CN114096674A

CN114096674A - 环状多核糖核苷酸的给药方法

Info

Publication number: CN114096674A
Application number: CN202080044871.7A
Authority: CN
Inventors: 阿瓦克·卡维吉安; 亚历山德拉·索菲·德波尔; 尼古拉斯·麦卡特尼·普拉吉斯; 埃里卡·加布里埃尔·韦恩斯坦; 凯瑟琳·西富恩特斯-罗贾斯
Original assignee: Flagship Venture & Innovation No6 Co ltd
Current assignee: Flagship Venture & Innovation No6 Co ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-02-25
Also published as: US20230061936A1; KR20220024647A; US20220296729A1; CA3140594A1; AU2020296190A1; JP2022536951A; MA56538A; EP3987038A1; IL288983A; WO2020257727A1

Abstract

本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的药物组合物及其制剂的给药方法。

Description

环状多核糖核苷酸的给药方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年6月19日提交的美国临时申请号62/863,725的优先权和权益，其全部内容通过援引并入本文。

背景

某些环状多核糖核苷酸普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。

概述

本披露总体上涉及环状多核糖核苷酸的给药方法。如本文所披露的方法总体上涉及一种在细胞或受试者中表达蛋白质的方法，其包括向细胞或受试者提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的组合物；一种在细胞或受试者中结合蛋白质的方法，其包括向细胞或受试者提供包含结合位点的环状多核糖核苷酸的组合物，或两者。一种给药方法包括向细胞或受试者提供多次给药。例如，多次给药是再给药或交错给药。一种再给药环状多核糖核苷酸的组合物的方法包括通常在延长的时间段内向细胞或受试者(例如哺乳动物)提供两种或更多种组合物。一种交错给药环状多核糖核苷酸的组合物的方法包括通常在短时间间隔内提供两种或更多种组合物。

在一个方面，本发明的特征在于一种维持哺乳动物中蛋白质表达的方法，其包括：(a)向哺乳动物提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；和(b)在步骤(a)后6小时至90天，向哺乳动物提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。

在这些方面的一些实施例中，环状多核糖核苷酸是外源、合成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列、复制元件、或两者。

在这些方面的一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是相同的。在一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是不同的。

在这些方面的一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而恢复哺乳动物中所述蛋白质的表达。在一些实施例中，提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前。在一些实施例中，提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且在哺乳动物中由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前。在一些实施例中，所述方法进一步包括提供编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

在这些方面的一些实施例中，第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第一组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载体。在一些实施例中，第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第二组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载体。在一些实施例中，第三组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第三组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载体。

在这些方面的一些实施例中，由第一组合物表达的所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平。在一些实施例中，由第一组合物表达的所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第二水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第三水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。

在这些方面的一些实施例中，在提供第二组合物后所述蛋白质的平均水平是来自第一组合物的蛋白质的第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是来自第一组合物的蛋白质的第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第一组合物后6小时至90天，在提供第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第一组合物后6小时至270天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第一组合物后6小时至35天，在提供第一组合物和第二组合物后基本上检测不到所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第二组合物后哺乳动物中蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后哺乳动物中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供第三组合物后哺乳动物中产生的蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，蛋白质是治疗性蛋白质，例如，促红细胞生成素。在一些实施例中，蛋白质(例如，促红细胞生成素)的表达在哺乳动物中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。在本文所述方面的一些实施例中，治疗性蛋白质是酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、激素、细胞因子、抗体、用于免疫疗法的蛋白质(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、或CRISPR系统或其组分。在一些实施例中，蛋白质是抗原(例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原)。在一些实施例中，蛋白质是用于疫苗接种的蛋白质。

在第二方面，本发明的特征在于一种维持细胞或受试者中蛋白质表达的方法，其包括向细胞或受试者提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；从而维持所述蛋白质在细胞或受试者中的表达；。

在第三方面，本发明的特征在于一种维持细胞或受试者中蛋白质表达的方法，其包括在步骤(a)后6小时至90天，向细胞或受试者提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物；从而维持所述蛋白质在细胞或受试者中的表达；。

在第四方面，本发明的特征在于一种在细胞或受试者中表达蛋白质的方法，其包括向细胞或受试者提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者表达第一水平的经编码蛋白质；并且(i)第二水平至少与第一水平一样多，或者(ii)第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞或受试者中经编码蛋白质的表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。

在第五方面，本发明的特征在于一种在细胞或受试者中表达蛋白质的方法，其包括：向细胞或受试者提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者表达第二水平的经编码蛋白质，并且(i)第二水平至少与第一水平一样多，或者(ii)第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞或受试者中经编码蛋白质的表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。

在第六方面，本发明的特征在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的蛋白质水平相比，在向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：向细胞或受试者提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且(i)至少在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后的所述蛋白质水平，或(ii)在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞或受试者中所述蛋白质水平的表达。

在第七方面，本发明的特征在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的蛋白质水平相比，在向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：在第一组合物后，向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含(i)至少在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后的所述蛋白质水平，或(ii)在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞或受试者中所述蛋白质水平的表达。

在这些方面的一些实施例中，向受试者的第一细胞提供第一组合物，并且向受试者的第二细胞提供第二组合物，并且其中第一细胞和第二细胞是相同的细胞或不同的细胞。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低25％-75％之前。

在这些方面的一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将细胞或受试者中的蛋白质表达至少维持在蛋白质的第一水平。在一些实施例中，提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且(i)在细胞或受试者中基本上检测不到由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前，或(ii)在细胞或受试者中由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前。在一些实施例中，所述方法进一步包括提供环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

在这些方面的一些实施例中，在细胞或受试者中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向细胞或受试者提供第二组合物。在这些方面的一些实施例中，在第一组合物后至少14天并且在第一组合物后不超过90天，向细胞或受试者提供第二组合物。

在一些实施例中，所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平。在一些实施例中，所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第二水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第三水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供第二组合物后所述蛋白质的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供第二组合物后细胞或受试者中蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供第三组合物后细胞或受试者中产生的蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的所述蛋白质水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的所述蛋白质水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的所述蛋白质水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，蛋白质是治疗性蛋白质，例如，促红细胞生成素，和/或其中蛋白质(例如，促红细胞生成素)的表达在细胞或受试者中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。在一些实施例中，蛋白质是抗原(例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原)。在一些实施例中，蛋白质是用于疫苗接种的蛋白质。

在第八方面，本发明的特征在于一种在细胞或受试者中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向细胞或受试者提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且(i)环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多，或者(ii)在提供第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。

在此方面的一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中：(i)第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是相同的；或者(ii)第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是不同的。在此方面的一些实施例中，第一环状多核糖核苷酸包含第一结合位点和/或编码第一蛋白质，并且第二环状多核糖核苷酸包含第二结合位点和/或编码第二蛋白质，其中第一结合位点和第二结合位点是相同或不同的结合位点，并且/或者第一蛋白质和第二蛋白质编码相同的蛋白质或不同的蛋白质。

在第九方面，本发明的特征在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供第一组合物后包含环状多核糖核苷酸的水平；并且向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含(i)至少在提供第二组合物后的环状多核糖核苷酸水平，或(ii)在提供第二组合物后变化不超过环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中基本上检测不到通过提供第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之前。

在一些实施例中，提供环状多核糖核苷酸的第二组合物发生在第一组合物之后，并且在细胞或受试者中基本上检测不到由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之后。在一些实施例中，在基本上检测不到由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向细胞或受试者提供第二组合物。在一些实施例中，在第一组合物后至少14天并且在第一组合物后不超过90天，向细胞或受试者提供第二组合物。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而在提供第三组合物后将环状多核糖核苷酸的水平至少维持在第一水平，并且任选地，其中提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且(i)在细胞或受试者中基本上检测不到所述细胞或受试者中由第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之前，或(ii)在细胞或受试者中由第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平降低超过50％之前；或(iii)在细胞或受试者中由所述细胞或受试者中的第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平降低25％-75％之前。

在一些实施例中，所述方法进一步包括向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后表达的环状多核糖核苷酸的后续水平是在提供第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供第二组合物后环状多核糖核苷酸的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到环状多核糖核苷酸的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后环状多核糖核苷酸的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到环状多核糖核苷酸的那天测量的。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。在一些实施例中，在提供第二组合物后细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。在一些实施例中，由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的水平是在提供第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，由第二组合物产生的环状多核糖核苷酸的水平是在提供第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后环状多核糖核苷酸的水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，环状多核糖核苷酸的第三水平是在提供第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天后，维持环状多核糖核苷酸的第一水平。在一些实施例中，在提供第三组合物后细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，蛋白质(例如，促红细胞生成素)在受试者中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。在一些实施例中，蛋白质是抗原(例如，病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原)。

在第十方面，本发明的特征在于一种在细胞或受试者中结合靶的方法，其包括：向所述细胞或受试者提供包含含有靶的结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述靶以第一水平与结合位点结合；并且向所述细胞或受试者提供包含含有靶的结合位点的环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述靶以第二水平与结合位点结合，并且(i)第二水平至少与第一水平一样多，或者(ii)第二水平变化不超过第一水平的20％；

从而将细胞或受试者中靶的结合至少维持在结合的第一水平。

在第十一方面，本发明的特征在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中与靶的结合水平相比，在向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中结合靶的方法，其包括：(a)向细胞或受试者提供包含结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含与靶的结合水平；并且(b)在第一组合物后，向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含(i)至少在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后与靶的结合水平，或(ii)在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平与靶的结合；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中与靶的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞或受试者中与靶的结合水平。

在一些实施例中，其中提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中基本上检测不到由第一组合物产生的结合的第一水平之前。在一些实施例中，其中提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，其中提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者中由第一组合物产生的结合的第一水平降低25％-75％之前。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将细胞或受试者中的靶结合至少维持在结合的第一水平。在一些实施例中，提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且在细胞或受试者中基本上检测不到由第一和第二组合物在所述细胞或受试者中对靶的结合的第二水平之前。

在一些实施例中，提供第三组合物发生在提供第二组合物之后，并且在细胞或受试者中由第一和第二组合物产生的结合的第二水平降低超过50％之前。

在一些实施例中，所述方法进一步包括提供环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

在一些实施例中，提供环状多核糖核苷酸的第二组合物发生在第一组合物之后，并且在基本上检测不到由第一组合物产生的结合水平之后。在一些实施例中，在基本上检测不到由第一组合物产生的结合水平后至少6小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向细胞或受试者提供第二组合物。在一些实施例中，在第一组合物后14天并且在第一组合物后不超过90天，向细胞或受试者提供第二组合物。

在一些实施例中，结合的第一水平是在提供第一组合物后一天结合的最高水平。在一些实施例中，结合的第一水平是在提供第一组合物后一天结合的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或45天，结合的第二水平是在提供第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，结合的第三水平是在提供第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后结合的后续水平是在提供第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一些实施例中，在提供第二组合物后结合的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中结合的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后结合的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中结合的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述结合的第一水平在一些实施例中，在提供第二组合物后细胞或受试者中结合的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者中结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天结合的第二水平比在提供第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中结合的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的结合水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的结合水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述结合的第一水平在一些实施例中，在提供第三组合物后细胞或受试者中结合的第三水平比在提供第一组合物后结合的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天结合的第三水平比在提供第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，第一组合物的环状多核糖核苷酸和第二组合物的环状多核糖核苷酸是相同的。在一些实施例中，第一组合物的环状多核糖核苷酸和第二组合物的环状多核糖核苷酸是不同的。

在一些实施例中，第一组合物和第二组合物包含大约相同量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，第一组合物比第二组合物包含更高量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，第一组合物比第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物包含更高量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量变化不超过第一组合物的环状多核糖核苷酸量的1％、5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量少不超过1％、5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第三组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，细胞是动物细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞)。在一些实施例中，细胞是受试者中的多个细胞。在一些实施例中，第一组合物和/或第二组合物包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，相对于第一组合物和/或第二组合物中的总核糖核苷酸分子，第一组合物和/或第二组合物包含至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，第一组合物和/或第二组合物中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。

在一些实施例中，受试者是动物(例如，哺乳动物)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，蛋白质是抗原(例如，肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原)。

在第十二方面，本发明的特征总体上在于一种在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多；从而将细胞中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。

在第十三方面，本发明的特征总体上在于一种在哺乳动物中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向哺乳动物提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中在提供第一组合物后，所述哺乳动物包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多；从而将哺乳动物中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。

在第十四方面，本发明的特征总体上在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含环状多核糖核苷酸的水平；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供第二组合物后至少包含环状多核糖核苷酸的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。

在第十五方面，本发明的特征总体上在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后哺乳动物中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述哺乳动物中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：向所述哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中在提供第一组合物后，所述哺乳动物包含环状多核糖核苷酸的水平；并且向所述哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中在提供第二组合物后，所述哺乳动物包含至少所述环状多核糖核苷酸的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述哺乳动物中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述哺乳动物中的环状多核糖核苷酸水平。

在第十六方面，本发明的特征总体上在于一种在细胞中结合靶的方法，其包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平至少与结合的第一水平一样多；从而将细胞中的结合至少维持在第一水平。

在第十七方面，本发明的特征总体上在于一种在哺乳动物中结合靶的方法，其包括：向哺乳动物提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中在提供第一组合物后，所述哺乳动物包含第一水平的结合；并且向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平至少与结合的第一水平一样多；从而将哺乳动物中的结合至少维持在第一水平。

在第十八方面，本发明的特征总体上在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的结合水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中结合靶的方法，其包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含结合的水平；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供第二组合物后至少包含结合的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的结合水平。

在第十九方面，本发明的特征总体上在于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后哺乳动物中的结合水平相比，在向所述哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述哺乳动物中结合靶的方法，其包括：向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物在提供第一组合物后包含结合的水平；并且向哺乳动物提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物在提供第二组合物后至少包含结合的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述哺乳动物中的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述哺乳动物中的结合水平。

定义

本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其常见意义来理解。

如本文所用，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3’和/或5’端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸。

如本文所用，术语“适配体序列”是特异性结合至靶分子的非天然存在、或合成的寡核苷酸。典型地，适配体是从20至500个核苷酸。典型地，适配体通过二级结构而非序列同源性结合至其靶。

如本文所用，术语“加密原”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，所述核酸序列或结构有助于降低、逃避和/或避免免疫细胞的检测和/或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。

如本文所用，术语“表达序列”是编码产物(例如，肽或多肽)的核酸序列、或调控核酸。编码肽或多肽的示例性表达序列包含多个核苷酸三联体，其中每一个都编码氨基酸，并且被称为“密码子”。

如本文所用，术语“外源的”，当相对于生物分子(诸如环状RNA)使用时，意指通过人工将生物分子引入宿主基因组、细胞或生物中。例如，使用重组DNA技术和/或用于将生物分子内化到细胞中的方法添加至现有基因组、细胞、组织或受试者中的环状RNA对于现有核酸序列、细胞、组织或受试者以及保留生物分子的核酸序列、细胞、组织或受试者的任何子代来说是外源的。

如本文所用，术语“免疫蛋白结合位点”是与免疫蛋白结合的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点有助于掩蔽为外源性的环状多核糖核苷酸，例如，免疫蛋白结合位点被蛋白质(例如，竞争性抑制剂)结合，从而阻止环状多核糖核苷酸被免疫蛋白识别和结合，从而降低或避免针对环状多核糖核苷酸的免疫应答。

如本文所用，术语“免疫蛋白”是与免疫应答(例如像针对免疫原，例如环状多核糖核苷酸)相关的任何蛋白质或肽。免疫蛋白的非限制性实例包括T细胞受体(TCR)、抗体(免疫球蛋白)、主要组织相容性复合体(MHC)蛋白、补体蛋白、和RNA结合蛋白。

如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有对未修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如天然未修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C))的一个或多个化学修饰的任何核糖核苷酸类似物或衍生物。在一些实施例中，经修饰的核糖核苷酸的化学修饰是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。

如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。

如本文所用，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。

如本文所用，术语“调控元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。

如本文所用，术语“重复核苷酸序列”是一段DNA或RNA内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG(UG)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。

如本文所用，术语“复制元件”是可用于复制或者起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。

如本文所用，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。

如本文所用，术语“基本上对……有抗性”意指相较于参考物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性。

如本文所用，术语“化学计量翻译”意指从环状多核糖核苷酸翻译的表达产物的基本当量的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状多核糖核苷酸，环状多核糖核苷酸的化学计量翻译可以表示两个表达序列的表达产物可具有基本相等的量，例如两个表达序列之间的量差(例如摩尔差)可以为约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。

如本文所用，术语“翻译起始序列”是起始环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的核酸序列。

如本文所用，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。

如本文所用，术语“翻译效率”意指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)中。

如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其起始材料的测量。

如本文所用，术语“免疫原性”是针对物质诱导免疫应答的潜力。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可以诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是对于物质缺少或不存在高于可检测阈值的免疫应答。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施例中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导超过预定阈值的免疫应答。例如，当使用免疫原性测定来测量针对环状多核糖核苷酸的先天性免疫应答(诸如测量炎性标记物)时，如本文提供的非免疫原性多核糖核苷酸可以导致水平低于预定阈值的先天性免疫应答的产生。预定阈值可以是例如由针对对照参考物的先天性免疫应答产生的一种或多种标记物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

如本文所用，术语“基本上检测不到”可以指环状多核糖核苷酸或由环状多核糖核苷酸表达的蛋白质的水平低于通过相关检测技术(例如，色谱法(柱、纸、凝胶、HPLC、UHPLC、IC、SEC等)、电泳(UREA PAGE、基于芯片、聚丙烯酰胺凝胶、RNA、毛细管、c-IEF等)、基于荧光的检测技术等)可检测的水平。

如本文所用，术语“线性对应物”是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比序列相似性)并且具有相同或相似的核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有不同的核酸修饰或不具有核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的任何部分，所述任何部分短于线性对应物多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’UTR。

如本文所用，术语“缀合部分”指包含在缀合方法中使用的官能团的经修饰的核苷酸。

如本文所用，术语“载体”意指通过经由部分或完全包封剂或其组合共价修饰环状多核糖核苷酸来促进将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送至细胞中的化合物、组合物、试剂、或分子。载体的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白)或阳离子载体(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。

如本文所用，术语“裸递送”意指用于在不借助载体并且不对部分进行有助于递送至细胞的共价修饰的情况下递送至细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载体的配制品。

术语“稀释剂”意指包含本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解于其中的非活性溶剂的媒介物。稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液、等渗剂、或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、和1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、或糖粉。

如本文所用，术语“应答”或“应答水平”是暴露于刺激导致的任何可测量变化或任何水平的可测量变化。例如，可测量变化是表型(例如，细胞表型、物理表型、分子表型)的转变或变化，或者表明刺激正在起作用的任何特征，并且包括例如，在暴露于刺激后，细胞形态的变化、细胞类型产生的增加或减少、肌肉质量的增加或减少。作为另一个实例，刺激是蛋白质(例如，由环状多核糖核苷酸表达的促红细胞生成素)或包含结合位点的环状多核糖核苷酸，并且应答或应答水平是在暴露于受试者中的蛋白质或包含结合位点的环状多核糖核苷酸后表型的可测量转变(例如，受试者中网织红细胞的产生或水平增加)。

通过援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指示将每篇单独的公开、专利或专利申请通过援引并入本文。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施例的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。

图1显示，在注射至小鼠中之后，在注射后3天、4天和7天在小鼠肝脏中检测到的环状RNA水平高于线性RNA。

图2A和图2B显示，在将表达高斯萤光素酶的环状RNA或线性RNA注射至小鼠中之后，在给药环状RNA后1天、2天、7天、11天、16天和23天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性，而仅在给药经修饰的线性RNA后1天和2天在血浆中检测到其活性。

图3显示，在注射RNA之后，在施用RNA后16天在肝脏和脾脏中检测到环状RNA而非线性RNA。

图4显示，在注射RNA之后，如通过RIG-I、MDA-5、IFN-B和OAS评估的，线性RNA而非环状RNA显示出免疫原性。

图5示出了实验数据，证明与线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，用环状多核糖核苷酸(“无末端的”)再给药后小鼠中的高斯萤光素酶表达的持久性增加。

图6示出了实验数据，证明与交错给药线性多核糖核苷酸对应物(“线性3剂”)，或单剂的环状多核糖核苷酸(“无末端的”)，或单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性”)相比，交错给药环状多核糖核苷酸(“无末端的3剂”)后小鼠中的高斯萤光素酶表达的持久性增加。

图7示出了实验数据，证明与单剂的线性多核糖核苷酸对应物(“线性RNA”)相比，单剂环状多核糖核苷酸(“无止境RNA(Endless RNA)”)后；与单剂(“线性RNA”)相比，交错给药线性多核糖核苷酸对应物(“3剂线性RNA”)后；或与单剂(“无止境RNA”)相比，交错给药环状多核糖核苷酸(“3剂无止境RNA”)后，小鼠中的高斯萤光素酶表达的持久性增加。

图8示出了在具有载体(TransIT)和没有载体(未配制的)的情况下静脉内施用的环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。

图9示出了在没有载体的情况下肌肉内施用的环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。

图10示出了静脉内施用的环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平，并且可以再给药至少5次。

图11示出了环状多核糖核苷酸在更长时间段中在体内表达蛋白质，同时在多次连续注射后血浆中的蛋白质活性水平增加。

图12示出了在第一剂未配制的RNA给药后3、5、7、14、21和28天，在全血中检测到网织红细胞的数量增加，之后在我们的小鼠群体中网织红细胞计数恢复到3％-5％的正常范围。

图13示出了在第一剂TransIT配制的RNA给药后3、5、7、14、21和28天，在全血中检测到网织红细胞的数量增加，之后在我们的小鼠群体中网织红细胞计数恢复到3％-5％的正常范围。

图14示出了与仅媒介物对照相比，当未配制时，对于环状RNA给药和mRNA给药检测到网织红细胞计数增加。

图15示出了与仅媒介物对照相比，当用TransIT配制时，对于环状RNA给药和mRNA给药检测到网织红细胞计数增加。

图16示出了环状RNA的示例性体外产生过程示意图，所述环状RNA含有起始密码子、编码GFP的ORF(开放阅读框)、交错元件(2A)、加密原、和IRES(内部核糖体进入位点)。

图17示出了环状RNA的示例性体内产生过程的示意图。

图18示出了示例性环状RNA的设计，所述环状RNA包含起始密码子、编码GFP的ORF、交错元件(2A)、和加密原。

图19A和图19B是展示了两种不同环状RNA的体内化学计量蛋白质表达的示意图。

图20是示出了对来自用环状RNA或线性RNA转染的293T细胞的免疫相关基因的qRT-PCR分析的图。

图21是展示了在小鼠模型中示例性环状RNA的体内蛋白质表达的示意图。

图22是展示了在小鼠模型中示例性环状RNA的体内生物分布的示意图。

图23是展示了在小鼠模型中具有加密原(内含子)的示例性环状RNA的体内蛋白质表达的示意图。

图24是展示了在示例性纯化过程之后的示例性环状RNA的变性PAGE凝胶图像。

图25是展示了通过示例性环状RNA(缺少IRES、帽、5’和3’UTR)的Flag蛋白(约15kDa)表达的蛋白质印迹图像。

具体实施方式

本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的给药方法。如本文所披露的给药方法总体上涉及在提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在细胞中表达一定水平的蛋白质或产生一定水平的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸编码所述蛋白质。如本文所披露的给药方法总体上还涉及在提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在细胞中结合靶，其中所述环状多核糖核苷酸编码所述蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是外源、合成环状多核糖核苷酸。

在一些方面，本发明涉及一种在细胞中表达蛋白质的方法，其包括：向细胞提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞表达第一水平的所述蛋白质；并且向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平至少与第一水平一样多；从而将细胞中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。在一些方面，在细胞中表达蛋白质的方法包括：向细胞提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞表达第一水平的所述蛋白质；并且向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。在一些方面，在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多；从而将细胞中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些方面，在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些方面，在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在细胞中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。

在一些方面，本发明涉及于一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含所述蛋白质的水平；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含所述蛋白质的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。在一些方面，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含所述蛋白质的水平；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。在一些方面，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含环状多核糖核苷酸的水平；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供第二组合物后至少包含环状多核糖核苷酸的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。在一些方面，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供第二组合物后变化不超过在提供第一组合物后环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。在一些实施例中，提供环状多核糖核苷酸的第二组合物发生在第一组合物之后，并且在细胞中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质水平之后。本文所述方法中使用的环状多核糖核苷酸可以包含一个或多个表达序列。在一些实施例中，这些表达序列中的至少一个编码蛋白质。所述蛋白质可以是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。所述蛋白质可以是治疗性蛋白质。在一些实施例中，治疗性蛋白质可以具有活性，例如具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性。

本文所述的方法可以是用于治疗受试者的治疗或兽医方法。本文所述的方法可以用于治疗所述多个细胞中的疾病。在一些实施例中，本文所述的方法用于治疗由无功能、功能差或表达差的蛋白质或基因产物引起的疾病。在一些实施例中，本文所述的方法用于治疗遗传疾病(例如，突变、替代、缺失、扩增或重组)、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、肺病、肾病、肝病、遗传疾病、血管疾病、眼科疾病、肌肉骨骼疾病、淋巴疾病、听觉和内耳疾病、代谢疾病、炎症疾病、自身免疫性疾病或传染病。

给药方法

本文披露了一种在向细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两个剂量或组合物后，在细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸或表达一定水平蛋白质的给药方法。本文披露了一种在向受试者提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的至少两个剂量或组合物后，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生一定水平环状多核糖核苷酸或表达一定水平蛋白质的给药方法。所述组合物可以包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸。所述组合物可以包含含有结合位点的环状多核糖核苷酸。给药方法可以是通常在延长的时间段内，以两个或更多个剂量再给药环状多核糖核苷酸的组合物。给药方法可以是在短时间间隔内交错给药组合物。在一些实施例中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。来自环状多核糖核苷酸的蛋白质可以在细胞中表达。

在一些实施例中，所述方法包括向细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)至少第一组合物和第二组合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括提供(例如，施用)第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物。在一些实施例中，在细胞的寿命期间提供了另外的组合物。在一些实施例中，当细胞或受试者从所述组合物获得益处时，提供(例如，施用)了另外的组合物。在一些实施例中，以交错给药方案提供(例如，施用)了多种组合物，其中在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到来自所述多种组合物中的先前组合物的蛋白质或环状多核糖核苷酸的水平之前，提供(例如，施用)了在先前组合物后提供(例如，施用)的任何组合物。例如，为了以交错方案提供第一组合物和第二组合物，在提供(例如，施用)了第一组合物之后并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到来自所述多种组合物中的第一组合物的蛋白质或环状多核糖核苷酸的水平之前，提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，以再给药方案提供了多种组合物，其中在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到来自所述多种组合物中的先前组合物的蛋白质或环状多核糖核苷酸的水平之后，提供(例如，施用)了在先前组合物后提供(例如，施用)的任何组合物。例如，为了以再给药方案提供第一组合物和第二组合物，在提供(例如，施用)了第一组合物之后并且在细胞或受试者中基本上检测不到来自所述细胞或受试者中第一组合物的蛋白质或环状多核糖核苷酸的水平之后，提供(例如，施用)了第二组合物。

在一些实施例中，交错方案或再给药方案中的第一组合物包含第一量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，交错方案或再给药方案中的第二组合物包含第二量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，交错方案或再给药方案中的第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物包含第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第二量与环状多核糖核苷酸的第一量相同。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第三量与环状多核糖核苷酸的第一量相同。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多量与环状多核糖核苷酸的第一量相同。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第二量小于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第三量小于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多量小于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第二量大于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第三量大于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多量大于环状多核糖核苷酸的第一量。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量变化不超过第一组合物的环状多核糖核苷酸量的1％、5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量少不超过1％、5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量高0.1倍至1000倍。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量高0.1倍、1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，后续组合物(例如，在第一组合物后施用的组合物)的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量高0.1倍、1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量低0.1倍至1000倍。在一些实施例中，第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量低0.1倍、1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，后续组合物(例如，在第一组合物后施用的组合物)的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量低0.1倍、1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，后续组合物(例如，在一定量环状多核糖核苷酸的第一组合物之后)的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量高或低0.1倍至1000倍。在一些实施例中，后续组合物(例如，在一定量环状多核糖核苷酸的第一组合物之后)的环状多核糖核苷酸的量比第一组合物的环状多核糖核苷酸的量高或低0.1倍、1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。例如，第一组合物包含1倍的环状多核糖核苷酸，第二组合物与第一组合物相比包含5倍的环状多核糖核苷酸，并且第三组合物与第一组合物相比包含0.2倍的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，与第一组合物的环状多核糖核苷酸的量相比，第二组合物包含至少5倍的环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，第一组合物比第二组合物包含更高量的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，第一组合物比第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物包含更高量的环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

在一些实施例中，第一组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载体。在一些实施例中，第二组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂且不含任何载体。在一些实施例中，第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂并且不含任何载体。

在一些实施例中，如本文所述的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)被递送至受试者(例如，哺乳动物)。例如，如本文所述递送组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)的方法包括向有需要的受试者胃肠外施用如本文所述的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)。作为另一个实例，向受试者递送组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)的方法包括向受试者肠胃外施用所述组合物。在一些实施例中，如本文所述的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)包含载体。在一些实施例中，如本文所述的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)包含稀释剂并且不含任何载体。在一些实施例中，肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科、或局部方式。

在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是口服施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是经鼻施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是通过吸入施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是局部施用的。在一些实施例中，所述组合物是以眼科方式施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是直肠施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是通过注射施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是通过输注施用的。施用可以是全身性施用或局部施用。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是肠胃外施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是通过静脉内、动脉内、腹腔内、皮内、颅内、鞘内、淋巴管内、皮下或肌肉内施用的。在一些实施例中，所述组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)是经由眼内施用、耳蜗内(内耳)施用、或气管内施用来施用的。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是用载体进行的。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是在不借助于载体的情况下进行的。

如本文所述的环状多核糖核苷酸的组合物可以在受试者中诱导应答。在一些实施例中，在受试者中诱导应答的方法包括提供(例如，施用)包含含有结合位点和/或编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的组合物，用于在受试者中诱导应答水平。在特定实施例中，诱导应答的方法包括向受试者提供(例如，施用)编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸，其中受试者中来自环状多核糖核苷酸的促红细胞生成素的表达诱导受试者中网织红细胞的产生。在一些实施例中，在受试者中诱导应答水平的方法包括(a)向受试者提供(例如，施用)包含如本文所述诱导应答的环状多核糖核苷酸的第一组合物，并且在步骤(a)后14天至90天，向受试者提供(例如，施用)包含如本文所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而在提供第一组合物和第二组合物后在受试者中诱导应答水平。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的组合物编码用于在施用后在受试者中诱导应答或应答水平的治疗性蛋白质。在一些实施例中，向受试者提供编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸的组合物，用于诱导受试者中网织红细胞的产生。在一些实施例中，在受试者中诱导网织红细胞的方法包括(a)向受试者提供(例如，施用)包含编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸的第一组合物；以及(b)在步骤(a)后6小时至90天，向受试者提供(例如，施用)包含编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而诱导受试者中网织红细胞的产生。在一些实施例中，所述方法包括在步骤(a)后6小时至30天提供(例如，施用)第二组合物。在一些实施例中，所述方法包括在步骤(a)后14天至90天提供(例如，施用)第二组合物。在一些实施例中，来自提供包含结合位点或编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的应答水平大于来自线性对应物多核糖核苷酸的应答水平。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者中的应答水平相比，在向所述受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者中诱导应答水平的方法包括：向受试者提供(例如，施用)编码诱导应答水平的蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含应答水平；并且在第一组合物后向受试者提供(例如，施用)编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含应答水平；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者中的应答水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者中的应答水平。例如，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者中的网织红细胞产生水平相比，在向所述受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者中诱导一定水平的网织红细胞产生的方法包括：向受试者提供(例如，施用)编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的网织红细胞产生；并且在第一组合物后向受试者提供(例如，施用)编码促红细胞生成素的环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含网织红细胞产生水平；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者中的网织红细胞产生水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者中的网织红细胞产生水平。

在一些实施例中，用于给药方法(例如，交错给药或再给药)的如本文所述环状多核糖核苷酸的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，相对于环状多核糖核苷酸的组合物(例如，如本文所述的药物组合物)中的总核糖核苷酸分子，如本文所述环状多核糖核苷酸的组合物(例如，第一组合物、第二组合物、第三组合物等)包含至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，如本文所述组合物中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。

交错给药

本文披露了一种在向多个细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在所述多个细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸、表达一定水平蛋白质、或产生针对靶的一定水平结合的交错给药方法。本文披露了一种在向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生一定水平环状多核糖核苷酸、表达一定水平蛋白质、或产生针对靶的一定水平结合的交错给药方法。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的所述至少两种组合物是相同的组合物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的所述至少两种组合物是不同的组合物。在一些实施例中，相同的组合物包含编码相同蛋白质或包含相同结合位点的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，不同的组合物包含编码不同蛋白质或包含不同结合位点、或其组合的环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，维持哺乳动物(例如，人)中蛋白质表达的方法包括：(a)向哺乳动物(例如，人)提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；和(b)在步骤(a)后6小时至90天，向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。

在一些实施例中，维持哺乳动物(例如，人)中抗原表达的方法包括：(a)向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述抗原的环状多核糖核苷酸的第一组合物；和(b)在步骤(a)后6小时至90天，向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述抗原的环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是外源、合成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列、复制元件、或两者。

在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或90天、或其间的任何时间。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至45天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至30天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至30天加上由环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的半衰期。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的14天至30天加上由环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的半衰期。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的14天至65天加上由环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的半衰期。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的21天至41天加上由环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的半衰期。

在一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是相同的。在一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是不同的。在一些实施例中，第一组合物包含编码第一蛋白质的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含编码第二蛋白质的第二环状多核糖核苷酸，其中第一蛋白质和第二蛋白质是相同的蛋白质。在一些实施例中，第一组合物包含编码第一蛋白质的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含编码第二蛋白质的第二环状多核糖核苷酸，其中第一蛋白质和第二蛋白质是不同的蛋白质。在一些实施例中，第一组合物包含含有第一结合位点的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含含有第二结合位点的第二环状多核糖核苷酸，其中第一结合位点和第二结合位点是相同的结合位点。在一些实施例中，第一组合物包含含有第一结合位点的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含含有第二结合位点的第二环状多核糖核苷酸，其中第一结合位点和第二结合位点是不同的结合位点。在一些实施例中，第一组合物包含编码蛋白质的第一环状多核糖核苷酸和包含结合位点的第二环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供第一组合物之后，并且在哺乳动物(例如，人)中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向哺乳动物提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。在一些实施例中，提供(例如，施用)第三组合物发生在提供(例如，施用)了第二组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第三组合物发生在提供(例如，施用)了第二组合物之后，并且在哺乳动物中由第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低25％至75％之前。

在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多；从而将受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。

在一些实施例中，在提供了第一组合物后6小时至90天，在提供第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供了第一组合物后6小时至270天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供了第一组合物后6小时至35天，在提供了第一组合物和第二组合物后基本上检测不到所述蛋白质的第一水平。

此外，第二组合物可以在提供第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到来自受试者(例如，哺乳动物)中第一组合物的环状多核糖核苷酸的水平之前提供。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，在哺乳动物(例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向哺乳动物提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且环状多核糖核苷酸的第二水平至少与第一水平一样多；从而将哺乳动物中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些实施例中，在哺乳动物(例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物在提供了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向哺乳动物提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将哺乳动物中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。在一些实施例中，在哺乳动物(例如，人)中产生环状多核糖核苷酸的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；并且向哺乳动物提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，环状多核糖核苷酸的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将哺乳动物中的环状多核糖核苷酸至少维持在第一水平。

此外，第二组合物可以在提供了第一组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到来自哺乳动物中第一组合物的环状多核糖核苷酸的水平之前提供。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在施用了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第一水平的经编码蛋白质；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第二水平的经编码蛋白质，并且第二水平至少与第一水平一样多；从而将所述受试者(例如，哺乳动物)中经编码蛋白质的表达至少维持在经编码蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第一水平的经编码蛋白质；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第二水平的经编码蛋白质，并且第二水平至少与第一水平一样多；从而将所述受试者(例如，哺乳动物)中经编码蛋白质的表达维持在与经编码蛋白质的第一水平相比的类似水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第一水平的所述蛋白质；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。在一些方面，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第一水平的所述蛋白质；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。此外，第二组合物可以在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第二组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第二组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低25％至75％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，在哺乳动物(例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物表达第一水平的所述蛋白质；并且向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平至少与第一水平一样多；从而将哺乳动物中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。在一些方面，在哺乳动物(例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物表达第一水平的所述蛋白质；并且向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将哺乳动物中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。在一些方面，在哺乳动物(例如，人)中表达蛋白质的方法包括：向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述哺乳动物表达第一水平的所述蛋白质；并且向哺乳动物提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述哺乳动物表达第二水平的所述蛋白质，并且第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将哺乳动物中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。此外，第二组合物可以在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第二组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第二组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低25％至75％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中由第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，在细胞中结合靶的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且结合的第二水平至少与第一水平一样多；从而将细胞中与靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在细胞中与靶结合的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞中靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在细胞中与靶结合的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将细胞中与靶的结合至少维持在第一水平。

此外，第二组合物可以在提供了第一组合物之后，并且在细胞中基本上检测不到来自细胞中第一组合物的结合水平之前提供。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。在一些实施例中，在细胞中结合靶的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且结合的第二水平至少与第一水平一样多；从而将细胞中与靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在细胞中与靶结合的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将细胞中靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在细胞中与靶结合的方法包括：向细胞提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的结合，并且在提供第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将细胞中与靶的结合至少维持在第一水平。

此外，第二组合物可以在提供了第一组合物之后，并且在细胞中基本上检测不到来自细胞中第一组合物的结合水平之前提供。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供第二组合物发生在提供了第一组合物之后，并且在细胞中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中结合靶的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且结合的第二水平至少与第一水平一样多；从而将受试者(例如，哺乳动物)中与靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中与靶的结合至少维持在第一水平。

此外，第二组合物可以在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由受试者(例如，哺乳动物)中第一组合物产生的结合水平之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中结合靶的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且结合的第二水平至少与第一水平一样多；从而将受试者(例如，哺乳动物)中与靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的20％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中靶的结合至少维持在第一水平。在一些实施例中，在受试者(例如，哺乳动物)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含第一水平的结合；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含第二水平的结合，并且在提供(例如，施用)了第二组合物后，结合的第二水平变化不超过第一水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％；从而将受试者(例如，哺乳动物)中与靶的结合至少维持在第一水平。

此外，第二组合物可以在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由受试者(例如，哺乳动物)中第一组合物产生的结合水平之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低25％至75％之前。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的结合的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前。

在一些实施例中，交错给药方案或方法中的第一组合物和第二组合物之后可以是环状多核糖核苷酸的一种或多种另外的组合物。在一些实施例中，所述一种或多种另外的组合物包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。

在一些实施例中，在第二组合物后向细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而在提供了第三组合物后将环状多核糖核苷酸、蛋白质或结合的水平至少维持在第一水平。在一些实施例中，第三组合物在第二组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸、蛋白质或结合的水平之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第三组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸、表达的蛋白质、或产生的结合的第一水平降低超过50％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第三组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸、表达的蛋白质、或产生的结合的第一水平降低25％至75％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，第三组合物在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸、表达的蛋白质、或产生的结合的第一水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前提供(例如，施用)。对于交错给药，所述一种或多种另外的组合物可以在提供先前组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由所述一种或多种先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、结合或蛋白质的水平之前提供。在一些实施例中，所述一种或多种另外的组合物在提供(例如，施用)了先前组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由一种或多种先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、结合或蛋白质的水平降低超过50％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，所述一种或多种另外的组合物在提供(例如，施用)了先前组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由一种或多种先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、结合或蛋白质的水平降低25％至75％之前提供(例如，施用)。在一些实施例中，所述一种或多种另外的组合物在提供(例如，施用)了先前组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中由一种或多种先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、结合或蛋白质的水平降低超过1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％之前提供(例如，施用)。

在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之前，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之前，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之前，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了一个或多个另外的剂量的第三组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之前，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了一种或多种另外的组合物的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。

在一些实施例中，在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供前一种组合物后的一段时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了组合物。例如，可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第一组合物后的第一时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第二组合物；可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第二组合物后的第二时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第三组合物；可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第三组合物后的第三时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第四组合物；或者可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第四、第五、第六、第七、第八、第九或更多组合物后的第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个或更多时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第五、第六、第七、第八、第九或更多组合物。第一时间间隔可以短于细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物之前的所述蛋白质水平所需的时间量。

在一些实施例中，第二时间间隔比第一时间间隔更长。在一些实施例中，第三时间间隔比第一时间间隔更长。在一些实施例中，第四时间间隔比第一时间间隔更长。在一些实施例中，第五、第六、第七、第八、第九或更多时间间隔比第一时间间隔更长。在一些实施例中，第二时间间隔与第一时间间隔相同。在一些实施例中，第三时间间隔与第一时间间隔相同。在一些实施例中，第四时间间隔与第一时间间隔相同。在一些实施例中，第五、第六、第七、第八、第九或更多时间间隔与第一时间间隔相同。在一些实施例中，第二时间间隔比第一时间间隔更短。在一些实施例中，第三时间间隔比第一时间间隔更短。在一些实施例中，第四时间间隔比第一时间间隔更短。在一些实施例中，第五、第六、第七、第八、第九或更多时间间隔比第一时间间隔更短。在一些实施例中，第二时间间隔比第一时间间隔更长。在一些实施例中，第三时间间隔比第二时间间隔更长。在一些实施例中，第四时间间隔比第三时间间隔更长。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供第一组合物后1-2天环状多核糖核苷酸的最高水平。在提供第一组合物后1-2天环状多核糖核苷酸的最高水平，例如，在提供第一组合物后24小时至48小时(例如，1-2天)环状多核糖核苷酸的峰值量。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供第一组合物后1-2天环状多核糖核苷酸的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，环状多核糖核苷酸的第二水平是在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，环状多核糖核苷酸的第三水平是在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的环状多核糖核苷酸的后续水平是在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的环状多核糖核苷酸的后续水平比在提供第一组合物后1-2天所述环状多核糖核苷酸的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。

在一些实施例中，在提供第二组合物后环状多核糖核苷酸的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到环状多核糖核苷酸的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后环状多核糖核苷酸的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到环状多核糖核苷酸的那天测量的。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。在一些实施例中，在提供第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供第三组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述结合的第一水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持结合的第一水平。在一些实施例中，在提供第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中结合的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供第三组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中结合的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中结合的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平。在提供第一组合物后1-2天蛋白质的最高水平，例如，在提供第一组合物后24小时至48小时(例如，1-2天)由环状多核糖核苷酸表达的蛋白质的峰值量。在一些实施例中，所述蛋白质的第一水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第二水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，在提供第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第三水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，在提供第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施例中，对于在第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平比在提供第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平高至少1倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。

在一些实施例中，在提供第二组合物后所述蛋白质的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。在一些实施例中，在第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

在一些实施例中，在提供了第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供了第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。

在一些实施例中，在提供了第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供了第三组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些实施例中，在提供了环状多核糖核苷酸的第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第三水平比在提供第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物的所述蛋白质水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物的所述蛋白质水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物的所述蛋白质水平。所维持的所述蛋白质水平是在提供了第一组合物后第1天细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第三组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物、第十组合物或更多组合物至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天后，维持第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的蛋白质水平比在提供第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的蛋白质水平高1％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％。在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平比在提供第一组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平高1％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％。

再给药

本文披露了一种在向细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸、一定水平结合、或表达蛋白质的再给药方法。本文披露了一种在向细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生一定水平环状多核糖核苷酸、一定水平结合、或表达蛋白质的再给药方法。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的所述至少两种组合物是相同的组合物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的所述至少两种组合物是不同的组合物。在一些实施例中，相同的组合物包含编码相同蛋白质或包含相同结合位点的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，不同的组合物包含编码不同蛋白质或包含不同结合位点的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，第一组合物包含编码第一蛋白质的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含编码第二蛋白质的第二环状多核糖核苷酸，其中第一蛋白质和第二蛋白质是相同的蛋白质。在一些实施例中，第一组合物包含编码第一蛋白质的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含编码第二蛋白质的第二环状多核糖核苷酸，其中第一蛋白质和第二蛋白质是不同的蛋白质。在一些实施例中，第一组合物包含含有第一结合位点的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含含有第二结合位点的第二环状多核糖核苷酸，其中第一结合位点和第二结合位点是相同的结合位点。在一些实施例中，第一组合物包含含有第一结合位点的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含含有第二结合位点的第二环状多核糖核苷酸，其中第一结合位点和第二结合位点是不同的结合位点。在一些实施例中，第一组合物包含编码蛋白质的第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含含有结合位点的第二环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，维持哺乳动物(例如，人)中蛋白质表达的方法包括：(a)向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；和(b)在步骤(a)后6小时至90天，向哺乳动物提供(例如，施用)包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，从而维持哺乳动物中所述蛋白质的表达。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物发生在提供(例如，施用)了第一组合物之后，并且在哺乳动物中基本上检测不到由第一组合物表达的所述蛋白质的第一水平之后。在一些实施例中，所述方法进一步包括在第二组合物后向哺乳动物提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而恢复哺乳动物中的所述蛋白质。

在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或90天、其间的任何时间。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或90个月、或其间的任何时间。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20年、或其间的任何时间。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至45天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至30天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的6小时至65天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的30天至45天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的14天至30天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的14天至45天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的30天至65天。在一些实施例中，提供(例如，施用)第二组合物是在步骤(a)后的30天至90天。

在一些实施例中，在提供(例如，施用)了第一组合物后6小时至90天，在提供(例如，施用)第一组合物和第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供(例如，施用)了第一组合物后6小时至270天，在提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。在一些实施例中，在提供(例如，施用)了第一组合物后6小时至35天，在提供(例如，施用)第一组合物和第二组合物后基本上检测不到所述蛋白质的第一水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含所述蛋白质的水平；从而与在提供了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。在一些实施例中，与在提供了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的蛋白质水平相比，在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的蛋白质水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含所述蛋白质的水平；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中所述蛋白质水平的表达。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的蛋白质水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中所述蛋白质水平的表达。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含所述蛋白质的水平；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的蛋白质水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中表达一定水平所述蛋白质的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中所述蛋白质水平的表达。

此外，第二组合物可以在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平之后提供。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平后1分钟至20年、或其间的任何时间，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了第二组合物。在一些实施例中，在第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，并且在第一组合物后少于20年、15年或10年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了第二组合物。在一些实施例中，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了第二组合物1分钟至20年、或其间的任何时间。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供第一组合物后包含环状多核糖核苷酸的水平；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供第二组合物后至少包含环状多核糖核苷酸的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供第二组合物后包含变化不超过环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第二组合物后至少包含环状多核糖核苷酸的水平；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的线性对应物水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第二组合物后包含变化不超过环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的线性对应物水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供了第二组合物后包含变化不超过环状多核糖核苷酸水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第一组合物后包含一定水平的环状多核糖核苷酸；并且向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了第二组合物后包含变化不超过环状多核糖核苷酸水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％c或50％的一定水平所述蛋白质；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的线性对应物水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平。

在一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是相同的。在一些实施例中，第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中第一环状多核糖核苷酸和第二环状多核糖核苷酸是不同的。

此外，第二组合物可以在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中基本上检测不到细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中来自第一组合物的环状多核糖核苷酸水平之前提供。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平后1分钟至20年、或其间的任何时间，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，在第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，并且在第一组合物后少于20年、15年或10年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供了第二组合物。在一些实施例中，向细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物1分钟至20年、或其间的任何时间。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的结合水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中结合靶的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含结合的水平；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含结合的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的结合水平的表达。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的所述蛋白质水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中与靶结合的方法包括：向细胞提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含所述蛋白质的水平；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平结合；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的结合水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中结合靶的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的结合；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含结合的水平；从而与在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平相比，在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中结合水平的表达。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平结合；从而与在提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的结合水平相比，在向所述细胞提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平结合的方法包括：向细胞提供包含结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的结合；并且在第一组合物后向细胞提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含在提供了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的1％、5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的一定水平结合；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞中的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述细胞中的结合水平的表达。

在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物，例如，人)中结合靶的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的结合；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少包含结合的水平；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中结合水平的表达。在一些实施例中，与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在向所述受试者(例如，哺乳动物)提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者(例如，哺乳动物)中与靶结合的方法包括：向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；并且在第一组合物后向受试者(例如，哺乳动物)提供(例如，施用)环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述受试者(例如，哺乳动物)包含在提供(例如，施用)了环状多核糖核苷酸的第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平结合；从而与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平相比，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后维持所述受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平。

此外，第二组合物可以在提供第一组合物之后，并且在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的蛋白质水平之后提供。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的结合水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中基本上检测不到由第一组合物产生的结合水平后1分钟至20年、或其间的任何时间，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，在第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，并且在第一组合物后少于20年、15年或10年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物。在一些实施例中，向细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)提供(例如，施用)了第二组合物1分钟至20年、或其间的任何时间。

在一些实施例中，再给药方案或方法中的第一组合物和第二组合物之后可以是环状多核糖核苷酸的一种或多种另外的组合物。在一些实施例中，所述一种或多种另外的组合物包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。对于再给药，所述一种或多种另外的组合物可以在提供先前组合物之后，并且在多个细胞中(例如，在受试者中)基本上检测不到由所述一种或多种先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、结合或蛋白质的水平之后提供。例如，在基本上检测不到由先前组合物产生的环状多核糖核苷酸、产生的结合、或表达的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述多个提供了所述一种或多种另外的组合物。对于再给药，所述一种或多种另外的组合物可以在提供先前组合物之后提供。例如，在提供一种或多种先前组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了所述一种或多种另外的组合物。在一些实施例中，在提供一种或多种先前组合物后1分钟至20年，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了所述一种或多种另外的组合物。在一些实施例中，在提供一种或多种先前组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，但不超过20年、15年或10年，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了所述一种或多种另外的组合物。

在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)施用或提供了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物之前的所述蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)提供了第二组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第三组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物之前的所述蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第三组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平之后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物之前的所述蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。在一些实施例中，在细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物前的所述蛋白质水平后1分钟至20年，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了如上所述的组合物。

在一些实施例中，在提供第一组合物后，向细胞施用或提供了第二组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞提供了第二组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后，向细胞施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第三组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第三组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后，向细胞施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞施用或提供了所述一种或多种另外的组合物的第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多组合物。在一些实施例中，在提供第一组合物后1分钟至20年，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了如上所述的组合物。

在一些实施例中，在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供前一种组合物后的一段时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供了组合物。例如，可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第一组合物后的第一时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第二组合物；可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第二组合物后的第二时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第三组合物；可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第三组合物后的第三时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第四组合物；或者可以在向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第四、第五、第六、第七、第八、第九或更多组合物后的第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个或更多时间间隔后，向细胞或受试者(例如，哺乳动物)施用或提供第五、第六、第七、第八、第九或更多组合物。第一时间间隔可以长于细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平恢复到大约在施用或提供第一组合物之前的所述蛋白质水平所需的时间量。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中环状多核糖核苷酸的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，将在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中结合的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者(例如，哺乳动物)中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

在一些实施例中，在提供环状多核糖核苷酸的第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的水平比在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述多个中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

环状多核糖核苷酸

本文所述的环状多核糖核苷酸及其组合物或药物组合物可用于治疗和兽医给药方法，以在向多个细胞提供至少两剂环状多核糖核苷酸后，在所述多个细胞中产生一定水平的环状多核糖核苷酸、一定水平的与靶的结合、或一定水平的蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在哺乳动物例如人中是非免疫原性的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。在一些实施例中，细胞被修饰以包含环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括表达产物的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含用于与靶结合的结合位点。在一些实施例中，经由本文所述的任何给药、交错给药或再给药方法，向多个细胞提供了环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸在受试者中诱导应答或应答水平。在一些实施例中，由包含在环状多核糖核苷酸中的序列编码的表达产物在所述多个细胞中的一个或多个细胞中表达。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期增大了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更多。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或是至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如瞬时地或长期地调节细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定改变，诸如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生瞬时改变，诸如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从DNA产生RNA的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”RNA，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，所述“串”RNA最终可以被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少100个核苷酸的长度可能是有用的。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且被配置用于在受试者体内细胞中的持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，所述一个或多个表达序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。表达序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间段内的表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些情况下，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的水平。

表达序列

本文披露了在向细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，由细胞中的表达序列产生一定水平蛋白质的给药方法，其中环状多核糖核苷酸编码所述蛋白质。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个编码肽或多肽的表达序列。这种肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。这种肽可以具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。这种肽可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。

多肽可以是直链或支链的。多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。

肽或多肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标记物、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽。本文所述的可用于本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]Drug Discov Today[今日药物发现]:21(7):1076-113)。此类抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原、细胞内抗原。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA表达序列，其中每一个都可以可编码多肽。多肽可以大量产生。这样，多肽可以是可产生的任何蛋白质分子。多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调控酶(例如，调控脂质或类固醇的产生)、抗原、耐受原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被裂解(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码蛋白质例如治疗性蛋白质的表达序列。在一些实施例中，表达序列的表达产物是蛋白质，例如，治疗性蛋白质。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。在一些实施例中，治疗性蛋白质是抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原、细菌抗原或病毒抗原。

在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸可以的示例性蛋白质包括EGF(上皮生长因子)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括酶，例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、非ATP依赖型蛋白酶和去饱和酶。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达苯丙氨酸羟化酶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达

萤光素酶(nLuc)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达促红细胞生成素。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌蛋白，所述分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达高斯萤光素酶(gLuc)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括膜蛋白或跨膜蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达跨膜受体，例如G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、抗原受体或嵌合抗原受体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像Flag、Myc或His。在一些实施例中，可以由环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括GFP。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达标签蛋白，例如含有蛋白质标签的融合蛋白或工程化蛋白，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)、钙调蛋白标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、聚谷氨酸标签(EEEEEE)、E标签(GAPVPYPDPLEPR)、FLAG标签(DYKDDDDK)、HA标签(YPYDVPDYA)、His标签(HHHHHH)、Myc标签(EQKLISEEDL)、NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES)、S标签(KETAAAKFERQHMDS)、SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、Sof标签1(SLAELLNAGLGGS)、Sof标签3(TQDPSRVG)、Spot标签(PDRVRAVSHWSS)、Strep标签(Strep标签II：WSHPQFEK)、TC标签(CCPGCC)、Ty标签(EVHTNQDPLD)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST)、VSV标签(YTDIEMNRLGK)、或Xpress标签(DLYDDDDK)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体，例如抗体片段或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，诸如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。

本文披露了在向细胞提供环状多核糖核苷酸的至少两种组合物后，在细胞中产生一定水平蛋白质的给药方法，其中环状多核糖核苷酸编码所述蛋白质。

蛋白质可以是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。蛋白质可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。蛋白质可以包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调控酶(例如，调控脂质或类固醇的产生)、抗原、耐受原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被裂解(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。

在一些实施例中，蛋白是治疗性蛋白。治疗性蛋白质可以具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。在一些实施例中，治疗性蛋白质是人因子VIII、人因子IX、REP1、腺苷脱氨酶、人NGF、核编码的ND4、SECRA2a、SUMO1、VEGF、PDE6A、p53、PBFD、ARSA、ABCD1、APOE4、RPGR、DCLRE1C、VEGF165、PDGF-B、γ-肌聚糖、肌营养不良蛋白、LAMP2B、CNGB3、视网膜色素变性GTPase调节子或CLN6。

在一些实施例中，蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，蛋白质是EGF(上皮生长因子)。在一些实施例中，示例性蛋白质是酶，例如氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、ATP非依赖性酶和去饱和酶。在一些实施例中，本文披露的示例性蛋白质包括细胞内蛋白或胞质蛋白质。在一些实施例中，示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白质，或者是具有分泌信号肽的蛋白质。在一些情况下，蛋白质是非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像Flag、Myc或His。在一些实施例中，蛋白质是标签蛋白，例如含有蛋白质标签的融合蛋白或工程化蛋白，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)、钙调蛋白标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、聚谷氨酸标签(EEEEEE)、E标签(GAPVPYPDPLEPR)、FLAG标签(DYKDDDDK)、HA标签(YPYDVPDYA)、His标签(HHHHHH)、Myc标签(EQKLISEEDL)、NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES)、S标签(KETAAAKFERQHMDS)、SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、Sof标签1(SLAELLNAGLGGS)、Sof标签3(TQDPSRVG)、Spot标签(PDRVRAVSHWSS)、Strep标签(Strep标签II：WSHPQFEK)、TC标签(CCPGCC)、Ty标签(EVHTNQDPLD)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST)、VSV标签(YTDIEMNRLGK)、或Xpress标签(DLYDDDDK)。

在一些实施例中，蛋白质是抗体，例如抗体片段或其一部分。抗体可以是任何同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，蛋白质是抗体的一部分，诸如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另一部分。在一些实施例中，蛋白质是抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。

本发明包括用于蛋白质表达的方法，其包括翻译本文提供的环状多核糖核苷酸的至少一个区域。蛋白质表达可以在一个或多个细胞中发生，例如在向细胞提供第一组合物、第二组合物、第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物、第九组合物或第十组合物后的细胞中。

在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸、或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸、或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，这些方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成如本文提供的连续多肽、如本文提供的离散多肽、或两者。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区域的翻译在体外发生，如兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区域的翻译在体内发生，例如，在真核细胞的转染或原核细胞(诸如细菌)的转化之后。在一些实施例中，翻译发生在一个或多个细胞中，例如在向细胞提供环状多核糖核苷酸的组合物之后。

在一些方面，本披露提供了在受试者体内表达一个或多个表达序列的方法，其包括：将环状多核糖核苷酸施用至所述受试者的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含所述一个或多个表达序列；并且在细胞中表达环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中表达在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间段内减少不大于约40％的一个或多个表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中表达至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天维持在变化不大于约40％的水平的一个或多个表达序列。在一些实施例中，使用本文所述的任何递送方法进行环状多核糖核苷酸的施用。在一些实施例中，经由静脉内注射向受试者施用环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的施用包括但不限于产前施用、新生儿施用、产后施用、口服、通过注射(例如静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴内、皮下和肌肉内)、通过眼科施用、通过耳蜗内(内耳)施用、通过鼻内施用、通过气管内施用和通过吸入施用。

在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括体内或细胞中的翻译后修饰，例如经由细胞机器。

结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码至少一个结合位点。所述至少一个结合位点可结合靶，诸如蛋白质、RNA或DNA。所述至少一个结合位点是蛋白结合位点、RNA结合位点或DNA结合位点。所述至少一个结合位点赋予细胞至少一种治疗特征。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予细胞核酸(例如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)定位。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予包含环状多核糖核苷酸的细胞核酸活性(例如，是导致包含miRNA的细胞中核酸降解的miRNA结合位点)。在一些实施例中，所述至少一个结合位点结合至细胞表面上的细胞受体。在一些实施例中，当所述至少一个结合位点结合至细胞表面上的细胞受体时，环状多核糖核苷酸被内化到如本文所述的细胞中。在一些实施例中，所述至少一个结合位点与线性多核苷酸杂交，所述线性多核苷酸有助于环状多核糖核苷酸内化到细胞中。例如，线性多核苷酸包含与环状多核糖核苷酸的至少一个结合位点杂交的区域和与细胞表面上的细胞受体结合的区域。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的与细胞受体结合的区域导致结合后与环状多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸内化。

在一些情况下，circRNA包含结合位点。结合位点可以包含适配体。在一些情况下，circRNA包含至少两个结合位点。例如，circRNA可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个结合位点。在一些实施例中，本文描述的circRNA是结合一个或多个靶或一个或多个靶的一个或多个结合部分的分子支架。每个靶可以是但不限于不同或相同的核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如、药物)、适配体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段及其任何组合。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至相同靶。在一些实施例中，所述一个或多个结合位点结合至相同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至一个或多个不同靶。在一些实施例中，所述一个或多个结合位点结合至不同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，circRNA充当一种或多种结合一个或多个靶的支架。在一些实施例中，circRNA充当一个或多个靶的一个或多个结合部分的支架。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个靶的一个或多个结合部分特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circRNA通过与一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，本文描述的circRNA包括针对一个或多个特定目的靶的结合位点。在一些实施例中，circRNA包括针对每个目的靶的多个结合位点或结合位点的组合。在一些实施例中，circRNA包括针对每个目的结合部分的多个结合位点或结合位点的组合。例如，circRNA可以包括针对多肽靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，circRNA包括针对多核苷酸靶例如DNA或RNA、mRNA靶、rRNA靶、tRNA靶或基因组DNA靶的一个或多个结合位点。

在一些情况下，circRNA包含针对单链DNA的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对双链DNA的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对抗体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对病毒颗粒的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对小分子的结合位点。在一些情况下，circRNA包含在细胞内或细胞上结合的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对RNA-DNA杂交体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对未甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对适配体的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对单链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对双链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对抗体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对病毒颗粒上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对小分子上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对细胞内或细胞上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对RNA-DNA杂交体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对未甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对适配体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽上结合部分的结合位点。在一些情况下，circRNA包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞上的结合部分的结合位点。

在一些情况下，结合位点与靶的包含至少两个酰胺键的部分结合。在一些情况下，结合位点不结合靶的包含磷酸二酯键的部分。在一些情况下，靶的一部分不是DNA或RNA。在一些情况下，结合部分包含至少两个酰胺键。在一些情况下，结合部分不包含磷酸二酯键。在一些情况下，结合部分不是DNA或RNA。

本文提供的circRNA可以包括针对复合物上的结合部分的一个或多个结合位点。本文提供的circRNA可以包含一个或多个靶结合位点以形成复合物。例如，本文提供的circRNA可充当支架，以在circRNA和靶之间形成复合物。在一些实施例中，circRNA与单个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与两个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与三个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与四个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与五个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，circRNA与两个或更多个靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，circRNA与三个或更多靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circRNA与单个靶形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circRNA与两个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，第一circRNA与第一靶的第一结合部分和第二靶的第二不同结合部分形成复合物。在一些实施例中，第一circRNA与第一靶的第一结合部分形成复合物，并且第二circRNA与第二靶的第二结合部分形成复合物。

在一些实施例中，circRNA可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-DNA复合物、多肽-RNA复合物、多肽-适配体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-DNA复合物、病毒颗粒-RNA复合物、病毒颗粒-适配体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-DNA复合物、细胞-RNA复合物、细胞-适配体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-DNA复合物、小分子-适配体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合。

在一些实施例中，circRNA可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-DNA复合物、多肽-RNA复合物、多肽-适配体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-DNA复合物、病毒颗粒-RNA复合物、病毒颗粒-适配体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-DNA复合物、细胞-RNA复合物、细胞-适配体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-DNA复合物、小分子-适配体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合上的一个或多个结合部分。

在一些情况下，结合位点与多肽、蛋白或其片段结合。在一些实施例中，结合位点与靶的多肽、蛋白或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与分离的多肽、细胞的多肽、纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或部分结合。例如，结合位点与抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分析物混合物(例如裂解物)的结构域、片段、表位、区域或的一部分结合。例如，结合位点与来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物中的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以结合靶的结合部分。在一些情况下，结合部分在多肽、蛋白质、或其片段上。在一些实施例中，结合部分包含多肽、蛋白质或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含分离的多肽、细胞的多肽、经纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上。结合部分包括分析物(例如，裂解物)的混合物上的结合部分或分析物(例如，裂解物)的混合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分。

在一些情况下，结合位点与化合物(例如小分子)的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合结合至药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合位点结合至化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分结合至有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点所结合的小分子部分可以例如从天然存在或合成分子的文库获得，包括通过组合方式产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并且在以下专利中进行了描述：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其披露内容通过援引并入本文。结合位点可以结合小分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在药物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以例如从天然存在或合成分子的文库获得，所述文库包括通过组合手段产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并且在以下专利中进行了描述：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其披露内容通过援引并入本文。

结合位点可以结合特异性结合对的成员(例如配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合靶的抗原部分或半抗原部分。结合位点可结合共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合细胞(例如细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合天然环境(例如组织)，培养的细胞或微生物(例如细菌、真菌、原生动物或病毒)或裂解的细胞中的靶。结合位点可以结合至靶的一部分，所述部分被修饰(例如，化学地修饰)以提供一个或多个另外的结合位点，例如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(例如磷酸基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(例如甲基)。结合位点可以结合特异性结合对的成员的结合部分。结合部分可以在特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以是抗原的或半抗原的。结合部分可以在共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在天然环境(例如，组织)、培养的细胞、或微生物(例如，细菌、真菌、原生动物或病毒)、或裂解的细胞中。可以修饰(例如，化学地)结合部分，以提供一个或多个另外的结合位点，诸如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(诸如磷酸酯基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(诸如甲基基团)。

在一些情况下，结合位点结合来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合来自宿主的样品中发现的分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分上或者包含来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分。来自宿主的样品包括体液(例如，尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等)。样品可以直接检查或者可以进行预处理以使结合部分更易于检测。样品包括一定数量的来自有生命物或先前有生命物的物质。样品可以是天然的、重组的、合成的或非天然存在的。结合位点可以结合上述任何，其从细胞天然或重组表达，在细胞裂解物中或细胞培养基中，是体外翻译的样品，或从样品(例如细胞裂解物)免疫沉淀。结合部分可以是以上中的任一种，其从细胞天然或重组表达、在细胞裂解物或细胞培养基中、是体外翻译的样品、或是来自样品(例如，细胞裂解物)的免疫沉淀。

在一些情况下，结合位点与在无细胞系统中或在体外表达的靶结合。例如，结合位点与细胞提取物中的靶结合。在一些情况下，结合位点与细胞提取物中的靶结合，所述细胞提取物具有DNA模板以及用于转录和翻译的试剂。结合位点可以与在无细胞系统中或在体外表达的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分在无细胞系统中或在体外表达。例如，靶的结合部分在细胞提取物中。在一些情况下，靶的结合部分在细胞提取物中，所述细胞提取物具有DNA模板以及用于转录和翻译的试剂。可以使用的细胞提取物的示例性来源包括小麦胚芽、大肠杆菌、兔网织红细胞、极端嗜热菌、杂交瘤、爪蟾属(Xenopus)卵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞(例如，人细胞)。可用于表达靶多肽(例如，在阵列上产生靶多肽)的示例性无细胞方法包括蛋白质原位阵列(PISA)、多重斑点技术(MIST)、自组装mRNA翻译、核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)、纳米孔NAPPA、DNA阵列至蛋白质阵列(DAPA)、无膜DAPA、纳米孔复制和μIP-微凹版印刷、以及pMAC-蛋白质微阵列复制(参见Kilb等人,Eng.Life Sci.[生命科学工程]2014,14,352-364)。

在一些情况下，结合位点与从DNA模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的靶结合。结合位点可以与原位合成的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分是从DNA模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的。在一些情况下，平行或在单一反应中从多个相应的DNA模板原位合成多个结合部分。用于原位靶多肽表达的示例性方法包括以下文献中描述的那些：Stevens,Structure[结构]8(9):R177-R185(2000)；Katzen等人,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]23(3):150-6.(2005)；He等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术新见]19(1):4-9.(2008)；Ramachandran等人,Science[科学]305(5680):86-90.(2004)；He等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]29(15):E73-3(2001)；Angenendt等人,Mol.Cell Proteomics[分子与细胞蛋白组学]5(9):1658-66(2006)；Tao等人,Nat Biotechnol[自然生物技术]24(10):1253-4(2006)；Angenendt等人,Anal.Chem.[分析化学]76(7):1844-9(2004)；Kinpara等人,J.Biochem.[生物化学杂志]136(2):149-54(2004)；Takulapalli等人,J.Proteome Res.[蛋白组学研究杂志]11(8):4382-91(2012)；He等人,Nat.Methods[自然方法]5(2):175-7(2008)；Chatterjee和J.LaBaer,Curr Opin Biotech[生物技术新见]17(4):334-336(2006)；He和Wang,BiomolEng[生物分子工程]24(4):375-80(2007)；以及He和Taussig,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]274(1-2):265-70(2003)。

在一些情况下，结合位点与包含至少6个核苷酸跨度(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸)的核酸靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的核酸靶结合，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合核酸靶的结合部分。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含至少6个核苷酸，例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个核苷酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含连续核苷酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含不连续核苷酸段。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换、或截短。

在一些情况下，结合位点与包含至少6个氨基酸(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸)跨度的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的蛋白靶结合，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合蛋白靶的结合部分。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含至少6个氨基酸，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个氨基酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含不连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换、或截短。

在一些实施例中，结合位点与膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以结合膜结合蛋白的结合部分。在一些实施例中，结合部分在膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。示例性的膜结合蛋白包括但不限于GPCR(例如肾上腺素能受体、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、神经降压素受体、甘丙肽受体、多巴胺受体、阿片受体、血清素受体、生长抑素受体等)、离子通道(例如、烟碱乙酰胆碱受体、钠通道、钾通道等)、非兴奋性和兴奋性通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子和激素受体(例如表皮生长因子(EGF)受体)，等。结合位点可以结合膜结合蛋白的突体变或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结合部分。结合部分也可以在膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，GPCR的一些单点或多点突变保留功能并在疾病中涉及(参见，例如，Stadel等人,(1997)Trends in Pharmacological Review[药理学趋势综述]18:430-37)。

结合位点结合至例如泛素连接酶的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如泛素衔接子、蛋白酶体衔接子或蛋白酶体蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如内吞、吞噬、溶酶体途径、自噬途径、巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬、多囊体途径、或其组合中涉及的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。

RNA结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括RNA结合位点，所述RNA结合位点修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一些实施例中，RNA结合位点调节宿主基因的表达。RNA结合位点可以包括与内源基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)杂交的序列、与外源核酸(例如病毒DNA或RNA)杂交的序列、与RNA杂交的序列、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节DNA-或RNA-结合因子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与RNA结合的适配体序列。适配体序列可以结合至内源基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)、外源核酸(例如病毒DNA或RNA)、RNA、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节DNA-或RNA-结合因子的序列。适配体序列的二级结构可以结合至RNA。通过将适配体序列与RNA结合，环状RNA可以与RNA形成复合物。

在一些实施例中，RNA结合位点可以是tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA、和hnRNA结合位点之一。RNA结合位点是本领域普通技术人员熟知的。

某些RNA结合位点可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含RNAi分子，所述RNAi分子具有RNA或RNA样结构，典型地具有15-50个碱基对(例如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、和切丁酶(dicer)底物。

在一些实施例中，RNA结合位点包含siRNA或shRNA。siRNA和shRNA类似于内源性miRNA基因加工途径中的中间体。在一些实施例中，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然。像siRNA一样，微RNA可以使用RISC来下调靶基因，但是与siRNA不同，大多数动物miRNA都不裂解mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解来降低蛋白质输出。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3’-UTR内；miRNA似乎靶向与从miRNA5’端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。此区域称为种子区域。因为siRNA和miRNA是可互换的，所以外源性siRNA可以下调具有与siRNA的种子互补性的mRNA。3’-UTR内的多个靶位点可以提供更强的下调。

微RNA(miRNA)是短非编码RNA，与核酸分子的3’-UTR结合并且通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可包含一种或多种miRNA靶序列、miRNA序列或miRNA种子。此类序列可以对应于任何miRNA。

miRNA序列包含“种子”区域，即成熟miRNA的第2-8位区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有沃森-克里克互补性。miRNA种子可以包含成熟miRNA的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的第2-8个核苷酸)，其中相应miRNA靶中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施例中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的第2-7个核苷酸)，其中相应miRNA靶中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。

miRNA种子的碱基可以与靶序列基本上互补。通过将miRNA靶序列工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或被宿主免疫系统检测到，可以调节降解或调节翻译。此过程将减少环状多核糖核苷酸递送时脱靶效应的危险。

环状多核糖核苷酸可包括与靶基因约5至约25个连续核苷酸相同的miRNA序列。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并且从二核苷酸AA开始，包含约30％-70％、约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％的GC含量，并且例如通过标准BLAST搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。

相反，可以将微小RNA结合位点工程化出(即从其去除)环状多核糖核苷酸，以调节特定组织中的蛋白表达。多个组织中表达的调控可通过引入或去除一个或几个miRNA结合位点(例如，miRNA结合位点在细胞中赋予核酸活性)来完成。

已知miRNA调控mRNA并且从而调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-ld、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)、和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。MiRNA还可以调控复杂的生物学过程，诸如血管生成(miR-132)。在本文所述的环状多核糖核苷酸中，可以去除或引入与此类过程有关的miRNA的结合位点，以使环状多核糖核苷酸的表达适应生物学相关的细胞类型或相关生物学过程的情况。在一些实施例中，miRNA结合位点包括例如miR-7。

通过理解miRNA在不同细胞类型中的表达模式，可以将本文所述的环状多核糖核苷酸工程化用于在特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下的更有靶向性的表达。通过引入组织特异性miRNA结合位点，环状多核糖核苷酸可以设计用于组织中或在生物学条件下的最佳蛋白表达。

另外，可以将miRNA种子位点掺入环状多核糖核苷酸中以调节某些细胞中的表达，这导致生物学改善。此方面的一个实例是miR-142位点的掺入。将miR-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中可调节造血细胞中的表达，还可减少或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白的免疫应答。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一种miRNA，例如2种、3种、4种、5种、6种或更多种。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含miRNA，所述miRNA与这些核苷酸序列中任一个或与跟靶序列互补的序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％核苷酸序列同一性。

已知miRNA序列的列表可以在研究组织维护的数据库中找到，这些研究组织例如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial SloanKettering Cancer Center)、和欧洲分子生物学实验室(European Molecule BiologyLaboratory)。RNAi分子可以是通过本领域已知的技术易于设计和产生的。另外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含长非编码RNA。长非编码RNA(lncRNA)包括长度超过100个核苷酸的非蛋白编码转录物。较长的长度将lncRNA与小调节RNA(例如miRNA、siRNA和其他短RNA)区分开。通常，大多数(约78％)lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可以调控附近基因的转录。

RNA结合位点的长度可以在约5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间，或可以是约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个、或更多个核苷酸。RNA结合位点与目的靶的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个大型基因间非编码RNA(lincRNA)结合位点。LincRNA构成了大部分的长非编码RNA。LincRNA是非编码转录物，并且在一些实施例中，长度超过约200个核苷酸。在一些实施例中，lincRNA具有外显子-内含子-外显子结构，类似于蛋白质编码基因，但是不包含开放阅读框并且不编码蛋白质。与编码基因相比，LincRNA表达可以是严格组织特异性的。LincRNA典型地与其相邻基因共表达，其程度与成对的相邻蛋白质编码基因相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含环化的lincRNA。

在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包括一个或多个lincRNA，例如FIRRE、LINC00969、PVT1、LINC01608、JPX、LINC01572、LINC00355、C1orf132、C3orf35、RP11-734、LINC01608、CC-499B15.5、CASC15、LINC00937、和RP11-191。

已知lincRNA和lncRNA序列的列表可以在研究组织(例如，基因组和整合生物学研究所(Institute of Genomics and Integrative Biology)、昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所(Diamantina Institute at the University of Queensland)、根特大学(GhentUniversity)和中山大学(Sun Yat-sen University))维护的数据库中找到。LincRNA和lncRNA分子可以是通过本领域已知的技术易于设计和产生的。另外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。

RNA结合位点可以包含与内源性基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。互补序列可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。互补序列可以通过与基因的mRNA杂交并且防止其翻译而对所述基因具有特异性。RNA结合位点可包含与内源基因或基因产物(例如DNA、RNA或其衍生物或杂交物)的全部或片段反义或基本上反义的序列。

RNA结合位点可以包含与线性多核糖核苷酸的区域基本上互补或完全互补的序列。互补序列可以对用于环状多核糖核苷酸与线性多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸区域具有特异性。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸还包含与细胞上的蛋白质(诸如受体)结合的区域。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的与细胞受体结合的区域导致结合后与环状多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸内化到细胞中。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含RNA结合位点，所述RNA结合位点具有RNA或RNA样结构，典型地在约5-5000个碱基对之间(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp，lncRNA 200-500bp)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。

DNA结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含DNA结合位点，诸如指导RNA(gRNA)的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导RNA或gRNA序列的互补序列。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。指导RNA序列可以具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可用于设计有效的指导RNA。可以使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)(一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单RNA分子)实现基因编辑。经化学修饰的sgRNA可以在基因组编辑中有效。

gRNA可以识别特定的DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。

在一些实施例中，gRNA是用于基因编辑的CRISPR系统的一部分。对于基因编辑，可将环状多核糖核苷酸设计为包括一个或多个与所需的靶DNA序列相对应的指导RNA序列。gRNA序列可包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸与Cas9或其他外切核酸酶相互作用以切割DNA，例如，Cpf1与gRNA序列的至少约16个核苷酸相互作用以进行可检测的DNA切割。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含可与DNA结合的适配体序列。适配体序列的二级结构可以结合至DNA。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过将适配体序列与DNA结合而与DNA形成复合物。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括结合双链体DNA中的大沟的序列。在一个这样的情况下，由环状多核糖核苷酸和双链体DNA产生的三链体结构的特异性和稳定性是通过Hoogsteen氢键提供，其不同于双链DNA中经典沃森-克里克碱基配对中形成的那些氢键。在一种情况下，环状多核糖核苷酸通过大沟与靶双链体的富嘌呤链结合。

在一些实施例中，三链体形成发生在两个基序中，以环状多核糖核苷酸相对于靶双链体的富嘌呤链的取向辨别。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中的多嘧啶序列段通过Hoogsteen氢键以平行方式(即，与双链体的富嘌呤链相同的5’至3’方向)结合至双链体DNA的多嘌呤序列段，而多嘌呤段(R)通过反向Hoogsteen氢键以反平行方式结合至双链体的嘌呤链。在反平行中，嘌呤基序包含G:G-C、A:A-T或T:A-T的三联体；而在平行中，嘧啶基序包含C+:G-C或T:A-T三联体的典型三联体(其中C+代表N3位置上的质子化胞嘧啶)。环状多核糖核苷酸中的反平行GA和GT序列在中性pH下可形成稳定的三链体，而环状多核糖核苷酸中的平行CT序列可在酸性pH下结合。环状多核糖核苷酸中胞嘧啶上的N3可以被质子化。用5-甲基-C取代C可能允许在生理pH下结合环状多核糖核苷酸中的CT序列，因为5-甲基-C具有比胞嘧啶更高的pK。对于嘌呤和嘧啶基序，连续的至少10个碱基对的同型嘌呤-同型嘧啶序列段有助于环状多核糖核苷酸结合至双链体DNA，因为较短的三链体在生理条件下可能不稳定，并且序列中断会使三链体结构不稳定。在一些实施例中，针对三链体形成的DNA双链体靶在一条链中包括连续的嘌呤碱基。在一些实施例中，针对三链体形成的靶包括在DNA双链体的一条链中的同型嘌呤序列和在互补链中的同型嘧啶序列。

在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体是稳定的结构。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体表现出增加的半衰期，例如增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更大，例如，持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。

蛋白结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点。在一些实施例中，蛋白结合位点包含适配体序列。在一个实施例中，与由参考化合物(例如缺少蛋白结合位点的环状多核糖核苷酸，例如线性RNA)所触发的应答相比，环状多核糖核苷酸包括蛋白结合位点以减少来自宿主的免疫应答。

在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，以结合蛋白，例如核糖体。通过将蛋白结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，具有经调节的降解或经调节的翻译。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如，以掩蔽环状多核糖核苷酸免于宿主免疫系统组分的作用，例如逃避CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为非内源性的核苷酸序列。

核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5’端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的内部起始(即，不依赖帽)或翻译不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个RNA序列，所述一个或多个RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。

在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包含与蛋白结合的蛋白结合序列。在一些实施例中，蛋白结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合蛋白质的精氨酸富集区。

在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，例如，充当使两个或更多个蛋白紧密接近的支架。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含两个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含三个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使三个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含四个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使四个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含五个或更多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使五个或更多个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，靶蛋白是相同的。在一些实施例中，靶蛋白是不同的。在一些实施例中，使靶蛋白紧密接近促进了蛋白复合物的形成。例如，本披露的环状多核糖核苷酸可以充当支架以促进包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶蛋白或更多的复合物的形成。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近促进两个或更多个靶蛋白的相互作用。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制酶促反应。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制信号转导途径。

在一些实施例中，蛋白结合位点包括但不限于与针对以下蛋白的结合位点，诸如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、p53、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX1、RBFOX2、RBFOX3、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1、以及任何其他结合RNA的蛋白。

在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的核酸序列，例如，可以与转录因子、增强子、阻遏物、聚合酶、核酸酶、组蛋白或结合DNA的任何其他蛋白结合的序列。在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的适配体序列。在一些实施例中，适配体序列的二级结构结合蛋白。在一些实施例中，环状RNA通过适配体序列与蛋白的结合而与蛋白形成复合物。

在一些实施例中，环状RNA缀合至小分子或其部分，其中所述小分子或其部分结合至靶，诸如蛋白。可以通过经修饰的核苷酸，例如通过点击化学，将小分子与环状RNA缀合。可以结合蛋白的小分子的实例包括但不限于4-羟基他莫昔芬(4-OHT)、AC220、阿法替尼、氨基吡唑类似物、AR拮抗剂、BI-7273、博舒替尼、色瑞替尼、氯烷烃、达沙替尼、弗瑞替尼、吉非替尼、HIF-1α-衍生的(R)-羟基脯氨酸、HJB97、基于羟基脯氨酸的配体、IACS-7e、依鲁替尼、依鲁替尼衍生物、JQ1、拉帕替尼、LCL161衍生物、来那度胺、nutlin小分子、OTX015、PDE4抑制剂、泊马度胺、ripk2抑制剂、RN486、Sirt2抑制剂3b、SNS-032、青灰因子、TBK1抑制剂、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮衍生物、基于噻唑烷二酮的配体、VH032衍生物、VHL配体2、VHL-1、VL-269及其衍生物。

在一些实施例中，环状RNA缀合至一个以上的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个小分子。在一些实施例中，环状RNA缀合至一个以上不同的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的小分子。在一些实施例中，与环状RNA缀合的多于一个的小分子被配置为募集其各自的靶蛋白接近，这可以导致靶蛋白之间的相互作用和/或其他分子和细胞变化。例如，环状RNA可以缀合至JQ1和酞胺哌啶酮两者或其衍生物，因此可以募集JQ1的靶蛋白(例如BET家族蛋白)和酞胺哌啶酮的靶蛋白(例如E3连接酶)。在一些情况下，与JQ1和酞胺哌啶酮缀合的环状RNA通过JQ1或其衍生物募集BET家族蛋白，通过由酞胺哌啶酮或其衍生物募集的E3连接酶用泛素标记BET家族蛋白，并且因此导致经标记的BET家族蛋白的降解。

其他结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对非RNA或非DNA靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，结合位点可以是小分子、适配体、脂质、碳水化合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、或其任何片段的结合位点中之一。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对脂质的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对膜的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对多组分复合物例如核糖体、核小体、转录机器等的一个或多个结合位点。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适配体序列。适配体序列可结合至本文所述的任何靶(例如，核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质等)。适配体序列具有可以结合靶的二级结构。在一些实施例中，适配体序列具有可以结合靶的三级结构。在一些实施例中，适配体序列具有可以结合靶的四级结构。环状多核糖核苷酸可以通过适配体序列结合至靶以形成复合物。在一些实施例中，复合物可检测持续至少5天。在一些实施例中，复合物可检测持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天。

靶

所述至少一个结合位点可与靶结合。所述至少一个结合位可包含至少一个与靶结合的适配体序列。在一些实施例中，circRNA包含针对一个或多个靶的一个或多个结合位点。靶包括但不限于核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如药物、荧光团、代谢产物)、适配体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞器、细胞、其他细胞部分，其任何片段及其任何组合。(参见例如，Fredriksson等人,(2002)Nat Biotech[自然生物技术]20:473-77；Gullberg等人,(2004)PNAS[美国国家科学院院刊],101:8420-24)。例如，靶是单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA、包含一个或多个双链区域和一个或多个单链区域的DNA或RNA、RNA-DNA杂交体、小分子、适配体、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、抗体、抗体片段、抗体混合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段、或其任何组合。

在一些实施例中，靶是多肽、蛋白质、或其任何片段。例如，靶可以是纯化的多肽、分离的多肽、融合标记多肽、附着于或跨越细胞或病毒或病毒粒子的膜的多肽、细胞质蛋白、细胞内蛋白、细胞外蛋白、激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷酸酶、芳香化酶、磷酸二酯酶、环化酶、解旋酶、蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、转移酶、水解酶、切割酶、异构酶、糖基化酶、细胞外基质蛋白、连接酶、泛素连接酶、影响翻译后修饰的任何连接酶、离子转运蛋白、离子转运通道、离子转运孔、凋亡蛋白、细胞粘附蛋白、致病蛋白、异常表达的蛋白、转录因子、转录调节物、翻译蛋白、表观遗传因子、表观遗传调节物、染色质调节物、分子伴侣、分泌蛋白、配体、激素、细胞因子、趋化因子、核蛋白、受体、跨膜受体、受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、生长因子受体、核受体、激素受体、信号转导物、抗体、膜蛋白、整合膜蛋白、外周膜蛋白、细胞壁蛋白、球状蛋白、纤维蛋白、糖蛋白、脂蛋白、染色体蛋白、原癌基因、癌基因、抑癌基因、其任何片段或其任何组合。在一些实施例中，靶是异源多肽。在一些实施例中，靶是使用分子技术(诸如转染)在细胞中过表达的蛋白质。在一些实施例中，靶是重组多肽。例如，靶是在由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞(例如，生物体过表达的蛋白质)产生的样品中。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多肽。在一些实施例中，靶是细胞(例如，健康细胞或与疾病或病症相关的细胞)天然表达的多肽。在一些实施例中，靶是抗原，诸如用于免疫生物体或在生物体中生成免疫应答，诸如用于抗体产生的多肽。

在一些实施例中，靶是抗体。抗体可以特异性结合至另一个分子的特定空间和极性组织。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、或重组抗体，并且可以通过本领域熟知的技术制备，这些技术诸如免疫宿主并收集血清(多克隆)，或通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，这些核苷酸序列或其诱变形式至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列。天然存在的抗体可以是包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白质。每个重链可以由重链可变区(V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区可以包含三个结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链可以包含轻链可变区(V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个结构域C_L。V_H和V_L区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR₁、CDR₁、FR₂、CDR₂、FR₃、CDR₃、和FR4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1 q))的结合。抗体可以是任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，lgG₁、lgG₂、lgG₃、lgG₄、lgA₁和lgA₂)、亚类或其经修饰的形式。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段。抗体片段可以是指抗体的保留特异性结合至结合部分(诸如抗原)的能力的一个或多个片段。另外，还包括免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。抗体片段的实例包括Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段，一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；由V_H结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-46)；以及分离的CDR和单链片段(scFv)，其中V_L和V_H区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-26；和Huston等人,(1988)PNAS[美国国家科学院院刊]85:5879-83)。因此，抗体片段包括Fab、F(ab)₂、scFv、Fv、dAb等。尽管两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合。此类单链抗体包括一个或多个抗原结合部分。抗体可以是多价抗体，例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或八价抗体。抗体可以是多特异性抗体。例如，可以例如通过重组地结合任何两种或更多种抗原结合剂(例如，Fab、F(ab)₂、scFv、Fv、IgG)来生成双特异性、三特异性、四特异性、五特异性、六特异性、七特异性或八特异性抗体。可以使用多特异性抗体使两个或更多个靶紧密接近，例如，降解机器和要降解的靶底物，或泛素连接酶和要泛素化的底物。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的、分离的、狗、猫、驴、绵羊、任何植物、动物、或哺乳动物的。

在一些实施例中，靶是核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式，诸如DNA或RNA(例如，mRNA)。DNA包括在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒、和染色体中发现的双链DNA。在一些实施例中，多核苷酸靶是单链、双链、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、染色体、基因、非编码基因组序列、基因组DNA(例如，片段化的基因组DNA)、经纯化的多核苷酸、分离的多核苷酸、杂交的多核苷酸、转录因子结合位点、线粒体DNA、核糖体RNA、真核多核苷酸、原核多核苷酸、合成的多核苷酸、连接的多核苷酸、重组多核苷酸、含有核酸类似物的多核苷酸、甲基化多核苷酸、脱甲基化多核苷酸、其任何片段、或其任何组合。在一些实施例中，靶是重组多核苷酸。在一些实施例中，靶是异源多核苷酸。例如，靶是由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞产生的多核苷酸(例如，与生物体异源的多核苷酸)。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多核苷酸。

在一些实施例中，靶是适配体。适配体是分离的核酸分子，其以高特异性和亲和力结合至结合部分或靶分子，例如蛋白。适配体是保持为一种或多种特定构象的三维结构，所述三维结构提供化学接触以特异性结合其给定靶。尽管适配体是基于核酸的分子，但适配体与其他核酸分子(诸如基因和mRNA)之间存在根本差异。在这些其他核酸分子中，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，因此此序列对信息存储的功能很重要。完全相反，基于靶分子的特异性结合的适配体功能并不完全依赖于保守的线性碱基序列(非编码序列)，而是特定的二级/三级/四级结构。适配体可能具有的任何编码潜能都是偶然的，并且不认为在适配体与其同源靶的结合中起作用。适配体与结合某些蛋白的天然存在的核酸序列不同。这些后者的序列是嵌入生物体基因组内的天然存在的序列，这些序列与参与天然存在的核酸(例如，核酸结合蛋白)的转录、翻译和转运的蛋白质的特定亚组结合。另一方面，适配体是非天然存在的核酸分子。尽管可以鉴定出结合核酸结合蛋白的适配体，但在大多数情况下，此类适配体与自然界中由核酸结合蛋白识别的序列具有极少或没有序列同一性。更重要的是，适配体可以结合几乎任何蛋白(不仅是结合核酸的蛋白)以及几乎任何目的伴侣，包括小分子、碳水化合物、肽等。对于大多数伴侣，甚至蛋白，与其结合的天然存在的核酸序列不存在。对于确实具有这种序列的那些配偶体，例如核酸结合蛋白，由于与紧密结合的适配体相比，自然界中使用的结合亲和力相对较低，因此此类序列将不同于适配体。适配体能够特异性结合至选择的配偶体并且例如通过结合来调节配偶体的活性或结合相互作用，适配体可以阻断其配偶体起功能的能力。与配偶体特异性结合的功能特性是适配体的固有特性。适配体可以是6-35kDa。适配体可以是20至500个核苷酸。适配体能以微摩尔至亚纳摩尔分子亲和力结合其伴侣，并且可以区分紧密相关的靶(例如，适配体可以选择性地结合来自相同基因家族的相关蛋白)。在某些情况下，适配体仅结合一个分子。在某些情况下，适配体结合目的分子的家族成员。适配体在某些情况下结合多个不同的分子。适配体能够使用通常见到的分子间相互作用，诸如氢键、静电互补性、疏水性接触和空间排阻来与特定配偶体结合。适配体具有用作治疗和诊断的许多期望的特征，包括高特异性和亲和力、低免疫原性、生物学功效以及优异的药代动力学特性。适配体可以包含由共价连接的互补多核苷酸的杂交形成的分子茎和环结构(例如，发夹环结构)。茎包含杂交的多核苷酸，并且环是共价连接两个互补多核苷酸的区域。适配体可以是包含适配体序列的线性核糖核酸(例如，线性适配体)或包含适配体序列的环状多核糖核酸(例如，环状适配体)。

在一些实施例中，靶是小分子。例如，小分子可以是大环分子、抑制剂、药物、或化合物。在一些实施例中，小分子含有不超过五个氢键供体。在一些实施例中，小分子含有不超过十个氢键受体。在一些实施例中，小分子具有500道尔顿或更小的分子量。在一些实施例中，小分子具有从约180至500道尔顿的分子量。在一些实施例中，小分子含有不超过五的辛醇-水分配系数lop P。在一些实施例中，小分子具有从-0.4至5.6的分配系数log P。在一些实施例中，小分子具有从40至130的摩尔折射率。在一些实施例中，小分子含有从约20至约70个原子。在一些实施例中，小分子具有140埃²或更小的极性表面积。

在一些实施例中，circRNA包含与单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同的结合位点。在一个实施例中，单个circRNA包含针对一个或多个不同靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，例如靶的混合物或文库，并且样品包含circRNA，所述circRNA包含两个或更多个与所述两个或更多个靶结合的结合位点。

在一些实施例中，单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶具有多个结合部分。在一个实施例中，单个靶可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结合部分。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，诸如靶的混合物或文库，并且样品包含两个或更多个结合部分。在一些实施例中，单个靶或多个靶包含多个不同的结合部分。例如，多个可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、或30,000个结合部分。

靶可以包含多个结合部分，所述多个结合部分包含至少2个不同的结合部分。例如，结合部分可以包含多个结合部分，所述多个结合部分包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、或25,000个不同的结合部分。

环状多核糖核苷酸元件

在一些实施例中，除了包含编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和/或至少一个结合位点的序列之外，环状多核糖核苷酸还包含如本文所述的元件中的一种或多种。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A尾。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少复制元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少IRES。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如特此通过援引以其全文并入本文的WO2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合。

例如，环状多核糖核苷酸包含编码除了以上披露那些之外的一种或多种多肽或肽的序列。一些实例包括但不限于荧光标签或标记物、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含编码如本文所述的另外的治疗性蛋白质的表达序列。在WO 2019/118919的段落[0151]-[0153]中描述了调控元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

例如，环状多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一个调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指选择性地起始或激活环状多核糖核苷酸中的表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和/或至少一个结合位点的序列，并且包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克(Kozak)或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。在WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。包括在环状多核糖核苷酸中的合适的IRES元件可以是能够接合真核核糖体的RNA序列。在WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，治疗性蛋白)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

本披露的环状多核糖核苷酸可以包含交错元件。术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)ExNPGP，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且所述一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，所述交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，所述交错元件是与所述一个或多个表达序列分离的序列。在一些实施例中，所述交错元件包含所述一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。

在WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包含与调控核酸像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、microRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反义的序列。

在WO 2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性的调控核酸，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列、或线性环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率比参考物的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高300％。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上当量的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上当量的比率产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。

在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非翻译区(UTR)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。

在WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性的非翻译区，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括聚A序列。在WO 2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性的聚A序列，所述专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。在WO 2019/118919的段落[0232]-[0252]中描述了示例性的核糖开关，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。在WO2019/118919的段落[0253]-[0259]中描述了示例性适体酶，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA结合位点。微小RNA(或miRNA)抗原是短非编码RNA，可与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包含一种或多种微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可以对应于任何已知的微小RNA，如在美国公开US 2005/0261218和美国公开US 2005/0059005中传授的那些，其内容通过援引以其全文并入本文。在WO 2019/118919的段落[0206]-[0215]中描述了RNA结合位点的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。在WO 2019/118919的段落[0218]-[0221]中描述了蛋白结合位点的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含加密原以降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答。在一方面，本文提供了环状多核糖核苷酸，当被递送至细胞(例如，接触)时，所述环状多核糖核苷酸与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，导致宿主的免疫应答降低。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性比缺少加密原的对应物的免疫原性小。

在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。UTR的调控特征可以包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。

在一些实施例中，5’或3’UTR可以构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，UTRAU富集元件(ARE)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。

在一些实施例中，去除表达序列中的AU富集元件(ARE)的修饰(例如可翻译区)可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。

在一些实施例中，加密原包含miRNA结合位点或与任何其他非编码RNA的结合位点。例如，将miR-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中不仅可以调节造血细胞中的表达，还可以降低或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。

在一些实施例中，加密原包含一个或多个蛋白结合位点，使得蛋白质(例如，免疫蛋白质)能够结合至RNA序列。通过将蛋白结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽环状多核糖核苷酸而免受宿主免疫系统组分的影响，环状多核糖核苷酸可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫应答，例如CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源性的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。

在一些实施例中，加密原包含一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如至连接的磷酸酯/至磷酸二酯键/至磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可防止或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的任何修饰。以下详细描述了本文提供的一些示例性修饰。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，降低宿主的免疫应答。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分RNA是内源性还是病毒性。参见例如，Yu,Z等人,(2015)RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as“self”[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”].Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，将所述文献通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shRNA的表达序列或可被加工成siRNA的RNA序列，并且shRNA或siRNA靶向RIG-I并降低RIG-I的表达。RIG-I可以感知外源环状RNA并引起外源环状RNA的降解。因此，具有靶向RIG-I的shRNA、siRNA或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可以降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸减少、逃避或避免细胞先天免疫应答的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚A序列、5’端、3’端、磷酸酯基团、羟基基团或其任何组合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含间隔子序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸的元件可以通过间隔区序列或接头彼此隔开。在WO 2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的间隔区序列，所述专利特此通过援引以其全文并入。

本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包含非核酸接头。在WO 2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸接头，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸还包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含其他序列，这些其他序列包括DNA、RNA、或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA、或其他RNAi分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸中存在的基因表达产物不同的基因表达产物。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’-UTR、3’-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，siRNA、lncRNA、shRNA)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。

作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性RNA的特征。例如，与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸作为产生多肽(例如，引发抗体应答的抗原和/或表位)的细胞转化试剂更加有用。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸与线性RNA相比，更易储存更长时间。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，所述方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。

此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包含特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤(腺嘌呤和/或鸟嘌呤)富集区。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个AU富集区或元件(ARE)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个本文其他处所述的重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的修饰。

环状多核糖核苷酸相对于参考序列可以包括一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，相对于亲本多核糖核苷酸具有一个或多个插入、添加、缺失和/或共价修饰的环状多核糖核苷酸包括在本披露的范围内。在WO 2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性的修饰，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或RNA结合位点。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而结合蛋白质或核酸或增加蛋白质或核酸结合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸序列基本上是双链的。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。

有16种可能的碱基配对，但是其中的六种(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可能形成实际的碱基对。其余的称为错配，并且以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，从而对其功能无影响且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，并且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富U或富A序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富U和/或富A序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6、或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富C和/或富G的序列中的至少一种。在一些实施例中，富C和/或富G序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含具有一个或多个基序的三级结构，例如假结结构、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。

在WO 2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的结构的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，如本文所披露的环状多核糖核苷酸包含用于将环状多核糖核苷酸与例如化合物(例如小分子)、抗体或其片段、肽、蛋白质、适配体、药物或其组合缀合的缀合部分。在一些实施例中，小分子可以与circRNA缀合，从而产生包含小分子的circRNA。在一些实施例中，circRNA包含至少两个缀合部分，例如与第一小分子(例如JQ1)结合的第一缀合部分和与第二小分子(例如沙利度胺)结合的第二缀合分子。在一些实施例中，circRNA包含与小分子(例如沙利度胺)结合的缀合部分和与蛋白质(例如BRD4)结合的结合位点。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从DNA产生RNA的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”RNA，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，所述“串”RNA最终可以被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度可能是有用的。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。

稳定性和半衰期

在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列，未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对降解(例如核酸外切酶的降解)有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在WO 2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的稳定性和半衰期的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更多。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中具有的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或为至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。

在一些实施例中，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的环状多核糖核苷酸在细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在哺乳动物例如人中是非免疫原性的。

生产方法

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。

在本披露的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包含多种抗原和/或表位的融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，这些多种技术包括但不限于经典诱变技术和重组技术，诸如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。

环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，所述技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可以被环化、或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。

制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下文献中：例如，Khudyakov和Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC Press[CRC出版社](2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具与应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；以及Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。

多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号US 6210931、美国专利号US 5773244、美国专利号US 5766903、美国专利号US5712128、美国专利号US 5426180、美国公开号US 20100137407、国际公开号WO 1992001813和国际公开号WO 2010084371；其各自的内容通过援引以其全文并入本文)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是纯化的，例如，去除了游离核糖核酸、线性或带切口的RNA、DNA、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域通常使用的任何已知方法纯化环状多核糖核苷酸。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。

环化

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在细胞内环化。

细胞外环化

在一些实施例中，使用化学方法环化、或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，线性环状多核糖核苷酸)的5'端和3'端包括化学反应性基团，当这些化学反应性基团彼此靠近时，可以在分子的3'端与5'端之间形成新的共价键。5'端可以含有NHS酯反应性基团，并且3'端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。

在一些实施例中，DNA或RNA连接酶可用于将5'-磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性环状多核糖核苷酸与1-10单位的T4 RNA连接酶(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs,Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，所述线性核酸能够与并列的5'和3'区域两者碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，可以使用夹板连接酶(像

连接酶)进行夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)(像单链RNA)可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，DNA或RNA连接酶可用于环状多核苷酸的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5'-或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，所述活性核酶序列能够将线性环状多核糖核苷酸的5'-末端连接至线性环状多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1至24小时。

在一些实施例中，可以通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，至少一个非核酸部分可以与线性环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近线性环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，诸如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如本文所述的适体或非核酸接头。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以由于非核酸部分而被环化或连环化，所述非核酸部分引起位于、邻近或连接至线性环状多核糖核苷酸的5'和3'端的原子、分子表面之间的吸引力。作为一个非限制性实例，可以通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此缔合，从而引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，共价地连接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近的肽可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于在本发明的线性初级构建体或线性RNA中使用的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号US20030082768中描述，将所述专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括例如通过以下方式被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸：使5'三磷酸与RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(三磷酸腺苷双磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可以通过两步反应发生，所述两步反应包括：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以去除所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单一磷酸的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。

在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约40％。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在WO 2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性的剪接元件，所述专利特此通过援引以其全文并入。

其他环化方法

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括单独内含子内或跨侧接内含子的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，来自两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单一环化多核糖核苷酸，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列存在于线性环状多核糖核苷酸的5’端和3’端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个配对的核苷酸。

在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。

在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶(例如，DNA或RNA连接酶)可用于生成环状多核糖核苷酸或互补体的模板、环状多核糖核苷酸的互补链、或环状多核糖核苷酸。

环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，Petkovic和Muller,“RNA circularization strategies in vivo and in vitro[体内外核糖核酸环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，和Muller和Appel,“Invitro circularization of RNA[核糖核酸的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。

环状多核糖核苷酸可以编码可用于复制的序列和/或基序。在WO 2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性的复制元件，所述专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，如本文所披露的环状多核糖核苷酸缺少复制元件。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列和复制元件。

在方法施用中使用本文所述的任何环状多核糖核苷酸都在本披露的范围内，其中所述方法包括向多个细胞提供第一剂量的环状多核糖核苷酸，随后向所述多个细胞提供第二剂量的环状多核糖核苷酸。在组合物施用中使用本文所述的任何环状多核糖核苷酸也在本披露的范围内。环状多核糖核苷酸可以包含表达序列、调控元件或非翻译区中的一个或多个。环状多核糖核苷酸可以胜任滚环翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。环状多核糖核苷酸可以在至少一个表达序列的3’端处包含交错元件。在一些实施例中，交错元件在滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可以编码具有C末端共有序列为D(V/I)ExNPGP的序列，其中x代表任何氨基酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，表达序列中的一个或多个包含科扎克起始序列。环状多核糖核苷酸可以包含终止元件，例如终止密码子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含加密原、调控元件、复制元件或准双链二级结构中的一个或多个。环状多核糖核苷酸可以包含一种或多种功能特征，例如比线性对应物更高的翻译效率、多种翻译产物的化学计量翻译效率、比缺少加密原的对应物更低的免疫原性、相比于线性对应物增加的半衰期、或细胞分裂期间的持续性。环状多核糖核苷酸可以包含复制结构域，使得环状多核糖核苷酸能够自我复制。

药物组合物

本发明的方法包括提供或施用与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的组合物。环状多核糖核苷酸的组合物可以作为药物组合物使用或施用，使用本文所述的任何给药、再给药或交错给药方法。本文所述的环状多核糖核苷酸组合物可以以多种不同剂量和多种不同浓度提供或施用。环状多核糖核苷酸组合物可以作为药物组合物提供或施用。药物组合物可以包含一种或多种药学上相关的载体或赋形剂。药物组合物可以包含环状多核糖核苷酸和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

药学上可接受的赋形剂可以是非载体赋形剂。非载体赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载体赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载体赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载体赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过援引并入本文)。

本文所述的药物组合物可用于治疗和兽医。在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含如本文所述的环状多核糖核苷酸)适于施用至受试者，其中所述受试者是非人动物，例如适合兽用。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用至人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于任何动物，诸如人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，诸如鹦鹉、家禽、鸡、鸭、鹅、母鸡或公鸡和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。

本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。

在一些实施例中，药学上可接受的载体或赋形剂是糖(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、山梨糖醇或果糖)、中性盐(例如，氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、碳酸钠、亚硫酸钠、磷酸钾或乙酸钠)、酸性组分(例如，富马酸、马来酸、己二酸、柠檬酸或抗坏血酸)、碱性组分(例如，三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、葡甲胺、钠或钾的三元或二元磷酸盐)或氨基酸(例如，甘氨酸或精氨酸)。

本文所述的环状多核糖核苷酸也可与递送载体一起包含在药物组合物中。

可以将本文所述的药物组合物配制为例如包括药物赋形剂或载体。药物载体可以是膜、脂质双层和/或聚合物载体，例如脂质体，诸如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒，并且通过已知方法，诸如经由部分或完全包封所述经修饰的环状多核糖核苷酸递送至有需要的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。递送方法也描述于例如Gori等人,Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies forHuman Gene Therapy[用于人类基因疗法的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的递送和特异性].Human Gene Therapy[人类基因疗法疗].2015年7月,26(7):443-451.doi:10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人,Cationic lipid-mediated delivery of proteins enablesefficient protein-based genome editing in vitro and in vivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].Nat Biotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或药物组合物作为裸递送配制品递送。如本文所披露的裸递送配制品在不借助载体并且不对环状多核糖核苷酸进行共价修饰或者不部分或完全包封环状多核糖核苷酸的情况下将环状多核糖核苷酸递送至细胞。

裸递送配制品是不含载体的配制品并且其中如本文所述的环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的环状多核糖核苷酸是未与有助于递送至细胞的蛋白质、小分子、颗粒、聚合物、或生物聚合物共价结合。

在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下中的任一种或全部：转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精、lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HC1)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白。

裸递送配制品可以包含非载体赋形剂。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括非活性成分。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括缓冲液，例如PBS。在一些实施例中，非载体赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂、或油。

在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液、或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺、和2-丙醇。缓冲液的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、或蔗糖。

本发明进一步涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞包含本文所述的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或细胞。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，环状多核糖核苷酸降低或不能产生宿主免疫系统应答。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。

在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送至或施用至)环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸、表达产物、或两者的量。

细胞

本发明方法中的细胞可以是真核细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。在一些实施例中，细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、人)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合的细胞。

在一些实施例中，细胞来自器官、组织或生物体。在用于本文披露的方法之前，可以从受试者取出细胞，例如通过手术切除、通过静脉穿刺等。细胞可以来自细胞培养物。本文披露的方法可用于受试者中的细胞，例如，将如本文所披露的组合物施用至包含细胞的受试者。包含细胞的受试者可以是水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等))、农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、或人。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者，并且由本文披露方法的环状多核糖核苷酸产生的蛋白质治疗所述受试者。

在一些实施例中，细胞是多个细胞。本发明方法中的多个细胞可以是多个真核细胞。在一些实施例中，所述多个细胞是多个动物细胞。在一些实施例中，所述多个细胞是多个哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述多个细胞是多个人细胞。在一些实施例中，所述多个细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、人)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合的多个细胞。细胞可以是受试者中的多个细胞。受试者可以是动物。受试者可以是哺乳动物。受试者可以是人。

在一些实施例中，多个细胞是来自器官、组织或生物体的细胞。在用于本文披露的方法之前，可以从受试者取出所述多个细胞，例如通过手术切除、通过静脉穿刺等。所述多个细胞可以来自细胞培养物。本文披露的方法可用于受试者中的多个细胞，例如，将如本文所披露的剂量施用至包含多个细胞的受试者。包含多个细胞的受试者可以是水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等))、农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、或人。在一些实施例中，受试者是有需要的受试者，并且由本文披露方法的环状多核糖核苷酸产生的蛋白质治疗所述受试者。

受试者

本发明方法中的受试者可以是动物。在一些实施例中，受试者是动物细胞。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟(例如，鹦鹉)、狮子、老虎和熊等))、来自农场或役用动物(马、牛(例如，奶牛和肉牛)、猪、鸡、火鸡、母鸡或公鸡、山羊、绵羊等)、或人。

在一些实施例中，如本文所披露的细胞在如本文所披露的受试者中。

在一些实施例中，受试者是有需要的受试者，并且由本文披露方法的环状多核糖核苷酸产生的蛋白质治疗所述受试者。

编号的实施例#1

[1]一种在细胞中表达蛋白质的方法，其包括：

向所述细胞提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞表达第一水平的所述蛋白质；并且

向所述细胞提供包含所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞表达第二水平的所述蛋白质，并且所述第二水平至少与所述第一水平一样多；

从而将所述细胞中的所述蛋白质表达至少维持在所述蛋白质的第一水平。

[2]一种在细胞中表达蛋白质的方法，其包括：

向所述细胞提供包含所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞表达第二水平的所述蛋白质，并且所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

[3]一种在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

向所述细胞提供包含所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供所述第一组合物后包含第一水平的所述环状多核糖核苷酸；并且

向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的所述环状多核糖核苷酸，并且所述环状多核糖核苷酸的所述第二水平至少与所述第一水平一样多；

从而将所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸至少维持在所述第一水平。

[4]一种在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞包含第二水平的所述环状多核糖核苷酸，并且在提供所述第二组合物后，环状多核糖核苷酸的所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

[5]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：

向所述细胞提供编码所述蛋白质的所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物后包含所述蛋白质的水平；并且

在所述第一组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少包含所述蛋白质的水平；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞中所述蛋白质水平的表达。

[6]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：

在所述第一组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞包含在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；

[7]一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞在提供所述第一组合物后包含所述环状多核糖核苷酸的水平；并且

向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞在提供所述第二组合物后至少包含所述环状多核糖核苷酸的水平；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述线性对应物水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸水平。

[8]一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞在提供所述第二组合物后包含变化不超过所述环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；

[9]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。

[10]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。

[11]如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将所述细胞中的所述蛋白质表达至少维持在蛋白质的第一水平。

[12]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前。

[13]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前。

[14]如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

[15]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到通过提供所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平之前。

[16]如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而在提供所述第三组合物后将所述环状多核糖核苷酸的水平至少维持在所述第一水平。

[17]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述细胞中的所述第一和第二组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平之前。

[18]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一和第二组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平降低超过50％之前。

[19]如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

[20]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质水平之后。

[21]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞提供了所述第二组合物。

[22]如前述实施例中任一项所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸的水平之后。

[23]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述多个中基本上检测不到由所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月或1年，向所述细胞提供了所述第二组合物。

[24]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[25]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[26]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第三组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[27]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第一组合物和所述第二组合物包含大约相同量的所述环状多核糖核苷酸。

[28]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第一组合物比所述第二组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸。

[29]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第一组合物比所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸。

[30]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量变化不超过所述第一组合物的环状多核糖核苷酸量的1％、5％、10％、15％、20％或25％。

[31]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比所述第一组合物的环状多核糖核苷酸的量少不超过1％、5％、10％、15％、20％或25％。

[32]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平。

[33]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

[34]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第二水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[35]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[36]如前述实施例中任一项所述的方法，其中对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[37]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

[38]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

[39]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。

[40]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。

[41]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述细胞中蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[42]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后所述细胞中蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[43]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[44]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[45]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平。

[46]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

[47]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述环状多核糖核苷酸的第二水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[48]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述环状多核糖核苷酸的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[49]如前述实施例中任一项所述的方法，其中对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述环状多核糖核苷酸的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[50]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的。

[51]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的。

[52]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。

[53]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。

[54]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[55]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[56]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[57]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[58]如前述实施例中任一项所述的方法，其中将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

[59]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[60]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[61]如前述实施例中任一项所述的方法，其中将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中所述环状多核糖核苷酸的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

[62]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[63]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述多个中的所述环状多核糖核苷酸水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述多个中的所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[64]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。

[65]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。

[66]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性。

[67]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是人因子VIII、人因子IX、REP1、腺苷脱氨酶、人NGF、核编码的ND4、SECRA2a、SUMO1、VEGF、PDE6A、p53、PBFD、ARSA、ABCD1、APOE4、RPGR、DCLRE1C、VEGF 165、PDGF-B、γ-肌聚糖、肌营养不良蛋白、LAMP2B、CNGB3、视网膜色素变性GTPase调节子或CLN6。

[68]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。

[69]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。

[70]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

[71]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

[72]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是受试者中的多个细胞。

[73]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者是动物。

[74]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

[75]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

[76]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步在表达序列的3’端处包含交错元件，并且缺少终止元件。

[77]如实施例[76]所述的方法，其中所述交错元件在所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中使核糖体停滞。

[78]如实施例[76]或[77]所述的方法，其中所述交错元件编码具有C末端共有序列为D(V/I)ExNPGP的序列，其中x＝任何氨基酸。

[79]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。

[80]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述一个或多个表达序列包含科扎克起始序列。

[81]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含选自以下的至少一种结构元件：

(a)加密原；

(b)调控元件；

(c)复制元件；以及

(d)准双链二级结构。

[82]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的功能特征：

(i)高于线性对应物的翻译效率；

(ii)多种翻译产物的化学计量翻译效率；

(iii)低于缺少加密原的对应物的免疫原性；

(iv)相比线性对应物增加的半衰期；以及

(v)细胞分裂过程中的持续性。

[83]如实施例[76]所述的方法，其中所述终止元件包含终止密码子。

[84]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为介导所述环状多核糖核苷酸的自我复制的复制结构域

[85]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸在细胞分裂过程中持续。

编号的实施例#2

[1]一种在细胞中表达蛋白质的方法，其包括：

[2]一种在细胞中表达蛋白质的方法，其包括：

[3]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：

[4]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中的蛋白质水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：

[5]如实施例[1]或[2]中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前。

[6]如实施例[1]-[2]中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。

[7]如实施例[1]-[2]或[5]-[6]中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将所述细胞中的所述蛋白质表达至少维持在蛋白质的第一水平。

[8]如实施例[7]所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前。

[9]如实施例[7]所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前。

[10]如前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

[11]如实施例[3]或[4]中任一项所述的方法，其中在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向所述细胞提供所述第二组合物。

[12]如实施例[1]、[2]或[5]-[10]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平。

[13]如实施例[1]、[2]或[5]-[10]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

[14]如实施例[13]所述的方法，其中在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第二水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[15]如实施例[13]或[14]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述蛋白质的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[16]如实施例[15]所述的方法，其中对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[17]如实施例[1]、[2]或[5]-[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

[18]如实施例[1]、[2]或[5]-[10]中任一项所述的方法，其中在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

[19]如实施例[1]、[2]、[5]、[7]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平。

[20]如实施例[7]、[8]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物、将第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平。

[21]如实施例[1]、[2]、[5]、[7]、[8]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述细胞中蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[22]如实施例[7]、[8]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后所述细胞中产生的蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[23]如实施例[1]、[2]、[5]、[7]、[8]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[24]如实施例[7]、[8]或[10]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[25]如实施例[3]、[4]、[10]或[11]中任一项所述的方法，其中将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

[26]如实施例[3]、[4]、[10]或[11]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[27]如实施例[3]、[4]、[10]或[11]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[28]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。

[29]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。

[30]如实施例[28]或[29]中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子换能器活性、营养储库活性、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性；b)是分子功能调节物；或者c)用作蛋白质标签。

[31]如实施例[28]-[30]中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是人因子VIII、人因子IX、REP1、腺苷脱氨酶、人NGF、核编码的ND4、SECRA2a、SUMO1、VEGF、PDE6A、p53、PBFD、ARSA、ABCD1、APOE4、RPGR、DCLRE1C、VEGF 165、PDGF-B、γ-肌聚糖、肌营养不良蛋白、LAMP2B、CNGB3、视网膜色素变性GTPase调节子或CLN6。

[32]一种在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

[33]一种在细胞中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

[34]一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

[35]一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

[36]如实施例[32]或[33]中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到通过提供所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平之前。

[37]如实施例[32]、[33]或[36]中任一项所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸的水平之后。

[38]如实施例[32]、[33]、[36]或[37]中任一项所述的方法，其中在基本上检测不到由所述第一组合物产生的所述多个中所述环状多核糖核苷酸水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向所述细胞提供所述第二组合物。

[39]如实施例[32]、[33]或[36]-[38]中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而在提供所述第三组合物后将所述环状多核糖核苷酸的水平至少维持在所述第一水平。

[40]如实施例[32]、[33]或[36]-[39]中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述细胞中的所述第一和第二组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平之前。

[41]如实施例[32]、3[3]或[36]-[40]所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一和第二组合物产生的所述环状多核糖核苷酸水平降低超过50％之前。

[42]如实施例[32]-[41]中任一项所述的方法，其进一步包括向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

[43]如实施例[34]或[35]中任一项所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质水平之后。

[44]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平。

[45]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中由所述第一组合物产生的所述环状多核糖核苷酸的水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

[46]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，由所述第二组合物产生的所述环状多核糖核苷酸的水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[47]如实施例[39]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述环状多核糖核苷酸的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[48]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后表达的所述环状多核糖核苷酸的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[49]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的。

[50]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的。

[51]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。

[52]如实施例[39]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平。

[53]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[54]如实施例[39]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后所述细胞中环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[55]如实施例[32]、[33]或[36]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[56]如实施例[39]-[42]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后所述环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[57]如实施例[34]、[35]或[43]中任一项所述的方法，其中将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中所述环状多核糖核苷酸的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

[58]如实施例[34]、[35]或[43]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[59]如实施例[34]、[35]或[43]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述多个中的所述环状多核糖核苷酸水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述多个中的所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[60]如实施例[32]-[59]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含靶的结合位点，编码蛋白质，或两者。

[61]一种在细胞中结合靶的方法，其包括：

向所述细胞提供包含含有结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述靶以第一水平与结合位点结合；并且

向所述细胞提供包含所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述靶以第二水平与所述结合位点结合，并且所述第二水平至少与所述第一水平一样多；

从而将所述细胞中所述靶的结合至少维持在结合的第一水平。

[62]一种在细胞中结合靶的方法，其包括：

向所述细胞提供包含含有结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述靶以第一水平与所述结合位点结合；并且

向所述细胞提供包含所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述靶以第二水平与所述结合位点结合，并且所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

[63]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中与靶的结合水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中结合靶的方法，其包括：

向所述细胞提供包含结合位点的所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物后，所述细胞包含与所述靶的所述结合水平；并且

在所述第一组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少包含与所述靶的所述结合水平；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中与所述靶的结合水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞中与所述靶的结合水平。

[64]一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞中与靶的结合水平相比，在向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞中结合靶的方法，其包括：

在所述第一组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞包含在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平的与靶结合；

[65]如实施例[61]或[62]中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一组合物产生的结合的第一水平之前。

[66]如实施例[61]、[62]或[65]中任一项所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前。

[67]如实施例[61]、[62]、[65]或[66]中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将所述细胞中所述靶的结合至少维持在结合的第一水平。

[68]如实施例[67]所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中基本上检测不到由所述第一和第二组合物在所述细胞中对所述靶的结合的第二水平之前。

[69]如实施例[67]或[68]中任一项所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞中由所述第一和第二组合物产生的所述结合的第二水平降低超过50％之前。

[70]如实施例[61]-[69]中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

[71]如实施例[63]、[64]或[70]中任一项所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在基本上检测不到由所述第一组合物产生的结合水平之后。

[72]如实施例[63]、[64]、[70]或[71]中任一项所述的方法，其中在基本上检测不到由所述第一组合物的结合水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向所述细胞提供所述第二组合物。

[73]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中结合的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述结合的最高水平。

[74]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中所述结合的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述结合的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

[75]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，结合的第二水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[76]如实施例[67]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，所述结合的第三水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[77]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或40天，在每种后续组合物后结合的后续水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

[78]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后结合的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中结合的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的。

[79]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在所述第一组合物后提供每种后续组合物后结合的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中结合的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的。

[80]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述结合的第一水平。

[81]如实施例[67]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或35天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述结合的第一水平。

[82]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述细胞中结合的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞中结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[83]如实施例[67]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后所述细胞中结合的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中结合的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[84]如实施例[61]、[62]或[65]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天结合的第二水平比在提供所述第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[85]如实施例[67]-[70]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天结合的第三水平比在提供所述第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[86]如实施例[63]、[64]或[70]-[72]中任一项所述的方法，其中将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中结合的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。

[87]如实施例[63]、[64]或[70]-[72]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的结合水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[88]如实施例[63]、[64]或[70]-[72]中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的结合水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

[89]如实施例[1]-[88]中任一项所述的方法，其中所述第一组合物和所述第二组合物包含大约相同量的所述环状多核糖核苷酸。

[90]如实施例[1]-[89]中任一项所述的方法，其中所述第一组合物比所述第二组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸。

[91]如实施例[1]-[90]中任一项所述的方法，其中所述第一组合物比第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸。

[92]如实施例[1]-[91]中任一项所述的方法，其中所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量变化不超过所述第一组合物的环状多核糖核苷酸量的1％、5％、10％、15％、20％或25％。

[93]如实施例[1]-[92]中任一项所述的方法，其中所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比所述第一组合物的环状多核糖核苷酸的量少不超过1％、5％、10％、15％、20％或25％。

[94]如实施例[1]-[93]中任一项所述的方法，其中所述第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[95]如实施例[1]-[94]中任一项所述的方法，其中所述第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[96]如实施例[1]-[95]中任一项所述的方法，其中所述第三组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[97]如实施例[1]-[96]中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。

[98]如实施例[1]-[97]中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。

[99]如实施例[1]-[98]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

[100]如实施例[1]-[99]中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

[101]如实施例[1]-[100]中任一项所述的方法，其中所述细胞是受试者中的多个细胞。

[102]如实施例[1]-[101]中任一项所述的方法，其中所述受试者是动物。

[103]如实施例[1]-[102]中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

[104]如实施例[1]-[103]中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

[105]如实施例[1]-[104]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步在表达序列的3’端处包含交错元件，并且缺少终止元件。

[106]如实施例[105]所述的方法，其中所述交错元件在所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中使核糖体停滞。

[107]如实施例[105]或[106]所述的方法，其中所述交错元件编码具有C末端共有序列为D(V/I)ExNPGP的序列，其中x＝任何氨基酸。

[108]如实施例[1]-[107]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点、聚A尾、复制元件、或其任何组合。

[109]如实施例[1]-[108]中任一项所述的方法，其中所述一个或多个表达序列包含科扎克起始序列。

[110]如实施例[1]-[109]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含选自以下的至少一种结构元件：

(a)加密原；

(b)调控元件；

(c)复制元件；以及

(d)准双链二级结构。

[111]如实施例[1]-[110]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含选自以下的至少一种功能特征：

(i)高于线性对应物的翻译效率；

(ii)多种翻译产物的化学计量翻译效率；

(iii)低于缺少加密原的对应物的免疫原性；

(iv)相比线性对应物增加的半衰期；以及

(v)细胞分裂过程中的持续性。

[112]如实施例[105]所述的方法，其中所述终止元件包含终止密码子。

[113]如实施例[1]-[112]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为介导所述环状多核糖核苷酸的自我复制的复制结构域。

[114]如实施例[1]-[113]中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸在细胞分裂过程中持续。

[115]一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述受试者中的应答水平相比，在向所述受试者提供环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述受试者中诱导应答水平的方法，其包括：

向所述受试者提供编码蛋白质和/或包含诱导所述应答水平的结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述受试者在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物后包含所述应答水平；并且

在所述第一组合物后向所述受试者提供编码蛋白质和/或包含结合位点的所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述受试者在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少包含所述应答水平；

[116]从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述受试者中的所述应答水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述受试者中的所述应答水平的表达。一种在受试者中诱导应答水平的方法，其包括：

(a)提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，所述环状多核糖核苷酸编码蛋白质和/或包含对所述受试者诱导所述应答的结合位点；并且

(b)在步骤(a)后6小时至90天，向所述受试者提供包含编码所述蛋白质和/或包含结合位点的环状多核糖核苷酸的第二组合物，

从而在提供所述第一组合物后并且在提供所述第二组合物后在所述受试者中诱导所述应答。

[117]一种在受试者中诱导应答的方法，其包括：

(a)提供包含环状多核糖核苷酸的第一组合物，所述环状多核糖核苷酸编码蛋白质和/或包含对所述受试者诱导所述应答的结合位点，其中所述应答处于第一水平；并且

(b)在步骤(a)后6小时至90天，向所述受试者提供包含编码所述蛋白质和/或包含诱导所述应答的结合位点的环状多核糖核苷酸的第二组合物。

[118]如实施例[115]-[117]中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是促红细胞生成素。

[119]如[115]-[118]中任一项所述的方法，其中所述应答是产生红细胞，或者所述应答水平是产生的红细胞的水平。

实例

提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实例1：体内施用环状RNA并显示出更长半衰期/增加的稳定性

此实例展示了在体内，与线性RNA相比，递送环状RNA的能力和环状RNA的增加稳定性。

对于此实例，环状RNA被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(Nluc)的ORF和交错序列的EMCV IRES(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A无终止和EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A终止)。在体外生成环状RNA。

经由静脉内(IV)尾静脉施用，向Balb/c小鼠注射具有Nluc ORF的环状RNA或作为对照的线性RNA。根据制造商的说明，使动物接受在基于脂质的转染试剂(米卢斯公司(Mirus))中配制的单剂5μg RNA。

处死小鼠，并且在给药后3、4和7天收集肝脏(n＝2只小鼠/时间点)。收集肝脏并将其储存在RNA稳定试剂(英杰公司(Invitrogen))中。使用微管匀浆器(赛默飞世尔科技公司)在RIPA缓冲液中匀质处理组织，并使用酚基RNA提取试剂提取RNA用于cDNA合成。使用qPCR以测量肝脏中线性RNA和环状RNA的存在。

通过qPCR在组织中进行RNA检测。为了检测扩增的线性和环状RNA引物，使用了Nluc ORF。(F：AGATTTCGTTGGGGACTGGC，R：CACCGCTCAGGACAATCCTT)。为了仅检测环状RNA，扩增5’-3’接合点的引物允许检测环状而非线性RNA构建体(F：CTGGAGACGTGGAGGAGAAC，R：CCAAAAGACGGCAATATGGT)。

在注射后3、4和7天，在小鼠肝脏中检测到的环状RNA水平高于线性RNA(图1)。因此，施用环状RNA并且在施用后至少7天可在体内检测到。

实例2：环状RNA的体内表达、半衰期和非免疫原性

此实例展示了环状RNA体内驱动表达的能力。它展示了与线性RNA相比，环状RNA的半衰期增加。最后，它展示了环状RNA被工程化为在体内为非免疫原性的。

对于此实例，环状RNA包括CVB3 IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF和两个侧接IRES-ORF的间隔元件。

在体外生成环状RNA。未修饰的线性RNA从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。将转录的RNA用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并且再次用RNA纯化柱纯化。使用夹板DNA(GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC)和T4RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无RNA酶的水中。

使小鼠接受2.5μg具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA、或作为对照的线性RNA(两者均在作为载体的基于脂质的转染试剂(米卢斯公司)中配制)的单剂尾静脉注射。

在给药后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司(Thermo Scientific Pierce))测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司(Promega))中读取板。

在给药环状RNA后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图2A和图2B)。

相比之下，高斯萤光素酶活性仅在给药经修饰的线性RNA后1和2天在血浆中检测到。在第6天或以后，未检测到高于背景水平的线性RNA衍生蛋白的酶活性(图2A和图2B)。

在第16天，切开三只动物的肝脏，并且使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司(BioRad))进行qRT-PCR分析。

如图3中所示，在第16天，在肝脏和脾脏两者中均检测到环状RNA而非线性RNA的qRT-PCR水平。如图4中所示，在第16天与载体转染的动物相比，用线性RNA转染的肝脏的免疫相关基因显示出RIG-I、MDA5、IFN-B和OAS的增加表达，而用环状RNA转染的肝脏未显示出这些标记物的RIG-I、MDA5、PKR、和IFN-β的增加表达。因此，在来自转染肝脏的环状RNA中不存在受体细胞中免疫原性相关基因的诱导。

此实例展示了环状RNA在更长时间段内体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。鉴于高斯萤光素酶在小鼠血浆中的半衰期是约20min(参见Tannous,Nat Protoc.[自然实验手册],2009,4(4):582-591)，相似的活性水平指示环状RNA的连续表达。此外，环状RNA显示出比其经修饰的线性RNA对应物更长的表达谱，而不诱导免疫相关基因。

实例3：环状RNA的体内再给药

此实例展示了使用两剂环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。

对于此实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF和两个侧接IRES-ORF的间隔元件。

在体外生成环状RNA。未修饰的线性RNA从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。转录的RNA用Monarch RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用Monarch RNA清除系统纯化。使用夹板DNA(GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG)和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过Urea-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠、0.1％SDS、1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号AM7000)中。

小鼠在第0天接受单剂尾静脉注射0.25μg具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA，或作为对照的线性RNA，二者均在作为载体的基于脂质的转染试剂(米卢斯公司)中配制，第56天施用第二剂。

在给药后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。

在第一剂环状RNA给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图5)。

相反，仅在经修饰的线性RNA给药后1和2天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图5)。

在第二剂环状RNA给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图5)。

相反，仅在经修饰的线性RNA给药后1、2、3天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。

此实例展示了环状RNA在更长时间段内体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。

实例4：环状RNA的体内交错给药

此实例展示了使用连续交错剂量的环状RNA在体内驱动环状RNA更高表达的能力。

在第0天、第2天和第5天，小鼠接受一剂尾静脉注射0.25pmol具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA，或作为对照的线性RNA，二者均在作为载体的基于脂质的转染试剂(米卢斯公司)中配制。

在给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28、35、42天，从每只小鼠的尾静脉中收集血样(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25分钟分离血浆，并使用高斯萤光素酶活性测定法(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X GLuc底物添加到5μl血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。

在单剂环状RNA给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图6和图7)。当给药3个剂量时，在第一剂环状RNA给药后6小时、1、2、3、5、7、14、21、28、35天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图6和图7)。

相反，仅在经修饰的线性RNA给药后6小时、1、2、3天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性并且表达水平不会增加超过其初始剂量。即使另外的线性RNA给药，在第x天或之后仍未检测到高于本底水平的来自线性RNA来源的蛋白质的酶活性(图6和图7)。

此实例展示了环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，在多次注射后血浆中的蛋白质活性水平增加。另外，证明环状RNA而不是线性RNA的重复给药引起表达。

实例5：经由静脉内递送裸剂量和载体剂量以及重复剂量(redose)的环状RNA

此实例展示了使用两剂静脉内施用的环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。

在此实例中，经修饰的mRNA由三联生物技术公司(Trilink Biotechnologies)定制合成，并包括上面列出的所有基序。在此实例中，RNA用假尿苷和5-甲基-C完全取代，用CleanCap^TMAG加帽并被聚腺苷酸化(120A)。

为了生成未配制的RNA，然后将环状RNA和mRNA在100μL PBS中稀释到0.25皮摩尔的最终浓度。

还使用阳离子脂质载体配制环状RNA和mRNA。在此实例中，根据制造商的说明，将15％TransIT(米卢斯生物公司(Mirus Bio))和7.5％Boost与RNA复合。

小鼠接受每种配制品中0.25皮摩尔具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA的单尾静脉注射剂量。在第0天进行注射，并在第49天施用第二剂。使用仅媒介物作为对照。

在给药后1、2、7、11、16和23天，通过颏下穿刺将血样(50μL)收集到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1X GLuc底物添加到5μL血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。

在第一剂未配制和TransIT配制的环状RNA两者给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图8)。

相反，仅在未配制和TransIT配制的经修饰的mRNA两者给药后1和2天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图8)。

在第二剂未配制和TransIT配制的环状RNA两者给药后1、2、3、8、14和21天再次在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图8)。

相反，仅在未配制和TransIT配制的经修饰的mRNA两者给药后后1、2和3天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图8)。

在每种情况下，高斯萤光素酶活性高于仅媒介物的对照。

此实例展示了在具有和无载体的情况下，静脉内施用的环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。

实例6：经由肌肉内注射裸剂量和重复剂量的环状RNA

此实例展示了使用两剂肌肉内施用的环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。

如实例5中所述生成环状RNA和mRNA。

为了生成未配制的RNA，然后将环状RNA和mRNA在100μL PBS中稀释到2.5皮摩尔的最终浓度。

小鼠接受向后腿单次肌肉内注射2.5皮摩尔的具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA。在第0天进行注射，并在第49天施用第二剂。使用仅媒介物作为对照。

在第一剂未配制的环状RNA给药后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。(图9)

相反，仅在未配制的mRNA给药后1和2天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。(图9)

在第二剂未配制的环状RNA给药后2、3、8和15天再次在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。(图9)

相反，仅在未配制的经修饰的mRNA给药后1、2和3天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。(图9)

在每种情况下，高斯萤光素酶活性高于仅媒介物的对照。

此实例展示了无载体的肌肉内施用的环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。

实例7：静脉内重复注射五次载体重复剂量的环状RNA引起功能性蛋白质的表达

此实例展示了使用五剂静脉内施用的环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。

如实例5中所述生成环状RNA和mRNA。

使用阳离子脂质载体配制环状RNA和mRNA。在此实例中，根据制造商的说明，将10％TransIT(米卢斯生物公司)和5％Boost与RNA复合。

小鼠接受0.25皮摩尔包括高斯萤光素酶ORF的环状RNA的单尾静脉注射剂量。注射在以下时间进行：第0天、第71天、第120天、第196天和第359天。使用仅媒介物作为对照。

在给药后0.25、1、2、3、7、14、21、28和35天，通过颏下穿刺将血样(50μL)收集到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μL 1X GLuc底物添加到5μL血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。

当用Trans-IT配制的环状RNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯萤光素酶活性：第一剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；第二剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第三剂给药后第1、2、3、7、14和21天；第四剂给药后第1、2、3、7、14、21和28天；以及，第五剂给药后第1、2、3、7、14和21天。(图10)

相反，当用Trans-IT配制的经修饰的mRNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯萤光素酶活性：第一剂给药后第0.25、1和2天；第二剂给药后第0.25、1和2天；第三剂给药后第0.25、1和2天；第四剂给药后第0.25、1和2天；以及，第五剂给药后第0.25、1和2天。(图10)

在每种情况下，环状RNA的高斯萤光素酶活性高于mRNA并且因此表达也高于mRNA。

此实例展示了静脉内施用的环状RNA在更长时间段中在体内表达蛋白质，以及在注射后数天血浆中的蛋白质活性水平，并且可以再给药至少5次。另外，证明环状RNA长期再给药产生了相似的表达谱。

实例8：载体再给药(5X)IV-毒性

此实例展示了在超过一年的时间内五次静脉内给药环状RNA的无毒效果。

如实例5中所述生成环状RNA和mRNA。

小鼠接受每种配制品中0.25皮摩尔编码高斯萤光素酶的环状RNA的单尾静脉注射剂量。注射在以下时间进行：第0天、第71天、第120天、第196天和第359天。使用仅媒介物作为对照。

在第399天处死小鼠，并且将肝脏、脾脏、肺和胆囊固定在福尔马林中。将每块切片一张，并用苏木精和伊红(H&E)染色。载玻片由ACVP委员会认证的兽医病理学家使用光学显微镜进行评估。每个组织的组织学检查结果按严重程度0-5进行分级，其中0＝无，1＝最低，2＝轻度，3＝中度，4＝显著，5＝重度。

当五次给药Trans-IT配制的环状RNA时，在肝脏、脾脏、肺和胆囊中观察到最低至轻度的组织学变化。几乎所有的组织病理学发现(表1)都出现在对照(载体对照和/或未治疗对照)、环状RNA和mRNA注射的动物中。所有发现都与背景、死亡前后或与测试的RNA毒性无关的非特异性变化一致

此实例展示了环状RNA可以重复给药超过一年，而没有组织病理学毒性的迹象。

表1-当五次给药Trans-IT配制的环状RNA时，在肝脏、脾脏、肺和胆囊中观察到最低至轻度的组织学变化

实例9：载体交错再给药(X2)-GLuc活动

此实例展示了通过再给药连续交错剂量的环状RNA驱动环状RNA表达的能力。

如实例5中所述生成环状RNA和mRNA。

还使用阳离子脂质载体配制环状RNA和mRNA。在此实例中，根据制造商的说明，将10％TransIT(米卢斯生物公司)和5％Boost与RNA复合。

小鼠接受0.25皮摩尔具有高斯萤光素酶ORF的经配制环状RNA和经修饰mRNA的单尾静脉注射剂量。注射分批次进行：第一批在第0天、第2天和第5天；并且第二批在第71天、第73天和第76天。使用仅媒介物作为对照。

当用Trans-IT配制的环状RNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯萤光素酶活性：第一剂批次1的第1、2、3、7、14、21、28和35天；以及第一剂批次2给药后第1、2、3、7、14、21、28和35天(图11)。

相反，当用Trans-IT配制的经修饰的mRNA给药时，在以下时间点在血浆中检测到高斯萤光素酶活性：第一剂批次1的第0.25、1、2和3天；以及第一剂批次2给药后第0.25、1和2天(图11)。

与mRNA对应物相比，当从环状RNA表达时，高斯萤光素酶的活性更高。

此实例展示了环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，在多次连续注射后血浆中的蛋白质活性水平增加。它证明环状RNA而不是线性RNA的重复给药引起表达。另外，证明环状RNA长期再给药产生了相似的表达谱。

实例10：IV注射的治疗相关环状多核糖核苷酸的TransIT剂量和重复剂量

此实例展示了使用两剂静脉内施用的治疗相关环状RNA驱动体内环状RNA表达的能力。

对于此实例，环状RNA包括EMCV IRES、编码促红细胞生成素(EPO)的ORF和两个侧接IRES-ORF的间隔元件。

在体外生成环状RNA。未修饰的线性RNA从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。转录的RNA用Monarch RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH，新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用Monarch RNA清除系统纯化。使用夹板DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。环状RNA经过Urea-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠、0.1％SDS、1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号AM7000)中。

在此实例中，经修饰的mRNA包括5’和3’珠蛋白UTR，其侧接环状RNA中编码的同一EPO ORF核苷酸序列。mRNA核苷酸用假尿苷和5-甲基-C完全取代，用CleanCap^TMAG加帽并聚腺苷酸化(90A)。

在一种配制品中，使用阳离子脂质载体配制环状RNA和mRNA。在此实例中，根据制造商的说明，以100uL最终注射体积将15％TransIT(米卢斯生物公司)和7.5％Boost与25pmol RNA复合。

还测试了未配制的环状RNA和mRNA。在此实例中，使用PBS将25pmol的每种RNA稀释至100uL的最终体积。

小鼠在第0天接受25皮摩尔的单尾静脉注射剂量，并在第79天施用第二次剂量。使用仅媒介物作为对照。

在第一次给药后第1、2、3、5、7、21、28和35天以及第二次给药后第1、2、3、5和7天，从小鼠尾部将血样(40uL)收集到EDTA管中。将全血用网织红细胞计数试剂(BD)染色30分钟，并在流式细胞仪上采集。分析仅限于落入前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)门内的红细胞(RBC)群体，获得了50000个事件。网织红细胞报告为总RBC群体中阳性染色细胞的百分比。

在第一剂给药后3、5、7、14、21和28天，在全血中检测到网织红细胞的数量增加，之后在我们的小鼠群体中网织红细胞计数恢复到3％-5％的正常范围(图12为未配制的且图13为TransIT配制的)。

在第二剂给药后，与仅媒介物对照相比，当用TransIT配制时，对于环状RNA给药和mRNA给药检测到网织红细胞计数增加。与治疗相关EPOGEN剂量相比，mRNA和环状RNA两者的这种增加更大且更持续；并且环状RNA的增加比mRNA给药更大且更持续(图14)。

另外，在第二剂给药后，与仅媒介物对照相比，当未配制时，对于环状RNA给药和mRNA给药检测到网织红细胞计数增加。在第5天和第7天，由环状RNA和mRNA诱导的网织红细胞计数大于治疗相关EPOGEN剂量，证明了更持续的治疗效果(图15)。由环状RNA诱导的治疗效果大于mRNA。

此实例表明，编码hEPO的环状RNA引发的生物学效应高于对等剂量mRNA所看到的生物学效应。在第1剂和第2剂之间，每次治疗的应答幅度非常相似，对于环状RNA为大约25％，对于mRNA为18％-20％。

此实例展示了与载体一起静脉内施用的编码治疗相关ORF的环状RNA在更长时间段中体内表达蛋白质，从而导致在注射后数天观察到的生理效应。另外，证明环状RNA的再给药产生了相似的表达谱。

实例11：体外环状RNA产生

此实例描述了环状RNA的体外产生。

环状RNA被设计为具有图16中所示的起始密码子(SEQ ID NO:1)、一个或多个ORF(SEQ ID NO:2)、一个或多个交错元件(SEQ ID NO:3)、一个或多个加密原(SEQ ID NO:4)、和IRES(SEQ ID NO:5)。环化使得能够滚环翻译多个开放阅读框(ORF)，所述多个开放阅读框具有用于离散ORF表达和受控的蛋白质化学计量的交替性交错元件、用于减弱或减轻RNA免疫原性的一个或多个加密原、以及靶向RNA用于核糖体进入的任选IRES，而没有聚A序列。

在此实例中，如下生成环状RNA。使用T7 RNA聚合酶，通过体外转录由具有5’-和3’-ZKSCAN1内含子和编码连接至2A序列的GFP的ORF的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司，EF0652)处理，并且再次用RNA纯化系统纯化。

通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New England Bio,Inc.)，M0202M)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成夹板连接环状RNA，并且在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。

实例12：体内环状RNA产生，细胞培养

此实例描述了环状RNA的体内产生。

将GFP(SEQ ID NO:2)克隆至表达载体，例如pcDNA3.1(+)(阿德基因公司(Addgene))(SEQ ID NO:6)中。将此载体诱变以诱导细胞中的环状RNA产生(SEQ ID NO:6且如Kramer等人2015所述)，如图17中所示。

将HeLa细胞在37℃和5％CO₂下，在补充有青霉素-链霉素和10％胎牛血清、含高葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格培养基(DMEM)(生命技术公司(Life Technologies))中生长。使用脂质转染试剂(生命技术公司)转染一微克上述表达质粒，并且根据制造商的说明，在转染后的1小时与20天之间，使用基于酚的RNA分离试剂(生命技术公司)从转染的细胞中分离总RNA。

为了测量GFP环状RNA和mRNA水平，使用随机六聚体进行qPCR逆转录。简而言之，对于RT-qPCR，将来自同一来源的Hela细胞的总RNA和RNA酶R消化的RNA用作RT-PCR的模板。为了制备GFP mRNA和环状GFP RNA的cDNA，根据制造商的说明，使用逆转录酶(Super-ScriptII:RNA酶H；英杰公司)和随机六聚体进行逆转录反应。使用6％PAGE分析扩增的PCR产物，并且通过溴化乙锭染色可视化。为了估算富集因子，通过光密度法(ImageQuant；分子动力学公司(Molecular Dynamics))定量PCR产物，并且通过UV吸光度测量总RNA样品的浓度。

用RNA印迹分析进行另外的RNA测量。简言之，使用基于酚的试剂(TRIzol)获得全细胞提取物，或者使用商业试剂盒(CelLytic核提取试剂盒，西格玛公司(Sigma))对细胞进行分级分离来获得核蛋白提取物和细胞质蛋白提取物。为了抑制RNA聚合酶II转录，在37℃下用夫拉平度(flavopiridol)(终浓度1mM；西格玛公司)处理细胞0-6h。对于RNA酶R处理，将10mg的总RNA用20U的RNA酶R(奕必城公司(Epicentre))在37℃下处理1h。

使用寡核苷酸探针的RNA印迹如下进行。使用标准引物设计工具设计寡核苷酸探针、PCR引物。将T7启动子序列添加至反向引物以获得体外转录反应中的反义探针。根据制造商的说明，使用T7 RNA聚合酶与DIG-RNA标记混合物进行体外转录。通过DNA I消化去除DNA模板，并且通过酚氯仿提取和随后的沉淀纯化RNA探针。探针以50ng/ml使用。使用乙二醛上样染料(安拜昂公司(Ambion))使总RNA(2μg-10μg)变性，并且在MOPS缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶上解析。将凝胶在1×TBE中浸泡20min，并且使用半干印迹系统(伯乐公司(Bio-Rad))将其转移至Hybond-N+膜(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上持续1h(15V)。将膜干燥，并且在120,000μJ cm-2下进行1次UV交联(在265nm)。在68℃下进行预杂交1h，并且将DIG标记的体外转录的RNA探针杂交过夜。将膜在2×SSC、0.1％SDS中在68℃下洗涤三次持续30min，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在68℃下洗涤三次(30min)。用与碱性磷酸酶抗体直接缀合的抗DIG进行免疫检测。使用化学发光碱性磷酸酶底物(CDP star试剂)和图像检测和定量系统(LAS-4000检测系统)可视化免疫反应条带。

实例13：环状RNA的制备和体外翻译

此实例描述了环状RNA的基因表达和基因产物的检测。

在此实例中，环状RNA被设计为具有起始密码子(SEQ ID NO:1)、GFP ORF(SEQ IDNO:2)、一个或多个交错元件(SEQ ID NO:3)、一个或多个人源加密原(SEQ ID NO:4)且具有或不具有IRES(SEQ ID NO:5)，参见图18。在此实例中，在体外或细胞中生成环状RNA，如实例10和11中所述。

将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡(Fitchburg,WI,USA))中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μM甲硫氨酸和亮氨酸、20μM除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8U/μLRNA酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪(Toyobo,Osaka,Japan))。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶(安进公司，日本东京(Atto,Tokyo,Japan))上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl，pH 6.8，4％SDS，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。

以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博公司(Millipore))之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司(Rockland))可视化印迹。

预期GFP蛋白在细胞裂解物中可视化，并且由于滚环翻译，在环状RNA中检测到比线性RNA中更高的数量。

实例14：环状RNA的化学计量蛋白质表达

此实例描述了环状RNA化学计量表达蛋白质的能力。

在此实例中，一种环状RNA被设计为包含加密原(SEQ ID NO:4)和编码GFP的ORF(SEQ ID NO:2)和编码RFP的ORF(SEQ ID NO:7)，具有侧接GFP和RFP ORF的交错元件(SEQID NO:3)，参见图19A类似地设计另一种环状RNA，然而它将在GFP与RFP ORF之间具有终止和起始密码子，而不是侧接2A序列，参见图19B。在体外或细胞中生成环状RNA，如实例11和12中所述。

将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡)中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μM甲硫氨酸和亮氨酸、20μM除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8U/μL RNA酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪)。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶(安进公司，日本东京)上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。

以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博公司)之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司)可视化印迹。

预期GFP和RFP ORF未被终止密码子和起始密码子隔开的环状RNA将具有相等量的每种蛋白质，而使用在ORF之间包括起始密码子和终止密码子的环状RNA处理的细胞将具有不同量的每种蛋白质。

实例15：合成环状RNA在细胞中展示了免疫原性基因表达降低

此实例展示了工程化以与线性RNA相比具有降低的免疫原性的环状RNA。

编码治疗性蛋白质的环状RNA在受体细胞中提供与线性RNA相比减少的免疫原性相关基因(RIG-I、MDA5、PKA和IFN-β)诱导。RIG-I可以识别短的5’三磷酸酯无帽双链或单链RNA，而MDA5可以识别更长的dsRNA。RIG-I和MDA5均可参与激活MAVS并且触发抗病毒应答。PKR可以被dsRNA激活，并且被干扰素(诸如IFN-β)诱导。如以下实例中所示，如通过q-PCR通过RIG-I、MDA5、PKR和IFN-β的表达评估的，显示了环状RNA在293T细胞中具有与类似线性RNA相比减少的免疫相关基因激活。

环状RNA和线性RNA被设计为编码(1)科扎克3xFLAG-EGF序列，无终止元件；(2)科扎克3xFLAG-EGF，其侧接终止元件(终止密码子)；(3)科扎克3xFLAG-EGF，其侧接2A序列；或(4)科扎克3xFLAG-EGF序列，其侧接2A序列、后接终止元件(终止密码子)。

在此实例中，通过将0.1x10⁶个细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。

使用的引物序列：用于GAPDH的引物，F：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，R：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA；RIG-I，F：TGTGGGCAATGTCATCAAAA，R：GAAGCACTTGCTACCTCTTGC；MDA5，F：GGCACCATGGGAAGTGATT，R：ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG；PKR，F：TCGCTGGTATCACTCGTCTG，R：GATTCTGAAGACCGCCAGAG；IFN-β，F：CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC，R：GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG。

如图20中所示，与线性RNA转染细胞相比，用环状RNA转染的293T细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出RIG-I、MDA5、PKR和IFN-β的降低。因此，与线性RNA转染细胞相比，在环状RNA转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。

实例16：体内表达

此实例描述了环状RNA体内表达蛋白质的能力。

对于此实例，环状RNA被设计为包含一个或多个加密原(SEQ ID NO:4)和编码GFP(SEQ ID NO:2)或RFP(SEQ ID NO:7)或萤光素酶(SEQ ID NO:8)的ORF，具有侧接GFP、RFP或萤光素酶ORF的交错元件(SEQ ID NO:3)，参见图21。在体外或细胞中生成环状RNA，如实例11和实例12中所述。

经由皮内(ID)、肌肉内(IM)、口服(PO)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)施用使6-8周龄的雄性BALB/c小鼠接受300mg/kg(6mg)如本文所述具有GFP、RFP或萤光素酶ORF的环状RNA(50uL体积)、或作为对照的线性RNA。使动物接受单次剂量或三次注射(第1天、第3天、第5天)。

从未给药的对照小鼠以及给药后2、4、8、24、48、72、96、120、168和264小时收集血液、心脏、肺、脾、肾、肝和皮肤注射位点(n＝4只小鼠/时间点)。在研究终止时从颈静脉穿刺收集血样。

使用分支DNA(bDNA)定量(潘诺米克公司(Panomics)/昂飞公司(Affymetrix))对血清和组织进行环状RNA定量。使用每个板上已知量RNA(添加至未处理的组织样品)的标准曲线来定量已处理组织中的RNA。将以皮克(pg)为单位的计算量相对于施加至板上的裂解物中的称重组织量归一化。如先前实例中所述，通过FACS或蛋白质印迹评价每个组织中的蛋白质表达(RFP或GFP)。

在给药后6、24、48、72和96小时，向独立组的已给药予萤光素酶环状RNA的小鼠注射3mg萤光素，并且在体内成像系统(IVIS光谱，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上对动物成像。在给药后6小时，处死并解剖三只动物，并且对肌肉、皮肤、引流淋巴结、肝脏和脾脏离体成像。

预期小鼠在已处理的组织中表达GFP、RFP或萤光素酶。

实例17：体内生物分布

此实例描述了控制和测量环状RNA体内生物分布的能力。

在此实例中，如实例8所述，用编码萤光素酶的环状RNA处理小鼠。简而言之，环状RNA被设计为包括一种或多种加密原(SEQ ID NO:4)和编码萤光素酶(SEQ ID NO:8)的ORF，具有侧接萤光素酶ORF的交错元件(SEQ ID NO:3)，参见图22。在体外或细胞中生成环状RNA，如实例11和12中所述。

在给药后6、24、48、72和96小时，向小鼠给与萤光素酶环状RNA(通过注射3mg萤光素)，并在体内成像系统(IVIS Spectrum，珀金埃尔默公司)上对动物成像。在给药后6小时，处死并解剖三只动物，并且对肌肉、皮肤、引流淋巴结、肝脏和脾脏离体成像

使用分支DNA(bDNA)定量(潘诺米克公司//昂飞公司)对血清和组织进行环状RNA定量。使用每个板上已知量RNA(添加至未处理的组织样品)的标准曲线来定量已处理组织中的RNA。将以皮克(pg)为单位的计算量相对于施加至板上的裂解物中的称重组织量归一化。

通过IM或ID施用，以如下四个剂量水平向独立的组的6-8周龄的雄性BALB/c小鼠给与萤光素酶环状RNA：10mg、2mg、0.4mg和0.08mg(每组数量＝6)。在给药后6、24、48、72和96小时，给动物注射3mg萤光素并在体内成像系统(IVIS Spectrum，珀金埃尔默公司)上成像。在给药后6小时，处死并解剖三只动物，并且对肌肉、皮肤、引流淋巴结、肝脏和脾脏离体成像。如实例8所述，还评估了小鼠组织的萤光素酶表达，并分析了这种表达的组织分布。

预期小鼠在处理过的组织中显示萤光素酶表达。

实例18：体内非免疫原性

此实例描述了细胞感染后环状RNA的免疫原性的体内评估。

此实例描述了在施用具有加密原的环状RNA后免疫应答的定量和比较，参见图23。在一个实施例中，与对照相比，在一次或多次施用环状RNA后，具有加密原的环状RNA中的任一种将具有降低的(例如，与施用对照RNA相比降低的)免疫原性应答。

环状RNA的免疫原性的量度是血清中的细胞因子水平。

在此实例中，在一次或多次施用环状RNA之后检查细胞因子血清水平。将来自前述实例中任一个的环状RNA经由皮内(ID)、肌肉内(IM)、口服(PO)、腹膜内(IP)、或静脉内(IV)施用至6-8周龄的BALB/c小鼠。从不同的群组抽取血清：对小鼠进行全身和/或局部注射，一次或多次注射具有加密原的环状RNA和不带有加密原的环状RNA。

将收集的血清样品在PBS中稀释1-10倍，并且通过酶联免疫吸附测定(PBL生物化学实验室(PBL Biomedical Labs)，新泽西州皮斯卡塔韦市(Piscataway,NJ))和TNF-α(安迪生物公司(R&D)，明尼苏达州明尼阿波利斯市(Minneapolis,MN))分析小鼠的IFN-α。

除血清中的细胞因子水平之外，炎性标记物的表达是免疫原性的另一种量度。在此实例中，在施用后1、4和24小时，将收获来自用媒介物(无环状RNA)、线性RNA或环状RNA处理的小鼠的脾组织。将使用以下技术对样品进行分析：qRT-PCR分析、RNA印迹或FACS分析。

对于qRT-PCR分析，如先前所述定量RIG-I、MDA5、OAS、OASL、TNF-α和PKR的mRNA水平。

关于RNA印迹分析。如上所述，对样品进行处理并分析IFN-α13、IFN-β(开放生物系统公司(Open Biosystems))、TNF-α或GAPDH(ATCC)。

对于FACS分析，将细胞用针对CD83(研究诊断公司(Research DiagnosticsInc))、HLA-DR、CD80或CD86的直接缀合抗体染色，并且在流式细胞仪上进行分析。

在一个实施例中，与对照RNA相比，在一次或多次施用后，具有加密原的环状RNA将具有降低的细胞因子水平(如通过ELISA、RNA印迹、FACS和/或qRT-PCR测量的)。

实例19：环状RNA的分离和纯化

此实例展示了环状RNA的纯化。

在某些实施例中，如先前实例中所述，环状RNA可以在表达编码的蛋白质产物之前被分离和纯化。此实例描述了使用UREA凝胶分离进行的分离。如以下实例所示，分离并纯化环状RNA。

CircRNA1被设计为编码没有终止密码子的三联FLAG标签化EGF(264nt)。它在用于翻译起始的起始密码子处具有科扎克序列(SEQ ID NO:10)。CirRNA2具有与环状RNA1相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(273nt，SEQ ID NO:11)。环状RNA3被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接交错元件(2A序列)、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:9)。CircRNA4具有与环状RNA3相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(339nt)。CircRNA5被设计为编码如下的FLAG标签化EGF，其侧接2A序列且后接FLAG标签化纳米萤光素酶(873nt，SEQ ID NO:12)。CircRNA6具有与环状RNA5相同的序列，除了它在EGF与纳米萤光素酶基因之间包括终止元件(三联终止密码子)和在纳米萤光素酶序列端部包括终止元件(三联终止密码子)(762nt，SEQ ID NO:13)。如本文所述分离CircRNA1、CircRNA2、CircRNA3、CircRNA4、CircRNA5、和CircRNA6。如本文所述分离CircRNA1、CircRNA2、CircRNA3、CircRNA4、CircRNA5、和CircRNA6。

在此实例中，如所述生成线性和环状RNA。为了纯化环状RNA，在6％变性PAGE上解析连接混合物，并且切除对应于环状RNA中的每一种的RNA条带。压碎切除的RNA凝胶片段，并且用800μl 300mM NaCl过夜洗脱RNA。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3M乙酸钠存在时用乙醇沉淀RNA。通过6％变性PAGE分析洗脱的环状RNA，参见图24。

通过PAGE可视化具有可变大小的环状RNA的单条条带。

实例20：蛋白质表达的检测

此实例展示了环状RNA的体外蛋白质表达。

蛋白质表达是由mRNA生成特定蛋白质的过程。此过程包括将DNA转录成信使RNA(mRNA)，随后将mRNA翻译成多肽链，这些多肽链最终被折叠成功能性蛋白，并且可以靶向至特定的亚细胞或细胞外位置。

如以下实例中所示，由环状RNA序列体外表达蛋白质。

环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:9)。

将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。

使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图25)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。

检测到荧光表明存在表达产物。因此，显示了环状RNA驱动蛋白质的表达。

序列表

SEQ ID NO:1(起始密码子)

AUG

SEQ ID NO:2(GFP)

EGFP：

SEQ ID NO:3(交错元件)

P2A：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct

T2A：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca

E2A：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc

其他：F2A、BmCPV2A、BmIFV2A

SEQ ID NO:4 ZKSCAN内含子

或

SEQ ID NO:5(IRES)

IRES(EMCV)：

SEQ ID NO:6(addgene p3.1漆酶)

pcDNA3.1(+)漆酶2 MCS外显子载体序列6926bp

SEQ ID NO:7(RFP)

mCherry：

SEQ ID NO:8(萤光素酶)

nLuc：

SEQ ID NO:9

科扎克3XFLAG-EGF P2A无终止(330bp)

5-13：科扎克序列

14-262：3XFLAG-EGF

263-328：P2A

SEQ ID NO:10

科扎克3XFLAG-EGF无终止(264bp)

5-13：科扎克序列

14-262：3XFLAG-EGF

SEQ ID NO:11

科扎克3XFLAG-EGF终止(273bp)

5-13：科扎克序列

14-262：3XFLAG-EGF

263-271：三联终止密码子

SEQ ID NO:12

科扎克1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-Nluc P2A无终止(873bp)

5-13：科扎克序列

14-202：1XFLAG-EGF

203-265：T2A

266-805：1XFLAG-Nluc

806-871：P2A

SEQ ID NO:13

科扎克1XFLAG-EGF终止1XFLAG-Nluc终止(762bp)

5-13：科扎克序列

14-202：1XFLAG-EGF

203-211：三联终止密码子

212-751：1XFLAG-Nluc

752-760：三联终止密码子

hEPO ORF

Claims

1.一种维持哺乳动物中蛋白质表达的方法，其包括：

(a)向所述哺乳动物提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；和

(b)在步骤(a)后6小时至90天，向所述哺乳动物提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，

从而维持所述蛋白质在所述哺乳动物中的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且

(i)在所述哺乳动物中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前；或

(ii)在所述哺乳动物中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平之后；或

(iii)在所述哺乳动物中由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸：(i)是外源、合成环状多核糖核苷酸；和/或(ii)缺少聚A序列、复制元件、或两者。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且所述第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中：

(i)所述第一环状多核糖核苷酸和所述第二环状多核糖核苷酸是相同的；或

(ii)所述第一环状多核糖核苷酸和所述第二环状多核糖核苷酸是不同的。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其进一步包括：

(i)在所述第二组合物后向所述哺乳动物提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而维持所述哺乳动物中所述蛋白质的表达，或

(ii)在所述第二组合物后向所述哺乳动物提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而恢复所述哺乳动物中所述蛋白质的表达；

并且任选地，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且(a)在所述哺乳动物中基本上检测不到由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前；或(b)在所述哺乳动物中由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前；和/或

(iii)提供编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中：

(i)由所述第一组合物表达的所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后1-2天所述蛋白质的最高水平；或

(ii)由所述第一组合物表达的所述蛋白质的第一水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％；并且任选地，

(iii)在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第二水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；并且任选地，

(iv)在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(v)对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在提供所述第二组合物后所述蛋白质的平均水平是来自所述第一组合物的蛋白质第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从(i)提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天；或(ii)在提供每种后续组合物之后至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中

(i)在提供所述第一组合物后6小时至90天，在提供所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平；和/或

(ii)在提供所述第一组合物后6小时至270天，在提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平；和/或

(iii)在提供所述第一组合物后6小时至35天，在提供所述第一组合物和所述第二组合物后基本上检测不到所述蛋白质的第一水平。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中：

(i)在提供所述第二组合物后所述哺乳动物中蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述哺乳动物中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(ii)在提供所述第三组合物后所述哺乳动物中产生的蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(iii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(iv)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质，例如，促红细胞生成素；和/或

其中所述蛋白质(例如，促红细胞生成素)的表达在所述哺乳动物中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。

11.一种维持细胞或受试者中蛋白质表达的方法，其包括：

(a)向所述细胞或受试者提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物；并且

(b)在步骤(a)后6小时至90天，向所述细胞或受试者提供包含编码所述蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，

从而维持所述蛋白质在所述细胞或受试者中的表达；任选地，其中向所述受试者的第一细胞提供所述第一组合物，并且向所述受试者的第二细胞提供所述第二组合物，并且其中所述第一细胞和第二细胞是相同的细胞或不同的细胞。

12.一种在细胞或受试者中表达蛋白质的方法，其包括：

(a)向所述细胞或所述受试者提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或所述受试者表达第一水平的经编码蛋白质；并且

(b)向所述细胞或所述受试者提供包含编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或所述受试者表达第二水平的经编码蛋白质，并且

(i)所述第二水平至少与所述第一水平一样多，或者

(ii)所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

从而将所述细胞或受试者中经编码蛋白质的表达至少维持在所述蛋白质的第一水平；任选地，其中向所述受试者的第一细胞提供所述第一组合物，并且向所述受试者的第二细胞提供所述第二组合物，并且其中所述第一细胞和第二细胞是相同的细胞或不同的细胞。

13.一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中的蛋白质水平相比，在向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中表达一定水平所述蛋白质的方法，其包括：

(a)向细胞或受试者提供编码蛋白质的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供环状多核糖核苷酸的第一组合物后包含一定水平的所述蛋白质；和

(b)在所述第一组合物后，向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含

(i)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少所述蛋白质的水平，或

(ii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平所述蛋白质；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞或受试者中所述蛋白质水平的表达；并且任选地，其中向所述受试者的第一细胞提供所述第一组合物，并且向所述受试者的第二细胞提供所述第二组合物，并且其中所述第一细胞和第二细胞是相同的细胞或不同的细胞。

14.如权利要求11或12所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且

(i)在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平之前；和/或

(ii)在所述细胞或受试者中由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低超过50％之前；和/或

(iii)在所述细胞或受试者中由所述第一组合物表达的蛋白质的第一水平降低25％-75％之前。

15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将所述细胞或受试者中的所述蛋白质表达至少维持在蛋白质的第一水平，并且任选地，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且(i)在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平之前，或(ii)在所述细胞或受试者中由所述第一和第二组合物表达的所述蛋白质的第二水平降低超过50％之前。

16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

17.如权利要求13、15或16中任一项所述的方法，其中向所述细胞或受试者提供所述第二组合物：

(i)在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一组合物表达的蛋白质水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，或者

(ii)在所述第一组合物后至少14天，并且在所述第一组合物后不超过90天。

18.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的第一水平是

(i)在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平，和/或

(ii)在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％。

19.如权利要求18所述的方法，其中：

(i)在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第二水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(ii)在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述蛋白质的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(iii)对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后表达的所述蛋白质的后续水平是在提供所述第一组合物后一天所述蛋白质的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(iv)在提供所述第二组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的；和/或

(v)在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述蛋白质的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中所述蛋白质的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述蛋白质的那天测量的；和/或

(vi)在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述蛋白质的第一水平；和/或

(vii)在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物、所述第二组合物和所述第三组合物后维持所述蛋白质的第一水平；和/或

(viii)在提供所述第二组合物后所述细胞或受试者中蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞或受试者中蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(ix)在提供所述第三组合物后所述细胞或受试者中产生的蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中蛋白质的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(x)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天或45天蛋白质的第二水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(xi)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天蛋白质的第三水平比在提供所述第一组合物后所述蛋白质的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

20.如权利要求13或15-17中任一项所述的方法，其中：

(i)将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天；和/或

(ii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(iii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述蛋白质水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

21.如权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质，例如，促红细胞生成素，和/或其中所述蛋白质(例如，促红细胞生成素)的表达在所述细胞或受试者中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。

22.一种在细胞或受试者中产生环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

(a)向所述细胞或受试者提供包含所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供所述第一组合物后包含第一水平的环状多核糖核苷酸；和

(b)向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述细胞或受试者包含第二水平的环状多核糖核苷酸，并且

(i)环状多核糖核苷酸的所述第二水平至少与所述第一水平一样多，或者

(ii)在提供所述第二组合物后，环状多核糖核苷酸的所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

从而将所述细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸至少维持在所述第一水平；任选地，其中所述第一组合物包含第一环状多核糖核苷酸，并且所述第二组合物包含第二环状多核糖核苷酸，其中：

(ii)所述第一环状多核糖核苷酸和所述第二环状多核糖核苷酸是不同的；

任选地，其中所述第一环状多核糖核苷酸包含第一结合位点和/或编码第一蛋白质，并且所述第二环状多核糖核苷酸包含第二结合位点和/或编码第二蛋白质，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点是相同或不同的结合位点，并且/或者所述第一蛋白质和所述第二蛋白质编码所述相同的蛋白质或不同的蛋白质。

23.一种与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平相比，在向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中产生一定水平环状多核糖核苷酸的方法，其包括：

(a)向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供所述第一组合物后包含所述环状多核糖核苷酸的水平；并且

(b)向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞或受试者包含(i)至少在提供所述第二组合物后的所述环状多核糖核苷酸水平，或(ii)在提供所述第二组合物后变化不超过所述环状多核糖核苷酸水平的20％的一定水平所述蛋白质；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和第二组合物后所述细胞或受试者中的所述线性对应物水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞或受试者中的所述环状多核糖核苷酸水平。

24.如权利要求22所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且在所述细胞或受试者中基本上检测不到通过提供所述第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之前。

25.如权利要求24所述的方法，其中提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之后。

26.如权利要求23或25所述的方法，其中向所述细胞或受试者提供所述第二组合物

(i)在基本上检测不到由所述第一组合物产生的环状多核糖核苷酸水平后至少1分钟、1小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，或者

27.如权利要求22或24所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞或受试者提供环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而在提供所述第三组合物后将环状多核糖核苷酸的水平至少维持在所述第一水平，并且任选地，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且

(i)在所述细胞或受试者中基本上检测不到所述细胞或受试者中由所述第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平之前，或

(ii)在所述细胞或受试者中由所述第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平降低超过50％之前；或

(iii)在所述细胞或受试者中由所述细胞或受试者中的所述第一和第二组合物产生的环状多核糖核苷酸水平降低25％-75％之前。

28.如权利要求22-27中任一项所述的方法，其进一步包括向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

29.如权利要求22、24、27或28中任一项所述的方法，其中：

(i)所述环状多核糖核苷酸的所述第一水平是在提供所述第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平；和/或

(ii)对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后表达的环状多核糖核苷酸的后续水平是在提供所述第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(ii)在提供所述第二组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的；和/或

(iii)在所述第一组合物后提供每种后续组合物后所述环状多核糖核苷酸的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％，其中所述环状多核糖核苷酸的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述环状多核糖核苷酸的那天测量的；和/或

(iv)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天后，维持所述环状多核糖核苷酸的第一水平；和/或

(v)在提供所述第二组合物后所述细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(vi)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第二水平比在提供所述第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

31.如权利要求23、25、26或28中任一项所述的方法，其中：

(i)将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天；和/或

(ii)由所述第一组合物产生的环状多核糖核苷酸的水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％；和/或

(iii)在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，由所述第二组合物产生的环状多核糖核苷酸的水平是在提供所述第一组合物后一天环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(iv)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的环状多核糖核苷酸水平比在提供环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的所述环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(v)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后环状多核糖核苷酸的水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后环状多核糖核苷酸的线性对应物水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

32.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，所述环状多核糖核苷酸的第三水平是在提供所述第一组合物后一天所述环状多核糖核苷酸的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

33.如权利要求27-29或32中任一项所述的方法，其中：

(i)在提供环状多核糖核苷酸的所述第三组合物至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天后，维持环状多核糖核苷酸的第一水平；和/或

(ii)在提供所述第三组合物后所述细胞或受试者中环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后所述多个中环状多核糖核苷酸的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(iii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天环状多核糖核苷酸的第三水平比在提供所述第一组合物后环状多核糖核苷酸的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

34.如权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述蛋白质(例如，促红细胞生成素)在所述受试者中诱导应答(例如，网织红细胞的产生)。

35.一种在细胞或受试者中结合靶的方法，其包括：

(a)向所述细胞或受试者提供包含含有靶的结合位点的环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述靶以第一水平与结合位点结合；和

(b)向所述细胞或受试者提供包含含有靶的结合位点的所述环状多核糖核苷酸的第二组合物，其中所述靶以第二水平与所述结合位点结合，并且(i)所述第二水平至少与所述第一水平一样多，或者(ii)所述第二水平变化不超过所述第一水平的20％；

从而将所述细胞或受试者中所述靶的结合至少维持在结合的第一水平。

36.一种与在提供环状多核糖核苷酸的线性对应物的第一组合物和第二组合物后细胞或受试者中与靶的结合水平相比，在向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第一组合物和第二组合物后在所述细胞或受试者中结合靶的方法，其包括：

(a)向所述细胞或受试者提供包含结合位点的所述环状多核糖核苷酸的第一组合物，其中所述细胞或受试者在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物后包含与所述靶的结合水平；和

(b)在所述第一组合物后，向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物，其中所述细胞或受试者包含(i)至少在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后与所述靶的结合水平，或(ii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后变化不超过所述水平的20％的一定水平与靶的结合；

从而与在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中与所述靶的结合水平相比，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述细胞或受试者中与所述靶的结合水平。

37.如权利要求35所述的方法，其中提供所述第二组合物发生在提供所述第一组合物之后，并且(i)在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一组合物产生的结合的第一水平之前，或(ii)在所述细胞或受试者中由所述第一组合物产生的结合的第一水平降低超过50％之前，或(iii)在所述细胞或受试者中由所述第一组合物产生的结合的第一水平降低25％-75％之前。

38.如权利要求35或37所述的方法，其进一步包括在所述第二组合物后向所述细胞或受试者提供所述环状多核糖核苷酸的第三组合物，从而将所述细胞或受试者中与所述靶的结合至少维持在结合的第一水平，并且任选地，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞或受试者中基本上检测不到由所述第一和第二组合物在所述细胞或受试者中对所述靶的结合的第二水平之前。

39.如权利要求38所述的方法，其中提供所述第三组合物发生在提供所述第二组合物之后，并且在所述细胞或受试者中由所述第一和第二组合物产生的所述结合的第二水平降低超过50％之前。

40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述环状多核糖核苷酸的第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物。

41.如权利要求36或38所述的方法，其中：

(i)提供环状多核糖核苷酸的所述第二组合物发生在所述第一组合物之后，并且在基本上检测不到由所述第一组合物产生的结合水平之后；和/或

(ii)在基本上检测不到由所述第一组合物产生的结合水平后至少6小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月或22个月，向所述细胞或受试者提供所述第二组合物；和/或

(iii)在所述第一组合物后14天并且在所述第一组合物后不超过90天，向所述细胞或受试者提供所述第二组合物。

42.如权利要求35或37-40中任一项所述的方法，其中：

(i)结合的第一水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平；和/或

(ii)结合的第一水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的40％、50％、60％、70％、80％或90％；和/或

(iii)在提供所述第二组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或45天，结合的第二水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(iv)在提供所述第三组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，结合的第三水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(v)对于在所述第一组合物后提供的每种后续组合物，在提供每种后续组合物后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30天，在每种后续组合物后结合的后续水平是在提供所述第一组合物后一天结合的最高水平的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％；和/或

(vi)在提供所述第二组合物后结合的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中结合的平均水平是从提供所述第二组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的；和/或

(vii)在所述第一组合物后提供每种后续组合物后结合的平均水平是所述第一水平的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或110％，其中结合的平均水平是从提供每种后续组合物后一天至基本上检测不到所述结合的那天测量的；和/或

(viii)在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后维持所述结合的第一水平；和/或

(ix)在提供所述第二组合物后所述细胞或受试者中结合的第二水平比在提供所述第一组合物后所述细胞或受试者中结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；

(x)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天结合的第二水平比在提供所述第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

43.如权利要求36或41所述的方法，其中：

(i)将在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中结合的水平维持至少1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天；和/或

(ii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的结合水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；和/或

(iii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第二组合物后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的结合水平比在提供所述环状多核糖核苷酸的所述线性对应物的所述第一组合物和所述第二组合物后所述细胞或受试者中的结合水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

44.如权利要求38-40或42中任一项所述的方法，其中：

(i)在提供所述第一组合物后至少6小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天或30天，在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第一组合物、第二组合物和第三组合物后维持所述结合的第一水平；和/或

(ii)在提供所述第三组合物后所述细胞或受试者中结合的第三水平比在提供所述第一组合物后结合的第一水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％；

(iii)在提供所述环状多核糖核苷酸的所述第三组合物或1小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天结合的第三水平比在提供所述第一组合物后所述结合的第一水平高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或60％。

45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中：

(i)所述第一组合物的环状多核糖核苷酸和所述第二组合物的环状多核糖核苷酸是相同的；或

(ii)所述第一组合物的环状多核糖核苷酸和所述第二组合物的环状多核糖核苷酸是不同的。

46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中：

(i)所述第一组合物和所述第二组合物包含大约相同量的所述环状多核糖核苷酸；或

(ii)所述第一组合物比所述第二组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸；和/或

(iii)所述第一组合物比第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组合物包含更高量的所述环状多核糖核苷酸；和/或

(iv)所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量变化不超过所述第一组合物的环状多核糖核苷酸量的1％、5％、10％、15％、20％或25％；

(v)所述第二组合物的环状多核糖核苷酸的量比所述第一组合物的环状多核糖核苷酸的量少不超过1％、5％、10％、15％、20％或25％；和/或

(vi)所述第一组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂；和/或

(vii)所述第二组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂；和/或

(viii)所述第三组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂；和/或

(x)所述细胞是动物细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞)；和/或

(xi)所述细胞是受试者体内的多个细胞

(xii)所述第一组合物和/或所述第二组合物包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子；

(xiii)相对于所述第一组合物和/或所述第二组合物中的所述总核糖核苷酸分子，所述第一组合物和/或所述第二组合物包含至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子；和/或

(xiv)所述第一组合物和/或所述第二组合物中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。

47.如权利要求11-46中任一项所述的方法，其中所述受试者是动物(例如，哺乳动物)。

48.如权利要求11-47中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

49.如权利要求1、11、12和22中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗原(例如，肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原)。