WO2010125293A1 - Adressage d'acides nucléiques dans les mitochondries - Google Patents

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WO2010125293A1
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protein
nucleic acid
mitochondria
psu9
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PCT/FR2010/050792
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Laurence Drouard
Antonio Placido
François SIEBER
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Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
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    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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    • C12N2795/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a shuttle system for importing nucleic acids of interest into a mitochondria.
  • This system is based on the use of a fusion protein between a mitochondrial targeting sequence and a nucleic acid binding protein of interest.
  • This shuttle system is useful, for example, in the agronomic field, in the field of gene therapy, and in research projects aimed at characterizing the function of mitochondrial genes.
  • Mitochondria are organelles present in almost all eukaryotic cells. They are involved in many fundamental processes such as the production of ATP by oxidative phosphorylation, amino acid synthesis and programmed cell death. It is now accepted that mitochondria originate from the endosymbiosis of an ⁇ -proteobacterium within a proto-eukaryotic cell. In fact, the mitochondria have their own genetic material, but this is no more than the remnant of the ancestral ⁇ -proteobacteria. It codes only for a limited number of genes and the vast majority of macromolecules (e.g. about 1500 proteins and some RNAs) required for mitochondrial biogenesis now depend on the expression of nuclear genes. These macromolecules are then transported from the cytosol into the organelle.
  • the TOM for Translocase of the Outer Mitochondrial Membrane
  • the TIM complex for "Translocase of the Inner Mitochondrial Membrane"
  • the mechanism of protein transport requires a particular sequence, the mitochondrial targeting sequence, generally located at the N-terminus of the protein and recognized by the TOM complex (Habib SJ, Methods CeII Biol, 80, 761 -781, 2007). Once the protein translocated in the matrix space, this addressing sequence is then cleaved by a peptidase. Stan et al., (Mol CeII Biol, 23, 2239-2250, 2003) thus describes that the DHFR protein fused to the mitochondrial targeting sequence pSu9 is imported into yeast mitochondria.
  • RNA transport in mitochondria Compared to proteins, a smaller number of RNAs are imported into mitochondria. Nevertheless, this transport of RNA is also essential for cell viability. It is non-coding RNA and more particularly transfer RNA (tRNA). Unlike proteins, the mechanisms of RNA transport in mitochondria are poorly known and appear to use different protein components in different organisms (Salinas et al., Trends in Biochem, 33, 320-329, 2008).
  • the mitochondrial genome undergoes numerous point mutations (especially in mammals), insertions, deletions or recombinations (for example in higher plants). These more or less important modifications of the mitochondrial DNA lead to dysfunctions which have serious repercussions on the functioning of the cell. Such dysfunctions are at the center of various neurodegenerative and neuromuscular human diseases, diabetes, aging, and even certain cancers (Bonnet et al., Biochem Biophys Acta, 1783, 1707-1717, 2008, Florentz et al., CeII Mol Life Sci, 60, 1356-1375, 2003, Trifunovic et al., Nature, 429, 417-423, 2004).
  • mitochondrial dysfunction In plants, mitochondrial dysfunction, often related to the presence of unusual coding sequences in the organelle genome, is responsible for the cytoplasmic male sterility (MSC) phenomenon. This phenomenon is reflected in the inability of plants to produce functional pollen and is a widely used tool in the production of hybrid seeds that are more vigorous in crops such as maize, cotton or rice (Budar and Pelletier, CR Acad Sci , 324, 543-550, 2001).
  • One of the possible approaches to complement a mutated mitochondrial gene is to introduce a gene into the nuclear genome of the cell, and to import the protein encoded by the gene into mitochondria using the mitochondrial protein import pathway.
  • this technique only complements the mitochondrial dysfunctions whose origin is protein. Indeed, this approach does not make it possible to complement mitochondrial diseases due for example to mitochondrial tRNA mutations, or to directly influence the replication, maintenance or expression of the genome of the mitochondria.
  • the main limitation of this method is to cope with difficult intracellular trafficking of highly hydrophobic proteins encoded by the mitochondrial genome.
  • mRNA messenger RNA
  • the nucleic acid of interest can be imported into plant mitochondria isolated by electroporation (Farre and Araya, Nucleic Acid Res, 29, 2484-2491, 2001) or directly (Koulintchenko et al., EMBO J, 22, 1245). -1254, 2003).
  • the introduced genes were then expressed under the control of a mitochondrial promoter.
  • the in vitro transport of DNA in electroporated mitochondria suffers from two major problems.
  • the electroporation technique causes the loss of integrity of a significant part of the organelles.
  • this technique can not be applied for the moment to whole cells. Direct DNA transport is not as deleterious as electroporation.
  • the expression of the inserted transgene remains random, weak and difficult to obtain.
  • Another technique relies on the use of PNA molecules ("Peptide
  • Nucleic Acid that is, macromolecules that mimic DNA.
  • the PNA molecules are fused with a mitochondrial targeting sequence, and can be imported into mitochondria of human cells (Muratovska et al., Nucleic Acids Res, 29, 1852-1863, 2001).
  • mitochondrial targeting sequence a mitochondrial targeting sequence that can be imported into mitochondria of human cells.
  • the PNA-peptide bond is difficult to achieve and the conjugate is vulnerable to proteases.
  • RNA transport in mitochondria Another technique relies on the use of natural RNA transport in mitochondria.
  • tRNAs encoded by the nuclear genome are transported in the organelle. This transport has been experimentally demonstrated in several organisms, including man (Salinas et al., Trends Biochem Sci, 33, 320-329, 2008, Rubio et al., Proc Natl Acad Sci, 105, 9186-9191, 2008).
  • Recently, articles have described the possibility of importing an ARNtLys into human mitochondria. Indeed, the absence of a functional mitochondrial tRNAlys leads to MERRF syndrome (for "Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers”), which leads to a serious degenerative disease. Kolesnikova et al.
  • RNALys or its derivatives can not be generalized to any which tRNA.
  • the use of the RIC complex which comprises a dozen subunits and its insertion in mitochondrial membranes is difficult to implement.
  • no large RNA, such as mRNA has been transported to date with these systems.
  • the inventors have established a strategy for developing a protein shuttle system allowing the efficient and "desired” introduction of any nucleic acid into mitochondria.
  • This protein shuttle system is based on the use of a protein capable of noncovalently attaching nucleic acids.
  • This protein overexpressed in fusion to a mitochondrial targeting sequence, is internalized in the mitochondria by carrying with it the allogeneic nucleic acid.
  • DHFR mouse cytosolic DiHydroFolate Reductase
  • the pSu9-DHFR fusion protein makes it possible to import several different nucleic acids, namely the cytosolic plant tRNAa, the larch mitochondrial tRNAHis precursor, and the mitochondrial atp9 gene mRNA. potato, in isolated mitochondria of potato. Some of these RNAs are large in size.
  • the shuttle system according to the invention has allowed the importation of a transcript of about 250 nucleotides corresponding to the precursor form of larch mitochondrial tRNA (His), and that of a complete mRNA of about 650. nucleotides, namely mitochondrial atp9 potato mRNA.
  • the pSu9-DHFR fusion protein allows the import of RNA not only in potato mitochondria, but also in yeast mitochondria.
  • the shuttle system according to the invention is therefore generalizable to the mitochondria of any organism.
  • This system also allows the import of nucleic acids other than RNA, since it has been shown that 75 nucleotide DNA can be imported into potato and yeast mitochondria.
  • the shuttle system according to the invention therefore allows the importation of any type of nucleic acid, even large, within mitochondria from any organism.
  • the implementation protocol of the invention is simple and effective.
  • this shuttle system can be used to import nucleic acids in a targeted and specific manner, by implementing it with a fusion protein capable of binding nucleic acids in a sequence-specific manner.
  • the invention provides fusion proteins between a mitochondrial targeting sequence and a nucleic acid binding protein of interest. Such fusion proteins are referred to herein as "fusion proteins according to the invention”.
  • Any mitochondrial targeting sequence may be used within the scope of the invention. Such sequences are well known to those skilled in the art and include, for example, pSu9. Other mitochondrial targeting sequences are, for example, that of the cytokrome oxidase subunit IV (coxIX) of the yeast Saccharomyces cerevisiae (Menand et al., Proc Natl Acad Sci, 95, 1 1014-1 1019, 1998).
  • mitochondrial targeting sequence can be any correctly predicted mitochondrial targeting sequence and of which function has been experimentally demonstrated, according to criteria well known to those skilled in the art (Habib et al., Methods in CeII Biology, 80, 761-781, 2007).
  • the mitochondrial targeting sequence according to the invention comprises or consists of the pSu9 sequence of the atp9 gene of Neurospora crassa.
  • mitochondrial targeting sequence pSu9 is meant here the polypeptide encoded either by the sequence SEQ ID NO: 2, or by nucleotide sequences derived from SEQ ID NO: 2.
  • Such derived nucleotide sequences may for example correspond to: a fragment of at least 50, 75, 100, 125, 150, 175 or 200 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID NO: 2;
  • allelic variant of the sequence SEQ ID NO: 2 an allelic variant of the sequence SEQ ID NO: 2; a sequence homologous to pSu9 originating from a species other than
  • Neurospora crassa provided that the addressing sequences encoded by such derived sequences retain their ability to address the fusion protein to mitochondria. This ability can easily be verified by those skilled in the art, for example using the protocols described in Example 1 .1.7 or by Pujol et al. (Proc Natl Acad Sci, 105, 6481 - 6485, 2008).
  • sequence at least 95% (for example) identical to a reference sequence is meant a sequence identical to the reference sequence except that this sequence may comprise up to five mutations (substitutions, deletions and / or or insertions) for each one hundred nucleotide portion of the reference sequence.
  • a fragment of 95 nucleotides and a sequence of 100 nucleotides comprising 5 substitutions relative to the reference sequence are two examples of sequences 95% identical to the reference sequence. Percentage identity is generally determined using sequence analysis software (e.g., the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705).
  • sequence analysis software e.g., the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705
  • the substitutions, deletions and / or insertions at the level of the nucleotide sequence do not lead to a change of reading phase, nor to the introduction of a stop codon.
  • the substitutions can either be silent or lead to mutations at the level of the protein encoded by the nucleic acid.
  • the nucleic acid binding protein of interest may be any protein capable of binding a nucleic acid non-covalently. Those skilled in the art can readily determine if a protein is capable of binding a nucleic acid by the delay gel technique (see Examples 1-1.13 and 1.2.1).
  • the nucleic acid-binding protein of interest can bind the nucleic acid of interest either nonspecifically (ie, it is capable of binding nucleic acids independently of their sequence), or in a sequence-specific manner (ie, it is not capable of binding only to nucleic acids containing a particular sequence).
  • the mitochondrial targeting sequence is fused to the nucleic acid binding protein of interest so that only one protein is translated.
  • the nucleic acid encoding the mitochondrial targeting sequence is fused to the acid encoding the nucleic acid-binding protein of interest so that there is a single, open reading phase.
  • the fusion protein according to the invention comprises the mitochondrial targeting sequence fused to the N-terminus of the protein binding a nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid binding protein of interest is murine DHFR protein, which binds nucleic acids in a non-specific manner.
  • DHFR is meant here the protein encoded by the sequence SEQ ID NO: 1
  • nucleotide sequences derived from SEQ ID NO: 1 can for example correspond to:
  • nucleic acid of interest can have any sequence.
  • nucleic acid binding protein of interest is the MS2 phage shell protein, which binds nucleic acids in a sequence-specific manner.
  • MS2 phage coat protein or "CP” is meant here the protein encoded either by nucleotides 208 to 564 of the sequence SEQ ID NO: 18, or by nucleotide sequences derived from nucleotides 208 to 564 of the sequence SEQ ID NO: 18.
  • Such derived nucleotide sequences may for example correspond to:
  • phage MS2 recognizes the stem-loop region of RNA
  • stem-loop region of MS2 RNA refers to nucleotides 154 to 172 and / or nucleotides 193 to 21 1 of the sequence SEQ ID NO: 17. Therefore, when the invention is implemented with the phage MS2 shell protein, the nucleic acid of interest must contain or be fused to at least one stem-loop region of the MS2 RNA.
  • the nucleic acid of interest may, for example, contain or be fused to at least one copy of nucleotides 154 to 172 of the sequence SEQ ID NO: 17, nucleotides 193 to 21 1 of the sequence SEQ ID NO: 17, or nucleotides 125 to 239 of the sequence SEQ ID NO: 17.
  • nucleic acid binding protein of interest may be PUMILI01 or a nucleic acid binding fragment thereof (Ozawa et al., Nature Methods, 4, 413-419, 2007). It can also be proteins such as transcription factors that specifically bind patterns known to those skilled in the art, reasons that can be found easily in the Interpro, Pfam or SCOP databases.
  • the bZip proteins of Antirrhinum majus which preferentially bind the CACGTG or TGACGT / C motifs (Martinez-Garcia et al., The Plant J, 13, 489-505).
  • a particularly preferred embodiment relates to a fusion protein comprising or consisting of a mitochondrial targeting sequence fused to the MS2 phage shell protein.
  • the mitochondrial targeting sequence preferably corresponds to the mitochondrial targeting sequence pSu9.
  • the subject of the invention is a pSu9-CP fusion protein comprising or consisting of a fragment of at least 50, 75, 100, 125, 150 or 175 amino acids of SEQ ID NO: 19, or comprising or consisting of a sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence SEQ ID NO: 19.
  • a fusion protein comprising or consisting of a mitochondrial targeting sequence fused to the DHFR protein.
  • the mitochondrial targeting sequence preferably corresponds to the mitochondrial targeting sequence pSu9. Therefore, the subject of the invention is a pSu9-DHFR fusion protein comprising or consisting of a sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence SEQ ID NO: 3, or comprising or consisting of a fragment of at least 50, 75, 100, 125, 150, 200 or 250 amino acids of SEQ ID NO: 3.
  • the fusion proteins according to the invention which comprise or consist of a sequence at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence SEQ ID NO: 3 or 19 may contain mutations such as deletions, insertions and / or amino acid substitutions. In a preferred embodiment, these proteins differ from the proteins of sequence SEQ ID NO: 3 or 19 by conservative substitutions.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a fusion protein according to the invention, as well as recombinant vectors comprising such a nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein according to the invention is preferably placed under the control of expression signals (eg promoter, enhancer, terminator, translation signals, including, for example UTR regions 5 'and 3'), so as to form an expression cassette.
  • expression signals eg promoter, enhancer, terminator, translation signals, including, for example UTR regions 5 'and 3'
  • a preferred embodiment of the invention relates to recombinant vectors for gene therapy.
  • recombinant vector for gene therapy is meant here any vector suitable for gene therapy.
  • Such vectors are generally in the form of a recombinant virus, and therefore correspond to viral vectors.
  • the viral vector may be chosen from an adenovirus, a retrovirus, in particular a lentivirus, an adeno-associated virus (AAV), a herpes virus, a cytomegalovirus (CMV), a vaccinia virus, etc.
  • the recombinant virus is a defective virus.
  • the term "defective virus” refers to a virus unable to replicate in a target cell.
  • the genome of the defective viruses is devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated, rendered non-functional or substituted by other sequences and in particular by the nucleic acid which encodes the peptide of interest.
  • the defective virus retains the sequences of its genome which are necessary for the encapsulation of the viral particles.
  • the vector contains a nucleic acid encoding a fusion protein between a mitochondrial targeting sequence (eg pSu9) and a protein that binds a nucleic acid in a sequence-specific manner (for example the phage MS2 hull protein).
  • the present invention relates to the use, in vivo or in vitro, of a fusion protein according to the invention (ie a fusion protein between a mitochondrial targeting sequence and a protein binding a nucleic acid of interest), or a nucleic acid encoding said fusion protein for importing said nucleic acid of interest into a mitochondria.
  • a fusion protein according to the invention ie a fusion protein between a mitochondrial targeting sequence and a protein binding a nucleic acid of interest
  • a nucleic acid encoding said fusion protein for importing said nucleic acid of interest into a mitochondria.
  • said fusion protein is not bound to the nucleic acid of interest covalently.
  • the fusion protein is naturally capable of binding nucleic acid of interest, without the need to implement a chemical reaction so as to create bonds covalent between the fusion protein and the nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid of interest according to the invention can be any type of nucleic acid. It may be a single-stranded or double-stranded molecule, of DNA or RNA nature, and of mitochondrial, plastid or cytoplasmic origin.
  • the nucleic acid of interest according to the invention may be an antisense RNA, or a messenger RNA (mRNA) or a complete or partial transfer RNA (tRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • tRNA complete or partial transfer RNA
  • the shuttle system of the invention has enabled the transport of nucleic acids of different sizes, including large nucleic acids such as a 775 nucleotide transcript (see Example 1.2.5). Therefore, in a particular embodiment, the nucleic acid of interest has a size greater than 24, 50, 100, or 500 bases or base pairs.
  • the nucleic acid of interest is a complete messenger RNA or a complete transfer RNA, in particular a messenger RNA including the 5 'and 3' UTR regions.
  • in vitro is meant any method that is not performed on a multicellular organism such as an animal and / or human organism.
  • in vitro methods include methods performed on cells, tissues or organs previously isolated from an animal and / or human pluricellular organism.
  • in vitro methods also include methods performed on plant cells or tissues.
  • said fusion protein comprises or consists of the mitochondrial targeting sequence pSu9 fused to the DHFR protein, or the pSu9 mitochondrial targeting sequence fused to the MS2 phage shell protein.
  • Mitochondria can either be isolated or present within a cell. The person skilled in the art can easily obtain isolated mitochondria by example using the protocols described in Examples 1.1 .4. and 1 .1.6. Mitochondria can be derived from any eukaryotic organism, such as yeasts, fungi, plants or animals (including humans).
  • the fusion protein can bind the nucleic acid in a nonspecific manner or in a sequence-specific manner.
  • a nucleic acid-binding fusion protein in a sequence-specific manner is preferably used.
  • the invention also relates to a kit for importing a nucleic acid of interest into a mitochondria comprising: i. a fusion protein according to the invention, or a nucleic acid encoding said fusion protein; and, optionally, ii. at least one reagent for importing the nucleic acid of interest into the mitochondria; and / or iii. instructions for importing a nucleic acid of interest into a mitochondria.
  • the reagents of the kit may correspond to any of the reagents described in the examples of the present application. They may, for example, correspond to at least one reagent chosen from an import buffer (eg Mannitol 600 mM, potassium phosphate pH 7.5 2 mM, Hepes-KOH pH 7.2 20 mM, KCl 40 mM, DTT 2 mM, malate 2mM, 2mM NADH), wash buffer (eg 300mM sucrose, 10mM pH 7.5 potassium phosphate, 1mM EDTA, 0.1% (w / v) BSA, 5mM glycine) and buffer STOP (eg washing buffer containing 5 mM EGTA and 5 mM EDTA).
  • the composition of these reagents may vary depending on the organism from which the mitochondria or the cell containing the mitochondria originates.
  • the present application also relates to a process for the in vitro import of a nucleic acid of interest into an isolated mitochondria, comprising the step of bringing into contact a fusion protein according to the invention with a nucleic acid of interest and a Isolated mitochondria, thereby allowing non-covalent binding of the nucleic acid to the fusion protein.
  • the bringing into contact may for example be carried out by mixing about 1 ⁇ g of the fusion protein with about 50 to 100 fmoles of the nucleic acid of interest and about 200 ⁇ g of isolated mitochondria.
  • an import buffer for example containing 600 mM Mannitol, potassium phosphate pH 7.5 2 mM, Hepes-KOH pH 7.2 20 mM, KCI 40 mM, 2 mM DTT, 2 mM malate and 2 mM NADH
  • ADP ATP
  • ATP ATP
  • incubate at a temperature and for a suitable duration.
  • the incubation may be carried out between 40 ° C. and 30 ° C., between 20 ° C. and 30 ° C., or preferably around 25 ° C.
  • the incubation may for example have a duration of from 5 minutes to 16 minutes. h ("overnight"), 15 minutes to 2 hours, or about 30 minutes.
  • the method may include a further step of adding a mixture containing RNAse or DNAse to degrade the nucleic acids of interest located outside the mitochondria.
  • the process may contain another additional step which consists of stopping the reaction, centrifuging the mixture, removing the supernatant, and washing the mitochondria pellet.
  • Nucleic acids from the mitochondria pellet can then be extracted for analysis.
  • the importing method furthermore contains the following steps, before step (a):
  • fusion protein to produce a fusion protein according to the invention; and optionally, - purifying said fusion protein.
  • the fusion protein according to the invention may for example be produced by recombinant techniques, for example by expression of the nucleic acid encoding a fusion protein according to the invention in a host cell suitable for the production of recombinant proteins.
  • host cells include E. coli bacteria, yeasts, fungi, baculovirus host cells, as well as insect cells, plant, animal and / or human cells.
  • An aspect of the invention relates to the import of nucleic acids of interest in a sequence-specific manner.
  • the cell is transformed by two acids nucleic acid, one being the nucleic acid of interest, and the other encoding a fusion protein according to the invention binding a nucleic acid in a sequence-specific manner.
  • both nucleic acids are transcribed into RNA.
  • the RNA coding for the fusion protein according to the invention is translated into protein. Once expressed in the cytoplasm of the cell, the fusion protein then allows the import of the nucleic acid of interest, also present in the cytoplasm, in the mitochondria.
  • the invention relates to a nucleic acid combination
  • a nucleic acid combination comprising: a) a nucleic acid encoding a fusion protein between a mitochondrial targeting sequence and a nucleic acid binding protein in a sequence-specific manner; and b) a nucleic acid of interest fused to the nucleic acid bound by said nucleic acid binding protein in a sequence-specific manner, or a nucleic acid whose transcription produces such a nucleic acid.
  • the nucleic acid combination comprises: a) a nucleic acid encoding the mitochondrial targeting sequence (e.g., pSu9) fused to the MS2 phage shell protein; and b) a nucleic acid of interest fused to at least one stem-loop region of the MS2 RNA.
  • the mitochondrial targeting sequence e.g., pSu9
  • a single recombinant vector comprises the nucleic acids (a) and (b).
  • the combination corresponds to a recombinant vector comprising the nucleic acids (a) and (b).
  • a vector is part of the recombinant vectors according to the invention.
  • the two nucleic acids are positioned on two different vectors.
  • the combination corresponds to a combination of recombinant vectors, one comprising the nucleic acid (a), the other comprising the nucleic acid (b).
  • the invention also relates to a method for importing in vitro or in vivo a nucleic acid of interest into a mitochondria of a cell, comprising the steps of: a) obtaining or preparing a combination of nucleic acids as defined above; and b) introducing said combination of nucleic acids into a cell.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein according to the invention is preferably placed under the control of expression signals (eg promoter, enhancer, terminator, translation signals, 5 'or 3' UTR), so as to form a expression cassette.
  • the nucleic acid of interest fused to the nucleic acid recognized by said nucleic acid binding protein in a sequence-specific manner it is preferably placed under the control of signals allowing its transcription (eg promoter, "enhancer", terminator ).
  • the cell may be any eukaryotic cell containing mitochondria, for example, yeast cells, fungi, protozoa, plants or animals (including human cells).
  • the vectors can be introduced into the cell by any appropriate method, such as electroporation, biolistic transformation, transformation via Agrobacterium or any bacterial agent adapted to the host organism, microinjection, chemical methods, etc.
  • the method will usually be chosen according to the type of cell used.
  • the fusion proteins, nucleic acids, vectors, uses and methods described above are particularly useful in the field of gene therapy, in the agronomic field, for producing proteins in mitochondria. , to analyze fundamental processes for mitochondrial biogenesis, and to manipulate the expression of the mitochondrial genome.
  • the fusion proteins, nucleic acids, vectors, uses and methods described above may for example be used for the analysis of fundamental processes for mitochondrial biogenesis.
  • fusion proteins, nucleic acids, vectors, uses and methods described above also allow manipulation of mitochondrial genome expression.
  • the shuttle system according to the invention allows the easy and efficient introduction of antisense RNA, of sense or antisense DNA or RNA oligonucleotides, of ribozymes complementary to regions involved in replication, transcription or translation in order to test directly and rapidly the effect on the expression of the mitochondrial genome, for example in plants.
  • the fusion proteins, nucleic acids, vectors, uses and methods described above allow the production of allogenic proteins.
  • the present invention allows, for the first time, the introduction of complete mRNAs with their regions 5 'and 3' UTR in a mitochondrion. The production of the corresponding protein is then possible. In the absence of essential sequences for eukaryotic translation, these mRNAs will be exclusively translated into protein in the mitochondria where they are addressed. If the genetic code diverges, which is the case for animal mitochondria, for example, mRNA can only be produced in the mitochondria from the codons used.
  • the present invention also relates to the use of the fusion proteins according to the invention in the field of gene therapy.
  • the nucleic acid of interest is imported into a mitochondria of a human or animal cell by means of a fusion protein according to the invention.
  • one aspect of the invention relates to:
  • a recombinant vector according to the invention or a combination of vectors or nucleic acids according to the invention, for use as a medicament and / or for use in gene therapy; the use of a recombinant vector according to the invention, or of a combination of vectors or nucleic acids according to the invention, for the preparation of a medicament, preferentially intended for gene therapy;
  • composition comprising a fusion protein according to the invention, a recombinant vector according to the invention, or a combination of vectors or nucleic acids according to the invention.
  • the recombinant vectors may correspond to any recombinant vector containing a fusion protein according to the invention. They correspond preferentially to vectors for gene therapy. Vectors and combinations of vectors or nucleic acids preferably correspond to those described in paragraph 4 above, entitled "targeted and specific method of importing a nucleic acid of interest”.
  • the vector (s) may be introduced in vivo by any technique known to those skilled in the art.
  • a gene gun can also be used, for example by depositing the DNA on the surface of "gold" particles and projecting them so that the DNA penetrates through the skin of a patient.
  • Injections with a liquid gel are also possible to transfect both skin, muscle, fatty tissue and breast tissue.
  • Microinjection techniques, electroporation, calcium phosphate precipitation, formulations with the aid of Nanocapsules or liposomes are other techniques available.
  • Biodegradable polyalkyl cyanoacrylate nanoparticles are particularly advantageous.
  • the use of cationic lipids promotes the encapsulation of nucleic acids that are negatively charged, and facilitates fusion with negatively charged cell membranes.
  • Targeted gene delivery is described, for example, in WO 95/28494.
  • DNA can be conventionally transferred via the use of Agrobacterium tumefaciens.
  • the vectors and combinations according to the invention can be used to treat any human disease related to a mitochondrial deficiency.
  • the vectors and combinations make it possible to complement the deficient gene by introducing by transgenesis the non-mutated gene into the nuclear genome, whereas direct genetic transgenesis of human mitochondria is currently impossible. The product of this gene is then addressed to the mitochondria.
  • the present invention makes it possible to greatly expand the range of transportable nucleic acids in the mitochondria.
  • it makes it possible to test, very rapidly, in vitro, in isolated mitochondria, the nucleic acids most suited to complement a deficient mitochondrial function, and / or to inhibit the replication of the "sick" nucleic acid molecules in order to remake switch the critical threshold to "healthy" nucleic acid molecules.
  • MERRF syndrome Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers
  • the invention thus relates to a recombinant vector according to the invention, or a combination of vectors or nucleic acids according to the invention, for treating and / or preventing the MERRF syndrome.
  • the nucleic acid of interest that is present in the vector or the combination according to the invention is human mitochondrial tRNAlys.
  • the present invention finally relates to the use of the fusion proteins according to the invention in the agronomic field.
  • the nucleic acid of interest is imported into a mitochondria of a plant cell by means of a fusion protein according to the invention which preferably binds said nucleic acid of interest in a sequence-specific manner.
  • one aspect of the invention relates to the in vitro use of the vector according to the invention, or a combination of vectors or nucleic acids according to the invention, for the import of said nucleic acid of interest into a mitochondrion of a plant cell.
  • the plant cell may for example correspond to a protoplast.
  • the recombinant vectors may correspond to any recombinant vector containing a fusion protein according to the invention.
  • the vectors and combinations of vectors or nucleic acids preferably correspond to those described in paragraph 4 above. above, entitled "Targeted and specific import method of a nucleic acid of interest".
  • the invention relates more particularly to a process for obtaining a recombinant plant characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining or preparing a combination of vectors or nucleic acids according to the invention; b) introducing said combination of vectors or nucleic acids into a plant cell, for example by transforming a protoplast; c) regenerating an entire plant from the recombinant plant cell obtained in step (b); and d) selecting the plants having integrated in their genome said vectors or nucleic acids.
  • the invention also relates to a method for obtaining a recombinant plant characterized in that it comprises the following steps: a) contacting a fusion protein according to the invention with the nucleic acid of interest and isolated mitochondria; and b) leaving in contact so that the nucleic acid of interest is imported into the isolated mitochondria; c) introducing said isolated mitochondria into a plant cell, for example a protoplast; d) regenerating an entire plant from the recombinant plant cell obtained in step (c); and e) selecting the plants having integrated into their genome said nucleic acid of interest.
  • the above method can also be implemented with fusion proteins according to the invention that bind the nucleic acid of interest in a sequence-specific manner with fusion proteins according to the invention that bind the nucleic acid. of interest in a non-specific way.
  • step (d) or (e) above methods can then be crossed with each other, and plants homozygous for the nucleic acid of interest can be selected.
  • the plants obtained in step (d) or (e) can be crossed with a plant of the same species, and the plants derived from the cross and having retained the nucleic acid of interest can be selected.
  • the recombinant plants obtained by such methods are also part of the invention, as well as the seeds and fruits of such plants.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the in vitro use of a vector according to the invention, or a combination of vectors or nucleic acids according to the invention, to generate cytoplasmic male sterility in a plant.
  • Figure 1 A. Interaction of the pSu9-DHFR protein with the radioactive transcript corresponding to cytosolic TARNtAIa of Arabidopsis thaliana. The analysis was performed by the delay gel technique. The figure shows an autoradiography of the gel in native condition. The first column (-) shows radiolabeled TARNtAIa as a probe. The other columns (DHFR) show that a delayed migration of the probe is observed in the presence of increasing amount of DHFR.
  • B Effect of the addition of pSu9-DHFR on the in vitro import of radioactively labeled tRNAAla transcript into isolated potato mitochondria. The figure represents the autoradiography of a 15% denaturing polyacrylamide gel.
  • “In” represents the initial amount of tRNAAla transcript present in the import medium. "+” Represents the amount of tRNAAlaI transcript in the presence of 1 ⁇ g of pSu9-DHFR. “-” represents the amount of tRNAAla transcript in the absence of pSu9-DHFR. Two exposures of the same gel (4h and night) are presented.
  • Figure 2 A. Effect of addition of pSu9-DHFR and DHFR on in vitro import of radioactively labeled tRNAAla transcript into isolated mitochondria of potato.
  • the figure shows the autoradiography of a polyacrylamide gel denaturing 15%.
  • "In” represents the initial amount of tRNAAla transcript present in the import medium.
  • "-” represents the amount of tRNAAla transcript in the absence of DHFR or pSu9-DHFR.
  • “2” represents the amount of tRNAAla transcript in the presence of 2 ⁇ g of DHFR or pSu9-DHFR.
  • "4" represents the amount of tRNAAlaI transcript in the presence of 4 ⁇ g of DHFR or pSu9-DHFR.
  • B represents the amount of tRNAAlaI transcript in the presence of 4 ⁇ g of DHFR or pSu9-DHFR.
  • Figure 3 Effect of the addition of pSu9-DHFR on the in vitro import of transcript corresponding to the edited or unedited larch tRNA precursor of larch in isolated mitochondria of potato.
  • A Scheme of the larch tRNAHis precursor.
  • P1 and P2 indicate the schematic location of the primer hybridization sites used for cRT-PCR.
  • B Import of the radioactively labeled transcript. The figure represents the autoradiography of a 15% denaturing polyacrylamide gel. "In” represents the initial amount of precursor transcript of tRNAHis present in the import medium. "-” represents the amount of precursor transcript of tRNAHis in the absence of pSu9-DHFR.
  • FIG. 4 Effect of the addition of pSu9-DHFR on the in vitro import of an oligonucleotide corresponding to radioactively labeled TARNtAIa in isolated mitochondria of potato.
  • the figure shows the autoradiography of a 15% denaturing polyacrylamide gel.
  • T represents the initial amount of tRNAAla transcript present in the import medium.
  • + Represents the amount of tRNAAlaI transcript in the presence of 1 ⁇ g of pSu9-DHFR.
  • “-” represents the amount of tRNAAla transcript in the absence of pSu9-DHFR.
  • Mi means the RNase treatment performed on intact mitochondria.
  • Mtp refers to the RNase treatment performed on mitoplasts. AT.
  • Figure 5 Import of RNA into mitochondria in the presence of pSu9-MS2.
  • B Inducible and stable expression of S.
  • the proteins are revealed thanks to an anti-Myc antibody.
  • p pSu9-MS2 form
  • m MS2 form.
  • the PCR product obtained after amplification by RT-PCR using a specific pair of oligonucleotides is visualized by an arrow. * : Aspecific amplification product.
  • C Western blot and northern blot analysis of the quality of yeast mitochondrial preparations. An antibody directed against the Kar2 protein of the endoplasmic reticulum shows the absence of contamination of the mitochondrial preparations. An oligonucleotide probe directed against the yeast cytosolic trK2 tRNAlys (UUU) shows the absence of RNA contaminants in mitochondrial preparations.
  • the PCR product obtained after amplification by RT-PCR using a specific pair of oligonucleotides is visualized by an arrow.
  • SEQ ID NO: 1 represents the mouse DHFR coding sequence.
  • SEQ ID NO: 2 represents the pSu9 mitochondrial targeting sequence of the atp9 gene of Neurospora crassa.
  • SEQ ID NO: 3 represents the protein sequence of the pSu9-DHFR fusion protein.
  • SEQ ID NO: 4 represents the sequence encoding the Arabidopsis thaliana cytosolic tRNA.
  • SEQ ID NO: 5 represents the sequence encoding GFP.
  • SEQ ID NO: 6 represents the sequence encoding the precursor form of larch mitochondrial tRNA (His). The nucleotides at position 81, 87 and 1 17 are editing sites.
  • SEQ ID Nos. 7 and 8 represent primers for analysis by the technique of cRT-PCR.
  • SEQ ID NO: 9 represents the sequence encoding the potato mitochondrial atp9.
  • the nucleotides at position 353, 383, 414, 415, 423, 425, 515, 524, 545 and 556 correspond to editing sites.
  • the unedited version of the gene coding for mitochondrial atp9 contains a cytidine at positions marked "y". At the level of the corresponding mRNA obtained after transcription, these positions are published in uridine by mitochondrial matrix enzymes (generating thymidines at the corresponding DNA sequences).
  • SEQ ID NO: 10 represents the sequence encoding the potato mitochondrial atp9 alone. This sequence contains the same editing sites as the sequence SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID Nos. 1-14 represent oligonucleotides for PCR mutagenesis.
  • SEQ ID Nos. 15 and 16 represent primers used for RT-analysis.
  • SEQ ID NO: 17 represents the sequence encoding the precursor form of the fused larch mitochondrial tRNA on the 3 'side to the sequence encoding the stem-loop portion of the MS2 RNA.
  • SEQ ID NO: 18 represents the nucleotide sequence corresponding to the mitochondrial targeting sequence pSu9 fused to the CP protein.
  • SEQ ID NO: 19 represents the polypeptide sequence of the pSu9 mitochondrial targeting sequence fused to the CP protein.
  • SEQ ID Nos. 20 to 27 represent oligonucleotides for PCR mutagenesis.
  • SEQ ID Nos. 28 to 34 represent the sequences of at least ten amino acids shown in Figure 3C.
  • SEQ ID NO: 35 represents the sequence called anticox-2SL, which comprises the antisense region of the promoter region of the yeast mitochondrial COX I gene, fused on the 3 'side to the sequence of the stem-loop portion of the RNA.
  • SEQ ID NO: 36 represents anticox-2SL oligonucleotide primer # 1
  • SEQ ID NO: 37 represents oligonucleotide primer # 2 of anticox-2SL.
  • SEQ ID NO: 38 represents an oligonucleotide sequence complementary to yeast trK3 mitochondrial tRNA.
  • SEQ ID NO: 39 represents an oligonucleotide sequence complementary to yeast trK2 cytosolic tRNA.
  • the vector pQE40 (Quiagen) containing a chimeric gene coding for mouse DHFR (SEQ ID NO: 1) fused to the mitochondrial targeting sequence pSu9 of the atp9 gene of Neurospora crassa (SEQ ID NO: 2, Pfanner et al., Eur J Biochem, 169, 289-293, 1987) was used for overexpression of the pSu9-DHFR fusion protein (SEQ ID NO: 3).
  • This vector pSu9-DHFRpQE40 is used to transform E. coli bacteria strain M15.
  • pSu9-DHFR can easily be purified in native conditions using a histidine tag present at the C-terminus of the protein. The following protocol was used.
  • Superflow Ni-NTA resin (Qiagen) are washed 3 times in 500 ⁇ l of washing buffer (50 mM pH8.2 Tris-malate, 0.6 M NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% glycerol (v / v) imidazole 70 mM).
  • the resin is recovered between each washing by centrifugation for 5 minutes at 9000 g.
  • the supernatant of the cell lysate is added to the resin. The whole is incubated for 1 hour with gentle agitation. After centrifugation for 5 minutes at 9000 g, the supernatant is removed.
  • the resin is washed 3 times in 300 ⁇ L of washing buffer as previously.
  • the proteins fixed on the resin are then eluted in the presence of 100 ⁇ l of elution buffer (25 mM pH 7.5 hepes, 0.6 M NaCl, 5 mM MgCl 2, 250 mM imidazole) for 15 minutes.
  • the eluate is recovered by centrifugation for 5 minutes at 9000 g. This elution step is repeated twice and the eluates are frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C.
  • the Riboprobe® kit allows the production of in vitro transcripts from the pGEM®-T Easy vector containing the genes of interest and linearized with a restriction enzyme. Depending on the orientation of the insert in the vector, T7 or Sp6 RNA polymerases are used. The reaction is carried out for 3 hours at 37 ° C.
  • reaction medium 5 to 10 ⁇ g of digested plasmid DNA, 4 ⁇ l of 5x transcription buffer (400 mM pH 7.4 Hepes-KOH, 120 mM MgCl 2, 200 mM DTT, 1 mM spermidine), NTP mixture ** , 1 ⁇ l of an enzymatic mixture (15-20 U of T7 or Sp6 RNA polymerase, 0.3 U of pyrophosphatase) and 40 U of RNases (RNaseOUT TM - Invitrogen).
  • 5x transcription buffer 400 mM pH 7.4 Hepes-KOH, 120 mM MgCl 2, 200 mM DTT, 1 mM spermidine
  • NTP mixture ** 1 ⁇ l of an enzymatic mixture (15-20 U of T7 or Sp6 RNA polymerase, 0.3 U of pyrophosphatase) and 40 U of RNases (RNaseOUT TM - Invitrogen).
  • RNA is then precipitated at -20 ° C. for one hour in 2.5 volumes of ethanol in the presence of 0.1 volume of sodium acetate pH 4.8. centrifugation for 20 minutes at 16000 g, the pellet is dried in the open air and taken up in 10 .mu.l of water.
  • RNA labeled with a fluorophore are produced in a reaction medium containing 0.5 mM GTP, CTP and ATP, 0.375 mM UTP and 100 ⁇ M UTP Chromatide Alexa Fluor® 488 (Molecular Probe). 1.1.3. PCR Mutagenesis - chimeric gene construction
  • the chimeric genes are constructed by the technique of extension of overlapping fragments by PCR. This method requires two steps. In the first step, two PCRs are carried out in parallel starting from two different matrices: the matrix n ° 1 in the presence of the first pair of primers (primers a and b) and the matrix n ° 2 in the presence of the second pair of d primers (primers c and d). One tenth of the two PCR products obtained are then placed in the presence of the primers a and d to carry out a final PCR step. In the end, the PCR product corresponds to the fusion of a part of the two starting matrices.
  • the yield is about 15 mg of mitochondrial protein equivalent per kg of potato tubers (Bintje variety). When used for import experiments, the mitochondria are put back into a minimum volume of PdT wash buffer. 1.1.5. Determination of mitochondria in protein equivalent by the method of
  • Mitoplasts are mitochondria in which there has been rupture of the outer membrane.
  • a method based on the principle of hypotonic swelling is used. The change in osmolarity causes the rupture of the outer membrane, but not that of the inner membrane.
  • the protocol followed to obtain potato mitoplasts is that described by Delage et al. (Mol CeII Biol, 23, 4000-4012, 2003).
  • the precursor of the protein whose import into the mitochondria is to be studied is synthesized by transcription and translation coupled into a rabbit reticulocyte lysate in the presence of [35S] -labeled methionine.
  • TNT® Coupled Retyculocyte Lysate System Promega.
  • the reaction medium of 50 ⁇ L contains 25 ⁇ l of TNT® Rabbit Retyculocyte Lysate (Promega), 2 ⁇ l of TNT® transcription buffer (Promega), 1 ⁇ l of T7 or Sp6 TNT® RNA polymerase (Promega) according to the orientation of the gene in the plasmid, 1 ⁇ L of a mixture of amino acids without methionine 1 mM, 2 ⁇ L of [ 35 S] methionine 10 ⁇ Ci / ⁇ L (specific activity of 1000 Ci / mmol), 1 to 2 ⁇ g of a plasmid containing the T7 promoter or Sp6 RNA polymerase and the complete cDNA of the protein of interest. After 1 hour 30 of incubation at 30 ° C., the whole is frozen at -80 ° C.
  • the radiolabelled proteins (5 ⁇ l) are added and the solution is incubated for 30 minutes at 25 ° C. with stirring.
  • the reaction medium is then placed on a 27% sucrose cushion (Tris-HCl pH 7.5 20 mM, sucrose 27% w / v, EDTA pH 8.0 1 mM, K2HPO4 100 mM, BSA 1 mg / mL). and the mitochondria are recovered after centrifugation for 10 minutes at 9000 g.
  • the supernatant is removed and the mitochondria pellet is analyzed on denaturing polyacrylamide gel.
  • the gel is then dried and then exposed against a phospholmager (Fuji) plate or autoradiographed. In practice, an import experiment requires a number of checks.
  • the first sample undergoes no particular treatment
  • the second sample undergoes treatment with proteinase K (100 ⁇ g / ml for 10 minutes at room temperature then inhibited with 1 mM PMSF).
  • proteinase K 100 ⁇ g / ml for 10 minutes at room temperature then inhibited with 1 mM PMSF.
  • mitochondria were pre-treated with valinomycin (2 .mu.M) for 10 minutes at 4 ⁇ O before adding the labeled proteins. This treatment has the effect of dissipating the membrane potential thus blocking the transport of the precursor through the protein import channel.
  • the fourth sample is treated with valinomycin and proteinase K. Under these conditions, neither the precursor protein nor the mature protein are protected from degradation by proteinase K. This control shows that the band considered as the mature protein does not is not a degradation product resistant to proteinase K.
  • Protein separation is performed by 12% polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions in the presence of SDS.
  • the gel comprises a concentration gel (5% acrylamide / bisacrylamide 37.5 / 1 (w / v), Tris-HCl pH 6.8 125 mM, SDS 0.1% (w / v)) and a separation gel (12% acrylamide / bisacrylamide 35.5 / 1 (w / v), Tris-HCl pH 8.8 380 mM, SDS 0.1% (w / v)).
  • the polymerization of the gel is obtained by adding 0.1% (w / v) ammonium persulfate and 0.01% (v / v) TEMED.
  • a volume of Laemmli buffer (Tris-HCl pH6.8 100 mM, SDS 4% (w / v), ⁇ -mercaptoethanol 4% (v / v), glycerol 15%, bromophenol blue 0.05% (w / v) )) is added to the protein samples before deposition.
  • the migration is in SDS-PAGE buffer (25 mM Tris, 250 mM glycine, 0.1% SDS (w / v)) at a constant amperage of 30 mA.
  • the proteins are revealed by incubation in a staining solution (0.25% (w / v) Coomassie Blue, 10% (v / v) acetic acid, 40% (v / v) methanol) for 30 minutes and then with several successive passages in a decolorization solution (acetic acid 10% (v / v), ethanol 20% (v / v)).
  • a staining solution 0.25% (w / v) Coomassie Blue, 10% (v / v) acetic acid, 40% (v / v) methanol
  • acetic acid 10% (v / v), ethanol 20% (v / v) The gel is then dried for 1 hour in a gel dryer before being exposed to a phosphorimager (Fuji) plate and / or autoradiographed to visualize the radioactive proteins.
  • RNAs are then extracted and the radioactive transcript analysis is performed on a denaturing polyacrylamide gel for small RNA (75 nucleotides) or agarose formaldehyde gel for larger RNAs (500 to 1000 nucleotides). The gel is then dried and then exposed against a phosphorimager (Fuji) plate or autoradiographed.
  • STOP buffer 5 mM EGTA, 5 mM EDTA in washing buffer
  • RNAs in the matrix space 100 ⁇ l of RNase mixture can also be added after obtaining mitoplasts. In this case, the RNase-protected RNAs passed through the inner membrane and are present in the mitochondrial matrix.
  • RNAs In experiments with non-radiolabeled RNA, internalization of the RNAs was assessed by RT-PCR or circularized RNA PCR (cRT-PCR).
  • the mitochondria are visualized by confocal microscopy directly after the incubation step in the import medium.
  • RNA extraction buffer Tris-HCl pH 7.5 10 mM, MgCl 2 10 mM, SDS 1% (w / v)
  • phenol saturated with water 100 ⁇ l
  • the aqueous phase is removed and allowed to precipitate at -20 ° C. for one hour in 2.5 volumes of ethanol in the presence of 0.1 volume. of sodium acetate pH 4.8 1 M.
  • the pellet is dried in the open air and taken up in 10 .mu.l of water. 1.1.9. Fractionation of RNA on polyacrylamide gel
  • the fractionation of radioactive tRNA transcripts and / or mitochondrial tRNA is carried out by electrophoresis on a 15% polyacrylamide gel under denaturing conditions.
  • the gel (8x12x0.03 cm) has the following composition: 15% acrylamide / bisacrylamide (19/1), 7M urea, 1 x TBE buffer (90 mM Tris, 2.5 mM EDTA, 90 mM boric acid).
  • the polymerization is obtained by adding 0.07% (w / v) ammonium persulfate (APS) and 0.035% (v / v) TEMED.
  • the tRNA transcripts are supplemented with a volume of loading buffer (95% Formamide (v / v), 20 mM EDTA, 0.05% (w / v) bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol). % (w / v)).
  • the electrophoresis buffer is 1 x TBE and the migration is carried out at a maximum amperage of 25 mA. After migration, the nucleic acids are visualized under UV after incubation for 5 minutes in a bath of ethidium bromide at 0.5 ⁇ g / ⁇ L.
  • the gel is then incubated for 30 minutes in a solution of 10% (v / v) acetic acid, 20% (v / v) ethanol and then dried for 1 hour in a gel dryer, before being exposed against a plate of Phosphorlmager (Fuji ) and / or autoradiographed to visualize the radioactive transcripts.
  • RNAs of high molecular weight are separated by electrophoresis on agarose gel 1% (w / v), formaldehyde 18% (v / v), MOPS 1x (MOOS 20mM, 2mM sodium acetate, EDTA 1 mM) in a 1 x MOPS migration buffer.
  • MOPS 1x MOOS 20mM, 2mM sodium acetate, EDTA 1 mM
  • RNAs are then transferred overnight by capillarity into 2 ⁇ SSC on a HybondTM-N + nylon membrane (Amersham).
  • the membrane is rinsed in 2x SSC, put on Whatmann paper soaked with 2x SSC and fixed for 5 minutes under UV.
  • the membrane is rinsed in water, briefly incubated in methylene blue 0.2% (w / v) - 0.2 M sodium acetate pH 4.8 and then discolored in water. This step makes it possible to visualize RNAs and molecular weight markers that are not radioactively labeled.
  • the membrane is then exposed to a phosphorimager (Fuji) plate and / or autoradiographed to visualize the radioactive transcripts.
  • CRT-PCR reaction (circularized Reverse Transcription coupled with
  • RNAs T4 RNA ligase
  • ligation buffer 50 mM Hepes
  • NaOH pH 8, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT The enzyme is inactivated for 15 minutes at 65 ° C. and then the RNAs are precipitated in 2.5 volumes of 100% ethanol in the presence of 0.1 volume of sodium acetate pH 4.8 1 M. After centrifugation for 20 minutes at 16000 g, the pellet is dried in the open air and taken up in 10 .mu.l of water.
  • a reverse transcription reaction is then performed to synthesize the complementary DNA (cDNA) corresponding to the ligation between the 5 'and 3' ends of the RNA analyzed.
  • 400 ng of RNA are denatured for 5 minutes at 65 ° C. in the presence of 20 pmol of specific primer of the desired RNA.
  • the reverse transcription reaction takes place for 1 hour at 52 ° C.
  • the fluorochrome MitoTrackerTM Orange CM-H2TMRos (Molecular Probes) is used to control the integrity of mitochondria. It is A-chloromethyltetramethylrosamine which is a vital dye penetrating specifically in mitochondria with membrane potential. It fluoresces in the red ( ⁇ m: 574 nm) when excited at 551 nm. This dye is added to isolated mitochondria at a final concentration of 0.5 ⁇ M. Chromatide® Alexa Fluor® 488 Fluorescent UTP (Molecular Probes) used for fluorescent RNA labeling in green ( ⁇ m: 561 nm) when excited at 488 nm. The image processing is done on the software LSM 510 version 2.8 (Zeiss).
  • the RNA-protein interaction has been studied using the delay gel technique.
  • the protocol used is Promega protocol No. 0 TB1 10, entitled "gel shift assay System".
  • the reaction is carried out in a reaction volume of 9 ⁇ l comprising: 0 to 20 pmol of the protein, 2 ⁇ l of 5x delay gel buffer (20% (v / v) glycerol, 5 mM MgCl 2, 2.5 mM EDTA, DTT 2 5 mM, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5).
  • the medium is incubated for 10 minutes at ambient temperature.
  • One ⁇ l of radiolabeled tRNA (approximately 10 fmoles corresponding to 20
  • the medium Before migration, the medium is supplemented with one ⁇ l of loading buffer (Tris-HCl pH 7.5
  • the gel is prepared from a solution of 4% acrylamide / N, N 'methymene bisacrylamide (19/1) in 0.5x TBE buffer (45 mM Tris, pH EDTA).
  • the polymerization of the gel is catalyzed by the addition of 0.04% (w / v) APS and 0.04% (v / v) TEMED. Before loading the samples, the gel is energized at 350 V for 10 min. The migration is then carried out for 20 min at 350 V in the TBE buffer 0.5x. The gel is dried and then exposed against a phosphorimager (Fuji) plate or autoradiographed.
  • the delay gel technique was used to demonstrate that the recombinant DHFR protein purified using the histidine tag is capable of binding nucleic acids.
  • the nucleic acid substrate chosen in this case corresponds to the cytosolic tRNAAIa of Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4). This RNA was obtained by in vitro radioactive transcription from a recombinant plasmid (Carneiro et al., Plant Mol Biol, 26, 1843-1853, 1994). A delay of the tRNAAla1 transcript in the presence of DHFR was observed (FIG. 1 A). The inventors have therefore demonstrated that there is an interaction between DHFR and nucleic acids.
  • mouse DHFR has a much broader interaction spectrum, and that it can interact with any nucleic acid.
  • PSu9-DHFR protein is imported into isolated mitochondria of potato
  • the pSu9-GFP protein was then overexpressed and purified as mentioned above for the pSu9-DHFR protein. Although the pSu9-GFP protein is correctly internalized in vitro in isolated potato mitochondria, this protein is unable to interact with tRNAAIa in contrast to the pSu9-DHFR protein. 4. It has been shown that a folate substrate analogue, methotrexate, which is capable of binding to DHFR (Eilers and Schatz, Nature, 322, 228-232, 1986), inhibits the import of TARNtAIa into isolated mitochondria (Figure 3B).
  • the non-radiolabeled transcript corresponding to the edited precursor form of tRNAHis was used for an import experiment in isolated mitochondria of potato and in the presence of pSu9-DHFR. After incubation, the total RNAs were extracted from mitochondria and the processing of tRNAHis was analyzed by the cRT-PCR technique.
  • the complementary primer called P1 (SEQ ID NO: 7) was used for the reverse transcription step and the PCR step was carried out with this same complementary primer and the direct primer, called P2 (SEQ ID NO: 8). The schematic localization of these primers is shown in Figure 3A.
  • the amplification product was cloned into the pGem-T vector Easy vector (Promega) and the DNA sequence of the resulting clones was performed using an Applied Biosystems 3100 (Perkin Elmer). Fifteen different clones were analyzed. The sequence of the 5 'and 3' ends of 15 clones is shown in Figure 3C. These sequences show that all the molecules analyzed, except for one, are matured at their 5 'end. For five of them, the 3 'end is also matured: the terminal CCA end was added post-transcritionally by the tRNA-nucleotidyl transferase located in the mitochondrial matrix.
  • the chimeric construct making it possible to obtain the trnH-atp9 transcript was obtained by PCR mutagenesis from the plasmid containing the sequence encoding the edited precursor transcript of larch mitochondrial tRNA and that containing the sequence encoding the unedited version of the gene. atp9 mitochondrial potato.
  • the oligonucleotides necessary for PCR mutagenesis are presented as SEQ ID Nos. 1, 12, 13 and 14.
  • the RNA transcripts corresponding to these two constructs were synthesized in vitro in the presence or absence of radioactive UTP. These transcripts were then used in in vitro import trials in isolated mitochondria of potato.
  • RT-PCR experiments were then used to analyze their internalization in isolated mitochondria.
  • the two primers used for RT-PCR analysis have the sequences SEQ ID Nos. 15 and 16. These allow the discrimination of exogenous RNAs of endogenous atp9 RNAs. Amplification products of the expected size were obtained only in the RT-PCR experiments carried out in the presence of reverse transcriptase and from the mitochondrial extracted RNAs incubated with each of the transcripts in the presence of pSu9-DHFR.
  • CTATCGGTATTGGAAACGT [TT] TTAGTTCCTCGATTCATT (sequence of clones after import); CTATCGGTATTGGAAACGT
  • the above sequences represent nucleotides 271 to 309 of the sequence SEQ ID NO: 10. The boxes indicate the published editing sites, and the underlined nucleotides indicate the unedited editing sites.
  • EXAMPLE 2 IN VITRO ADDRESSING OF PLANT TANOLA IN MITOCHONDRIES ISOLATED YEAST VIA THE PSU9-DHFR PROTECTIVE SHUTTLE
  • the shuttle system based on the use of the plant model pSu9-DHFR fusion protein is generalizable to any mitochondria from any organism.
  • the present invention is partly based on the recognition of the pSu9-DHFR protein by the import complex TOM / TIM mitochondrial proteins. This complex existing in all the mitochondrial systems studied to date, the shuttle system according to the invention is generalizable to any organism. 2.1. Material and methods
  • the reaction medium of 100 ⁇ L contains 50 ⁇ l of import buffer 2x yeast (Sorbitol 1, 2 mM, 40 mM Hepes-KOH pH 7.4, 2 mM DTT), 4 ⁇ creatine phosphokinase, 0.5 pmol of phosphocreatine, 2 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 200 ⁇ g mitochondria (protein equivalent), 50 fmoles of [Oc 32 P] UTP (100,000 cpm) labeled transcript and 1 ⁇ g of pSu9-DHFR.
  • the RNase mixture and the STOP pad is made with buffer "I xbb.
  • RNAs in the matrix space 100 ⁇ l of RNase mixture can also be added after obtaining mitoplasts. In this case, the RNase-protected RNAs passed through the inner membrane and are present in the mitochondrial matrix. 2.1.3. Obtaining mitoplasts
  • the mitochondria are maintained for 15 minutes in K1 K2 buffer (0.2M KH2PO4, 0.8M K2HPO4, pH 7.5) before adding a volume of 2x yeast buffer (1M Sorbitol, Hepes- 40 mM KOH pH 7.4).
  • K1 K2 buffer 0.2M KH2PO4, 0.8M K2HPO4, pH 7.5
  • 2x yeast buffer 1M Sorbitol, Hepes- 40 mM KOH pH 7.4
  • EXAMPLE 3 IN VITRO ADDRESSING OF AN OLIGONUCLEOTIDE IN ISOLATED MITOCHONDRIES OF POTATOES OR YEAST VIA THE PSU9-DHFR PROTECTIVE SHUTTLE
  • wash buffer Tris-HCl pH 7.5 10 mM, 5 mM magnesium acetate, 2 mM DTT
  • the membrane was dried then autoradiographed and / or exposed against a phosphorimager plate to visualize the interaction.
  • Recombinant DHFR purified with the tag histidine is able to bind not only RNA but also DNA.
  • the DNA substrate chosen in this case corresponds to an oligonucleotide (single-stranded DNA) corresponding to the sequence of cytosolic TARNtAIa A. thaliana (SEQ ID NO: 4).
  • This chemically synthesized oligonucleotide (Sigma Aldrich) and labeled 5 ' was incubated with a membrane on which the recombinant proteins DHFR and GFP were transferred. No interaction between GFP and oligonucleotide was observed, while a signal reflecting an interaction between DHFR and oligonucleotide was obtained. 3.2.2. In vitro internalisation of oligonucleotides in mitochondria isolated from potato or yeast
  • EXAMPLE 4 SPECIFIC ADDRESSING OF A FUSION RNA WITH THE SNAP RING SEQUENCE OF THE PHASE MS2 IN MITOCHONDRIES ISOLATED VIA THE PROTECTIVE SHUTTLE CONSISTING OF THE PHASE SHELL PROTEIN MS2 FUSED TO THE MITOCHONDRIAL ADDRESSING SEQUENCE PSU9
  • the shuttle system according to the invention can be extended to stable genetic systems for the specific and controllable introduction of a given nucleic acid into mitochondria.
  • the development of a desired targeting system of a specific RNA is based on the use of a protein capable of recognizing and associating with a specific RNA sequence.
  • this protein corresponds to the phage MS2 (also called CP) hull protein, which is known to recognize and associate with an RNA-specific sequence adopting a particular stem-loop secondary structure (Beach). et al., Curr Biol, 9, 569-578, 1999. Querido et al., Methods in Cell Biol, 85, 273-292, 2008).
  • the pSu9-DHFR shuttle system allows the import of any RNA
  • the pSu9-CP shuttle system allows the targeted and specific import of an RNA only associated with phage MS2 loop RNA. .
  • the sequence corresponding to the mitochondrial targeting sequence pSu9 was fused to the CP protein (SEQ ID NO: 18). This construct was cloned into the bacterial expression vector pQE40 and allowed to obtain the pSu9-CP protein.
  • the primers used to generate this construct by PCR mutagenesis correspond to the sequences SEQ ID Nos. 24, 25, 26 and 27.
  • RNA substrates were obtained by in vitro transcription.
  • the pSu9-CP protein was purified using the histidine tag present at the C-terminal end of the fusion protein, according to a model similar to that developed for the recombinant pSu9-DHFR protein.
  • the interaction between the two partners can be validated by the late freeze or northwestern approaches.
  • the rRNA precursor of the non-fused tRNAHis to the loop RNA portion of MS2 was generated and can be used as a negative control.
  • the shuttle system according to the invention can be extended to stable genetic systems for the treatment of malaria. specific and controllable introduction of a nucleic acid into mitochondria.
  • the shuttle system pSu9-MS2 presented in Example 4 and illustrated by the in vitro import of RNA into isolated mitochondria was extended in the present example to a stable and inducible genetic system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 5.1 Materials and Methods 5.1.1 Transformation of Yeast Cells
  • Construction pSu9-MS2 (SEQ ID NO: 18) was cloned into the TRP pESC vector at the MCS2 cloning cassette.
  • the primers used to generate this PCR construct correspond to the sequences SEQ ID NO: 36 (ATAATGTTATATAAGTAATAATATAATAAAATATCCTAAGGTACC) and SEQ ID NO: 37 (CCCGGGAATACTGCAGACATGGG). Both constructs are under the control of a galactose inducible promoter.
  • the pSu9-MS2 construct is cloned in fusion with a vector sequence coding for a Myc tag which subsequently allows the display of the protein expressed in the presence of galactose using commercially available antibodies directed against this tag. myc. Competent yeast cells are then transformed using this doubly recombinant vector.
  • TRP pESC vector comprising the same MCS1 construct but containing only the gene coding for the MS2 protein (without pSu9 addressing sequence) in MCS2 is produced. It will serve as a negative control.
  • the set of protocols, from the transformation to the induction of the expression of the two partner molecules (the shuttle protein pSu9-MS2 and the anticox-2SL RNA) is described in FIG. manual "pESCYeastEpitopeTaggingVectors" supplied with the vector by the company
  • RNA extracts are obtained by the trizol method (Tri Reagent, MolecularResearch Center) according to the supplier's recommendations.
  • the quality of purification of mitochondria is verified: i) at the protein level by western blot experiments with antibodies directed against a mitochondrial protein (the TOM20 protein) and against a cytosolic protein (the KAR2 protein), ii) at the RNA level by northern blot experiments using oligonucleotide probes specific for trK3 mitochondrial tRNAs (SEQ ID NO: 38, GTGAGAATAGCTGGTGTTG) and trK2 cytosolic tRNAlys (UUU) (SEQ ID NO: 39, GGCTCCTCATAGGGGGCTCG).
  • RNAs are extracted according to the protocol described in 1.1.8 either from the total yeast fraction or from the mitochondrial fraction.
  • RNAs fractionated on acrylamide gel (1 .1.9) are transferred to Hybond N membrane (Amersham). Electrotransfer was performed in 0.25 X TAE buffer (10 mM Tris-Acetate pH 8.0, 0.25 mM EDTA) for 15 minutes at 150 mA, followed by 30 minutes at 500 mM. The membrane is briefly dried and the tRNAs are fixed by irradiation in UV light (366 nm) for 3 to 5 minutes.
  • the oligonucleotides are labeled radioactively at their end (3.1.1).
  • the radiolabeled probe is added to the hybridization solution (6x SSC, 0.5% SDS) in a hybridization roller containing the membrane along the wall.
  • the hybridization is carried out in an oven at a temperature of 45 ° C. overnight.
  • the membrane is then washed twice for 10 minutes in 2x SSC buffer and once for 30 minutes in 2x SSC buffer, 0.1% SDS at the hybridization temperature.
  • the membrane is briefly dried and exposed against a Phosphorimager (Fuji) plate or autoradiography.
  • the composition of the 2x SSC is: 30 mM Trisodium Citrate pH 7.0; NaCl
  • Figure 5B shows that after galactose induction, yeast cells transformed with the double construct pSu9-MS2 and anticox-2SL expressed both the shuttle protein in its precursor form (noted p in Figure 5B) and RNA whose amplification was possible by RT-PCR using specific primers.
  • p in Figure 5B the precursor form of yeast cells transformed with the double construct pSu9-MS2 and anticox-2SL expressed both the shuttle protein in its precursor form
  • RNA whose amplification was possible by RT-PCR using specific primers.
  • neither the pSu9-MS2 protein nor the anticox-2SL RNA were present when the yeasts had been transformed with the pESC TRP vector alone.
  • the vector only included the construct coding for the MS2 protein the precursor form was not present in the total protein extract. It should be noted that in the absence of galactose, no induction, neither protein nor RNA was obtained. The specific and inducible expression of the constructions has therefore been validated.
  • the yeast cells transformed with these three types of constructs were used to prepare mitochondria according to the protocol described above. These mitochondria were free of cytosolic contamination as evidenced by the western and northern experiments shown in Figure 5C.
  • the KAR2 protein was present in the 3 total extracts of the yeasts transformed with the vector alone (-), with the vector comprising MS2 and anticox-2SL and with the vector comprising pSu9-MS2 and anticox-2SL. This protein was not found in the mitochondrial protein extracts (validated by the use of an anti-TOM20 antibody) of the three types of yeast.
  • trK2 cytosolic tRNAlYS (UUU) was present in the total nucleic acid extracts but was absent from the mitochondrial nucleic acid fractions (validated by trK3 mitochondrial tRNALys detection). All of these experiments validated the purity of the mitochondrial fractions.
  • the use of the anti-Myc antibody showed the presence of the pSu9-MS2 protein in its mature form only in the mitochondria of the yeast cells doubly transformed with the pSu9-MS2 construct and the anticox-2SL construction.
  • the presence of the anticox-MS2 RNA was revealed by RT-PCR analysis using specific primers only in the mitochondria of these same transformed yeast cells.
  • the amplification product obtained by RT-PCR was cloned and sequenced to verify that it corresponded to the sequence of the anticox-2SL RNA.
  • This RNA was not found at the level of the mitochondria of yeast cells transformed with the vector comprising the MS2 construct, demonstrating the importance of pSu9-MS2 fusion for the establishment of stable shuttle system which is the object of the present invention.
  • pSu9-MS2 protein allows the import of an RNA of interest (in this case the anticox-2SL RNA) fused to the stem-loop part of MS2 in the mitochondria of a cell.

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Abstract

La présente invention concerne un système navette permettant d'importer des acides nucléiques d'intérêt dans une mitochondrie. Ce système est basé sur l'utilisation d'une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt. Ce système navette est utile, par exemple, dans le domaine agronomique, dans le domaine de la thérapie génique, et dans le cadre de projets de recherche visant à caractériser la fonction de gènes mitochondriaux.

Description

ADRESSAGE D'ACIDES NUCLEIQUES DANS LES MITOCHONDRIES
La présente invention concerne un système navette permettant d'importer des acides nucléiques d'intérêt dans une mitochondrie. Ce système est basé sur l'utilisation d'une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt. Ce système navette est utile, par exemple, dans le domaine agronomique, dans le domaine de la thérapie génique, et dans le cadre de projets de recherche visant à caractériser la fonction de gènes mitochondriaux.
Les mitochondries sont des organites présents dans la quasi totalité des cellules eucaryotes. Elles sont impliquées dans de nombreux processus fondamentaux tels que la production d'ATP par phosphorylation oxydative, la synthèse d'acides aminés et la mort cellulaire programmée. Il est aujourd'hui admis que la mitochondrie provient de l'endosymbiose d'une α-protéobactérie à l'intérieur d'une cellule proto-eucaryotique. De fait, les mitochondries possèdent leur propre matériel génétique mais ce dernier n'est plus que le vestige de celui de l'α-protéobactérie ancestrale. Il ne code plus que pour un nombre limité de gènes et la grande majorité des macromolécules (e.g. environ 1500 protéines et quelques ARN) nécessaires à la biogenèse mitochondriale dépendent aujourd'hui de l'expression de gènes nucléaires. Ces macromolécules sont alors transportées du cytosol dans l'organelle.
En conséquence, très tôt dans l'évolution, cet organite a dû développer des systèmes de transport qui permettent à ces macromolécules de traverser la double membrane mitochondriale. Ceci est tout particulièrement vrai pour les protéines et les composants majeurs des machineries d'importation de ces macromolécules ont été identifiés chez tous les eucaryotes. En particulier, le complexe TOM (pour « Translocase of the Outer Mitochondrial membrane ») représente la porte d'entrée principale des protéines matricielles au niveau de la membrane externe mitochondriale et le complexe TIM (pour « Translocase of the Inner Mitochondrial membrane ») est nécessaire pour la translocation à travers la membrane interne (Dolezal et al., Science, 313, 314-318, 2006 ; Bolender et al., EMBO Rep, 9, 42-49, 2008). De plus, le mécanisme de transport des protéines requiert une séquence particulière, la séquence d'adressage mitochondriale, généralement située à l'extrémité N-terminale de la protéine et reconnue par le complexe TOM (Habib SJ, Methods CeII Biol, 80, 761 -781 , 2007). Une fois la protéine transloquée dans l'espace matriciel, cette séquence d'adressage est alors clivée par une peptidase. Stan et al., (Mol CeII Biol, 23, 2239-2250, 2003) décrit ainsi que la protéine DHFR fusionnée à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est importée dans les mitochondries de levure.
Comparativement aux protéines, un nombre plus restreint d'ARN est importé dans les mitochondries. Néanmoins ce transport d'ARN est également essentiel à la viabilité cellulaire. Il s'agit d'ARN non codant et plus particulièrement d'ARN de transfert (ARNt). Contrairement aux protéines, les mécanismes de transport des ARN dans les mitochondries sont mal connus et semblent faire appel à des composants protéiques différents selon les organismes (Salinas et al., Trends in Biochem, 33, 320-329, 2008).
Le génome mitochondrial subit de nombreuses mutations ponctuelles (en particulier chez les mammifères), insertions, délétions ou recombinaisons (par exemple chez les plantes supérieures). Ces modifications plus ou moins importantes de l'ADN mitochondrial aboutissent à des dysfonctionnements qui engendrent de graves répercussions sur le fonctionnement de la cellule. De tels dysfonctionnements sont au centre de différentes maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires, du diabète, du vieillissement, et même de certains cancers (Bonnet et al., Biochem Biophys Acta, 1783, 1707-1717, 2008 ; Florentz et al., CeII Mol Life Sci, 60, 1356-1375, 2003 ; Trifunovic et al., Nature, 429, 417-423, 2004). Chez les végétaux, le dysfonctionnement des mitochondries, souvent lié à la présence de séquences codantes inhabituelles dans le génome de l'organelle, est à l'origine du phénomène de stérilité mâle cytoplasmique (SMC). Ce phénomène se traduit par l'incapacité des plantes à produire du pollen fonctionnel et constitue un outil très utilisé dans la production de semences hybrides qui sont plus vigoureuses en culture comme le maïs, le coton ou le riz (Budar et Pelletier, C R Acad Sci, 324, 543-550, 2001 ).
Cet organite se retrouve donc au cœur de nombreux programmes de recherche mais les défis majeurs qui restent à relever se heurtent à plusieurs verrous scientifiques et techniques. L'un des verrous les plus importants est l'absence d'une technique fiable et aisée à mettre en œuvre permettant de transformer l'ADN mitochondrial végétal ou humain de manière stable. Seule la transformation du génome mitochondrial de la levure Saccharomyces cerevisiae (Fox et al., Proc Natl Acad Sci, 85, 7288-7292, 1988) et de l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii (Remacle et al., Proc Natl Acad Sci, 103, 4771 - 4776, 2006) a pu être obtenue à ce jour.
L'une des approches possibles pour complémenter un gène mitochondrial muté est d'introduire un gène dans le génome nucléaire de la cellule, et d'importer la protéine codée par le gène dans la mitochondrie en utilisant la voie d'importation mitochondriale des protéines. Cependant cette technique ne permet de complémenter que les dysfonctionnements mitochondriaux dont l'origine est protéique. En effet, cette approche ne permet pas de complémenter des maladies mitochondriales dues par exemple à des mutations d'ARNt mitochondriaux, ni d'influencer directement la réplication, le maintien ou l'expression du génome de la mitochondrie. De plus, la principale limite que présente cette méthode est de faire face à un trafic intracellulaire difficile des protéines fortement hydrophobes codées par le génome mitochondrial.
Aussi, il a été envisagé d'adresser de l'ARN messager (ARNm) à la périphérie des mitochondries, pour adresser ensuite la protéine correspondante dans la mitochondrie. En effet, il a été démontré, tant chez S. cerevisiae que dans les cellules humaines, que des ARNm codant des protéines mitochondriales sont enrichis à la surface des organelles. Ainsi, les protéines traduites à partir de ces ARNm sur des polysomes cytosoliques situés à la surface des organelles sont aussitôt entraînées à travers la double membrane mitochondriale. L'importance des régions 3' UTR (pour « 3' untranslated région ») dans la localisation mitochondriale des ARNm a conduit des chercheurs à utiliser ces séquences pour adresser des protéines fortement hydrophobes et compenser ainsi des déficiences mitochondriales entraînant des neuropathies optiques (Bonnet et al., Biochem Biophys Acta, 1783, 1707-1717, 2008 ).
Le transport d'acides nucléiques étrangers dans des mitochondries isolées, de façon transitoire ou stable, et ce afin d'étudier ou de manipuler l'expression du génome mitochondrial, n'a été couronné de succès que dans un nombre limité de cas en utilisant les techniques suivantes.
Vestweber et al. (Biochem Soc Tra, 17:5, 827-828, 1989) ont montré que le peptide DHFR fusionné à la séquence d'adressage mitochondriale de coxIV est importé dans la mitochondrie. De plus, cette protéine peut entrainer avec elle un oligonucléotide de petite taille lorsque celui-ci est lié à la protéine de manière covalente. L'oligonucléotide étant lié de manière covalente à la protéine de fusion, cette méthode ne présente que peu d'intérêt en termes d'applications pour une expression allotopique.
L'acide nucléique d'intérêt peut être importé dans des mitochondries végétales isolées par électroporation (Farre et Araya, Nucleic Acid Res, 29, 2484-2491 , 2001 ) ou par voie directe (Koulintchenko et al., EMBO J, 22, 1245-1254, 2003). Les gènes introduits ont été ensuite exprimés sous la dépendance d'un promoteur mitochondrial. Cependant, le transport in vitro d'ADN dans des mitochondries isolées par électroporation souffre de deux problèmes majeurs. D'une part, la technique d'électroporation entraîne la perte d'intégrité d'une partie non négligeable des organelles. D'autre part, cette technique ne peut être appliquée pour l'instant à des cellules entières. Le transport d'ADN par voie directe n'est pas aussi délétère que l'électroporation. En revanche, l'expression du transgène inséré reste aléatoire, faible et difficile à obtenir. Une autre technique repose sur l'utilisation de molécules de PNA (« Peptide
Nucleic Acid »), c'est-à-dire des macromolécules qui miment l'ADN. Les molécules de PNA sont fusionnées avec une séquence d'adressage mitochondrial, et peuvent être importées dans des mitochondries de cellules humaines (Muratovska et al., Nucleic Acids Res, 29, 1852-1863, 2001 ). Cependant la liaison PNA-peptide est difficile à réaliser et le conjugué est vulnérable aux protéases.
Une autre technique repose sur l'utilisation du transport naturel d'ARN dans les mitochondries. Dans la grande majorité des cas, ce sont des ARNt codés par le génome nucléaire qui sont transportés dans l'organite. Ce transport a été expérimentalement démontré dans plusieurs organismes, dont l'homme (Salinas et al., Trends Biochem Sci, 33, 320-329, 2008 ; Rubio ét al., Proc Natl Acad Sci, 105, 9186-9191 , 2008). Récemment, des articles ont décrit la possibilité d'importer un ARNtLys dans des mitochondries humaines. En effet, l'absence d'un ARNtLys mitochondrial fonctionnel conduit au syndrome MERRF (pour « Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers »), lequel aboutit à une maladie dégénérative grave. Kolesnikova et al. (Human Mol Genêt, 13, 2519-2534, 2004) décrit le transport de l'ARNtLys de levure, ou de formes mutantes, par utilisation d'un système de transport d'ARN présent dans les mitochondries humaines. Mahata ét al. (Science, 314, 471 -474, 2006) décrit le transport de l'ARNtLys cytosolique humain dans des mitochondries de cellules humaines par apport d'un complexe protéique d'importation d'ARNt (appelé RIC pour « RNA Import Complex ») du protozoaire Leishmania. Enfin, le transport dans des mitochondries de cellules humaines de petits ARN antisens sous la dépendance d'une séquence signal d'importation d'ARNt de Leishmania et en présence du complexe RIC, a permis la dégradation spécifique d'ARN ciblés (Mukherjee et al., Human Mol Genêt, 17, 1292-1298, 2008). Cependant, le transport in vivo de l'ARNtLys ou de ses dérivés, soit par l'utilisation d'un système de transport encore inconnu dans les mitochondries humaines, soit par l'utilisation du complexe RIC, ne peut être généralisable à n'importe quel ARNt. De plus, l'utilisation du complexe RIC qui comporte une douzaine de sous-unités et son insertion dans des membranes mitochondriales est difficile à mettre en œuvre. Enfin, aucun ARN de grande taille, comme par exemple un ARNm, n'a été transporté à ce jour avec ces systèmes.
Ces diverses approches possèdent donc chacune plusieurs inconvénients qui vont de l'instabilité des molécules à la difficulté d'internalisation ou d'expression. De plus, elles limitent les champs d'application du fait de l'absence de système généralisable. En effet, chacune des approches ci-dessus mentionnées n'est possible que pour une classe précise d'acide nucléique. II serait donc souhaitable d'obtenir un outil permettant l'importation d'acides nucléiques dans les mitochondries qui (i) lèverait la restriction actuelle quant à la très faible diversité des acides nucléiques qui ont pu être adressés aux mitochondries ; (ii) lèverait la restriction actuelle quant à la faible taille des acides nucléiques qui ont pu être adressés aux mitochondries ; (iii) éviterait la lourdeur des techniques actuellement disponibles ; et (iv) permettrait d'assurer la fonctionnalité et la stabilité des acides nucléiques transportés.
DESCRIPTION DE L'INVENTION Les inventeurs ont établi une stratégie pour développer un système de navette protéique permettant l'introduction efficace et « à souhait » de n'importe quel acide nucléique dans les mitochondries. Ce système de navette protéique est basé sur l'utilisation d'une protéine capable de fixer de façon non covalente des acides nucléiques. Cette protéine, surexprimée en fusion à une séquence d'adressage mitochondriale, est internalisée dans la mitochondrie en entraînant avec elle l'acide nucléique allogène.
Plus particulièrement, les inventeurs ont identifié une protéine soluble capable de lier des acides nucléiques de façon aspécifique et sans faire appel à une réaction chimique entrainant des liaisons covalentes, la DiHydroFolate Reductase cytosolique de souris (DHFR). Ils ont fusionné cette protéine à une séquence d'adressage mitochondriale, en l'occurrence celle de la sous-unité 9 de l'ATP synthase (atp9) de Neurospora crassa. Cette protéine de fusion est appelée pSu9-DHFR.
Les inventeurs ont démontré que la protéine de fusion pSu9-DHFR permet l'importation de plusieurs acides nucléiques différents, à savoir l'ARNtAIa cytosolique de plante, le précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze, et l'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre, dans des mitochondries isolées de pomme de terre. Certains de ces ARN sont de taille importante. Ainsi, le système navette selon l'invention a permis l'importation d'un transcrit d'environ 250 nucléotides correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze, et celle d'un ARNm complet d'environ 650 nucléotides, à savoir l'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre. II a par ailleurs été montré que la protéine de fusion pSu9-DHFR permet l'importation d'ARN non seulement dans des mitochondries de pomme de terre, mais aussi dans des mitochondries de levure. Le système navette selon l'invention est donc généralisable aux mitochondries de n'importe quel organisme. Ce système permet également l'importation d'acides nucléiques autres que des ARN, puisqu'il a été montré qu'un ADN de 75 nucléotides pouvait être importé dans des mitochondries de pomme de terre et de levure. Le système navette selon l'invention permet donc l'importation de n'importe quel type d'acide nucléique, même de grande taille, au sein de mitochondries issue de n'importe quel organisme. De plus, le protocole de mise en œuvre de l'invention est simple et efficace. Enfin, ce système navette peut être utilisé pour importer des acides nucléiques de manière ciblée et spécifique, en le mettant en œuvre avec une protéine de fusion capable de fixer des acides nucléiques de manière séquence-spécifique.
1. Protéines de fusion selon l'invention
L'invention concerne des protéines de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt. De telles protéines de fusion sont appelées ici « protéines de fusion selon l'invention ».
N'importe quelle séquence d'adressage mitochondriale peut être utilisée dans le cadre de l'invention. De telles séquences sont bien connues de l'homme du métier et incluent, par exemple, pSu9. D'autres séquences d'adressage mitochondriale sont par exemple celle de la sous-unité IV de la cytochrome oxydase (coxIX) de la levure Saccharomyces cerevisiae (Menand et al., Proc Natl Acad Sci, 95, 1 1014-1 1019, 1998), celle de la sous-unité VIII de la cytochrome oxydase de Schizosaccharomyces pombe (Ozawa et al., Nature Methods, 4, 413-419, 2007) ou encore celle de la sous-unité F1 β de l'atp synthase de Nicotiana plumbaginifolia (Moberg et al., J Mol Biol, 336, 1 129-1 140, 2004) Cette liste n'est pas exhaustive et la séquence d'adressage mitochondriale peut être n'importe quelle séquence d'adressage mitochondriale correctement prédite et dont la fonction a été expérimentalement démontrée, selon des critères bien connus de l'homme du métier (Habib et al., Methods in CeII Biology, 80, 761 -781 , 2007).
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence d'adressage mitochondriale selon l'invention comprend ou consiste en la séquence pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa. Par « séquence d'adressage mitochondriale pSu9 », on entend ici le polypeptide codé soit par la séquence SEQ ID NO : 2, soit par des séquences nucléotidiques dérivées de SEQ ID NO : 2. De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à : - un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 2 ;
- une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à SEQ ID NO : 2 ;
- un variant allèlique de la séquence SEQ ID NO : 2; - une séquence homologue à pSu9 provenant d'une autre espèce que
Neurospora crassa; à condition que les séquences d'adressage codées par de telles séquences dérivées conservent leur capacité d'adresser la protéine de fusion à la mitochondrie. Cette capacité peut facilement être vérifiée par l'homme du métier, par exemple en utilisant les protocoles décrits dans l'exemple 1 .1.7 ou par Pujol et al. (Proc Natl Acad Sci, 105, 6481 - 6485, 2008).
Les séquences nucléotidiques dérivées peuvent différer de la séquence de référence par substitution, délétion et/ou insertion d'un ou de plusieurs nucléotides, et ceci à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité de la protéine codée par l'acide nucléique. Par « séquence au moins 95% (par exemple) identique à une séquence de référence », on entend une séquence identique à la séquence de référence si ce n'est que cette séquence peut comporter jusqu'à cinq mutations (substitutions, délétions et/ou insertions) pour chaque partie de cent nucléotides de la séquence de référence. Ainsi, pour une séquence de référence faisant 100 nucléotides, un fragment de 95 nucléotides et une séquence de 100 nucléotides comportant 5 substitutions par rapport à la séquence de référence sont deux exemples de séquences 95% identiques à la séquence de référence. Le pourcentage d'identité est généralement déterminé en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, le Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). De préférence, les substitutions, délétions et/ou insertions au niveau de la séquence nucléotidique ne conduisent pas à un changement de phase de lecture, ni à l'introduction d'un codon-stop. Les substitutions peuvent soit être silencieuses, soit conduire à des mutations au niveau de la protéine codée par l'acide nucléiques.
La protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut correspondre à n'importe quelle protéine capable de lier un acide nucléique de façon non covalente. L'homme du métier peut facilement déterminer si une protéine est capable de lier un acide nucléique par la technique du gel retard (voir les exemples 1 .1.13. et 1 .2.1.).
La protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut lier l'acide nucléique d'intérêt soit de manière aspécifique (i.e. elle est capable de lier les acides nucléiques indépendamment de leur séquence), soit de manière séquence-spécifique (i.e. elle n'est capable de se lier qu'à des acides nucléiques contenant une séquence particulière).
La séquence d'adressage mitochondriale est fusionnée à la protéine liant un acide nucléique d'intérêt de sorte à ce qu'une seule protéine soit traduite. En d'autres termes, l'acide nucléique codant la séquence d'adressage mitochondriale est fusionnée à l'acide codant la protéine liant un acide nucléique d'intérêt de sorte à ce qu'il y ait une seule et même phase ouverte de lecture. La protéine de fusion selon l'invention comporte la séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à l'extrémité N-terminale de la protéine liant un acide nucléique d'intérêt.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt est la protéine DHFR murine, qui lie des acides nucléiques de manière aspécifique. Par « DHFR », on entend ici la protéine codée soit par la séquence SEQ ID
NO : 1 , soit par des séquences nucléotidiques dérivées de SEQ ID NO : 1 . De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à :
- un fragment d'au moins 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 550 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1 ;
- une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à SEQ ID NO : 1 ;
- un variant allèlique de la séquence SEQ ID NO : 1 ;
- une séquence homologue à DHFR provenant d'une autre espèce que la souris; à condition que les protéines codées par de telles séquences nucléotidiques dérivées conservent leur capacité à lier des acides nucléiques. Lorsque l'invention est mise en œuvre avec la protéine DHFR, l'acide nucléique d'intérêt peut avoir n'importe quelle séquence. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt est la protéine de coque du phage MS2, qui lie des acides nucléiques de manière séquence-spécifique. Par « protéine de coque du phage MS2 » ou « CP », on entend ici la protéine codée soit par les nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18, soit par des séquences nucléotidiques dérivées des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18. De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à :
- un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ou 350 nucléotides des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18 ;
- une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18 ;
- un variant allèlique des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18;
- une séquence homologue à CP provenant d'une autre espèce que le phage MS2; à condition que les protéines codées par de telles séquences dérivées conservent leur capacité à lier des acides nucléiques de manière séquence-spécifique. La protéine de coque du phage MS2 reconnaît la région en tige-boucle de l'ARN
MS2. Le terme « région en tige-boucle de l'ARN MS2 » désigne les nucléotides 154 à 172 et/ou les nucléotides 193 à 21 1 de la séquence SEQ ID NO : 17. De ce fait, lorsque l'invention est mise en œuvre avec la protéine de coque du phage MS2, l'acide nucléique d'intérêt doit contenir ou être fusionné à au moins une région en tige-boucle de l'ARN MS2. L'acide nucléique d'intérêt peut par exemple contenir ou être fusionné à au moins une copie des nucléotides 154 à 172 de la séquence SEQ ID NO : 17, des nucléotides 193 à 21 1 de la séquence SEQ ID NO : 17, ou des nucléotides 125 à 239 de la séquence SEQ ID NO : 17. Cependant, l'homme du métier peut construire une protéine de fusion selon l'invention contenant une protéine liant un acide nucléique d'intérêt de manière séquence- spécifique qui est différente de la protéine de coque du phage MS2. Par exemple, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut correspondre à PUMILI01 ou l'un de ses fragments liant des acides nucléiques (Ozawa et al., Nature Methods, 4, 413-419, 2007). II peut aussi s'agir de protéines comme les facteurs de transcription qui lient de façon spécifique des motifs connus par l'homme du métier, motifs que l'on peut retrouver facilement dans les banques de données Interpro, Pfam ou encore SCOP. Citons par exemple les protéines bZip d'Antirrhinum majus qui lient préférentiellement les motifs CACGTG ou TGACGT/C (Martinez-Garcia ét al., The Plant J, 13, 489-505). Un mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la protéine de coque du phage MS2. La séquence d'adressage mitochondriale correspond préférentiellement à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9. De ce fait, l'invention a pour objet une protéine de fusion pSu9-CP comprenant ou consistant en un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150 ou 175 acides aminés de SEQ ID NO : 19, ou comprenant ou consistant en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 19.
Un autre mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la protéine DHFR. La séquence d'adressage mitochondriale correspond préférentiellement à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9. De ce fait, l'invention a pour objet une protéine de fusion pSu9-DHFR comprenant ou consistant en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 3, ou comprenant ou consistant en un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 200 ou 250 acides aminés de SEQ ID NO : 3. Les protéines de fusion selon l'invention qui comprennent ou consistent en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 3 ou 19 peuvent contenir des mutations telles que des délétions, insertions et/ou substitutions d'acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré, ces protéines diffèrent des protéines de séquence SEQ ID NO : 3 ou 19 par des substitutions conservatives.
L'invention concerne également un acide nucléique codant une protéine de fusion selon l'invention, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant un tel acide nucléiques. Dans les vecteurs recombinants selon l'invention, l'acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux d'expression (e.g. promoteur, « enhancer », terminateur, signaux de traduction, incluant par exemple les régions UTR 5' et 3'), de manière à former une cassette d'expression. Un mode de réalisation préféré selon l'invention porte sur des vecteurs recombinants pour thérapie génique. Par « vecteur recombinant pour thérapie génique » on entend ici tout vecteur convenant à la thérapie génique. De tels vecteurs sont généralement sous la forme d'un virus recombinant, et correspondent donc à des vecteurs viraux. Le vecteur viral peut être choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès, un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. Le terme « virus défectif » désigne un virus incapable de se répliquer dans une cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs est dénué d'au moins les séquences nécessaires pour la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées, soit rendues non fonctionnelles ou encore substituées par d'autres séquences et en particulier par l'acide nucléique qui code pour le peptide d'intérêt. Néanmoins, de préférence, le virus défectif conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsulation des particules virales. Dans un mode de réalisation préféré des vecteurs recombinants pour thérapie génique, le vecteur contient un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale (par exemple pSu9) et une protéine qui lie un acide nucléique de manière séquence-spécifique (par exemple la protéine de coque du phage MS2). 2. Utilisation des protéines de fusion selon l'invention et kits pour l'importation d'acides nucléiques d'intérêt dans des mitochondries
La présente invention concerne l'utilisation, in vivo ou in vitro, d'une protéine de fusion selon l'invention (i.e. une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt), ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie.
Comme apparent au vu des exemples, ladite protéine de fusion n'est pas liée à l'acide nucléique d'intérêt de façon covalente. En d'autres termes, dans le cadre de la présente invention, la protéine de fusion est naturellement capable de lier d'acide nucléique d'intérêt, sans qu'il soit nécessaire de mettre en œuvre une réaction chimique de sorte à créer des liaisons covalentes entre la protéine de fusion et l'acide nucléique d'intérêt.
L'acide nucléique d'intérêt selon l'invention peut être n'importe quel type d'acide nucléique. Il peut s'agir d'une molécule simple brin ou double brin, de nature ADN ou ARN, et d'origine mitochondriale, plastidiale ou cytoplasmique. Par exemple, l'acide nucléique d'intérêt selon l'invention peut être un ARN antisens, ou un ARN messager (ARNm) ou encore un ARN de transfert (ARNt) complet ou partiel. Le système navette selon l'invention a permis le transport d'acides nucléiques de différentes tailles, y compris des acides nucléiques de grande taille tels qu'un transcrit de 775 nucléotides (voir exemple 1.2.5.). De ce fait, dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique d'intérêt a une taille supérieure à 24, 50, 100, ou 500 bases ou paires de bases. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique d'intérêt est un ARN messager complet ou un ARN de transfert complet, en particulier un ARN messager incluant les régions 5' et 3' UTR.
Par « in vitro », on entend ici toute méthode qui n'est pas réalisée sur un organisme pluricellulaire tel qu'un organisme animal et/ou humain. En revanche, les méthodes in vitro incluent des méthodes réalisées sur des cellules, tissus ou organes préalablement isolés d'un organisme pluricellulaire animal et/ou humain. Les méthodes in vitro incluent également des méthodes réalisées sur des cellules ou tissus de plantes.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine DHFR, ou en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine de coque du phage MS2. Les mitochondries peuvent soit être isolées, soit être présentes au sein d'une cellule. L'homme du métier peut facilement obtenir des mitochondries isolées, par exemple en utilisant les protocoles décrits dans les exemples 1.1 .4. et 1 .1.6. Les mitochondries peuvent être issues de n'importe quel organisme eucaryote, tel que des levures, des champignons, des plantes ou des animaux (y compris des humains).
Lorsque les mitochondries sont isolées, la protéine de fusion peut lier l'acide nucléique de manière aspécifique ou de manière séquence-spécifique. Dans le cas d'une importation dans une mitochondrie d'une cellule, une protéine de fusion liant l'acide nucléique de manière séquence-spécifique est préférentiellement utilisé.
L'homme du métier peut aisément vérifier si l'acide nucléique d'intérêt a été importé dans la mitochondrie, par exemple en utilisant le protocole décrit dans l'exemple 1.1.7.
L'invention concerne également un kit pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie comprenant : i. une protéine de fusion selon l'invention, ou un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et, optionnellement, ii. au moins un réactif pour l'importation de l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie ; et/ou iii. des instructions pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie.
Les réactifs du kit peuvent correspondre à n'importe lequel des réactifs décrits dans les exemples de la présente demande. Ils peuvent par exemple correspondre à au moins un réactif choisi parmi un tampon import (e.g. Mannitol 600 mM, phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, Hepes-KOH pH 7,2 20 mM, KCI 40 mM, DTT 2 mM, malate 2 mM, NADH 2 mM), un tampon de lavage (e.g. saccharose 300 mM, phosphate de potassium pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,1 %(p/v), glycine 5 mM) et un tampon STOP (e.g. le tampon de lavage contenant de l'EGTA 5 mM et de l'EDTA 5 mM). La composition de ces réactifs pourra varier en fonction de l'organisme dont provient la mitochondrie ou la cellule contenant la mitochondrie.
3. Procédé d'importation d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée
La présente demande concerne également un procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée, comprenant l'étape de mettre en contact une protéine de fusion selon l'invention avec un acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée, permettant ainsi la liaison non covalente de l'acide nucléique à la protéine de fusion. La mise en contact peut par exemple être réalisée en mélangeant environ 1 μg de la protéine de fusion avec environ 50 à 100 fmoles de l'acide nucléique d'intérêt et environ 200 μg de mitochondries isolées. A ce mélange est additionné les réactifs appropriés, tels qu'un tampon import (par exemple contenant du Mannitol 600 mM, du phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, de l'Hepes-KOH pH 7,2 20 mM, du KCI 40 mM, du DTT 2 mM, du malate 2 mM et du NADH 2 mM), de l'ADP, et de l'ATP.
Après la mise en contact, on laisse en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée. Pour ce faire, on incube à une température et pendant une durée appropriée. Par exemple, l'incubation peut être réalisée entre 40C et 3O0C, entre 200C et 300C, ou préférentiellement aux alentours de 250C. L'incubation peut par exemple avoir une durée de 5 min à 16 h (« overnight »), 15 min à 2 heures, ou environ 30 min.
Le procédé peut comporter une étape supplémentaire consistant à ajouter un mélange contenant de la RNAse ou de la DNAse afin de dégrader les acides nucléiques d'intérêt se trouvant à l'extérieur des mitochondries.
Le procédé peut contenir une autre étape supplémentaire qui consiste en l'arrêt de la réaction, la centrifugation du mélange, l'élimination du surnageant, et le lavage du culot de mitochondries.
Les acides nucléiques du culot de mitochondries peuvent ensuite être extraits pour analyse.
Lorsque le procédé d'importation selon l'invention est mis en œuvre avec un acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention, le procédé d'importation contient en outre les étapes suivantes, avant l'étape (a) :
- produire une protéine de fusion selon l'invention ; et optionnellement, - purifier ladite protéine de fusion.
La protéine de fusion selon l'invention peut par exemple être produite par des techniques recombinantes, par exemple par expression de l'acide nucléique codant une protéine de fusion selon l'invention dans une cellule hôte convenant à la production de protéines recombinantes. De telles cellules hôtes incluent notamment les bactéries {E.coli), les levures, les champignons, les cellules hôtes de baculovirus, ainsi que les cellules d'insectes, les cellules végétales, animales et/ou humaines.
4. Procédé d'importation d'un acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie d'une cellule Un aspect de l'invention concerne l'importation d'acides nucléiques d'intérêt de manière séquence-spécifique. Dans ce cas, la cellule est transformée par deux acides nucléiques, l'un étant l'acide nucléique d'intérêt, et l'autre codant une protéine de fusion selon l'invention liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique. Une fois intégrés dans le génome nucléaire de la cellule, les deux acides nucléiques sont transcrits en ARN. L'ARN codant la protéine de fusion selon l'invention est traduit en protéine. Une fois exprimée dans le cytoplasme de la cellule, la protéine de fusion permet alors l'importation de l'acide nucléique d'intérêt, lui aussi présent dans le cytoplasme, dans la mitochondrie.
Ainsi, l'invention concerne une combinaison d'acides nucléiques comprenant : a) un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à l'acide nucléique lié par ladite protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique, ou un acide nucléique dont la transcription produit un tel acide nucléique. Dans un mode de réalisation préféré, la combinaison d'acides nucléiques comprend : a) un acide nucléique codant la séquence d'adressage mitochondriale (par exemple pSu9) fusionnée à la protéine de coque du phage MS2; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à au moins une région en tige-boucle de l'ARN MS2.
Dans un premier mode de réalisation, un seul et même vecteur recombinant comprend les acides nucléiques (a) et (b). En d'autres termes, la combinaison correspond à un vecteur recombinant comprenant les acides nucléiques (a) et (b). Un tel vecteur fait partie des vecteurs recombinants selon l'invention. Alternativement, les deux acides nucléiques sont positionnés sur deux vecteurs différents. Dans ce cas, la combinaison correspond à une combinaison de vecteurs recombinants, l'un comprenant l'acide nucléique (a), l'autre comprenant l'acide nucléique (b).
L'invention concerne également un procédé d'importation in vitro ou in vivo d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule, comprenant les étapes de : a) obtenir ou préparer une combinaison d'acides nucléiques tels que définis ci-dessus; et b) introduire ladite combinaison d'acides nucléiques dans une cellule. L'acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux d'expression (e.g. promoteur, « enhancer », terminateur, signaux de traduction, 5' ou 3'UTR), de manière à former une cassette d'expression. Quant à l'acide nucléique d'intérêt fusionné à l'acide nucléique reconnu par ladite protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique, il est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux permettant sa transcription (e.g. promoteur, « enhancer », terminateur). La cellule peut correspondre à n'importe quelle cellule eucaryote contenant des mitochondries, par exemple des cellules de levure, de champignons, de protozoaires, de plantes ou d'animaux (y compris des cellules humaines).
Les vecteurs peuvent être introduits dans la cellule par n'importe quelle méthode appropriée, telle que l'électroporation, la transformation biolistique, la transformation via agrobacterium ou tout agent bactérien adapté à l'organisme hôte, la micro-injection, les méthodes chimiques, etc. La méthode sera généralement choisie en fonction du type de cellule utilisé.
5. Domaines d'application de l'invention Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus sont notamment utiles dans le domaine de la thérapie génique, dans le domaine agronomique, pour produire des protéines dans des mitochondries, pour analyser des processus fondamentaux pour la biogenèse mitochondriale, et pour manipuler l'expression du génome mitochondrial. Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus peuvent par exemple être utilisés pour l'analyse de processus fondamentaux pour la biogenèse mitochondriale. La facilité à introduire à volonté des acides nucléiques dans des mitochondries, quelque soit leur séquence et/ou leur taille, permet d'envisager de nombreuses études visant à comparer des acides nucléiques sauvages à des formes mutées, à étudier leur stabilité, et/ou leur fonctionnalité dans l'organelle.
Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus permettent également la manipulation de l'expression du génome mitochondrial. Ainsi, le système navette selon l'invention permet l'introduction aisée et efficace d'ARN antisens, d'oligonuléotides ADN ou ARN sens ou antisens, de ribozymes complémentaires à des régions impliquées dans la réplication, la transcription ou la traduction afin de tester directement et rapidement l'effet sur l'expression du génome mitochondrial, par exemple chez les plantes.
D'autre part, les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus permettent la production de protéines allogènes. La présente invention permet, pour la première fois, l'introduction d'ARNm complets avec leurs régions 5' et 3' UTR dans une mitochondrie. La production de la protéine correspondante est alors envisageable. En absence des séquences indispensables à la traduction eucaryotique, ces ARNm seront exclusivement traduits en protéine dans la mitochondrie où ils sont adressés. Si le code génétique diverge, ce qui est le cas pour les mitochondries animales par exemple, l'ARNm ne pourra être produit que dans la mitochondrie de part les codons utilisés.
La présente invention concerne également l'utilisation des protéines de fusion selon l'invention dans le domaine de la thérapie génique. L'acide nucléique d'intérêt est importé dans une mitochondrie d'une cellule humaine ou animale grâce à une protéine de fusion selon l'invention.
Ainsi, un aspect de l'invention porte sur :
- un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour utilisation en tant que médicament et/ou pour utilisation en thérapie génique ; - l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour la préparation d'un médicament, préférentiellement destiné à la thérapie génique ;
- une composition pharmaceutique comprenant une protéine de fusion selon l'invention, un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention.
Les vecteurs recombinants peuvent correspondre à n'importe quel vecteur recombinant contenant une protéine de fusion selon l'invention. Ils correspondent préférentiellement à des vecteurs pour thérapie génique. Les vecteurs et combinaisons de vecteurs ou d'acides nucléiques correspondent préférentiellement à ceux décrits dans le paragraphe 4 ci-dessus, intitulé « Procédé d'importation ciblé et spécifique d'un acide nucléique d'intérêt ».
Le ou les vecteurs peuvent être introduits in vivo par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, il est possible d'introduire le vecteur d'ADN in vivo sous une forme nue, c'est-à-dire sans l'aide d'un quelconque véhicule ou système qui faciliterait la transfection du vecteur dans les cellules. Un canon à gènes peut être également employé, par exemple en déposant l'ADN à la surface de particules « en or » et en projetant celles-ci de manière à ce que l'ADN pénètre à travers la peau d'un patient. Des injections au moyen d'un gel liquide sont également possibles pour transfecter à la fois peau, muscle, tissu gras et tissu mammaire. Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Des nanoparticules en polyalkyl cyanoacrylate biodégradables sont particulièrement avantageuses. Dans le cas de liposomes, l'utilisation de lipides cationiques favorise l'encapsulation des acides nucléiques qui sont chargés négativement, et facilite la fusion avec les membranes cellulaires chargées négativement. Une administration ciblée de gènes est par exemple décrite dans la demande WO 95/28 494. Chez les plantes, l'ADN peut être transféré classiquement via l'utilisation d'Agrobacterium tumefaciens.
Les vecteurs et combinaisons selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter n'importe quelle maladie humaine liée à une déficience mitochondriale. Les vecteurs et combinaisons permettent de complémenter le gène déficient en introduisant par transgenèse le gène non muté dans le génome nucléaire, alors que la transgenèse génétique directe des mitochondries humaines est actuellement impossible. Le produit de ce gène est ensuite adressé à la mitochondrie. La présente invention permet d'élargir considérablement la panoplie d'acides nucléiques transportables dans la mitochondrie. De plus, elle permet de tester très rapidement, in vitro, dans les mitochondries isolées, les acides nucléiques les plus adaptés pour complémenter une fonction mitochondriale déficiente, et/ou pour inhiber la réplication des molécules d'acides nucléiques « malades » afin de refaire basculer le seuil critique vers les molécules d'acides nucléiques « saines ».
Un exemple de maladie qui peut être traité par les vecteurs recombinants et combinaisons selon l'invention est le syndrome MERRF (« Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers »). L'invention porte donc sur un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour traiter et/ou prévenir le syndrome MERRF. Dans ce cas, l'acide nucléique d'intérêt qui est présent dans le vecteur ou la combinaison selon l'invention est l'ARNtLys mitochondrial humain. La présente invention concerne enfin l'utilisation des protéines de fusion selon l'invention dans le domaine agronomique. L'acide nucléique d'intérêt est importé dans une mitochondrie d'une cellule de plante grâce à une protéine de fusion selon l'invention qui, de préférence, lie ledit acide nucléique d'intérêt de manière séquence-spécifique.
Ainsi, un aspect de l'invention porte sur l'utilisation in vitro du vecteur selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule de plante. La cellule de plante peut par exemple correspondre à un protoplaste. Les vecteurs recombinants peuvent correspondre à n'importe quel vecteur recombinant contenant une protéine de fusion selon l'invention. Les vecteurs et combinaisons de vecteurs ou d'acides nucléiques correspondent préférentiellement à ceux décrits dans le paragraphe 4 ci- dessus, intitulé « Procédé d'importation ciblé et spécifique d'un acide nucléique d'intérêt ».
L'invention concerne plus particulièrement un procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) obtenir ou préparer une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention; b) introduire ladite combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques dans une cellule de plante, par exemple en transformant un protoplaste ; c) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (b) ; et d) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome lesdits vecteurs ou acides nucléiques.
Par ailleurs, il est possible d'injecter des mitochondries isolées dans des protoplastes de plante (Verhoeven et al., Plant CeII Reports, 14 : 781 -785, 1995). De ce fait, l'invention concerne également un procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact une protéine de fusion selon l'invention avec l'acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée ; et b) laisser en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée ; c) introduire ladite mitochondrie isolée dans une cellule de plante, par exemple un protoplaste ; d) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (c) ; et e) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome ledit acide nucléique d'intérêt.
La méthode ci-dessus peut aussi bien être mise en œuvre avec des protéines de fusion selon l'invention liant l'acide nucléique d'intérêt de manière séquence-spécifique qu'avec des protéines de fusion selon l'invention liant l'acide nucléique d'intérêt de manière aspécifique.
Les plantes obtenues à l'étape (d) ou (e) des méthodes ci-dessus peuvent ensuite être croisées entre elles, et des plantes homozygotes pour l'acide nucléique d'intérêt peuvent être sélectionnées. Alternativement, les plantes obtenues à l'étape (d) ou (e) peuvent être croisées avec une plante de la même espèce, et les plantes issues du croisement et ayant conservé l'acide nucléique d'intérêt peuvent être sélectionnées. Les plantes recombinantes obtenues par de tels procédés font également partie de l'invention, ainsi que les semences et fruits de telles plantes.
Ces procédés sont utiles pour améliorer les caractéristiques des plantes d'intérêt agronomique, par exemple leur résistance aux stress biotiques et/ou abiotiques, et pour maîtriser la stérilité mâle cytoplasmique. Dans ce dernier cas, les procédés selon l'invention sont utilisés pour introduire un ARNm produisant une protéine capable de générer une stérilité mâle cytoplasmique. Ainsi, un mode de réalisation préféré de l'invention concerne l'utilisation in vitro d'un vecteur selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour générer une stérilité mâle cytoplasmique chez une plante.
Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande.
Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes « comprenant », « contenant », « comportant » et « consistant en » ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : A. Interaction de la protéine pSu9-DHFR avec le transcrit radioactif correspondant à TARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana. L'analyse a été effectuée par la technique de gel retard. La figure présente une autoradiographie du gel en condition native. La première colonne (-) montre TARNtAIa radiomarqué servant de sonde. Les autres colonnes (DHFR) montrent qu'une migration retardée de la sonde est observée en présence de quantité croissante de DHFR. B. Effet de l'addition de pSu9- DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAla marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. «In » représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAla présente dans le milieu d'importation. « + » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en présence de 1 μg de pSu9-DHFR. « - » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en l'absence de pSu9-DHFR. Deux expositions du même gel (4h et la nuit) sont présentées.
Figure 2 : A. Effet de l'addition de pSu9-DHFR et de DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAla marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. « In » représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAla présente dans le milieu d'importation. « - » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en l'absence de DHFR ou de pSu9-DHFR. « 2 » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en présence de 2 μg de DHFR ou de pSu9-DHFR. « 4 » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en présence de 4 μg de DHFR ou de pSu9-DHFR. B. Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAla marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre en présence de méthotrexate. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. « In » représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAla présente dans le milieu d'importation. « - » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en l'absence de pSu9-DHFR. « + » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en présence de 1 μg de pSu9-DHFR. « Mtrx » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla: en présence de 1 μg de pSu9- DHFR et de méthotrexate (50 μM).
Figure 3 : Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro de transcrit correspondant au précurseur d'ARNtHis édité ou non édité de mélèze dans des mitochondries isolées de pomme de terre. A. Schéma du précurseur d'ARNtHis de mélèze. P1 et P2 indiquent la localisation schématique des sites d'hybridation des amorces utilisées pour la cRT-PCR. B. Importation du transcrit marqué radioactivement. La figure représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. « In » représente la quantité initiale de transcrit précurseur d'ARNtHis présente dans le milieu d'importation. « - » représente la quantité de transcrit précurseur d'ARNtHis en l'absence de pSu9-DHFR. « + » représente la quantité de transcrit précurseur d'ARNtHis en présence de 1 μg de pSu9-GFP. « pretrnH-ed » désigne le précurseur d'ARNtHis édité. « pretrnH-uned » désigne le précurseur d'ARNtHis non édité. « tr » désigne le transcrit d'ARNtHis mature. C. Séquence de 15 clones de l'ARNtHis obtenus après importation in vitro. Seules les extrémités 5' et 3' des séquences sont représentées. La séquence CCA ajoutée post-transcriptionnellement, observée pour 5 de ces clones, est représentée en texte italique souligné. Les séquences du précurseur non complètement mature sont représentées en gras. Figure 4 : Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro d'un oligonucléotide correspondant à TARNtAIa marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. « T » représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAla présente dans le milieu d'importation. « + » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en présence de 1 μg de pSu9-DHFR. « - » représente la quantité de transcrit d'ARNtAla en l'absence de pSu9-DHFR. « Mi » désigne le traitement RNase réalisé sur mitochondries intègres. « Mtp » désigne le traitement RNase réalisé sur mitoplastes. A.
Mitochondries isolées de pomme de terre. B. Mitochondries isolées de levure.
Figure 5 : Importation d'ARN dans les mitochondries en présence de pSu9-MS2. A. Effet de l'addition de MS2 ou pSu9-MS2 sur l'importation du transcrit radioactif correspondant à l'ARNtHis fusionné à la région ARN en tige-boucle du phage MS2 dans des mitochondries de pomme de terre. Autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 8%. - : absence de protéine MS2 ou pSu9-MS2, + : en présence de 1 μg de MS2 ou pSu9-MS2. B. Expression inductible et stable de cellules de levure S. cerevisiae transformées avec le vecteur pESC TRP comportant ou non le gène codant pour MS2 ou pSu9-MS2 et le gène codant pour la construction anticox-2SL. Analyse par western blot de l'expression de la protéine dans un extrait total de protéines de levure et analyse par RT-PCR de l'expression de l'ARN dans un extrait total d'ARN de levure. - : levures transformées avec le vecteur pESC TRP seul ; M : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox-2SL et pour la protéine MS2 ; pM : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox-2SL et pour la protéine preMS2. Les protéines sont révélées grâce à un anticorps anti-Myc. p : forme pSu9-MS2, m : forme MS2. Le produit PCR obtenu après amplification par RT-PCR à l'aide d'un couple d'oligonucléotides spécifique est visualisé par une flèche. * : produit d'amplification aspécifique. C. Analyse par western blot et par northern blot de la qualité des préparations de mitochondries de levure. Un anticorps dirigé contre par la protéine Kar2 du réticulum endoplasmique montre l'absence de contamination des préparations mitochondriales. Une sonde oligonucléotidique dirigée contre l'ARNtLys(UUU) trK2 cytosolique de levure montre l'absence de contaminants ARN dans les préparations mitochondriales. Total : extrait de protéines totales de levure ou d'ARN total de levure ; Mito : extrait de protéines mitochondriales de levure ou d'ARN mitochondrial de levure. - : levures transformées avec le vecteur pESC TRP seul ; M : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox-2SL et pour la protéine MS2 : pM : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox-2SL et pour la protéine preMS2. D. Analyse de l'importation de la protéine MS2 et de l'ARN anticox- 2SL dans des levures transformées ou non. Analyse par western blot pour MS2 à l'aide d'anticorps dirigé contre le tag Myc fusionné à la protéine par clonage dans le vecteur pESC TRP et analyse par RT-PCR pour l'ARN anticox-2SL avec un couple d'amorces spécifique. - : levures transformées avec le vecteur pESC TRP seul ; M : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox-2SL et pour la protéine MS2 ; pM : transformation avec le vecteur comportant le gène codant pour l'ARN anticox- 2SL et pour la protéine preMS2. Le produit PCR obtenu après amplification par RT-PCR à l'aide d'un couple d'oligonucléotides spécifique est visualisé par une flèche.
DESCRIPTION DES SEQUENCES DU LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID NO : 1 représente la séquence codant la DHFR de souris.
SEQ ID NO : 2 représente la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa.
SEQ ID NO : 3 représente la séquence protéique de la protéine de fusion pSu9- DHFR SEQ ID NO : 4 représente la séquence codant l'ARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO : 5 représente la séquence codant la GFP.
SEQ ID NO : 6 représente la séquence codant la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze. Les nucléotides en position 81 , 87 et 1 17 sont des sites d'édition.
SEQ ID Nos. 7 et 8 représentent des amorces pour analyse par la technique de cRT-PCR.
SEQ ID NO : 9 représente la séquence codant I'atp9 mitochondrial de pomme de terre. Les nucléotides en position 353, 383, 414, 415, 423, 425, 515, 524, 545 et 556 correspondent à des sites d'édition. La version non éditée du gène codant I'atp9 mitochondrial contient une cytidine aux positions notées « y ». Au niveau de l'ARNm correspondant obtenu après transcription, ces positions sont éditées en uridine par des enzymes matricielles mitochondriales (générant des thymidines au niveau des séquences d'ADN correspondantes). SEQ ID NO : 10 représente la séquence codant I'atp9 mitochondrial de pomme de terre seule. Cette séquence contient les mêmes sites d'édition que la séquence SEQ ID NO : 9.
SEQ ID Nos. 1 1 à 14 représentent des oligonucléotides pour mutagenèse par PCR. SEQ ID Nos. 15 et 16 représentent des amorces utilisées pour analyse par RT-
PCR.
SEQ ID NO : 17 représente la séquence codant la forme précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze fusionnée, du côté 3', à la séquence codant la partie en tige- boucle de l'ARN MS2. SEQ ID NO : 18 représente la séquence nucléotidique correspondant à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine CP. SEQ ID NO : 19 représente la séquence polypeptidique de la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine CP.
SEQ ID Nos. 20 à 27 représentent des oligonucléotides pour mutagenèse par PCR. SEQ ID Nos. 28 à 34 représentent les séquences d'au moins dix acides aminés montrées sur la Figure 3C.
SEQ ID NO: 35 représente la séquence appelée anticox-2SL, qui comprend la région anti-sens de la région promotrice du gène COX I mitochondrial de levure, fusionnée du côté 3' à la séquence de la partie tige-boucle de l'ARN MS2. SEQ ID NO : 36 représente l'amorce oligonucléotidique n°1 de anticox-2SL
SEQ ID NO : 37 représente l'amorce oligonucléotidique n°2 de anticox-2SL. SEQ ID NO : 38 représente une séquence oligonucléotidique complémentaire à l'ARNtLys mitochondrial trK3 de levure.
SEQ ID NO : 39 représente une séquence oligonucléotidique complémentaire à l'ARNtLys cytosolique trK2 de levure.
EXEMPLE 1 : ADRESSAGE IN VITRO d'ARN ALLOGENE DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE PLANTES VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9- DHFR 1.1. Matériel et Méthodes
1.1.1. Surexpression et purification de la protéine recombinante pSu9-DHFR dans Escherichia coli
Le vecteur pQE40 (Quiagen) contenant un gène chimère codant la DHFR de souris (SEQ ID NO : 1 ) fusionnée à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa (SEQ ID NO : 2 ; Pfanner et al., Eur J Biochem, 169, 289-293, 1987) a été utilisé pour la surexpression de la protéine de fusion pSu9-DHFR (SEQ ID NO : 3). Ce vecteur pSu9-DHFRpQE40 est utilisé pour transformer des bactéries E. coli, souche M15. pSu9-DHFR peut facilement être purifiée en condition native à l'aide d'un tag histidine présent à l'extrémité C terminale de la protéine. Le protocole suivant a été utilisé. 5 mL de milieu LB additionnés d'ampicilline (100 μg/mL) sont ensemencés avec la souche recombinante d'E. coli M15 contenant le plasmide pSu9-DHFRpQE40 et sont incubés une nuit à 370C sous agitation. Cette préculture est utilisée pour ensemencer 45 mL de LB (Extrait de levure 5 g/l, bactotryptone 10 g/l, NaCI 10 g/l, pH 7,0) additionnés d'ampicilline (100 μg/mL) et d'IPTG (isopropyl-b-D-galactothiopyranoside) (1 mM). L'IPTG induit l'expression de la protéine. La surexpression est réalisée pendant 4 heures à 370C sous agitation. Les bactéries sont récupérées par centrifugation pendant 5 minutes à 1 1000 g à température ambiante.
Toutes les étapes sont réalisées à 40C. Après obtention des bactéries induites celles-ci sont soumises à 10 sonications d'une durée de 8 secondes chacune dans 1 ,8 ml_ de tampon de lyse (Tris-malate pH8,2 50 m M, NaCI 0,6 M, MgCI2 5 m M, glycérol 1% (v/v), Triton X-100 1 % (v/v), Imidazole 70 m M, 20 μl de PMSF (paramehtyl sulfonyl fluoride) 100 mM ajoutés extemporanément). Le lysat cellulaire est centrifugé 30 minutes à 4000 g. 200 μL de résine Ni-NTA Superflow (Qiagen) sont lavés 3 fois dans 500 μL de tampon de lavage (Tris-malate pH8,2 50 mM, NaCI 0,6 M, MgCI2 5 mM, glycérol 1 % (v/v), imidazole 70 mM). La résine est récupérée entre chaque lavage par centrifugation 5 minutes à 9000 g. Le surnageant du lysat cellulaire est ajouté à la résine. L'ensemble est incubé 1 heure sous agitation douce. Après centrifugation 5 minutes à 9000 g, le surnageant est éliminé. La résine est lavée 3 fois dans 300 μL de tampon de lavage comme précédemment. Les protéines fixées sur la résine sont alors éluées en présence de 100 μL de tampon d'élution (Hepes pH 7,5 25 mM, NaCI 0,6 M, MgCI2 5 mM, imidazole 250 mM) pendant 15 minutes. L'éluat est récupéré par centrifugation 5 minutes à 9000 g. Cette étape d'élution est répétée 2 fois et les éluats sont congelés dans de l'azote liquide puis conservés à -800C.
1.1.2. Transcription d'ADN in vitro Le kit Riboprobe® (Promega) permet la production de transcrits in vitro à partir du vecteur pGEM®-T Easy contenant les gènes d'intérêt et linéarisé par une enzyme de restriction. Suivant l'orientation de l'insert dans le vecteur, les ARN polymérase T7 ou Sp6 sont utilisées. La réaction se déroule 3 heures à 370C dans 20 μL du milieu réactionnel suivant : 5 à 10 μg d'ADN plasmidique digéré, 4 μL de tampon de transcription 5x (Hepes- KOH pH 7,5 400 mM, MgCI2 120 mM, DTT 200 mM, spermidine 1 O mM), mélange de NTP**, 1 μL d'un mélange enzymatique (15-20 U d'ARN polymérase T7 ou Sp6, 0,3 U de pyrophosphatase) et 40 U d'inhibiteur de RNases (RNaseOUT™ - Invitrogen).
Après la réaction de synthèse des transcrits, 2 unités de DNase RQ1 (Promega) ainsi que 5 μL de tampon DNase 10x (Tris-HCI pH 8,0 200 mM, MgCI2 100 mM) sont ajoutés et le volume est complété à 50 μL. Une incubation à 370C pendant 15 minutes est nécessaire pour digérer l'ADN. Afin d'éliminer les nucléotides non incorporés durant la transcription in vitro et les produits de dégradation de l'ADN, le milieu réactionnel est déposé sur une colonne de Sephadex G-50 d'1 mL préalablement séchée par centrifugation à 200 g. L'élution se fait par une nouvelle centrifugation dans les mêmes conditions. Les ARN sont ensuite précipités à -2O0C pendant une heure dans 2,5 volumes d'éthanol en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10 μL d'eau.
Trois types d'ARN peuvent être produits suivant le mélange de NTP utilisé. Des transcrits d'ARN non marqués sont réalisés dans un milieu réactionnel contenant 2,5 mM de chaque NTP. Des ARN marqués radioactivement sont produits dans un milieu réactionnel contenant 2,5 mM de GTP, CTP et ATP, 0,5 mM d'UTP et 4 μl_ d'[α32P]UTP (10 μCi/μL, activité spécifique : 3 μCi/pmol). Des ARN marqués avec un fluorophore sont produits dans un milieu réactionnel contenant 0,5 mM de GTP, CTP et ATP, 0,375 mM d'UTP et 100 μM d'UTP Chromatide® Alexa Fluor® 488 (Molecular Probe). 1.1.3. Mutagenèse par PCR - construction de gènes chimériques
Les gènes chimériques sont construits par la technique d'extension de fragments chevauchants par PCR. Cette méthode nécessite deux étapes. Lors de la première étape, deux PCR sont réalisées en parallèle à partir de deux matrices différentes : la matrice n ° 1 en présence du premier couple d'amorces (amorces a et b) et la matrice n ° 2 en présence du deuxième couple d'amorces (amorces c et d). Un dixième des deux produits PCR obtenus sont alors mis en présence des amorces a et d pour réaliser une dernière étape de PCR. Au final, le produit PCR correspond à la fusion d'une partie des deux matrices de départ.
1.1.4. Purification de mitochondries de pommes de terre Le protocole utilisé est celui décrit par Pujol et al. (Proc Natl Acad Sci, 105, 6481 -
6485, 2008). Le rendement est d'environ 15 mg d'équivalent de protéines mitochondriales par kg de tubercules de pommes de terre (variété Bintje). Lorsqu'elles sont utilisées pour des expériences d'importation, les mitochondries sont remises dans un volume minimal de tampon de lavage PdT. 1.1.5. Dosage des mitochondries en équivalent protéines par la méthode de
Bradford
Cette méthode est basée sur la modification de la longueur d'onde d'absorption du bleu de Coomassie G-250 en milieu acide après sa fixation sur les protéines (595 nm). En pratique, 800 μL de réactif de Bradford (BioRad) et 200 μL d'extrait protéique à quantifier sont mélangés et l'absorbance est mesurée à 595 nm. Cette mesure de DO permet de déterminer la quantité de protéines présentes en se référant à une gamme étalon de BSA établie avec des quantités connues. La quantité de mitochondries utilisée lors des différentes expériences a été évaluée par cette technique. Dans la présente demande, « mg de mitochondries » fait référence à des mg d'équivalent en protéines mitochondriales. 1.1.6. Obtention de mitoplastes
Les mitoplastes sont des mitochondries chez lesquelles il y a eu rupture de la membrane externe. Pour préparer les mitoplastes, une méthode basée sur le principe de gonflement hypotonique est utilisée. Le changement d'osmolarité entraîne la rupture de la membrane externe, mais pas celle de la membrane interne. Le protocole suivi pour obtenir des mitoplastes de pomme de terre est celui décrit par Delage et al. (Mol CeII Biol, 23, 4000-4012, 2003).
1.1.7. Importation in vitro de protéines radiomarquées dans des mitochondries isolées de pomme de terre • Transcription et traduction in vitro
Le précurseur de la protéine dont on souhaite étudier l'importation dans les mitochondries est synthétisé par une transcription et une traduction couplées dans un lysat de réticulocytes de lapin en présence de méthionine marquée au [35S]. Nous utilisons le système « TNT® Coupled Retyculocytes Lysate System » (Promega). Le milieu réactionnel de 50 μL contient 25 μL de TNT® Rabbit Retyculocytes Lysate (Promega), 2 μL du tampon de transcription TNT® (Promega), 1 μL de T7 ou de Sp6 ARN polymérase TNT® (Promega) suivant l'orientation du gène dans le plasmide, 1 μL d'un mélange d'acides aminés sans méthionine 1 mM, 2 μL de [35S] méthionine 10 μCi/μL (activité spécifique de 1000 Ci/mmol), 1 à 2 μg d'un plasmide contenant le promoteur T7 ou Sp6 ARN polymérase et l'ADNc complet de la protéine d'intérêt. Après 1 heure 30 d'incubation à 3O0C, l'ensemble est congelé à -8O0C.
• Test d'importation in vitro de protéines dans les mitochondries L'importation in vitro de protéines dans les mitochondries est réalisée selon le protocole décrit par Pujol ét al. (Proc Natl Acad Sci, 105, 6481 -6485, 2008). Cinquante μg de mitochondries de pomme de terre sont repris dans un volume final de 50 μL contenant 25 μL de tampon d'importation (Mannitol 300 mM, Hepes-KOH pH 7,5 20 mM, KCI 80 mM, K2HPO4 1 mM, malate 1 mM, DTT 1 mM, NADH 1 mM) en présence de 40 μM d'ADP et 2 mM d'ATP. Les protéines radiomarquées (5 μL) sont ajoutées et la solution est incubée 30 minutes à 25°C sous agitation. Le milieu réactionnel est ensuite déposé sur un coussin de saccharose à 27% (Tris-HCI pH 7,5 20 mM, saccharose 27% p/v, EDTA pH 8,0 1 mM, K2HPO4 100 mM, BSA 1 mg/mL) et les mitochondries sont récupérées après centrifugation 10 minutes à 9000 g. Le surnageant est éliminé et le culot de mitochondries est analysé sur gel de polyacrylamide dénaturant. Le gel est ensuite séché puis exposé contre une plaque phospholmager (Fuji) ou mis en autoradiographie. Dans la pratique, une expérience d'importation nécessite un certain nombre de contrôles. Quatre essais différents sont donc généralement réalisés : -le premier échantillon ne subit aucun traitement particulier ; -le second échantillon subit un traitement à la protéinase K (100 μg/mL pendant 10 minutes à température ambiante inhibée ensuite avec 1 mM de PMSF). Avec ce traitement, seules les protéines incorporées dans les mitochondries sont alors protégées de l'action de la protéinase K ;
-dans le troisième essai, les mitochondries sont pré-traitées à la valinomycine (2 μM) pendant 10 minutes à 4<O avant l'ajout des protéines marquées. Ce traitement a pour effet de dissiper le potentiel de membrane bloquant ainsi le transport du précurseur à travers le canal d'importation des protéines.
-le quatrième échantillon est traité à la valinomycine et à la protéinase K. Dans ces conditions, ni la protéine précurseur ni la protéine mature sont protégées de la dégradation par la protéinase K. Ce contrôle montre que la bande considérée comme la protéine mature n'est pas un produit de dégradation résistant à la protéinase K.
• Analyse de protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant
La séparation des protéines est effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12% en conditions dénaturantes en présence de SDS. Le gel comporte un gel de concentration (5% acrylamide/bisacrylamide 37,5/1 (p/v), Tris-HCI pH 6,8 125 mM, SDS 0,1 % (p/v)) et un gel de séparation (12% acrylamide/bisacrylamide 35,5/1 (p/v), Tris- HCI pH 8,8 380 mM, SDS 0,1 % (p/v)). La polymérisation du gel est obtenue par addition de persulfate d'ammonium 0,1% (p/v) et de TEMED 0,01% (v/v). Un volume de tampon Laemmli (Tris-HCI pH6,8 100 mM, SDS 4% (p/v), β-mercaptoéthanol 4% (v/v), glycérol 15%, bleu de bromophénol 0,05% (p/v)) est ajouté aux échantillons protéiques avant dépôt. La migration se fait dans du tampon SDS-PAGE (Tris 25 mM, glycine 250 mM, SDS 0,1 % (p/v)) sous ampérage constant de 30 mA. Les protéines sont révélées par incubation dans une solution de coloration (Bleu de Coomassie 0,25% (p/v), acide acétique 10% (v/v), méthanol 40% (v/v)) pendant 30 minutes puis par plusieurs passages successifs dans une solution de décoloration (Acide acétique 10% (v/v), éthanol 20% (v/v)). Le gel est ensuite séché 1 heure dans un sécheur de gel, avant d'être exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mis en autoradiographie pour visualiser les protéines radioactives.
• Importation d'acides nucléiques dans des mitochondries
Une expérience d'importation d'un transcrit radiomarqué dans des mitochondries de pomme de terre est réalisée dans un milieu réactionnel de 100 μL contenant 50 μL de tampon import 2x PdT (Mannitol 600 mM, phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, Hepes- KOH pH 7,2 20 mM, KCI 40 mM, DTT 2 mM, malate 2 mM, NADH 2 mM), 40 μM d'ADP,
5 mM d'ATP, 5 mM de MgCI2, 200 μg de mitochondries (équivalent protéines), 50 à 100 fmoles de transcrit marqué au [Oc32P]UTP (50 000 à 100 000 cpm) et 1 μg de pSu9-DHFR. Après incubation 30 minutes à 250C, 100 μl_ d'un mélange RNase (100 μg/mL de RNase A, 750 U/mL de RNase T1 dans du tampon de lavage : saccharose 300 mM, phosphate de potassium pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,1 %(p/v), glycine 5 mM) sont ajoutés afin de dégrader les molécules de transcrits se trouvant à l'extérieur des mitochondries. Après une incubation de 10 minutes à 40C, 1 ml_ de tampon STOP (EGTA 5 mM, EDTA 5 mM dans du tampon de lavage) est ajouté et l'ensemble est centrifugé 5 minutes à 9000 g. Le surnageant est éliminé et le culot de mitochondries subit deux autres étapes identiques de lavage. Les ARN sont ensuite extraits et l'analyse des transcrits radioactifs est réalisée sur un gel de polyacrylamide dénaturant pour de petits ARN (75 nucléotides) ou sur gel d'agarose formaldéhyde pour des ARN de plus grande taille (500 à 1000 nucléotides). Le gel est ensuite séché puis exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) ou mis en autoradiographie.
Dans tous les cas, une expérience contrôle réalisée en absence de pSu9-DHFR est réalisée. Elle permet de vérifier que la présence de pSu9-DHFR a un effet positif sur le transport d'ARN. Pour valider l'internalisation des ARN dans l'espace matriciel, 100 μL de mélange RNase peuvent également être ajoutés après obtention de mitoplastes. Dans ce cas, les ARNs protégés de l'action des RNases ont traversé la membrane interne et sont présents dans la matrice mitochondriale.
Lors des expériences en présence d'ARN non radiomarqués, l'internalisation des ARN a été évaluée par RT-PCR ou par RT-PCR sur ARN circularisé (cRT-PCR).
Lors des expériences en présence d'un ARN marqué par un fluorophore, les mitochondries sont visualisées en microscopie confocale directement après l'étape d'incubation dans le milieu d'importation.
1.1.8. Extraction d'ARN mitochondriaux
Un culot de mitochondries de pomme de terre (200 μg équivalent protéines) repris dans 10 μL de tampon de lavage est ajouté à 100 μL de tampon d'extraction d'ARN (Tris- HCI pH 7,5 10 mM, MgCI2 10 mM, SDS 1% (p/v)) et 100 μL de phénol saturé en eau. Après 15 minutes d'agitation forte au vortex puis centrifugation 10 minutes à 12 000 g, la phase aqueuse est prélevée et mise à précipiter à -2O0C pendant une heure dans 2,5 volumes d'éthanol en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10 μL d'eau. 1.1.9. Fractionnement d'ARN sur gel de polyacrylamide
Le fractionnement de transcrits d'ARNt radioactifs et/ou d'ARNt mitochondriaux est réalisé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15% en conditions dénaturantes. Le gel (8x12x0,03 cm) a la composition suivante : 15% d'acrylamide/bisacrylamide (19/1 ), 7M urée, tampon TBE 1 x (Tris 90 mM, EDTA 2,5 mM, acide borique 90 mM). La polymérisation est obtenue par addition de 0,07% (p/v) de persulfate d'ammonium (APS) et de 0,035% (v/v) de TEMED. Avant dépôt, les transcrits d'ARNt sont additionnés d'un volume de tampon de charge (Formamide 95% (v/v), EDTA 20 mM, bleu de bromophénol 0,05% (p/v), xylène cyanol 0,05% (p/v)). Le tampon d'électrophorèse est le TBE 1 x et la migration s'effectue sous un ampérage maximal de 25 mA. Après migration, les acides nucléiques sont visualisés sous UV après incubation 5 minutes dans un bain de bromure d'éthidium à 0,5 μg/μL. Le gel est ensuite incubé 30 minutes dans une solution 10% (v/v) acide acétique, 20% (v/v) éthanol puis séché 1 heure dans un sécheur de gel, avant d'être exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mis en autoradiographie pour visualiser les transcrits radioactifs.
1.1.10. Fractionnement d'ARN sur gel d'agarose formaldéhyde
Les ARN de haut poids moléculaires (> 500 nucléotides) sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 % (p/v), formaldéhyde 18% (v/v), MOPS 1x (MOPS 2OmM, acétate de sodium 2mM, EDTA 1 mM ) dans un tampon de migration MOPS 1 x. Les ARN sont d'abord dénaturés 10 minutes à 7O0C dans 4 volumes de tampon de charge (MOPS 15 mM, formamide 60% (v/v), formaldéhyde 15% (v/v), glycérol 4% (v/v), xylène de cyanol 0,025% (p/v), bleu de bromophénol 0,025% (p/v)) et 1 μL de BET (10 μg/μL) puis refroidis rapidement 5 minutes sur la glace. Après 5 minutes de pré-migration du gel à 70V, les échantillons sont déposés et l'électrophorèse se déroule pendant 3 heures à 50V. Le gel est lavé 3 fois 10 minutes dans de l'eau et 2 fois 30 minutes dans du tampon SSC 2Ox (NaCI 3M, citrate trisodique 0,3 M, pH 7). Les ARN sont ensuite transférés par capillarité durant la nuit dans du SSC 2Ox sur une membrane de nylon HybondTM-N+ (Amersham). La membrane est rincée dans du SSC 2x, mise sur du papier Whatmann imbibé de SSC 2x et fixée 5 minutes sous UV. La membrane est rincée dans de l'eau, incubée brièvement dans du bleu de méthylène 0,2% (p/v) - acétate de sodium 0,2 M pH 4,8 puis décolorée dans de l'eau. Cette étape permet de visualiser les ARN et les marqueurs de poids moléculaires non marqués radioactivement. La membrane est ensuite mise à exposer contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mise en autoradiographie pour visualiser les transcrits radioactifs. 1.1.11. Réaction de cRT-PCR ("circularised Reverse Transcription coupled with a
Polymérisation Chain Reaction")
Dans un premier temps 1 μg d'ARN mitochondriaux sont circularisés par incubation 3 heures à 370C en présence de 100 unités de T4 RNA ligase (Fermentas) et de 3,4 μM d'ATP dans du tampon de ligation (50 mM Hepes-NaOH pH 8, 10 mM MgCI2, 10 mM DTT). L'enzyme est inactivée 15 minutes à 650C puis les ARN sont précipités dans 2,5 volumes d'éthanol 100% en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10 μL d'eau. Une réaction de transcription inverse (RT) est ensuite réalisée afin de synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc) correspondant à la ligation entre les extrémités 5' et 3' de l'ARN analysé. 400 ng d'ARN sont dénaturés pendant 5 minutes à 650C en présence de 20 pmol d'amorce spécifique de l'ARN recherché. La réaction de transcription inverse a lieu pendant 1 heure à 520C dans 20 μL d'un milieu réactionnel contenant : 100 nmol de chaque dNTP, 100 nmol de DTT, 4 μL de tampon RT 5x (Tris-HCI pH 8,3 250 mM, KCI 375 mM, MgCI2 15 mM), 100 unités de SuperScript III RTTM (Invitrogen) et 40 unités d'inhibiteur de RNases (RNaseOUTTM - Invitrogen). L'enzyme est inactivée pendant 15 minutes à 700C. Un dixième des produits de cette réaction est utilisé comme matrice pour une réaction de PCR. 1.1.12. Observations microscopiques
Les observations microscopiques sont réalisées sur un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM 510. Le fluorochrome MitoTrackerTM Orange CM-H2TMRos (Molecular Probes) est utilisé pour contrôler l'intégrité des mitochondries. Il s'agit du A- chlorométhyltétraméthylrosamine qui est un colorant vital pénétrant spécifiquement dans les mitochondries présentant un potentiel membranaire. Il fluoresce dans le rouge (λm : 574 nm) lorsqu'il est excité à 551 nm. Ce colorant est ajouté aux mitochondries isolées à une concentration finale de 0,5 pM. L'UTP fluorescent Chromatide® Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes) utilisé pour le marquage d'ARN fluoresce dans le vert ( λm : 561 nm) lorsqu'il est excité à 488 nm. Le traitement des images se fait sur le logiciel LSM 510 version 2.8 (Zeiss).
1.1.13. Technique de gel retard
L'interaction ARN-protéine a été étudiée à l'aide de la technique de gel retard. Le protocole utilisé est le protocole n 0 TB1 10 de Promega, intitulé « gel shift assay System ». La réaction est faite dans un volume réactionnel de 9 μL comprenant : 0 à 20 pmole de la protéine, 2 μL de tampon gel retard 5x (glycérol 20% (v/v), MgCI2 5 mM, EDTA 2,5 mM, DTT 2,5 mM, NaCI 250 mM, Tris-HCI pH 7,5 50 mM). Le milieu est incubé 10 minutes à température ambiante. Un μl_ d'ARNt radiomarqué (environ 10 fmoles correspondant à 20
000 cpm) est ensuite ajouté puis l'ensemble est incubé sous une légère agitation à 25<€.
Avant migration, le milieu est additionné d'un μl_ de tampon de charge (Tris-HCI pH 7,5
250 mM, glycérol 40% (v/v)). Le gel est préparé à partir d'une solution d'acrylamide/N,N' méthymène bisacrylamide (19/1 ) de 4% dans du tampon TBE 0,5x (Tris 45 mM, EDTA pH
8,3 1 ,25 mM, acide borique 45 mM). La polymérisation du gel est catalysée par l'addition d'APS 0,04% (p/v) et de TEMED 0,04% (v/v). Avant de charger les échantillons, le gel est mis sous tension de 350 V pendant 10 min. La migration s'effectue ensuite pendant 20 min à 350 V dans le tampon TBE 0,5x. Le gel est séché puis exposé contre une plaque de phosphorimager (Fuji) ou mis en autoradiographie.
1.2. Résultats
1.2.1. Interaction entre la protéine DHFR et l'ARN
La technique de gel retard a été utilisée pour démontrer que la protéine DHFR recombinante purifiée à l'aide du tag histidine est capable de fixer des acides nucléiques. Le substrat acide nucléique choisi dans ce cas correspond à l'ARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4). Cet ARN a été obtenu par transcription radioactive in vitro à partir d'un plasmide recombinant (Carneiro et al., Plant Mol Biol, 26, 1843-1853, 1994). Un retard du transcrit d'ARNtAla en présence de DHFR a été observé (Figure 1 A). Les inventeurs ont donc démontré qu'il existe une interaction entre DHFR et des acides nucléiques.
Il est à noter qu'il a déjà été démontré que la DHFR cytosolique humaine est capable d'interagir spécifiquement avec un court fragment d'ARN de son propre ARNm (Tai et al., Biochem Biophys Res Comm, 2008). Cependant, il n'était pas connu que la DHFR de souris possède un spectre d'interaction beaucoup plus large, et qu'elle peut interagir avec un quelconque acide nucléique.
1.2.2. La protéine pSu9-DHFR est importée dans des mitochondries isolées de pomme de terre
L'importation de la protéine de fusion pSu9-DHFR de 28,6 kDa dans des mitochondries isolées de pomme de terre a été vérifiée. Il a été montré que la protéine pSu9-DHFR est bien importée dans les mitochondries, et que la protéine est protégée de l'action des protéases après importation, et clivée au niveau de la séquence d'adressage pour générer une protéine de taille mature de 22 kDa.
1.2.3. Importation in vitro du transcrit correspondant à l'ARNtAIa dans des mitochondries isolées de pomme de terre II a été montré que l'importation de TARNtAIa dans des mitochondries est fortement augmentée en présence de la protéine de fusion pSu9-DHFR (Figure 1 B). De plus, il a été également démontré que cette méthode permet à l'ARNtAIa d'atteindre l'espace matriciel des mitochondries, comme le démontre le fait que l'ARNtAIa est, après importation et obtention de mitoplastes, protégé contre l'action de ribonucléases. La protéine de fusion pSu9-DHFR peut donc être utilisée pour l'importation d'acides nucléiques dans des mitochondries.
La très forte augmentation de l'internalisation de l'ARNtAIa en présence de la protéine pSu9-DHFR dans des mitochondries végétales isolées a été corroborée par les résultats suivants :
1. Des expériences d'importation en présence de quantités croissantes de pSu9- DHFR ont montré que l'efficacité d'importation du transcrit d'ARNtAla était corrélée à la quantité de pSu9-DHFR présente dans le milieu d'incubation (Figure 2A).
2. Il a été trouvé que la protéine recombinante DHFR seule (c'est à dire sans séquence d'adressage mitochondriale) est incapable d'entraîner l'ARNtAIa à l'intérieur des mitochondries isolées (Figure 2A). 3. Aucun effet n'a été observé sur l'importation du transcrit d'ARNtAla en présence de la protéine de fusion pSu9-GFP (pour « pSu9-« Green Fluorescent Protein »). La protéine pSu9-GFP a été obtenue de façon identique à la protéine pSu9-DHFR à partir d'un clone recombinant comportant la séquence d'adressage mitochondrial pSu9 en fusion avec la séquence codant la GFP (SEQ ID NO : 5), ceci dans le vecteur pQE40. La protéine pSu9-GFP a alors été surexprimée et purifiée comme ci-dessus mentionnée pour la protéine pSu9-DHFR. Bien que la protéine pSu9- GFP soit correctement internalisée in vitro dans les mitochondries isolées de pomme de terre, cette protéine est incapable d'interagir avec l'ARNtAIa contrairement à la protéine pSu9-DHFR. 4. Il a été montré qu'un analogue de substrat du folate, le méthotrexate, qui est capable de se fixer sur la DHFR (Eilers et Schatz, Nature, 322, 228-232, 1986), inhibe l'importation de TARNtAIa dans les mitochondries isolées (Figure 3B).
5. L'importation d'un transcrit d'ARNtAla marqué avec un fluorophore, l'UTP
Chromatide® Alexa Fluor® 488, dans des mitochondries isolées en présence de pSu9-DHFR a été visualisée directement par microscopie confocale. Les résultats obtenus montrent qu'en absence de pSu9-DHFR, pratiquement aucune mitochondrie ne fluoresce alors qu'en présence de la protéine recombinante, la quasi totalité des mitochondries sont fluorescentes, attestant de la présence d'ARNtAla au niveau des organelles. A ce jour, l'importation in vitro de TARNtAIa dans des mitochondries isolées de pommes de terre avait été observée en l'absence de tout facteur cytosolique additionnel, mais ce avec une efficacité très faible (Delage ét al., Mol CeII Biol, 23, 4000-4012, 2003).
En présence de la protéine recombinante pSu9-DHFR, cet ARNt est internalisé de manière beaucoup plus efficace dans ces mêmes mitochondries (de 50 à 100 fois, soit de 10 à 20% de l'ARN mis en présence des mitochondries au temps T=O de l'incubation). 1.2.4. Importation in vitro du transcrit correspondant au précurseur d'ARNtHis mitochondrial de mélèze dans des mitochondries isolées de pomme de terre
L'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre d'un transcrit de 250 nt correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze (SEQ ID NO : 6) a été testée. Dans un premier temps, deux transcrits radiomarqués obtenus par transcription in vitro à partir d'un plasmide recombinant ont été utilisé. Ces transcrits correspondent respectivement aux formes éditée et non éditée de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze. En effet, dans les mitochondries végétales, les transcrits mitochondriaux subissent un processus d'édition : un certain nombre de cytidine sont convertis post- transcriptionnellement en uridine (Gagliardi et Binder, Annual Plant Reviews, 31 , 51 -96, 2007). Il a été montré précédemment par les Inventeurs que l'ARNtHis mitochondrial de mélèze possède trois sites d'édition (Maréchal-Drouard et al., Nucleic Acids Res, 24, 3229-3234, 1996). L'internalisation d'un précurseur d'ARNt dans la mitochondrie doit conduire à sa prise en charge par la machinerie moléculaire mitochondriale et à son clivage en 5' et en 3' par les RNases P et Z respectivement. Les inventeurs ont précédemment montré que seule la forme éditée de l'ARNtHis était maturée in vitro. De plus, in vivo, la forme non éditée et non maturable est rapidement dégradée dans les mitochondries (Placido et al., J Biol Chem, 280, 33573-33579, 2005). Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 3B. Après incubation, un ARN migrant à la taille de l'ARN correspondant à la forme mature de l'ARNtHis est retrouvé dans les mitochondries incubées en présence de pSu9-DHFR, et ce uniquement lorsque la forme éditée du précurseur est utilisée.
Dans un second temps, le transcrit non radiomarqué correspondant à la forme précurseur éditée de l'ARNtHis a été utilisé pour une expérience d'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre et en présence de pSu9-DHFR. Après incubation, les ARN totaux ont été extraits des mitochondries et la maturation de l'ARNtHis a été analysée par la technique de cRT-PCR. Pour se faire, l'amorce complémentaire, appelée P1 (SEQ ID NO : 7) a été utilisée pour l'étape de réverse transcription et l'étape de PCR a été réalisée avec cette même amorce complémentaire et l'amorce directe, appelée P2 (SEQ ID NO : 8). La localisation schématique de ces amorces est présentée sur la Figure 3A. Le produit d'amplification a été clone dans le vecteur pGem-T Easy vector (Promega) et la séquence ADN des clones en résultant a été réalisée à l'aide d'un appareil Applied Biosystems 3100 (Perkin Elmer). Quinze clones différents ont été analysés. La séquence des extrémités 5' et 3' de 15 clones est présentée sur la Figure 3C. Ces séquences montrent que toutes les molécules analysées, sauf une, sont maturées à leur extrémité 5'. Pour cinq d'entre elles, l'extrémité 3' est également maturée : l'extrémité CCA terminale a été ajoutée post-transcritionnellement par la tRNA-nucleotidyl transferase localisée dans la matrice mitochondriale. Ceci démontre que l'ARNtHis a bien été adressé à la mitochondrie, puisque l'ARNtHis a subi un processus de maturation présent uniquement au sein des mitochondries. A ce jour, seuls des ARNt ou l'ARN 5S avaient été importés dans des mitochondries isolées de divers organismes (Salinas et al., Trends Biochem Sci, 33, 320- 329, 2008). Les présents résultats démontrent que des acides nucléiques de plus grande taille peuvent être importés dans des mitochondries grâce à la présente invention. Au vu de ces résultats, la protéine de fusion pSu9-DHFR peut être utilisée pour internaliser dans l'espace matricielle mitochondrial, de façon aspécifique et à souhait, des ARN de grande taille.
1.2.5. Importation in vitro dans des mitochondries isolées de pomme de terre du transcrit correspondant à la forme mitochondriale non éditée de l'ARNm atp9 de pomme de terre L'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre a ensuite été réalisée pour les deux transcrits suivants : un transcrit de 775 nt (trnH-atp9) correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze fusionné à la version non éditée d'atpθ mitochondrial de pomme de terre (SEQ ID NO : 9) et un transcrit de 651 nt (atp9) correspondant à la version non éditée d'atpθ mitochondrial de pomme de terre seule (SEQ ID NO : 10). La construction chimérique permettant l'obtention du transcrit trnH-atp9 a été obtenue par mutagenèse par PCR à partir du plasmide contenant la séquence codant le transcrit précurseur édité de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze et celui contenant la séquence codant la version non éditée du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre. Les oligonucléotides nécessaires à la mutagenèse par PCR sont présentés en tant que SEQ ID Nos. 1 1 , 12, 13 et 14. Les transcrits ARN correspondant à ces deux constructions ont été synthétisées in vitro en présence ou non d'UTP radioactif. Ces transcrits ont alors été utilisés dans des essais d'importation in vitro dans des mitochondries isolées de pomme de terre.
Il a été montré que lorsque la protéine pSu9-DHFR est ajoutée au milieu d'importation, un signal radioactif beaucoup plus intense est visible après incubation, tant lorsque les ARN ont été extraits de mitochondries que de mitoplastes. L'estimation de chacun des signaux radioactifs par rapport à la quantification des ARN colorés au bromure d'éthidium et à l'activité spécifique du transcrit a permis d'estimer à environ 3% la quantité de transcrits importés dans les mitochondries. Aucune différence significative entre l'échantillon « mitochondries » et l'échantillon « mitoplastes » n'a été observée, suggérant que ces ARNs ont atteint l'espace matriciel.
Afin de conforter les données obtenues ci-dessus, des expériences similaires ont été réalisées avec des transcrits non radioactifs. Des expériences de RT-PCR ont ensuite permis d'analyser leur internalisation dans les mitochondries isolées. Les deux amorces utilisées pour l'analyse en RT-PCR ont les séquences SEQ ID Nos. 15 et 16. Celles-ci permettent la discrimination des ARN exogènes des ARN endogènes d'atp9. Des produits d'amplification de la taille attendue ont été obtenus uniquement lors des expériences de RT-PCR menées en présence de réverse transcriptase et à partir des ARN extraits des mitochondries incubés avec chacun des transcrits en présence de pSu9-DHFR. Le clonage de ces fragments dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega) suivi de leur séquençage ont permis de vérifier que les produits de RT-PCR obtenus correspondaient effectivement aux séquences des transcrits exogènes. Enfin, l'analyse de la séquence de ces clones a permis de démontrer que certains des sites « éditables » étaient effectivement édités après internalisation de l'ARN dans les mitochondries isolées. L'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre possède neuf sites d'édition (Dell'Orto et al., Plant Science, 88, 45-53, 1993).
Parmi les séquences analysées, 6,6 % des clones possèdent deux des neuf sites édités :
CTATCGGTATTGGAAACGT[TT]TTAGTTCCTCGATTCATT (séquence des clones après import) ; CTATCGGTATTGGAAACGT|CC]TTAGTTCCTCGATTCATT (séquence non éditée). Les séquences ci-dessus représentent les nucléotides 271 à 309 de la séquence SEQ ID NO : 10. Les boites indiquent les sites d'édition édités, et les nucléotides soulignés indiquent les sites d'édition non édités.
De plus, parmi les séquences analysées, 23,3% des clones possèdent deux autres des neuf sites édités : CAT|T|GTTTGCCC|T|AATGATGGCCTTTTTGATCTCAT (séquence des clones après import) ; CAT§GTTTGCCC|C|AATGATGGCCTTTTTGATCTCAT (séquence non éditée). Les séquences ci-dessus représentent les nucléotides 388 à 423 de la séquence SEQ ID NO : 10. Les boites indiquent les sites d'édition édités, et les nucléotides soulignés indiquent les sites d'édition non édités. Ceci démontre l'ARN exogène introduit peut atteindre les enzymes impliquées dans le processus d'édition au niveau matriciel des mitochondries. Par ailleurs, ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus in vitro démontrant que les sites d'édition ne sont pas tous édités avec la même efficacité (Takenaka et al., Mitochondrion, 8, 35-46, 2008).
L'ensemble des résultats ci-dessus montre que le système de navette protéique pSu9-DHFR :
- permet l'internalisation dans des mitochondries non pas uniquement d'ARNt (75 nt) mais aussi de molécules d'ARN de taille très largement supérieure (775 nt) ;
- permet l'internalisation d'ARN de façon indépendante d'une structure ARNt ;
- permet l'internalisation de ces ARN au niveau de la matrice des mitochondries ; et
- permet l'adressage dans les mitochondries d'ARNm, lesquels sont ensuite reconnus par les machineries mitochondriales intervenant dans l'expression génique.
EXEMPLE 2 : ADRESSAGE IN VITRO DE L'ARNtAla DE PLANTES DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE LEVURE VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9-DHFR
Comme il va être montré dans l'exemple 2, le système navette basé sur l'utilisation de la protéine de fusion pSu9-DHFR en modèle végétal est généralisable à toute mitochondrie issue de n'importe quel organisme. En effet, la présente invention est pour partie basée sur la reconnaissance de la protéine pSu9-DHFR par le complexe d'importation TOM/TIM mitochondrial des protéines. Ce complexe existant dans tous les systèmes mitochondriaux étudiés à ce jour, le système navette selon l'invention est généralisable à tout organisme. 2.1. Matériel et Méthodes
2.1.1. Purification de mitochondries de levure Saccharomyces cerevisae Le protocole utilisé est celui décrit par Daum et al. (J Biol Chem, 257, 13075- 13080, 1982). 2.1.2. Importation d'ARN dans des mitochondries isolées de levure
Concernant les expériences d'importation d'ARN dans des mitochondries de levure, le protocole est le même que celui ci-dessus décrit pour les mitochondries de pomme de terre à la différence du tampon d'importation qui est inspiré du protocole d'importation spécifique de l'ARNtLys (Tarassov et al., J Mol Biol, 245, 315-323, 1995). Le milieu réactionnel de 100 μL contient 50 μL de tampon import 2x levure (Sorbitol 1 ,2 mM, Hepes-KOH 40 mM pH 7,4, DTT 2 mM), 4 U Créatine phosphokinase, 0,5 pmol de phosphocréatine, 2 mM MgCI2, 1 mM d'ATP, 200 μg de mitochondries (équivalent protéines), 50 fmoles de transcrit marqué au [Oc32P]UTP (100 000 cpm) et 1 μg de pSu9- DHFR. Le mélange RNase et le tampon STOP sont réalisés avec du tampon "I xBB.
Dans tous les cas, une expérience contrôle réalisée en absence de pSu9-DHFR est réalisée. Elle permet de vérifier que la présence de pSu9-DHFR a un effet positif sur le transport d'ARN. Pour valider l'internalisation des ARN dans l'espace matriciel, 100 μl_ de mélange RNase peuvent également être ajoutés après obtention de mitoplastes. Dans ce cas, les ARNs protégés de l'action des RNases ont traversé la membrane interne et sont présents dans la matrice mitochondriale. 2.1.3. Obtention de mitoplastes
Pour la levure, les mitochondries sont maintenues 15 minutes dans du tampon K1 K2 (KH2PO4 0,2M, K2HPO4 0,8M, pH 7,5) avant d'ajouter un volume de tampon 2x levure (Sorbitol 1 ,2 M, Hepes-KOH 40 mM pH 7,4). 2.2. Résultats Le transcrit correspondant à l'ARNtAIa cytosolique de plantes (SEQ ID NO : 4) a été testé pour son internalisation dans des mitochondries de levure en présence ou non de la protéine recombinante pSu9-DHFR. Il a été démontré qu'en présence de la protéine pSu9-DHFR, l'ARNtAIa cytosolique de plante, qui n'est pas normalement adressé aux mitochondries de levure, est très efficacement internalisé dans les mitochondries isolées de la levure S. cerevisiae. Cette internalisation se fait au niveau matriciel puisque le transcrit a été retrouvé en proportion équivalente dans les mitoplastes.
EXEMPLE 3 : ADRESSAGE IN VITRO D'UN OLIGONUCLEOTIDE DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE POMME DE TERRE OU DE LEVURE VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9-DHFR
Les exemples ci-dessus démontrent que le système navette selon l'invention permet d'internaliser des ARN allogènes. Il va être démontré ci-dessous que ce système navette peut être utilisé pour internaliser efficacement tout type d'acide nucléique, notamment de l'ADN. En premier lieu, l'interaction entre un fragment d'ADN simple brin correspondant à un oligonucléotide de 75 nt de long et la protéine recombinante pSu9- DHFR a été validée. En second, l'internalisation de cet oligonucléotide dans des mitochondries isolées de pomme de terre ou de levure a été testée.
3.1. Matériel et Méthodes
3.1.1. Technique de Southwestern Cette technique permet l'identification de protéines interagissant avec un oligonucléotide radiomarqué. Les protéines fixées sur la membrane Immobilon-P (Millipore) sont renaturées la nuit à 4<O dans du tampon de renaturation (Tris-HCI pH 7,5
10OmM, NP 40 0,1% (v/v)). Le NP-40, détergent ionique, permet une meilleure élimination du SDS. Après 4 lavages, de 15 min de la membrane dans le même tampon à 40C sous agitation douce, la membrane est saturée 5 min à température ambiante dans du tampon de blocage (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM, BSA 5% (p/v), Triton X-100 0,01 % (v/v). Le filtre est alors mis en présence 106 cpm de l'oligonucléotide radiomarqué (en présence de polynucléotide kinase et de [γ-32P]ATP) dans 5 mL de tampon d'hybridation (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM, Triton X-100 0,01 % (v/v) et incubé une nuit à 4<€. Après 4 lavages de 5 min à 4<O avec le tampon de lavage (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM), la membrane est séchée puis mise en autoradiographie et/ou exposée contre une plaque de phosphorimager pour visualiser l'interaction.
3.1.2. Importation d'oligonucléotide radiomarqué dans des mitochondries isolées Le marquage en 5' d'oligonucléotide en présence de [732P]ATP et de polynucléotide kinase se fait classiquement selon les recommandations du fournisseur (Fermentas). Les expériences d'importation d'oligonucléotide radiomarqué dans des mitochondries isolées ont été menées selon les mêmes protocoles que pour l'importation d'ARN dans des mitochondries de pomme de terre ou de levure (voir pages ci-dessus) à une exception près : l'internalisation d'ADN dans l'organelle a été validée par l'ajout de 100 μL de mélange DNase (25 μg de DNase I, MgCI2 10 mM dans du tampon de lavage pour les mitochondries de pomme de terre et dans du tampon 1xBB pour les mitochondries de levure) après obtention de mitochondries ou de mitoplastes. 3.2. Résultats 3.2.1. Interaction entre la protéine DHFR et l'ADN La technique de Southwestern a été utilisée pour démontrer que la protéine
DHFR recombinante purifiée à l'aide du tag histidine est capable de fixer non pas uniquement de l'ARN mais également de l'ADN. Le substrat ADN choisi dans ce cas correspond à un oligonucléotide (ADN simple brin) correspondant à la séquence de TARNtAIa cytosolique d'A. thaliana (SEQ ID NO : 4). Cet oligonucléotide synthétisé chimiquement (Sigma Aldrich) et marqué en 5' a été incubé avec une membrane sur laquelle les protéines recombinantes DHFR et GFP ont été transférées. Aucune interaction entre la GFP et l'olligonucléotide n'a été observée, alors qu'un signal reflétant une interaction entre la DHFR et l'oligonucléotide a été obtenu. 3.2.2. Internalisation in vitro d'oligonucléotides dans des mitochondries isolées de pomme de terre ou de levure
L'interaction entre DHFR et oligonucléotide étant possible, ce dernier a été utilisé dans des expériences d'importation in vitro. Les résultats obtenus pour les essais réalisés avec des mitochondries isolées de pomme de terre et de levure sont illustrés sur les Figures 4A et 4B respectivement. Si l'oligonucléotide est incubé avec les mitochondries en absence de pSu9-DHFR, aucun signal n'est visible après autoradiographie. En revanche, l'ajout de la protéine pSu9-DHFR dans le milieu d'importation facilite le passage de l'oligonucléotide à travers la double membrane mitochondriale, et un signal est révélé tant à partir des fractions d'acides nucléiques extraites tant des mitochondries que des mitoplastes repurifiés. Dans ce système, la fraction d'oligonucléotide ayant atteint l'espace matriciel a été estimée à environ 1%. Ceci démontre que ce nouvel outil de navette protéique est pleinement utilisable pour transporter de l'ADN dans des mitochondries isolées.
EXEMPLE 4 : ADRESSAGE SPECIFIQUE D'UN ARN EN FUSION AVEC LA SEQUENCE TIGE BOUCLE DU PHAGE MS2 DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES VIA LA NAVETTE PROTEIQUE CONSTITUEE PAR LA PROTEINE DE COQUE DU PHAGE MS2 FUSIONNEE A LA SEQUENCE D'ADRESSAGE MITOCHONDRIALE PSU9
Le système navette selon l'invention peut être étendu à des systèmes génétiques stables pour l'introduction spécifique et contrôlable d'un acide nucléique donné dans les mitochondries. Le développement d'un système d'adressage à souhait d'un ARN spécifique est basé sur l'utilisation d'une protéine capable de reconnaître et de s'associer à une séquence ARN spécifique. Dans le présent exemple, cette protéine correspond à la protéine de coque du phage MS2 (également appelée CP), laquelle est connue pour reconnaître et s'associer à une séquence-spécifique d'ARN adoptant une structure secondaire en tige-boucle particulière (Beach et al., Curr Biol, 9, 569-578, 1999 ; Querido et al., Methods in CeII Biol, 85, 273-292, 2008). Alors que le système de navette pSu9- DHFR permet l'importation de n'importe quel ARN, le système de navette pSu9-CP permet l'importation ciblée et spécifique d'un ARN uniquement associé à l'ARN en tige boucle du phage MS2.
4.1. Construction de la protéine pSu9-CP
Plusieurs constructions ont été réalisées par mutagenèse par PCR. La séquence codant la forme précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze a été fusionnée du côté 3' à la séquence codant la partie en tige-boucle de l'ARN MS2 (SEQ ID NO : 17). Cette séquence en tige boucle est présente 2 fois. Les amorces utilisées pour générer cette construction par mutagenèse par PCR correspondent aux séquences SEQ ID Nos. 20, 21 , 22 et 23.
La séquence correspondant à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 a été fusionnée à la protéine CP (SEQ ID NO : 18). Cette construction a été clonée dans le vecteur d'expression bactérien pQE40 et permet l'obtention de la protéine pSu9-CP. Les amorces utilisées pour générer cette construction par mutagenèse par PCR correspondent aux séquences SEQ ID Nos. 24, 25, 26 et 27.
4.2. Obtention des deux partenaires et validation de l'interaction Les ARN substrats ont été obtenus par transcription in vitro. La protéine pSu9-CP a été purifiée à l'aide du tag histidine présent à l'extrémité C-terminale de la protéine de fusion, selon un modèle analogue à celui développé pour la protéine recombinante pSu9- DHFR.
L'interaction entre les deux partenaires peut être validée par les approches de gel retard ou de northwestern. L'ARN précurseur de l'ARNtHis non fusionnée à la partie ARN en tige boucle de MS2 a été généré et peut être utilisé comme contrôle négatif.
4.3. Importation in vitro dans des mitochondries isolées
Le résultat obtenu pour l'expérience réalisée avec des mitochondries isolées de pomme de terre est illustré sur la Figure 5A. Lorsque l'ARNtHis fusionné à la séquence codant la partie en tige-boucle de l'ARN MS2 a été incubé avec les mitochondries en absence de pSu9-MS2, aucun signal n'a été visible après autoradiographie. En revanche, l'ajout de la protéine pSu9-MS2 dans le milieu d'importation a facilité le passage de l'ARN chimère (ARNtHis-tige-boucle ARN MS2) à travers la double membrane mitochondriale et un signal a été révélé à partir de la fraction d'acides nucléiques extraite des mitochondries post-traitées avec des ribonucléases et repurifiées après importation, comme précédemment décrit dans l'Exemple I (paragraphe 1.1.7). Comme attendu, lorsque la protéine MS2 n'a pas été fusionnée à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 (MS2 seule), l'incorporation de l'ARN chimère dans les mitochondries n'a pas été facilitée. Ceci montre que l'outil de navette protéique pSu9-MS2 est utilisable pour transporter un ARN fusionné à la région en tige boucle qui lui est spécifique dans des mitochondries isolées. EXEMPLE 5 : ADRESSAGE SPECIFIQUE D'UN ARN EN FUSION AVEC LA
SEQUENCE TIGE-BOUCLE DU PHAGE MS2 VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9- MS2 DANS DES MITOCHONDRIES DE CELLULES DE LEVURE DOUBLEMENT TRANSFORMEES Comme indiqué en introduction de l'Exemple 4, le système navette selon l'invention peut être étendu à des systèmes génétiques stables pour l'introduction spécifique et contrôlable d'un acide nucléique dans les mitochondries. Le système navette pSu9-MS2 présenté dans l'Exemple 4 et illustré par l'importation in vitro d'un ARN dans des mitochondries isolées a été étendu dans le présent exemple à un système génétique stable et inductible chez la levure Saccharomyces cerevisiae. 5.1 Matériel et méthodes 5.1.1 Transformation des cellules de levure
La construction pSu9-MS2 (SEQ ID NO : 18) a été clonée dans le vecteur pESC TRP au niveau de la cassette de clonage MCS2. La seconde construction correspondant à la séquence anti-sens du promoteur mitochondrial du gène COX1 codant pour la sous-unité 1 de la cytochrome oxydase mitochondriale de levure (Christianson and Rabinowitz, J. Biol. Chem., 1983, 258 :14025-14033) et fusionné à la séquence codant la partie en tige- boucle de l'ARN MS2 (SEQ ID NO : 35, ATAATGTTATATAAGTAATAATATAATAAAATATCCTAAGGTACCTAATTGCCTAGAAA ACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGTCGACTCTAGAAAACATGAGGATCACCCATG TCTGCAGTATTCCCGGG), a été clonée au niveau de la cassette de clonage MCS1 du vecteur pESC TRP. Cette séquence en tige-boucle est présente deux fois. Cette seconde construction est appelée anticox-2SL. Les amorces utilisées pour générer cette construction par PCR correspondent aux séquences SEQ ID NO : 36 (ATAATGTTATATAAGTAATAATATAATAAAATATCCTAAGGTACC) et SEQ ID NO : 37 (CCCGGGAATACTGCAGACATGGG). Les deux constructions sont sous le contrôle d'un promoteur inductible au galactose. De plus, la construction pSu9-MS2 est clone en fusion avec une séquence du vecteur codant pour un tag Myc permettant par la suite la visualisation de la protéine exprimée en présence de galactose à l'aide d'anticorps disponible commercialement et dirigé contre ce tag Myc. Des cellules de levure compétentes sont alors transformées à l'aide de ce vecteur doublement recombinant. De façon similaire, un vecteur pESC TRP recombinant comportant la même construction en MCS1 mais contenant uniquement le gène codant pour la protéine MS2 (sans séquence d'adressage pSu9) en MCS2 est réalisé. Il servira de contrôle négatif. L'ensemble des protocoles, de la transformation à l'induction de l'expression des deux molécules partenaires (la protéine navette pSu9-MS2 et l'ARN anticox-2SL) est décrit dans le manuel « pESCYeastEpitopeTaggingVectors » fourni avec le vecteur par la société
Stratagène.
5.1.2 Purification des mitochondries et analyse de l'expression et de l'importation dans les mitochondries de levures transgéniques de pSu9-MS2 et de anticox-2SL L'expression de la protéine navette pSu9-MS2 a été analysée par expérience de western blot à l'aide d'un anticorps (Santa Cruz Biotechnology) dirigé contre le tag Myc exprimé en fusion avec la protéine. Pour ce faire, des extraits protéiques totaux obtenus par centrifugation de 20 μl_ de cellules de levure sont fractionnés sur gel de polyacrylamide 12% et transférés sur membrane Immobilon P (Millipore). L'expression de l'ARN anticox-2SL a été analysée par RT-PCR à partir d'amorces spécifiques (séquences SEQ ID NO : 36 et 37). Pour ce faire, des extraits d'ARN totaux sont obtenus par la méthode au trizol (Tri Reagent, MolecularResearch Center) selon les recommandations du fournisseur. Les mitochondries de levure sont hautement purifiées par passage sur un gradient de saccharose selon le protocole détaillé dans (Gregg et al. JoVE., consultable sur le site internet jove.com/index/details.stp?ID=1417). La qualité de la purification des mitochondries est vérifiée : i) au niveau protéique par des expériences de western blot avec des anticorps dirigés contre une protéine mitochondriale (la protéine TOM20) et contre une protéine cytosolique (la protéine KAR2), ii) au niveau ARN par des expériences de northern blot à l'aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'ARNtLys mitochondrial trK3 (SEQ ID NO : 38, GTGAGAATAGCTGGTGTTG) et de l'ARNtLys(UUU) cytosolique trK2 (SEQ ID NO : 39, GGCTCCTCATAGGGGGCTCG). Les séquences des ARNt trK2 et trK3 sont disponibles dans (Kolesnikova et al., Human Mol Genêt, 13, 2519-2534). Pour ce faire les ARN sont extraits selon le protocole décrit en 1.1.8 soit à partir de fraction totale de levure soit à partir de fraction mitochondriale. Les ARN fractionnés sur gel d'acrylamide (1 .1.9) sont transférés sur membrane d'Hybond N (Amersham). L'électrotransfert est effectué dans du tampon TAE 0,25 X (Tris-Acétate 10 mM pH 8,0, EDTA 0,25 mM) pendant 15 minutes sous une intensité de 150 mA, puis 30 minutes sous une intensité de 500 mM. La membrane est brièvement séchée et les ARNt sont fixés par irradiation en lumière UV (366 nm) pendant 3 à 5 minutes. Les oligonucléotides sont marqués radioactivement à leur extrémité (3.1 .1 ). La sonde radiomarquée est ajoutée à la solution d'hybridation (SSC 6x, SDS 0,5%) dans un rouleau d'hybridation contenant la membrane disposée le long de la paroi. L'hybridation s'effectue dans une étuve à une température de 450C pendant la nuit. La membrane est ensuite lavée deux fois 10 minutes dans du tampon SSC 2x puis une fois 30 minutes dans du tampon SSC 2x, SDS 0,1% à la température d'hybridation. La membrane est brièvement séchée et exposée contre une plaque de Phosphorimager (Fuji) ou mise en autoradiographie. La composition du SSC 2x est : Citrate-trisodique 30 mM pH 7,0 ; NaCI
0,3M. L'internalisation dans les mitochondries de la protéine navette pSu9-MS2 est vérifiée par expérience de western blot comme décrit ci-dessus. L'internalisation dans les mitochondries de l'ARN anticox-2SL est vérifiée par RT-PCR selon l'approche décrite ci- dessus.
5.2 Résultats
La figure 5B montre qu'après induction au galactose, les cellules de levure transformées avec la double construction pSu9-MS2 et anticox-2SL exprimaient à la fois la protéine navette sous sa forme précurseur (noté p sur la Figure 5B) et l'ARN dont l'amplification a été possible par RT-PCR à l'aide d'amorces spécifiques. Par contre, ni la protéine pSu9-MS2, ni l'ARN anticox-2SL n'étaient présents lorsque les levures avaient été transformées avec le vecteur pESC TRP seul. Enfin, lorsque le vecteur comportait uniquement la construction codant pour la protéine MS2, la forme précurseur n'était pas présente dans l'extrait total de protéines. Il est à noter qu'en l'absence de galactose, aucune induction, ni de la protéine ni de l'ARN n'a été obtenue. L'expression spécifique et inductible des constructions a donc été validée. Les cellules de levure transformées avec ces trois types de constructions ont été utilisées pour préparer des mitochondries selon le protocole décrit ci-dessus. Ces mitochondries étaient exemptes de contamination cytosolique comme l'ont attesté les expériences de western et de northern montrées sur la Figure 5C. La protéine KAR2 était présente dans les 3 extraits totaux des levures transformées avec le vecteur seul (-), avec le vecteur comportant MS2 et anticox-2SL et avec le vecteur comportant pSu9-MS2 et anticox-2SL. Cette protéine n'a pas été retrouvée dans les extraits protéiques mitochondriaux (validés par l'utilisation d'un anticorps anti-TOM20) des trois types de levure. De même, l'ARNtLyS(UUU) cytosolique trK2 était présent dans les extraits d'acides nucléiques totaux mais était absent des fractions d'acides nucléiques mitochondriales (validées par la détection de l'ARNtLys mitochondrial trK3). L'ensemble de ces expériences a validé la pureté des fractions mitochondriales. Enfin comme le montre la Figure 5D, l'utilisation de l'anticorps anti-Myc a montré la présence de la protéine pSu9-MS2 sous sa forme mature uniquement dans les mitochondries des cellules de levure doublement transformées avec la construction pSu9- MS2 et la construction anticox-2SL. De même la présence de l'ARN anticox-MS2 n'a été révélée par l'analyse par RT-PCR à l'aide d'amorces spécifiques que dans les mitochondries de ces mêmes cellules de levure transformées. Le produit d'amplification obtenu par RT-PCR a été clone et séquence afin de vérifier qu'il correspondait à la séquence de l'ARN anticox-2SL. Cet ARN ne se retrouvait pas au niveau des mitochondries de cellules de levure transformées avec le vecteur comportant la construction MS2, démontrant l'importance de la fusion pSu9-MS2 pour l'établissement du système navette stable qui fait l'objet de la présente invention.
En conclusion, cette expérience démontre que la protéine pSu9-MS2 (pSu9-CP) permet l'importation d'un ARN d'intérêt (en l'occurrence l'ARN anticox-2SL) fusionné à la partie tige-boucle de MS2 dans la mitochondrie d'une cellule.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation in vitro d'une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale pSu9 et une protéine choisie parmi la protéine DHFR et la protéine de coque du phage MS2, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie.
2. Utilisation selon la revendication 1 , où ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine DHFR.
3. Utilisation selon la revendication 1 , où ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine de coque du phage MS2.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où :
- ladite séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 2 ; - ladite protéine DHFR est codée par une séquence nucléotidique au moins
80% identique à la séquence SEQ ID NO : 1 ; et
- ladite protéine de coque du phage MS2 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, où ledit acide nucléique d'intérêt est un ARN messager complet ou un ARN de transfert complet.
6. Kit pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie comprenant : a) une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale pSu9 et une protéine choisie parmi la protéine DHFR et la protéine de coque du phage MS2, ou un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; b) au moins un réactif pour l'importation de l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie ; et, optionnellement, c) des instructions pour importer l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie.
7. Protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine de coque du phage MS2.
8. Protéine de fusion selon la revendication 7, où ladite séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 2, et où ladite protéine de coque du phage MS2 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18.
9. Acide nucléique codant la protéine de fusion selon la revendication 7 ou 8.
10. Vecteur recombinant contenant un acide nucléique tel que défini à la revendication 9.
1 1 . Combinaison d'acides nucléiques comprenant : a) un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale pSu9 et la protéine de coque du phage
MS2; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à au moins une copie de la région en tige-boucle de l'ARN MS2, ou un acide nucléique dont la transcription produit cet acide nucléique.
12. Combinaison selon la revendication 1 1 , où les acides nucléiques (a) et (b) sont compris par un vecteur recombinant.
13. Composition pharmaceutique comprenant une protéine de fusion telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 4, et/ou une combinaison selon la revendication 1 1 ou 12.
14. Procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée, comprenant les étapes de : a) mettre en contact une protéine de fusion telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 avec l'acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée ; et b) laisser en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée.
15. Procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule, comprenant les étapes de : a) obtenir ou préparer une combinaison d'acides nucléiques selon la revendication 1 1 ou 12 ; et b) introduire ladite combinaison d'acides nucléiques dans une cellule.
16. Procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) obtenir ou préparer une combinaison d'acides nucléiques selon la revendication 1 1 ou 12 ; b) introduire ladite combinaison dans une cellule de plante ; c) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (b) ; et d) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome lesdits acides nucléiques.
17. Plante recombinante susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 16.
18. Semence ou fruit d'une plante recombinante homozygote selon la revendication 17.
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