WO2016046508A1 - Procédé de criblage de molécules interférentes - Google Patents

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WO2016046508A1
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acid molecule
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Frédéric BIENVENU
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite De Montpellier
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening interfering molecules.
  • RNA interference is based on the fact that small molecules of ribonucleic acids can interact with messenger RNAs. A complex mechanism, controlled by numerous enzymes, leads to the degradation of the messenger RNAs, thus inhibiting the expression of the genes encoding said messenger RNAs and consequently inhibiting the expression of the proteins that result therefrom.
  • RNA species including microRNAs, hairpin RNAs, and are capable of inhibiting the expression of genes, and hence the proteins that result from them, by similar mechanisms.
  • US Pat. No. 8,252,535 describes the use of an artificial sequence comprising a sequence to be targeted complementary to the sequence of a known interfering RNA. This method also makes it possible to simultaneously inhibit RNAs coding for different target genes. However, such a method remains imperfect, and does not particularly make it possible to effectively screen interfering RNAs specific for a natural target.
  • Nucleic acid molecules having a positive effect on gene expression are also known from the state of the art.
  • siRNAs used to activate the genes involved in cell pluripotency.
  • the application WO2006113246A2 describes sRNAs that promote the expression of genes, in particular by binding to promoter regions. However, these molecules have the effect of targeting regulatory sequences but do not specifically target the gene coding sequences.
  • One of the objects of the invention is to provide a method for screening interfering molecules having a better sensitivity.
  • Another subject of the invention relates to a hybrid nucleic acid making it possible to implement a method for screening interfering molecules, this method being more sensitive than those known from the state of the art.
  • Yet another object of the invention is to provide the means to easily and efficiently implement the aforementioned method.
  • the invention relates to a method of screening, in particular in vitro, nucleic acid interfering increasing:
  • genes and / or ribonucleic acids or transcribed RNAs of said genes having at least partly a sequence complementarity with said genes or said RNAs, and
  • said method comprising a step of introducing into a eukaryotic cell, particularly capable of performing RNA interference, a hybrid nucleic acid molecule comprising:
  • a third nucleotide sequence encoding at least one determined peptide, said third sequence being under translational control in cis of the first sequence
  • said first sequence being modified, in particular by substitution or deletion or addition of at least one nucleotide, so that the level of translation of said at least one peptide is reduced by at least 10% relative to the level of translation of said at least one peptide under control of said first sequence in its unmodified version, especially optimal.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that it is possible to screen interfering molecules making it possible to increase the expression of the genes when they are selected by means of a nucleic acid molecule having a d initiation of the modified (non-optimal) translation.
  • RNA interference mechanisms having properties opposite to those widely described and accepted in the state of the art, namely known expression inhibition properties of RNA interference mechanisms. .
  • nucleic acid molecule which comprises a first translation initiation sequence which is not natural, and which differs from said sequence as it can be found in wild eukaryotes (that is to say not having a mutation at said level); sequence of initiation of the translation).
  • translation initiation sequence is understood to be the sequence of nucleic acids present in the genes and in the messenger RNAs which results therefrom, and which surrounds the ATG initiation codon. This sequence is more commonly known as Kozak sequence.
  • the term "optimal" means the maximum translation level operating for a given gene in a given cell type and in a given culture condition.
  • the optimal level of translation is the maximum level of production of a protein by an RNA under the control of said translation initiation site where the loading of the first amino acid imported by the Methionine initiator transfer RNA takes place.
  • the cell is understood to be unable, in the natural physiological state, to produce more protein for a given RNA than its optimal level.
  • the expression “increasing the expression of genes” is understood to mean any modification which has the consequence of obtaining an amount of protein coded by said gene that is higher than the quantity of protein obtained without modification. Also, in the presence of an interfering nucleic acid according to the invention, the protein product of a gene (targeted by said nucleic acid interfere) will be more abundant than the protein product of the same gene in the absence of a nucleic acid interfere targeting said gene, or in the presence of an interfering nucleic acid targeting another gene.
  • This definition of "increasing gene expression” is a conventional definition used by those skilled in the art.
  • interfering molecules are understood to mean nucleic acid molecules capable of regulating the expression of genes by means of RNA interference.
  • One of the examples of interfering molecules covered by the invention are therefore the small interfering RNAs (siRNAs for Small Interfering RNA), the micro RNAs (miRNAs for "micro RNA”), or the small RNAs in the hairpin (shRNA for "short”). hairpin RNA ").
  • SiRNAs are small double-stranded RNAs of 21 to 24 nucleotides.
  • the small double-stranded interfering RNAs are recognized in the cytoplasm of the cell by a protein complex called RISC complex (for RNA inducing silencing complex).
  • This activated complex will recognize its target transcript, a messenger RNA, by complementarity of the nucleic bases. This recognition system ensures the high specificity of this mechanism.
  • the Argonaute protein, part of the RISC complex can cut the transcript at the recognition site. Ago can therefore act as an endonuclease. The two pieces of the Ago cleaved transcript will be rapidly degraded via their ends by exonucleases.
  • MiRNAs are single-stranded RNAs capable of forming double-stranded structures by base pairing. During RISC formation there is a transition from double stranded miRNA to single stranded miRNA. Only the specific strand of the miRNA target messenger RNA is conserved within the complex. The target mRNA is then loaded into the RISC complex. Two inhibition routes are then possible, either the degradation of the target mRNA if the complex contains the Ago2 protein, or the repression of the translation of the latter if the complex contains the Ago1 protein.
  • ShRNAs are RNAs that adopt a stem and loop structure that may be involved in the RNA interference phenomenon. After management by the RISC complex, the sense strand is degraded. The antisense strand directs the RISC complex to mRNAs having a complementary sequence. The mechanism of degradation is then similar to that operated by the siRNAs.
  • interfering nucleic acids having at least partly a sequence complementarity with said gene or said RNA means that the interfering nucleic acids to be screened are firstly selected on the one hand to be at least partially complementary to the sequence of a gene, or the messenger RNA that it encodes, so that the screening is specific.
  • the interfering nucleic acids can not be completely complementary to the sequence of the gene they target, insofar as they have a size, in number of nucleotides, lower than that of the targeted gene.
  • hybrid nucleic acid molecule means a molecule nucleic acid hybrid which is composed of at least two nucleic acid fragments that are not adjacent in nature. This hybrid molecule does not exist in the natural state.
  • Said hybrid nucleic acid molecule comprises at least three sequences:
  • a first non-coding sequence intended to initiate the translation or more commonly called a translation initiation sequence.
  • This sequence is modified, that is to say that it has at least one different nucleotide compared to the same sequence observed in the general population,
  • a third nucleotide sequence coding for at least one determined peptide, this peptide possibly corresponding to an immunogenic tag, or tag, or to a functional protein exhibiting an enzymatic activity or to a protein having luminescent or fluorescent properties.
  • the second sequence is contained in the third sequence.
  • the third sequence which codes for said at least one determined peptide comprises part of its sequence which is at least partly complementary to the sequence of said interfering nucleic acids to be screened.
  • the second sequence corresponds to a part of the third sequence both coding a part of the determined peptide, or, on the other hand, that the determined peptide is "hybridized", that is to say that it is encoded by a sequence in which an exogenous sequence (the second sequence) has been introduced.
  • the determined peptide will comprise a part of its nucleic acid sequence which is not naturally included in the sequence of said determined peptide.
  • the second and third sequences are identical. This is particularly the case when the sequence coding for the determined peptide is also wholly partly complementary, or completely complementary, to the nucleic acid interfering with which to be screened. This is particularly the case of the sequence encoding the FLAG tag. If an interfering molecule increasing the expression of the tag is searched for, the nucleic acid sequence encoding the FLAG tag is placed downstream of the first sequence and the hybrid nucleic acid molecule is then composed of three sequences. (which in fact represent only two), the second and third being completely confused, or identical. In the hybrid nucleic acid molecule, there is a functional control of the third sequence by the first sequence, this control being exercised in cis which means that the control is done when both sequences are carried by the same molecule.
  • the first sequence of the hybrid molecule is modified so that the translation of said at least one peptide is decreased by at least 10% relative to the level of translation of said at least one peptide under control of said first sequence in its unmodified version, especially optimal.
  • a eukaryotic cell comprising a hybrid nucleic acid molecule having no first modified sequence will express at least 10% more determined peptide (encoded by the third sequence) that the same eukaryotic cell comprising a hybrid nucleic acid molecule having said first modified sequence.
  • the sequences of the interfering nucleic acids and the second sequence of the hybrid nucleic acid molecule are at least partially complementary, according to the complementarity of bases A-T / AU and GC, well known to those skilled in the art.
  • the term "at least partly complementary” means that the vast majority of nucleotides that make up the interfering nucleic acids to be screened are complementary to the nucleotides that define the second sequence of the hybrid nucleic acid molecule.
  • the nucleotides of the interfering nucleic acids to be screened and those which make up the second sequence of the hybrid nucleic acid molecule to be more than 90% complementary, advantageously more than 95%, in particular more than 99% especially 100%, or in other words that the two molecules have less than 10%, preferably less than 5%, especially less than 1%, in particular 0% mismatches.
  • the second sequence of the interfering nucleic acid molecule is composed of about 20 nucleotides, it is particularly advantageous that the complementarity is total.
  • the invention is indeed based on this surprising finding made by the inventors according to which a modification of the translation initiation sequence allows a weaker expression of the determined peptide, which serves as a marker, and thus makes it possible to visualize more precisely the expression variation, in particular the increase in expression, when the efficacy of an interfering nucleic acid is tested.
  • a first step which consists in the transformation of eukaryotic cells able to carry out RNA interference, by well-known techniques of the state of the art of transfection, of a hybrid nucleic acid molecule. This may include electroporation, calcium phosphate transformation, lipofection, viral infection, or nucleofection. These examples of transformation of eukaryotic cells are given for information only, and can not limit the scope of the invention.
  • the aforementioned cells are ready to be used for the screening of interfering nucleic acids. It may be advantageous to have stably transformed cells (that is to say cells having integrated into their genome said hybrid nucleic acid molecule) in order to be able, by simple cell culture, always use the same transformed cell. .
  • the cell or cells transformed in the previous step are again transformed by conventional means well known to those skilled in the art, in order to introduce into said cells said interfering nucleic acids to be screened.
  • the cells thus transformed with, on the one hand, the hybrid nucleic acid molecule and a population of a nucleic acid that interferes with screening, are cultured, in a third step, to allow the implementation of the interference process.
  • RNA for a specified time that one skilled in the art, with his general knowledge of RNA interference can easily determine depending on the type of cell used.
  • the cells are then, in a fourth step, analyzed in order to measure the level of expression, that is to say the presence, the absence or the quantity of said determined peptide encoded by said molecule of hybrid nucleic acids.
  • This presence, absence or quantity of determined peptide is evaluated in comparison with the quantity of said same determined peptide expressed by said cells transformed with said hybrid nucleic acid molecule, but which has not been transformed with interfering nucleic acids to be screened, or which has been transfected with interfering nucleic acids that have no target (i.e., complementary sequences) in the hybrid nucleic acid molecule.
  • the amount of peptide determined in the cells transformed with an interfering nucleic acid is less than or equal to or less than 10% of the amount of the peptide in cells that have not been transformed with any nucleic acid interfere, or which have been transfected with interfering nucleic acids that have no target (i.e., complementary sequences) in the hybrid nucleic acid molecule, said interfering nucleic acid will not be retained.
  • the amount of peptide determined in the cells transformed with an interfering nucleic acid is at least 10% greater than the amount of the peptide in cells which have not been transformed with any interfering nucleic acid, or which has been transfected with acids interfering nuclei that have no target (i.e., complementary sequences) in the hybrid nucleic acid molecule, then said interfering nucleic acid will be retained because it exerts an activating effect on the expression or the activity of the gene that it targets.
  • the peptide itself has autofluorescent properties, it is possible to measure its amount directly from living cells, in particular by flow cytometry.
  • the hybrid nucleic acid molecule via the third sequence, to encode at least two peptides which are capable of effecting an energy transfer between fluorescent molecules or FRET.
  • the third sequence encodes at least two peptides capable of producing FRET, it is possible to measure the amount of peptide expressed, and therefore the effect of the nucleic acid, interfere directly on the living cells transformed with the Hybrid nucleic acid molecule, whether or not transformed by a nucleic acid, interferes by measuring the fluorescence emission resulting from the energy transfer.
  • the method according to the invention is a method for screening interfering nucleic acids increasing:
  • a third nucleotide sequence encoding at least one determined peptide, said third sequence being under translational control in cis of the first sequence
  • said first block being modified, by substitution, deletion or addition of at least one nucleotide, so that the level of translation of said at least one peptide is reduced by at least 10% relative to the level of translation of said at least one peptide under control of said first sequence in its unmodified version, especially optimal,
  • This method makes it possible to conclude that if the level of expression of said at least one peptide is 10% greater than the level of expression of said peptide expressed by a eukaryotic cell obtained in step 1, but which is not converted with any acid nucleic interfering, or an interfering nucleic acid exhibiting no sequence complementarity with the second sequence of said hybrid nucleic acid molecule, the interfering nucleic acid which has allowed this expression increase of more than 10% is a nucleic acid interfering of interest according to the invention.
  • the interfering nucleic acid tested is not preserved because it does not have the properties of increasing the expression or the activity of the targeted gene.
  • the hybrid nucleic acid molecule may be either a ribonucleic acid (RNA) or a single or double-stranded deoxyribonucleic acid (single-stranded DNA or double-stranded DNA).
  • RNA ribonucleic acid
  • deoxyribonucleic acid single-stranded DNA or double-stranded DNA.
  • the hybrid nucleic acid molecule is a deoxyribonucleic acid molecule.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak translation initiation sequence downstream of either an internal ribosome or IRES entry site, or an RNA cap (5).
  • 'CAP Kozak translation initiation sequence downstream of either an internal ribosome or IRES entry site, or an RNA cap (5).
  • the initiation of the translation takes place thanks to the presence of a Kozak sequence.
  • the ribosomes and all the translation machinery are "loaded” on the messenger RNA.
  • Such "loading” is performed using either an RNA cap (5'CAP) or using an internal ribosome entry sequence or IRES.
  • These sequences (5'CAP / IRES) have also the ability to stabilize the messenger RNAs to which they are loaded, or even to export the messenger RNAs to their translation sites.
  • RNA cap is a modified nucleotide found at the 5 'end of messenger RNAs in eukaryotic cells. It is a post-transcriptional modification that is introduced by the successive action of several enzymes located in the nucleus.
  • the cap consists of a methylated guanosine at the N7 position, connected to the first nucleotide of the messenger RNA transcribed by a 5'-5'-triphosphate linkage.
  • IRES allow the direct recruitment of ribosomes at the initiator codon, regardless of the presence of the cap and the scanning mechanism. IRES are structured regions of mRNA that interact directly with the ribosome or with translation initiation factors.
  • the invention relates to the method defined above, wherein the nucleic acid molecule comprises said first sequence positioned upstream, or in position 5 ', of said third sequence.
  • the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule In order to coordinate the cis regulation of the third sequence, it is advantageous for the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule to be positioned upstream of the third sequence encoding the determined peptide.
  • the first and third sequences can thus be directly linked, or adjacent, but can also be separated by another sequence whether it is the second sequence or any other sequence.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said second sequence is positioned,
  • the invention relates to the process as defined above, wherein said nucleic acid molecule is a molecule of deoxyribonucleic acids, in particular double-stranded, optionally contained in a vector, or a ribonucleic acid molecule, especially single-stranded.
  • the hybrid nucleic acid molecule is introduced into a eukaryotic cell.
  • This hybrid nucleic acid molecule may be introduced in different forms into said eukaryotic cell, namely:
  • the hybrid nucleic acid molecule comprises, in addition to the three sequences mentioned above, a sequence allowing the transcription of an RNA
  • a DNA vector comprising said hybrid nucleic acid sequence
  • this vector comprising means allowing transcription of the hybrid nucleic acid molecule, in particular a promoter and, incidentally, a transcription enhancing sequence (enhancer).
  • the vector may then be a circular vector, and may include an origin of eukaryotic or viral replication so that it can replicate autonomously, or a linearized vector to stimulate its integration into the eukaryotic cell. It is furthermore advantageous that said vector comprises one or more protein coding sequences making it possible to select the cells which have integrated into their genome said vector, for example, and without being limiting,
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak sequence represented, in its unmodified version, by the following sequence:
  • R represents a purine
  • s represents G or C
  • m represents A / U or C.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule which must be modified by deletion or deletion or insertion of at least one nucleotide.
  • the invention relates to a method as defined above, in which
  • hybrid nucleic acid molecule is a molecule of acids deoxyribonucleic acid, in particular double-stranded
  • said first sequence in its unmodified version is represented by the following sequence: 5'-ssmRccATGG -3 '(SEQ ID NO: 2), or
  • said first sequence in its unmodified version, is represented by the following sequence: 5'-ssmRccAUGG -3 '(SEQ ID NO: 3 ).
  • sequence SEQ ID NO: 2 covers the following different sequences:
  • sequence SEQ ID NO: 3 covers the following different sequences:
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, in its modified version, one of the following sequences:
  • the inventors have surprisingly found that the insertion of the doublet A (T / U) before the initiator codon of the translation of the Kozak sequence, or the G-> T substitution, after the initiator codon of the translation of the Kozak sequence. had an effect on the translation efficiency of any sequence under control of these mutated Kozak sequences.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, in its modified version:
  • deoxyribonucleic acids in particular double-stranded, any one of the following sequences:
  • hybrid nucleic acid molecule is a molecule of ribonucleic acids, in particular single-stranded, any one of the sequences
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, as modified in any one of SEQ ID NOs: 38 to 101. Still more advantageously, the invention relates to the aforementioned method, wherein said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, as modified in any one of the sequences: SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 100.
  • said method comprising a step of introducing into a eukaryotic cell, particularly capable of performing RNA interference, a hybrid nucleic acid molecule comprising:
  • a first non-coding sequence intended to initiate the translation, said first sequence comprising or consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, said first sequence being modified,
  • said first modified sequence comprising or consisting of any one of SEQ ID NO: 38 to 101, and in particular SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 100.
  • the invention relates to a method for screening nucleic acid interfering increasing:
  • said method comprising a step of introducing into a eukaryotic cell, particularly capable of performing RNA interference, a hybrid nucleic acid molecule comprising:
  • a third nucleotide sequence encoding at least one determined peptide, said third sequence being under translational control in cis of the first sequence
  • said first modified sequence comprising or consisting of any one of SEQ ID NO: 38 to 101, and in particular SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 100.
  • the invention also relates more advantageously to the aforementioned method, wherein said second sequence comprises from 18 to 10,000 nucleotides at least partly complementary to the sequence of said interfering nucleic acids to be screened, in particular from 18 to 1000, in particular from 18 to 500, more particularly from 18 to 100 consecutive nucleotides at least partly complementary to the sequence of said interfering nucleic acids to be screened.
  • An advantageous size of the third sequence is from 18 to 500 nucleotides, which means that the sequence can comprise 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,
  • the invention relates to a method as defined above, wherein said at least one peptide is a natural or recombinant protein, labeled or not, including an autofluorescent protein.
  • the third sequence therefore encodes one or more peptides, and especially one or more proteins that can be labeled with immunogenic peptides such as FLAG, HA, V5, MYC, HIS tags, or labeled with proteins.
  • fluorescents such as GFP, PSC, RFP, mCherry ... This list is not exhaustive and can not limit the scope of the invention.
  • the peptides used are the eGFP encoded by the sequence SEQ ID NO: 102, the murine cyclin D1 (CD1) encoded by the sequence SEQ ID NO: 103, the murine Hras protein encoded by the sequence SEQ ID NO: 104 or export 1 (XPO) encoded by the sequence SEQ ID NO: 105.
  • the advantageous labels are as follows: the Flag tag encoded by the sequence SEQ ID NO: 106, the HA tag encoded by the sequence SEQ ID NO: 107, the Ntag tag encoded by the sequence SEQ ID NO: 108, the V5 tag encoded by the sequence SEQ ID NO: 109, the Myc tag encoded by SEQ ID NO: 110, or the tag Ctag encoded by the sequence SEQ ID NO: 111.
  • labeled peptides that can be used in the context of the invention are in particular: Myc-XPO encoded by the sequence SEQ ID NO: 112, XPO-V5 encoded by the sequence SEQ ID NO: 113, coded Myc-XPO-V5 by the sequence SEQ ID NO: 114, Ha-CD1 encoded by the sequence SEQ ID NO: 115
  • the invention further relates to a hybrid nucleic acid molecule comprising:
  • a second sequence at least partially complementary to at least one nucleic acid interferes
  • a third nucleotide sequence encoding at least one determined peptide, said third sequence being under translational control in cis of the first sequence
  • said first sequence being modified, by substitution, deletion or addition of at least one nucleotide, so that the level of translation of said at least one peptide is decreased by at least 10% relative to the level of translation of said at least one peptide under control of said first sequence in its unmodified version, especially optimal.
  • hybrid nucleic acid molecules are new and do not exist in the natural state because they are artificial molecules consisting of fragments of molecules from different origins and genomic locations.
  • the invention relates to a hybrid nucleic acid molecule as defined above, wherein said first sequence is a Kozak type transcription initiation sequence, downstream of an internal ribosome entry site. or 1RES, or a cap (5'cap).
  • the invention relates to a hybrid nucleic acid molecule mentioned above, wherein said first sequence is a Kozak sequence represented, in its unmodified version, by the sequence next :
  • R represents a purine
  • s represents G or C
  • m represents A / U or C.
  • the invention relates to a hybrid nucleic acid molecule mentioned above, wherein said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, in its unmodified version, one of the following sequences: SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 35.
  • the invention relates to a hybrid nucleic acid molecule as defined above, wherein said first modified sequence is chosen from:
  • nucleic acid molecule hybridizes a molecule of deoxyribonucleic acids, in particular double-stranded, any one of SEQ ID NO: 38 to 69, and
  • nucleic acid molecule hybridises a molecule of ribonucleic acids, in particular a single-stranded acid, any one of the sequences SEQ ID NO:
  • the invention relates to a hybrid nucleic acid molecule defined above, said nucleic acid molecule being chosen from the molecules of the following sequence: SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126 , SEQ ID NO: 127 and SEQ ID NO: 128.
  • CGCGCCATatgg actacaaggacg acg atg acaag ctcg atg g agg ataccccta 120 cgacgtgcccgactacgccggaggactcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTG mKoz-AT- CGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCT Ntag-mCD1 CCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGA
  • the first sequence in its mutated version, is indicated by a frame.
  • hybrid nucleic acid molecule illustrate, in a nonlimiting manner, the various possibilities covered by the invention, and for example:
  • the first sequence is framed, the second sequence is 3 'of the first sequence, and the third sequence is 5' of the first sequence.
  • This hybrid nucleic acid molecule ideally makes it possible to select nucleic acids which increase the expression of the FLAG peptide.
  • the first sequence is framed, the second sequence is 3 'of the first sequence, and the third sequence is 3' of the second sequence.
  • This hybrid nucleic acid molecule ideally allows the selection of nucleic acids increasing the expression of the HA or FLAG peptide, respectively.
  • the second and the third sequence can be superimposed, that is, a part of the second sequence corresponds to the third sequence.
  • the hybrid nucleic acid molecules as illustrated by the sequences SEQ ID NOs: 116 to 128 thus also make it possible to select interfering nucleic acids against the cyclin D1 protein, murine or human, or the Ras protein.
  • the above-mentioned hybrid nucleic acid molecule is contained in a vector, in particular a eukaryotic vector.
  • the vectors consist essentially of the following sequences: pBABE, in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 129 or 130 or MSCV, in particular represented by the sequence SEQ ID NO: 131.
  • the invention relates to a eukaryotic cell comprising at least one hybrid nucleic acid molecule as defined above.
  • the invention also relates to an animal, in particular a mammal, in particular a rodent comprising at least one hybrid nucleic acid molecule as defined above.
  • the invention embraces any type of eukaryotic cell capable of RNA interference.
  • eukaryotic cell capable of RNA interference.
  • One of ordinary skill in the art with his general knowledge of eukaryotic cells cultured in vitro, is able to easily identify the appropriate cells and to determine transformation or transfection methods for introducing the nucleic acid molecule defined above.
  • the invention further relates to an intermediate hybrid nucleic acid molecule comprising:
  • a third nucleotide sequence encoding at least one determined peptide, said third sequence being under translational control in cis of the first sequence, as defined above,
  • said first sequence being modified, by substitution, deletion or addition of at least one nucleotide, so that the level of translation of said at least one peptide is decreased by at least 10% relative to the level of translation of said at least one peptide under control of said first sequence in its unmodified version, especially optimal.
  • the invention relates to the abovementioned molecule in which said first sequence is a Kozak sequence represented, in its unmodified version, by the following sequence:
  • R represents a purine
  • s represents G or C
  • m represents A / U or C
  • said first sequence is a Kozak sequence comprising or consisting of, in its modified version, one of the following sequences: SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • This intermediate hybrid nucleic acid molecule is in fact the basic structure of the abovementioned hybrid nucleic acid molecule, said at least one restriction enzyme cleavage site permitting the cloning of said second sequence according to the gene for which it is present. It is desirable to screen for interfering nucleic acids increasing the expression of said gene and / or the activity of said gene and / or transcribed ribonucleic acids of said gene.
  • the invention also relates to the use of at least one nucleic acid molecule as defined above, for the screening, in vitro in particular, of interfering nucleic acids increasing the expression of genes and / or the activity of genes and / or transcribed ribonucleic acids of said genes.
  • the invention furthermore relates to a kit, or a kit, comprising:
  • At least one eukaryotic cell at least one eukaryotic cell.
  • a kit or kit according to the invention may also comprise:
  • a kit or kit according to the invention may also comprise:
  • o at least one eukaryotic cell capable of RNA interference.
  • the transformation means used can be means for transforming eukaryotic cells such as means for transforming calcium phosphate cells, means for transforming with liposomes, means of transformation with polycationic agents or transformation means. by electrolocation or nucleofection.
  • the invention also relates to a kit or a kit comprising:
  • At least one hydride nucleic acid molecule as defined above said molecule being contained in a eukaryotic cell, and
  • Figure 1 schematically describes the different types of hybrid nucleic acid molecules described in the invention.
  • 1 schematically represents the first sequence
  • 2 schematically represents the second sequence
  • 3 schematically represents the third sequence
  • 3 * represents the third sequence in which the second sequence was inserted
  • n represents a sequence which is neither the first nor the second nor the third sequence.
  • FIG. 2 represents the diagrams resulting from the sequencing of the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule having a first non-mutated sequence (top diagram) and the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule having a first mutated sequence pat an insertion of an AT dinucleotide, indicated by the eclipsed (top diagram).
  • Figure 3 shows the alignment of the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 120 with the sequences of interfering nucleic acid molecules tested. The sequence numbers (SEQ ID) are indicated.
  • FIG. 4 represents a western blot made from cells possessing the hybridized nucleic acid molecule SEQ ID NO: 120 and transfected with the siRNAs SEQ ID NO: 138 (1), SEQ ID NO: 140 (3), SEQ ID NO: 142 (5), SEQ ID NO: 144 (7), control SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 150 (F3), SEQ ID NO: 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) or SEQ ID NO: 154 (FM).
  • the proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.). In control, the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • FIG. 5 represents a western blot made from cells having the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 120 not transfected (-) or transfected with the control siRNAs SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 146 (FN),
  • CT The proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.). In control, the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • Figures 6A and 6B show the comparison of the effect of the mutation of the first sequence of the hybrid nucleic acid molecule.
  • FIG. 6A represents a western blot made from cells possessing the Hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 136 transfected with control siRNAs SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 150 (F3) or SEQ ID NO: 154 (FM).
  • the proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.).
  • the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • FIG. 6A represents a western blot made from cells having the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 120 transfected with the control siRNAs SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 150 (F3) or SEQ ID NO: 154 (FM).
  • the proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.).
  • the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • FIG. 7 represents a histogram of FRET results representing the amount of expression of CD1 in cells having the sequence SEQ ID NO: 1 transfected with one of the following siRNAs: SEQ ID NO: 146 (B), SEQ ID NO : 147 (C), SEQ ID NO: 148 (D), SEQ ID NO: 149 (E), SEQ ID NO: 150 (F), SEQ ID NO: 151 (G), SEQ ID NO: 152 (H) , SEQ ID NO: 153 (I), SEQ ID NO: 155 (J), SEQ ID NO: 156 (K), SEQ ID NO: 154 (L), SEQ ID NO: 137 (M), SEQ ID NO: 138 (N), SEQ ID NO: 139 (O), SEQ ID NO: 140 (P), SEQ ID NO: 141 (Q), SEQ ID NO: 142 (R), SEQ ID NO: 143 (S), SEQ ID NO: 144 (T) or SEQ ID NO: 145 (U), relative to cells having the sequence SEQ
  • siRNAs that increase the expression are indicated by an arrow.
  • Figure 8 shows a western blot made from cells having the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 121 and transfected with the siRNA SEQ ID NO: 139 (2), SEQ ID NO: 140 (3), SEQ ID NO: 142 (5), SEQ ID NO: 144 (7), control SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 150 (F3), SEQ ID NO: 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) or SEQ ID NO: 154 (FM).
  • the proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.).
  • the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • Figure 9 shows a western blot made from cells having the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 121 and transfected with siRNA SEQ ID NO: 139 (2), SEQ ID NO: 140 (3), SEQ ID NO: 142 (5), SEQ ID NO: 144 (7), control SEQ ID NO: 161/162 (T.), SEQ ID NO: 150 (F3), SEQ ID NO: 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) or SEQ ID NO: 154 (FM).
  • the proteins are revealed with an anti-HA antibody (B.).
  • the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (A.).
  • FIG. 10 represents a FRET results histogram representing the amount of CD1 expression (in arbitrary units) in cells having a construct with murine Kozak sequence (A), murine Kozak sequence mutated by AT insertion (B), or optimized Kozak sequence (C).
  • the error bars indicate the standard deviation obtained for three independent experiments.
  • Figure 11 shows a western blot made from cells having a construct with murine Kozak sequence (A), murine Kozak sequence mutated by AT insertion (B), or optimized Kozak sequence (C).
  • the level of cyclin D1 is revealed with an anti-cyclin D1 antibody (1.RB-010-PABX (AB3), Fisher scientific).
  • the protein charge is revealed with an anti-actin antibody (2. ab6276, Abcam).
  • Figure 12 shows a histogram showing the abundance of D1 cyclin messenger RNAs in cells with a murine Kozak sequence construct (A), the AT-insert mutated murine Kozak sequence (B), or the optimized Kozak sequence (C). .
  • FIG. 13 represents a FRET results histogram representing the amount of CD1 expression (in arbitrary units) in cells having one of the following constructs:
  • N1-tagged cyclin D1 under control of murine Kozak of cyclin D1 having an AT insertion (Ntag-mKozAT); black bars,
  • siRNA SEQ ID NO: 149/150 B
  • siRNA SEQ ID NO: 155 C
  • siRNA SEQ ID NO: 154 D
  • siRNA SEQ ID NO: 142 C
  • Example 1 Example of a construction of a hybrid nucleic acid molecule comprising the first sequence SEQ ID NO: 37 (AT insertion).
  • the inventors have used a strategy of directed mutagenesis by introducing into the sequence Kozak SEQ ID NO: 9 an AT-diphenucleotide, by PCR, using the GeneArt® kit (Life technology), according to the instructions of the supplier.
  • the insertion is done using the template vector comprising the sequence SEQ ID NO: 9 and sense and antisense oligonucleotides containing the AT mutation / insertion:
  • PCR polymerase chain reaction
  • Step 2 PCR / mutagenesis
  • FIG. 2 shows the results of the sequencing.
  • Example 2 Construction example of a hybrid nucleic acid molecule comprising the first sequence SEQ ID NO: 36 (substitution G-> T).
  • This method makes it possible to rapidly transfect the cells transiently with the hybrid nucleic acid constructs.
  • the transfection is performed according to the instructions of the supplier.
  • b- Viral infection after production of viruses containing the constructs of interest In order to obtain cells which stably express a hybrid nucleic acid molecule according to the invention, the inventors have taken advantage of the viral infection.
  • the protocol used is the following:
  • HSB 2x medium is prepared as follows: dissolve 0.8 g of NaCl, 0.027 g of Na2HP04 "2:20, and 1 .2 g of HEPES in a volume of 90 ml of distilled water.
  • the mixture is left at room temperature for 20 to 30 minutes with occasional gentle agitation.
  • the mixture is then added to the culture medium and the cells were incubated at 37 ⁇ overnight.
  • Day 3 the morning of the third day, about half of the middle is changed. The medium is then kept at 4 ⁇ ⁇ . The operation is repeated every 6 hours and the supernatant stored at 4 ° C. In the evening, the supernatants are mixed and optionally centrifuged at 1000 rpm overnight.
  • Day 4 The viruses are recovered, and the medium is changed three times in the day to maintain the infectious viruses.
  • Day 5 the viruses are filtered on a 0.45 ⁇ filter and used to infect NIH3T3 cells for 1 to 2 hours in a volume of 1.5 to 2 mL comprising 8 ⁇ g / mL of polybrene. Then 10 ml of medium is added and the cells are incubated overnight. Day 6: the medium is changed with 10 mL of fresh medium.
  • Days 8 and 9 the cells are then analyzed by flow cytometry to test the expression of fluorescent proteins.
  • the cells are then infected with the molecule.
  • Example 4 Screening Example of Interfering Nucleic Acid Molecules Increasing Gene Expression and / or Activity of Transcribed Gene and / or Ribonucleic Acid of said Genes
  • stable cells expressing the hybrid nucleic acid construct are maintained in subconfluent culture at 37 ° C, 5% CO 2 in an incubator.
  • the stock cells expressing the hybrid construct are treated with trypsin to be detached from the culture support and seeded in 24-well plates in order to reach a confluence of adherent cells of 40 to 80% on the evening.
  • siRNAs to be tested are prepared according to the Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Life Technologies) protocol. Briefly, 1, 5 ⁇ of Lipofectamine® is diluted in 25 ⁇ of OPTI-MEM® medium. In parallel, 5 pmol of siRNA in ⁇ , ⁇ of sterile water are diluted in 25 ⁇ of OPTI-MEM® medium. The two OPTI-MEM® solutions are then mixed and incubated for 5 minutes at room temperature.
  • the protein lysates of the various conditions tested are then normalized by means of quantification of DNA or proteins, in order to compare an equivalent total quantity of material resulting from the different treatment conditions.
  • the standardized lysates are then analyzed in western blot using an antibody specific for the translation product of the hybrid construct, or in FRET, or fluorescence if the translation product of the hybrid construction allows it.
  • the inventors have performed a screening of interfering molecules according to the invention by using the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 220.
  • the first sequence is CGCGCCATatgg (SEQ ID NO: 62 )
  • siRNA interfering nucleic acids
  • HA linker Nter GAGCUACCUCCUAUGGGGAUG (SEQ ID NO: 137),
  • HA AUGCUGCACGGGCUGAUGCGG (SEQ ID NO: 138),
  • HA 2 GGGAUGCUGCACGGGCUGAUG (SEQ ID NO: 139),
  • HA 3 AUGGGGAUGCUGCACGGGCUG (SEQ ID NO: 140),
  • HA 4 UGGGGAUGCUGCACGGGCUGA (SEQ ID NO: 141),
  • HA 5 GGGGAUGCUGCACGGGCUGAU (SEQ ID NO: 142),
  • HA 6 GGAUGCUGCACGGGCUGAUGC (SEQ ID NO: 143),
  • HA 7 GAUGCUGCACGGGCUGAUGCG (SEQ ID NO: 144),
  • HA Linker Cter AGCCGGCGACCUCCUAUGGGG (SEQ ID NO: 145),
  • FLAG N2 UUCCUGCUGCUACUGUUCGAG (SEQ ID NO: 147),
  • FLAG V2 CUGAUGUUCCUGCUGCUACUG (SEQ ID NO: 149),
  • FIG. 3 shows the alignment of the different interfering nucleic acids (siRNA) tested on the sequence of the SEQ ID molecule.
  • siRNA tranfection control negative control siRNAs ("scramble", T.) are also transfected. These siRNAs have the following sense sequence: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 '(SEQ ID NO: 161) and the complementary strand has the following sequence: 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO: 162).
  • the inventors used the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO 118.
  • hybrid nucleic acid molecule having a first mutated sequence makes it possible to screen interfering nucleic acid molecules by comparing the effect of an interfering nucleic acid on the presence of an acid molecule.
  • hybrid nucleic nuclei having a first non-mutated sequence SEQ ID NO: 136.
  • the FLAG M siRNA (SEQ ID NO: 154) makes it possible to detect an increase in the level of expression of CD1 only when the hybrid nucleic acid molecule comprises a mutation in its first sequence (FIG. 6A), but not when the first sequence is not mutated (Figure 6B).
  • the inventors have performed a screening of interfering molecules according to the invention by using the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 121.
  • the first sequence is CCAGCCATGt (SEQ ID NO: 52).
  • siRNA transfection control the negative control siRNAs ("scramble", T.) are also transfected. These siRNAs have the following sense sequence: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 '(SEQ ID NO: 161) and the complementary strand has the following sequence: 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO: 162).
  • Flag M siRNA makes it possible to detect an expression level of the CD1 marker peptide that is higher than the level observed with a non-relevant control. The same results are thus observed as those obtained for the hybrid nucleic acid molecule SEQ ID NO: 120.
  • the inventors have confirmed that only a hybrid nucleic acid molecule having a first mutated sequence makes it possible to screen interfering nucleic acid molecules by comparing the effect of an interfering nucleic acid in the presence of a hybrid nucleic acid molecule. having a first non-mutated sequence (SEQ ID NO: 136).
  • FLAG M siRNA SEQ ID NO: 1544 makes it possible to detect an increase in the expression level of CD1 only when the hybrid nucleic acid molecule comprises a mutation in its first sequence.
  • hybrid nucleic acid molecules comprising a first mutated sequence, in particular by a G-> T substitution or an insertion of an AT dinucleotide, makes it possible to screen interfering nucleic acid molecules which increase expression.
  • Example 5 Screening Example Using FRET as Detection Means
  • DNA per liter, 5 microliters per well are deposited in triplicates in a 384-well box (Greiner- # 784076).
  • a mixture of 5 microliters of donor antibody (CISBIO-# 610HATAB) and acceptor (CISBIO-# 61 FG2XLB) according to the supplier's instructions (CISBIO) is added to each well and followed by incubation protected from light and at room temperature for 1 hour.
  • the FRET fluorescence reading between the donor and the acceptor directed against the TAGs produced by the transgene of interest is carried out by means of an HTRF apparatus (PHERAstar FS-BMG LABTECH) according to the supplier's instructions.
  • a 10% increase in the signal relative to the control siRNA (T.) is considered significant for the control. increase in the expression of the transgene of interest.
  • the quantitative results of FRET show that the interfering nucleic acid molecules FN (SEQ ID NO: 146; B), Flag (SEQ ID NO: 148 and 149; D and E), FLAG Cter (SEQ ID NO: 156; ), FM (SEQ ID NO: 154; L) and H A3 (SEQ ID NO: 140; P) increase the expression. All of these data show that the method according to the invention makes it possible to screen interfering nucleic acid molecules which increase the expression of genes.
  • the inventors have therefore compared the protein expression levels of the cyclin D1 protein, the protein expression of which is controlled by
  • mKozAT murine Kozak sequence of cyclin D1 having an AT insertion according to the invention
  • the protein lysates were then normalized to an equivalent concentration of total proteins by the Bradford method, and then analyzed in western blot against actin or cyclin D1. These samples were also analyzed by the Tandem-HTRF method described in Example 5.
  • results illustrate a decrease in expression from mKozAT compared to the wild-type mKoz sequence or compared to an artificial KozOPT sequence. This means that the mutated Kozak sequence has the effect of decreasing protein expression.
  • the messenger RNAs were used to generate complementary DNA (cDNA) by Reverse Transcription, then these cDNAs were analyzed by quantitative PCR (qPCR).
  • the level of messenger RNA resulting from the mKoz-Ntag-CycD1 or mKozAT-Ntag-CycD1 or KozOPT-Ntag-CycD1 constructs was evaluated according to the qPCR after normalization using the housekeeping genes (Hprt, B2M, Trfrl, Tubb and Gapdh).
  • a comparable level of messenger RNA for Ntag-CycD1 appears between the mKoz-Ntag-CycD1 or mKozAT-Ntag-CycD1 or KozOPT-Ntag-CycD1 lines.
  • N1-tagged cyclin D1 under control of murine Kozak of cyclin D1 having an AT insertion (Ntag-mKozAT),
  • Cyclin D1 labeled in C-terminal under control of murine Kozak of cyclin D1 having an AT insertion (Ctag-mKozAT)
  • Cyclin D1 labeled N-terminal under control of murine Kozak cyclin D1 optimized to increase expression (Ntag-KozOPT).
  • siRNAs tested in Figure 7 were used: SQE ID NO: 149/150; SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 154 and SEQ ID NO: 142.
  • siRNAs increasing the expression are systematically identified when the reporter is put under control of a mutated Kozak sequence (here presenting an AT insertion).

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Abstract

L'invention concerne un procédé de criblage d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression ou l'activité de séquences géniques exprimées, ledit procédé comprenant une étape d'introduction dans une cellule d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant : - une première séquence non codante destinée à initier la traduction, - une seconde séquence complémentaire desdits acides nucléiques interférents à cribler, et éventuellement - une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé ladite première séquence étant modifiée de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminué d'au moins 10%.

Description

Procédé de criblage de molécules interférentes
La présente invention concerne un procédé de criblage de molécules interférentes.
Le phénomène connu d'interférence à ARN (RNAi) est basé sur le fait que de petites molécules d'acides ribonucléiques peuvent interagir avec les ARN messagers. Un mécanisme complexe, contrôlé par de nombreuses enzymes, conduit à la dégradation des ARN messagers, inhibant ainsi l'expression des gènes codant lesdits ARN messagers et inhibant, par voie de conséquence, l'expression des protéines qui en découlent.
Parmi les petits ARN interférents, plusieurs espèces d'ARN ont été identifiées, notamment les micro-ARN, les ARN en épingle à cheveux, et sont capable d'inhiber l'expression de gènes, et donc des protéines qui en découle, par des mécanismes similaires.
Il est actuellement très largement admis de tester pour chacun des gènes d'intérêt pour lesquels une inhibition par interférence à ARN est recherchée, de tester individuellement chaque ARN interfèrent pour chacun des gènes envisagés. Un tel procédé est long et coûteux, puisqu'il est nécessaire de vérifier que chaque ARN interfèrent envisagé exerce bien son effet inhibiteur sur l'expression du gène cible. De plus, il est nécessaire de vérifier que chacun des ARN interférents considérés comme exerçant un effet inhibiteur approprié n'exerce pas par ailleurs un effet inhibiteur « parasite » en bloquant également l'expression d'un ou plusieurs autres gènes que celui qui est ciblé initialement.
Le brevet US8 252 535 décrit l'utilisation d'une séquence artificielle comprenant une séquence à cibler complémentaire de la séquence d'un ARN interfèrent connu. Ce procédé permet par ailleurs d'inhiber simultanément des ARN codant des gènes cibles différents. Toutefois un tel procédé demeure imparfait, et ne permet pas notamment de cribler efficacement des ARN interférents spécifiques d'une cible naturelle.
On connaît en outre de l'état de la technique des molécules d'acides nucléiques ayant un effet positif sur l'expression de gènes.
Par exemple Voutila et al, Molecular Therapy, 2012-08-01 décrit des siRNA utilisés pour activer les gènes impliqués dans la pluripotence cellulaire. La demande WO2006113246A2 décrit des sRNA activateurs de l'expression de gènes, notamment en se fixant sur des régions promotrices, Toutefois, ces molécules ont pour effet de cibler des séquences régulatrices mais ne ciblent pas spécifiquement les séquences codantes de gènes.
Aussi, l'invention a pour but de palier à ces inconvénients. Un des objets de l'invention est de fournir un procédé de criblage de molécules interférentes présentant une meilleures sensibilité.
Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique hybride permettant de mettre en œuvre un procédé de criblage de molécules interférentes, ce procédé étant plus sensible que ceux connus de l'état de la technique.
Encore un autre but de l'invention est de fournir les moyens permettant de mettre en œuvre facilement et efficacement le procédé susmentionné.
Aussi, l'invention concerne un procédé de criblage, notamment in vitro, d'acides nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques ou ARN transcrits desdits gènes, lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec lesdits gènes ou lesdits ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence étant modifiée, notamment par substitution ou délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminué d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs qu'il est possible de cribler des molécules interférentes permettant d'augmenter l'expression des gènes lorsque ces dernières sont sélectionnées au moyen d'une molécule d'acides nucléiques possédant une séquence d'initiation de la traduction modifiée (non- optimale).
Aussi, les inventeurs ont identifié pour la première fois des ARN interférents possédant des propriétés opposées à celles largement décrites et admises dans l'état de a technique, à savoir les propriétés d'inhibition de l'expression connues des mécanismes d'interférence à ARN.
Dans l'invention, il est primordial de disposer d'une molécule d'acide nucléique qui comprend une première séquence d'initiation de la traduction qui ne soit pas naturelle, et qui diffère de ladite séquence telle qu'elle peut être retrouvée chez les eucaryotes sauvages (c'est-à-dire ne présentant pas de mutation au niveau de ladite séquence d'initiation de la traduction).
Dans l'invention, on entend par séquence d'initiation de la traduction la séquence d'acides nucléiques présente dans les gènes et dans les ARN messagers qui en découle, et qui entoure le codon d'initiation ATG. Cette séquence est plus communément appelée séquence Kozak.
Dans l'invention on entend par « optimale », le niveau de traduction maximum opérant pour un gène déterminé dans un type cellulaire donné et dans une condition de culture donnée. Le niveau optimal de traduction est le niveau maximum de production d'une protéine par un ARN sous la dépendance dudit site d'initiation de la traduction où a lieu le chargement du premier acide aminé importé par l'ARN de transfert initiateur Methionine. La cellule s'entend comme n'étant pas capable, à l'état naturel physiologique, de produire plus de protéine pour un ARN donné que son niveau optimal.
Dans l'invention, on entend par « augmentant l'expression de gènes » toutes modifications qui a pour conséquence d'obtenir une quantité de protéine, codée par ledit gène, plus élevée que la quantité de protéine obtenu sans modification. Aussi, en présence d'un acide nucléique interfèrent selon l'invention, le produit protéique d'un gène (ciblé par ledit acide nucléique interfèrent) sera plus abondant que le produit protéique du même gène en l'absence d'un acide nucléique interfèrent ciblant ledit gène, ou en présence d'un acide nucléique interfèrent ciblant un autre gène. Cette définition d'« augmentant l'expression de gènes » est une définition classique utilisée par l'homme du métier.
Aussi, même si le mécanisme moléculaire qui implique cette augmentation protéique est post transcriptionnelle (stabilisation de l'ARN, augmentation de la transcription), on parlera toujours d'augmentation d'expression génique.
Dans l'invention « augmentation de l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques ou ARN transcrits desdits gènes » correspond, comme indiqué ci-dessus, à l'un des mécanismes conduisant à l'augmentation de l'expression des gènes, c'est-à-dire à l'augmentation du produit protéique codé par ledit gène.
Dans l'invention on entend par molécules interférentes des molécules d'acide nucléique capables de réguler l'expression de gènes par interférence à ARN. Un des exemples de molécules interférentes couvertes par l'invention sont donc les petits ARN interférents (siRNA pour Small interfering RNA), les micros ARN (miRNA pour « micro RNA »), ou les petits ARN en épingle à cheveux (shRNA pour « short hairpin RNA »). Les siRNA sont de petits ARN double brin de 21 à 24 nucléotides. Les petits ARN interférents à l'état de double brin sont reconnus dans le cytoplasme de la cellule par un complexe protéique nommé complexe RISC (pour RNA induce silencing complex). Celui-ci s'active en libérant le brin complémentaire de l'ARN ou brin sens. Ce complexe activé va reconnaître son transcrit cible, un ARN messager, par complémentarité des bases nucléiques. Ce système de reconnaissance assure la haute spécificité de ce mécanisme. Une fois la cible liée, la protéine Argonaute, faisant partie du complexe RISC, peut couper le transcrit au niveau du site de reconnaissance. Ago peut donc agir comme une endonucléase. Les deux morceaux du transcrit clivé par Ago vont être rapidement dégradés via leurs extrémités par des exonucléases.
Les miRNA sont des ARN simple brins capable de former par appariement de base des structures double brins. Au cours de la formation du RISC il y a passage d'un miRNA double brin à un miRNA simple brin. Seul le brin spécifique de l'ARN messager cible du miRNA est conservé au sein du complexe. L'ARNm cible est alors chargé au sein du complexe RISC. Deux voies d'inhibition sont alors possibles, soit la dégradation de l'ARNm cible si le complexe contient la protéine Ago2, soit la répression de la traduction de ce dernier si le complexe contient la protéine Ago1 .
Les shRNA sont des ARN adoptant une structure en tige et boucle pouvant être impliqués dans le phénomène d'interférence par ARN. Après la prise en charge par le complexe RISC, le brin sens est dégradé. Le brin anti-sens dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire. Le mécanisme de dégradation est alors similaire à celui opéré par les siRNA.
Dans le cadre de l'invention, le mécanisme selon lequel certaines molécules interférentes sont capables d'augmenter l'expression de gènes n'est pas encore élucidé. Toutefois, les inventeurs ont montré, au moyen du procédé selon l'invention, que certaines molécules qui sont généralement réputée dans l'état de la technique comme inhibant la traduction d'ARN messagers, ou déstabilisant les ARN messagers sont en fait capables d'augmenter l'expression ou la stabilité desdits ARN messagers. Dans l'invention « lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN » signifie que les acides nucléiques interférents à cribler sont préalablement sélectionnés d'une part pour être au moins en partie complémentaire de la séquence d'un gène, ou de l'ARN messager qu'il code, de sorte que le criblage soit spécifique. Par ailleurs, l'homme du métier comprendra que les acides nucléiques interférents ne peuvent être complètement complémentaires de la séquence du gène qu'ils ciblent, dans la mesure où ils ont une taille, en nombre de nucléotides, inférieure à celle du gène ciblé.
Dans l'invention, on entend par molécule d'acide nucléique hybride, une molécule d'acides nucléiques hybride qui est composée d'au moins deux fragments d'acides nucléiques qui ne sont pas adjacents dans la nature. Cette molécule hydride n'existe donc pas à l'état naturel.
Ladite molécule d'acide nucléique hybride, comme mentionné ci-dessus, comprend au moins trois séquences :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, ou plus communément appelée séquence d'initiation de la traduction. Cette séquence est modifiée, c'est-à-dire qu'elle présente au moins un nucléotide différent par rapport à la même séquence observée dans la population générale,
- une deuxième séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, qui correspond à la séquence cible de l'acide ou des acides nucléiques interférents, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ce peptide pouvant correspondre à une étiquette immunogène, ou tag, ou encore à une protéine fonctionnelle présentant une activité enzymatique ou à une protéine présentant des propriétés luminescentes ou fluorescentes.
Dans l'invention, il est possible que la deuxième séquence soit contenue dans la troisième séquence. Cela signifie que la troisième séquence qui code ledit au moins un peptide déterminé comporte une partie de sa séquence qui est au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler. Cela peut signifier d'une part que la deuxième séquence correspond à une partie de la troisième séquence toutes deux codant une partie du peptide déterminé, ou d'autre part que le peptide déterminé est « hybride », c'est-à-dire qu'il est codé par une séquence dans laquelle une séquence exogène (la deuxième séquence) a été introduite. Dans ce second cas, le peptide déterminé comportera une partie de sa séquence d'acide nucléique qui n'est pas naturellement comprise dans la séquence dudit peptide déterminé.
Dans l'invention, il est également possible que la deuxième et la troisième séquence soient identiques. C'est le cas notamment lorsque la séquence codant le peptide déterminé est également intégralement en partie complémentaire, ou complètement complémentaire, des acides nucléiques interférents à cribler. C'est le cas notamment de la séquence codant l'étiquette FLAG. S'il est recherché une molécule interférente augmentant l'expression de l'étiquette, la séquence d'acides nucléiques codant l'étiquette FLAG est placée en aval de la première séquence et la molécule d'acide nucléique hybride est alors composée de trois séquences (qui en fait n'en représentent que deux), la deuxième et la troisième étant complètement confondues, ou identiques. Dans la molécule d'acides nucléiques hybride, il existe un contrôle fonctionnel de la troisième séquence par la première séquence, ce contrôle étant exercé en cis ce qui signifie que le contrôle se fait lorsque les deux séquences sont portées par la même molécule.
La première séquence de la molécule hybride est modifiée de sorte que la traduction dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale. En d'autres termes, en l'absence d'acides nucléiques interférents, une cellule eucaryote comprenant une molécule d'acides nucléiques hybride ne présentant pas de première séquence modifiée exprimera au moins 10% plus de peptide déterminé (codé par la troisième séquence) que la même cellule eucaryote comprenant une molécule d'acides nucléiques hybride présentant ladite première séquence modifiée.
Afin de permettre une interaction entre la molécule d'acides nucléiques hybrides et les acides nucléiques interférents à cribler, il est nécessaire que les séquences des acides nucléiques interférents et la seconde séquence de la molécule d'acide nucléique hydride soient au moins en partie complémentaire, selon la complémentarité des bases A-T/A-U et G-C, bien connue de l'homme du métier.
Dans l'invention on entend par « au moins en partie complémentaire » le fait que la grande majorité de nucléotides qui composent les acides nucléiques interférents à cribler soient complémentaires des nucléotides qui définissent la deuxième séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride. En particulier, il est avantageux que les nucléotides des acides nucléiques interférents à cribler et ceux qui composent la deuxième séquence de la molécule d'acides nucléique hybride soient complémentaires à plus de 90%, avantageusement plus de 95%, notamment plus de 99% en particulier 100%, ou en d'autres termes que les deux molécules présentent moins de 10%, avantageusement moins de 5%, notamment moins de 1 %, en particulier 0% de mésappariements. Lorsque la deuxième séquence de la molécule d'acides nucléique interférents est composée d'environ 20 nucléotides, il est particulièrement avantageux que la complémentarité soit totale.
L'invention repose en effet sur cette constatation surprenante faite par les inventeurs selon laquelle une modification de la séquence d'initiation de la traduction permet une expression plus faible du peptide déterminé, qui sert de marqueur, et donc permet de visualiser de manière plus précise la variation d'expression, notamment l'augmentation d'expression, lorsque l'efficacité d'un acide nucléique interfèrent est testée.
Le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
- Une première étape qui consiste en la transformation de cellules eucaryotes aptes à réaliser de l'interférence à ARN, par des techniques bien connues de l'état de la technique de transfection, d'une molécule d'acides nucléiques hybride. Il peut s'agir notamment d'électroporation, de transformation au phosphate de calcium, de lipofection, d'infection virale, ou encore de nucléofection. Ces exemples de transformation de cellules eucaryotes sont donnés à titre indicatif, et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
Une fois transformées, transitoirement ou de manière stable, les cellules susmentionnées sont prêtes à être utilisées pour le criblage des acides nucléiques interférents. Il peut être avantageux de disposer de cellules transformées de manière stable (c'est-à-dire de cellules ayant intégré dans leur génome ladite molécule d'acides nucléiques hybride) afin de pouvoir, par simple culture cellulaire, utiliser toujours la même cellule transformée.
- Dans une seconde étape, la cellule ou les cellules transformées à l'étape précédente sont une nouvelle fois transformées par des moyens conventionnels bien connus de l'homme du métier, afin d'introduire dans lesdites cellules lesdits acides nucléiques interférents à cribler.
- Les cellules ainsi transformées avec d'une part la molécule d'acides nucléiques hybride et une population d'un acide nucléique interfèrent à cribler sont mises en culture, dans une troisième étape, afin de permettre la mise en œuvre du processus d'interférence à ARN, pendant un temps déterminé que l'homme du métier, avec ses connaissances générales de l'interférence à ARN peut facilement déterminer selon le type de cellule utilisé.
- A l'issue dudit temps déterminé, les cellules sont alors, dans une quatrième étape, analysées afin de mesurer le taux d'expression, c'est-à-dire la présence, l'absence ou la quantité dudit peptide déterminé codé par ladite molécule d'acides nucléiques hybrides. Cette présence, absence ou quantité de peptide déterminé est évaluée en comparaison avec la quantité dudit même peptide déterminé exprimé par lesdites cellules transformées avec ladite molécule d'acide nucléiques hybride, mais qui n'a pas été transformée avec des acides nucléiques interférents à cribler, ou qui a été transfectée avec des acides nucléiques interférents qui n'ont pas de cible (c'est-à-dire de séquences complémentaires) dans la molécule d'acides nucléiques hybrides.
Si la quantité de peptide déterminé dans les cellules transformées avec un acide nucléique interfèrent est inférieure ou égale ou supérieure à moins de 10% à la quantité du peptide dans les cellules qui n'ont été transformées avec aucun acide nucléique interfèrent, ou qui ont été transfectées avec des acides nucléiques interférents qui n'ont pas de cible (c'est-à-dire de séquences complémentaires) dans la molécule d'acides nucléiques hybrides, ledit acide nucléique interfèrent ne sera pas retenu. Si par contre la quantité de peptide déterminé dans les cellules transformées avec un acide nucléique interfèrent est supérieure d'au moins 10 % à la quantité du peptide dans les cellules qui n'ont été transformées avec aucun acide nucléique interfèrent, ou qui a été transfectée avec des acides nucléiques interférents qui n'ont pas de cible (c'est-à-dire de séquences complémentaires) dans la molécule d'acides nucléiques hybrides, alors ledit acide nucléique interfèrent sera retenu, car il exerce un effet activateur de l'expression ou de l'activité du gène qu'il cible.
Afin de mesurer la différence du niveau d'expression d'au moins 10%, il est possible d'utiliser des techniques conventionnelles d'immunodétection capables de détecter de manière quantitative les rayonnements lumineux émis par une détection par chimioluminescence ou par fluorescence.
Par exemple, il est possible de réaliser soit un immunomarquage du peptide d'intérêt par la technique de western blot, et de mesurer sa quantité par chimioluminescence. De la même manière si l'anticorps dirigé contre le peptide est couplé à un marqueur fluorescent, il est possible de mesurer sa quantité en mesurant le rayonnement fluorescent émis après excitation à la longueur d'onde appropriée.
Lorsque le peptide est lui-même doté de propriétés autofluorescentes, il est possible de mesurer sa quantité directement à partir des cellules vivantes, notamment par cytométrie de flux.
II peut également être avantageux que la molécule d'acide nucléique hybride, par l'intermédiaire de la troisième séquence code au moins deux peptides qui sont susceptibles de réaliser un transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou FRET. Dans ce cas particulier où la troisième séquence code au moins deux peptides susceptibles de réaliser du FRET, il est possible de mesurer la quantité de peptide exprimé, et donc l'effet de l'acide nucléique interfèrent, directement sur les cellules vivantes transformées avec la molécule d'acides nucléiques hybride transformée ou non par un acide nucléique interfèrent en mesurant l'émission de fluorescence résultat du transfert d'énergie.
En résumé, le procédé selon l'invention est un procédé de criblage d'acides nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes, lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN,
ledit procédé comprenant
1 - une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant : - une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminué d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale,
2- une étape d'introduction dans la cellule eucaryote obtenue à l'étape précédente d'un acide nucléique interfèrent, et
3- une étape de mesure de l'expression dudit au moins un peptide.
Ce procédé permet de conclure que si le niveau d'expression dudit au moins un peptide est supérieur de 10% au niveau d'expression dudit peptide exprimé par une cellule eucaryote obtenue à l'étape 1 , mais qui n'est transformé avec aucun acide nucléique interfèrent, ou un acide nucléique interfèrent ne présentant aucune complémentarité de séquence avec la deuxième séquence de ladite molécule d'acides nucléiques hybride, l'acide nucléique interfèrent qui a permis cette augmentation d'expression de plus de 10% est un acide nucléique interfèrent d'intérêt selon l'invention.
Dans le cas contraire, l'acide nucléique interférant testé n'est pas conservé car il ne présente pas les propriétés d'augmentation de l'expression ou de l'activité du gène ciblé.
Il est à noter que dans l'invention, la molécule d'acides nucléiques hybride peut être soit un acide ribonucléique (ARN), soit un acide désoxyribonucléique simple ou double brin (ADN simple brin ou ADN double brin). Avantageusement, la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acide désoxyribonucléique.
Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak d'initiation de la traduction en aval soit d'un site d'entrée interne des ribosomes ou 1RES, ou soit d'une coiffe ARN (5'CAP). L'initiation de la traduction a lieu grâce à la présence d'une séquence Kozak. Toutefois, afin de permettre l'initiation de la traduction, il est nécessaire que les ribosomes et toute la machinerie de traduction soient « chargés » sur l'ARN messager. Un tel « chargement » est opéré à l'aide soit d'une coiffe ARN (5'CAP) soit à l'aide d'une séquence interne d'entrée des ribosomes ou 1RES. Ces séquences (5'CAP/IRES) ont également la capacité de stabiliser les ARN messagers sur lesquels ils sont chargés, voire même d'exporter les ARN messagers vers leurs sites de traduction.
La coiffe ARN (5'CAP) est un nucléotide modifié que l'on trouve à l'extrémité 5' des ARN messagers dans les cellules eucaryotes. C'est une modification post- transcriptionnelle qui est introduite par l'action successive de plusieurs enzymes localisées dans le noyau. La coiffe se compose d'une guanosine méthylée en position N7, reliée au premier nucléotide de l'ARN messager transcrit par une liaison 5'-5' triphosphate.
Les 1RES permettent le recrutement direct des ribosomes au niveau du codon initiateur, indépendamment de la présence de la coiffe et du mécanisme de balayage. Les 1RES sont des régions structurées de l'ARNm qui interagissent directement avec le ribosome ou avec les facteurs d'initiation de la traduction.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé défini ci- dessus, dans lequel la molécule d'acide nucléique comprend ladite première séquence positionnée en amont, ou en position 5', de ladite troisième séquence.
Afin de coordonner la régulation en cis de la troisième séquence, il est avantageux que la première séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride soit positionnée en amont de la troisième séquence codant le peptide déterminé. Les premières et troisièmes séquences peuvent être ainsi liées directement, ou adjacentes, mais peuvent également être séparées par une autre séquence qu'il s'agisse de la deuxième séquence ou de tout autre séquence.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite deuxième séquence est positionnée,
- soit en 5' de ladite première séquence,
- soit en 3' de ladite première séquence et en 5' de ladite troisième séquence,
- soit en 3' de ladite troisième séquence,
- soit comprise dans la troisième séquence.
Les différentes possibilités d'ordonnancement des séquences de la molécule d'acides nucléiques hybrides sont illustrées par la Figure 1 .
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la dite molécule d'acide nucléique est une molécule d'acides désoxyribonucléiques, notamment double brin, éventuellement contenu dans un vecteur, ou une molécule d'acides ribonucléiques, notamment simple brin.
Comme cela a été mentionné précédemment, la molécule d'acides nucléiques hybride est introduite dans une cellule eucaryote. Cette molécule d'acides nucléiques hybride peut être introduite sous différentes formes dans la dite cellule eucaryote, à savoir :
- sous la forme d'un acide ribonucléique ou ARN simple brin, qui sera pris en charge par la machinerie de traduction de la cellule eucaryote pour traduire ledit au moins un peptide déterminé codé par ladite troisième séquence,
- sous la forme d'un acide désoxyribonucléique ou ADN, en particulier double brin, qui devra alors être transcrit en ARN par la machinerie cellulaire de la cellule eucaryote, puis traduit, dans ce cas il sera important que la molécule d'acides nucléique hybride comprenne, outre les trois séquences susmentionnées, une séquence permettant la transcription d'un ARN,
- sous la forme d'un vecteur ADN comprenant ladite séquence d'acides nucléiques hybride, ce vecteur comprenant des moyens permettant la transcription de la molécule d'acides nucléiques hybride, notamment un promoteur et accessoirement une séquence augmentant la transcription (enhancer). Le vecteur peut alors être un vecteur circulaire, et pouvant comprendre une origine de réplication eucaryote ou virale afin qu'il puisse se répliquer de manière autonome, ou un vecteur linéarisé afin de stimuler son intégration dans la cellule eucaryote. Il est par ailleurs avantageux que ledit vecteur comprenne une ou plusieurs séquences codant des protéines permettant de sélectionner les cellules qui ont intégré dans leur génome ledit vecteur, par exemple, et sans être limitatif,
■ des séquences codant des peptides permettant la résistance à certains antibiotique, comme la puromycine, la néomycine/G148, la blasticidine, ou encore la zéocine,
■ des séquences codants des protéines auto fluorescentes comme la protéine fluorescente verte et ses dérivés, ou
■ des séquences codant des protéines exerçant une sélection négative sur les cellules qui l'expriment, comme par exemple la thymidine kinase.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa version non modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1 )
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C.
Il s'agit de cette séquence SEQ ID NO : 1 qui correspond à la première séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride qui doit être modifiée par suppression, ou délétion ou insertion d'au moins un nucléotide.
Dans encore un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides désoxyribonucléiques, notamment double brin, ladite première séquence dans sa version non modifiée, est représentée par la séquence suivante : 5'- ssmRccATGG -3' (SEQ ID NO : 2), ou
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides ribonucléiques, notamment simple brin, ladite première séquence dans sa version non modifiée, est représentée par la séquence suivante : 5'- ssmRccAUGG -3' (SEQ ID NO : 3).
Aussi, la séquence SEQ ID NO : 2 couvre les différentes séquences suivantes :
5'-GGCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 4),
5'-GGCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 5),
5'-GGAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 6),
5'-GGAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 7),
5'-GCCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 8),
5'-GCCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 9),
5'-GCAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 10),
5'-GCAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 11 ),
5'-CGCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 12),
5'-CGCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 13),
5'-CGAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 14),
5'-CGAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 15),
5'-CCCGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 16),
5'-CCCACCATGG-3' (SEQ ID NO: 17),
5'-CCAGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 18), et
5'-CCAACCATGG-3' (SEQ ID NO: 19).
De la même manière, la séquence SEQ ID NO : 3 couvre les différentes séquences suivantes :
5'-GGCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 20),
5'-GGCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 21 ),
5'-GGAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 22),
5'-GGAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 23),
5'-GCCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 24),
5'-GCCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 25),
5'-GCAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 26),
5'-GCAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 27),
5'-CGCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 28),
5'-CGCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 29),
5'-CGAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 30), 5'-CGAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 31 ),
5'-CCCGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 32),
5'-CCCACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 33),
5'-CCAGCCAUGG-3' (SEQ ID NO: 34), et
5'-CCAACCAUGG-3' (SEQ ID NO: 35).
Avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée, l'une des séquences suivantes :
5'- SSMRCCA(T/U)Gt -3' (SEQ ID NO : 36), ou
5'- SSMRCCa(t/u)A(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 37).
Les inventeurs ont constaté de manière surprenante que l'insertion du doublet A(T/U) avant le codon initiateur de la traduction de la séquence Kozak, ou la substitution G->T, après le codon initiateur de la traduction de la séquence Kozak avait un effet sur l'efficacité de traduction de toute séquence sous contrôle de de ces séquences Kozak mutées.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée :
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides
désoxyribonucléiques, notamment double brin, l'une quelconque des séquences suivantes :
5'-GGCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 38),
5'-GGCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 39),
5'-GGAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 40),
5'-GGAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 41 ),
5'-GCCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 42),
5'-GCCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 43),
5'-GCAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 44),
5'-GCAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 45),
5'-CGCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 46),
5'-CGCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 47),
5'-CGAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 48),
5'-CGAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 49),
5'-CCCGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 50),
5'-CCCACCATGt-3' (SEQ ID NO: 51 ),
5'-CCAGCCATGt-3' (SEQ ID NO: 52),
5'-CCAACCATGt-3' (SEQ ID NO: 53), 5'-GGCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 54),
5'-GGCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 55),
5'-GGAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 56),
5'-GGAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 57),
5'-GCCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 58),
5'-GCCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 59),
5'-GCAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 60),
5'-GCAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 61 ),
5'-CGCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 62),
5'-CGCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 63),
5'-CGAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 64),
5'-CGAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 65),
5'-CCCGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 66),
5'-CCCACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 67),
5'-CCAGCCATATGG-3' (SEQ ID NO: 68), et
5'-CCAACCATATGG-3' (SEQ ID NO: 69),
et
lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride est une molécule d'acides ribonucléiques, notamment simple brin, l'une quelconque des séquences
5'-GGCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 70),
5'-GGCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 71 ),
5'-GGAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 72),
5'-GGAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 73),
5'-GCCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 74),
5'-GCCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 75),
5'-GCAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 76),
5'-GCAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 77),
5'-CGCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 78),
5'-CGCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 79),
5'-CGAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 80),
5'-CGAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 81 ),
5'-CCCGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 82),
5'-CCCACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 83),
5'-CCAGCCAUGU-3' (SEQ ID NO: 84),
5'-CCAACCAUGU-3' (SEQ ID NO: 85),
5'-GGCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 86),
5'-GGCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 87), 5'-GGAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 88),
5'-GGAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 89),
5'-GCCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 90),
5'-GCCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 91 ),
5'-GCAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 92),
5'-GCAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 93),
5'-CGCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 94),
5'-CGCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 95),
5'-CGAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 96),
5'-CGAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 97),
5'-CCCGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 98),
5'-CCCACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 99),
5'-CCAGCCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 100), et
5'-CCAACCAUAUGG-3' (SEQ ID NO: 101 ).
Encore plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 38 à 101 . Toujours plus avantageusement, l'invention concerne le procédé susmentionné, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée en l'une quelconque des séquences : SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 91 , SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 100.
L'invention concerne ainsi avantageusement un procédé de criblage d'acides nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes, lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, ladite première séquence comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1 , ladite première séquence étant modifiée,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, et - une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence modifiée comprenant ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 38 à 101 , et notamment SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 91 , SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 100.
Les définitions précédentes s'appliquent mutatis mutandis.
Ainsi, avantageusement l'invention concerne un procédé de criblage d'acides nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes, lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence modifiée comprenant ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 38 à 101 , et notamment SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 91 , SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 100.
L'invention concerne encore plus avantageusement le procédé susmentionné, dans lequel ladite deuxième séquence comprend de 18 à 10000 nucléotides au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler, notamment de 18 à 1000, en particulier de 18 à 500, plus particulièrement de 18 à 100 nucléotides consécutifs au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler.
Il est souhaitable pour multiplier les chances de cribler des acides nucléiques interférents selon l'invention de disposer d'une molécule d'acides nucléiques hybride qui présente une troisième séquence d'une grande taille, qui ne sera jamais inférieure à 18 nucléotides, taille minimale d'un petit ARN interfèrent.
Une taille avantageuse de la troisième séquence est de 18 à 500 nucléotides, ce qui signifie que la séquence peut comprendre 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116,
Figure imgf000018_0001
Avantageusement, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment, dans lequel ledit au moins un peptide est une protéine naturelle ou recombinante, étiquetée ou non, notamment une protéine autofluorescente.
La troisième séquence code donc un ou plusieurs peptides, et notamment une ou plusieurs protéines qui peuvent être étiquetés à l'aide de peptides immunogènes tels que les étiquettes (ou tags) FLAG, HA, V5, MYC, HIS, ou étiqueté avec des protéines fluorescentes telles que la GFP, la CFP, la RFP, la mCherry... Cette liste n'est pas limitative et ne saurait restreindre la portée de l'invention.
De manière plus avantageuse les peptides utilisés sont l'eGFP codée par la séquence SEQ ID NO : 102, la cycline D1 (CD1 ) murine codée par la séquence SEQ ID NO : 103, la protéine Hras murine codée par la séquence SEQ ID NO : 104 ou l'exportine 1 (XPO) codée par la séquence SEQ ID NO : 105. Les étiquettes avantageuses sont les suivantes : l'étiquette Flag codée par la séquence SEQ ID NO : 106, l'étiquette HA codée par la séquence SEQ ID NO : 107, l'étiquette Ntag codée par la séquence SEQ ID NO : 108, l'étiquette V5 codée par la séquence SEQ ID NO : 109, l'étiquette Myc codée par la séquence SEQ Dl NO : 110 ou encore l'étiquette Ctag codée par la séquence SEQ ID NO : 111 .
Aussi, les peptides étiquetés pouvant être utilisés dans le cadre de l'invention sont notamment : Myc-XPO codé par la séquence SEQ ID NO : 112, XPO-V5 codée par la séquence SEQ ID NO : 113, Myc-XPO-V5 codée par la séquence SEQ Dl NO : 114, Ha-CD1 codée par la séquence SEQ ID NO : 115
L'invention concerne en outre une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire d'au moins un acide nucléique interfèrent, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
De telles molécules d'acides nucléiques hybrides sont nouvelles et n'existent pas à l'état naturel puisqu'il s'agit de molécules artificielles constituées de fragments de molécules issus d'origines et de localisations génomiques différentes.
Avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite première séquence est une séquence d'initiation de la transcription de type Kozak, en aval d'un site d'entrée interne des ribosomes ou 1RES, ou d'une coiffe (5'cap).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée, dans laquelle ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa version non modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1 )
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C.
Avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée, dans laquelle ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version non modifiée, l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 35.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie précédemment, dans laquelle ladite première séquence modifiée est choisie parmi :
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride une molécule d'acides désoxyribonucléiques, notamment double brin, l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 38 à 69, et
- lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride une molécule d'acides ribonucléiques, notamment simple brin, l'une quelconque des séquences SEQ ID NO :
70 à 101 .
Encore plus avantageusement, l'invention concerne une molécule d'acides nucléiques hybride définie ci-dessus, ladite molécule d'acide nucléique étant choisie parmi les molécules de séquence suivante : SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 117, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 119, SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 121 , SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 123, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO : 125, SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO : 127 et SEQ ID NO : 128.
SEQ ID GCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCACAGAA
116 : TACAAGCTTGTGGTGGTGGGCGCTGGAGGCGTGGGAAAGAGT
KOZopt-HA GCCCTGACCATCCAGCTGATCCAGAACCACTTTGTGGACGAGT ras-Flag ATGATCCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCAT
TGATGGGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGT
CAAGAAGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAG
GGGAGGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAACAACACCAAGTC
CTTCGAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGT
GAAAGATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAG
TGTGACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAG
GACCTTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAG
CCAAGACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAG
TCCGTGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACC
CGATGAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCT GTCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG
SEQ ID NO GCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCACAGAA
117 TACAAGCTTGTGGTGGTGGGCGCTGtAGGCGTGGGAAAGAGT
KOZopt-HA- GCCCTGACCATCCAGCTGATCCAGAACCACTTTGTGGACGAGT rasG 2V-Flag ATGATCCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCAT
TGATGGGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGT
CAAGAAGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAG
GGGAGGGCTTCCTCTGTGTA I I I GCCATCAACAACACCAAGTC
CTTCGAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGT
GAAAGATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAG
TGTGACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAG
GACCTTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAG
CCAAGACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAG
TCCGTGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACC
CGATGAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCT
GTCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG
SEQ ID NO CGCGCCATatgGAACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGAC 118 CATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACCG mKoz-AT- GGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCGC mCD1 -Ctag CCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCC
ATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGT
GAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCAT
GAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGAA
GAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGG
CCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTT
GTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTG
CAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGG
CCGCCATGACTCCCCACGAI I I CATCGAACACTTCCTCTCCAA
AATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCA
TGCACAGACC I I I GTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTC
Al I I CCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGTG
GCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTTC
CTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCA
AGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTG
AAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACG
TCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGAA GAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT GGACATCgcggccgctggaggagactacaaggacgacgatgacaagtcggccgct g g agg atacccctacg acg tg cccg actacg cc
SEQ ID |CGCGCCATatgG|AACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGAC 119 CATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACCG mKoz-AT- GGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCGC mCD1 CCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCC
ATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGT
GAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCAT
GAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGAA
GAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGG
CCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTT
GTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTG
CAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGG
CCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCAA
AATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCA
TGCACAGACCTTTGTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTC
ATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGTG
GCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTTC
CTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCA
AGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTG
AAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACG
TCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGAA
GAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT
GGACATC
SEQ ID NO |CGCGCCATatgg|actacaaggacg acg atg acaag ctcg atg g agg ataccccta 120 cgacgtgcccgactacgccggaggactcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTG mKoz-AT- CGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCT Ntag-mCD1 CCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGA
GACCTGTGCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAG
GAGATTGTGCCATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGC
TGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCC
CGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGC
CCTTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCA
TGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGC
CGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAG GAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGT
GGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTT
CCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCAT
CCGCAAGCATGCACAGACC I I I GTGGCCCTCTGTGCCACAGA
TGTGAAGTTCA I I I CCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGG
AGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCC
CAACAACTTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCC
AGAGTCATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAG
GAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCC
CAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGA
AGTGGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACG
TGCGAGATGTGGACATC
SEQ ID NO CCAGCCATGt acccctacg acg tg cccg actacg ccctcg atg g agg ag actacaa 121 ggacgacgatgacaagggaggactcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTGC hKOZ-HA- GAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGCCAACCTC FLAG-hCD1 CTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGCGGAGGA
GACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGTGCAGAA
GGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCACCTGGAT
GCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGGTCT
TCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCGCTGG
AGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACT
TGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCCCCTGA
CGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCATCCGGC
CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAACAAGC
TCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGAI I I CATTGA
ACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAACAAACA
GATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCTGTGC
CACAGATGTG AAGTTC A I I I CCAATCCGCCCTCCATGGTGGCA
GCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACCTGAG
GAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACGCTTC
CTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGGGCC
TGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCTGCGC
CAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGGAGGA
GGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACACCCA
CCGACGTGCGGGACGTGGACATC
SEQ ID NO CCAGCCATatggactacaaggacgacgatgacaagGAACACCAGCTCCT 122 GTGCTGCGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGC hKoz-AT- CAACCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGC
FLAG-hCD1 - GGAGGAGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGT
HA GCAGAAGGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCAC
CTGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGG
AGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTC
GCTGGAGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGG
CCACTTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCC
CCTGACGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCAT
CCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAA
CAAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGAI I I
CATTGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAAC
AAACAGATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCT
GTGCCACAG ATGTG AAGTTCA I I I CCAATCCGCCCTCCATGGT
GGCAGCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACC
TGAGGAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACG
CTTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCG
GGCCTGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCT
GCGCCAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGG
AGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACA
CCCACCGACGTGCGGGACGTGGACATCtacccctacgacgtgcccgact acgcc
SEQ ID NO CCAGCCATatggactacaaggacgacgatgacaagctcgatggaggatacccctac 123 gacgtgcccgactacgccggaggactcgagGAACACCAGCTCCTGTGCTG hKoz-AT-Ntag- CGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGTACCCCGATGCCAACCT hCD1 CCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCATGCTGAAGGCGGAGG
AGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCAAATGTGTGCAGAA
GGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGATCGTCGCCACCTGGAT
GCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGGTCT
TCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCGCTGG
AGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACT
TGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATCCCCCTGA
CGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCGACAACTCCATCCGGC
CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGCTCCTGGTGAACAAGC
TCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCCCGCACGAI I I CATTGA ACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGAGGAGAACAAACA
GATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTTCGTTGCCCTCTGTGC
CACAGATGTG AAGTTC A I I I CCAATCCGCCCTCCATGGTGGCA
GCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCAAGGCCTGAACCTGAG
GAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTACCGCCTCACACGCTTC
CTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGGGCC
TGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCTGGAGTCAAGCCTGCGC
CAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAAGGCCGCCGAGGAGGA
GGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGACCTGGCTTGCACACCCA
CCGACGTGCGGGACGTGGACATC
SEQ ID NO : gactacaaggacgacgatgacaagGCCACCatATGGAACACCAGCTCCT 124 GTGCTGCGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACAC
FLAG-KOZopt- CAATCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGAC AT-mCD1 -HA GGAGGAGACCTGTGCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGT
GCAGAAGGAGATTGTGCCATCCATGCGGAAAATCGTGGCCAC
CTGGATGCTGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGA
GGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTC
CCTGGAGCCCTTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGG
CCACCTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCC
CTTGACTGCCGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAACTCTATC
CGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAAC
AAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGAI I I CA
TCGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAA
GCAGACCATCCGCAAGCATGCACAGACC I I I GTGGCCCTCTG
TGCCACAGATGTGAAGTTCA I I I CCAACCCACCCTCCATGGTA
GCTGCTGGGAGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCT
GGGCAGCCCCAACAACTTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCA
CTTTCTTTCCAGAGTCATCAAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGT
GCCTGCCAGGAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTG
CGCCAGGCCCAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGA
GGAGGGGGAAGTGGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGC
CCACCGACGTGCGAGATGTGGACATCTACCCCTACGACGTGC
CCGACTACGCC
SEQ ID NO : GCCACCatATGGAACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGA 125 CCATCCGCCGCGCGTACCCTGACACCAATCTCCTCAACGACC
KOZopt-AT- GGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGTGCG mCD1 -HA- CCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGC STOP-FLAG CATCCATGCGGAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCT
GTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCC
ATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCCTTGAAGA
AGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTG
GCCTCTAAGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGT
TGTGCATCTACACTGACAACTCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCT
GCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTG
GCCGCCATGACTCCCCACGAI I I CATCGAACACTTCCTCTCCA
AAATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGC
ATGCACAGACC I I I GTGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTT
CAI I I CCAACCCACCCTCCATGGTAGCTGCTGGGAGCGTGGT
GGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAACTT
CCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATC
AAGTGTGACCCGGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATT
GAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAAC
GTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGTGGAGGA
AGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGT
GGACATCTACCCACGACGTGCCCGACTACGCCTGAgactacaagg acgacgatgacaag
SEQ ID NO: gactacaaggacgacgatgacaagGGAAGAGCGCCAGCCatATGGAAC 126 ACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAAACCATCCGCCGCGCGT
FLAG-hKoz- ACCCCGATGCCAACCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGGGCCA
AT-hCD1 - TGCTGAAGGCGGAGGAGACCTGCGCGCCCTCGGTGTCCTACT
STOP-HA TCAAATGTGTGCAGAAGGAGGTCCTGCCGTCCATGCGGAAGA
TCGTCGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGT
GCGAGGAGGAGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACC
GCTTCCTGTCGCTGGAGCCCGTGAAAAAGAGCCGCCTGCAGC
TGCTGGGGGCCACTTGCATGTTCGTGGCCTCTAAGATGAAGG
AGACCATCCCCCTGACGGCCGAGAAGCTGTGCATCTACACCG
ACAACTCCATCCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCTGC
TCCTGGTGAACAAGCTCAAGTGGAACCTGGCCGCAATGACCC
CGCACGA I I I CATTGAACACTTCCTCTCCAAAATGCCAGAGGC
GGAGGAGAACAAACAGATCATCCGCAAACACGCGCAGACCTT
CGTTGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTCAI I I CCAATCCG
CCCTCCATGGTGGCAGCGGGGAGCGTGGTGGCCGCAGTGCA AGGCCTGAACCTGAGGAGCCCCAACAACTTCCTGTCCTACTAC
CGCCTCACACGCTTCCTCTCCAGAGTGATCAAGTGTGACCCG
GACTGCCTCCGGGCCTGCCAGGAGCAGATCGAAGCCCTGCT
GGAGTCAAGCCTGCGCCAGGCCCAGCAGAACATGGACCCCAA
GGCCGCCGAGGAGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGTGGAC
CTGGCTTGCACACCCACCGACGTGCGGGACGTGGACATCTGA
tacccctacgacgtgcccgactacgcc
SEQ ID NO : gccaccATATGGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAGGATCTGGCT 127 GCCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAAATTGGTGTCGGTGCCT
KOZopt-AT- ATGGGACGGTGTACAAAGCCCGAGATCCCCACAGTGGCCACT Myc-CDK4-V5 TTGTGGCCCTCAAGAGTGTGAGAGTTCCTAATGGAGGAGCAG
CTGGAGGGGGCCTTCCCGTCAGCACAGTTCGTGAGGTGGCC
TTGTTAAGGAGGCTGGAGGCC I I I GAACATCCCAATGTTGTAC
GGCTGATGGATGTCTGTGCTACTTCCCGAACTGATCGGGACAT
CAAGGTCACCCTAGTG I I I GAGCATATAGACCAGGACCTGAGG
ACATACCTGGACAAAGCACCTCCACCGGGCCTGCCGGTTGAG
ACCATTAAGGATCTAATGCGTCAGTTTCTAAGCGGCCTGGATTT
TCTTCATGCAAACTGCATTGTTCACCGGGACCTGAAGCCAGAG
AACATTCTAGTGACAAGTAATGGGACCGTCAAGCTGGCTGACT
TTGGCCTAGCTAGAATCTACAGCTACCAGATGGCCCTCACGCC
TGTGGTGGTTACGCTCTGGTACCGAGCTCCTGAAGTTCTTCTG
CAGTCTACATACGCAACACCCGTGGACATGTGGAGCGTTGGCT
GTATC I I I GCAGAGATGTTCCGTCGGAAGCCTCTCTTCTGTGG
AAACTCTGAAGCCGACCAGTTGGGGAAAATC I I I GATCTCATT
GGATTGCCTCCAGAAGACGACTGGCCTCGAGAGGTATCTCTAC
CTCGAGGAGCC I I I GCCCCCAGAGGGCCTCGGCCAGTGCAG
TCAGTGGTGCCAGAGATGGAGGAGTCTGGAGCGCAGCTGCTA
CTGGAAATGCTGACC I I I AACCCACATAAGCGAATCTCTGCCTT
CCGAGCCCTGCAGCACTCCTACCTGCACAAGGAGGAAAGCGA
CGCAGAGGGCAAACCGATTCCGAACCCGCTGCTGGGCCTGGA
TAGCACC
SEQ ID NO : gactacaaggacgacgatgacaagGCCACCatATGGgaACAGAATACAAG 128 CTTGTGGTGGTGGGCGCTGGAGGCGTGGGAAAGAGTGCCCT
FLAG-KOZopt- GACCATCCAGCTGATCCAGAACCAC I I I GTGGACGAGTATGAT
AT-Gly-Ras- CCCACTATAGAGGACTCCTACCGGAAACAGGTGGTCATTGATG
HA GGGAGACATGTCTACTGGACATCTTAGACACAGCAGGTCAAGA AGAGTATAGTGCCATGCGGGACCAGTACATGCGCACAGGGGA
GGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAACAACACCAAGTCCTTC
GAGGACATCCATCAGTACAGGGAGCAGATCAAGCGGGTGAAA
GATTCAGATGATGTGCCAATGGTGCTGGTGGGCAACAAGTGTG
ACCTGGCTGCTCGCACTGTTGAGTCTCGGCAGGCCCAGGACC
TTGCTCGCAGCTATGGCATCCCCTACATTGAAACATCAGCCAA
GACCCGGCAGGGCGTGGAGGATGCCTTCTATACACTAGTCCG
TGAGATTCGGCAGCATAAATTGCGGAAACTGAACCCACCCGAT
GAGAGTGGTCCTGGCTGCATGAGCTGCAAATGTGTGCTGTCC
TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC
Dans le tableau ci-dessus, la première séquence, dans sa version mutée, est indiquée par un cadre.
Ces exemples de molécule d'acides nucléiques hybrides illustrent, de manière non limitative les différentes possibilités couvertes par l'invention, et par exemple :
- dans la séquence SEQ ID NO ; 128, la première séquence est encadrée, la deuxième séquence est en 3' de la première séquence, et la troisième séquence est en 5' de la première séquence. Cette molécule d'acide nucléique hybride permet idéalement de sélectionner des acides nucléiques augmentant l'expression du peptide FLAG.
- dans la séquence SEQ ID NO : 126 ou 125, la première séquence est encadrée, la deuxième séquence est en 3' de la première séquence, et la troisième séquence est en 3' de la deuxième séquence. Cette molécule d'acide nucléique hybride permet idéalement de sélectionner des acides nucléiques augmentant l'expression du peptide HA ou FLAG, respectivement.
Bien évidemment, comme mentionné ci-dessus, la deuxième et la troisième séquence peuvent être superposées, c'est-à-dire qu'une partie de la deuxième séquence correspond à la troisième séquence. Aussi, les molécules d'acides nucléiques hybrides telles qu'illustrées par les séquences SEQ ID NO : 116 à 128 permettent donc aussi de sélectionner des acides nucléiques interférents contre la protéine cycline D1 , murine ou humaine, ou encore la protéine Ras.
Chacune des séquences susmentionnées, lorsqu'il n'est pas mentionné STOP (codon souligné dans les séquences SEQ ID NO : 125 et 126) dans sa dénomination (sous le numéro de séquence) est terminée par un codon terminateur TAG, TAA ou TGA.
Du fait de la complémentarité des bases, l'homme du métier est capable de déterminer les correspondances des séquences susmentionnées en ARN.
De manière avantageuse, la molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée est contenue dans un vecteur, notamment un vecteur eucaryote. Plus avantageusement les vecteurs sont constitués essentiellement des séquences suivantes : pBABE, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 129 ou 130 ou MSCV, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 131 .
En outre, l'invention concerne une cellule eucaryote comprenant au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également un animal, notamment un mammifère, en particulier un rongeur comprenant au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie ci-dessus.
L'invention embrasse tout type de cellule eucaryote capable d'interférence à ARN. L'homme du métier, avec ses connaissances générales des cellules eucaryotes cultivées in vitro est capable d'identifier aisément les cellules appropriées et de déterminer les méthodes de transformation ou transfection pour y introduire la molécule d'acides nucléiques définie ci-dessus.
L'invention concerne de plus une molécule d'acides nucléiques hybride intermédiaire comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction, telle que définie précédemment,
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence, telle que définie précédemment,
et au moins un site de coupure par une enzyme de restriction, permettant l'insertion d'une molécule d'acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'un acide nucléique interfèrent,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
Avantageusement, l'invention concerne la molécule susmentionnée dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa version non modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1 )
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C, et notamment dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée, l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5. Cette molécule d'acides nucléiques hybride intermédiaire est en fait la structure de base de la molécule d'acides nucléiques hybride susmentionnée, ledit au moins un site de coupure par une enzyme de restriction permettant le clonage de ladite deuxième séquence selon le gène pour lequel il est souhaitable de cribler des acides nucléiques interférents augmentant l'expression dudit gène et/ou l'activité dudit gène et/ou d'acides ribonucléiques transcrits dudit gène.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie précédemment, pour le criblage, notamment in vitro, d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression de gènes et/ou l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes.
L'invention concerne par ailleurs un kit, ou une trousse, comprenant :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite précédemment, et
- au moins une cellule eucaryote.
Une trousse ou un kit selon l'invention peut également comprendre :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite précédemment, et
- des moyens de transformation d'une cellule eucaryote par ladite molécule d'acides nucléiques hybride.
Une trousse ou un kit selon l'invention peut également comprendre :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que décrite précédemment, et
o des moyens de transformation d'une cellule eucaryote par ladite molécule d'acides nucléiques hybride, et/ou
o au moins une cellule eucaryote, capable d'interférence à ARN.
Les moyens de transformation utilisés peuvent être des moyens de transformation des cellules eucaryotes tels que des moyens de transformation des cellules au phosphate de calcium, des moyens de transformation avec des liposomes, des moyens de transformation avec des agents poly cationiques ou encore de moyens de transformation par électrolocation ou nucléofection.
L'invention concerne également un kit ou une trousse comprenant :
- au moins une molécule d'acides nucléiques hydride telle que définie ci-dessus, ladite molécule étant contenue dans une cellule eucaryote, et
- des moyens de transformation de ladite cellule par des acides nucléiques interférents.
On notera que dans tout ce qui précède, il est utilisé le terme « transformation » de cellule au sens d'introduction de molécule(s) d'acides nucléiques exogène(s) dans la cellule eucaryote considérée. L'homme du métier comprendra ainsi que cette notion de transformation correspond à la notion de « transfection » communément utilisée dans l'état de la technique. L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples décrits ci- après.
Brève description des figures
La figure 1 décrit de manière schématique les différents types de molécules d'acides nucléiques hybrides décrites dans l'invention. 1 représente schématiquement la première séquence, 2 représente schématiquement la deuxième séquence et 3 représente schématiquement la troisième séquence. 3* représente la troisième séquence dans laquelle a été insérée la seconde séquence, n représente une séquence qui n'est ni la première ni la deuxième ni la troisième séquence.
La figure 2 représente les diagrammes issus du séquençage de la première séquence de la molécule d'acide nucléique hybride présentant une première séquence non mutée (diagramme du haut) et de la première séquence de la molécule d'acide nucléique hybride présentant une première séquence mutée pat une insertion d'un dinucléotide AT, indiqué par l'éclipsé (diagramme du haut).
La figure 3 représente l'alignement de la molécule d'acide nucléique hybride SEQ ID NO : 120 avec les séquences de molécules d'acides nucléiques interférents testés. Les numéros de séquence (SEQ ID) sont indiqués.
La figure 4 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 120 et transfectées avec les siRNA SEQ ID NO : 138 (1 ), SEQ ID NO : 140(3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144 (7), témoin SEQ ID NO : 161 /162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3), SEQ ID NO : 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) ou SEQ ID NO : 154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 5 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 120 non transfectées (-) ou transfectées avec les siRNA témoin SEQ ID NO : 161 /162 (T.), SEQ ID NO : 146 (F-N),
SEQ ID NO : 149 (F2), SEQ ID NO : 148 (F), SEQ ID NO : 142 (5) ou SEQ ID NO : 145
(CT). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
Les figures 6A et 6B représentent la comparaison de l'effet de la mutation de la première séquence de la molécule d'acides nucléiques hybride.
La figure 6A représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 136 transfectées avec les siRNA témoin SEQ ID NO : 161/162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3) ou SEQ ID NO : 154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 6A représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 120 transfectées avec les siRNA témoin SEQ ID NO : 161/162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3) ou SEQ ID NO : 154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 7 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la quantité d'expression de CD1 dans des cellules possédant la séquence SEQ ID NO : 1 transfectées avec l'un des siRNA suivant : SEQ ID NO : 146 (B), SEQ ID NO : 147 (C), SEQ ID NO : 148 (D), SEQ ID NO : 149 (E), SEQ ID NO : 150 (F), SEQ ID NO : 151 (G), SEQ ID NO : 152 (H), SEQ ID NO : 153 (I), SEQ ID NO : 155 (J), SEQ ID NO : 156 (K), SEQ ID NO : 154 (L), SEQ ID NO : 137 (M), SEQ IDNO : 138 (N), SEQ ID NO : 139 (O), SEQ ID NO : 140 (P), SEQ ID NO : 141 (Q), SEQ ID NO : 142 (R), SEQ ID NO : 143 (S), SEQ ID NO : 144 (T) ou SEQ ID NO : 145 (U), par rapport à des cellules possédant la séquence SEQ ID NO : 120 et transfectées avec les siRNA témoin (SEQ ID NO : 161/162). Les résultats sont exprimés en pourcentage. En contrôle sont présentés les résultats obtenus pour des cellules non transfectées (U).
Les siRNA augmentant l'expression sont indiquées par une flèche.
La figure 8 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 121 et transfectées avec les siRNA SEQ ID NO : 139 (2), SEQ ID NO : 140 (3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144 (7), témoin SEQ ID NO : 161 /162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3), SEQ ID NO : 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) ou SEQ ID NO : 154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 9 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 121 et transfectées avec les siRNA SEQ ID NO : 139 (2), SEQ ID NO : 140 (3), SEQ ID NO : 142 (5), SEQ ID NO : 144 (7), témoin SEQ ID NO : 161 /162 (T.), SEQ ID NO : 150 (F3), SEQ ID NO : 152 (F5), SEQ ID NO : 153 (F6) ou SEQ ID NO : 154 (F-M). Les protéines sont révélées avec un anticorps anti HA (B.). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (A.).
La figure 10 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la quantité d'expression de CD1 (en unité arbitraire) dans des cellules possédant une construction avec la séquence Kozak murine (A), la séquence Kozak murine mutée par insertion AT (B), ou la séquence Kozak optimisée (C). Les barres d'erreurs indiquent l'écart type obtenu pour trois expériences indépendantes.
La figure 11 représente un western blot réalisé à partir de cellules possédant une construction avec la séquence Kozak murine (A), la séquence Kozak murine mutée par insertion AT (B), ou la séquence Kozak optimisée (C). Le niveau de cycline D1 est révélé avec un anticorps anti-cycline D1 (1 . RB-010-PABX (AB3), Fisher scientific). En contrôle, la charge de protéine est révélée avec un anticorps anti actine (2. ab6276, Abcam).
La figure 12 représente un histogramme montrant l'abondance des ARN messagers cyclines D1 dans des cellules possédant une construction avec la séquence Kozak murine (A), la séquence Kozak murine mutée par insertion AT (B), ou la séquence Kozak optimisée (C).
La figure 13 représente un histogramme de résultats de FRET représentant la quantité d'expression de CD1 (en unité arbitraire) dans des cellules possédant l'une des constructions suivantes :
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 ayant une insertion AT (Ntag-mKozAT) ; barres noires,
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 (Ntag-mKoz); barres blanches,
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 AT (Ctag-mKozAT) ; barres grises,
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 ayant une insertion AT (Ctag-mKozAT) ; barres avec des hachures penchées, et
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 optimisée pour augmenter l'expression (Ntag-KozOPT) ; barres avec des hachures horizontales,
traitées avec différents siRNA : contrôle non relevant (A) ; siRNA SEQ ID NO : 149/150 (B), siRNA SEQ ID NO : 155 (C), siRNA SEQ ID NO : 154 (D) et siRNA SEQ ID NO : 142 (C).
EXEMPLES
Exemple 1 : Exemple d'une construction d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant la première séquence SEQ ID NO : 37 (insertion AT).
Pour obtenir une construction comprenant une première séquence mutée représentée par la séquence SEQ ID NO : 36, les inventeurs ont utilisé une stratégie de mutagenèse dirigée en introduisant dans la séquence Kozak SEQ ID NO : 9 un di- nucléotide AT, par PCR, en utilisant le kit GeneArt® (Life technology), selon les instructions du fournisseur.
Brièvement, l'insertion se fait au moyen du vecteur matrice comprenant la séquence SEQ ID NO : 9 et des oligonucléotides sens et antisens contenant la mutation/insertion AT :
sens : 5'-TGGTACGGCgccaccATatggactacaaggac-3' (SEQ ID NO : 132),
antisens : 5'-gtccttgtagtccatATggtggcGCCGTACCA-3' (SEQ ID NO : 133).
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) se fait dans les conditions suivantes : Étape 1 -méthylation du plasmide matrice: 20 minutes à 37<Ό
Etape 2: PCR/mutagénèse
a- 1 cycle de 2 minutes à 95 °C
b- 1 cycle de 30 secondes à 95 °C
1 cycle de 30 secondes à 60 °C
1 cycle de 4 minutes à 68 °C
c- Retour à b 35 fois
d- 1 cycle de 5 minutes à 68 °C
e- 1 un cycle à durée indéterminée à 4<Ό pour conserver le produit de réaction Les produits de PCR ainsi obtenu sont alors séquencés et les vecteurs comprenant la séquence SEQ ID NO : 59 sont sélectionnés.
La figure 2 montre les résultats du séquençage.
Exemple 2: Exemple de construction d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant la première séquence SEQ ID NO : 36 (substitution G->T).
Pour obtenir une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant une première séquence mutée par substitution du G situé juste après l'ATG par un T, il suffit :
1 -soit de remplacer le tag en ammenant un tag qui débute par T à la place d'un G (HA à la place de Flag par exemple),
2-soit on réalise une insertion d'un triplet (1 codon) afin d'ajouter un acide aminé codé par un codon commençant par un T. Il faut ajouter 3 bases (ou un multiple de 3) pour garder le cadre de lecture de la traduction du peptide rapporteur qui suit.
Dans le cas ou la modification de la séquence codante n'a pas d'importance, il est aussi possible de réaliser une mutagenèse dirigée comme indiquée à l'exemple 1 , en utilisant les oligonucléotides suivants :
sens : 5'-TGGTACGGCgccaccatgTTRactacaaggac-3' (SEQ ID NO : 157), R étant une purine
antisens : 5'-gtccttgtagtYAAcatggtggcGCCGTACCA-3' (SEQ ID NO : 158), Y étant une pyrimidine.
Exemple 3 : Exemple de transformation de cellules eucaryote par la molécule d'acides nucléiques hybride
Selon les expériences à mener plusieurs techniques de transfection peuvent être utilisées :
a- Transfection à Lipofectamine ®3000 (Invitrogen) :
Cette méthode permet de transfecter de manière rapide les cellules de manière transitoire avec les constructions d'acides nucléiques hybrides. La transfection est réalisée selon les instructions du fournisseur.
b- Infection virale après production de virus contenant les constructions d'intérêt : Afin d'obtenir des cellules qui expriment de manière stable une molécule d'acides nucléiques hybride selon l'invention, les inventeurs ont tiré avantage de l'infection virale.
Le protocole utilisé est le suivant :
Jour 1 : 3x106 cellules 293T en croissance exponentielle sont ensemencées dans des boites de 100 mm avec 10 mL de milieu complet (DMEM, 10% sérum de veau fœtal, pénicilline, streptomycine et L-glutamine) et incubée à 37<Ό toute la nuit.
Jour 2 : 2 à 3 heures avant la transfection, le milieu de culture est changé afin de limiter les variations de pH.
Dans un tube, les plasmides suivants sont ajoutés dans l'ordre :
- 12 μg de vecteur MSCV ou de vecteur rétroviral comprenant la molécule d'acides nucléiques hybrides,
- 6 μg de plasmide Gag-pol, et
- 2 μg de plasmide Eco, (protéine de reconnaissance virale spécifique de cellules murines, utilisée pour des raisons de sécurité liées aux manipulations d'OGM). Ensuite, 500 μΐ d'eau stérile sont ajoutés aux vecteurs. Puis 500 μΐ de tampon 2x HBS sont ajoutés, et l'ensemble est agité sans toutefois être soumis à une agitation au vortex. Enfin 50 μΐ d'une solution de CaCI2 ph 5,5 est ajoutée, et le mélangé est agité sans toutefois être soumis à une agitation au vortex. Le milieu HSB 2x est préparé de la manière suivante : dissoudre 0,8 g de NaCI, 0,027 g de Na2HP04«2H20, et 1 .2 g d'HEPES dans un volume de 90 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 7.05 avec du NaOH 0,5 N, et ajuster le volume à 100 mL avec de l'eau distillée. Stériliser la solution en la filtrant au travers d'un filtre possédant des pores de 0,22 μηι, et aliquoter la solution par 5 mL avant congélation à -20^ pour une durée maximum d'un an.
Le mélange est laissé à température ambiante 20 à 30 min avec agitation douce occasionnelle. Le mélange est alors ajouté au milieu de culture et les cellules sont incubées à 37 <Ό toute la nuit.
Jour 3 : le matin du troisième jour, environ la moitié du milieu est changé. Le milieu est alors conservé à 4 <Ό. L'opération est renouvelée toutes les 6-heures et le surnageant conservé à 4°C. Le soir, les surnageant sont mélangés et éventuellement centrifugés à l OOOOrpm toute la nuit.
Jour 4 : Les virus sont récupérés, et le milieu est changé trois fois dans la journée pour maintenir les virus infectieux.
Jour 5 : les virus sont filtrés sur un filtre 0,45 μηι et utilisés pour infecter des cellules NIH3T3 pendant 1 à 2 heures dans un volume de 1 ,5 à 2 mL comprenant 8 μg/mL de polybrene. Puis 1 0 mL de milieu sont ajoutés et les cellules ont incubées toute la nuit. Jour 6 : le milieu est changé avec 10 mL de milieu frais.
Jours 8 et 9 : les cellules sont alors analysées par cytométrie de flux pour tester l'expression de protéines fluorescentes.
Les cellules sont alors infectées avec la molécule.
Exemple 4 : Exemple de criblage de molécules d'acides nucléiques interfèrent augmentant l'expression de gènes et/ou l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes.
1 -Protocole
- culture de cellules,
o les cellules stables exprimant la construction d'acides nucléiques hybride sont maintenues en culture sous-confluentes à 37°C, 5%C02 dans un incubateur.
- mises en plaque,
Le matin de la transfection des siRNA à cribler, les cellules stock exprimant la construction hybride sont traitées à la trypsine pour être décollées du support de culture et ensemencées en plaques 24 puits afin d'atteindre une confluence de cellules adhérentes de 40 à 80% le soir.
- préparation des siRNA et transfection
Les siRNA à tester sont préparés selon le protocole Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Life technologies). Brièvement, 1 ,5 μΐ de Lipofectamine® est diluée dans 25 μΐ de milieu OPTI-MEM®. En parallèle, 5 pmol de siRNA dans Ο,δμΙ d'eau stérile sont dilués dans 25 μΐ de milieu OPTI-MEM®. Les deux solutions d'OPTI-MEM® sont alors mélangées et incubées pendant 5 minutes à température ambiante.
Le mélange précédent de 50 μΐ est alors ajouté dans chaque puits. Les cellules sont incubées à 37<Ό jusqu'au lendemain.
- Analyse des résultats
Le lendemain, les cellules sont lavées au PBS puis lysées au moyen d'un tampon de lyse (TRIS 10mM pH=8, EDTA 1 m M, NP-40 0,05%, +/- inhibiteurs de protéase-ROCHE-cOmplete) et d'une étape de sonication à raison de 5 cycles de sonication au bioruptor (Diagenode), composés de 15' de sonication active (puissance maximum de l'appareil) suivies de 15' de pause, afin de récupérer les protéines intra-cellulaires, notamment la protéine de fusion produite par la séquence hybride. Les lysats protéiques des différentes conditions testées sont ensuite normalisés au moyen d'une quantification d'ADN ou de protéines, afin de comparer une quantité totale équivalente de matériel issu des différentes conditions de traitement. Les lysats normalisés sont ensuite analysés en western blot à l'aide d'un anticorps spécifique du produit de traduction de la construction hybride, ou en mesure de FRET, ou de fluorescence si le produit de traduction de la construction hybride le permet.
2-Résultats
a-Mutation par insertion AT
Dans une première série d'expériences, les inventeurs ont réalisé un criblage de molécules interférentes selon l'invention en utilisant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 220. Dans cette molécule la première séquence est CGCGCCATatgg (SEQ ID NO : 62),
la seconde séquence est :
ACTACAAGGACGACGATGACAAGCTCGATGGAGGATACCCCTACGACGTGCCCGA CTACGCCGGAGGACTCGAGG (SEQ ID NO : 134), et correspond à un enchaînement FLAG-intercalaire-HA-intercalaire
et la troisième séquence est :
AACACCAGCTCCTGTGCTGCGAAGTGGAGACCATCCGCCGCGCGTACCCTGACAC CAATCTCCTCAACGACCGGGTGCTGCGAGCCATGCTCAAGACGGAGGAGACCTGT GCGCCCTCCGTATCTTACTTCAAGTGCGTGCAGAAGGAGATTGTGCCATCCATGCG GAAAATCGTGGCCACCTGGATGCTGGAGGTCTGTGAGGAGCAGAAGTGCGAAGA GGAGGTCTTCCCGCTGGCCATGAACTACCTGGACCGCTTCCTGTCCCTGGAGCCC TTGAAGAAGAGCCGCCTGCAGCTGCTGGGGGCCACCTGCATGTTCGTGGCCTCTA AGATGAAGGAGACCATTCCCTTGACTGCCGAGAAGTTGTGCATCTACACTGACAAC TCTATCCGGCCCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAACTGCTTCTGGTGAACAAGCTCA AGTGGAACCTGGCCGCCATGACTCCCCACGATTTCATCGAACACTTCCTCTCCAAA ATGCCAGAGGCGGATGAGAACAAGCAGACCATCCGCAAGCATGCACAGACCTTTG TGGCCCTCTGTGCCACAGATGTGAAGTTCATTTCCAACCCACCCTCCATGGTAGCT GCTGGGAGCGTGGTGGCTGCGATGCAAGGCCTGAACCTGGGCAGCCCCAACAAC TTCCTCTCCTGCTACCGCACAACGCACTTTCTTTCCAGAGTCATCAAGTGTGACCC GGACTGCCTCCGTGCCTGCCAGGAACAGATTGAAGCCCTTCTGGAGTCAAGCCTG CGCCAGGCCCAGCAGAACGTCGACCCCAAGGCCACTGAGGAGGAGGGGGAAGT GGAGGAAGAGGCTGGTCTGGCCTGCACGCCCACCGACGTGCGAGATGTGGACAT
C (SEQ ID NO : 135)
Dans les conditions expérimentales telles que décrites ci-dessus, les inventeurs ont testés les différents acides nucléiques interférents (siRNA) suivant :
HA linker Nter : GAGCUACCUCCUAUGGGGAUG (SEQ ID NO : 137),
HA : AUGCUGCACGGGCUGAUGCGG (SEQ ID NO : 138),
HA 2 : GGGAUGCUGCACGGGCUGAUG (SEQ ID NO : 139),
HA 3 : AUGGGGAUGCUGCACGGGCUG (SEQ ID NO : 140),
HA 4 : UGGGGAUGCUGCACGGGCUGA (SEQ ID NO : 141 ),
HA 5 : GGGGAUGCUGCACGGGCUGAU (SEQ ID NO : 142),
HA 6 : GGAUGCUGCACGGGCUGAUGC (SEQ ID NO : 143),
HA 7 : GAUGCUGCACGGGCUGAUGCG (SEQ ID NO : 144),
HA Linker Cter : AGCCGGCGACCUCCUAUGGGG (SEQ ID NO : 145),
FLAG N : CUGCUGCUACUGUUCGAGCUA (SEQ ID NO : 146),
FLAG N2 : UUCCUGCUGCUACUGUUCGAG (SEQ ID NO : 147),
FLAG : AUGUUCCUGCUGCUACUGUUC (SEQ ID NO : 148),
FLAG V2 : CUGAUGUUCCUGCUGCUACUG (SEQ ID NO : 149),
Flag 3 : CUGAUGUUCCUGCUGCUACUG (SEQ ID NO : 150),
FLAG 4 : UGAUGUUCCUGCUGCUACUGU (SEQ ID NO : 151 ),
FLAG 5 : GAUGUUCCUGCUGCUACUGUU (SEQ ID NO : 152),
FLAG 6 : ACCUGAUGUUCCUGCUGCUAC (SEQ ID NO : 153),
FLAG M : AUGUUCCUGCUGCUGCUAUUC (SEQ ID NO : 154),
FLAG+linker Cter : CUGCUGCUACUGUUCAGCCGG (SEQ ID NO : 155), et
FLAG Cter2 ha et : UUCCUGCUGCUACUGUUCAGC (SEQ ID NO : 156).
Afin de faciliter la lecture, la figure 3 représente l'alignement les différents acides nucléiques interférents (siRNA) testés sont sur la séquence de la molécule SEQ ID
NO : 120.
En contrôle de tranfection de siRNA, les siRNA témoins négatifs (« scramble » ; T.) sont également transfectés. Ces siRNA ont la séquence sens suivante : 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3' (SEQ ID NO : 161 ) et le brin complémentaire possède la séquence suivante : 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO : 162).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 4. De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA Flag M (SEQ ID NO : 154) permet de détecter un niveau d'expression du peptide marqueur CD1 plus élevé que le niveau observé avec un témoin non relevant.
Afin de confirmer que la position de la troisième séquence n'avait pas d'effet sur le criblage d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression, les inventeurs ont utilisé la molécule d'acides nucléiques hybrides SEQ ID NO 118.
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 5.
De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA Flag N (SEQ ID NO : 146) et le siRNA HA-CT (SEQ ID NO : 145) permet de détecter un niveau d'expression du peptide marqueur CD1 plus élevé que le niveau observé avec un témoin non relevant.
Enfin, les inventeurs ont confirmé que seule une molécule d'acides nucléiques hybride présentant une première séquence mutée permettait de cribler des molécules d'acides nucléiques interférents en comparant l'effet d'un acide nucléique interférant en présente d'une molécule d'acide nucléiques hybride présentant une première séquence non mutée (SEQ ID NO : 136).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés aux Figure 6A et 6B.
On constate de cette expérience que le siRNA FLAG M (SEQ ID NO : 154) permet de détecter une augmentation du niveau d'expression de CD1 uniquement lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride comporte une mutation dans sa première séquence (Figure 6A), mais pas lorsque la première séquence n'est pas mutée (Figure 6B).
b- Mutation par substitution G->T
Dans une seconde série d'expériences, les inventeurs ont réalisé un criblage de molécules interférentes selon l'invention en utilisant la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 121 . Dans cette la première séquence est CCAGCCATGt (SEQ ID NO : 52).
En contrôle de transfection de siRNA, les siRNA témoins négatifs (« scramble » ; T.) sont également transfectés. Ces siRNA ont la séquence sens suivante : 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3' (SEQ ID NO : 161 ) et le brin complémentaire possède la séquence suivante : 5'-ACGUGACACA UUCGGAGAAtt -3' (SEQ ID NO : 162).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 8.
De cette figure on constate que parmi les différents siRNA testés, le siRNA Flag M (SEQ ID NO : 154) permet de détecter un niveau d'expression du peptide marqueur CD1 plus élevé que le niveau observé avec un témoin non relevant. On observe donc les mêmes résultats que ceux obtenus pour la molécule d'acides nucléiques hybride SEQ ID NO : 120.
Les inventeurs ont confirmé que seule une molécule d'acides nucléiques hybride présentant une première séquence mutée permettait de cribler des molécules d'acides nucléiques interférents en comparant l'effet d'un acide nucléique interférant en présence d'une molécule d'acide nucléiques hybride présentant une première séquence non mutée (SEQ ID NO : 136).
Les résultats obtenus par Western Blot sont représentés à la Figure 9.
On constate de cette expérience que le siRNA FLAG M (SEQ ID NO : 154) permet de détecter une augmentation du niveau d'expression de CD1 uniquement lorsque la molécule d'acides nucléiques hybride comporte une mutation dans sa première séquence.
En conclusion, seules des molécules d'acides nucléiques hybrides comprenant une première séquence mutée, notamment par une substitution G->T ou une insertion d'un dinucléotide AT, permet de cribler des molécules d'acides nucléiques interférents qui augmentent l'expression.
Exemple 5 : Exemple de criblage utilisant le FRET comme moyen de détection
Les cellules exprimant de manière stable la construction SEQ ID NO : 120, ont été ensemencées en plaques 24 puits le matin afin d'atteindre une confluence de 60% le soir de la transfection avec les siRNA. Le soir, les cellules ont été transfectées à la lipofectamine (RNAimax-procédure du fournisseur) à raison de 10 nM de siRNA par puits. Différents siRNA (voir exemple 4) ont été testés afin d'évaluer leur impact respectifs sur l'expression du transgène d'intérêt. Le lendemain matin, les cellules ont été lavées au PBS 1 x, lysées dans 100 microlitres du tampon (TRIS 10 mM pH=8, EDTA 1 mM, 0,05% NP-40, + inhibiteurs de protéases), collectées dans des tubes eppendorf, puis soumises à sonication à raison de 5 cycles composés de 15 secondes de sonication active (puissance maximum) suivies de 15 secondes de pause, dans un sonicateur à bain de la marque Diagénode. Les lysats cellulaires sont ensuite centrifugés pour 5 minutes à 15000 rcf à 4°C.
Le surnagent est récupéré et après ajustement à concentration similaire en ADN (et/ou protéine) de chacun des échantillons (après mesure de la concentration en ADN par quantification au nanodrop, ou concentration protéique par la méthode de Bradford) à raison de 100 microgrammes d'ADN par litre, 5 microlitres par puits sont déposés en triplicats en boite 384 puits (Greiner-#784076). Un mélange de 5 microlitres d'anticorps donneur (CISBIO-#610HATAB) et accepteur (CISBIO-#61 FG2XLB) selon les instructions du fournisseur (CISBIO), est ajouté à chacun des puits et suivi d'une incubation à l'abri de la lumière et à température ambiante pour 1 heure. La lecture de fluorescence provenant du FRET entre le donneur et l'accepteur dirigés contre les TAGs produits par le transgène d'intérêt (Flag et HA) est réalisée au moyen d'un appareil d'HTRF (PHERAstar FS-BMG LABTECH) selon les instructions du fournisseur. Après normalisation des données par rapport au contrôle ne présentant pas de FRET (lysat ne contenant pas de TAGs capable de produire un signal de FRET), une augmentation de 10% du signal par rapport au siRNA contrôle (T.) est considérée significative pour l'augmentation de l'expression du transgène d'intérêt.
Les résultats sont indiqués à la figure 7.
Les résultats quantitatifs de FRET montrent que les molécules d'acides nucléiques interférents F-N (SEQ ID NO : 146 ; B), Flag (SEQ ID NO : 148 et 149; D et E), FLAG Cter (SEQ ID NO : 156 ; J), F-M (SEQ ID NO : 154 ; L) et H A3 (SEQ ID NO : 140 ; P) augmentent l'expression. L'ensemble de ces données montre que le procédé selon l'invention permet de cribler des molécules d'acides nucléiques interférents qui augmentent l'expression de gènes.
Exemple 6 : détermination du mécanisme sous-iacent
Comme mentionné ci-dessus, on constate que le criblage de molécules d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression génique nécessite l'utilisation d'une séquence Kozak présentant une mutation déterminée. Une telle séquence Kozak a pour effet de réduire l'expression du gène qu'elle contrôle, c'est à dire réduire la traduction de la protéine.
Dans un premier temps les inventeurs ont donc comparé les niveaux d'expression protéique de la protéine cycline D1 dont l'expression protéique est contrôlée par
- la séquence Kozak murine de la cycline D1 (mKoz), notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 12
- la séquence Kozak murine de la cycline D1 présentant une insertion AT selon l'invention (mKozAT), représentée par la séquence SEQ ID NO : 9, et
- la séquence Kozak de la cycline D1 optimisée (KozOPT), de séquence SEQ ID NO : 62.
Les lignées cellulaires de fibroblastes murins dépourvues du gène endogène de la Cycline D1 (Ccndl-/-) et exprimant de façon stable la construction mKoz-Ntag-CycD1 ou mKozAT-Ntag-CycD1 (SEQ ID NO : 120) ou KozOPT-Ntag-CycD1 , ont été ensemencées le matin du premier jour et cultivées dans un incubateur à 37°C avec un taux stable de C02 à 5%, afin d'être d'atteindre une confluence cellulaire de l'ordre de 80% le lendemain. A ce stade, les lignées ont été collectées afin d'en extraire soit les protéines (tampon de lyse = Tris 10 m M, EDTA 1 mM et NP-40 0,05%), soit les ARN totaux avec du Trizol.
Les lysats protéiques ont ensuite été normalisées à une concentration équivalente de protéines totales par la méthode de Bradford, puis analysées en western blot contre l'actine ou la Cycline D1 . Ces échantillons ont aussi été analysés par la méthode de Tandem-HTRF décrite à l'exemple 5.
Les résultats obtenus sont présentés à la figure 10 et à la figure 11 .
Les résultats illustrent une diminution de l'expression issue de mKozAT comparée à la séquence mKoz sauvage ou comparé à une séquence artificielle KozOPT. Cela signifie donc que la séquence Kozak mutée a pour effet de diminuer l'expression protéique.
Les ARN messager ont été utilisées pour générer de l'ADN complémentaire (ADNc) par Transcription Reverse, puis ces ADNc ont été analysées en PCR quantitative (qPCR). Le taux d'ARN messager issu des constructions mKoz-Ntag- CycD1 ou mKozAT-Ntag-CycD1 ou KozOPT-Ntag-CycD1 à été évalué d'après la qPCR après normalisation en utilisant les gènes de ménage (Hprt, B2M, Trfrl , Tubb et Gapdh).
Les résultats sont présentés à la figure 12.
II apparaît un taux d'ARN messager pour Ntag-CycD1 comparable (écart non significatif entre les groupes par un test de Student) entre les lignées mKoz-Ntag- CycD1 ou mKozAT-Ntag-CycD1 ou KozOPT-Ntag-CycD1 .
Aussi, le niveau d'expression est donc modulé à un niveau traductionnel. Exemple 7 : Comparaison des séquences Kozak dans le cadre du criblage des siRNA de l'invention
Afin de confirmer l'importance des séquences Kozak mutées, les inventeurs ont enfin testé l'effet de différents siRNA (augmentation ou diminution de l'expression) à partir de différentes constructions :
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 ayant une insertion AT (Ntag-mKozAT),
- Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 (Ntag-mKoz),
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 AT (Ctag-mKozAT),
- Cycline D1 étiquetée en C-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 ayant une insertion AT (Ctag-mKozAT), et - Cycline D1 étiquetée en N-terminal sous contrôle de la Kozak murine de la cycline D1 optimisée pour augmenter l'expression (Ntag-KozOPT).
Plusieurs siRNA testés à la figure 7 ont été utilisés : SQE ID NO : 149/150 ; SEQ ID NO : 155, SEQID NO : 154 et SEQ ID NO : 142.
Les tests comparatifs sont présentés à la figure 13.
Ces données montrent que quel que soit la séquence Kozak, un siRNA diminuant l'expression sera toujours identifié comme tel. Par contre, les siRNA augmentant l'expression sont systématiquement identifié lors que le rapporteur est mis sous contrôle d'une séquence Kozak mutée (présentant ici une insertion AT).
L'ensemble de ces résultats confirment l'importance de la région régulant la traduction du rapporteur dans le criblage des siRNA qui augmentent l'expression de gènes selon l'invention.
L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de criblage d'acides nucléiques interférents augmentant :
- l'expression de gènes et/ou
- l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes, lesdits acides nucléiques interférents présentant au moins en partie une complémentarité de séquence avec ledit gène ou ledit ARN, et
ledit procédé comprenant une étape d'introduction, dans une cellule eucaryote, notamment apte à réaliser de l'interférence à ARN, d'une molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents à cribler,
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminué d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la molécule d'acides nucléiques hybride comprend ladite première séquence positionnée amont de ladite troisième séquence.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la dite molécule d'acide nucléique est une molécule d'acides désoxyribonucléiques, notamment double brin, éventuellement contenu dans un vecteur, ou une molécule acides ribonucléiques, notamment simple brin.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak représentée, dans sa version non modifiée, par la séquence suivante :
5'- ssmRccA(T/U)GG -3' (SEQ ID NO : 1 )
où R représente un purine, s représente G ou C et m représente A/U ou C.
5. Procédé selon l'un quelconque des revendications 1 , 2 ou 3, dans lequel ladite première séquence est une séquence Kozak comprenant ou consistant en, dans sa version modifiée, l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite deuxième séquence comprend de 18 à 10000 nucléotides au moins en partie complémentaire de la séquence desdits acides nucléiques interférents.
7. Molécule d'acides nucléiques hybride comprenant :
- une première séquence non codante destinée à initier la traduction,
- une seconde séquence au moins en partie complémentaire d'au moins un acide nucléique interfèrent, et
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
8. Molécule d'acides nucléiques hybride selon la revendication 7, ladite molécule d'acide nucléique étant choisie parmi les molécules de séquence suivante : SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 117, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 119, SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 121 , SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 123, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO : 125, SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO : 127 et SEQ ID NO : 128.
9. Cellule eucaryote comprenant au moins une molécule d'acides nucléiques hybride telle que définie à la revendication 7 ou la revendication 8.
10. Kit, comprenant :
- au moins une molécule d'acides nucléiques selon la revendication 7 ou la revendication 8, et
- au moins une cellule eucaryote et/ou des moyens de transformation d'une cellule eucaryote par ladite molécule d'acides nucléiques hybride.
11. Molécule d'acides nucléiques hybride intermédiaire comprenant : - une première séquence non codante destinée à initier la traduction, telle que définie dans la revendication 1 ,
- une troisième séquence nucléotidique codant au moins un peptide déterminé, ladite troisième séquence étant sous contrôle traductionnel en cis de la première séquence, telle que définie dans la revendication 1 ,
et au moins un site de coupure par une enzyme de restriction, permettant l'insertion molécule d'acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'un acide nucléique interfèrent,
ladite première séquence étant modifiée, par substitution, délétion ou addition d'au moins un nucléotide, de sorte que le niveau de traduction dudit au moins un peptide est diminuée d'au moins 10% par rapport au niveau de traduction dudit au moins un peptide sous contrôle de ladite première séquence dans sa version non modifiée, notamment optimale.
12. Utilisation d'au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 7 ou la revendication 8, ou la revendication 11 , pour le criblage d'acides nucléiques interférents augmentant l'expression de gènes et/ou l'activité de gènes et/ou d'acides ribonucléiques transcrits desdits gènes.
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