rekombination (CRE), das floxP-flan kierte Genbereiche verändert (Sauer, B. Methods 14: 381-392 (2998)), wird eine Gentherapie bestimmter Zielzellen ermöglicht. Als Vekoren werden vielfach virale Vesikel wie z. B. adenovirale oder retrovirale Ab kömmlinge (Miller, N. Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8, 803-815; Mountain, A., Tibtech. 18: 119-128 (2000); Schiedner, G. et al., Nat. Genet. 18, 180-183 (1998); Parr, M. J., Nat. Med. 3, 1145-1149 (1997); Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11400-11406 (1996); Feng, M. et al., Nat. Biotechnol. 15: 866-870 (1997)) benutzt. Aber auch die DNA eines Plasmidkonstruktes kann blank oder in Aggregaten mit Li posomen oder Polymerkörpern verabreicht werden (Hengge, U. et al., Nat. Genet. 10: 161-166 (1995); Gottschalk, S. et al., Gene Ther. 3: 3410-3414 (1990); Wagner, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3410-3414 (1990)). Für gentherapeutische Ansätze und Veränderungen der myofibroblastischen Zellfunktion sind geeignete regulatorische Sequenzen bzw. ein Promoter notwendig, die/der die entsprechenden Zellfunktionseingriffe und Veränderungen in der Expression in Myofibro blasten dirigieren kann, voraussetzende Bedingung, die aber bislang nicht erfüllt ist. Denn erst durch den Einsatz regulatorischer Sequenzen inner halb eines Promoters, die die Zellfunktionseigenschaften (a) durch eine veränderte Genexpression, (b) durch eine Einwirkung in die Proteinsyn these oder (c) durch Genomalteration myofibroblastensprechend dirigie ren, können myofibroblastische Zellen gentherapeutisch angesprochen werden.
Bei der Charakterisierung des regulierenden Sequenzbereichs des α-SMA-
Gens (nachfolgend auch "α-SMA-5'-Sequenzbereich") wurde überraschen
derweise gefunden, dass einzelne Bereiche hierin, nämlich innerhalb -698
bis +18 des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (Nummerierung, falls nicht anders
angegeben, bezogen auf das in Fig. 7A gezeigte α-SMA-Gen aus rattus
norvegicus) Aktivitäten aufweisen, die sich von der Aktivität des Gesamt
bereiches unterscheiden. So wurde gefunden, dass der Bereich -189 bis
+18 des α-SMA-Gens transkriptionsaktivierend ist, wohingegen der
Bereich -698 bis -190 zelltypspezifische regulative Eigenschaften
aufweist, d. h. in Verbindung mit dem Core-Bereich (-189 bis +18) für die
zelltypspezifische Kontrolle zuständig ist. Aufbauend auf den Befund, dass
diese Bereiche die Genexpression in Myofibroblasten und
myofibroblastähnlichen Zellen oder auch in anderen transient oder
permanent SMA-exprimierenden Zellen steuern können, wurde ein System
für eine myofibroblastischen Steuerung erarbeitet. Die vorliegende Erfin
dung betrifft demgemäss
- 1. eine Nukleinsäuresequenz, umfassend
- a) einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden Se quenzbereich des alpha-Smovth-Muscle-Actin-Gens (α-SMA-Gens) und
- b) wenigstens eine weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz, die mit der Sequenz (1) operativ verknüpft ist;
- 2. eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäure sequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich von der Ratte stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus der in Fig. 5A gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 1), insbesondere aus der in Fig. 7A gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 5), umfasst;
- 3. eine bevorzugte Ausführungsform der in (2) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktionelle Bereich eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der Sequenz -189 bis +18 der Fig. 7A (d. h. aus der Sequenz der Fig. 7C; SEQ ID No.: 7) stammt;
- 4. eine bevorzugte Ausführungsform der in (2) definierten Nukleinsäure sequenz, wobei der funktionelle Bereich eine zelltypspezifische Nuklein säuresequenz ist und insbesondere aus der Sequenz -698 bis -190, besonders bevorzugt aus der Sequenz -698 bis -215, der Fig. 7A stammt;
- 5. eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich von der Maus stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5B gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 2) insbesondere aus der in SEQ ID No.: 18 gezeigten Sequenz aufweist;
- 6. eine bevorzugte Ausführungsform der in (5) definierten
Nukleinsäuresequenz, wobei der funktionelle Bereich
- a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbeson dere aus den Nukleotiden 490 bis 697 der in SEQ ID No.: 18 gezeigten Se quenz stammt und/oder
- b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 489 der in SEQ ID No.: 18 gezeigten Sequenz stammt;
- 7. eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Menschen stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5C gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 3) insbesondere aus der in SEQ ID No.: 19 gezeigten Sequenz aufweist;
- 8. eine bevorzugte Ausführungsform der in (7) definierten
Nukleinsäuresequenz, wobei der funktionelle Bereich
- a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und ins besondere aus den Nukleotiden 513 bis 715 der in SEQ ID No.: 19 gezeigten Sequenz stammt und/oder
- b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 512 der in SEQ ID No.: 19 gezeigten Sequenz stammt;
- 9. eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Huhn stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5D gezeigten Sequenz insbesondere aus der in SEQ ID No.: 20 gezeigten Sequenz aufweist;
- 10. eine bevorzugte Ausführungsform der in (9) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktionelle Bereich
- 11. eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und ins besondere aus den Nukleotiden 497 bis 699 der in SEQ ID No.: 20 gezeigten Sequenz stammt und/oder
- 12. eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 496 der in SEQ ID No.: 20 gezeigten Sequenz stammt;
- 13. eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz, wie in (3), (6), (8) oder (10) definiert;
- 14. eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz, wie in (4), (6), (8) oder (10) definiert;
- 15. einen Vektor, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie in (11) und/oder (12) definiert;
- 16. einen Vektor, in dem eine Nukleinsäuresequenz, wie in (1) bis (10) definiert, inseriert ist;
- 17. eukaryontische Zellen oder Organismen, die mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in (1) bis (10) definiert oder einem Vektor, wie in (13) oder (14) definiert, transient oder stabil transfiziert transformiert oder infiziert sind;
- 18. ein Verfahren zur Herstellung der eukaryontischen Zellen, wie in (15) definiert, umfassend das Transfizieren, Transformieren oder Infizieren von Ausgangszellen mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder mit Vektoren, wie in (13) oder (14) definiert;
- 19. ein Verfahren zur Herstellung der Organismen, wie in (15) definiert, umfassend das Injizieren von ES-Zellen, die mit den Nuklein säuresquenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder mit Vektoren, wie in (13) oder (14) definiert, transfiziert sind, in Blastozysten der Organismen und Einsetzen in die Leihmutter;
- 20. ein Verfahren zur Isolierung oder zur Sichtung von Glatten Muskel zellen, Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Orga nismus, umfassend die Expression eines Reportergens in einer eukaryonti schen Zelle oder einen Organismus, wie in (15) definiert;
- 21. ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von Glatten Muskelzellen oder Myofibroblasten in Organismen oder Organen, umfassend Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder einem Vektor, wie in (14) definiert, in die Orga nismen oder Organe;
- 22. ein Arzneimittel, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie in An sprüchen (1) bis (10), (11) oder (12) definiert, oder einen Vektor, wie in (13) oder (14) definiert und
- 23. die Verwendung eines funktionellen Bereichs aus dem regulierenden Sequenzbereich des α-SMA-Gens zur zelltyp- und differenzierungsspezifi schen Reporterexpression und zur zelltyp- und differenzierungsspezifi schen Genveränderung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der beigefügten Figuren und Bei
spiele näher erläutert.
Fig. 1 Messung der Luziferasereporteraktivität in ruhenden und myofibro
blastischen (aktivierten) Hepatischen Sternzellen (HSC) unter Kontrolle
des PRL-700-Reporterkonstruktes.
Fig. 2a Immuncytologie nach Einzelzelldissoziation von differenzierten EB
und Kultivierung der vom Verband gelösten Zellen. In pSMA-GFP-190
transfizierten Zellen zeigten auch α-SMA-negative Zellen (1C) eine GFP-
Expression (1B). In pSMA-GFP-700 transfizierten Zellen hatten alle GFP
exprimierende Zellen (2B) eine α-SMA-Expression (2C). Die DAPI-Färbung
der DNA zeigte, dass Konstrukten in etwa 30% der stabil transfizierten
Zellen GFP exprimiert wurde (1A, 1B).
Fig. 2b Aufbau des SMA-GFP-700 bzw. SMA-GFP-190 Reportervektor für
stabile Transfektionen in embryonalen Stammzellen oder transgene
Reportermausmodelle. In die Konstrukte ist zwischen den GFP-Reporter
(EGFP-Variante) und den 716bp bzw. 207bp aus der 5'-Region des α-
SMA-Gen als heterologe regulatorische Sequenz das erste Intron des
chicken β-Actins kloniert. Zur Selektion von stabilen Transfektanten hat
das Konstrukt, neben der Ampicillinresistenz eine weitere Resistenz gegen
Neomycin, die in eukaryotischen Zellen eine G418 Selektion erlaubt.
Fig. 3a Luciferasereporteraktivitäten unterschiedlich langer SMA-Kon
strukte (SMA-125 bis SMA-700) die nach transienter Transfektion in
embryonalen Myotuben und Myoblasten der Zellinie L6 ermittelt wurden.
L6-Zellen, die nach Serumentzug in α-SMA-exprimierende Myotuben dif
ferenzieren, zeigten eine 4-5 Induktion aller Konstrukte im Vergleich zu
den Vorläufer L6-Myoblasten. Die Aktivitäten der SMA-Konstrukte wurden
mit der Aktivität des SV40-Promoter (100%) in Relation gesetzt. Die Ver
suche wurden in drei unabhängigen Experimenten mit Doppelansätzen
durchgeführt.
Fig. 3b Plasmidkonstrukt zur Expression eines Peptids oder Polypeptids
von Interesse unter Kontrolle der 716 bp-5'-Sequenz (SEQ ID No.: 5) des α-
SMA-Gens. Zur Detektion der Expression kann in den Consensus des
Leserasters (ORF) ein oder mehrere Erkennungssequenzen (Tags)
eingebaut werden wie die kodierende Sequenz für Streptavidin (SEQ ID
No.: 34) und/oder ein von einem Antikörper (9E10) erkanntes Epitope wie
myc (SEQ ID No.: 35), und/oder zur Aufreinigung auch eine für fünf Histidine
kodierende Sequenz (SEQ ID No.: 36) enthalten. Sowohl die Sequenz des
Peptids von Interesse als auch die damit verknüpften TAG-Sequenzen
unterliegen der zelltypspezifischen Kontrolle des regulativen
Sequenzbereichs des α-SMA-Gens.
Fig. 4 LoxP-vermittelte Cre-Rekombination unter Kontrolle des α-SMA-5'-
Genbereichs:
a.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID No.: 32) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5 -Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actin (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre-vermittelten Excision des IoxP-flankierten Neomycin-Gens (neo) (2) und der anschließenden Expression des Gens von Interesse (3).
b.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID No.: 32) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actin (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre-vermittelten Excision des loxP-flankierten Gens von Interesse (2), sodaß eine anschließende Expression des Gens von Interesse unterbrochen wird (3).
c.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-ER-Fusionsgens (SEQ ID No.: 32 +ER™, Danielian PS et al., Mol. Endocrinol. 7: 232-240, 1993) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actins (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-ER- Fusionsgens in Myofibroblasten (1). Nach Zusatz bzw. Injektion von 0,1 bis 2 mg 4-OHT kann im nächsten Schritt die Bindung des Liganden durch das ER-Peptid erfolgen und sich ein Cre-ER/4-OHT-Komplex bilden.
a.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID No.: 32) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5 -Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actin (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre-vermittelten Excision des IoxP-flankierten Neomycin-Gens (neo) (2) und der anschließenden Expression des Gens von Interesse (3).
b.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID No.: 32) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actin (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre-vermittelten Excision des loxP-flankierten Gens von Interesse (2), sodaß eine anschließende Expression des Gens von Interesse unterbrochen wird (3).
c.: Durch die transkriptionelle Kontrolle des Cre-ER-Fusionsgens (SEQ ID No.: 32 +ER™, Danielian PS et al., Mol. Endocrinol. 7: 232-240, 1993) durch den 5'-Bereich des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (SEQ ID No.: 5) in Kombination mit dem ersten Intron des β-Actins (SEQ ID No.: 31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-ER- Fusionsgens in Myofibroblasten (1). Nach Zusatz bzw. Injektion von 0,1 bis 2 mg 4-OHT kann im nächsten Schritt die Bindung des Liganden durch das ER-Peptid erfolgen und sich ein Cre-ER/4-OHT-Komplex bilden.
Anschließend transloziert der Kompex in den Kern und es werden durch
Cre die in Fig. 4a und b gezeigten genetischen Veränderungsschritte (2)
und (3) durchgeführt.
In Fig. 4 bedeutet:
nS: nukleäre Signalpeptidsequenz
schraffierte Fläche: Intronsequenz
LP: Linker Peptidsequenz
ER™: Sequenz für alterierten Östrogenrezeptor mit hoher Affinität für den synthetischen Liganden, 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT), der aber endogen produziertes 17β-Estradiol nicht bindet.
β-A: β-Aktin-Intron (SEQ ID No.: 31)
4-OHT: 4-Hydroxytamoxifen.
nS: nukleäre Signalpeptidsequenz
schraffierte Fläche: Intronsequenz
LP: Linker Peptidsequenz
ER™: Sequenz für alterierten Östrogenrezeptor mit hoher Affinität für den synthetischen Liganden, 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT), der aber endogen produziertes 17β-Estradiol nicht bindet.
β-A: β-Aktin-Intron (SEQ ID No.: 31)
4-OHT: 4-Hydroxytamoxifen.
Fig. 5: 5'-upstream Region und Anfang Exonl des α-SMA in verschiedenen
Spezien (Region -713 bis +52, Nummerierung bezogen auf Sequenz A)
A: Ratte (Rattus norvegicus; SEQ ID No.: 1)
B: Maus (Mus musculus; SEQ ID No.: 2)
C: Mensch (SEQ ID No.: 3)
D: Huhn (Gallus gallus; SEQ ID No.: 4).
A: Ratte (Rattus norvegicus; SEQ ID No.: 1)
B: Maus (Mus musculus; SEQ ID No.: 2)
C: Mensch (SEQ ID No.: 3)
D: Huhn (Gallus gallus; SEQ ID No.: 4).
Fig. 6: Alignment der in Fig. 5 gezeigten Sequenzen.
Fig. 7: zeigt die bevorzugte, aus Ratte (Rattus norvegicus) stammenden
α-SMA Sequenzen der vorliegenden Erfindung (SEQ ID No.:)
A: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis +18 (5)
B: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -124 bis +18 (6)
C: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis +18 (7)
D: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis +18 (8)
E: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis +18 (9)
F: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -484 bis +18 (10)
G: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis +18 (11)
H: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis -125 (12)
I: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis -190 (13)
J: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis -215 (14)
K: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -484 bis -245 (15)
L: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis -485 (16)
M: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis -522 (17)
A: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis +18 (5)
B: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -124 bis +18 (6)
C: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis +18 (7)
D: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis +18 (8)
E: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis +18 (9)
F: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -484 bis +18 (10)
G: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis +18 (11)
H: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis -125 (12)
I: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis -190 (13)
J: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis -215 (14)
K: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -484 bis -245 (15)
L: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis -485 (16)
M: 5'-Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis -522 (17)
Fig. 8A: β-1-Globin-Gen von Oryctolagus cuniculus; Intron II/Exon III-
Übergang; Acc.No: V00882: Sequenz 1250-1343 (SEQ ID No.: 30).
Fig. 8B: Cytoplasmisches β-Actin-Gen von Gallus gallus; Acc.No: X00182,
Intron I (544-1542); gezeigt ist die Sequenz von 550 bis 1503 (SEQ ID
No.: 31).
Fig. 8C: Skizze einer floxP-site: Die FIoxP-Sequenz (siehe auch SEQ ID
No.: 33) besteht aus 13 bp invertierten Repeats (horizontale Pfeile), die
eine 8 bp asymmetrische Core-Region flankieren, welche an zwei Stellen
(vertikale Pfeile) durch Cre geschnitten wird.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den überraschenden Befund, dass
durch spezifische regulatorische Sequenzen des α-SMA-Gens, insbeson
dere solche die eine oder mehrere der in Figur A bis M von Fig. 7 (SEQ ID
NOs.: 5 bis 17) gezeigten Sequenzen enthalten, die Genexpression der
hiermit operativ verknüpften funktionellen Nukleinsäuresequenz so z. B.
eines Reportergens oder eines anderen funktionellen Gens in Myofibro
blasten oder myofibroblastähnlichen Zellen induziert wird.
Die Nukleinsäuresequenz der Ausführungsform (1) der Erfindung enthält
einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden
Sequenzbereich des α-SMA-Gens. Dieser regulierende Sequenzbereich
kann dabei von Säugern, insbesondere von Primaten oder Nagern oder
Vögeln und besonders bevorzugt von Ratte, Maus, Mensch oder Huhn
stammen.
In der bevorzugten Ausführungsform (2) stammt der regulierende
Sequenzbereich, wie vorstehend erwähnt, von der Ratte. Besonders
bevorzugt ist dabei, dass der funktionelle Bereich eine
transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und besonders
bevorzugt aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz stammt. Hierbei sind
insbesondere solche transkriptionsaktivierende Sequenzen bevorzugt, die
wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 40 und besonders bevorzugt
wenigstens 60 konsekutive Basen aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz
aufweisen und besonders bevorzugt die in Fig. 7B oder 7C gezeigten
Sequenzen (SEQ ID NOs.: 6 oder 7) umfassen. Alternativ oder zusätzlich
hierzu kann der funktionelle Bereich eine zelltypspezifische
Nukleinsäuresequenz sein, bevorzugt eine solche, die aus der Sequenz
-698 bis -190 der Fig. 7A (Nukleotide 1 bis 580 von SEQ ID No.: 5),
besonders bevorzugt aus der Sequenz -699 bis -215 der Fig. 7A, stammt.
Dabei sind solche zelltypspezifische Sequenzen bevorzugt, die wenigstens
25, vorzugsweise wenigstens 35, konsekutive Basen aus der Sequenz
-698 bis -190 der Fig. 7A aufweisen und besonders bevorzugt die in Fig.
7I oder 7M gezeigten Sequenzen umfassen.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsformen (5)-(10) stammt der
regulierende Sequenzbereich von der Maus, dem Menschen oder dem
Huhn, wobei die funktionellen Bereich vorstehend unter (5) bis (10)
definiert sind. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung
ist auch hier, dass die transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz
wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 40 und besonders bevorzugt
wenigstens 60 konsekutive Basen aus der unter (6), (8) oder (10)
definierten transkriptionsaktivierenden Sequenz aufweist bzw. wenigstens
25, vorzugsweise wenigstens 35, konsekutive Basen aus der vorstehend
unter (6), (8) oder (10) definierten zelltypspezifischen Sequenz aufweist.
Insbesondere sind solche Teilsequenzen aus in den SEQ ID NOs.: 18, 19
und 20 gezeigten Sequenzen bevorzugt, die den Sequenzen 7B-7M der
Sequenz aus Ratte entsprechen (gemäss dem Alignment in Fig. 6).
Die weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Ausführungsform (1)
der Erfindung kann dabei eine peptid- oder proteinkodierende DNA-
Sequenz (einschließlich jedoch nicht eingeschränkt auf Reportergene,
Sequenzen, die für pharmakologisch aktive Proteine kodieren und
regulatorische DNA-Sequenzen) oder eine funktionelle RNA-kodierende
Sequenz (einschließlich jedoch nicht eingeschränkt auf eine
Ribozymbindungsstelle) sein.
Geeignete Reportergene sind z. B. die in der nachfolgenden Tabelle 1
aufgeführten Gene. Andere funktionelle Gene im Sinne der vorliegenden
Erfindung sind z. B. Gene, die für pharmakologisch aktive Proteine oder
Peptide kodieren.
Die eukaryontischen Zellen oder Organismen gemäß Ausführungsform
(15) der vorliegenden Erfindung können durch dem Fachmann
wohlbekannte Transfektions-, Transformations- oder Infektionsverfahren
von Ausgangszellen bzw. Infizieren von Es-Zellen in Blastozysten der
Organismen und Einsetzen in die Leihmutter erhalten werden. Solche
Verfahren sind z. B. in Bradley, A., Nature, 309: 255-256 (1984)
beschrieben.
Bislang war es nicht möglich die myofibroblastische Aktivierung durch ei
nen Reporter zu sichten, da ein regulierender Sequenzbereich, der spezi
fisch auf den Aktivierungsübergang von ruhenden Zellen zu myofibroblas
tischen Zellen anspricht, nicht gefunden wurde. Durch die Fusion des Se
quenzbereichs von -698 bis +18 (SEQ ID No.: 5) mit einem Reportergen
(siehe Tabelle 1) und Insertion in einen Transfervektor und anschließender
Transfektion kann die myofibroblastische Aktivierung gesichtet werden
(Fig. 1). In bisherigen Methoden wurde für eine Sichtung des myofibro
blastischen Aktivierungsvorgangs immunzytologische oder immunhistolo
gische Verfahren gewählt, die mehrere Arbeitschritte wie Fixieren der Zel
len, Antigenblocken, Antikörperinkubation und Detektion beinhalteten (F.
Hofman, Current protocols in immunology, Chapt. 5.8:
Immunohistochemistry; Eds. J. E. Coligan et al., National Institute of
Health, USA (1996)). Zur immunzytologischen bzw. immunhistologischen
Detektion von Myofibroblasten konzentrierten sich die Verfahren auf die
immunochemische Anfärbung des α-SMA-Proteins. Quantitative Aussagen
über die Aktivierung z. B. durch ein toxikologisches Reagenz waren aller
dings auf diese Weise nicht möglich. In der vorgelegten Erfindung wurde
als α-SMA-5'-Sequenz kontrollierter Reporter des myofibroblastischen
Transformationsprozeß vorzugsweise lumineszierende Reporterproteine
gewählt und die Aktivierung der Zellen quantitativ und sehr empfindlich
durch ein Luminometer (MLX Microplate Luminometer der Fa. Dynex
Technologies, Chantilly, USA) gemessen (Fig. 1). Durch eine quantitative
Reporterbestimmung ergibt sich durch das Verfahren erstmals die Möglich
keit toxikologische und pharmakologische Studien quantitativ durch
zuführen, die dann Aussagen über das myofibroblastische Aktivierungs
potential der Substanz ergeben und damit die Möglichkeit der Detektion
des chronisch relevanten Organschädigungpotential.
Die Bestimmung des myofibroblastischen Übergangs an Zellen, die den
Vektor mit dem α-SMA-5-Sequenz-Reportertusionkonstrukt beinhalten,
birgt auch die Möglichkeit therapeutischer Medikamentsichtungen durch
zuführen, hier kann eine Verminderung der myofibroblastischen Aktivie
rung z. B. durch ein Toxin oder einen fibrogenen Wachtumsfaktor wie z. B.
Transforming Growth Factor beta (TGF β) anhand des α-SMA-5'-Sequenz
kontrollierten Reporters ausgelesen werden.
Das vorgelegte Verfahren, in dem α-SMA-5'-Sequenzbereiche (-698 bis
+18) zur Reportersteuerung genutzt werden, umfaßt neben der Sichtung
der myofibroblastischen Aktivierung die Isolierung von bestimmten Zellen
anhand der α-SMA-5'-gesteuerten Reporterexpression. Dies wird in dem
vorgestellten Verfahren vorzugsweise durch operative Verknüpfung von α-
SMA-5'-Sequenzbereichen mit einem fluoreszierenden Reporter (z. B. GFP
siehe Tabelle 1) durchgeführt, so daß nach Einbringen des Vektorkon
struktes in einen Organismus oder einer Zellpopulation die Isolierung von
myofibroblastisch aktivierten oder SM-differenzierten (SM: smooth
muscle) Zellen aus einem Zellgemisch oder Verbandes αufgrund der Fluo
reszenz mithilfe eines FACS-Gerätes (FACS: Fluorescence activated cell
sorting) durchgeführt werden kann. Alternativ erlaubt die Verknüpfung des
α-SMA-5'-Sequenzbereichs mit anderen Reportern die Isolierung von
aktivierten oder SMA-exprimierenden Zellen durch Mikrodissektion unter
licht- oder fluoreszenzmikroskopischer Kontrolle.
Die vorgelegte Erfindung umfaßt ebenfalls die Rolle des Sequenzbereich
-698 bis +18 des α-SMA-Gens für die spezifische Genexpression in embry
onalen Stammzellen (Es), die in Embroid Bodies zu embryonalen Kardio
myozyten, glatten Muskelzellen oder Skelettmuskelzellen differenzieren
(Evans, M., Kaufmann, M., Nature, 292, 154-156 (1981)). Der Vergleich
verschiedener stabil in Es-transfezierter Konstrukte des α-SMA-Gens mit
unterschiedlichen Domänen des α-SMA-5'-gelegenen Sequenzbereichs
zeigte, daß für eine Selektion von Kardiomyozyten, Skelettmuskelzellen
und Glatten Muskelzellen aus embryonalen Zellaggregaten eine Reporter
steuerung durch zusätzliche 5-gelegenen Domänen im Bereich -698 bis
-190 des α-SMA-Gens (Seq. I,), K, L und M der Fig. 7) notwendig sind
(Fig. 2).
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die operative Verknüpfung des α-SMA-
5'- Sequenzbereichs oder Teilbereiche der Sequenzen (Seq. A bis M von
Fig. 7) mit anderen die Expression beeinflußenden Nukleinsäuresequen
zen. Beispiel sind Intronsequenzen wie die des β-Globin- (siehe Fig. 8a,
SEQ ID No.: 30) oder des Huhn-β-Aktin-Gens (siehe Fig. 8b, SEQ ID
No.: 31), aber auch andere Enhancersequenzen wie die des viralen CMV
wie in dem Vektor von Fig. 3. Aber auch andere hier nicht genannte ex
pressionsbeeinflußende Sequenzen können mit den α-SMA-5'-Sequenzen
oder Domänen aus denen (Seq. A bis M von Fig. 7) operativ verknüpft
werden.
Wird nicht ein Reportergen, sondern ein anderer peptid- oder proteinko
dierender Genbereich mit dem α-SMA-5'-Sequenzbereichen (SEQ ID
NOs.: 5 bis 17) verknüpft, kommt es zu einer α-SMA-5'-gesteuerten Ex
pression des operativ verknüpften Genbereichs. In der bevorzugten Aus
führungsform der Erfindung wird Sequenz A von Fig. 7 für eine Steuerung
der Expression des Genbereichs von Interesse benutzt. Fig. 1 oder Fig. 3
zeigt die transiente Expression unter transkriptioneller Kontrolle der Se
quenz A von Fig. 7: Die transkriptionellen Kontrolle durch Sequenz A ver
hindert die Expression in Myoblasten oder ruhenden myofibroblastischen
Vorläufer; während sie nach Myotubendifferenzierung oder nach myo
fibroblastischer Transdifferenzierung zur Expression des verknüpften Gen
bereichs führt. Wird Sequenz C von Fig. 7 mit dem Zielgen verknüpft,
kommt es auch zur Expression in vielen Zelltypen wie z. B. in Fibroblasten,
bei Verknüpfung der Sequenzen A, F, G von Fig. 7 nur in myobbroblasti
schen Zellen oder SMC-Abkömmlingen. Der durch α-SMA-5'- Sequenzbe
reiche (Seq. A bis M von Fig. 7) transkriptionell gesteuerte Genbereich
kann wiederum ebenfalls mit zusätzlichen Sequenzdomänen verknüpft
werden. Die Verknüpfung unter Berücksichtigung des Leserasters mit ko
dierenden Sequenzen für bestimmte Tags oder Reporterdomänen ermög
licht die Verfolgung der Genexpression oder die Aufreinigung des unter der
Kontrolle der verschiedenen α-SMA-5'-Sequenzbereichen exprimierten
Sequenzbereichs (Fig. 3b).
Durch die operative Verknüpfung der α-SMA-5'-Sequenzbereiche (Seq. A
bis M von Fig. 7) mit Sequenzen, die RNA kodierender DNA oder Genbe
reiche für intrazelluläre Signalmediatoren enthalten, kann funktionell in die
phänotypischen Veränderungen myofibroblastischer Zellen eingegriffen
werden. Nach Insertion solcher Konstrukte in einen Vektor, der sich zur
Gentherapie eignet (wie z. B. verschiedene Generationen von
adenoviralen, retroviralen oder lentiviralen Vektoren und deren
Abkömmlinge (Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11400-11406
(1996); Feng, M. et al., Nat. Biotechnol. 15: 866-870 (1997)) bzw.
nackte oder in Aggregaten mit geladenen Polymeren oder Liposomen zu
sammengefaßte Plasmidvektoren) (Hengge, U. et al., Nat. Genet. 10: 161-166
(1995); Gottschalk, S. et al., Gene Ther. 3: 448-457 (1996))
wird die Vorausetzung für gentherapeutische Ansätze myofibroblastischer
Zellen, myofibroblastähnlicher, oder SM-ähnlicher Zellen geschaffen, die
bei sklerosierenden Erkrankungen genutzt werden können.
Die operative Verknüpfung von Sequenzbereichen aus Sequenz A bis M
aus Fig. 7, wobei in dieser Erfindung vorzugsweise die Sequenz A aus Fig.
7 benutzt wurde, mit dem Enzym für die zyklische Rekombination (Cre)
(SEQ ID No.: 32) ermöglicht es in myofibroblastisch-differenzierten Zellen,
Genbereiche, die mit einer floxP-Sequenz (Fig. 8c, SEQ ID No.: 33) flan
kiert wurden, neu zu rekombinieren. Hier kann nach Funktion des Cre-En
zyms und der Orientierung der floxP-Sequenzen eine Inversion, eine
Excision, Integration oder Translokation des gefloxten Genbereichs unter
Kontrolle der gewählten regulierenden α-SMA-5'-Sequenzbereiche erfol
gen. In dieser Erfindung gewählte mögliche Konstruktionen des Vektors
sind in Fig. 4 dargestellt.
In dem Verfahren (17) gemäß der vorliegenden Erfindung werden
transformierte ES-Zellen in Blastozysten eines Wirtsorganismus injiziert
und in die Leihmutter eingesetzt (V. Papaioannou, R. Johnson, in Gene
Targeting. A Practical Approach, ed. A. L: Joyner, Oxford UK (1993); T.
Doetschman, Transgenis Animal Technology. A Laboratory Handbook,
Academic Press Inc. San Diego, USA (1994)). Nach Rückkreuzungen der
geborenen und herangewachsenen transgenen Chimäre werden homozy
gote Tiere intoxiziert und auf ihre transgene Genexpression untersucht.
Alternativ kann in dem Verfahren (17) die Konstrukte ohne Vektorrückrad
durch Miokroinjektion in den Vorkern zu transgenen Organismen führen
(J. W. Gordon et al., Methods Enzymol. 101: 411-33 (1983); B. Hogan et
al., in Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual, Gold Spring
Harbor, NY (1994)).
Organismen gemäß Ausführungsformen (15) und (17) der vorliegenden
Erfindung umfasst Säuger einschließlich Primaten, Nager und Huftiere
(wobei es sich vorzugsweise um nicht-humane Säuger handelt).
Die Arzneimittel gemäß Ausführungsform (20) der vorliegenden Erfindung
können - in Abhängigkeit von der Applikationsform - neben den
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen/Vektoren noch handelsübliche
Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel und dergleichen enthalten.
Die Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele
näher erläutert.
Folgende kommerziell erhältliche Vektoren wurden im Verlauf der Arbeit
benutzt:
Als allgemeine Klonierungsvektoren dienten pBluescript-SKII+ (Clontech, Heidelberg) und pGEM3Z (Promega, Mannheim). Bereiche des α-SMA- Promoter wurden anschließend in den promoterlosen Luciferase-Vektor pRL-null (Promega, Mannheim) kloniert. Um die Aktivität erzeugter Konstukte zu vergleichen wurden aus der pRL-Familie zusätzlich pRL-SV40 und pRL-CMV oder auch Vektoren der pGL3-Familie (Promega, Heidelberg) verwendet.
Als allgemeine Klonierungsvektoren dienten pBluescript-SKII+ (Clontech, Heidelberg) und pGEM3Z (Promega, Mannheim). Bereiche des α-SMA- Promoter wurden anschließend in den promoterlosen Luciferase-Vektor pRL-null (Promega, Mannheim) kloniert. Um die Aktivität erzeugter Konstukte zu vergleichen wurden aus der pRL-Familie zusätzlich pRL-SV40 und pRL-CMV oder auch Vektoren der pGL3-Familie (Promega, Heidelberg) verwendet.
Aus isolierter Ratten-DNA wurde zunächst ein 736 bp langes Fragment aus
dem 5'-Promoterbereich des α-SMA-Gens amplifiziert und kloniert. Dazu
erfolgte zunächst eine PCR-Amplifikation des Promoterbereichs von -708
bis +28 aus genomischer Ratten-DNA mit den Primer SMA-710F (HindIII)
und SMA-30R (EcoRI), die die angegebenen Restriktionsschnittstellen in
ihrer Sequenz beinhalten. Nach Restriktion wurde das Fragment (-698 bis
+18) in pRL-null durch Ligation inseriert und der resultierende Vektor pRL-
SMA-700 für Untersuchungen an eukaryontischen Zellen in E. coli K12-
Stämmen amplifiziert (siehe auch Sequenz von Fig. 7A).
Für die Herstellung der α-SMA-5-Genbereich-Reporterkonstrukte wurden
in Reportervektoren unterschiedliche 5'-Genbereichen des α-SMA inse
riert. Das mit den Primern SMA-710-F und SMA-30-R hergestellte Amplifi
kat von genomischer Ratten-DNA wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten
und in pBSSK + (Stratagene) kloniert und so pB-SMA-700 erzeugt. Unter
Nutzung der vorhandenen Restriktionschnittstellen im Promoterbereich
des α-SMA-Gens wurden die Fragmente SMA-480 (PstI), SMA-215 (PvuII)
und SMA-125 (DraII) erzeugt, indem sie mit EcoRI und dem spezifischen
Restriktionsenzym aus pB-SMA-700 geschnitten wurden und zunächst in
pGEM (Promega) oder pB-SK (Stratagene) kloniert wurden. Dabei
entstanden folgende Plasmide: pGEM-SMA-480, pGEM-SMA-215 und pB-
SMA-125. Mit den Primer SMA-245F (PstI) oder SMA-190F(HindIII) als
sense Primer und SMA-30R als antisense Primer wurden spezifische
Fragmente generiert, die anschließend über ihre primer-assoziierten
Restriktionsschnittstellen kloniert wurden, dadurch entstanden pGEM-
SMA-245 und pB-SMA 190.
Alle Promoterfragmente des crSMA-Promoter wurden über EcoRI/HindIII
oder EcoRI/SacI in pRL-null kloniert, wodurch 6 unterschiedliche lange
Deletionsreporterkonstukte SMA-700 bis SMA-125 erzeugt wurden.
Transfektionen wurden mit dem Transfekti
onsreagenz FuGENE™6 (Boehringer Mannheim, Mannheim) durchgeführt.
Pro Ansatz wurde 1,5 µg Plasmid-DNA verwendet, die sich aus 1,2 µg pRL-
700 und 0,3 µg pGL3-Kontrollplasmid zusammensetzten, was einem
DNA/Reagenz-Verhältnis von 1 : 3 entspricht. Für die Tranfektionen wur
den ruhende Hepatische Sternzellen (HSC), die durch enzymatische Le
berperfusion und Dichtegradientenzentrifugation aus der Rattenleber
isoliert wurden (Knock, D. S., de Leeuw, A. M., Exp. Cell. Res., 139, 468
471 (1982)) und nach Kultur in Myofibroblasten differenzierte HSC ver
wendet (Geerts, A. et al., J. Hepatology, 9, 59-68 (1989)).
Eine Messung der Aktivitä
ten erfolgte mit dem Dualen-Luciferase Reporter-Assay-System (DLR™,
Promega, Mannheim). In den transienten Transfektionen zeigten nur my
ofibroblastische Zellen eine deutliche Aktivität des pRL-700-Reporterkon
strukt. α-SMA-negative Zellen zeigen Reporteraktivitäten, die unterhalb
von einem Prozent der relativen Aktivität lagen. In Myofibroblasten wurde
der Reporter um den Faktor 14 induziert. Ruhende Zellen hatten keine
Aktivitäten (< 1%) (Fig. 1). Damit kann das Konstrukt nach Transfektion
zur Sichtung der myofibroblastischen Aktivierung verwendet werden.
Aus
einem modifizierten GFP-Expressionvektor (pCAGGS) (Ikawa, M. et al.,
Develop. Growth Differ. 37; 455-459 (1995)) mit einem Fragment des
Chicken-β-Actin-Promoter und dem ersten Intron des Chicken-β-Actins
(SEQ ID No.: 31) wurde das kardiale Promoterelement durch einen
Restriktionsverdau mit SnaßI und ApaI exzidiert und mit dem α-SMA-Pro
moterelementen nach Verdau von pRL-700 oder pRL-190 mit XhoI und
EcoRI ersetzt. Nach Aufreinigung der Banden über ein Agarosegel wurden
die Enden aufgefüllt, um eine "Blunt End"-Klonierung durchführen zu
können. Um eine Religation des Vektors zu verhindern, wurden bei diesem
zusätzlich eine Dephosphorylierung der 5'-Enden durchgeführt. Nach
einer Ligationsreaktion und Transformation in E. coli wurden positive Klone
isoliert, deren Plasmid-DNA aufgereinigt und sequenziert und so der
Einbau der α-SMA-Promoterfragmente in der richtigen Orientierung
überprüft. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des markierten
Primers SMA-100 (TM = 63°C), der im Bereich -100 des α-SMA-Promoter
bindet, durchgeführt. Die Konstrukte sind in Fig. 2b dargestellt.
Zur Erzeugung von stabilen Es-Transfektanten wurden
die beiden GFP-Reporterkonstrukte pSMA-GFP-700 und -190 (Abb. 2b)
hergestellt und in embryonale murine D3-Stammzellen transfiziert. Die
stabil transfizierten Klone wurden mittels ihrer Neomycin (G418)-
Resistenz, die im GFP-Konstrukt beinhaltet ist, selektioniert. Dazu wurde
24 Stunden nach der Transfektion zum erstenmal 50 µg/ml Neomycin
(10 mg/ml, GibcoBRL, Eggenstein) zugesetzt.
Zur Differenzierung von Stammzellen wurden diese ohne Feederzellen und
ohne Zugabe von LIF in DMEM (440 mg D-Glukose, 110 mg Natriumpyru
vat, L-Glutamin, Sigma) mit 20% FCS, das für Es-Zellen getestet war
(GibcoßRL, Gaithersburg, MD), 1x nicht-essentiellen Aminsäuren
(GibcoBRL), 1x Penicillin-Streptomycin (GibcoBRL) und 0,1 mM 3-Mercap
toethanol (Sigma) kultiviert. Für den Ansatz von Embroid Bodies (EB)
wurden 2,25 × 105 bzw. 4,25 × 105 Zellen in 1 ml Kulturmedium verdünnt.
Jeweils 20 µl der Zellsuspension (450 oder 800 Zellen) wurden als
hängende Tropfen kultiviert (Drab, M. et al., FASEB, 11: 905-911 (1997)
und Kolossov, E. et al., J. Cell. Biol., 143: 2045-2056 (1998)).
Die Immunhistolgie an EB, die mit dem pSMA-GFP-190 Promoterfragment
transfiziert wurden, zeigte, daß GFP-positive Zellareale nicht immer eine
α-SMA-Expression hatten und nicht alle α-SMA-positiven Zellen GFP expri
mierten. GFP-positive Zellen konnten Actinin-exprimierenden kardialen
oder skelettalen Muskelzelltypen zugeordnet werden. Caldesmon-positive
glatte Muskelzellen wiesen keine GFP-Expression auf.
Im Gegensatz dazu zeigte das pSMA-GFP-700 Konstrukt eine spezifische
GFP-Expression, die GFP-Expression konnte dabei sowohl in kardialen und
skelettalen Bereichen als auch in caldesmonpositiven glatten Muskelzellen
gefunden werden. Das gesichtete Reportermuster unter Kontrolle der
SequeTü A des α-SMA-Gens entspricht in differenzierten ES-Zellen demje
nigen während der Embryogenese.
Anhand der Reporteraktivität konnten Zellen durch Trypsinierung verein
zelt werden (Fig. 2b) und getrennt untersucht werden.
Zur Herstellung von stabil transfizierten embryonalen Stammzellen
wurden die α-SMA-Transgen-Vektoren zunächst durch einen
Restriktionsverdau, dessen Schnittstelle im Ampicillingen liegt, linearisiert
und nach einer Aufreinigung in H2O gelöst (1 µg/pl). Anschließend wurde
eine Elektroporation vorgenommen. Dazu wurden 5 × 106 Es-Zellen in 0,7 ml
PBS aufgenommen, resuspendiert und in eine Küvette überführt. Pro
Elektroporationen wurden 30 µg linearisierte Plasmid-DNA in einem Volu
men von 100 µl verwendet. Nach Zugabe der DNA in die Küvette erfolgte
zunächst eine Inkubation für 10 min auf Eis, die der Bildung von Prä
komplexen diente. Danach wurde mit einem Elektroporator der Firma
Biorad (München) bei 500 µF und 0,24 V ein Impuls erzeugt. Zur Rege
neration wurden die Zellen zunächst für 20 Minuten auf Eis inkubiert und
anschließend auf neomycinresistene Feederzellen plattiert.
Die Es- Zellen wurden in Blastozysten einer Wirtsmaus injeziert und in die
Leihmutter eingesetzt (V. Papaioannou, R. Johnson, in Gene Targeting. A
Practical Approach, ed. A. L: Joyner, Oxford UK (1993); T. Doetschman,
Transgenis Animal Technology. A Laboratory Handbook, Academic Press
Inc. San Diego, USA (1994)). Nach Rückkreuzungen der geborenen und
herangewachsenen transgenen Chimäre wurden homozygote Tiere
intoxiziert und auf ihre transgene Genexpression untersucht.
Alternativ können Konstrukte ohne Vektorrückrad (siehe Fig. 2b) durch
Miokroinjektion in den Vorkern zu transgenen Mäusen führen (J. W. Gordon
et al., Methods Enzymol. 101: 411-33 (1983); B. Hogan et al., in
Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual, Gold Spring
Harbor, NY (1994)).
Zur Induktion einer chronischen Leberschädigung wurden zwei wöchentli
che Gaben von 4%igem Tetrachlorkohlenstoff in Mineralöl (6 ml/kg Kör
pergewicht) den Mäusen intraperitoneal 2, 4, 6 oder 8 Wochen lang ver
abreicht. Da Tetrachlorkohlenstoff vor allem zu einer Hepatitis führt,
wurde in den Lebern transgener GFP-Mäuse die Aktivierung von myofibro
blastischen Zellen gesichtet. Daneben wurden die Mäuse auf eine
Pulmonitis und Nephritis sowie auf das Auftreten myofibroblastischer Zel
len in der Lunge und der Niere untersucht.
Claims (32)
1. Nukleinsäuresequenz, umfassend
- a) einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden Se quenzbereich des alpha-Smooth-Muscle-Actin-Gens (α-SMA-Gens) und
- b) wenigstens eine weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz, die mit der Sequenz (i) operativ verknüpft ist.
2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei der regulierende Se
quenzbereich des α-SMA-Gens von Säugern, insbesondere von Primaten
oder Nagern, oder Vögeln stammt und besonders bevorzugt von Ratte,
Maus, Mensch oder Huhn stammt.
3. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei der regulierende Se
quenzbereich von der Ratte stammt und die Nukleinsäuresequenz vor
zugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus der in Fig. 5A
gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 1), insbesondere aus der in Fig. 7A ge
zeigten Sequenz (SEQ ID No.: 5), umfasst.
4. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, wobei der funktionelle Bereich
eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere
aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz (SEQ ID No.: 7) stammt.
5. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 4, wobei die transkriptionsaktivie
rende Sequenz wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 40 und besonders
bevorzugt wenigstens 60 konsekutive Basen aus der in Fig. 7C gezeigten
Sequenz aufweist und besonders bevorzugt die in Fig. 7B oder 7C gezeigte
Sequenz (SEQ ID NOs.: 6 oder 7) umfasst.
6. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, wobei der funktionelle Bereich
eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der
Sequenz -698 bis -190 der Fig. 7A (Nukleotide 1 bis 509 von SEQ ID
No.: 5), besonders bevorzugt aus der Sequenz -698 bis -215 der Fig. 7A
(Nukleotide 1 bis 484 von SEQ ID No.: 5) stammt.
7. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6, wobei die zellspezifische Se
quenz wenigstens 25, vorzugsweise wenigstens 35 konsekutive Basen aus
der Sequenz -698 bis -190 der Fig. 7A aufweist und besonders bevorzugt
die in Fig. 7I oder 7M (SEQ ID No.: 13 oder 17) gezeigte Sequenz umfasst.
8. Nukleinsäuresequenz nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 7,
wobei die Nukleinsäuresequenz sowohl eine transkriptionsaktivierende als
auch eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz umfasst und/oder eine
der in SEQ ID NOs.: 5 bis 17 gezeigten Sequenzen aufweist.
9. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei der regulierende Se
quenzbereich von der Maus stammt und die Nukleinsäuresequenz vor
zugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5B ge
zeigten Sequenz (SEQ ID No.: 2) insbesondere aus der in SEQ ID No.: 18
gezeigten Sequenz aufweist.
10. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 9, wobei der funktionelle Bereich
- a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbeson dere aus den Nukleotiden 490 bis 697 der in SEQ ID No.: 18 gezeigten Se quenz stammt und/oder
- b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 489 der in SEQ ID No.: 18 gezeigten Sequenz stammt.
11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei der regulierende Se
quenzbereich vom Menschen stammt und die Nukleinsäuresequenz vor
zugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5C ge
zeigten Sequenz (SEQ ID No.: 3) insbesondere aus der in SEQ ID No.: 19
gezeigten Sequenz aufweist.
12. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 11, wobei der funktionelle Bereich
- a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und ins besondere aus den Nukleotiden 513 bis 715 der in SEQ ID No.: 19 gezeigten Sequenz stammt und/oder
- b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 512 der in SEQ ID No.: 19 gezeigten Sequenz stammt.
13. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei der regulierende Se
quenzbereich vom Huhn stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugs
weise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5D gezeigten
Sequenz (SEQ ID No.: 4) insbesondere aus der in SEQ ID No.: 20 gezeigten
Sequenz aufweist.
14. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13, wobei der funktionelle Be
reich (a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und ins
besondere aus den Nukleotiden 497 bis 699 der in SEQ ID No.: 20
gezeigten Sequenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus
den Nukleotiden 1 bis 496 der in SEQ ID No.: 20 gezeigten Sequenz
stammt.
15. Nukleinsäuresequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1
bis 14, wobei die weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz eine peptid-
oder proteinkondierende DNA-Sequenz, insbesondere ausgewählt ist aus
Reportergenen, Sequenzen, die für pharmakologisch aktive Proteine ko
dieren, und regulatorische DNA-Sequenzen, oder eine funktionelle RNA
kodierende Sequenz, insbesondere eine Ribozymbindungsstelle, ist.
16. Transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 4
bis 5, 10, 12 oder 14 definiert.
17. Zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 6 bis 7,
10, 12 oder 14 definiert.
18. Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, wie in Anspruch 16
und/oder 17 definiert.
19. Vektor, in dem eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 1 bis 15
definiert, inseriert ist.
20. Eukaryontische Zellen oder Organismen, die mit einer Nukleinsäurese
quenz, wie in Ansprüchen 1 bis 15 definiert, oder einem Vektor, wie in An
spruch 18 oder 19 definiert, transient oder stabil transfiziert transformiert
oder infiziert sind.
21. Eukaryontische Zellen oder Organismen gemäß Anspruch 20, die einen
Reporter unter Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des α-SMA-Gens
exprimieren.
22. Eukaryontische Zellen oder Organismen gemäß Anspruch 20, die ein
pharmakologisch aktives Protein, eine regulatorische DNA-Sequenz oder
eine funktionelle RNA-Sequenz unter Kontrolle des α-SMA-Gens expri
mieren oder aufweisen.
23. Verfahren zur Herstellung der eukaryontischen Zellen, wie in Ansprü
chen 20 bis 22 definiert, umfassend das Transfizieren, Transformieren
oder Infizieren von Ausgangszellen mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in
Ansprüchen 1 bis 15 definiert, oder mit Vektoren, wie in Anspruch 18 oder
19 definiert.
24. Verfahren zur Herstellung der Organismen, wie in Ansprüchen 20 bis
22 definiert, umfassend das Injizieren von ES-Zellen, die mit den Nuklein
säuresquenzen, wie in Ansprüchen 1 bis 15 definiert, oder mit Vektoren,
wie in Anspruch 18 oder 19 definiert, transfiziert sind, in Blastozysten der
Organismen und Einsetzen in die Leihmutter.
25. Verfahren zur Isolierung oder zur Sichtung von glatten Muskelzellen,
Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zeuge
misch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Organismus,
umfassend die Expression eines Reportergens in einer eukaryontischen
Zelle oder ein Organismus gemäß Anspruch 21.
26. Verfahren zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunk
tion von Glatten Muskelzellen oder Myofibroblasten in Organismen oder
Organen, umfassend Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, wie in An
sprüchen 1 bis 15 definiert, oder Vektoren, wie in Anspruch 18 oder 19
definiert, in die Organismen oder Organe.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Einbringen in die Organismen
oder Organe unter Nutzung transgener oder knock-out/-in Technologie
erfolgt.
28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Verfahren eine gentherapeuti
scher Fusionsvektorapplikation ist.
29. Arzneimittel, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen
1 bis 3, 14 oder 17 definiert, oder einen Vektor, wie in Anspruch 18 oder
19 definiert.
30. Arzneimittel nach Anspruch 29, welches zur Manipulation der Genex
pression und/oder der Zellfunktion von glatten Muskelzellen oder Myo
fibroblasten in Organismen oder Organen geeignet ist.
31. Verwendung eines funktionellen Bereichs aus dem regulierenden Se
quenzbereich des α-SMA-Gens zur zelltyp- und differenzierungsspezifi
schen Reporterexpression und zur zelltyp- und differenzierungsspezifi
schen Genveränderung.
32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei der funktionelle Bereich des α-
SMA-Gens
- a) eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 16 oder 17 definiert, ist;
- b) eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 1 bis 15 definiert, ist und/oder
- c) in einem Vektor, wie in Ansprüchen 18 oder 19 definiert, vorliegt.
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10053879A DE10053879A1 (de) | 2000-07-11 | 2000-10-31 | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen |
EP00128446A EP1172375A1 (de) | 2000-07-11 | 2000-12-22 | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und Myofibroblast-ähnlichen Zellen durch Verwendung der regulatorischen Bereiche des Alpha Smooth Muscle Aktin-Gens |
JP2002509372A JP2004502448A (ja) | 2000-07-11 | 2001-07-10 | 筋線維芽細胞及び筋線維芽細胞様細胞における遺伝子発現、ゲノム改変、並びにレポーター発現 |
US10/332,733 US20040106565A1 (en) | 2000-07-11 | 2001-07-10 | Gene expression, genome alteration and reporter expression in myofibroblasts and myofibroblast-like cells |
AU2001283937A AU2001283937A1 (en) | 2000-07-11 | 2001-07-10 | Gene expression, genome alteration and reporter expression in myofibroblasts and myofibroblast-like cells |
EP01962847A EP1315748A2 (de) | 2000-07-11 | 2001-07-10 | Genexpression, genomalteration und reporterexpression in myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen zellen |
PCT/EP2001/007913 WO2002004509A2 (de) | 2000-07-11 | 2001-07-10 | Genexpression, genomalteration und reporterexpression in myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen zellen |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10033633 | 2000-07-11 | ||
DE10053879A DE10053879A1 (de) | 2000-07-11 | 2000-10-31 | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10053879A1 true DE10053879A1 (de) | 2002-02-07 |
Family
ID=7648527
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10053879A Withdrawn DE10053879A1 (de) | 2000-07-11 | 2000-10-31 | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040106565A1 (de) |
EP (1) | EP1315748A2 (de) |
JP (1) | JP2004502448A (de) |
AU (1) | AU2001283937A1 (de) |
DE (1) | DE10053879A1 (de) |
WO (1) | WO2002004509A2 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20060065693A (ko) * | 2003-08-29 | 2006-06-14 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 기능적 뉴클레오티드 분자 검출 방법 |
EP2972380A2 (de) * | 2013-03-14 | 2016-01-20 | Galapagos NV | Molekulare targets und zusammensetzungen sowie verfahren zur identifikation davon bei der behandlung von fibrose |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5885769A (en) * | 1991-02-14 | 1999-03-23 | Schering Corporation | Screening systems |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000024254A1 (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-04 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for modulating expression within smooth muscle cells |
-
2000
- 2000-10-31 DE DE10053879A patent/DE10053879A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-07-10 WO PCT/EP2001/007913 patent/WO2002004509A2/de not_active Application Discontinuation
- 2001-07-10 AU AU2001283937A patent/AU2001283937A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-10 EP EP01962847A patent/EP1315748A2/de not_active Withdrawn
- 2001-07-10 JP JP2002509372A patent/JP2004502448A/ja active Pending
- 2001-07-10 US US10/332,733 patent/US20040106565A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5885769A (en) * | 1991-02-14 | 1999-03-23 | Schering Corporation | Screening systems |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Datenbank MEDLINE über STN Karlsruhe: Medline 86250825/AN (Abstr. zu: Caroll,S.L. et al., J. Biol. Chem 261 (19), 1986, 8965-76) * |
Datenbank MEDLINE über STN Karlsruhe: Medline 90112036/AN (Abstr. zu: Reddy,S. et al., J. Biol. Chem 265 (3), 1990, 1683-7) * |
Datenbank MEDLINE über STN Karlsruhe: Medline 90375543/AN (Abstr. zu: Min,B.H. et al., J. Biol. Chem. 265 (27), 1990, 16667-75) * |
Datenbank MEDLINE über STN Karlsruhe: Medline 91216472/AN (Abstr. zu: Nakano,Y. et al., Gene 99/2), 1991, 285-9) * |
Datenbank MEDLINE über STN Karlsruhe: Medline 92112840/AN (Abstr. zu: Blank,R.S. et al., J. BiolChem 267 (2), 1992, 984-9) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004502448A (ja) | 2004-01-29 |
EP1315748A2 (de) | 2003-06-04 |
US20040106565A1 (en) | 2004-06-03 |
WO2002004509A3 (de) | 2002-08-01 |
AU2001283937A1 (en) | 2002-01-21 |
WO2002004509A2 (de) | 2002-01-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69833649T2 (de) | Ef-1-alpha transkriptionsregulatorische dna aus hamster | |
DE69433034T2 (de) | Expression von heterologen genen nach einem ziel-expressionsprofil | |
DE69534310T2 (de) | Ptc gene und ihre verwendung | |
DE69838905T2 (de) | Transkriptionsfaktor islet-brain 1 (ib1) | |
DE69333923T2 (de) | Stabil transfizierte Zelllinien welche Gaba-A- Rezeptoren mit der Untereinheitenzusammensetzung alpha-3, beta-3 und gamma-2 exprimieren | |
DE69332798T2 (de) | Ikaros: ein regulatorisches gen bei der t-zell differenzierung | |
DE69819505T2 (de) | Mit smad wechselwirkende polypeptide und verwendungen davon | |
DE10393473T5 (de) | Trap-Tagging: ein neuartiges Verfahren zur Identifikation und Reinigung von RNA-Protein-Komplexen | |
DE4225569C2 (de) | Verwendung einer Sonde zur Tumordiagnostik oder Tumortherapie | |
DE10053879A1 (de) | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen | |
DE69734143T2 (de) | Neue methoden zur charakterisierung von verbindungen, welche die stf-1 expression in inselzellen der bauchspeicheldrüse stimuliert | |
DE69534022T2 (de) | Genomische DNS Fragmente der regulierenden Sequenz der Beta 2 Untereinheit des neuronalen Nikotin-Acetycholin Rezeptors; damit transformierte transgene Tiere. | |
EP0902092A2 (de) | Verfahren zur Identifizierung von Zielgenen von Transkriptionsfaktoren | |
US6821759B1 (en) | Methods of performing homologous recombination based modification of nucleic acids in recombination deficient cells and use of the modified nucleic acid products thereof | |
EP1172375A1 (de) | Genexpression, Genomalteration und Reporterexpression in Myofibroblasten und Myofibroblast-ähnlichen Zellen durch Verwendung der regulatorischen Bereiche des Alpha Smooth Muscle Aktin-Gens | |
DE60225839T2 (de) | Mittel zur isolierung von lebensfähigen zellen, die c-kit exprimieren | |
WO2001027265A1 (de) | Nukleinsäuresequenzen von hyperplasien und tumoren der schilddrüse | |
DE69434333T2 (de) | Methoden unter verwendung von eaa3 oder eaa4 rezeptoren | |
DE19946173B4 (de) | Expression der bovinen Acetyl-Coenzym A Carboxylase α | |
DE60223205T2 (de) | Transgenes Tiermodell für Alzheimer-Erkrankung | |
Yang | Genetic control of cerebellar granule cell production and cerebellar morphogenesis by murine zinc finger transcription factor Ru49 | |
WO2001068698A2 (de) | Nichtselektiver kationenkanal | |
WO2008155122A1 (de) | Gezielte bereitstellung von rekombinase-aktivität durch trans-spleissen | |
Li | Regulation of gene expression of a winged-helix transcription factor, brain factor-1, an essential regulator of forebrain development | |
DE19956513A1 (de) | Resolvase-katalysierte, Sequenz-spezifische DNA-Rekombination in eukaryotischen Zellen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: CELL CENTER COLOGNE GMBH, 50931 KOELN, DE |
|
8130 | Withdrawal |