JPH09511901A

JPH09511901A - グルタミン酸受容体（またはｅａａ受容体）ポリヌクレオチド及びその使用

Info

Publication number: JPH09511901A
Application number: JP7517070A
Authority: JP
Inventors: カンボジ、ラジェンダー; ナット、スティーブン
Original assignee: アレリックス・バイオファーマスーティカルス・インコーポレーテッド
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 1997-12-02
Also published as: CA2179208A1; CA2179208C; US6136544A; DE69434333T2; AU1377095A; ATE293162T1; DE69434333D1; EP0741782A1; EP0741782B1; WO1995017508A2; WO1995017508A3

Abstract

(57)【要約】ヒトＣＮＳ受容体をコードするＤＮＡであって、インビボにおいて、該ＤＮＡから二以上の受容体蛋白、即ち、その編集された形態および編集されていない形態が発現されるＤＮＡが提供される。この編集された形態および編集されていない形態は機能的に異なっており、選択的に発現されるように思える。従って、このような編集を受けるＣＮＳ受容体をコードする遺伝子は、潜在的な治療上の有用性について化合物をスクリーニングする上での価値を有する。

Description

【発明の詳細な説明】グルタミン酸受容体（またはＥＡＡ受容体）ポリヌクレオチド及びその使用〔発明の分野〕本発明は、新規のＣＮＳ受容体ポリヌクレオチド類およびこれがコードする蛋白、並びに治療用化合物のスクリーニングにおけるその使用に関する。〔発明の背景〕哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）では、神経刺激の伝達は、「送り手」ニューロンにより放出される神経伝達物質と、「受け手」ニューロン上の表面受容体（ここに神経伝達物質が結合してこれを励起させる）との相互作用により調節される。ＣＮＳには多くの神経伝達物質が存在し、その各々が特異的な受け手ニューロンを標的としている。例えば、グルタミン酸、ドーパミン及びセロトニンという神経伝達物質はそれぞれ異なるファミリーの受容体を標的としている。例えば、興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）と呼ばれるグルタミン酸は、グルタミン酸受容体又はＥＡＡ受容体といろいろな名前で呼ばれる受容体と相互作用し、ドーパミンやセロトニンはそれぞれドーパミン受容体及びセロトニン受容体と、特異的に相互作用する。各受容体ファミリーの中で受容体は、そのリガンド結合性又は機能的な特徴により分類される。例えば、あるＥＡＡ受容体は、アゴニストであるＮＭＤＡ（Ｎ −メチル−Ｄ−アスパラギン酸）、ＡＭＰＡ（アルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキサゾール−４−プロピオン酸）、及びカイニン酸（２− カルボキシ−４−（１−メチルエテニル）−３−ピロリジンアヤテート）への結合の差により分類されている。すなわち、ＮＭＤＡ受容体はグルタミン酸に結合し、ＮＭＤＡにはカイニン酸又はＡＭＰＡへ結合するよりも大きな親和力で結合し、ＡＭＰＡ受容体やカイニン酸受容体はグルタミン酸に結合し、ＡＭＰＡとカイニン酸にはそれぞれ他のアゴニストより大きな親和力で結合する。ドーパミン受容体やセロトニン受容体とは対照的に、いくつかのＥＡＡ受容体は、確立された電気生理学的測定法（例えば、ホルマン（Hollman）ら、Nature 342:643，1989）、又は細胞膜のコンダクタンスを検出する他の適当な測定法により測定されるように、電気生理学的な意味で機能性である。本質的にＥＡＡ受容体はリガンド依存性イオンチャネル（ligand-gated ionchannel）を形成する。すなわち、適当なリガンド（例えば、グルタミン酸、ＡＭＰＡ、カイニン酸又はＮＭＤＡ）の結合に応答して、ＥＡＡ受容体イオンチャネルは「開く」、すなわち正常のシナプス伝達に必要な陽イオンの流入に対してより透過し易くなる。リガンドが結合しない場合は、イオンチャネルは「閉じた」ままであり、すなわち陽イオンに対して透過性が低く、シナプス伝達に必要な陽イオンの内部への流入を妨害する。少なくとも６つのＡＭＰＡ型のネズミの受容体がクローン化されており、ＧｌｕＲ−１からＧｌｕＲ−６と命名されている。発現実験は、このネズミ受容体ファミリーの中でＣａ²⁺透過性に関連した機能性の測定では、ＧｌｕＲ−２が最も主要なサブユニットであることを示唆している。突然変異実験では、この透過性は、ラットのＧｌｕＲ−２の推定されるチャネル形成性トランスメンブランII（ＴＭII）中の、単一のアミノ酸（アルギニン（Ｒ））により決定されること；グルタミン（Ｑ）残基は他のＡＭＰＡ受容体に存在することが証明された。引き続いて、ＧｌｕＲ−２受容体のＲ型は、ＲＮＡ編集（editing）過程によりＱ型と同じ遺伝子から生成されることが明らかにされ、ラットの脳ではこの「編集」過程の発生がＧｌｕＲ−２チャネルの陽イオン流入を決定することを示している（ソマー（Sommer）ら、1991，Cell，67:11）。現在までの報告では、発育中の中枢神経系の未変化Ｑ型の低レベルの発現を伴う、ネズミのＧｌｕＲ−２について編集過程のほとんど１００％の効率が見いだされている（ソマー（Sommer）ら、前述；及びブーナシェフ（Burnashev）ら、1992 ，Neuron，8:189）。さらに最近では、ＡＭＰＡ型のラットの受容体ＧｌｕＲ− ５とＧｌｕＲ−６も、ＲＮＡ編集を受けることが証明された（ソマー（Sommer）ら、前述；及びブーナシェフ（Burnashev）ら、前述；コーラー（Kohler）ら、1 993，Neuron，10:491）。ＲＮＡ編集は比較的まれな現象であるが、種々の生物中で起き、多くの異なる機序が関与する。ネズミのＡＭＰＡ受容体（ＧｌｕＲ−２）の編集は、塩基が対になったイントロン／エキソン構造を必要とすることが証明されている。２本鎖ＤＮＡに特異的な核のアデノシンデアミナーゼは、その機序とその過程の制御の直接の証拠はまだ研究されていないが、塩基変換に関与すると言われている。ヒトのグルタミン酸受容体もいくつかクローン化されており、ｈＧｌｕＲ１（プケット（Puckett）ら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci.，88:7557）、ｈＧｌｕＲ−２、ｈＧｌｕＲ−３（Biochem．Biophys．Acta，1994，1219:563）のようなＡＭＰＡ型のもの、及びｈｕｍＥＡＡ１（EP 529,994）；ｈｕｍＥＡＡ２（EP 5 29,995）；ｈｕｍＥＡＡ３（EP 617,123）及びｈｕｍＥＡＡ４（EP 578,409）のようなカイニン酸型のものがある。ヒトグルタミン酸受容体は、学習および記憶の獲得を仲介する役割があると言われているため、医学的に非常に重要である。さらに、興奮性アミノ酸はニューロンに対して非常に毒性が強く、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、てんかん、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、ＡＩＤＳ脳症及び痴呆症候群（dimentia complex）などのいくつかの神経学的障害に、この神経伝達系の機能異常が関係している。現在まで、ＲＮＡ編集現象（ＣＮＳ受容体及び特にグルタミン酸受容体の機能性をの重要な決定因子）は、ヒトでは観察されていない。〔発明の概要〕現在、ヒトＣＮＳ受容体のインビボの合成は、編集機序により制御されることが発見されている。この「編集」により、１つのヒトＣＮＳ受容体遺伝子から、構造的に異なる複数の型のコードされた受容体蛋白（すなわち、編集された受容体と編集されない受容体）が発現される。いくつかの神経変性症状には、異常な編集機序が関与していると言われている。本明細書に提示する証拠は、この編集機序が組織選択的に起きており、発生的に制御されていることを示している。従って、あるＣＮＳ受容体をコードする遺伝子の発現生成物は、治療的有効性を有する可能性がある化合物のスクリーニングに有用であり、特に編集されたＣＮＳ受容体と選択的に相互作用する薬剤候補の選択に有用である。従って、本発明は、１つの側面において、以下の工程を含むことを特徴とするヒトＣＮＳ受容体選択性リガンドの同定方法に関する：ａ）候補リガンドと、編集を受けるタイプの第１のヒトＣＮＳ受容体との相互作用の測定；ｂ）候補リガンドと、第１の受容体の編集により改変された変種である第２のヒトＣＮＳ受容体との相互作用の測定；そしてｃ）該受容体の１つと選択的に相互作用する候補リガンドの選択、又はｄ）該受容体の両方と実質的に等しく相互作用する候補リガンドの選択。本発明のこの方法は、本発明の実施態様において、第１及び第２のヒトグルタミン酸受容体、特にＡＭＰＡ型又はカイニン酸型のヒトグルタミン酸受容体を用いて行われる。本発明の方法に使用するために、本発明はさらに、新規の型の編集された及び編集されていないヒトＣＮＳ受容体（特に編集された及び編集されていないヒトグルタミン酸受容体）を発現するように形質転換された細胞を提供する。このような細胞の作成に使用するために、本発明は関連する面で、このような受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。更なる側面において、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とするインビボでヒトＣＮＳ受容体の編集を調節する物質を同定するのに有用な方法を提供する：ａ）（１）編集されたヒトＣＮＳ受容体の編集されていない型をコードするＤＮＡの取り込み、そして（２）培養すると、編集された型の受容体を生成する、ヒトニューロン細胞株の入手；ｂ）編集の候補調節物質の存在下での細胞株の培養；そしてｃ）受容体の編集された型の作成に及ぼす調節物質の作用の測定。以下、本発明のこれら側面及び他の側面について、添付の図面を参照してより詳細に記載する。〔図面の簡単な説明〕図１は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂ受容体の編集されていない型のゲノムＤＮＡと蛋白配列を示す。図２は、ＧｌｕＲ２Ｂ受容体の編集された型及び編集されていない型の部分的アミノ酸配列の比較である。図３は、編集を受けるＧｌｕＲ２Ｂ遺伝子のエキソン、及びゲノムＤＮＡの単離に使用されるプライマーを例示する。図４は、ヒトゲノムＧｌｕＲ２ＢＤＮＡの酵素的消化の結果を例示する。図５は、ヒトＥＡＡ３受容体の編集されていない型のゲノムＤＮＡと蛋白配列を提供する。図６は、ヒトＥＡＡ４受容体の編集されていない型のゲノムＤＮＡと蛋白配列を提供する。図７は、ヒトＥＡＡ３受容体とＥＡＡ４受容体の編集を例示する：ａ）ＴＭＩにおけるゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡヌクレオチド配列とアミノ酸配列の比較；ｂ）ＴＭIIにおけるゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡヌクレオチド配列とアミノ酸配列の比較。〔発明の詳細な説明およびその公的な実施態様〕本発明は、ヒトＣＮＳ受容体をコードする１つの遺伝子がインビボで発現されたとき、この遺伝子により決定されるアミノ酸配列の受容体だけでなく、この遺伝子にコードされない１つまたはそれ以上の型の受容体も産生するとの発見に基づく。この編集現象は、あるヒト受容体のｃＤＮＡ配列をある受容体の対応するゲノムＤＮＡ配列と比較することにより明らかにされた。配列の差から、ゲノムＤＮＡに対してｃＤＮＡ配列は変化しており、その結果ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡによりコードされる受容体に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する受容体蛋白をコードすることが明らかになった。こうして、編集現象は受容体蛋白構造が異なる受容体、及びある場合には受容体蛋白の機能が異なる受容体を与える。これらの異なる型の受容体は、本明細書において「編集された」及び「編集されていない」として特徴付けられるポリヌクレオチドの発現生成物である。「編集されていない」ポリヌクレオチドは、ゲノムによりコードされた配列を有するものである。同様に「編集されていない」受容体蛋白では、受容体蛋白配列中の各アミノ酸は、ゲノムＤＮＡ配列（すなわち、そこからアミノ酸が発現される編集されていないポリヌクレオチド）内に適切な起源コドンを有する。一方「編集された」受容体蛋白は、編集されていないポリヌクレオチドから発現されるが、そこからアミノ酸が発現される編集されていないポリヌクレオチド中の少なくとも１つのアミノ酸が異なる受容体蛋白配列を有する。「編集された」及び「編集されていない」という用語は、本明細書ではまた、各受容体蛋白のｍＲＮＡ、ｓＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列についても使用される。本明細書において編集された受容体及び編集されていないＣＮＳ受容体に関して使用される「独特の（distinct）」という用語は、編集された受容体及び編集されていない受容体の間の差を意味し、これは少なくとも１つの構造の差、すなわちアミノ酸配列の差、又は機能の差（すなわち、リガンド結合性、又はリガンド／受容体相互作用を決定するのに適した測定法で測定することができる電気生理学的性質の差）を包含する。「機能的に独特の」という用語は、編集された受容体及び編集されていない受容体のそれぞれは、ある刺激に対して反応が異なることを示す。例えば、機能的に独特の型のＥＡＡ受容体は、あるリガンドに応答してリガンド依存性イオンチャネル活性を示す編集されていない受容体により示され、一方編集された受容体はそのリガンドの存在下でチャネル活性を示さない。機能的に独特の型のＣＮＳ受容体も、独特のリガンド結合性を示す。編集の機序については、いかなる単一の理論にも拘束されるつもりはないが、遺伝子の「編集」は転写のレベルの酵素により触媒されると考えられる。すなわち「編集」酵素は、ゲノムＣＮＳ受容体をコードするＤＮＡの転写の間、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドを認識し、適当な対応するヌクレオチドをｍＲＮＡに取り込む代わりに、異なるヌクレオチドをｍＲＮＡに取り込む。ＣＮＳ受容体ポリヌクレオチドの編集は、必ずしも常に起きるわけではなく、ある条件又はシグナルが、ＣＮＳポリヌクレオチドを編集する場合および編集しない場合を指令するようである。後に詳細に説明されるように、ヒトＣＮＳ遺伝子の編集も組織特異的に起き、あるＣＮＳ組織では頻度高く起き他の組織ではあまり起きないことが見いだされた。本明細書において「ゲノム性ポリヌクレオチド」とは、ゲノムＤＮＡのコード配列に一致するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを意味する。すなわち、本発明のゲノム性ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡのエキソン性コード配列よりなり非コーディングイントロン性配列が欠如する合成ＤＮＡ若しくはｃＤＮΛでもよい。ゲノム性ポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡ配列に一致するＲＮＡ、すなわち編集されていない型でもよい。本明細書において「単離された」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、他のヒト蛋白をコードするポリヌクレオチドを含有しないポリヌクレオチドを示す、完全な（intact）ポリヌクレオチドに関して使用される。ヒトＣＮＳ受容体蛋白に関して、「単離された」という用語は、同様に他のヒト蛋白を含まない受容体蛋白を意味する。すなわち、１つの側面において、本発明は、編集された及び／又は編集されていない型の受容体と相互作用するリガンドの同定方法を提供し、該方法は、リガンド候補と編集を受ける第１のヒトＣＮＳ受容体の間の相互作用、及びリガンド候補と第１の受容体の編集により改変された変種である第２のヒトＣＮＳ受容体の間の相互作用を測定することと、次に、特定の型の受容体に対する薬剤を標的とする場合は該受容体の１つと選択的に相互作用するリガンドを選択し、又は受容体ファミリーに無差別に作用する薬剤が必要な場合は両方の受容体と相互作用するリガンドを選択することとを具備する。このようなスクリーニング法に使用するために、受容体遺伝子ファミリーの中で、編集により改変される受容体をコードするポリヌクレオチドを同定し、入手することが必要であろう。特定のＣＮＳ受容体をコードする遺伝子が編集を受けるか否かを決定するためには、受容体のゲノムＤＮＡ配列を、核酸及びそこからインビボで特異的に得られるアミノ酸配列、遺伝子配列からインビボで転写されるｍＲＮＡ配列又はそのｃＤＮＡ同等物、及びそこから発現される蛋白配列を比較する。遺伝子の編集を検出するために、遺伝子配列を、インビボの処理で得られるｍＲＮＡや蛋白の配列と比較することが重要である。編集条件（例えば、必要な編集酵素の存在）は、特別に添加しなければおそらくインビトロでは存在しないため、遺伝子配列を人工的に（すなわち、インビトロ条件下で）産生したｍＲＮＡ又は蛋白配列と比較しても編集配列が反映されないであろう。既知の遺伝子又は新規遺伝子の編集に関する情報が必要な場合も、遺伝子及びそのｃＤＮＡを得るための一般的方法は同じである。例えば、サン（Sun）ら（P roc．Natl．Acad．Sci．USA，1992，89:1443）が記載した方法を使用して、目的の受容体をコードするｃＤＮＡを単離することができる。典型的には最初の段階で、目的の配列をヒト脳のｃＤＮＡライブラリーから得る。このためＣＮＳ受容体のすべて又は一部をコードするｃＤＮＡを単離するための適当な核酸プローブを設計し、次に調製することが必要であろう。新規のＣＮＳ受容体遺伝子が必要な場合は、いくつかのＣＮＳ受容体（例えば、カイニン酸型のＣＮＳ受容体）の中で保存されていると考えられるＣＮＳ受容体の領域に基づくプローブを使用することができる。既知の遺伝子が必要な場合は、使用されるプローブは、好ましくはその遺伝子にユニークな遺伝子の領域に相補的である。あるいは、ｃＤＮＡ配列（公知の場合）を、合成法を用いて調製し次に全長ｃＤＮＡの小断片を連結させることができる。プローブにハイブリダイズするｃＤＮＡの単離は、当業者に公知の方法で行われる。プローブを用いて全長受容体ｃＤＮＡを単離することは可能であるが、一般的には行われておらず、むしろ全長ｃＤＮＡの断片が単離される。ｃＤＮＡ断片を連結し、ｃＤＮＡ断片の重複領域により連結部位を決定して、全長ｃＤＮＡが調製される。全長ｃＤＮＡを調製した後、これをサンガー（ Sanger）配列決定法のような当業者に公知の方法を用いて配列が決定される。この遺伝子のｍＲＮＡ配列はもちろん全長ｃＤＮＡに対応する。ここから発現される蛋白の配列は、単離されたｃＤＮＡ配列からも得られる。全長ｃＤＮＡが調製されたら、このすべて又は一部をプローブとして用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーから目的の対応するゲノム性の受容体をコードするＤＮＡを単離することができる。この方法ではやはり、全長ゲノムＤＮＡは明らかにならないであろう；しかし、ゲノムＤＮＡの単離された断片を用いて、受容体をコードする全長ゲノムＤＮＡを調製することができる。特定のゲノムＤＮＡの単離を促進するために、目的のＤＮＡをまず増幅して、ライブラリーの他のＤＮＡに対する量を増加させる。これは典型的には、充分確立されたＰＣＲ法を用いて行われる。この場合、目的のゲノムＤＮＡの末端にハイブリダイズすることが知られている短いＤＮＡ断片をライブラリーに添加し、適当なＰＣＲ条件下で目的のＤＮＡを増幅し、こうしてその検出と単離を促進する。遺伝子はいったん単離及び／又は全長型に調製されると、遺伝子は配列決定され、次にその配列を、単離されたＤＮＡの配列と比較することができる。配列の間の差が、インビボの配列編集の存在を示す。特定の遺伝子の編集が起きたことを決定又は仮定するために、全ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡポリヌクレオチドを配列決定することが必要ではないことは、当業者には理解できるであろう。１つの別の方法では、配列の不一致すなわち編集を探索するために、各ｃＤＮＡ及び遺伝子のほんの一部のみが配列決定される。この点で、編集が起きそうな遺伝子の領域（例えば、受容体蛋白の機能性ドメインをコードする領域）を選択することが重要であろう。この機能性の受容体ドメインは受容体毎に異なる。ＥＡＡ受容体遺伝子では、細胞内トランスメンブランドメインをコードする領域（これはイオンチャネル活性に重要である）が、編集の証拠について調べられる領域である。イオンチャネルを形成しないドーパミンやセロトニン受容体の場合は、リボゾーム結合ドメインをコードすると考えられる受容体遺伝子の領域を、配列の不一致について調べる。ゲノムＤＮＡ性及びｃＤＮＡポリヌクレオチドの選択された領域に編集が見いだされない場合は、当然次に全配列を比較して特定の遺伝子が編集されているか否かを結論付けることが必要であろう。編集が起きた（又は起きたかも知れない）ことを同定する別の方法は、単離されたＣＮＳ受容体ｃＤＮＡや遺伝子のそれぞれから発現される受容体蛋白の性質を比較することである。このためにｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを発現ベクター中にクローン化して、これを用いて適当な細胞（後術される）を形質転換し、そこから産生される受容体蛋白又は膜調製物を単離して、リガンド結合及び／又は電気生理学的測定法（これも後述される）を用いて比較する。蛋白間の機能的な差も、その発現の前のいずれかの時点で特定のＣＮＳ受容体蛋白の編集が起きたことの指標となる。ＣＮＳ受容体遺伝子の編集が起きたことを仮定するためには、ゲノムＤＮＡと蛋白生成物の間の配列の差に複数の遺伝子又は交互に現れるエキソンが関与する可能性を除外する（すなわち、このような配列の差が編集の存在を証明することを確認する）ことが必要であろう。まず前述の特異的ＤＮＡプローブを用いて、脳の異なる領域のゲノムＤＮＡライブラリーから、蛋白をコードするゲノムＤＮＡを単離しなければならない。これにより複数の遺伝子（その１つまたはそれ以上は領域特異的である）が存在するか否かが確認され、その存在を見逃すことはないであろう。さらにプライマーに基づくＰＣＲ増幅法を用いて、ＤＮＡライブラリー中にほんの少量存在するかも知れないＤＮＡを増幅することができる。ゲノムＤＮＡを単離した後、複数の遺伝子（すなわち、蛋白の編集されていない型をコードする遺伝子及び蛋白の編集された型をコードする遺伝子）が存在しないことを確認する１つの方法は、１つの型の遺伝子（又はコードするエキソン）で存在し、別の型の遺伝子（又はコードするエキソン）にはない特徴（例えば、制限酵素部位）を同定することである。すなわち、ゲノムＤＮＡの単離物を、問題の領域中に認識部位が存在する制限酵素に接触させることにより、プローブ特異的ハイブリダイゼーションを用いる分析で２つの断片が生成する。一方ゲノムＤＮＡの単離物を、間題の領域中に認識部位が存在しない制限酵素に接触させることにより、プローブ特異的ハイブリダイゼーションを用いる分析で１つの断片のみが生成する。予測される結果からの不一致は複数の遺伝子又はエキソンが関与していることを示し、不一致の理由を同定するために予測された結果を与えるゲノムＤＮＡは、充分配列決定しなければならない。編集された型及び編集されていない型の受容体蛋白の特徴に関する情報はもちろん、各型の蛋白の蛋白配列が公知の場合のみ利用できる。しかし多くの場合、利用できる情報は、既知の遺伝子配列に一致するか又は一致しないかも知れない受容体遺伝子配列及び蛋白配列である。すなわち、遺伝子のＲＮＡ編集が存在するか否かを決定するために、又はそれをコードすると考えられる遺伝子に配列が一致しない蛋白になるのに複数の遺伝子又はエキソンが関与するか否かを決定するのに、異なる方法を使用しなければならない。このような方法の１つは、２つの遺伝子のコード配列はほんのわずか（例えば、１つのコドン）しか異ならないという事実にもかかわらず、イントロンの遺伝子配列は遺伝子毎に異なるという事実に基づく。この方法では、単離されたゲノムＤＮＡは制限酵素で消化され、次にニトロセルロースフィルター上に固定化される。標的領域（すなわち、遺伝子：蛋白の不一致の領域）に対する標識ＤＮＡプローブを用いて、酵素消化ＤＮＡ断片を同定する。ゲノムＤＮＡの配列は既知であるため、標的領域中の制限部位の存在、従って特定の酵素消化から予測される制限断片の数がわかり、その結果が予測される断片より多いか又は少ない場合は、複数の遺伝子又は交互に現れるコドンの存在を示しているであろう。あるいはＰＣＲで増幅した単離されたゲノムＤＮＡは、複数の遺伝子又は別のエキソンを探索する過程で充分配列が決定されるであろう。この方法は好ましくは、他の方法（例えば前述の方法）で得られる結果を確認するために、又はそのような方法が確認できる結果を与えないとき、使用される。単離された遺伝子又は遺伝子断片の全長の配列決定によりその本体が確認されるであろう。もし脳の各領域からの相当数の（すなわち、50〜100）の陽性クローンを配列決定しても「編集された」蛋白をコードする遺伝子が見つからない場合は、蛋白配列の不一致の可能性としての複数の遺伝子の存在及び交互に現れるエキソンの存在は除外される。さらにＤＮＡと蛋白配列の差がランダム突然変異（すなわち、点突然変異又は他の型の突然変異）の結果でない可能性を排除するために、それがランダム突然変異に関係のある頻度以上で起きることを決定することが重要である。この点で、ヒトＣＮＳにおける突然変異は極度にまれなため、1000分の１又は10,000分の１以上の頻度で編集された型及び編集されていない型の蛋白が発現されれば、いずれかの蛋白が突然変異の結果であることは除外されるであろう。本発明の具体的な実質的において、ヒトＥＡＡ受容体（すなわち、同時係属米国特許出願第07/896,937号に記載のＧｌｕＲ２Ｂ受容体）は、具体例で詳述されるように編集を受けることが決定された。簡単に説明すると、ＧｌｕＲ２Ｂ受容体のゲノムＤＮＡ断片及び受容体蛋白のアミノ酸配列からの全長ｃＤＮＡをプローブとして使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを調べた。これらのプローブを使用して単離された全長ゲノムＤＮＡの配列を決定し、次にその配列を全長ＧｌｕＲ２ＢｃＤＮＡ及び蛋白配列と比較した。配列の比較によりトランスメンブランIIドメインにコーディング領域が同定された。具体的には、ゲノムＤＮＡは蛋白配列の587位でグルタミン酸をコードすることが見いだされ、一方ｃＤＮＡは５８７位でコードしていた。ＧｌｕＲ２Ｂ受容体をコードするゲノムＤＮＡ配列は図１に例示されており、米国特許出願07/896,937号とは2134位でＧからＡへの単一のヌクレオチドの変化があることで異なる。この変化は、587位でＧｌｕＲ２Ｂ受容体の蛋白配列にも反映されている。蛋白配列の変化は、図２によりさらに明らかであろう。従って本発明の実施態様において、ヒトＧｌｕＲ受容体（特にヒトＧｌｕＲ２受容体）のＱ−５８７型をコードするポリヌクレオチドが提供される。またヒトＧｌｕＲ２受容体のＱ−５８７型をコードするポリヌクレオチドを取り込んだ形質転換されたポリヌクレオチドも提供される。またヒトＧｌｕＲ２受容体のＱ−５８７型自身も提供される。複数のＧｌｕＲ２受容体をコードする遺伝子が存在しないこと、すなわち１つの遺伝子はＧｌｕＲ２Ｂの編集されていないＱ−５８７型をコードし、別の遺伝子はＧｌｕＲ２ＢのＲ−５８７型をコードすること、又はこれらの編集された型及び編集されていない型をコードする複数のエキソンは存在しないことを確認するために、ゲノムＧｌｕＲ２ＢＤＮＡを制限酵素で消化した。具体的にはゲノムＤＮＡ試料を、「編集」を受けるコドンを含有するエキソン中の認識部位を有することが知られている制限酵素（ＢｇｌII）で消化し、他のゲノムＤＮＡ試料を、編集されたエキソン中に認識部位を持たない制限酵素（ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III及びＰｓｔＩ）で消化した。酵素消化後、ＤＮＡとその断片をゲル電気泳動を用いて分離し、エキソンに特異的な標識プローブを用いて「編集された」エキソンを有する断片を同定した。予測されたように、ＢｇｌII消化により２つのＤＮＡ断片が生じた。ＢｇｌII酵素消化により３つ又はそれ以上の断片が得られれば、イントロン配列が異なる２つの遺伝子が存在するか、又はＢｇｌII部位を有するが異なる配列を有する２つのエキソンが存在することを示していたであろう。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩを用いるＤＮＡ消化により、それぞれ１つにバンドが得られた。ここでも２つ以上のバンドの出現は、前述の２つの遺伝子又はエキソンの存在を示していたでであろう。最後に、ゲノムＧｌｕＲ２ＢＤＮＡとＧｌｕＲ２Ｂ受容体との配列の差がランダム突然変異の結果ではないことを確認するために、いくつかのＧｌｕＲ２ＢゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡクローンを配列決定して配列変化の頻度を求めた。このために、前述の種々のタイプの脳組織をプローブ探索した。結果は明らかに、突然変異は、ＧｌｕＲ２ＢＤＮＡと発現されたＧｌｕＲ２Ｂ蛋白の間に起きた配列の変化の原因ではないことを示していた。ＧｌｕＲ２Ｂの「編集」は異なる組織で異なる頻度で起き、例えば海馬、小脳及び側頭皮質のＧｌｕＲ２Ｂは１００％編集され（すなわち、58 7位にアルギニンを有していた）、黒質（substantia nigra）のＧｌｕＲ２Ｂは7 1％編集され、線条体のＧｌｕＲ２Ｂは89％編集され、胎児脳組織のＧｌｕＲ２Ｂは96％編集されていた。本発明の他の実施態様において、それぞれEP617,123及びEP578,409号（参考のため本発明に引用される）に記載のカイニン酸ファミリーのヒトＥＡＡ３及びＥＡＡ４受容体は、編集を受けることが見いだされた。ＧｌｕＲ２Ｂ受容体の編集を測定するのに使用したものと同様の技術を用いて、ヒトＥＡＡ３とＥＡＡ４ゲノムＤＮＡは、対応するｃＤＮＡとは異なるアミノ酸配列を有する受容体をコードすることが観察された。具体的にはＥＡＡ３ゲノムＤＮＡは、成熟受容体蛋白の591位にグルタミン酸（Ｑ）残基をコードし、脳の種々の領域由来のｃＤＮＡは591位にアルギニン（Ｒ）残基をコードすることが観察された。一方ＥＡＡ４ゲノムＤＮＡは３つの部位で編集されていることが見いだされた（成熟蛋白の53 2位のイソロイシンがバリンで置換され、536位のチロシンがシステインで、そして586位のグルタミンがアルギニンに置換された）。ＥＡＡ３とＥＡＡ４のゲノム配列はそれぞれ図５と図６にに例示されている。これらの部位のそれぞれの蛋白配列の変化は、図７に例示した単一のヌクレオチド置換（アデノシン→グアノシン（Ａ→Ｇ））の結果である。すなわち本発明の実施態様において、以下のヒトＣＮＳ受容体蛋白、そしてこれらをコードするポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドを発現できるように取り込んだ形質転換した細胞が提供される：（１）ヒトＥＡＡ３受容体のＲ−５９１及びＱ−５９１型；（２）アミノ酸（Ｉｌｅ−５３２、Ｖａｌ−５３２、Ｔｙｒ−５３６、Ｃｙｓ−５３６、Ｇｌｎ−５８６、及びＡｒｇ−５８６）の１つまたはそれ以上の新規な組合せを有するヒトＥＡＡ４受容体蛋白の型。ＥＡＡ３とＥＡＡ４の両方のグルタミンからアルギニン（Ｑ／Ｒ）への置換は、受容体蛋白のトランスメンブランII（ＴＭII）領域に起きる。ＥＡＡ４の追加のＩ／Ｖ⁵³²とＹ／Ｃ⁵³⁶編集部位はＴＭＩ領域に存在し、ＥＡＡ４の８個のイソフォームの作成を可能にするためさらに複雑さを増している。従ってＥＡＡ４のＲＮＡ編集は、脳のグルタミン酸活性化Ｃａ²⁺流入を制御する受容体のモザイクを与える。編集されたコドンの頻度を、脳の種々の領域の組織で調べ、差別的に起きることが見いだされた。８つの可能な型のイソフォームのうち、５つ（具体的には、Ｉ．Ｃ．Ｒ、Ｖ．Ｃ．Ｒ、Ｉ．Ｙ．Ｑ、Ｖ．Ｃ．Ｑ、及びＩ．Ｙ．Ｒ）は種々の領域で見いだされた。ヒトＧｌｕＲ２の場合のように、観察された編集された／編集されていないコドンの相対頻度も、年齢特異的に差別的に制御された。ヒト胎児脳（妊娠１７〜１８週）から単離したＥＡＡ４ｃＤＮＡクローンは、比較的低い編集効率を示した。２歳の女児の小脳から増幅した大部分のＥＡＡ４ｃＤＮＡは、半編集型のＩ．Ｃ．Ｒであった。この変種も、線条体ｃＤＮＡに見いだされる主要なタイプであった。理論に拘束されるつもりはないが、同年齢の個人において独特のニューロン性集団で異なる編集状態が存在することができると考えられる。すなわちＩ．Ｃ．Ｒ型は、全体として脳にはまれであるが、小脳や線条体のような特異的ニューロン組織中のカイニン酸受容体チャネル複合体中である役割を果たすであろう。海馬由来のｃＤＮＡは、編集されたＥＡＡ４の独特の異なる発現パターンを示し、試験した大部分のｃＤＮＡは完全に編集されたＶ．Ｃ．Ｒであった。黒質における編集により、ほぼ同じ比率の編集されていないＩ．Ｙ．Ｑと完全に編集されたＶ．Ｃ．ＲｃＤＮＡが得られ、側頭皮質では編集は観察されなかった。ＥＡＡ３のＱ／Ｒ編集頻度を調べると、ヒトの脳で不均一な分布が明らかになった。胎児組織も、成人の脳で一般的に観察されるよりも高率に、編集されていないＱ型を有した。本試験で使用した小脳及び側頭皮質組織は、２歳の女児から単離され、小脳のＥＡＡ３編集の有意な（ｐ＜0.05）減少を示した。同年齢の別の女児（２歳）から単離された海馬組織は、側頭組織と同様のレベルの編集を示したが、小脳の編集とは異なっていた（ｐ＜0.05）。編集の効率も、黒質（６０歳）と線条体（５７歳と６３歳）では高かった。編集を受けるＣＮＳ受容体遺伝子を同定し確認した後は、遺伝子操作技術を用いて、薬剤スクリーニングにおいて標的とされる受容体の型（例えば、１つまたはそれ以上の編集された型及び／又は編集されていない型）を産生する細胞を作成することが好ましい。本発明の１つの実施態様では、このように遺伝子操作された細胞（原核細胞及び真核細胞を含む）の作成は、宿主細胞に組換えＤＮＡ作成体を導入することにより行われ、ここで組換えＤＮＡ作成体中の分泌型の受容体（すなわち、本来のシグナルペプチド又は機能的異種同等物を有する型）をコードするＤＮＡは、受容体をコードするＤＮＡを発現するように選択された宿主中で機能する発現調節成分に、機能的に連結しており、こうして目的の受容体蛋白が作成される。本明細書においてこのような細胞は、受容体をコードするＤＮＡを「発現できるように」（expressively）取り込んでいることを特徴とする。この受容体をコードするＤＮＡは、特定の細胞宿主中で自然には見いだされない場合は、このような宿主に対して「異種」であると見なされる。「編集されていない」受容体をコードするＤＮＡは、天然でゲノムＤＮＡであるか、又は蛋白配列から得られるもの（すなわち、ｃＤＮＡ）である。一方「編集された」受容体をコードするＤＮＡは、ゲノム型では存在しないためｃＤＮＡ型でのみ使用される。ヒト受容体の産生のための宿主として作用させるために選択される特定のタイプの細胞は、当該分野で現在入手できるいくつかのタイプの細胞の任意のものでよい。しかし、リガンドスクリーニング測定法に使用される受容体の産生のために選択されるタイプの細胞は、発現される受容体をコードするＤＮＡの編集を発現しないことが重要である。本発明の１つの実施態様において、ＣＮＳ受容体の産生用の宿主として作用させるために選択される細胞株は、ヒトニューロン細胞でない哺乳動物細胞である。遺伝子操作用にそのような細胞株のいくつかタイプが現在利用可能であり、これらには以下のものが含まれる。Ｐｒｏ５（ＡＴＣＣＣＲＬ１２８１）を含む、例えばＫ１系統のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ６１）；ＣＶ−１系統（ＡＴＣＣＣＲＬ７０）、ＣＯＳ−１系統（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）のＳＶ４０−形質転換アフリカミドリザル腎から得られた繊維芽細胞様細胞；マウスＬ−細胞、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、マウスＣ１２７細胞、２９３系統のヒト胚腎細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、ＨｅＬａ系統のものを含むヒト癌細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２）。これらの宿主で使用するのに適合させた種々の遺伝子発現系が現在利用可能である。これらの系の任意のものを、ヒトＣＮＳ受容体をコードするＤＮＡを発現するのに選択することができる。これらの系は典型的にはプラスミドベクターの形で入手され、発現カセット（その機能性成分は、発現調節成分配列よりなるＤＮＡを含有し、これは宿主に認識され、その５’に結合したとき受容体をコードするＤＮＡの発現を可能にする）を含有する。この系はさらに、受容体をコードする領域の３’に結合したとき発現を停止するＤＮＡ配列を取り込んでいる。すなわち、選択された哺乳動物細胞宿主で発現させるために、受容体を分泌可能な型でコードするＤＮＡが、宿主に認識される発現調節ＤＮＡ配列に連結しており、発現を進める受容体をコードするＤＮＡの５’領域、及び発現を停止させる３’領域を有する、組換えＤＮＡ発現作成体が作成される。この組換えＤＮＡ発現作成体を有するプラスミドベクターは、発現宿主中でプラスミドの複製を可能にし、好ましくはまた細菌宿主（例えば、大腸菌（E．coli））中でプラスミド増幅を可能にする、典型的には複製開始点（通常ウイルス由来）のような他の機能性成分を取り込んでいる。安定に形質転換された組換え細胞の選択を可能にするマーカーを提供するために、ベクターはまた、形質転換体に生存の利点を与える遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性を与える遺伝子、この場合形質転換体はネオマイシンを補足した培地に塗布される）も取り込んでいる。受容体をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞での発現をするために使用される種々の組換えＤＮＡ発現系には、哺乳動物細胞に感染するウイルスのプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）などを利用するものがある。また発現を進めるのに有用なものは、レトロウイルスのＬＴＲのようなプロモーター、温度に制御されるもの及びショウジョウバエから単離されたもののような昆虫細胞プロモーター、そして重金属に制御されるもののような哺乳動物遺伝子プロモーター（すなわち、メタロチオネイン遺伝子プロモーター）及び他のステロイド誘導性プロモーターがある。受容体をコードするＤＮＡは発現のために任意の発現ベクターに取り込まれ、宿主細胞はこれを用いて通常法（例えば、ＤＮＡ介在形質転換、電気穿孔法、又は粒子銃形質転換）により形質転換される。この点で、この受容体をコードするＤＮＡは、単離されたゲノム配列と同義のコドン同等物で置換されることは理解されるであろう。発現ベクターは、一時的又は安定に受容体をコードするＤＮＡを発現する、形質転換細胞株を与えるように選択される。一時的発現のためには、宿主細胞は典型的には、哺乳動物細胞中で機能する複製開始点を有する発現ベクターで形質転換される。安定な発現のためには、そのような複製開始点は不要であるが、ベクターは、形質転換体に生存のための利点を与え、その選択を可能にする、生成物をコードする遺伝子を有する。そのような選択性マーカーをコードする遺伝子には、マイコフェノール酸に対する耐性を与える大腸菌ｇｐｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオマイシンに耐性を与えるトランスポゾンＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子、ＤＨＦＲ−細胞の表現型をＤＨＦＲ＋細胞に変化させるマウス細胞又は大腸菌細胞からのｄｈｆｒ配列、及びＴＫ−細胞の表現型をＴＫ＋細胞に変化させる単純ヘルペスウイルスのｔｋ遺伝子がある。一時的発現及び安定な発現の両方とも、リガンドスクリーニング測定法に使用される、形質転換された細胞株、及びそこから得られる膜調製物を与える。リガンドスクリーニング測定法に使用するために、受容体をコードするＤＮＡを一時的に発現する細胞は、後の使用のために凍結保存する。しかしプラスミドの複製速度は速く通常数日で細胞は死滅するため、形質転換した細胞はできるだけ早く使用すべきである。この測定は、完全な（intact）細胞又は完全な細胞からの膜調製物を用いて行われる。膜調製物は典型的にはリガンド結合実験のためのより便利な基質であり、従って結合基質として好ましい。スクリーニング目的（すなわち、リガンド結合実験）の膜調製物を調製するために、凍結した完全な細胞を冷水懸濁物中でホモジナイズし、遠心分離して膜ペレットを集める。次にこのペレットを冷水中で洗浄し、測定法の結合に競合するであろう内因性リガンド（ＥＡＡ受容体の場合はグルタミン酸）を透析して除去する。透析した膜を次にそのまま使用するか、又は凍結乾燥型で保存した後リガンド結合測定法に使用する。あるいは、一時的トランスフェクションの約２日後、又は安定に形質転換した細胞を新鮮に塗布した後同程度の日数後集めた完全で新鮮な細胞を、膜調製物に使用した方法と同じ方法によりリガンド結合測定法に使用する。細胞を用いるとき、細胞を傷つけないようにより穏やかな遠心分離により細胞を集め、緩衝化媒体（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）中で洗浄して浸透圧ショックや細胞の破裂を避けなければならない。リガンド候補とヒトＣＮＳ受容体との間の結合相互作用は、典型的にはあらかじめ決められた量（一般的には約25μg〜100μg）（例えば、蛋白定量により測定される）の細胞由来の膜を用いて評価される。一般に競合的結合測定法は、内因性リガンド（例えばグルタミン酸、セロトニン又はドーパミンであり、関与する受容体のタイプにより異なる）に対するリガンド候補の親和性を評価するのに有用である。競合的結合測定法は、種々の濃度の未標識リガンド候補の存在下で、膜調製物を放射標識内因性リガンドとインキュベートすることにより行われる。インキュベート後、置換された又は結合した放射標識リガンドを回収し測定して、基質として使用した特定の受容体に対する、リガンド候補と内因性リガンドの相対的結合親和性を測定する。こうして本発明のヒトＣＮＳ受容体に対する種々のリガンド候補の親和性が測定される。受容体をコードするＤＮＡを発現する細胞を用いる代わりに、リガンド／受容体相互作用は電気生理学的に測定することもできる。例えば、例えば、アフリカツノガエル卵母細胞（Xenopus oocytes）は、受容体をコードするメッセンジャーＲＮＡを卵母細胞細胞質へ注入するか、又は受容体をコードするＤＮＡを卵母細胞の核内へ注入することにより導入すると、機能性膜結合受容体を与える。細胞質性送達のメッセンジャーＲＮＡを作成するために、受容体をコードするＤＮＡを典型的にはまず、適当なプロモーター領域（例えば、Ｔ３又はＴ７バクテリオファージプロモーター）に隣接するプラスミドベクター内へサブクローニングして、ＲＮＡメッセージへの転写を可能にする。次に挿入した遺伝子からインビトロでＲＮＡを転写し、集め、次にアフリカツノガエル卵母細胞に注入する。ナノリットル量のＲＮＡ溶液を注入した後卵母細胞を数日間インキュベートし、次に浴溶液で供給されるリガンド候補に応答する能力について試験する。陽イオンが選択的に通過する膜チャネルを介して部分的に機能するＥＡＡ受容体の場合、浴溶液中で特定のリガンド候補に応答する受容体の機能を、典型的には細胞内へ挿入された微小電極を用いて、確立された方法で電流として測定する。編集された型及び編集されていない型の受容体を発現した後、編集された型の受容体を編集されていない型の受容体から区別することが好ましい。ある種の神経退行性疾患は、編集機序の機能異常が関係していることが考えられる。受容体の編集された型及び編集されていない型の機能的な差は、治療上有用な可能性（例えば、チャネル活性のような特定の機能の過活動性の防止、又は遅れている受容体機能の増強）のある化合物のスクリーニングに有用である。この意味で、編集された型又は編集されていない型の受容体に選択的な化合物が好ましい。編集された型と編集されていない型は、前述のようにリガンド結合性（すなわち、一方の型に結合するリガンドは他方の型に対するほとんど又は全く親和性がないかも知れない）により区別してもよい。すなわち、編集された型と編集されていない型の受容体の選択性を測定する１つの方法は、競合的結合測定法を実施することである。具体的には、編集された型の受容体をコードする細胞を、内因性リガンドの存在下で適当な条件下で試験化合物とインキュベートし、この型の受容体に対する化合物のリガンド結合親和性を内因性リガンドに比較して求める。この親和性を、同じ方法で測定された編集されていない型の受容体に対する化合物のリガンド結合親和性と比較する。もちろん、ある化合物が１つの受容体に対して強い親和性を示し、一方他の受容体に対しては比較的弱い親和性を示すような場合は、差別的リガンド結合性の受容体機能に及ぼす影響を考慮する。あるいは、編集された型及び編集されていない型の受容体は、特にＥＡＡ受容体が関係する場合は、電気生理学的機能に基づき区別してもよい。電気生理学的機能は、受容体をコードする細胞又はその膜調製物を流れるリガンドに誘導された電流を、ベルドールン（Verdoorn）ら、Mol．Pharmacol.，1988，34:298が記載したようなチャネル活性測定法を用いて測定される。簡単に説明すると、内因性リガンド（例えば、グルタミン酸）の存在下で細胞又は膜調製物をインキュベートし、得られる電流を測定する。受容体が優先的に結合したリガンドが、これらの機能試験の実施に最も適したリガンドであり、例えばカイニン酸はカイニン酸に優先的に結合する受容体の最も適したリガンドであり、一方ＡＭＰＡはＡＭＰＡに優先的に結合する受容体の最も適したリガンドである。次に、編集された型及び編集されていない型の受容体の電気生理学的機能の差を測定する。前述のように、差別的に結合する試験化合物が電気生理学的機能に及ぼす影響も測定することができる。本発明のＧｌｕＲ２Ｂ受容体実施態様に関して、編集されていない型及び編集された型の受容体の機能的差は、前述のように測定できる。ＧｌｕＲ２Ｂ受容体中で電流を誘導するのに使用されるリガンドは好ましくはＡＭＰＡである。ＡＭＰＡの存在下で、編集されていない型の受容体は、リガンド依存性イオンチャネル（これは２価陽イオン、特にカルシウムに対して透過性である）を形成しながら電流を誘発し、一方編集された型の受容体は２価陽イオンに対して透過性のイオンチャネルを形成するが電流を誘発しない。本発明の別の実施態様において、編集されていない型の蛋白をコードするゲノムＤＮＡの同定、及び編集されていないｍＲＮＡのｃＤＮＡからの、編集されたｍＲＮＡのｃＤＮＡの区別を促進する、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが提供される。少なくとも約１７ヌクレオチドよりなるプローブは、「編集されていない」ゲノムＤＮＡの編集されていない領域に対応するか、又は「編集された」ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡの編集された領域に対応する。理解されるように、標的ＤＮＡ配列をうまく同定するための、本発明のプローブを用いるためのいくつかの方法が存在する。例えば１つの方法では、通常の方法でプローブをハイブリダイゼーションプローブとして使用する。すなわち、単離され固定化されたＤＮＡを、ハイブリダイゼーション条件下でプローブと組合せると、プローブは対応する配列を有するＤＮＡにハイブリダイズする。一般にＤＮＡ／プローブのハイブリダイゼーションを同定するためには、このために確立されたリンカー技術を用いてプローブを標識（例えば、放射標識物、酵素標識物、発光標識物などのレポーター分子への結合）するか、又はプローブに放射性同位元素分子（例えば、³ Ｈ及び¹³ Ｃ）のような標識物をその構造中に取り込ませる。２つのレポーター型がきわめて相同性が高いため、編集された型と編集されていない型のｃＤＮＡを区別するためには、高緊縮性条件及び通常標的領域の配列相補物であるプローブを用いなければならない。本発明のプローブを用いる別の方法は、公知のＰＣＲ増幅方法である。この方法では、３’末端に「編集されていない」コドンを取り込んでいるプローブを調製する。このプローブをＰＣＲ条件下でゲノム性核酸混合物とインキュベートすると、このプローブに相補的な配列が存在する場合は、その配列が増幅される。しかし、もし「編集された」ものをコードする配列のみが存在する場合は、この一致しない配列ではＰＣＲ増幅は起きないであろう。別の面で本発明は、インビボでヒトＣＮＳ受容体の編集を調節する物質を同定するためのインビトロの方法を提供し、該方法は以下よりなる：ａ）（１）編集されたヒトＣＮＳ受容体の編集されていない型をコードするＤＮＡの取り込み、そして（２）培養すると、編集された型の受容体を生成する、ヒトニューロン細胞株の入手; ｂ）編集の調節候補物質の存在下での細胞株の培養；そしてｃ）受容体の編集された型の作成の調節物質の作用の測定。このような細胞株の作成のための宿主細胞として特に適しているのは、ＩＭＲ −３２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２７）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ１０）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣＨＴＢ１１）と呼ばれるヒトニューロン性細胞株である。本発明の１つの実施態様において、選択された宿主は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂ受容体の編集されていない型、又はヒトＥＡＡ３受容体又はヒトＥＡＡ４受容体の編集されていない型をコードするポリヌクレオチドを発現できるように取り込むように形質転換される。形質転換体は培養することにより編集された型のコードされた受容体を発現することは、測定中に使用される条件下で細胞を培養して回収されるメッセージからｃＤＮＡライブラリーを作成し、選択された受容体標的をコードするｃＤＮＡ中の適当な配列の変化により編集を明らかにすることにより、確認される。作成された宿主中で編集活性が確認されれば、次に編集活性を有する選択された調節物質の存在下で宿主をインキュベートし、次に再び培養の間に生成したＲＮＡ転写体からｃＤＮＡライブラリーを作成する。従って、予測された編集部位のｃＤＮＡ配列の変化は、ＣＮＳ受容体編集過程に及ぼす選択された調節物質の作用を明らかにする。以下に本発明の具体的な実施態様を示すが、これらは決して本発明を限定するものと考えてはならない。実施例１ＧｌｕＲ２ＢをコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離以下のＰＣＲプライマーを用いて、ＧｌｕＲ２ＢのゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列の両方を増幅した：これらのプライマーは、ＧｌｕＲ２ＢのｃＤＮＡ配列のコード領域から得られ、図３に記載されている。ＰＣＲ−１プライマー及びＰＣＲ−２プライマーは、それぞれトランスメンブランドメインＩ（ＴＭＩ）の５’のＤＮＡ領域とトランスメンブランドメインII（ＴＭII）の３’領域をコードし、いずれも単一のエキソン中にあり、ＧｌｕＲ２ＢゲノムＤＮＡ（クロンテック（Clontech）から入手した）を増幅するのに使用した。ＰＣＲ−２プライマーはＰＣＲ−３プライマー（これは隣接するコドンの領域をコードする）と組合せて、ＧｌｕＲ２ＢｃＤＮＡ（ストラタジーン（Stratagene）から入手したヒトＺＡＰｃＤＮＡライブラリー）を増幅するのに使用した。ＰＣＲ−３プライマーが隣のエキソンの領域に対応するという事実は、ｃＤＮＡのみが調べられ、ゲノムＤＮＡの混入する断片（これは２つのエキソンの間にイントロンＤＮＡが存在するため、はるかにサイズが大きい）は調べられていないことを確実にしている。ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのＤＮΛ増幅反応混合物は以下よりなる：ＤＮＡ 1 00〜500ng、各プライマー30pmol、各ｄＮＴＰ 0.2mM（10mM ＫＣｌ、10mM 硫酸アンモニウム、20mM トリス−塩酸、ｐＨ8.8、２mM 硫酸マグネシウム、0.1％トリトン中）。最初の35回の増幅サイクルは以下の通りである：94℃で30秒間、55 〜61℃で45秒間、72℃で２分間。この後に72℃で10分間行なった。増幅したＤＮＡをゲル電気泳動を用いて分離し、目的のＤＮＡ断片（すなわち、ゲノムＤＮＡから294塩基対断片とｃＤＮＡから326塩基対断片）をゲルから精製し、プラスミドｐＴ７ブルー（ノバゲン（Novagen）より入手した）中にサブクローニングし、スクリーニングと配列決定を行なった。ゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列の比較により、トランスメンブランIIドメインのコーディング領域中の2134位で１つのヌクレオチドの違いが見つかった。具体的には、ゲノムＤＮＡはＧを有し従ってグルタミン酸をコードし、ｃＤＮＡはＡを有し従つてアルギニンをコードしていた。実施例２ＧｌｕＲ２ＢのＲＮＡ編集の頻度編集の頻度は、実施例１に従って単離したプラスミドＤＮＡを用いて測定した。最初に、ＢｇｌIIで消化してＧｌｕＲ２挿入体（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）の存在を確認した。線状化したプラスミドＤＮＡは、ＧｌｕＲ２挿入体の存在を示す。次に線状化したプラスミドを、編集の有無について試験した。これをＢｂｖＩ（この認識部位は編集されていない配列中に存在する）消化により測定した。従って、編集されていないＤＮＡをＢｂｖｌで消化すると２つの断片が得られ、編集されたＤＮＡをＢｂｖｌで消化すると１つの断片が得られる。編集されたＧｌｕＲ２Ｂと編集されていないＧｌｕＲ２Ｂの頻度は以下の通りである：実施例３ＧｌｕＲ２Ｂ遺伝子のＲＮＡ編集の確認最初にサザンブロット解析を行い、２つの独特のＧｌｕＲ２Ｂ遺伝子が存在するか否かを測定した。分注したヒトゲノムＤＮＡ（８μg）を個々にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ及びＢｇｌII制限酵素（ニュー・イングランド・バイオラボズ（New England Biolabs）より入手した）で消化した。次に消化したＤＮＡを0.7％アガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜に移し、ＵＶで架橋させた。固定したＤＮＡを、精製したＴＭＩ／ＴＭIIエキソンプローブ（すなわち、実施例１からのＰＣＲ−１／ＰＣＲ−２増幅生成物）にハイブリダイズさせ、ランダムプライム法を用いて［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシヤム（Amersham））で標識した。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ（生理食塩水クエン酸ナトリウム）、50％ホルムアルミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、0.5％ＳＤＳおよび100μｇ/mlの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で、42℃で16時間行なった。フィルターを、0.5×ＳＳＣ／0.5％ＳＤＳまで緊縮性を増加させて、60℃で２時間洗浄した後、Ｘ線フィルムに−80℃で48時間露光させた。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩ消化により、ＴＭＩ／ＴＭIIプローブとハイブリダイゼーションさせると１つのバンドが得られた。この結果は、ＴＭＩ／ＴＭII領域中にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩ酵素の認識部位を有さないことが公知の単一のＧｌｕＲ２Ｂ遺伝子の存在を示していた。次に、２つの型のＧｌｕＲ２Ｂ受容体の発現に複数のエキソンが関与しているか否かを決定する必要があった。これは、ゲノムＤＮＡをＢｇｌII制限酵素で消化して行なった。ＴＭＩ／ＴＭIIエキソンはＢｇｌII認識部位を含有する。すなわち、１つのエキソンは２つのバンドを与え、複数の関連エキソンは３つ又はそれ以上のバンドを与えるであろう。２つのバンド（5.5ｋｂと2.2ｋｂ）のみが観察され、異なる型のＧｌｕＲ２Ｂは複数のエキソンの結果ではないことを示していた。分析結果は図４に示す。実施例４編集されていないＧｌｕＲ２Ｂ受容体の発現哺乳動物での一時的発現のために、ヒトＧｌｕＲ２Ｂ受容体をコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩに取り込む。このベクターはインビトロゲン社（Invtrogen Corporation）（サンジエゴ、カリホルニア州、米国；カタログ番号V490-20）から入手できる。これは、真核細胞系でのＤＮＡ発現のために設計された多機能性の4.2ｋｂのプラスミドベクターである。このベクターに取り込まれているのは、ＣＭＶプロモーター及びエンハンサー、スプライス切片及びポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０及びポリオーマ(Polyoma)ウイルス複製開始点、配列決定と突然変異のための１本鎖ＤＮＡをレスキューするためのＭ１３複製開始点、センス及びアンチセンスＲＮＡ転写体の産生のためのＳｐ６及びＴ７ＲＮＡプロモーター、及びＣｏｌＥ１様高コピープラスミド複製開始点である。ポリリンカーは、ＣＭＶプロモーターの下流（及びＴ７プロモーターの３’）に適切に位置する。発現ベクターへのＧｌｕＲ２Ｂ受容体をコードするＤＮＡの取り込みを促進するために、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫｃＤＮＡ挿入体の５’フランク（flank ）にＮｏｔＩ部位を導入し、次にＤＮＡ挿入体を3.4ｋｂのＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩ断片として放出し、これを次にｐｃＤＮＡＩポリリンカーのＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩ部位に導入する。得られたプラスミドを次に、一時的発現のために選択された哺乳動物細胞宿主（この場合、ＣＯＳ−１系統の細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、メリーランド州）より入手できる、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０））中に導入する。ＤＥＡＥ介在ＤＮＡトランスフェクションにより、細胞を10⁶個の細胞当たり８μgのＤＮＡでトランスフェクションし、マニアティス(Maniatis)ら（前述）の方法に従い、クロロキンで処理する。簡単に説明すると、ＣＯＳ−１細胞を５×10⁶細胞／シャーレの濃度で塗布し、ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で24時間増殖させる。次に培地を除き、細胞をＰＢＳで次に培地で洗浄する。次に細胞にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥＡＥデキストラン(0.4mg/ml)、100μＭクロロキン、10％ヌセルム（N uSerum）、ＤＮＡ（0.4mg/ml）を含有するトランスフェクション溶液10mlを適用する。37℃で３時間インキュベートした後、前述のように細胞をＰＢＳと培地で洗浄し、次にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中10％ＤＭＳＯで１分間ショックを与える。 10％ＦＢＳ補足培地で細胞を２〜３日間増殖させ、インキュベートの最後にシャーレを氷の上に置き、冷ＰＢＳで洗浄し、こすって細胞をはがす。1000rpmで10分間遠心分離して細胞を集め、以後のリガンド結合測定法に使用するために、液体窒素中で細胞のペレットを凍結させる。同様の方法で、２つの異なるタイプの細胞（ＣＨＯＫ１とＣＨＯＰｒｏ５）を宿主として使用して、安定にトランスフェクションした細胞株も調製される。これらの細胞株を作成するために、安定な発現を可能にする哺乳動物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン（Invitrogen））にＤＮＡを取り込む。ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルスプロモーターの発現制御を受け、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位とターミネーターの上流にくるように、そして選択性マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０初期プロモーターに支配される）よりなるベクターバックグランド中に、挿入する。前述のように作成したプラスミドを導入するために、宿主ＣＨＯ細胞をまず10 ％ＦＢＳ補足ＭＥＭ培地中５×10⁵個の密度で接種する。24時間増殖させた後、プレートに新鮮な培地を加え、３時間後リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（マニアティス（Maniatis）ら、前述）を用いて細胞をトランスフェクションする。簡単に説明すると、３μgのＤＮＡを混合し、緩衝化カルシウム溶液と室温で10 分間インキュベートする。等量の緩衝化リン酸溶液を加え、懸濁液を室温で15分間インキュベートする。次にインキュベートした懸濁液を細胞に４時間添加し、除去し、15％グリセロールを含有する培地で細胞にショックを与える。３分間後、細胞を培地で洗浄し、通常の増殖条件下で24時間インキュベートする。Ｇ４１８（１mg/ml）を含有する10％ＦＢＳ補足アルファ−ＭＥＭ培地でネオマイシンに耐性の細胞を選択する。約２〜３週間後Ｇ４１８耐性の各クローンを単離し、クローン選択を行い、次に測定のために増殖させる。実施例５リガンド結合測定法凍結状態のトランスフェクションされた細胞を、ハンドホモジナイザーを用いて氷冷した蒸留水に懸濁し、５秒間音波処理し、次に50,000ｇで20分間遠心分離する。上澄液を捨て、膜ペレットを−70℃で凍結して保存する。ＣＯＳ細胞膜ペレットを氷冷した50mMのトリス−塩酸(ｐＨ7.55、５℃)に懸濁し、再び50,000ｇで10分間遠心分離して、結合に競合するであろう内因性グルタミン酸を除去する。ペレットを氷冷した50mMのトリス−塩酸（ｐＨ7.55）に再懸濁し得られた膜調製物を、後述の結合実験のための組織供給源として使用する。結合測定法は、25〜100μｇ（蛋白定量に基づく）に等しい量のＣＯＳ由来の膜と選択された放射標識リガンドを用いて行う。特にＡＭＰＡ結合測定法用に、インキュベーション混合物は、最終容量１ml中で0.1ＭＫＳＣＮと2.5mMＣａＣｌ₂とともに25〜100μgの組織蛋白及びＤ，Ｌ−アルファ−[５−メチル−³Ｈ]アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸（³Ｈ− ＡＭＰＡ、27.6Ci/mmole、最終10nM）よりなる。非特異結合は１mMのＬ−グルタミン酸の存在下で測定される。試料をプラスチックのミニバイアル中で氷の上で 60分間インキュベートし、結合リガンドと遊離リガンドを50,000ｇで30分間遠心分離して分離する。ペレットを４mlの冷インキュベーション緩衝液中で２回洗浄し、次に５mlのベックマンレディ蛋白プラス（Beckman Ready-Protein Plus）シンチレーションカクテルを加えて計測する。実施例６ＧｌｕＲ４をコードするゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの単離別のヒトＣＮＳ受容体、すなわちＧｌｕＲ４受容体（これは同時係属出願中の米国特許出願第07/924,553号に記載）について、実施例１に概略した方法と同様の方法を行なった。ＧｌｕＲ２Ｂについて使用したものと同じ領域のＰＣＲプライマーを調製し、ＧｌｕＲ４ゲノムＤＮＡ（クロンテック（Cl ontech）より入手した）及びｃＤＮＡ（ストラタジーン（Stratagene）よりヒトＺＡＰｃＤＮＡライブラリーで入手した）を増幅するのに使用した。単離したＧｌｕＲ４ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを、配列の差について比較したが、ＧｌｕＲ４ヒトＣＮＳ受容体中に編集が起きたことを示すものはなかった。実施例７ＥＡＡ３とＥＡＡ４をコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離ＥＡＡ３のゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列を増幅するのに以下のＰＣＲプライマーを使用した：増幅−マウスのゲノム構造とヒトｃＤＮＡ配列を用いて、ＥＡＡ３とＥＡＡ４のゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方を増幅するように上記プライマーを設計した。ＥＡＡ３、ＥＡＡ４、及びＥＡＡ５’ｃＤＮＡを増幅するのに、それぞれＰＣＲ５−３／ＰＣＲ５−２６及びＰＣＲ６−１／ＰＣＲ６−３の組合せを使用した。これらのプライマーは別々のエキソン由来であり、従って１つのｃＤＮＡのみが試験され、ｃＤＮＡライブラリーのゲノムＤＮＡの混入の可能性はないことを確認していた。ゲノムＤＮＡは、プライマー組合せ５−２／５−２６及び５ｉｎｔ−３／５ｉｎｔ−１（ＥＡＡ３）；そしてＰＣＲ６−１／ＰＣＲ６−２と６ｉｎｔ−３／６ｉｎｔ−１（ＥＡＡ４）を用いて調べた。ヒトｃＤＮＡは、ヒト小脳（女性、２歳）、海馬（女性、２歳）、側頭皮質（女性、２歳）、黒質（男性及び女性、６０歳）、線条体（尾（caudate）と被殼（putamen）、男性、５７歳）、及び胎児脳（女性、妊娠１７〜１８週）ｃＤＮＡ（ストラタジーン・クローニング・システムズ社（Strata gene Cloning Systems Inc.）、ラホイア（La Jolla）、カリホルニア州、米国；それぞれ、カタログ番号#935201、#936205、#935205、#936210、#936213及び# 936206）のバクテリオファージラムダ（λＺＡＰ）ライブラリーから単離した。これらのライブラリーからのＤＮＡを、基本的にはキアゲン社（Qiagen Inc.）（チャツワース（Chatsworth）、カリホルニア州、米国）ファージＤＮＡ調製プロトコールに従い単離した。ヒトゲノムＤＮＡは、クロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）、パロアルト（Palo Alto）、カリホルニア州、米国）より得た。プライマーの組合せは、前述のようにゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＥＡＡ３とＥＡＡ４を増幅した。正しいサイズのＰＣＲ生成物［ＰＣＲ５−２／ＰＣＲ５−２６（142塩基対）、ＰＣＲ５−３／ＰＣＲ５−２６（315塩基対）、５ｉｎｔ−３／５ｉｎｔ−１（138塩基対）、ＰＣＲ６ −１／ＰＣＲ６−３（474塩基対）、ＰＣＲ６−１／ＰＣＲ６−２（221塩基対）及び６ｉｎｔ−３／６ｉｎｔ−１（127塩基対）］をアガロースゲルから精製し、プラスミドｐＴ７ブルー（ノバゲン社（Novagen Inc.）、マジソン、ウィスコンシン州、米国）中にサブクローニングし、スクリーニングと配列決定を行なった。サザンブロット解析−１つの制限酵素（ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶ）で消化した８μgのヒトゲノムＤＮＡを、0.7 ％アガロースゲルで電気泳動し、次にナイロン膜（シュレイチャー・アンド・シュエル社（Schleicher and Schuell Inc.）、キーン（Keene）、ニューハンプシャー州、米国）に移行させた。紫外線照射により共有結合で架橋させて、ＤＮＡを膜上に固定化した。精製したＰＣＲ６−１／ＰＣＲ６−３（ＥＡＡ４、ＴＭＩ）、６ｉｎｔ−３／６ｉｎｔ−１（ＥＡＡ４、ＴＭII）及び５ｉｎｔ−３／５ｉｎｔ−１（ＥＡＡ３、ＴＭII）ＰＣＲ増幅生成物を、別々にランダムプライム法を用いて［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社（Amersham）、アーリントンハイツ、イリノイ州、米国）で標識し、ゲノムＤＮＡのプローブ結合に使用した。ハイブリダイゼーションは、６×生理食塩水クエン酸（１×ＳＳＣは0.15ＭＮａＣｌ、0.015Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ7.6）、50％ホルムアルミド、５×デンハルツ（Denhart's）溶液、0.5％ＳＤＳおよび100μｇ/mlの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で、42℃で16時間行なった。フィルターを、１×ＳＳＣ／0.5％ＳＤＳまで緊縮性を増加させて、60℃で20分間洗浄した後、Ｘ線フィルムに−80℃で 72時間露光させた。実施例８ＥＡＡ３とＥＡＡ４遺伝子のＲＮＡ編集の確認ＲＮＡ編集測定法−プラスミドＤＮＡを単離し、まず制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングした（図８）。内部の制限部位［ＢｓｔＸＩ（ＥＡＡ３）、ＥｃｏＲＶ（ＥＡＡ４）又はＢａｍＨＩ（ＥＡＡ５）］の存在は、正しい配列を示していた。ＴＭII Ｑ／Ｒ部位の編集の有無は、Ｂｂｖｌ消化により測定した。ＢｂｖＩの認識配列は、^5'GCAGC(N)_8.... ^3'であり、従って編集されていない配列（GCAGC）を切断し、改変された型（GCGGC）には作用しない。Ｑ型対Ｒ型の得られた制限パターンの明瞭な差は、クローンを分類するのに便利な方法を与えた。ＴＭＩＩ／Ｖ及びＹ／Ｃ編集部位は、小ゲノム断片やＴＭＩ部位の代表的な試料のように、ＤＮＡ配列決定により確認した。前記の表は、異なるｃＤＮＡ供給源から増幅されたＥＡＡ３及びＥＡＡ４ｃＤＮＡ中のＴＭＩとＴＭII編集の相対頻度を明らかにしている。評価したｃＤＮＡクローンの数は、その編集状態と組織供給源に従って記載してある。実施例９ＥＡＡ５をコードするゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離別のヒトＣＮＳ受容体、すなわちＥＡＡ５受容体（これは同時係属出願中の米国特許出願第07/945,210号に記載、参考のため本明細書に引用）について、実施例７に概略した方法と同様の方法を行なった。ＥＡＡ４について使用したものと同じ領域のＰＣＲプライマーを調製し、ＥＡＡ５ゲノムＤＮＡ（クロンテック（ Clontech）より入手した）及びｃＤＮＡ（ストラタジーン（Stratagene）よりヒトＺＡＰｃＤＮＡライブラリーで入手した）を増幅するのに使用した。単離したＥＡＡ５ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを、ＴＭＩ/II領域中で予測される配列の差について比較したが、ＥＡＡ５ヒトＣＮＳ受容体中に編集が起きないことを示すものはなかった。しかし、さらに解析すると、ＥＡＡ５ｃＤＮＡの２つの変種が見つかり、これは予測される細胞外アミノ末端領域にアミノ酸置換があった：Ｓｅｒ−３１０→Ａｌａ及びＡｒｇ−３５２→Ｇｌｎ。これらの変種は、Ｔ→Ｇ及びＧ→Ａ置換が関与するＲＮＡ編集に起因させることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月２１日【補正内容】請求の範囲１．ヒトＣＮＳ受容体リガンドを同定する方法であって、ａ）候補リガンドと、編集を受けるタイプの編集されていない第１のヒトＣＮＳ受容体との相互作用を測定することと；ｂ）候補リガンドと、第１の受容体の編集により改変された変種である編集さた第２のヒトＣＮＳ受容体との相互作用を測定することと；そしてｃ）該受容体の１つと選択的に相互作用する候補リガンドを選択すること、又はｄ）該受容体の両方と実質的に等しく相互作用する候補リガンドを選択することとを含むことを特徴とする方法２．前記受容体はヒトＥＡＡ受容体である、請求項１に記載の方法。３．前記ＥＡＡ受容体はヒトＧｌｕＲ２受容体である、請求項２に記載の方法。４．前記ＥＡＡ受容体は図５に定義されたヒトＥＡＡ３受容体である、請求項３に記載の方法。５．前記ＥＡＡ受容体は図６に定義されたヒトＥＡＡ４受容体である、請求項２に記載の方法。６．編集を受けるヒトＣＮＳ受容体の編集されていない形をコードする、単離されたポリヌクレオチド。７．前記受容体はヒトＥＡＡ受容体である、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。８．前記受容体は、ヒトＧｌｕＲ２受容体、図５に定義したヒトＥＡＡ３受容体及び図６に定義したヒトＥＡＡ４受容体から選択されるヒトＥＡＡ受容体の編集されていない形である、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。９．編集された形のヒトＣＮＳ受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記受容体は、Ｖａｌ−５３２、Ｃｙｓ−５３６、及びＡｒｇ−５８６がら選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が組み込まれた形のヒトＥＡＡ４受容体から選択されるポリヌクレオチド。１０．請求項６〜９のいずれか１項に記載の異種ＤＮＡ分子を、その中に発現できるように取り込んでいる細胞。１１．インビボでヒトＣＮＳ受容体の編集を調節する物質を同定するのに有用な方法であって、ａ）（１）編集を受けるヒトＣＮＳ受容体の編集されていない形をコードするＤＮＡを取り込んでおり、且つ（２）培養すると、編集された形の受容体を生成するようなヒトニューロン細胞株を入手することと；ｂ）編集の候補調節物質の存在下で前記細胞株を培養することと；そしてｃ）編集された形の受容体の作成に及ぼす調節物質の作用を測定することと、を含むことを特徴とする方法。１２．前記細胞株は、編集されていない形のヒトＥＡＡ受容体をコードするＤＮＡを取り込んでいる、請求項１１に記載の方法。１３．前記ヒトＥＡＡ受容体はヒトＧｌｕＲ２受容体である、請求項１２に記載の方法。１４．Ｖａｌ−５３２、Ｃｙｓ−５３６、及びＡｒｇ−５８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が組み込まれている、図６に定義した編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。１５．Ｖａｌ−５３２及びＣｙｓ−５３６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が組み込まれている、請求項１４に記載の編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。１６．少なくとも２つの前記アミノ酸が組み込まれている、請求項１４に記載の編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。【手続補正書】【提出日】１９９６年１２月１１日【補正内容】（1）明細書第２５頁第１０行〜第１１行に「形成するが」とある記載を、「形成しないので」と訂正します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ナット、スティーブンオーストリア国、アー − 1030 ウィーン、ドクトル・ボーア − ガッセ７、リサーチ・インスティチューツ・オブ・モルキュラー・パソロジー内

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＣＮＳ受容体リガンドを同定する方法であって、ａ）候補リガンドと、編集を受けるタイプの第１のヒトＣＮＳ受容体との相互作用を測定することと；ｂ）候補リガンドと、第１の受容体の編集により改変された変種である第２のヒトＣＮＳ受容体との相互作用を測定することと；そしてｃ）該受容体の１つと選択的に相互作用する候補リガンドを選択すること、又はｄ）該受容体の両方と実質的に等しく相互作用する候補リガンドを選択することとを含むことを特徴とする方法２．前記受容体はヒトＥＡＡ受容体である、請求項１に記載の方法。３．前記ＥＡＡ受容体はヒトＧｌｕＲ２受容体である、請求項２に記載の方法。４．前記ＥＡＡ受容体はヒトＥＡＡ３受容体である、請求項３に記載の方法。５．前記ＥＡＡ受容体はヒトＥＡＡ４受容体である、請求項２に記載の方法。６．編集されたヒトＣＮＳ受容体の編集されていない形をコードする、単離されたポリヌクレオチド。７．前記受容体はヒトＥＡＡ受容体である、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。８．前記受容体は、ヒトＧｌｕＲ２受容体、ヒトＥＡＡ３受容体及びヒトＥＡＡ４受容体から選択されるヒトＥＡＡ受容体の編集されていない形である、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。９．新規な編集された形のヒトＣＮＳ受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。１０．前記受容体はヒトＥＡＡ受容体である、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。１１．前記受容体は、Ｖａｌ−５３２、Ｃｙｓ−５３６、及びＡｒｇ−５８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が組み込まれた形のヒトＥＡＡ４受容体から選択される、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。１２．請求項６〜１１のいずれか１項に記載の異種ＤＮＡ分子を、その中に発現できるように取り込んでいる細胞。１３．インビボでヒトＣＮＳ受容体の編集を調節する物質を同定するのに有用な方法であって、ａ）（１）編集されたヒトＣＮＳ受容体の編集されていない形をコードするＤＮＡを取り込んでおり、且つ（２）培養すると、編集された形の受容体を生成するようなヒトニューロン細胞株を入手することと；ｂ）編集の候補調節物質の存在下で前記細胞株を培養することと；そしてｃ）編集された形の受容体の作成に及ぼす調節物質の作用を測定することと、を含むことを特徴とする方法。１４．前記細胞株は、編集されていない形のヒトＥＡＡ受容体をコードするＤＮＡを取り込んでいる、請求項１３に記載の方法。１５．前記ヒトＥＡＡ受容体はヒトＧｌｕＲ２受容体である、請求項１４に記載の方法。１６．Ｖａｌ−５３２、Ｃｙｓ−５３６、及びＡｒｇ−５８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が組み込まれている、編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。１７．Ｖａｌ−５３２及びＣｙｓ−５３６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が組み込まれている、請求項１６に記載の編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。１８．少なくとも２つの前記アミノ酸が組み込まれている、請求項１６に記載の編集された形のヒトＥＡＡ４受容体。