DE69434333T2

DE69434333T2 - Methoden unter verwendung von eaa3 oder eaa4 rezeptoren

Info

Publication number: DE69434333T2
Application number: DE69434333T
Authority: DE
Inventors: Rajender Kamboj; Stephen Dr. Bohr-Gasse 7 NUTT
Original assignee: NPS Allelix Corp Canada
Current assignee: Shire NPS Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: WO1995017508A2; DE69434333D1; CA2179208C; EP0741782B1; EP0741782A1; CA2179208A1; JPH09511901A; WO1995017508A3; AU1377095A; ATE293162T1; US6136544A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue ZNS-Rezeptor Polynukleotide und die Proteine, die sie kodieren, und ihre Verwendung beim Screenen potenzieller therapeutischer Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Im Zentralnervensystem (ZNS) von Säugetieren wird die Übertragung von Nervenimpulsen durch die Wechselwirkung zwischen einer Neurotransmittersubstanz, die von dem "sendenden" Neuron freigesetzt wird und einem Oberflächenrezeptor auf dem "empfangenden" Neuron, an den der Neurotransmitter bindet und dessen Anregung verursacht, kontrolliert. Es gibt eine Vielzahl von Neurotransmittern im ZNS, von denen jeder auf spezifische empfangende Neuronen abzielt. Beispielsweise zielen Glutamat, Dopamin und Serotonin Neurotransmitter jeweils auf eine unterschiedliche Familie von Rezeptoren ab. Glutamat, das als eine exzitatorische Aminosäure (engl.: excitatory amino acid) bezeichnet wird, wechselwirkt mit Rezeptoren, die unterschiedlich als Glutamat- oder EAA-Rezeptoren bezeichnet werden, während Dopamin und Serotonin spezifisch jeweils mit Dopamin- und Serotonin-Rezeptoren wechselwirken.
Innerhalb jeder Rezeptorfamilie werden die Rezeptoren durch ihre Ligandenbindung oder funktionellen Eigenschaften klassifiziert. Zum Beispiel werden einige EAA-Rezeptoren nach ihrer differenziellen Bindung an die Antagonisten, NMDA (N-Methyl-D-aspartat), AMPA (Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionat) und Kainat (2-Carboxy-4(1-methylethenyl)-3-pyrrolidinacetat) klassifiziert. Somit binden NMDA-Rezeptoren Glutamat und binden NMDA mit größerer Affinität als Kainat oder AMPA, während AMPA- und Kainat-Rezeptoren Glutamat binden und jeweils AMPA und Kainat mit größerer Affnität als andere Antagonisten binden.
Im Gegensatz zu Dopamin- und Serotonin-Rezeptoren sind einige EAA-Rezeptoren in einem elektrophysiologischen Sinn funktionell, wie durch etablierte elektrophysio logische Assays, wie jene, die bei Hollman et al. in Nature 342: 643, 1989 beschrieben sind, oder durch irgendeinen anderen Assay, der geeignet ist zum Nachweisen von Leitfähigkeit über eine Zellmembran, bestimmt wurde. Im Wesentlichen bilden EAA-Rezeptoren Liganden vermittelte Ionenkanäle. So wird sich als Antwort auf die Bindung eines geeigneten Liganden, z.B. Glutamat, AMPA, Kainat oder NMDA, ein EAA-Rezeptor Ionenkanal "öffnen" oder permeabler werden, um das Einströmen von Kationen zu erlauben, was für eine normale synaptische Übertragung benötigt wird. In der Abwesenheit von Ligandenbindung bleiben die Ionenkanäle "geschlossen" oder weniger permeabel gegenüber Kationen, was den nach innen gerichteten Fluss von Kationen verhindert, der für die synaptische Übertragung benötigt wird.
Mindestens sechs Nager-Rezeptoren des AMPA Typs wurden kloniert und als GluR-1 bis 6 bezeichnet. Expressionsstudien legen nahe, dass GluR-2 die dominante Untereinheit bei der Bestimmung der funktionellen Eigenschaften ist, die mit Ca²⁺ Permeabilität in dieser Nager-Rezeptor Familie assoziiert sind. Mutationsstudien haben gezeigt, dass diese Permeabilität durch eine einzelne Aminosäure, Arginin (R) in dem putativen Kanal bildenden Transmembran II (TMII) des Ratten GluR-2 bestimmt wird; ein Glutamin (Q) Rest ist in den anderen AMPA-Rezeptoren anwesend. Es wurde anschließend gezeigt, dass die R Form des GluR-2-Rezeptors von demselben Gen wie die Q Form durch einen RNA Editierungsvorgang gebildet wird, was anzeigt, dass im Rattenhirn das Auftreten dieses "Editierungs"vorgangs den Kationenfluss in GluR-2 Kanäle bestimmt (Sommer et al., 1991, Cell, 67: 11). Bisherige Berichte haben nahezu 100% Wirksamkeit des Editierungsvorgangs für Nager GluR-2 mit niedrigen Expressionsmengen von nicht veränderten Q Formen im sich entwickelnden zentralen Nervensystem gefunden (Sommer et al., supra; und siehe Burnashev et al., 1992, Neuron, 8: 189). Erst kürzlich wurde von den Ratten-Rezeptoren des AMPA Typs GluR-5 und GluR-6 auch gezeigt, dass sie RNA Editierung unterlaufen (Sommer et al., supra; Burnashev et al., supra; und siehe Kohler et al., 1993, Neuron, 10: 491).
RNA Editierung ist ein relativ seltenes Phänomen, aber tritt in verschiedenen Organismen auf und kann eine Vielzahl von verschiedenen Mechanismen einschließen. Für das Editieren des Nager AMPA Rezeptors, GluR-2, wurde gezeigt, dass es eine basengepaarte Intron/Exon Struktur benötigt. Es wird postuliert, dass eine nukleäre Adenosin Deaminase, die spezifisch ist für doppelsträngige DNA in die Basenkonversion involviert ist, obwohl der direkte Beweis des Mechanismus und irgendeine Regulation des Vorgangs noch untersucht werden müssen.
Es wurden mehrere menschliche Glutamat-Rezeptoren kloniert, einschließlich solcher des AMPA Typs, wie hGluR1 (Puckett et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7557), hGluR-2, hGluR-3 (Biochem. Biophys. Acta, 1994, 1219: 563) und jene des Kainattyps, wie humEAA1 ( EP 529,994 ); humEAA2 ( EP 529,995 ); humEAA3 ( EP 617,123 ) und humEAA4 ( EP 578,409 ). Die menschlichen Glutamat-Rezeptoren sind aufgrund ihrer postulierten Rolle in der Vermittlung von Lernen und Gedächtnisaneigung von großer medizinischer Bedeutung. Zusätzlich können exzitatorische Aminosäuren hochgiftig auf Neurone sein, und eine Dysfunktion in diesem Neurotransmittersystem wurde in einige neurologische Störungen, wie Alzheimer'sche Erkrankung, Huntington'sche Chorea, Epilepsie, Parkinson'sche Erkrankung, amytrophe laterale Sklerose, AIDS Enzephalopathie und Demenzkomplex eingeschlossen. Bis heute wurde das RNA Editierungsphänomen, eine wichtige Determinante der funktionellen Eigenschaften von ZNS-Rezeptoren und insbesondere Glutamat-Rezeptoren, nicht in Menschen beobachtet.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde jetzt entdeckt, dass die Synthese von menschlichen ZNS-Rezeptoren in vivo durch einen Editierungsmechanismus reguliert ist. Dieses "Editieren" führt zu der Expression eines einzelnen menschlichen ZNS-Rezeptorgens von strukturell verschiedenen Formen des kodierten ZNS-Rezeptorproteins, d.h. editierten und nicht-editierten Rezeptorformen. Es wird postuliert, dass gewisse neurodegenerative Erkrankungszustände mit einem abweichenden Editierungsmechanismus assoziiert sind. Der hier vorgelegte Beweis zeigt weiterhin, dass dieser Editierungsmechanismus in einer gewebeselektiven Weise und in einer entwicklungsregulierten Weise funktioniert. Somit sind die Expressionsprodukte eines gegebenen ZNS-Rezeptor kodierenden Gens in Screening Verbindungen für potenzielle therapeutische Anwendung und insbesondere in der Auswahl von Arzneimittelkandidaten, die selektiv mit editierten menschlichen ZNS-Rezeptorformen wechselwirken, wertvoll.
Demzufolge stellt die Erfindung in einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Identifizierung eines menschlichen ZNS-Rezeptor selektiven Liganden bereit, umfassend:

a) Bestimmen der Wechselwirkung zwischen einem Kandidatenliganden und einem ersten nicht-editierten menschlichen EAA-Rezeptor einer der Editierung unterworfenen Art, der menschliche EAA3-Rezeptor wie in 5 definiert, oder menschlicher EAA4-Rezeptor wie in 6 definiert ist,
b) Bestimmen der Wechselwirkung zwischen dem Kandidatenliganden und einem zweiten editierten menschlichen EAA-Rezeptor, der eine editierungsveränderte Variante des ersten Rezeptors ist, und entweder
c) Auswählen des Kandidatenliganden, der selektiv mit einem der Rezeptoren wechselwirkt, oder
d) Auswählen des Kandidatenliganden, der im Wesentlichen äquivalent mit beiden Rezeptoren wechselwirkt.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Agenzien bereit, welche die Editierung von menschlichen EAA3-Rezeptoren in vivo modulieren, umfassend:

a) Erhalten einer menschlichen neuronalen Zelllinie, die (1) für die nicht-editierte Form von menschlichem, der Editierung unterworfenem EAA3-Rezeptor kodierende DNA enthält, und die (2) bei Kultivierung die editierte Form des Rezeptors bildet,
b) Kultivieren der Zelllinie in der Gegenwart eines Kandidatenmodulators der Editierung, und
c) Bestimmen der Wirkung des Modulators auf die Bildung der editierten Form des Rezeptors.

In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Agenzien bereit, welche die Editierung von menschlichem EAA4-Rezeptor in vivo modulieren, umfassend:

a) Erhalten einer menschlichen neuronalen Zelllinie, die (1) für die nicht-editierte Form von menschlichem, der Editierung unterworfenem EAA4-Rezeptor kodierende DNA enthält, und die (2) bei Kultivierung die editierte Form des Rezeptors bildet,
b) Kultivieren der Zelllinie in der Gegenwart eines Kandidatenmodulators der Editierung, und
c) Bestimmen der Wirkung des Modulators auf die Bildung der editierten Form des Rezeptors.

Diese und andere Aspekte der Erfindung werden detaillierter unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
Kurzbezugnahme auf die Zeichnungen
1 die genomischen DNA und Proteinsequenzen der nicht-editierten Form des menschlichen GluR2B-Rezeptors bereitstellt;
2 ein Vergleich der teilweisen Aminosäuresequenzen der editierten und nicht-editierten Formen des GluR2B-Rezeptors ist;
3 das Exon des GluR2B Gens, das der Editierung unterworfen ist, und die Primer, die in der genomischen DNA Isolierung verwendet wurden, darstellt; und
4 die Ergebnisse einer enzymatischen Spaltung von menschlicher genomischer GluR2B DNA darstellt.
5 die genomischen DNA und Proteinsequenzen der nicht-editierten Form des menschlichen EAA3-Rezeptors bereitstellt;
6 die genomischen DNA und Proteinsequenzen der nicht-editierten Form von menschlichem EAA4-Rezeptor bereitstellt;
7 das Editieren in menschlichen EAA3- und EAA4-Rezeptoren darstellt:
a) Vergleich von genomischen und cDNA Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen in TMI; b) Vergleich von genomischen und cDNA Nukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen in TMII; und
Detaillierte Beschreibung der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung basiert auf der vorliegenden Entdeckung, dass ein einzelnes Gen, das für einen menschlichen ZNS-Rezeptor kodiert, wenn es in vivo exprimiert wird, nicht nur zu einem Rezeptor der Aminosäuresequenz führen kann, die durch das Gen bestimmt ist, sondern auch zu einer oder mehreren Formen des Rezeptors führen kann, die nicht durch das Gen kodiert werden. Dieses Editierungsphänomen wurde durch Vergleichen der cDNA Sequenz eines gegebenen menschlichen Rezeptors mit der entsprechenden genomischen DNA Sequenz für den gegebenen Rezeptor enthüllt. Sequenzunterschiede zeigten, dass die cDNA Sequenz im Vergleich zu der genomischen Sequenz verändert wurde, mit dem Ergebnis, dass die cDNA, die ein Rezeptorprotein kodierte, mindestens eine Aminosäure Substitution in Vergleich zu dem Rezeptor aufwies, der durch die genomische DNA kodiert wurde. Auf diese Weise führt das Editierungsphänomen zu Rezeptorformen, die sich bezüglich der Rezeptorprotein Struktur unterscheiden, und in einigen Fällen auch bezüglich der Rezeptorprotein Funktion.
Diese verschiedenen Rezeptorformen sind die Expressionsprodukte von Polynukleotiden, die hier als "editiert" und "nicht-editiert" charakterisiert sind. "Nicht-editierte" Polynukleotide sind jene, die eine genomisch kodierte Sequenz aufweisen. Genauso weist in "nicht-editierten" Rezeptorproteinen jede Aminosäure in der Rezeptorproteinsequenz ein geeignetes Quellkodon innerhalb der genomischen DNA Sequenz auf, d.h. das nicht-editierte Polynukleotid, von dem es exprimiert wird. "Editierte" Rezeptorproteine werden andererseits von nicht-editierten genomischen Polynukleotiden exprimiert, weisen aber dennoch eine Rezeptorproteinsequenz auf, in der mindestens eine Aminosäure in dem nicht-editierten Polynukleotid, von dem es exprimiert wird, nicht dargestellt ist. Die Begriffe "editiert" und "nicht-editiert" werden hier auch bezüglich mRNA, sDNA und cDNA Sequenzen der jeweiligen Rezeptorproteine verwendet.
Der Begriff "verschieden" so wie er hier bezüglich der editierten und nicht-editierten ZNS-Rezeptoren verwendet wird, betrifft die Unterschiede zwischen den editierten und nicht-editierten Rezeptoren, die mindestens eine einer strukturellen Differenz einschließen, d.h. ein Aminosäuresequenzunterschied oder ein funktioneller Unterschied, d.h. ein Unterschied in Ligandenbindung oder elektrophysiologischen Eigenschaften, die bestimmt werden können unter Verwendung von Assays, die zum Bestimmen von Ligand/Rezeptorwechselwirkung geeignet sind. Der Begriff "funktionell verschieden" gibt an, dass jede der editierten und nicht-editierten Rezeptorformen gegenüber einem gegebenen Stimulus verschieden reagiert. Zum Beispiel können funktionell verschiedene Formen eines EAA-Rezeptors durch eine nicht-editierte Rezeptorform dargestellt werden, die Liganden vermittelte Ionenkanalaktivität als Antwort auf einen gegebenen Liganden zeigt, während die editierte Form des Rezeptors keine Kanalaktivität in der Gegenwart dieses Liganden zeigt. Funktionell verschiedene Formen eines ZNS-Rezeptors können auch verschiedene Ligandenbindungseigenschaften aufweisen.
Ohne auf irgendeine einzelne Theorie bezüglich des Mechanismus der Editierung beschränkt zu sein, wird angenommen, dass die "Editierung" eines Gens durch ein Enzym auf der Ebene der Transkription katalysiert wird. So erkennt das "Editierungs" Enzym während der Transkription einer genomischen ZNS-Rezeptor kodierenden DNA ein Nukleotid innerhalb der DNA Sequenz und, anstelle das geeignete entsprechende Nukleotid in die mRNA einzubauen, baut es ein anderes Nukleotid in die mRNA ein. Die Editierung von ZNS-Rezeptor Polynukleotiden tritt nicht in 100 der Fälle auf, und so scheint es, dass bestimmte Bedingungen oder Signale vorgeben, wann ein ZNS-Polynukleotid editiert werden wird und wann Editierung nicht stattfinden wird. Wie detaillierter unten beschrieben wird, wurde auch gefunden, dass die Editierung von menschlichen ZNS-Genen gewebespezifisch auftritt, die mit größerer Frequenz in gewissen ZNS-Geweben als in deren anderen auftritt.
Der Begriff "genomisches Polynukleotid" wird hier als Bezug auf ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz verwendet, die der kodierenden Sequenz auf der genomischen DNA entspricht. So kann ein erfindungsgemäßes genomisches Polynukleotid eine genomische DNA oder synthetisch oder cDNA sein, welche die exonischen kodierenden Sequenzen der genomischen DNA umfasst, aber die keine nicht-kodierenden intronischen Sequenzen aufweist. Ein genomisches Polynukleotid kann auch RNA sein, die der genomischen DNA Sequenz entspricht, d.h. in nicht-editierter Form.
Der Begriff "isoliert" wird hier unter Bezug auf intakte Polynukleotide verwendet, um Polynukleotide zu bezeichnen, einschließlich sowohl DNA und RNA, die frei sind von Polynukleotiden, die für andere menschliche Proteine kodieren. Bezüglich eines menschlichen ZNS-Rezeptorproteins betrifft der Begriff "isoliert" dementsprechend ein Rezeptorprotein, das frei ist von anderen menschlichen Proteinen.
Somit stellt die Erfindung in Übereinstimmung mit einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden bereit, der mit den editierten und/oder nicht-editierten Formen eines Rezeptors wechselwirkt, welches das Bestimmen der Wechselwirkung zwischen dem Ligandenkandidaten und einem ersten ZNS-Rezeptor, welcher der Editierung unterworfen ist, und zwischen dem Ligandenkandidaten und einem zweiten menschlichen ZNS-Rezeptor, der eine editierungsveränderte Variante des ersten Rezeptors ist, und anschließend Auswählen des Liganden, der selektiv mit einem der Rezeptorformen wechselwirkt, in dem Fall wo das Abzielen eines Arzneimittels auf einen bestimmten Rezeptortyp gewünscht ist, oder Auswählen des Liganden, der mit beiden Rezeptorformen wechselwirkt, in dem Fall wo ein Arzneimittel, das nicht-unterscheidend bei der Rezeptorfamilie wirkt, gewünscht ist, umfasst.
Zur Verwendung in einem solchen Screening Verfahren wird es notwendig sein, Polynukleotide zu identifizieren und zu erhalten, die editierungsveränderte Rezeptorformen innerhalb einer Rezeptorgenfamilie kodieren. Um zu bestimmen, ob ein ge gebenes ZNS-Rezeptor kodierendes Gen der Editierung unterworfen ist, sollte die genomische DNA Sequenz des Rezeptors mit den Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen verglichen werden, die davon in vivo abgeleitet sind, insbesondere die mRNA Sequenz, die in vivo von der Gensequenz transkribiert wird, oder ihr cDNA Äquivalent, und die Proteinsequenz, die davon exprimiert wird. Es ist wichtig die Gensequenz mit Sequenzen der mRNA und des Proteins zu vergleichen, die von der in vivo Verarbeitung stammen, um die Editierung des Gens nachzuweisen. Der Vergleich der Gensequenz mit einer mRNA oder Proteinsequenz, die künstlich hergestellt wurde, d.h. unter in vitro Bedingungen, wird wahrscheinlich keine editierte Sequenz darstellen, weil Editierungszustände, zum Beispiel die Anwesenheit von benötigten Editierungsenzymen, wahrscheinlich in vitro nicht anwesend sind, es sei denn sie werden spezifisch hinzugefügt.
Gleichgültig ob Wissen über die Editierung eines bekannten Gens oder eines neuen Gens gesucht wird, ist das allgemeine Verfahren zum Erhalten des Gens und seines cDNA Äquivalents gleich. Zum Beispiel können Verfahren, wie jene die beschrieben sind von Sun et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 1443 verwendet werden, um gewünschte Rezeptor kodierende cDNAs zu isolieren. Typischerweise wird in einem ersten Schritt die gewünschte cDNA Sequenz von einer menschlichen Hirn cDNA Bibliothek erhalten. Für diesen Zweck ist es notwendig, geeignete Nukleinsäuresonden zu designen und anschließend herzustellen, um mit ihnen die cDNA, die den gesamten oder einen Teil eines ZNS-Rezeptors kodiert, zu isolieren. Wenn ein neues ZNS-Rezeptorgen gesucht wird, können die Sonden auf Regionen von ZNS-Rezeptoren beruhen, von denen angenommen wird, dass sie unter gewissen ZNS-Rezeptortypen konserviert sind, zum Beispiel unter ZNS-Rezeptoren des Kainat Typs. Wenn ein bekanntes Gen gesucht wird, werden die Sonden wünschenswerterweise komplementär zu einer Region des Gens sein, die einzigartig in diesem Gen ist. Alternativ dazu kann die cDNA Sequenz, wenn sie bekannt ist, unter Verwendung synthetischer Techniken hergestellt werden, indem kleinere Fragmente der Gesamtlängen cDNA hergestellt und anschließend ligiert werden. Die Isolierung von cDNA, die mit den Sonden hybridisiert, wird in einer Weise durchgeführt, die dem Fachmann gut bekannt ist. Obwohl es möglich ist, werden die Gesamtlängen Rezeptor cDNAs für gewöhnlich nicht unter Verwendung der Sonden isoliert, sondern es werden Fragmente der Gesamtlängen cDNAs isoliert. Die Gesamtlängen cDNAs werden hergestellt durch Ligation von cDNA Fragmenten, wobei Ligationsstellen durch überlappende Regionen der cDNA Fragmente bestimmt werden. Nach dem Herstellen einer Gesamtlängen cDNA kann sie unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie dem Sanger Sequenzierverfahren, sequenziert werden. Die mRNA Sequenz des Gens wird selbstverständlich der Gesamtlängen cDNA entsprechen. Die Sequenz des Proteins, das davon exprimiert wird, kann auch von der isolierten cDNA Sequenz stammen.
Nachdem eine Gesamtlängen cDNA hergestellt wurde, kann sie als Ganzes oder in Teilen als eine Sonde verwendet werden, um die gewünschte entsprechende genomische Rezeptor kodierende DNA aus einer genomischen DNA Bibliothek zu isolieren. Wiederum wird dieser Versuch wahrscheinlich nicht zu einer Gesamtlängen genomischen DNA führen, jedoch können isolierte Fragmente der genomischen DNA verwendet werden, um eine Gesamtlängen genomische Rezeptor kodierende DNA herzustellen. Um die Isolierung einer bestimmten genomischen DNA zu erleichtern, kann die gewünschte DNA zunächst amplifiziert werden, um ihre Menge im Vergleich zu dem Rest der DNA in der Bibliothek zu erhöhen. Dies wird typischerweise durch Verwendung der gut etablierten PCR Technik erreicht. In diesem Fall werden PCR Primer, die kurze DNA Fragmente sind, von denen bekannt ist, dass sie an die Terminusenden der gewünschten genomischen DNA hybridisieren, zu der Bibliothek hinzugefügt, und unter geeigneten PCR Bedingungen wird die gewünschte DNA amplifiziert, wodurch ihr Nachweis und ihre Isolierung erleichtert werden. Sobald es isoliert und/oder in seiner Gesamtlängenform hergestellt ist, kann das Gen sequenziert werden, und seine Sequenz kann anschließend mit jener der isolierten cDNA verglichen werden. Irgendwelche Unterschiede zwischen den Sequenzen zeigen das Auftreten von in vivo Sequenzeditierung an.
Es wird vom Fachmann begrüßt, dass es nicht notwendig sein muss, die gesamte cDNA und die genomischen DNA Polynukleotide zu sequenzieren, um zu bestimmen oder zu postulieren, dass Editierung des bestimmten Gens stattgefunden haben kann. In einem alternativen Verfahren wird nur ein Abschnitt von jeweils der cDNA und des Gens sequenziert, um nach Sequenzunterschieden oder Editierung zu suchen. Diesbezüglich wird es notwendig sein, eine Region des Gens auszuwählen, in der Editierung wahrscheinlich auftritt, zum Beispiel eine Region, die eine funk tionelle Domäne des Rezeptorproteins kodiert. Die funktionelle Rezeptordomäne wird selbstverständlich von Rezeptor zu Rezeptor variieren. In EAA-Rezeptorgenen sind die Regionen, die intrazelluläre Transmembrandomänen kodieren, die für Ionenkanalaktivität wichtig sind, Regionen, die hinsichtlich Beweis für Editierung untersucht werden können. Im Fall von Dopamin- und Serotonin-Rezeptoren, die keine Ionenkanäle bilden, sollten Regionen der Rezeptorgene, von denen angenommen wird, dass sie eine Ligandenbindungsdomäne kodieren, nach Sequenzunterschieden untersucht werden. Wenn keine Editierung in den gewählten Regionen der genomischen und cDNA Polynukleotide gefunden wird, wird es anschließend selbstverständlich notwendig sein, die gesamten Sequenzen von beiden zu vergleichen, um daraus schließen, dass das bestimmte Gen entweder editiert ist oder nicht.
Ein anderes Verfahren zur Identifizierung, ob Editierung aufgetreten ist oder aufgetreten sein könnte, ist es die Eigenschaften der Rezeptorproteine zu vergleichen, die von jeder/jedem ZNS-Rezeptor cDNA und Gen exprimiert werden. Für diesen Zweck werden die cDNA und genomische DNA in Expressionsvektoren kloniert, die verwendet werden, um geeignete Zellen zu transformieren, wie im Detail unten beschrieben ist, und die Rezeptorproteine oder Membranpräparationen, die daraus hergestellt werden, werden zum Vergleich unter Verwendung der Ligandenbindungs- und/oder elektrophysiologischen Assays, die auch im Detail unten beschrieben sind, isoliert. Funktionelle Unterschiede zwischen den Proteinen sind auch ein Indikator, dass Editierung dieses bestimmten ZNS-Rezeptorproteins an irgendeiner Stufe vor seiner Expression stattfindet.
Beim Postulieren, dass Editierung eines ZNS-Rezeptorgens stattfindet, wird es anschließend notwendig sein, die Möglichkeit auszuschließen, dass multiple Gene oder veränderte Exons für Sequenzunterschiede zwischen der genomischen DNA und dem Proteinprodukt verantwortlich sind, d.h. zu bestätigen, dass solche Sequenzunterschiede das Auftreten von Editierung beweisen. Zu Beginn muss genomische DNA, die das Protein kodiert, unter Verwendung spezifischer DNA Sonden, wie oben beschrieben, von den genomischen DNA Bibliotheken aus verschiedenen Regionen des Gehirns isoliert werden. Dies wird sicherstellen, dass falls multiple Gene vorliegen, von denen eines oder mehrere regionenspezifisch ist, ihre Existenz nicht übersehen wird. Weiterhin kann das Verfahren der Primer basierten PCR Amplifikation angewendet werden, um DNA zu amplifizieren, die in den DNA Bibliotheken in nur sehr geringen Mengen vorkommen kann.
Bei der Isolierung von genomischer DNA ist ein Weg, um zu bestätigen, dass multiple Gene, d.h. ein Gen, das für die nicht-editierte Form des Proteins kodiert und ein Gen, das für die editierte Form des Proteins kodiert, nicht existieren, oder dass alternativ gesplicte Exons nicht für die verschiedenen Proteinformen verantwortlich sind, die Eigenschaften, die in einer Form des Gens (oder kodierenden Exons) vorkommen, aber die in der anderen Form des Gens (oder kodierenden Exons) abwesend wären, zum Beispiel Restriktionsenzymstellen, zu identifizieren. Somit wird das Aussetzen von Isolaten der genomischen DNA gegenüber Restriktionsenzymen, für die eine Erkennungsstelle in der betroffenen Region anwesend ist, zu zwei Fragmenten in der Analyse unter Verwendung von Sonden spezifischer Hybridisierung führen. Einerseits wird das Exponieren genomischer DNA Isolate gegenüber Restriktionsenzymen, für die keine Erkennungsstelle in der betroffenen Region vorliegt, nur zu einem einzigen Fragment in der Analyse unter Verwendung Sonden spezifischer Hybridisierung führen. Unstimmigkeiten gegenüber den erwarteten Ergebnissen zeigen, dass ein multiples Gen oder Exon involviert sein könnte, und die genomische DNA, die zu den unerwarteten Ergebnissen geführt hat, muss vollständig sequenziert werden, um den Grund für die Unstimmigkeit zu identifizieren.
Information über die Eigenschaften von sowohl den editierten als auch den nicht-editierten Formen eines Rezeptorproteins wären selbstverständlich nur erhältlich, wenn die Proteinsequenzen von jeder der Proteinformen bekannt sind. In den meisten Fällen wird jedoch die einzige Information, die erhältlich ist, eine Rezeptorgensequenz und eine Proteinsequenz sein, die der bekannten Gensequenz entsprechen kann oder nicht. So müssen verschiedene Verfahren verwendet werden, um zu bestimmen, ob RNA Editierung des Gens auftritt oder ob multiple Gene oder Exons involviert sind, die zu einem Protein führen, das in der Sequenz nicht dem Gen entspricht, von dem angenommen wird, dass es das Protein kodiert. Ein solches Verfahren beruht auf der Tatsache, dass intronische Gensequenzen von Gen zu Gen variieren trotz der Tatsache, dass die kodierenden (exonischen) Sequenzen von zwei Genen nur geringfügig variieren, zum Beispiel durch ein einziges Kodon. In diesem Verfahren wird isolierte genomische DNA der Restriktionsenzymspaltung unterworfen und wird anschließend auf einem Nitrocellulosefilter immobilisiert. Eine markierte DNA Sonde, die auf die Zielregion gerichtet ist, d.h. die Region der Gen:Proteinunstimmigkeit, wird verwendet, um die Enzym gespaltenen DNA Fragmente zu identifizieren. Weil die Sequenz der genomischen DNA bekannt ist, wird die Existenz von Restriktionsstellen in der Zielregion und damit die Zahl von Restriktionsfragmenten, die von einer gegebenen Enzymspaltung erwartet werden, bekannt sein, und das Ergebnis von mehr oder weniger Fragmenten als erwartet, wird die Existenz von multiplen Genen oder alternativen Kodons anzeigen.
Alternativ dazu kann isolierte genomische DNA, die PCR amplifiziert wurde, in der Suche nach multiplen Genen oder alternativen Exons vollständig sequenziert werden. Dieses Verfahren wird vorzugsweise verwendet, um Ergebnisse zu bestätigen, die in anderen Verfahren erhalten wurden, wie jene die oben beschrieben sind, oder wenn solche Verfahren keine bestätigenden Ergebnisse liefern. Die vollständige Sequenzierung von irgendwelchen isolierten Genen oder Genfragmenten wird ihre Identität bestätigen. Wenn ein Gen, welches das "editierte" Protein kodiert, bei der Sequenzierung einer substanziellen Zahl von positiven Klonen von jeder Region des Gehirns, d.h. 50–100, nicht gefunden wird, dann kann die Existenz von multiplen Genen und die Existenz von alternierten Exons als Möglichkeiten für die Proteinsequenzunstimmigkeit ausgeschlossen werden.
Um darüber hinaus die Möglichkeit auszuschließen, dass der Unterschied zwischen den DNA und Proteinsequenzen nicht das Ergebnis einer zufälligen Mutation, d.h. einer Punktmutation oder einer anderen Form von Mutation ist, ist es wichtig zu bestimmen, dass er mit einer Frequenz auftritt, die größer ist als jene, die mit zufälliger Mutation assoziiert wäre. In dieser Hinsicht würde die Expression der editierten und nicht-editierten Formen des Proteins mit einer Frequenz von größer als 1 in 1000, oder 1 in 10.000 die Bedenken eliminieren, dass eines der Proteine das Ergebnis von Mutation war, insbesondere weil Mutationen in dem menschlichen ZNS sehr selten sind.
Um dem Fachmann beim Verstehen der vorliegenden Erfindung zu helfen, wurde der menschliche EAA-Rezeptor, nämlich der GluR2B-Rezeptor, der in der EP-A-574257 beschrieben ist, nur für beispielhafte Zwecke bestimmt, um der Editierung unterworfen zu werden, wie detailliert in den spezifischen Beispielen beschrieben ist. In Kürze wurden genomische DNA Fragmente des GluR2B-Rezeptors und Gesamtlängen cDNA, die von der Aminosäuresequenz des Rezeptorproteins stammt, verwendet, um eine genomische DNA Bibliothek zu untersuchen. Gesamtlängen genomische DNA, die unter Verwendung dieser Sonden isoliert wurde, wurde sequenziert, und ihre Sequenz wurde anschließend mit den Gesamtlängen GluR2B cDNA und Proteinsequenzen verglichen. Ein Vergleich der Sequenzen identifizierte einen einzigen Kodonunterschied in der kodierenden Region der Transmembran II Domäne. Insbesondere wurde gefunden, dass die genomische DNA ein Glutamin an Position 587 der Proteinsequenz kodiert, während die cDNA ein Arginin an Position 587 kodierte. Die genomische DNA Sequenz, die für den GluR2B-Rezeptor kodiert, ist in 1 dargestellt, und sie ist von der cDNA Sequenz, die in der EP-A-574257 durch den einzelne Nukleotidaustausch von G nach A an Position 2134 dargestellt ist, verschieden. Der Austausch wird auch in der Proteinsequenz des GluR2B-Rezeptors an Position 587 reflektiert. Der Austausch in der Proteinsequenz ist in 2 zur größeren Klarheit dargestellt.
Um zu bestätigen, dass multiple GluR2-Rezeptor kodierende Gene nicht existieren, d.h. ein Gen, das die nicht-editierte Q-587 Form von GluR2B kodiert und ein anderes Gen, das die R-587 Form von GluR2B kodiert, oder dass multiple Exons, die für diese editierten und nicht-editierten Formen kodieren, nicht existieren, wurde genomische GluR2B DNA der Restriktionsenzymspaltung unterworfen. Insbesondere wurde eine genomische DNA Probe mit einem Restriktionsenzym (BglII) gespalten, von dem bekannt ist, dass es eine Erkennungsstelle in dem Exon enthält, welches das Kodon enthält, das der "Editierung" unterworfen ist, während andere genomische DNA Proben mit Restriktionsenzymen (EcoRI, HindIII und PstI) gespalten wurden, die keine Restriktionsstellen in dem editierten Exon aufweisen. Nach der Enzymspaltung wurde die DNA und ihre Fragmente unter Verwendung von Gelelektrophorese aufgetrennt, und die Fragmente mit dem "editierten" Exon wurden unter Verwendung einer spezifisch für das Exon markierten Sonde identifiziert. Wie erwartet resultierten zwei DNA Fragmente aus der BglII Spaltung. Das Auftreten von drei oder mehr Banden nach einer BglII Enzymspaltung hätte entweder die Anwesenheit von zwei Genen angezeigt, in denen die intronischen Sequenzen verschieden sind, oder von zwei Exons, die beide die BglII Restriktionsstelle aufweisen, aber verschiedene Sequenzen besitzen. Eine einzige Bande resultierte aus jeder der EcoRI, HindIII und PstI DNA Spaltungen. Wiederum hätte das Auftreten von mehr als einer Bande in diesen Fällen entweder die Anwesenheit von zwei Genen oder Exons wie oben beschrieben angezeigt.
Um schließlich zu bestätigen, dass der Sequenzunterschied zwischen der genomischen GluR2B DNA und dem GluR2B-Rezeptor nicht das Ergebnis von zufälliger Mutation war, wurden einige GluR2B genomische und cDNA Klone sequenziert, um die Frequenz des Sequenzaustausches zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Typen von Hirngewebe mit Sonden untersucht, wie oben beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigten klar, dass Mutation nicht der Grund für die Sequenzaustausche war, die zwischen der GluR2B DNA und dem exprimierten GluR2B Protein auftraten. Die "Editierung" von GluR2B trat mit unterschiedlichen Frequenzen in verschiedenen Geweben auf, zum Beispiel war GluR2B des Hippocampus, Cerebellum und temporalen Kortex zu 100% editiert (d.h. enthielt das Arginin an Position 587), während GluR2B der Substantia nigra zu 71% editiert, GluR2B des Korpus striatum zu 89% editiert und GluR2B von fötalem Hirngewebe zu 96% editiert war.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden menschliche EAA3- und EAA4-Rezeptoren der Kainat Familie, die jeweils in der EP 617,123 und EP 578,409 beschrieben sind, bestimmt, um der Editierung unterworfen zu werden. Unter Verwendung ähnlicher Techniken, die verwendet wurden, um die Editierung in dem GluR2B-Rezeptor zu bestimmen, wurde beobachtet, dass menschliche EAA3 und EAA4 genomische DNA Rezeptoren mit verschiedenen Aminosäuresequenzen gegenüber ihrer entsprechenden cDNA kodieren. Insbesondere kodiert EAA3 genomische DNA einen Glutamin (Q) Rest an Position 591 des reifen Rezeptorproteins, während beobachtet wurde, dass cDNA, die von verschiedenen Regionen des Gehirns stammt, Arginin (R) an Position 591 kodiert. Andererseits wurde gefunden, dass die EAA4 genomische DNA an drei Stellen editiert ist; Isoleucin an Position 532 des reifen Proteins ist gegen Valin ausgetauscht, Tyrosin an Position 536 ist gegen Cystein, und Glutamin an Position 586 ist gegen Arginin ausgetauscht. Die genomischen Sequenzen von EAA3 und EAA4 sind jeweils in 5 und 6 dargestellt. Die Austausche in der Proteinsequenz an jeder dieser Stellen sind das Ergebnis einer einzigen Nukleotidsubstitution, Adenosin → Guanosin (A → G), wie in 7 dargestellt ist.
Der Glutamin gegen Arginin (Q/R) Austausch in sowohl EAA3 als auch EAA4 tritt in der Transmembran II (TMII) Region des Rezeptorproteins auf. Die zusätzlichen I/V⁵³² und Y/C⁵³⁶ Editierungsstellen in EAA4 treten in der TMI Region auf, was zusätzliche Komplexität hinzufügt, indem acht Isoformen von gebildetem EAA4 möglich werden. Somit führt RNA Editierung von EAA4 zu einem Mosaik von Rezeptoren, die den Glutamat aktivierten Ca²⁺ Einstrom in das Gehirn regulieren können. Die Frequenz von editierten Kodons wurde in Geweben von verschiedenen Regionen des Gehirns untersucht, und es wurde gefunden, dass sie unterschiedlich repräsentiert sind. Von den acht möglichen Isoformen wurden fünf in verschiedenen Regionen beobachtet; insbesondere I.C.R, V.C.R, I.Y.Q, V.C.Q. und I.Y.R. Wie im Fall von menschlichem GluR2 war die relative Frequenz der editierten/nicht-editierten Kodons, die beobachtet wurde, ebenfalls in einer altersspezifischen Weise differenziell reguliert. EAA4 cDNA Klone, die aus menschlichem fötalen Gehirn (17–18 Wochen Gestation) isoliert wurden, zeigten eine relativ geringe Editierungswirksamkeit. Der Hauptanteil von EAA4 cDNAs, die aus dem Cerebellum eines 2 Jahre alten Mädchens amplifiziert wurden, bestanden aus dem hemi-editierten I.C.R Typ. Diese Variante war auch der vorhenschende Typ, der in Korpus striatum cDNAs gefunden wurde. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass in Individuen desselben Alters verschiedene Editierungszustände in bestimmten neuronalen Populationen vorliegen können. So könnte die I.C.R Form eine Rolle in den Kainat Rezeptor Kanalkomplexen in einem spezifischen neuronalen Gewebe, wie dem Cerebellum oder Korpus striatum spielen, während sie in dem Gehirn als Ganzes selten sind. Vom Hippocampus stammende cDNAs zeigten ein unterscheidbar verschiedenes Expressionsmuster von editierter EAA4, wobei der Hauptteil von untersuchten cDNAs vollständig editierte V.C.R waren. Die Editierung in der Substantia nigra führte zu einem ungefähr gleichen Verhältnis von nicht-editierten I.Y.Q gegenüber vollständig editierter V.C.R cDNA, während im temporalen Kortex keine Editierung beobachtet wurde.
Die Untersuchung von Q/R Editierungsfrequenz in EAA3 zeigte auch eine nicht gleichmäßige Verteilung im menschlichen Gehirn. Wiederum weist fötales Gewebe ein höheres Verhältnis von nicht-editierten Q Formen gegenüber jenen, die für gewöhnlich in adultem Gehirn beobachtet werden, auf. Die cerebellaren und temporal kortikalen Gewebe, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von zwei 2 jährigen Mädchen isoliert und zeigen eine signifikante (p < 0,05) Reduktion von EAA3 Editierung im Cerebellum. Hippocampales Gewebe, das von einem anderen Individuum desselben Alters (Mädchen, 2 Jahre) isoliert wurde, zeigt Editierung in einer ähnlichen Menge gegenüber dem des temporalen Kortex, aber wieder verschieden zu jener des Cerebellum (p < 0,05). Auch für die Substantia nigra (60 Jahre) und das Korpus striatum (57 und 63 Jahre) wurden hohe Editierungswirksamkeiten gefunden.
Nachdem ein ZNS-Rezeptorgen, dass der Editierung unterworfen ist, identifiziert und bestätigt wurde, ist es wünschenswert, durch die Anwendung von genetischen Engineering Techniken Zellen zu konstruieren, die Formen des Rezeptors bilden, auf die im Arzneimittelscreenen abgezielt werden kann, z.B. eine oder mehrere der editierten Formen und/oder der nicht-editierten Form.
Die Konstruktion von solchen engineerten Zellen, einschließlich sowohl prokaryoter als auch eukaryoter Zellen, wird durch Einführen eines rekombinanten DNA Konstrukts in eine Wirtszelle erreicht, in der DNA, die für eine selektierbare Form der Rezeptoren kodiert, d.h. eine Form, die sein natives Signalpeptid oder ein funktionelles, heterologes Äquivalent davon trägt, operativ mit Expressionskontrollelementen verbunden ist, die funktionell im gewählten Wirt sind, um die Expression der Rezeptor kodierten DNA anzutreiben, und damit das gewünschte Rezeptorprotein zu bilden. Solche Zellen sind hier dadurch gekennzeichnet, dass sie die Rezeptor kodierende DNA darin "exprimierbar" enthalten. Die Rezeptor kodierende DNA wird als "heterolog" bezüglich des bestimmten zellulären Wirts bezeichnet, wenn eine solche DNA nicht natürlich in dem bestimmten Wirt vorkommt. Die "nicht-editierte" Rezeptor kodierende DNA kann in ihrer Natur entweder genomisch oder alternativ von der Proteinsequenz abgeleitet sein, d.h. cDNA. Andererseits kann die "editierte" Rezeptor kodierende DNA nur in einer cDNA Form verwendet werden, weil sie nicht in genomischer Form existiert.
Der bestimmte Zelltyp, der ausgewählt ist, um als Wirt für die Herstellung eines menschlichen Rezeptors zu dienen, kann irgendeiner von verschiedenen Zelltypen sein, die gegenwärtig im Stand der Technik zur Verfügung stehen. Es ist jedoch wichtig, dass der Zelltyp, der für die Herstellung von Rezeptor ausgewählt wird, der in Liganden Screening Assays verwendet werden soll, keine Editierung der zu exprimierenden Rezeptor kodierenden DNA verursacht. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelllinie, die ausgewählt ist, um als Wirt für die Herstellung eines ZNS-Rezeptors zu dienen, eine Säugetierzelle, die von einer menschlichen neuronalen Zelle verschieden ist. Verschiedene Typen von solchen Zelllinien sind gegenwärtig für genetische Engineering Arbeiten erhältlich, und diese schließen die chinesischen Hamsterovar (CHO) Zellen zum Beispiel der K1 Linie (ATCC CCL 61) einschließlich der Pro5 Variante (ATCC CRL 1281); die Fibroblasten ähnlichen Zellen, die von Nieren von SV40 transformierten afrikanischen grünen Affen der CV-1 Linie abgeleitet sind (ATCC CCL 70), der COS-1 Linie (ATCC CRL 1650) und von der COS-7 Linie (ATCC CRL 1651) abgeleitet sind; Maus L Zellen, Maus 3T3 Zellen (ATCC CRL 1658), Maus C127 Zellen, menschliche embryonale Nierenzellen der 293 Linie (ATCC CRL 1573), menschliche Karzinomzellen, einschließlich jener der HeLa Linie (ATCC CCL 2), ein.
Eine Vielzahl von Genexpressionssystemen wurde für die Verwendung mit diesen Wirten angepasst und sind jetzt kommerziell erhältlich. Irgendeines dieser Systeme kann ausgewählt werden, um die Expression der menschlichen ZNS-Rezeptor kodierenden DNA anzutreiben. Diese Systeme, die typischerweise in der Form von plasmidischen Vektoren erhältlich sind, schließen Expressionskassetten ein, deren funktionelle Bestandteile DNA konstituierende Expressionskontrollsequenzen einschließen, die vom Wirt erkannt werden und die Rezeptor kodierte DNA Expression erlauben, wenn sie 5' davon verknüpft sind. Die Systeme schließen weiterhin DNA Sequenzen ein, welche die Expression beenden, wenn sie 3' der Rezeptor kodierenden Region verknüpft sind. So wird für die Expression in einem ausgewählten Säugetierzellwirt ein rekombinantes DNA Expressionskonstrukt gebildet, in dem DNA, die für den Rezeptor in sekretierbarer Form kodiert, mit Expressionskontroll DNA Sequenzen verknüpft ist, die vom Wirt erkannt werden, und das eine Region 5' der Rezeptor kodierenden DNA einschließt, um die Expression voranzutreiben, und eine 3' Region, um die Expression zu beenden. Der plasmidische Vektor, der das rekombinante DNA Expressionskonstrukt trägt, enthält typischerweise solche anderen funktionellen Bestandteile wie einen Replikationsursprung, der für gewöhnlich von einem Virus stammt, um Replikation des Plasmids in dem Expressionswirt zu erlauben und wünschenswerterweise auch zur Plasmidamplifikation in einem bakteriellen Wirt, wie E. coli. Um einen Marker bereitzustellen, der die Selektion von stabil transformierten rekombinanten Zellen erlaubt, wird der Vektor auch ein Gen einschließen, das den Transformanten einen Überlebensvorteil verschafft, wie ein Gen, das für Neomycin Resistenz kodiert, in dessen Fall die Transformanten in Medium ausplattiert werden, das mit Neomycin ergänzt ist.
Eingeschlossen in die verschiedenen rekombinanten DNA Expressionssysteme, die verwendet werden können, um Säugetierzellexpression der Rezeptor kodierenden DNA zu erreichen, sind jene, die Promotoren von Viren ausnutzen, die Säugetierzellen infizieren, wie der Promotor des Cytomegalovirus (CMV), das Rous Sarkomvirus (RSV), Simianvirus (SV40), Mausmammatumorvirus (MMTV) und andere. Ebenfalls nützlich, um die Expression voranzutreiben, sind Promotoren wie der LTR von Retroviren, Insektenzellpromotoren, wie solche die durch Temperatur reguliert und von Drosophila isoliert werden, ebenso wie Säugergenpromotoren, wie jene die durch Schwermetalle reguliert werden, d.h. der Metallothioneingen Promotor und andere Steroid induzierbare Promotoren.
Die Rezeptor kodierende DNA wird zur Expression in irgendeinen geeigneten Expressionsvektor eingeführt, und Wirtszellen werden damit unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie DNA vermittelte Transformation, Elektroporation oder Partikelschusstransformation, transfiziert. In dieser Hinsicht wird verstanden, dass die Rezeptor kodierende DNA gegen ein synonymes Kodonäquivalent der isolierten genomischen Sequenz ausgetauscht sein kann. Expressionsvektoren können ausgewählt werden, um transformierte Zelllinien bereitzustellen, welche die Rezeptor kodierende DNA entweder transient oder in einer stabilen Weise exprimieren. Für transiente Expression werden Wirtszellen typischerweise mit einem Expressionsvektor transformiert, der einen Replikationsursprung trägt, der in einer Säugerzelle funktionell ist. Für stabile Expression sind solche Replikationsursprungspunkte nicht notwendig, aber die Vektoren werden typischerweise ein Gen tragen, das für ein Produkt kodiert, das den Transformanten einen Überlebensvorteil verleiht, um ihre Selektion zu erlauben. Gene, die für solche selektierbaren Marker kodieren, schließen das E. coli gpt Gen ein, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht, das neo Gen, von Transposon Tn5, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 und gegenüber Neomycin verleiht, die dhfr Sequenz aus Mauszellen oder E. coli, die den Phänotyp von DHFR– Zellen in DHFR+ Zellen verändert, und das tk Gen von Herpes simplex Virus, das TK– Zellen phänotypisch zu TK+ Zellen macht. Sowohl transiente Expression als auch stabile Expression kann transformierte Zelllinien und Membranpräparationen, die davon abgeleitet sind, zur Verwendung in Liganden Screening Assays bereitstellen.
Zur Verwendung in Liganden Screening Assays können Zellen, die transient die Rezeptor kodierende DNA exprimieren, gefroren zur späteren Verwendung gelagert werden, aber weil die schnelle Rate der Plasmidreplikation schließlich zu Zelltod führen wird, für gewöhnlich in einigen Tagen, sollten die Zellen sobald als möglich verwendet werden. Solche Assays können entweder mit intakten Zellen oder mit Membranpräparationen, die von solchen Zellen stammen, durchgeführt werden. Die Membranpräparationen stellen typischerweise ein geeigneteres Substrat für die Liganden Bindungsexperimente bereit und sind deshalb als Bindungssubstrate bevorzugt. Um Membranpräparationen für Screeningzwecke, d.h. Liganden Bindungsexperimente, herzustellen, werden gefrorene intakte Zellen homogenisiert, während sie sich in einer Kaltwassersuspension befinden, und ein Membranpellet wird nach Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wird anschließend in kaltem Wasser gewaschen und dialysiert, um endogene Liganden zu entfernen, wie Glutamat im Fall von EAA-Rezeptoren, die sonst um Bindung in den Assays konkurrieren würden. Die dialysierten Membranen können dann als solches oder nach der Lagerung in lyophilisierter Form in den Liganden Bindungsassays verwendet werden. Alternativ dazu können intakte frische Zellen, die ungefähr zwei Tage nach transienter Transfektion geerntet werden oder nach ungefähr demselben Zeitraum nach dem frischen Ausplattieren von stabil transfizierten Zellen, für Liganden Bindungsassays mit denselben Verfahren wie für Membranpräparationen verwendet werden. Wenn Zellen verwendet werden, müssen die Zellen durch sanftere Zentrifugation geerntet werden, um sie nicht zu beschädigen, und alle Waschschritte müssen in einem gepufferten Medium, zum Beispiel in Phosphat gepufferter Salzlösung durchgeführt werden, um osmotischen Schock und Zerreißen der Zellen zu vermeiden.
Die Bindungswechselwirkung zwischen einem Ligandenkandidaten und einem menschlichen ZNS-Rezeptor wird typischerweise unter Verwendung einer vorbestimmten Menge von zellabgeleiteter Membran bewertet (gemessen zum Beispiel durch Proteinbestimmung), im Allgemeinen von ungefähr 25 μg bis 100 μg. Im Allgemeinen werden kompetitive Bindungsassays nützlich sein, um die Affinität eines Ligandenkandidaten relativ zu einem endogenen Liganden, wie Glutamat, Serotonin oder Dopamin, abhängig von dem Typ des verwendeten Rezeptors, zu bestimmen. Dieser kompetitive Bindungsassay kann durchgeführt werden durch Inkubieren der Membranpräparation mit radioaktiv markiertem endogenen Ligand in der Anwesenheit von nicht-markiertem Ligandenkandiat, der bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wird. Nach der Inkubation kann entweder verdrängter gebundener radioaktiv markierter Ligand gewonnen und gemessen werden, um die relative Bindungsaffinität des Ligandenkandidaten und des exogenen Liganden für den bestimmten Rezeptor, der als Substrat verwendet wurde, zu bestimmen. Auf diese Weise können die Affinitäten von verschiedenen Ligandenkandidaten für die erfindungsgemäßen menschlichen ZNS-Rezeptoren gemessen werden.
Als eine Alternative zur Verwendung von Zellen, die Rezeptor kodierende DNA exprimieren, kann auch die Ligand/Rezeptor Wechselwirkung elektrophysiologisch bestimmt werden, z.B. unter Verwendung von Zellen von zum Beispiel Xenopus Oozyten, die funktionellen membrangebundenen Rezeptor nach Einführung durch Injektion entweder von Rezeptor kodierender Messenger RNA in das Oozyten Zytoplasma oder von Rezeptor kodierender DNA in den Oozyten Kern liefern. Um die Messenger RNA zum zytoplasmatischen Transport herzustellen wird die Rezeptor kodierte DNA typischerweise zunächst in einen plasmidischen Vektor benachbart zu einer geeigneten Promotorregion, wie den T3 oder T7 Bakteriophagen Promotoren subkloniert, um Transkription in RNA Message zu erlauben. Die RNA wird anschließend von dem eingebauten Gen in vitro transkribiert, gesammelt und anschließend in Xenopus Oozyten injiziert. Nach der Injektion von nl Volumina einer RNA Lösung werden die Oozyten stehen gelassen, um für bis zu einige Tage zu inkubieren, und werden einschließlich der Fähigkeit, auf einen Ligandenkandidaten zu antworten, der in einer Waschlösung ergänzt ist, getestet. In Fall von EAA-Rezeptoren, die teilweise dadurch wirken, dass sie einen Membrankanal, durch den Kationen selektiv hindurchtreten können, betreiben, kann das Funktionieren des Rezeptors als Antwort auf einen bestimmten Ligandenkandidaten in der Waschlösung typischerweise als ein elektrischer Strom unter Verwendung von Mikroelektroden gemessen werden, die in eine Zelle in einer etablierten Weise eingeführt werden.
Nachdem die editierten und nicht-editierten Formen eines Rezeptors exprimiert wurden, ist es wünschenswert, die editierte Form des Rezeptors von seinem nicht-editierten Gegenstück zu unterscheiden. Es wird verstanden, dass gewisse neurodegenerative Erkrankungszustände mit einem dysfunktionellen Editierungsmechanismus assoziiert sein können. Die funktionellen Unterschiede zwischen den editierten und nicht-editierten Formen eines Rezeptors sind deshalb wertvoll in Screening Verbindungen für potenzielle therapeutische Verwendung, z.B. um Überaktivität einer bestimmten Funktion, wie Kanalaktivität, zu vermeiden, oder um eine verzögerte Rezeptorfunktion zu verstärken. In dieser Hinsicht ist eine Verbindung, die selektiv entweder für die editierte oder nicht-editierte Form des Rezeptors ist, wünschenswert.
Die editierten und nicht-editierten Rezeptorformen können hinsichtlich von Liganden Bindungseigenschaften, wie oben beschrieben, unterschieden werden, d.h. bei einem Liganden, der an eine Form bindet, kann gefunden werden, dass er wenig oder keine Affinität für die andere Form aufweist. So schließt ein Verfahren zur Bestimmung von Selektivität der editierten und nicht-editierten Formen des Rezeptors das Durchführen von vergleichenden Bindungsassays ein. Insbesondere wird eine Zelle, welche die editierte Form des Rezeptors kodiert, mit einer Testverbindung unter geeigneten Bedingungen in der Anwesenheit eines endogenen Liganden inkubiert, und die Linganden Bindungsaffinität dieser Verbindung für diese Form des Rezeptors wird relativ zu dem endogenen Liganden bestimmt. Diese Affinität wird mit der Liganden Bindungsaffinität der Verbindung für die nicht-editierte Form des Rezeptors, die auf dieselbe Weise bestimmt wird, verglichen. Selbstverständlich sollten die Wirkungen von Rezeptorfunktion auf differenzielle Liganden Bindungseigenschaften in dem Fall berücksichtigt werden, indem eine Verbindung eine starke Affinität für eine Rezeptorform zeigt, während sie eine relativ schwache Affinität für die andere Rezeptorform zeigt.
Alternativ dazu können die editierten und nicht-editierten Formen eines Rezeptors auf der Basis von elektrophysiologischer Funktion unterschieden werden, insbesondere wenn EAA-Rezeptoren betroffen sind. Die elektrophysiologische Funktion wird bestimmt durch Messen des Liganden induzierten elektrischen Stroms über eine Rezeptor kodierende Zelle oder eine Membranpräparation davon, unter Verwendung eines Kanalaktivitätsassays, wie jener, der beschrieben ist von Verdoorn et al., in Mol. Pharmacol., 1988, 34: 298. In Kürze wird die Zell- oder Membranpräparation in der Anwesenheit eines endogenen Liganden zum Beispiel Glutamat inkubiert, und der resultierende elektrische Strom wird gemessen. Es wird verstanden, dass der Ligand ist, der bevorzugt von dem Rezeptor gebunden wird, der am meisten geeignete Ligand, mit dem diese funktionellen Studien durchgeführt werden, z.B. Kainat ist der am meisten geeignete Ligand für Rezeptoren, die vorzugsweise Kainat binden, während AMPA der am meisten geeignete Kandidat für Rezeptoren ist, die vorzugsweise AMPA binden. Unterschiede in der elektrophysiologischen Funktion der editierten und nicht-editierten Formen des Rezeptors können anschließend bestimmt werden. Wie oben angemerkt, kann auch die Wirkung von differenziellen Bindungstestverbindungen auf elektrophysiologische Funktion bestimmt werden.
Unter Bezugnahme auf die oben diskutierte GluR2B-Rezeptoranalyse können die funktionellen Unterschiede zwischen den nicht-editierten und editierten Formen des Rezeptors wie oben beschrieben bestimmt werden. Der Ligand, der verwendet wird, um Stromfluss in den GluR2B-Rezeptor zu induzieren, ist vorzugsweise AMPA. In der Anwesenheit von AMPA zeigt die nicht-editierte Form des Rezeptors einen elektrischen Strom weil sie einen Liganden vermittelten Ionenkanal bildet, der für divalente Kationen und bemerkenswerterweise für Calcium permeabel ist, während die editierte Form des Rezeptors keinen Strom zeigt, weil sie keinen Ionenkanal bildet, der für divalente Kationen permeabel ist.
Ein Verfahren zur Verwendung von Sonden schließt das Bereitstellen von DNA Oligonukleotidsonden ein, welche die Identifizierung von genomischer DNA, welche die nicht-editierte Form eines Proteins kodiert, erleichtert, und um die cDNA Version von editierter mRNA von der cDNA Version von nicht-editierter mRNA zu unterscheiden. Die Sonden, die mindestens ungefähr 17 Nukleotide umfassen, werden der nicht-editierten Region in der "nicht-editierten" genomischen DNA oder der editierten Re gion in der cDNA Version der "editierten" mRNA Sequenz entsprechen. Wie vorgesehen ist, existiert eine Vielzahl von Verfahren zum Verwenden von Sonden, um erfolgreich die Ziel DNA Sequenz zu identifizieren. In einem Verfahren wird zum Beispiel die Sonde als eine Hybridisierungssonde in der herkömmlichen Weise verwendet. So wird isolierte immobilisierte DNA mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen kombiniert, und die Sonde hybridisiert an DNA mit einer entsprechenden Sequenz. Im Allgemeinen, um DNA/Sondenhybridisierung zu identifizieren, ist die Sonde markiert, z.B. durch Konjugation an ein Reportermolekül, wie eine radioaktive Markierung, eine enzymatische Markierung, eine lumineszente Markierung oder ähnliches, unter Verwendung von Linkertechnologie, die für diesen Zweck etabliert wurde, oder die Sonde schließt in ihre Struktur eine Markierung, wie ein Radioisotop eines Moleküls, z.B. ³H und ¹³C ein. Um zwischen den editierten und nicht-editierten cDNA Formen zu unterscheiden, müssen hochstringente Bedingungen und für gewöhnlich Sonden, die Sequenzkomplemente der Zielregion sind, aufgrund der hochhomologen Natur von zwei Rezeptorformen verwendet werden.
Ein anderes Verfahren zur Verwendung von Sonden ist das gut bekannte PCR Amplifikationsverfahren. In diesem Verfahren wird eine Sonde hergestellt, die ein "nicht-editiertes" Kodon an seinem 3' terminalen Ende einschließt. Die Sonde wird unter PCR Bedingungen mit einer genomischen Nukleinsäuremischung inkubiert, und wenn eine Sequenz komplementär zu der Sonde anwesend ist, wird diese Sequenz amplifiziert. Wenn jedoch nur eine Sequenz, welche die "nicht-editierte" Version kodiert, anwesend ist, werden die fehlgepaarten Kodonsequenzen verhindern, dass PCR Amplifikation stattfindet.
In anderen ihrer Aspekte stellt die Erfindung in vitro Verfahren zur Identifizierung von Agenzien bereit, welche die Editierung von menschlichen EAA3- oder EAA4 Rezeptoren in vivo modulieren, umfassend:

a) Erhalten einer menschlichen neuronalen Zelllinie, die (1) für die nicht-editierte Form von menschlichem, der Editierung unterworfenem EEA3- oder EAA4 Rezeptor kodierende DNA enthält, und die (2) bei Kultivierung die editierte Form des Rezeptors bildet,
b) Kultivieren der Zelllinie in der Gegenwart eines Kandidatenmodulators der Editierung, und
c) Bestimmen der Wirkung des Modulators auf die Bildung der editierten Form des Rezeptors.

Besonders geeignet als Wirtszellen für die Herstellung von solchen Zelllinien sind die menschlichen neuronalen Zelllinien, die als IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) und SK-N-SH (ATCC HTB 11) bezeichnet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der gewählte Wirt transformiert, um darin exprimierbar ein Polynukleotid zu enthalten, das die nicht-editierte Form des menschlichen EAA3- oder menschlichen EAA4-Rezeptors kodiert. Die Bestätigung, dass die Transformanten die editierte Form des kodierten Rezeptors nach Kultivierung exprimieren, kann erhalten werden durch Herstellen einer cDNA Bibliothek aus Messenger, die von Zellen gewonnen wird, die unter den Bedingungen kultiviert werden, die in dem Assay verwendet werden, wobei sich Editierung durch geeignete Sequenzveränderungen in der cDNA, die das gewählte Rezeptorziel kodiert, zeigt. Wenn die Editierungsaktivität in dem hergestellten Wirt bestätigt ist, kann der Assay anschließend einfach fortgesetzt werden, indem der Wirt in der Anwesenheit eines gewählten Modulators von Editierungsaktivität inkubiert wird, und der anschließenden nochmaligen Konstruktion einer cDNA Bibliothek von den RNA Transkripten, die während der Kultivierung gebildet wurden. Veränderungen in der cDNA Sequenz an der vorhergesagten Editierungsstelle zeigt entsprechend eine Wirkung des gewählten Modulators auf den ZNS-Rezeptoreditierungsvorgang.
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden spezifischen Beispielen beschrieben, die nicht als einschränkend verstanden werden sollen. Solche Beispiele, die sich auf Experimente beziehen, die GluR2B, GluR2B-Rezeptoren, GluR4, GluR4-Rezeptoren, EAA5 und EAA5-Rezeptoren betreffen, sind nur für beispielhafte Zwecke eingeschlossen und fallen nicht innerhalb des Schutzumfangs der Patentansprüche.
Beispiel 1 – Isolierung von genomisch und cDNA kodiertem GluR2B
Die folgenden PCR Primer wurden verwendet, um sowohl genomische als auch cDNA Sequenzen von GluR2B zu amplifizieren:
Diese Primer waren von den kodierenden Regionen der cDNA Sequenz von GluR2B abgeleitet und sind in 3 gezeigt. Die PCR-1 und PCR-2 Primer, die jeweils eine Region der DNA 5' der Transmembran Domäne I (TMI) und eine Region 3' der Transmembran Domäne II (TMII) kodieren, von denen beide in einem einzigen Exon liegen, wurden verwendet, um GluR2B genomische DNA (erhalten von Clontech) zu amplifizieren. Der PCR-2 Primer, kombiniert mit dem PCR-3 Primer, der eine Region in einem benachbarten Kodon kodiert, wurden verwendet, um GluR2B cDNA (menschliche ZAP cDNA Bibliotheken, erhalten von Stratagene) zu amplifizieren. Die Tatsache, dass der PCR-3 Primer einer Region in einem benachbarten Exon entspricht, stellt sicher, dass nur cDNA's untersucht wurden und keine kontaminierenden Fragmente von genomischer DNA (die sehr viel größer in der Größe aufgrund der Anwesenheit von Intron DNA zwischen den zwei Exons wäre).
Die DNA Amplifikationsreaktionsmischungen für sowohl genomische als auch cDNAs enthielten: 100–500 ng DNA, 30 pmol jedes Primers, 5 Einheiten Taq Polymerase (erhalten von Promega), 0,2 mM jedes dNTP (in 10 mM KCl, 10 mM Ammoniumsulfat, 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 2 mM Magnesiumsulfat, 0,1% Triton). Die Bedingungen für die ersten 35 Amplifikationszyklen waren wie folgt: 94°C für 30 Sekunden, 55–61°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten. Dies wurde gefolgt von einer 10 Minuten Inkubation bei 72°C.
Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von Gelelektrophorese getrennt, und die gewünschten DNA Fragmente, d.h. ein 294 bp Fragment von der genomischen DNA und ein 326 bp Fragment von der cDNA, wurden aus dem Gel gereinigt und in Plasmid pT7blue (erhalten von Novagen) zum Screenen und Sequenzieren subkloniert.
Ein Vergleich der genomischen und cDNA Sequenzen identifizierte einen einzelnen Nukleotidunterschied in der kodierenden Region der Transmembran II Domäne an Position 2134. Insbesondere enthielt die genomische DNA ein G wodurch ein Glutamin kodiert wurde, während die cDNA ein A enthielt, wodurch ein Arginin kodiert wurde.
Beispiel 2 – Frequenz von RNA Editierung von GluR2B
Die Editierungsfrequenz wurde unter Verwendung der Plasmid DNA, die gemäß Beispiel 1 isoliert wurde, bestimmt. Zu Beginn wurde die Anwesenheit des GluR2 Inserts (entweder genomisch oder cDNA) durch Spaltung mit BglII bestätigt. Die Linearisierung der Plasmid DNA zeigt die Anwesenheit des GluR2 Inserts. Die linarisierten Plasmide wurden anschließend hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von Editierung getestet. Dies wurde durch BbvI Spaltung bestimmt, dessen Erkennungssequenz in der nicht-editierten Sequenz anwesend ist. So liefert die Spaltung von nicht-editierter DNA mit BbvI zwei Fragmente, während die Spaltung der editierten DNA mit BbvI ein einziges Fragment liefert. Die Frequenzen von editiertem vs. nicht-editiertem GluR2B waren wie folgt:
Beispiel 3 – Bestätigung von RNA Editierung des GluR2B Gens
Zunächst wurde eine Southern Blot Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, ob zwei verschiedene GluR2B Gene existieren. Aliquots von menschlicher genomischer DNA (8 μg) wurden zunächst einzeln mit EcoRI, HindIII, PstI und BglII Restriktionsenzymen (erhalten von New England Biolabs) gespalten. Die gespaltene DNA wurde anschließend auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und UV kreuzvernetzt. Die immobilisierte DNA wurde mit einer gereinigten TMI/TMII Exonsonde (d.h. das PCR-1/PCR-2 Amplifikationsprodukt aus Beispiel 1) hybridisiert und radioaktiv mit [α³²P]dCTP unter Verwendung des Random Priming Verfahrens (Amersham) markiert. Die Hybridisierung wurde in 6 × SSC (Salznatriumcitrat), 50% Formamid, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml sonifizierter Lachssperma DNA, bei 42°C für 16 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden mit steigenden Stringenzen bis zu 0,5 × SSC/0,5% SDS, bei 60°C für 20 Minuten, vor der Exposition gegenüber Röntgenfilm bei –80°C für 48 Stunden gewaschen. Die EcoRI, HindIII und PstI Spaltungen lieferten einzelne Banden nach Hybridisierung mit der TMI/TMII Sonde. Dieses Ergebnis zeigte die Existenz von einem einzigen GluR2B Gen, von dem bekannt war, dass es keine Erkennungsstellen in der TMI/TMII Region für die EcoRI, HindIII und PstI Enzyme besitzt.
Es war anschließend notwendig, zu bestimmen, ob multiple Exons in die Expression der zwei Formen des GluR2B Rezeptors involviert sind. Dies wurde erreicht durch Spalten der genomischen DNA mit dem BglII Restriktionsenzym. Das TMI/TMII Exon schließt eine BglII Erkennungsstelle ein. So würde ein einzelnes Exon zwei Banden liefern, wohingegen multiple miteinander in Beziehung stehende Exons 3 oder mehr Banden liefern würden. Es wurden nur 2 Banden von 5,5 kb und 2,2 kb beobachtet, was bestätigt, dass die verschiedenen Formen von GluR2B nicht ein Ergebnis von multiplexen Exons sind. Die Ergebnisse der Analyse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 4 – Expression von nicht-editiertem GluR2B-Rezeptor
Für die transiente Expression in Säugerzellen wird genomische und cDNA, die für den menschlichen GluR2B Rezeptor kodiert, in einen Säugerexpressionvektor pcDNA1 eingeführt, der kommerziell erhältlich ist von Invitrogen Corporation (San Diego, Kalifornien, USA; Katalognummer V490-20). Dies ist ein multifunktioneller 4,2 kb Plasmidvektor, der für DNA Expression in eukaryoten Systemen designed wurde.
Eingeführt in den Vektor sind der CMV Promotor und Enhancer, Splicesegment und Polyadenylierungssignal, ein SV40 und Polyomavirus Replikationsursprung und der M13 Ursprung, um einzelsträngige DNA für Sequenzierung und Mutagenese zu erhalten, Sp6 und T7 RNA Promotoren für die Herstellung von sense und antisene RNA Transkripten und ein Col E1-ähnlicher Vielfachkopien Plasmidursprung. Ein Polylinker ist entsprechend unterhalb des CMV Promotors (und des 3' des T7 Promotors) angeordnet.
Um das Einführen von GluR2B-Rezeptor kodierender cDNA in einen Expressionsvektor zu erleichtern, wird eine NotI Stelle in die 5' Flanke des Bluescript-SK cDNA Inserts eingeführt, und das DNA Insert wird anschließend als ein 3,4 kb HindIII/NotI Fragment freigesetzt, das anschließend in die HindIII/NotI Stellen in dem pcDNAI Polylinker eingeführt wird. Eine Sequenzierung über die Übergänge wird durchgeführt, um die richtige Insertorientierung in pcDNA1 zu bestätigen. Das resultierende Plasmid wird anschließend für transiente Expression in einen gewählten Säugerzellwirt eingeführt, in diesem Fall Zellen der COS-1 Linie (erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter ATCC CRL 1650). Die Zellen werden mit ungefähr 7 μg DNA pro 10⁶ COS Zellen durch DEAE-vermittelte DNA Transfektion transfiziert und mit Chlorochin gemäß dem Verfahren, das bei Maniatis et al., supra beschrieben ist, behandelt. In Kürze wurden COS-1 Zellen in einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/Schale ausplattiert und anschließend für 24 Stunden in PBS-ergänztem DMEM/F12 Medium angezogen. Das Medium wird anschließend entfernt, und die Zellen werden in PBS und anschließend in Medium gewaschen. Anschließend wird auf die Zellen 10 ml einer Transfektionslösung enthaltend DEAE Dextran (0,4 mg/ml), 100 μM Chlorochin, 10% NuSerum, DNA (0,4 mg/ml) in DMEM/F12 Medium aufgebracht. Nach Inkubation für 3 Stunden bei 37°C werden die Zellen in PBS und Medium, wie gerade beschrieben, gewaschen, und sie werden anschließend für 1 Minute mit 10% DMSO in DMEM/F12 Medium geschockt. Die Zellen werden für 2–3 Tage in 10% FBS-ergänztem Medium angezogen, und am Ende der Inkubation werden die Schalen auf Eis gestellt, mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend durch Abschaben entfernt. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 10 Minuten geerntet, und das zelluläre Pellet wird in flüssigem Stickstoff für die anschließende Verwendung in Liganden Bindungsassays eingefroren.
In einer ähnlichen Weise können auch stabil transfizierte Zelllinien unter Verwendung zweier verschiedener Zelltypen als Wirt hergestellt werden: CHO K1 und CHO Pro5. Um diese Zelllinien herzustellen, wird die DNA in den Säugerexpressionsvektor pRC/CMV (Invitrogen) eingeführt, der stabile Expression erlaubt. Die cDNA wird derart inseriert, dass sie unter die Expressionskontrolle des Cytomegalovirus Promotors und oberhalb der Polyadenylierungsstelle und des Terminators des Rinderwachstumshormongens und in einen Vektorhintergrund umfassend das Neomcyin Resistenzgen (angetrieben durch den SV40 frühen Promotor) als selektierbaren Marker gelangt.
Um Plasmide einzuführen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden die Wirts CHO Zellen zuerst in einer Dichte von 5 × 10⁵ in 10% FBS-ergänztem MEM Medium ausgesät. Nach Wachstum für 24 Stunden wird frisches Medium zu den Schalen hinzugefügt, und drei Stunden später werden die Zellen unter Verwendung des Calciumphosphat-DNA Copräzipitationsverfahrens (Maniatis et al., supra) transfiziert. In Kürze werden 3 μg DNA gemischt und mit gepufferter Calciumlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein gleiches Volumen an gepufferter Phosphatlösung wird hinzugefügt, und die Suspension wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wird die inkubierte Suspension auf die Zellen für 4 Stunden aufgebracht, entfernt, und die Zellen werden mit Medium enthaltend 15% Glycerol geschockt. Drei Minuten später werden die Zellen mit Medium gewaschen und für 24 Stunden unter normalen Wachstumsbedingungen inkubiert. Zellen, die resistent gegenüber Neomycin sind, werden in 10% FBS-ergänztem Alpha-MEM Medium mit G418 (1 mg/ml) selektiert. Einzelne Kolonien von G418 resistenten Zellen werden ungefähr 2–3 Wochen später isoliert, klonal selektiert und anschließend für Assayzwecke propagiert.
Beispiel 5 – Liganden Bindungsassay
Transfizierte Zellen im gefrorenen Zustand werden in eiskaltem destilliertem Wasser unter Verwendung eines Handhomogenisators resuspendiert, für 5 Sekunden sonifiziert und anschließend für 20 Minuten bei 50.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Membranpellet wird gefroren bei –70°C gelagert.
COS Zellmembranpellets werden in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (pH 7,55, 5°C) suspendiert und wiederum bei 50.000 g für 10 Minuten zentrifugiert, um endogenes Glutamat zu entfernen, das hinsichtlich der Bindung kompetitieren würde. Die Pellets werden in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (pH 7,55) Puffer resuspendiert, und die resultierende Membranpräparation wird als eine Gewebequelle für die unten beschriebenen Bindungsexperimente verwendet.
Die Bindungsassays werden unter Verwendung einer Menge an COS-abgeleitetem Membranäquivalent von 25–100 μg durchgeführt, wie durch Proteinbestimmung und einem gewählten radioaktiv markierten Ligand bewertet. Insbesondere bestanden für AMPA Bindungssassays die Inkubationsmischungen aus 25–100 μg Gewebeprotein und D,L-Alpha-[5-methyl-³H]amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-proprionsäure (³H-AMPA, 27,6 Ci/mmol, 10 nM Endkonzentration) mit 0,1 M KSCN und 2,5 mM CaCl₂ in 1 ml Endvolumen. Unspezifische Bindung wird in der Anwesenheit von 1 mM L-Glutamat bestimmt. Die Proben werden auf Eis für 60 Minuten in Plastikminiröhrchen inkubiert, und gebundener und freier Ligand werden durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 50.000 g getrennt. Die Pellets wurden zweimal in 4 ml des kalten Inkubationspuffers gewaschen, anschließend wird 5 ml Beckman Ready-Protein Plus Szintillationscocktail zum Zählen hinzugefügt.
Beispiel 6 – Isolierung von genomisch und cDNA kodiertem GluR4
Das Verfahren, das ähnlich ist zu jenem, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde für einen anderen menschlichen ZNS-Rezeptor, nämlich dem GluR4-Rezeptor durchgeführt, der in der gleichzeitig anhängigen US Anmeldung Serial Nr. 07/924,553 beschrieben ist. PCR-Primer für dieselben Regionen wie jene, die für GluR2B verwendet wurden, wurden hergestellt und verwendet, um GluR4 genomische DNA (erhalten von Clontech) und cDNA (in menschlichen ZAP cDNA Bibliotheken erhalten von Strategene) zu amplifizieren.
Die isolierte GluR4 genomische DNA und cDNA wurden hinsichtlich Sequenzunterschieden verglichen, und es wurden keine gefunden, die anzeigen, dass Editierung nicht in dem GluR4 menschlichen ZNS-Rezeptor auftritt.
Beispiel 7 – Isolierung von genomisch und cDNA kodiertem EAA und EAA4
Die folgenden PCR Primer wurden verwendet, um sowohl genomische als auch cDNA Sequenzen von EAA3 zu amplifizieren:
Amplifikation – Unter Verwendung der Maus genomischen Struktur und den menschlichen cDNA Sequenzen wurden die obigen Primer designed, um sowohl genomische als auch cDNA Sequenzen von EAA3 und EAA4 zu amplifizieren. Die Kombinationen PCR5-3/PCR5-26 und PCR6-1/PCR6-3 wurden verwendet um jeweils EAA3, EAA4 und EAA5 cDNAs zu ampflizieren. Diese Primer stammen von getrennten Exons, wodurch sie sicherstellen, dass nur cDNAs untersucht werden und keine potenzielle genomische DNA Kontamination in den cDNA Bibliotheken. Genomische DNAs wurden unter Verwendung der Primerkombinationen 5-2/5-26 und 5int-3/5int-1 (EAA); und PCR6-1/PCR6-2 und 6int-3/6-int-1 (EAA4) untersucht. Menschliche cDNAs wurden aus den Bakteriophagen Lambda (λZAP) Bibliotheken von menschlichem Cerebellum (Mädchen, 2 Jahre), Hippocampus (Mädchen, 2 Jahre), temporaler Kortex (Mädchen, 2 Jahre), Substantia nigra (Mann und Frau, 60 Jahre), Korpus striatum (Caudate und Putamen, Männer, 57 Jahre) und fötales Gehirn (weiblich 17–18 Wochen Gestation) cDNAs (Strategene Cloning Systems Inc., La Jolla, CA USA.; jeweils Kat. # 935201, 936205, 935205, 936210, 936213 und 936206) isoliert. DNA von diesen Bibliotheken wurden isoliert, indem im Wesentlichen dem Qiagen Inc. (Chatsworth, CA USA) Phagen DNA Herstellungsprotokoll gefolgt wurde.
Menschliche genomische DNA wurde von Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, CA USA) erhalten. Die Primerkombinationen wurden verwendet, um EAA3 und EAA4 unter Verwendung von entweder genomischer oder cDNA als einer Matrize, wie zuvor beschrieben, zu amplifizieren. Die PCR Produkte der richtigen Größen [PCR5-2/PCR-26 (142 bp), PCR5-3/PCR5-26 (315 bp), 5int-3/5int-1 (138 bp), PCR6-1/PCR6-3 (474 bp), PCR6-1/PCR6-2 (221 bp) und 6int-3/6int-1 (127 bp)] wurden aus einem Agarosegel gereinigt und in pT7blue (Novagen Inc., Madison, WI USA) zum Screenen und DNA Sequenzieren subkloniert.
Southern Blot Analyse – 8 μg menschlicher genomischer DNA, die mit einzelnen Restriktionsenzymen (HindIII, PstI, BamHI und EcoRV) gespalten wurden, wurden auf einem 0,7% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, anschließend auf eine Nylonmembran (Schleicher und Schuell Inc., Keene NH USA) transferiert. Die DNA wurde auf der Membran unter Verwendung von UV strahlungskovalentem Kreuzvernetzen immobilisiert. Gereinigte PCR6-1/PCR6-2 (EAA4, TMI), 6int-3/6int-1 (EAA4, TMII) und 5int-3-/5int-1 (EAA3, TMII) PCR Amplifikationsprodukte wurden getrennt radioaktiv mit [α-³²P]dCTP durch das Random Priming Verfahren (Amersham Corp. Arlington Heights IL USA) markiert und als Sonde für die genomische DNA verwendet. Die Hybridisierungen wurden in 6 × Standardsalzcitrat (1 × SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Na·Citrat, pH 7,6), 50% Formamid, 5 × Denhardt'sche Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml sonifizierte Lachssperma DNA bei 42°C für 16 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden mit steigenden Stringenzen bis zu 1 × SSC/0,5% SDS, 60°C für 20 min vor dem Aussetzen gegenüber Röntgenfilm bei –80°C für 72 Stunden gewaschen.
Beispiel 8 – Bestätigung von RNA Editierung von EEA3 und EAA4 Genen
RNA Editierungsassay – Plasmid DNA wurde isoliert und zunächst durch Restriktionsendonukleasespaltung (8) gescreent. Das Auftreten einer inneren Restriktionsstelle [BstXI (EAA3), EcoRV (EAA4) oder BamHI (EAA5)] zeigte eine richtige Sequenz an. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Editierung an der TMII Q/R Stelle wurde durch BbvI Spaltung bestimmt. BbvI besitzt eine Erkennungssequenz 5' GCAGC(N)₈ ... 3', und als solche wird es die nicht-editierte Sequenz (GCAGC) spalten und die veränderte Form (GCGGC) intakt lassen. Ein eindeutiger Unterschied in dem resultierenden Restriktionsmuster von Q vs. R Formen lieferte ein geeignetes Verfahren um die Klone einzuordnen. Die TMI I/V und Y/C Editierungsstellen wurden durch DNA Sequenzierung bestätigt, genauso wie die kleineren genomischen Fragmente und eine repräsentative Probe der TMII Stellen.
QUELLE VON cDNA
Die obige Tabelle zeigt die relative Frequenz von TMI und TMII Editierung in EAA3 und EAA4 cDNAs, die von verschiedenen cDNA Quellen amplifiziert wurden. Die Zahl der bewerteten cDNA Klone sind gemäß ihrem Editierungsstatus und der Gewebequelle aufgeführt.
Beispiel 9 – Isolierung von genomisch und cDNA kodiertem EAA5
Das Verfahren, das ähnlich ist zu jenem ist, das in Beispiel 7 dargestellt ist, wurde für einen anderen menschlichen ZNS-Rezeptor, nämlich den EAA5-Rezeptor durchgeführt, der in der gleichzeitig anhängigen US Anmeldung Serial Nr. 07/945,210 beschrieben ist, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die PCR Primer für dieselben Regionen wie jene, die für EAA4 verwendet wurden, wurden hergestellt und verwendet, um EAA5 genomische DNA (erhalten von Clontech) und cDNA (in menschlichen ZAP cDNA Bibliotheken erhalten von Stratagene) zu amplifizieren.
Die isolierte EEA5 genomische DNA und cDNA wurden hinsichtlich Sequenzunterschieden, die in den TMI/II Regionen erwartet wurden, verglichen, und es wurde keine gefunden, die anzeigt, dass Editierung nicht in dem EAA5 menschlichen ZNS-Rezeptor auftritt. Jedoch zeigten weitere Analysen zwei Variationen von EAA5 cDNA, die zu Aminosäuresubstitionen in der vorhergesagten extrazellulären aminoterminalen Region führen: Ser-310 → Ala und Arg-352 → Gln. Diese Variationen können der RNA Editierung zugeschrieben werden, die T → G und G → A Substitutionen einschließt.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines menschlichen ZNS-Rezeptorliganden, umfassend a) Bestimmen der Wechselwirkung zwischen einem Kandidatenliganden und einem ersten nicht-editierten menschlichen EAA-Rezeptor einer der Editierung unterworfenen Art, der menschliche EAA3-Rezeptor wie in 5 definiert, oder menschlicher EAA4-Rezeptor wie in 6 definiert ist, b) Bestimmen der Wechselwirkung zwischen dem Kandidatenliganden und einem zweiten editierten menschlichen EAA-Rezeptor, der eine editierungsveränderte Variante des ersten Rezeptors ist, und entweder c) Auswählen des Kandidatenliganden, der selektiv mit einem der Rezeptoren wechselwirkt, oder d) Auswählen des Kandidatenliganden, der im Wesentlichen äquivalent mit beiden Rezeptoren wechselwirkt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der EAA-Rezeptor ein menschlicher EAA3-Rezeptor wie in 5 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der EAA-Rezeptor ein menschlicher EAA4 Rezeptor wie in 6 definiert ist.
Verfahren zur Identifizierung von Agenzien, welche die Editierung von menschlichem EAA3-Rezeptor in vivo modulieren, umfassend a) Erhalten einer menschlichen neuronalen Zelllinie, die (1) für die nicht-editierte Form von menschlichem, der Editierung unterworfenem EAA3-Rezeptor kodierende DNA enthält, und die (2) bei Kultivierung die editierte Form des Rezeptors bildet, b) Kultivieren der Zelllinie in der Gegenwart eines Kandidatenmodulators der Editierung, und c) Bestimmen der Wirkung des Modulators auf die Bildung der editierten Form des Rezeptors.
Verfahren zur Identifizierung von Agenzien, welche die Editierung von menschlichem EAA4-Rezeptor in vivo modulieren, umfassend a) Erhalten einer menschlichen neuronalen Zelllinie, die (1) für die nicht-editierte Form von menschlichem, der Editierung unterworfenem EAA4 Rezeptor kodierende DNA enthält, und die (2) bei Kultivierung die editierte Form des Rezeptors bildet, b) Kultivieren der Zelllinie in der Gegenwart eines Kandidatenmodulators der Editierung, und c) Bestimmen der Wirkung des Modulators auf die Bildung der editierten Form des Rezeptors.