JP2022536951A - 環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法 - Google Patents

環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般に、その環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び製剤を投与する方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
相互参照
本出願は、２０１９年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／８６３，７２５号明細書の優先権と利益を主張するものであり、これの内容全体は、参照により本明細書に援用される。
特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及び細胞中に遍在的に存在する。
本開示は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法に関する。本明細書に開示される方法は、一般に、細胞又は対象においてタンパク質を発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの組成物を、細胞又は対象に提供する工程を含む方法、細胞又は対象においてタンパク質を結合する方法であって、結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの組成物を、細胞又は対象に提供する工程を含む方法、或いはその両方に関する。投与する方法は、複数回投与を、細胞又は対象に提供する工程を含む。例えば、複数回投与は、再投与又は時間差投与（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｉｎｇ）である。環状ポリリボヌクレオチドの組成物を再投与する方法は、２つ以上の組成物を、一般に長期間にわたって、細胞又は対象（例えば哺乳動物）に提供する工程を含む。環状ポリリボヌクレオチドの組成物を時間差投与する方法は、一般に短い時間間隔にわたって２つ以上の組成物を提供する工程を含む。
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する方法であって、（ａ）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供し、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む、方法を特徴とする。
これらの態様のある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、外因性の合成環状ポリリボヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、複製要素、又は両方を欠いている。
これらの態様のある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは同じである。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは異なる。
これらの態様のある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、哺乳動物に提供し、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、哺乳動物に提供し、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を回復させることをさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び哺乳動物において第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、本方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む。
これらの態様のある実施形態において、第１の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第１の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。ある実施形態において、第２の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第２の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。ある実施形態において、第３の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。
これらの態様のある実施形態において、第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルである。ある実施形態において、第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。ある実施形態において、タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。
これらの態様のある実施形態において、第２の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１の組成物からのタンパク質の第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１１０％であり、タンパク質の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１の組成物からのタンパク質の第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１１０％であり、タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、６時間～９０日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、６時間～２７０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、６時間～３５日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、実質的に検出不可能である。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後の哺乳動物におけるタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の哺乳動物におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後、哺乳動物において生成されるタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチンである。ある実施形態において、タンパク質（例えば、エリスロポエチン）の発現が、哺乳動物における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する。本明細書に記載される態様のある実施形態において、治療用タンパク質は、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば癌）用のタンパク質、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、又はＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素である。ある実施形態において、タンパク質は、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）である。ある実施形態において、タンパク質は、ワクチン接種用のタンパク質である。
第２の態様において、本発明は、細胞又は対象におけるタンパク質の発現を維持する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞又は対象に提供し；それによって、細胞又は対象におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第３の態様において、本発明は、細胞又は対象におけるタンパク質の発現を維持する方法であって、工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞又は対象に提供し；それによって、細胞又は対象におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第４の態様において、本発明は、細胞又は対象においてタンパク質を発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、コードされたタンパク質の第１のレベルを発現し；（ｉ）第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度であり、又は（ｉｉ）第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞又は対象におけるコードされたタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第５の態様において、本発明は、細胞又は対象においてタンパク質を発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、コードされたタンパク質の第２のレベルを発現し、（ｉ）第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度であり、又は（ｉｉ）第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞又は対象におけるコードされたタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第６の態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞又は対象に提供した後、細胞又は対象においてあるレベルのタンパク質を発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、あるレベルのタンパク質；（ｉ）少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベル、又は（ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第７の態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞又は対象に提供した後、細胞又は対象においてあるレベルのタンパク質を発現する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、（ｉ）少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベル、又は（ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法を特徴とする。
これらの態様のある実施形態において、第１の組成物を提供する工程は、対象における第１の細胞に対してであり、第２の組成物を提供する工程は、対象における第２の細胞に対してであり、ここで、第１の細胞及び第２の細胞は、同じ細胞又は異なる細胞である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞又は対象において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる。
これらの態様のある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、細胞又は対象に提供し、それによって、細胞又は対象におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び（ｉ）第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に、又は（ｉｉ）細胞又は対象における第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む。
これらの態様のある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって発現される細胞又は対象におけるタンパク質のレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月、細胞又は対象に提供される。これらの態様のある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の少なくとも１４日後及び第１の組成物の９０日以下後に、細胞又は対象に提供される。
ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルである。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。
ある実施形態において、タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、タンパク質の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、細胞又は対象におけるタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後、細胞又は対象において生成されるタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後のタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチンであり、及び／又はタンパク質（例えば、エリスロポエチン）の発現が、細胞又は対象における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する。ある実施形態において、タンパク質は、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）である。ある実施形態において、タンパク質は、ワクチン接種用のタンパク質である。
第８の態様において、本発明は、細胞又は対象において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、（ｉ）環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度であり、又は（ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
この態様のある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで：（ｉ）第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドが、同じであるか；又は（ｉｉ）第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドが、異なる。この態様のある実施形態において、第１の環状ポリリボヌクレオチドは、第１の結合部位を含み、及び／又は第１のタンパク質をコードし、第２の環状ポリリボヌクレオチドは、第２の結合部位を含み、及び／又は第２のタンパク質をコードし、ここで、第１の結合部位及び第２の結合部位が、同じであるか、又は異なる結合部位であり、及び／又は第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、同じタンパク質又は異なるタンパク質をコードする。
第９の態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞又は対象に提供した後の細胞又は対象においてあるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、（ｉ）少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベル、又は（ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物を提供することによって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物の後、及び第１の組成物によって生成される細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月にわたって、細胞又は対象に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の少なくとも１４日後及び第１の組成物の９０日以下後に、細胞又は対象に提供される。
ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、細胞又は対象に提供し、それによって、第３の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを、少なくとも第１のレベルに維持する工程をさらに含み、任意選択的に、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び（ｉ）細胞又は対象において第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に、又は（ｉｉ）細胞又は対象において第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、５０％超低下する前；又は（ｉｉｉ）細胞又は対象において第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる。
ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を、細胞又は対象に提供する工程をさらに含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後に、環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルである。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって維持される。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後、細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第１の組成物を提供した後、細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。ある実施形態において、第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。ある実施形態において、第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後の細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、タンパク質（例えば、エリスロポエチン）は、対象における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する。ある実施形態において、タンパク質は、抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原）である。
第１０の態様において、本発明は、細胞又は対象における標的を結合する方法であって、標的のための結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、標的が、第１のレベルで結合部位に結合する、工程；及び標的のための結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、標的が、第２のレベルで結合部位に結合し、（ｉ）第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度であり、又は（ｉｉ）第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
それによって、細胞又は対象における標的の結合を、少なくとも、結合の第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１１の態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における標的に結合するレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞又は対象に提供した後の細胞又は対象における標的を結合する方法であって、（ａ）結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、標的の結合のレベルを含む、工程；及び（ｂ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、細胞又は対象に提供する工程であって、細胞又は対象が、（ｉ）少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の標的への結合のレベル、又は（ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化する標的への結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における標的への結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における標的への結合のレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物による結合の第１のレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物による結合の第１のレベルが、細胞又は対象において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物による結合の第１のレベルが、細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる。
ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、細胞又は対象に提供し、それによって、細胞又は対象における標的の結合を、少なくとも、結合の第１のレベルに維持する工程をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び第１及び第２の組成物による細胞又は対象における標的の結合の第２のレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる。
ある実施形態において、第３の組成物を提供する工程は、第２の組成物を提供した後及び細胞又は対象における第１及び第２の組成物による結合の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物の後、及び第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった少なくとも６時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月後に細胞又は対象に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の１４日後及び第１の組成物の９０日以下後に、細胞又は対象に提供される。
ある実施形態において、結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルである。ある実施形態において、結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。ある実施形態において、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、結合の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後の結合のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、結合の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、結合が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、結合の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、結合が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の結合の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後の細胞又は対象における結合の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の結合の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の結合の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドが、同じである。ある実施形態において、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドが、異なる。
ある実施形態において、第１の組成物及び第２の組成物は、ほぼ同じ量の環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の組成物は、第２の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の組成物は、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量の１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下だけ変化する。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下少ない。ある実施形態において、第１の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第２の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、細胞は、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）である。ある実施形態において、細胞は、対象における複数の細胞である。ある実施形態において、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、第１の組成物及び／又は第２の組成物中の総リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、第１の組成物及び／又は第２の組成物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子である。
ある実施形態において、対象は、動物（例えば、哺乳動物）である。ある実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、タンパク質は、抗原（例えば、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原）である。
第１２の態様において、本発明は、一般に、細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１３の態様において、本発明は、一般に、哺乳動物において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；それによって、哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１４の態様において、本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１５の態様において、本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を哺乳動物に提供した後、哺乳動物においてあるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含み；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の哺乳動物における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１６の態様において、本発明は、一般に、細胞内の標的において結合する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、細胞が、第１の組成物を提供した後、結合の第１のレベルを含み；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも結合の第１のレベルと同程度である、工程；それによって、細胞における結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１７の態様において、本発明は、一般に、哺乳動物における標的において結合する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、第１の組成物を提供した後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも結合の第１のレベルと同程度である、工程；それによって、哺乳動物における結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１８の態様において、本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内で標的を結合する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、結合のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞における結合のレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
第１９の態様において、本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の哺乳動物における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を哺乳動物に提供した後、哺乳動物において標的を結合する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、第１の組成物を提供した後、結合のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する工程であって、哺乳動物が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の哺乳動物の結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、哺乳動物における結合のレベルを維持する工程を含む、方法を特徴とする。
定義
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。
本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、遊離末端を有さない（すなわち、遊離３’及び／又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又はエンドレス構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
本明細書において使用される際、「アプタマー配列」という用語は、標的分子に特異的に結合する非天然又は合成オリゴヌクレオチドである。典型的に、アプタマーは、２０～５００のヌクレオチドである。典型的に、アプタマーは、配列相同性ではなく二次構造を介してその標的に結合する。
本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ状ポリリボヌクレオチドの核酸配列又は構造である。
本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えば、ペプチド若しくはポリペプチド、又は調節核酸をコードする核酸配列である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含み、これらは、それぞれアミノ酸をコードし、「コドン」と呼ばれる。
本明細書において使用される際、「外因性」という用語は、生体分子（環状ＲＮＡなど）に関連して使用される場合、生体分子が、人の手によって宿主ゲノム、細胞又は生物に導入されたことを意味する。例えば、組み換えＤＮＡ技術及び／又は生体分子を細胞に取り込むための方法を用いて既存のゲノム、細胞、組織又は対象に加えられる環状ＲＮＡは、既存の核酸配列、細胞、組織又は対象、及び生体分子を保持する核酸配列、細胞、組織又は対象の任意の子孫に対して外因性である。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするのに役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって結合され、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は回避する。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、免疫原、例えば、環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパク質又はペプチドである。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体タンパク質、及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
本明細書において使用される際、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、天然非修飾ヌクレオチドアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）などの、非修飾天然リボヌクレオチドの化学組成物に対する１つ以上の化学修飾を有する任意のリボヌクレオチド類似体又は誘導体を意味する。ある実施形態において、修飾リボヌクレオチドの化学修飾は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合などの、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）修飾である。
本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれる。
本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成する。
本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列である。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中の反復される配列を含む。
本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフである。
本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分である。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを指し得る。
本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成を意味する。例えば、２つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば、２つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が、約０、又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、若しくは２０％未満であり得ることを意味し得る。
本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量を意味する。ある実施形態において、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において、又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値である。
本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチドに対する自然免疫応答を測定する際（炎症マーカーを測定するなど）、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで自然免疫応答の生成をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照に対する自然免疫応答によって生成されるマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以下であり得る。
本明細書において使用される際、「実質的に検出不可能」という用語は、関連する検出技術（例えば、クロマトグラフィー（カラム、ろ紙、ゲル、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、ＩＣ、ＳＥＣなど）、電気泳動（ＵＲＥＡ ＰＡＧＥ、チップベース、ポリアクリルアミドゲル、ＲＮＡ、キャピラリー、ｃ－ＩＥＦなど）、蛍光ベースの検出技術など）によって検出可能なレベルより低い環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから発現されるタンパク質のレベルを指し得る。
本明細書において使用される際、「線状同等物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列類似性）を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物（例えば、環状化前形態）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ配列類似性）及び同じか又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列類似性）及び異なる核酸修飾を有するか又は核酸修飾を有さず、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物であるポリリボヌクレオチド分子のフラグメントは、線状同等物ポリリボヌクレオチド分子より短い線状同等物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。ある実施形態において、線状同等物は、５’キャップをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、３’ＵＴＲをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
本明細書において使用される際、「共役部分」という用語は、共役の方法において使用するための官能基を含む修飾ヌクレオチドを指す。
本明細書において使用される際、「担体」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって、部分的に若しくは完全に封入剤によって、又はそれらの組合せで、細胞内への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを封入するか若しくはそれに共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、エクスビボ分化された網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。
本明細書において使用される際、「ネイキッド送達（ｎａｋｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」という用語は、担体を用いず、且つ細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾を有さない、細胞への送達のための製剤を意味する。ネイキッド送達製剤は、任意のトランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達製剤は、共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドを含み、且つ担体を含まない製剤である。
「希釈剤」という用語は、本明細書に記載される組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）が希釈又は溶解され得る不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例としては、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが挙げられる。固体希釈剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、又は粉砂糖が挙げられる。
本明細書において使用される際、「応答」又は「応答レベル」という用語は、刺激への曝露から生じる任意の測定可能な変化又は測定可能な変化の任意のレベルである。例えば、測定可能な変化は、表現型のシフト若しくは変化（例えば、細胞表現型、身体的表現型、分子表現型）又は刺激が働いているという情報を与える任意の特性であり、例えば、細胞形態の変化、ある細胞型の生成の増加若しくは減少、刺激への曝露後の筋肉量の増加若しくは減少を含む。さらなる例として、刺激結合部位を含むタンパク質（例えば、環状ポリリボヌクレオチドから発現されるエリスロポエチン）又は環状ポリリボヌクレオチドであり、応答又は応答レベルは、対象における結合部位を含むタンパク質又は環状ポリリボヌクレオチドへの曝露後の表現型の測定可能なシフト（例えば、対象における網状赤血球の増加した生成若しくはレベル）である。
参照による援用
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
マウスへの注入後、環状ＲＮＡが、注入の３、４、及び７日後の時点でマウスの肝臓における線状ＲＮＡより高いレベルで検出されたことを示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡが、ＲＮＡの投与の１６日後の時点で肝臓及び脾臓中で検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、環状ＲＮＡではなく線状ＲＮＡが、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳによって評価した際、免疫原性を示したことを示す。 線状ポリリボヌクレオチド同等物（「線状」）と比較した、環状ポリリボヌクレオチド（「エンドレス」）の再投与後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の増加した持続性を示す実験データを示す。 線状ポリリボヌクレオチド同等物（「線状３回投与」）、又は環状ポリリボヌクレオチド（「エンドレス」）の単回投与、又は線状ポリリボヌクレオチド同等物（「線状」）の単回投与の時間差投与と比較した、環状ポリリボヌクレオチド（「エンドレス３回投与」）の時間差投与後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の増加した持続性を示す実験データを示す。 線状ポリリボヌクレオチド同等物（「線状ＲＮＡ」）の単回投与と比較した、環状ポリリボヌクレオチド（「エンドレスＲＮＡ」）の単回投与、単回投与（「線状ＲＮＡ」）と比較した、線状ポリリボヌクレオチド同等物（「３回投与の線状ＲＮＡ」）の時間差投与、又は単回投与（「エンドレスＲＮＡ」）と比較した、環状ポリリボヌクレオチド（「３回投与のエンドレスＲＮＡ」）の時間差投与後のマウスにおけるガウシアルシフェラーゼ発現の増加した持続性を示す実験データを示す。 静脈内投与された環状ポリリボヌクレオチドが、担体あり（ＴｒａｎｓＩＴ）及び担体なし（非配合）で、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを示す。 筋肉内投与された環状ポリリボヌクレオチドが、担体なしで、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを示す。 静脈内投与された環状ポリリボヌクレオチドが、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現し、少なくとも５回再投与され得ることを示す。 環状ポリリボヌクレオチドが、複数回の連続注入後に血漿中のタンパク質活性の増加したレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを示す。 増加した数の網状赤血球が、非配合ＲＮＡの第１の用量の投与の３、５、７、１４、２１及び２８日後の時点で、全血中で検出され、その後、網状赤血球数が、マウス集団中で３～５％の正常範囲に戻ったことを示す。 増加した数の網状赤血球が、ＴｒａｎｓＩＴ配合ＲＮＡの第１の用量の投与の３、５、７、１４、２１及び２８日後の時点で、全血中で検出され、その後、網状赤血球数が、マウス集団中で３～５％の正常範囲に戻ったことを示す。 網状赤血球数の増加が、ビヒクルのみの対照と比較して、配合されない場合、環状ＲＮＡ投与及びｍＲＮＡ投与について検出されたことを示す。 網状赤血球数の増加が、ビヒクルのみの対照と比較して、ＴｒａｎｓＩＴが配合された場合、環状ＲＮＡ投与及びｍＲＮＡ投与について検出されたことを示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、スタガー要素（２Ａ）、エンクリプトゲン及びＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含有する環状ＲＮＡの例示的なインビトロ生成プロセスの概略図を示す。 環状ＲＮＡの例示的なインビボ生成プロセスの概略図を示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ、スタガー要素（２Ａ）及びエンクリプトゲンを含む例示的な環状ＲＮＡの設計を示す。 図１９Ａおよび図１９Ｂは、２つの異なる環状ＲＮＡのインビボ化学量論的タンパク質発現を示す概略図である。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。 マウスモデルにおける例示的な環状ＲＮＡのインビボ生体内分布を示す概略図である。 エンクリプトゲン（イントロン）を有する例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。 例示的な精製プロセス後の例示的な環状ＲＮＡを示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 ＩＲＥＳ、キャップ、５’及び３’ＵＴＲを欠いた例示的な環状ＲＮＡによるＦｌａｇタンパク質（約１５ｋＤａ）の発現を示すウエスタンブロット画像である。
本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法に関する。本明細書に開示される投与の方法は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、細胞内のタンパク質のレベルを発現するか又は環状ポリリボヌクレオチドのレベルを生成することに関し、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。本明細書に開示される投与の方法はまた、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、細胞内の標的に結合することに関し、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、外因性の合成環状ポリリボヌクレオチドである。
ある態様において、本発明は、細胞内でタンパク質を発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法に関する。ある態様において、細胞内でタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる。
ある態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルを発現する方法であって、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法に関する。ある態様において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルを発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。ある態様において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。ある態様において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物の後、及び第１の組成物によって発現される細胞におけるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後に行われる。本明細書に記載される方法において使用される環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み得る。ある実施形態において、発現配列の少なくとも１つが、タンパク質をコードする。タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、又は分泌タンパク質であり得る。タンパク質は、治療用タンパク質であり得る。ある実施形態において、治療用タンパク質は、活性を有してもよく、例えば、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又は輸送活性を有する。
本明細書に記載される方法は、対象を治療するための治療又は獣医学的方法であり得る。本明細書に記載される方法は、複数の細胞において疾患を治療するのに使用され得る。ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、非機能性、機能性の低い、又は不十分に発現されるタンパク質又は遺伝子産物から得られる疾患を治療するのに使用される。ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、遺伝性疾患（例えば、突然変異、置換、欠失、拡張、又は再結合（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ））、癌、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、腎疾患、肝疾患、遺伝性疾患、血管疾患、眼疾患、筋骨格疾患、リンパ系疾患、聴覚疾患及び内耳疾患、代謝性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は感染症を治療するのに使用される。
投与の方法
細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの用量又は組成物を投与した後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成するか又は細胞内であるレベルのタンパク質を発現するための投与の方法が、本明細書に開示される。環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの用量又は組成物を対象に提供（例えば、投与）した後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成するか又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）におけるタンパク質のレベルを発現するための投与の方法が、本明細書に開示される。組成物は、組成物タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含み得る。組成物は、結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含み得る。投与する方法は、一般に長期間にわたって２回以上の投与での環状ポリリボヌクレオチドの組成物の再投与であり得る。投与する方法は、短い時間間隔での組成物の時間差投与であり得る。ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。環状ポリリボヌクレオチドからのタンパク質は、細胞内で発現され得る。
ある実施形態において、本方法は、少なくとも第１の組成物及び第２の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供する（例えば、投与する）工程を含む。ある実施形態において、本方法は、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物、又はそれ以上を提供する（例えば、投与する）工程をさらに含む。ある実施形態において、さらなる組成物が、細胞寿命の期間にわたって提供される。ある実施形態において、さらなる組成物が、細胞又は対象が組成物から利益を得ながら、提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、複数の組成物が、時間差投与レジメンで提供される（例えば、投与され）、ここで、任意の組成物が、前の組成物が提供された（例えば、投与された）後、複数における前の組成物からのタンパク質又は環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供される（例えば、投与される）。例えば、時間差レジメンで第１の組成物及び第２の組成物を生成するために、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び複数における第１の組成物からタンパク質又は環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に、第２の組成物が、提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、複数の組成物が、再投与レジメンで提供され、ここで、複数における前の組成物からのタンパク質又は環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能になった後、前の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、任意の組成物が、提供される（例えば、投与される）。例えば、再投与レジメンで第１の組成物及び第２の組成物を生成するために、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び細胞又は対象における第１の組成物からのタンパク質又は環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象において実質的に検出不可能になった後、第２の組成物が提供される（例えば、投与される）。
ある実施形態において、時間差レジメン又は再投与レジメンにおける第１の組成物は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量を含む。ある実施形態において、時間差レジメン又は再投与レジメンにおける第２の組成物は、環状ポリリボヌクレオチドの第２の量を含む。ある実施形態において、時間差レジメン又は再投与レジメンにおける第３の組成物、第４の組成物、第５組成物、第６組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物、又はそれ以上が、環状ポリリボヌクレオチドの第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の量を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量と同じである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量と同じである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、又はそれ以上の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量と同じである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より少ない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より少ない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、又はそれ以上の量が環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より少ない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より多い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の量が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より多い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、又はそれ以上の量が環状ポリリボヌクレオチドの第１の量より多い。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量の１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下だけ変化する。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下少ない。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍～１０００倍多い。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍、１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍多い。ある実施形態において、後続の組成物（例えば、第１の組成物の後に投与される組成物）の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍、１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍多い。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍～１０００倍少ない。ある実施形態において、第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍、１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍少ない。ある実施形態において、後続の組成物（例えば、第１の組成物の後に投与される組成物）の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍、１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍少ない。ある実施形態において、後続の組成物（例えば、ある量の環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物の後）の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍～１０００倍多いか又は少ない。ある実施形態において、後続の組成物（例えば、ある量の環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物の後）の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より０．１倍、１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍多いか又は少ない。例えば、第１の組成物は、１倍の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第１の組成物と比較して５倍の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第３の組成物は、第１の組成物と比較して０．２倍の環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量と比較して少なくとも５倍の環状ポリリボヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、第１の組成物は、第２の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の組成物は、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、第１の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第２の組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物、又はそれ以上は、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。
ある実施形態において、第１の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。ある実施形態において、第２の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。ある実施形態において、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物、又はそれ以上は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いずれの担体も含まない。
ある実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、対象（例えば、哺乳動物）に送達される。例えば、本明細書に記載される組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）を送達する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載される組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）を、それを必要とする対象に非経口的に投与する工程を含む。別の例として、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）を対象に送達する方法は、組成物を対象に非経口的に投与する工程を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、担体を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、希釈剤を含み、任意の担体を含まない。ある実施形態において、非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に、又は局所的に行われる。
ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、経口投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、経鼻的に投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、吸入によって投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、局所的に投与される。ある実施形態において、組成物は、眼内に投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、直腸内に投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、注入によって投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、点滴によって投与される。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、非経口的に投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、頭蓋内に、髄腔内に、リンパ内に（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃｌｙ）、皮下に、又は筋肉内に投与される。ある実施形態において、組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、眼内投与、蝸牛内（内耳）投与、又は気管内投与によって投与される。ある実施形態において、本明細書に記載される送達の方法のいずれかは、担体を用いて行われる。ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの送達の方法は、担体を用いずに行われる。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物は、対象における応答を誘導し得る。ある実施形態において、対象における応答を誘導する方法は、対象における応答を誘導するために、結合部位を含み、及び／又はタンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物を提供する（例えば、投与する）工程を含む。特定の実施形態において、応答を誘導する方法は、エリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドを、対象に提供する（例えば、投与する）工程を含み、ここで、対象における環状ポリリボヌクレオチドからのエリスロポエチンの発現が、対象における網状赤血球の産生を誘導する。ある実施形態において、対象における応答レベルを誘導する方法は、（ａ）応答を誘導する本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を提供する（例えば、投与する）工程、及び工程（ａ）の１４日～９０日後に、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象に提供し（例えば、投与し）、それによって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、対象における応答レベルを誘導する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの組成物は、投与後に対象における応答又は応答レベルを誘導するために治療用タンパク質をコードする。ある実施形態において、エリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドの組成物が、対象における網状赤血球の産生を誘導するために対象に提供される。ある実施形態において、対象における網状赤血球を誘導する方法は、（ａ）エリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象に提供する（例えば、投与する）工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後に、エリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象に提供し（例えば、投与し）、それによって、対象における網状赤血球の産生を誘導する工程を含む。ある実施形態において、本方法は、工程（ａ）の６時間～３０日後に、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程を含む。ある実施形態において、本方法は、工程（ａ）の１４日～９０日後に、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程を含む。ある実施形態において、結合部位を含むか又はタンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを提供することからの応答レベルが、線状同等物のポリリボヌクレオチドからの応答レベルより高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象における応答レベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象に提供した後、対象における応答レベルを誘導する方法は、応答レベルを誘導するタンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が提供された後の応答レベルを含む、工程；及びタンパク質コードする環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が提供された後の応答レベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象における応答レベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象における応答レベルを維持する工程を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象における網状赤血球産生のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象に提供した後、対象における網状赤血球産生のレベルを誘導する方法は、エリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後の網状赤血球産生のレベルを含む、工程；及びエリスロポエチンをコードする環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後の網状赤血球産生のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象における網状赤血球産生のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象における網状赤血球産生のレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、投与（例えば、時間差投与又は再投与）の方法に使用される本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物（例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物など）は、環状ポリリボヌクレオチドの組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）中の総リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される組成物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子である。
時間差投与
複数の細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成するか、あるレベルのタンパク質を発現するか、又は複数の細胞内の標的へのあるレベルの結合を生成するための時間差投与の方法が、本明細書に開示される。対象（例えば、哺乳動物）に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した（例えば、投与した）後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成するか、あるレベルのタンパク質を発現するか、又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的へのあるレベルの結合を生成するための時間差投与の方法が、本明細書に開示される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物は、同じ組成物である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物は、異なる組成物である。ある実施形態において、同じ組成物は、同じタンパク質をコードするか又は同じ結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、異なる組成物は、異なるタンパク質をコードするか又は異なる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるタンパク質の発現を維持する方法は、（ａ）提供する（例えば、投与する）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物（例えば、ヒト）に提供する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供し（例えば、投与し）、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）における抗原の発現を維持する方法は、（ａ）抗原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、抗原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供し（例えば、投与し）、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、外因性の合成環状ポリリボヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、複製要素、又は両方を欠いている。
ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、若しくは９０日間、又はそれらの間の任意の時間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の６時間～４５日後である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の６時間～３０日後である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の６時間～３０日プラス環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質の半減期の後である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の１４日間～３０日プラス環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質の半減期の後である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の１４日間～６５日プラス環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質の半減期の後である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の２１日間～４１日プラス環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質の半減期の後である。
ある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは同じである。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは異なる。ある実施形態において、第１の組成物は、第１のタンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２のタンパク質をコードする第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、同じタンパク質である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１のタンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２のタンパク質をコードする第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、異なるタンパク質である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の結合部位を含む第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の結合部位及び第２の結合部位は、同じ結合部位である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の結合部位を含む第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の結合部位及び第２の結合部位は、異なる結合部位である。ある実施形態において、第１の組成物は、タンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチド及び結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物（例えば、ヒト）において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において２５％～７５％低下する前に行われる。ある実施形態において、本方法は、提供する（例えば、投与する）環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、哺乳動物に、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程をさらに含む。ある実施形態において、第３の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に行われる。ある実施形態において、第３の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び哺乳動物における第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、２５％～７５％だけ低下する前に行われる。
ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された後、６時間～９０日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された後、６時間～２７０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された後、６時間～３５日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物が提供された後、実質的に検出不可能である。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後及び対象（例えば、哺乳動物）における第１の組成物からの環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；それによって、哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、第１の組成物が提供された後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、哺乳動物における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された後及び哺乳動物における第１の組成物からの環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、哺乳動物において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、哺乳動物において２５％～７５％低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、哺乳動物において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、コードされたタンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、コードされたタンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）におけるコードされたタンパク質の発現を、少なくとも、コードされたタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、コードされたタンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、コードされたタンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；それによって、コードされたタンパク質の第１のレベルと比較して同様のレベルに、対象（例えば、哺乳動物）におけるコードされたタンパク質の発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質の発現を、少なくとも、タンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質の発現を、少なくとも、タンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成されるタンパク質のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供され得る（例えば、投与され得る）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、哺乳動物（例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。ある態様において、哺乳動物（例えば、ヒト）においてタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程であって、哺乳動物が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む。さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成されるタンパク質のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能である前に提供され得る（例えば、投与され得る）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において２５％～７５％だけ低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、細胞内の標的を結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、少なくとも、第１のレベルと同程度である、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、細胞内の標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、細胞内の標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された後及び細胞における第１の組成物からの結合のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において２５％～７５％だけ低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、細胞内の標的を結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、少なくとも、第１のレベルと同程度である、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、細胞内の標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、細胞内の標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、細胞における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された後及び細胞における第１の組成物からの結合のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において２５％～７５％だけ低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する工程は、第１の組成物が提供された後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的を結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、少なくとも、第１のレベルと同程度である、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的の結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び対象（例えば、哺乳動物）における第１の組成物からの結合のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供され得る（例えば、投与され得る）。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的を結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、少なくとも、第１のレベルと同程度である、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的の結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。ある実施形態において、対象（例えば、哺乳動物）における標的に結合する方法は、環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、結合の第１のレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、結合の第２のレベルを含み、結合の第２のレベルが、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後、第１のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、工程；それによって、対象（例えば、哺乳動物）における標的への結合を、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び対象（例えば、哺乳動物）における第１の組成物からの結合のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供され得る（例えば、投与され得る）。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に行われる。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に行われる。
ある実施形態において、時間差投与レジメン又は方法において第１の組成物及び第２の組成物の後、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のさらなる組成物が続き得る。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物は、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物は、第２の組成物の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供され（例えば、投与され）、それによって、第３の組成物が提供された後、環状ポリリボヌクレオチド、タンパク質、又は結合のレベルを、少なくとも第１のレベルに維持する。ある実施形態において、第３の組成物は、第２の組成物の後及び細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、タンパク質、又は結合のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第３の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、第１の組成物によって発現されるタンパク質、又は第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第３の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、第１の組成物によって発現されるタンパク質、又は第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第３の組成物は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、第１の組成物によって発現されるタンパク質、又は第１の組成物によって生成される結合の第１のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。時間差投与では、１つ以上のさらなる組成物が、前の組成物を提供した後及び前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、結合、又はタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物が、前の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、結合、又はタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物が、前の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、結合、又はタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において２５％～７５％だけ低下する前に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物が、前の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、結合、又はタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％超低下する前に提供される（例えば、投与される）。
ある実施形態において、第２の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻る前に、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻る前に、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる用量の第３の組成物が、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻る前に細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物が、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻る前に細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。
ある実施形態において、組成物が、前の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、ある時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。例えば、第２の組成物が、第１の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第１の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；第３の組成物が、第２の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第２の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；第４の組成物が、第３の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第３の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；又は第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の組成物が、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得る。第１の時間間隔は、第１の組成物を投与又は提供する前に、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、タンパク質のおよそのレベルに戻るのに必要な時間の量より短くなり得る。
ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第２の時間間隔より長い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第３の時間間隔より長い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルである。第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベル、例えば、第１の組成物を提供した２４時間～４８時間（例えば、１～２日）後からの環状ポリリボヌクレオチドのピーク量である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１～２日後、環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。
ある実施形態において、第２の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルは、第１の組成物を提供した後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルは、第１の組成物を提供した後、複数における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、結合の第１のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって維持される。ある実施形態において、結合の第１のレベルが、維持され、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって乱れる。ある実施形態において、第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における投与の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後、複数における結合の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルである。第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベル、例えば、タンパク質のピーク量は、第１の組成物を提供した２４時間～４８時間（例えば、１～２日）後に環状ポリリボヌクレオチドから発現した。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。ある実施形態において、タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。ある実施形態において、タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である。ある実施形態において、第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１～２日後のタンパク質の最高のレベルより少なくとも１倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１０００倍高い。
ある実施形態において、第２の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。ある実施形態において、第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される。
ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される。
ある実施形態において、第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物が提供された後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、第３の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物が提供された後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、タンパク質第１の組成物が提供された後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物が提供された後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、第１の組成物のタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第１の組成物のタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第１の組成物のタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物又はそれ以上を提供した後、維持される。維持されるタンパク質のレベルは、第１の組成物が提供された１日後の時点での細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルである。ある実施形態において、第１の組成物の後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第１の組成物の後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される。ある実施形態において、第１の組成物の後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第４の組成物、第５組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、第１０の組成物又はそれ以上を提供した後、維持される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルより１％～５％、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％、又は６０％～９８％高い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルより１％～５％、５％～１０％、１０％～１５％、１５％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９２％、９２％～９４％、９４％～９５％、９５％～９６％、９６％～９７％、９７％～９８％、９８％～９９％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９５％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９５％、又は６０％～９８％高い。
再投与
細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、細胞において環状ポリリボヌクレオチドのレベル、結合のレベルを生成し、又はタンパク質を発現するための再投与の方法が、本明細書に開示される。細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において環状ポリリボヌクレオチドのレベル、結合のレベルを生成し、又はタンパク質を発現するための再投与の方法が、本明細書に開示される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物は、同じ組成物である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物は、異なる組成物である。ある実施形態において、同じ組成物は、同じタンパク質をコードするか又は同じ結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、異なる組成物は、異なるタンパク質をコードするか又は異なる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の組成物は、第１のタンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２のタンパク質をコードする第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、同じタンパク質である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１のタンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２のタンパク質をコードする第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、異なるタンパク質である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の結合部位を含む第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の結合部位及び第２の結合部位は、同じ結合部位である。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の結合部位を含む第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の結合部位及び第２の結合部位は、異なる結合部位である。ある実施形態において、第１の組成物は、タンパク質をコードする第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、結合部位を含む第２の環状ポリリボヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるタンパク質の発現を維持する方法は、（ａ）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供し（例えば、投与し）、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、哺乳動物において実質的に検出不可能になった後に行われる。ある実施形態において、本方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後、哺乳動物に提供し（例えば、投与し）、それによって、哺乳動物におけるタンパク質を回復させる工程をさらに含む。
ある実施形態において、哺乳動物（例えば、ヒト）における抗原の発現を維持する方法は、（ａ）抗原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、哺乳動物に提供する（例えば、投与する）工程；及び（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、抗原をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、哺乳動物に提供し（例えば、投与し）、それによって、哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は９０日間、それらの間の任意の時間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、若しくは９０か月、又はそれらの間の任意の時間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０年間、又はそれらの間の任意の時間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、６時間～４５日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、６時間～３０日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、６時間～６５日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、３０日間～４５日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１４日間～３０日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、１４日間～４５日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、３０日間～６５日間である。ある実施形態において、第２の組成物を提供する（例えば、投与する）工程は、工程（ａ）の後、３０日間～９０日間である。
ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、６時間～９０日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した（例えば、投与した）後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、６時間～２７０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した（例えば、投与した）後、維持される。ある実施形態において、タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、６時間～３５日間にわたって、第１の組成物及び第２の組成物を提供した（例えば、投与した）後、実質的に検出不可能である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が提供された後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が提供された後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が提供された後、維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、細胞に提供された後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が提供された後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が提供された後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が提供された後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）においてあるレベルのタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）においてあるレベルのタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルを発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が提供された後のタンパク質のレベルを含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が提供された後のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）においてあるレベルのタンパク質を発現する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって生成されるタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能になった後に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが実質的に検出不可能になった後、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、及び第１の組成物の後、２０年間、１５年間、又は１０年間未満、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が提供された後、細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）においてあるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、：環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、少なくとも、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）においてあるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物が提供された後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、第２の組成物が提供された後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）においてあるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法は、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、第１の組成物が提供された（例えば、投与された）後、あるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する、第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後のタンパク質のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、外因性の合成環状ポリリボヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、複製要素、又は両方を欠いている。
ある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは同じである。ある実施形態において、第１の組成物は、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、第２の組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、第１の環状ポリリボヌクレオチド及び第２の環状ポリリボヌクレオチドは異なる。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物からの細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において実質的に検出不可能である前に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、実質的に検出不可能になった後、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、及び第１の組成物の後、２０年間、１５年間、又は１０年間未満、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞内の標的を結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の結合のレベルを含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞における結合のレベルの発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞内の標的に結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化する結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞における結合のレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において標的を結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルの結合を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物が提供された（例えば、投与された）後の対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルの発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）における標的に結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後のレベルの２０％以下だけ変化する結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した（例えば、投与した）後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した（例えば、投与した）後、対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルを維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞においてあるレベルの結合を生成するための方法は、結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が提供された後、あるレベルの結合を含む、工程；及び第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が提供された後のレベルの１％、５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％以下だけ変化する結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞における結合のレベルの発現を維持する工程を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）において標的を結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルの結合を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後の結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルの発現を維持する工程を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象（例えば、哺乳動物）に提供した後、対象（例えば、哺乳動物）における標的に結合する方法は、タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物が、提供された（例えば、投与された）後、あるレベルのタンパク質を含む、工程；及び環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象（例えば、哺乳動物）に提供する（例えば、投与する）工程であって、対象（例えば、哺乳動物）が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物が、提供された（例えば、投与された）後のレベルの２０％以下だけ変化する結合のレベルを含む、工程；それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルを維持する工程を含む。
さらに、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって生成されるタンパク質のレベルが、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）において実質的に検出不可能になった後に提供され得る。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物によって生成される細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルが実質的に検出不可能になった後、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えばヒト）に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、及び第１の組成物の後、２０年間、１５年間、又は１０年間未満、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。ある実施形態において、第２の組成物は、１分間～２０年間、又はそれらの間の任意の時間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に提供される（例えば、投与される）。
ある実施形態において、再投与レジメン又は方法において第１の組成物及び第２の組成物の後、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のさらなる組成物が続き得る。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物は、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物を含む。再投与では、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物を提供した後及び前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、結合又はタンパク質のレベルが、複数の細胞（例えば、対象）において実質的に検出不可能になった後に提供され得る。例えば、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチド、前の組成物によって生成される結合、又は前の組成物によって発現されるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、複数に提供される。再投与では、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物を提供した後に提供され得る。例えば、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物を提供した後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物を提供した後、１分間～２０年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物は、前の組成物を提供した後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間であるが、２０年間、１５年間、又は１０年間以下、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。
ある実施形態において、第２の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後に細胞又は対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に投与又は提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のタンパク質のおよそのレベルに戻った後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第３の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第３の組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物が、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物が、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。ある実施形態において、上述される組成物は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻った後、１分間～２０年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。
ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後、細胞に投与又は提供される。ある実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物を提供した後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞に提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第３の組成物は、第１の組成物を提供した後、細胞に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第３の組成物は、第１の組成物を提供した後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物が、第１の組成物を提供した後、細胞に投与又は提供される。ある実施形態において、１つ以上のさらなる組成物の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれ以上の組成物が、第１の組成物を提供した後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞に投与又は提供される。ある実施形態において、上述される組成物は、第１の組成物を提供した後、１分間～２０年間、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。
ある実施形態において、組成物が、前の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、ある時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供される。例えば、第２の組成物が、第１の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第１の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；第３の組成物が、第２の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第２の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；第４の組成物が、第３の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第３の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得；又は第５、第６、第７、第８、第９、若しくはそれ以上の組成物が、第４、第５、第６、第７、第８、第９、若しくはそれ以上の組成物を、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供した後、第４、第５、第６、第７、第８、第９、若しくはそれ以上の時間間隔の後、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）に投与又は提供され得る。第１の時間間隔は、細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、第１の組成物を投与又は提供する前のおよそのタンパク質のレベルに戻るのに必要な時間の量より長くなり得る。
ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔と同じである。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第５、第６、第７、第８、第９、又はそれ以上の時間間隔は、第１の時間間隔より短い。ある実施形態において、第２の時間間隔は、第１の時間間隔より長い。ある実施形態において、第３の時間間隔は、第２の時間間隔より長い。ある実施形態において、第４の時間間隔は、第３の時間間隔より長い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象（例えば、哺乳動物）における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い。
環状ポリリボヌクレオチド
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及びその組成物又は医薬組成物は、複数に、少なくとも２つの用量の環状ポリリボヌクレオチドを提供した後、複数の細胞において環状ポリリボヌクレオチドのレベル、標的への結合のレベル、又はタンパク質のレベルを生成するための、投与の治療的及び獣医学的方法において使用され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せにおいて複製することが可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含むように改変される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物のための配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、標的への結合のための結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される投与、時間差投与、又は再投与方法のいずれかによって、複数の細胞に提供される。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、対象における応答又は応答レベルを誘導する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドに含まれる配列によってコードされる発現産物は、複数の細胞における細胞の１つ以上において発現される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等物、例えば、線状発現配列、又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより増加した半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上だけ長い。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、若しくはそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分裂している間、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分裂後に、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間超～約３０日間、又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、分割している細胞内での半減期又は持続性を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば一時的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間～約３０日間又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例えば約３０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化される。ｖ
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るときに環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングと、標的に送達する能力によって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態において、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれ以上の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％減少しない。ある場合において、ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれ以上にわたって、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％を超えて変化しないレベルに維持される。
発現配列
細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、細胞における発現配列からのあるレベルのタンパク質を生成する投与方法が、本明細書に開示され、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このようなペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
ポリペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
ペプチド又はポリペプチドのいくつかの例としては、限定はされないが、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペプチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載される本発明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば抗原結合抗体又は抗体様フラグメント、例えば一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照されたい）。このような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、小器官内抗原に結合し得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ発現配列を含み、これらは、それぞれポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドは、かなりの量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、発現配列の発現産物は、タンパク質、例えば治療用タンパク質である。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば癌）、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。ある実施形態において、治療用タンパク質は、抗原である。ある実施形態において、抗原は、腫瘍抗原、細菌抗原、又はウイルス抗原である。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ、及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、酵素、例えば、オキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、及びデサチュラーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼを発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エリスロポエチンを発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、膜タンパク質、又は膜貫通タンパクが挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、膜貫通受容体、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、抗原受容体、又はキメラ抗原受容体を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質、例えば、蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ化タンパク質、例えば、タンパク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（ＨＨＨＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、抗体フラグメント、又はその部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント、又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
細胞に、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２つの組成物を提供した後、細胞においてあるレベルのタンパク質を生成する投与方法が、本明細書に開示され、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。
タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、又は分泌タンパク質であり得る。タンパク質は、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に限局され得るポリペプチドであり得る。タンパク質としては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
ある実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又は輸送活性を有し得る。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば癌）、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ若しくはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体、及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。ある実施形態において、治療用タンパク質は、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒト第ＩＸ因子、ＲＥＰ１、アデノシンデアミナーゼ、ヒトＮＧＦ、核にコードされたＮＤ４、ＳＥＣＲＡ２ａ、ＳＵＭＯ１、ＶＥＧＦ、ＰＤＥ６Ａ、ｐ５３、ＰＢＦＤ、ＡＲＳＡ、ＡＢＣＤ１、ＡＰＯＥ４、ＲＰＧＲ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＶＥＧＦ １６５、ＰＤＧＦ－Ｂ、γ－サルコグリカン、ジストロフィン、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＣＮＧＢ３、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節剤、又はＣＬＮ６である。
ある実施形態において、タンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ、及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質））が挙げられる。ある実施形態において、タンパク質は、ＥＧＦ（上皮成長因子）である。ある実施形態において、例示的なタンパク質は、酵素、例えば、オキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、及びデサチュラーゼである。ある実施形態において、本明細書に開示される例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある場合において、分泌タンパク質は、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得るか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。ある場合において、タンパク質は、非ヒトタンパク質、例えば、蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグである。ある実施形態において、タンパク質は、タグ化タンパク質、例えば、タンパク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（ＨＨＨＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）である。
ある実施形態において、タンパク質は、抗体、例えば、抗体フラグメント、又はその部分である。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、タンパク質は、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント、又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分である。ある実施形態において、タンパク質は、抗体の１つ以上の部分である。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。タンパク質発現は、１つ以上の細胞、例えば、第１の組成物、第２の組成物、第３の組成物、第４の組成物、第５の組成物、第６の組成物、第７の組成物、第８の組成物、第９の組成物、又は第１０の組成物を細胞に提供した後の細胞において行われ得る。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、ポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸、又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸、又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、本方法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される別個のポリペプチド又はその両方への環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクション又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。ある実施形態において、翻訳は、例えば、環状ポリリボヌクレオチドの組成物を細胞に提供した後、１つ以上の細胞において行われる。
ある態様において、本開示は、対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又は又はそれ以上の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列が、約４０％を超えて低下しないように発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれ以上にわたって約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与は、本明細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出生後投与、経口、注入（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、頭蓋内、髄腔内、リンパ内、皮下及び筋肉内）、眼内投与、蝸牛内（内耳）投与、鼻腔内投与、気管内投与、及び吸入投与によるものが挙げられる。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、折り畳み、又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、例えば、細胞機構を介したインビボ又は細胞内での翻訳後修飾を含む。
結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位をコードする。少なくとも１つの結合部位は、タンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡなどの標的に結合し得る。少なくとも１つの結合部位は、タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、又はＤＮＡ結合部位であり得る。少なくとも１つの結合部位は、少なくとも１つの治療特性を、細胞に与える。ある実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、核酸（例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド）局在化を、細胞に与える。ある実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、核酸活性（例えば、ｍｉＲＮＡを含む細胞内で核酸分解をもたらすｍｉＲＮＡ結合部位である）を、環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞に与える。ある実施形態において、少なくとも１つの結合部位は、細胞の表面上の細胞受容体に結合する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位が、細胞の表面上の細胞受容体に結合するとき、本明細書に記載されるように細胞に取り込まれる。ある実施形態において、少なくとも結合部位は、細胞への環状ポリリボヌクレオチドの内在化に役立つ線状ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。例えば、線状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１つの結合部位にハイブリダイズする領域及び細胞の表面上の細胞受容体に結合する領域を含む。ある実施形態において、細胞受容体に結合する線状ポリリボヌクレオチドの領域は、結合後に環状ポリリボヌクレオチドにハイブリダイズされた線状ポリリボヌクレオチドの内在化をもたらす。
ある場合において、環状ＲＮＡは、結合部位を含む。結合部位は、アプタマーを含み得る。ある場合において、環状ＲＮＡは、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、環状ＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の結合部位を含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、１つ以上の標的、又は１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に結合する分子足場である。各標的は、限定はされないが、異なるか又は同じ核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬剤）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、それらのいずれかのフラグメント、及びそれらの任意の組合せであり得る。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的に結合する。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的の１つ以上の結合部分に結合する。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、１つ以上の異なる標的に結合する。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、異なる標的の１つ以上の結合部分に結合する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として働く。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として働く。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に特異的に結合することによって、細胞過程を調節する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に特異的に結合することによって、細胞過程を調節する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的に特異的に結合することによって、細胞過程を調節する。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ＲＮＡは、対象とする１つ以上の特異的標的のための結合部位を含む。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、対象とする各標的のための複数の結合部位又は結合部位の組合せを含む。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、対象とする各結合部分のための複数の結合部位又は結合部位の組合せを含む。例えば、環状ＲＮＡは、ポリペプチド標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｍＲＮＡ標的、ｒＲＮＡ標的、ｔＲＮＡ標的、又はゲノムＤＮＡ標的などのポリヌクレオチド標的のための１つ以上の結合部位を含む。
ある場合において、環状ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、抗体のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ウイルス粒子のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、小分子のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、細胞内又は細胞において結合する結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、アプタマーのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチドのための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タグ化タンパク質、抗体、抗体フラグメント、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパクを含むウイルス粒子）、又は細胞のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、抗体における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ウイルス粒子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、小分子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、細胞内又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、アプタマーにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、環状ＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タグ化タンパク質、抗体、抗体フラグメント、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパクを含むウイルス粒子）、又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。
ある場合において、結合部位は、少なくとも２つのアミド結合を含む標的の一部に結合する。ある場合において、結合部位は、ホスホジエステル結合を含む標的の一部に結合しない。ある場合において、標的の一部は、ＤＮＡ又はＲＮＡでない。ある場合において、結合部分は、少なくとも２つのアミド結合を含む。ある場合において、結合部分は、ホスホジエステル結合を含まない。ある場合において、結合部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡでない。
本明細書において提供される環状ＲＮＡは、複合体における結合部分のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書において提供される環状ＲＮＡは、複合体を形成するために、標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。例えば、本明細書において提供される環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡと標的との間に複合体を形成するための足場として働き得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、単一の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、２つの標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、３つの標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、４つの標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、５つ以上の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、３つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。ある実施形態において、２つ以上の環状ＲＮＡは、単一の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、２つ以上の環状ＲＮＡは、２つ以上の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の環状ＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分及び第２の標的の第２の異なる結合部分と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の環状ＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分と複合体を形成し、第２の環状ＲＮＡは、第２の標的の第２の結合部分と複合体を形成する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せのための結合部位を含み得る。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せにおける１つ以上の結合部分のための結合部位を含み得る。
ある場合において、結合部位は、ポリペプチド、タンパク質、又はそのフラグメントに結合する。ある実施形態において、結合部位は、標的のドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はポリペプチド、タンパク質、若しくはそのフラグメントの一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、若しくは組み換えポリペプチドの一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は抗体若しくはそのフラグメントの一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は転写因子の一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は受容体の一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜貫通受容体の一部に結合する。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離、精製、及び／若しくは組み換えポリペプチドの一部に結合し得る。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分析物（例えば、溶解物）の混合物の一部に結合し得る。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は複数の細胞に由来するか若しくは単一細胞の溶解物に由来する部分に結合する。結合部位は、標的の結合部分に結合し得る。ある場合において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はそのフラグメント上にある。ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はポリペプチド、タンパク質、若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、若しくは組み換えポリペプチドの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は抗体若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は転写因子の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は受容体の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜貫通受容体の一部を含む。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離、精製、及び／若しくは組み換えポリペプチドの一部上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分析物（例えば、溶解物）の混合物の一部の上にある結合部分又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は複数の細胞に由来するか若しくは単一細胞の溶解物に由来する部分上にあるか又はそれらを含む。
ある場合において、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は化合物（例えば、小分子）の一部に結合する。例えば、結合は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は薬剤の一部薬剤の一部に結合する。例えば、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は化合物の一部に結合する。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は有機化合物の一部に結合する。ある場合において、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は９００ダルトン以下の分子量を有する小分子の一部に結合する。ある場合において、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は５００ダルトン以上の分子量を有する小分子の一部に結合する。結合部位が結合する小分子の一部は、例えば、組合せ手段によって生成される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然又は合成分子のライブラリーから得られる。コンビナトリアルライブラリー、並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当該技術分野において公知であり、米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される。結合部位は、小分子の結合部分に結合し得る。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は薬剤の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は有機化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は９００ダルトン以下の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は５００ダルトン以上の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。結合部分は、例えば、組合せ手段によって生成される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然又は合成分子のライブラリーから得られる。コンビナトリアルライブラリー、並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当該技術分野において公知であり、米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される。
結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは特異的結合対のメンバー（例えば、リガンド）の一部に結合し得る。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は１価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））若しくは多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の部分に結合し得る。結合部位は、標的の抗原性又はハプテン性部分に結合し得る。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は少なくとも１つの共通のエピトープ又は若しくは決定基を共有する単一の分子又は複数の分子の部分に結合し得る。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、若しくは動物細胞）の部分の一部に結合し得る。結合部位は、自然な環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、若しくはウイルス）、又は溶解細胞中にある標的に結合し得る。結合部位は、（例えば、化学的に）修飾されて、限定はされないが、色素（例えば、蛍光色素）、リン酸基、炭水化物基などのポリペプチド修飾部分、又はメチル基などのポリヌクレオチド修飾部分などの１つ以上のさらなる結合部位を提供する標的の一部に結合し得る。結合部位は、特異的結合対のメンバーの結合部分に結合し得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は特異的結合対のメンバー（例えば、リガンド）の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は１価（モノエピトープ）若しくは多価（ポリエピトープ）の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、抗原性又はハプテン性であり得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は少なくとも１つの共通のエピトープ若しくは決定基を共有する単一の分子若しくは複数の分子の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、若しくは動物細胞）の部分の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、自然な環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、若しくはウイルス）、又は溶解細胞中のいずれかにあり得る。結合部分は、（例えば、化学的に）修飾されて、限定はされないが、色素（例えば、蛍光色素）、リン酸基、炭水化物基などのポリペプチド修飾部分、又はメチル基などのポリヌクレオチド修飾部分などの１つ以上のさらなる結合部位を提供し得る。
ある場合において、結合部位は、宿主由来のサンプルに見られる、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分子の一部に結合する。結合部位は、宿主由来のサンプルに見られる、分子の結合部分に結合し得る。ある場合において、結合部分は、宿主由来のサンプルに見られる、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。宿主由来のサンプルは、体液（例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、唾液、脳脊髄液、涙液、粘液など）を含む。サンプルは、直接調べられ得、又は結合部分をより容易に検出可能にするように前処理されてもよい。サンプルは、生物又は元生物に由来するある量の物質を含む。サンプルは、天然、組み換え、合成、又は非天然であり得る。結合部位は、細胞溶解物又は細胞培養培地、インビトロ翻訳サンプル、又はサンプル（例えば、細胞溶解物）由来の免疫沈降において、自然に又は組み換えにより細胞から発現される上記のいずれかに結合し得る。結合部分は、細胞溶解物又は細胞培養培地、インビトロ翻訳サンプル、又はサンプル（例えば、細胞溶解物）由来の免疫沈降において、自然に又は組み換えにより細胞から発現される上記のいずれかであり得る。
ある場合において、結合部位は、無細胞系又はインビトロで発現される標的に結合する。例えば、結合部位は、細胞抽出物中の標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ＤＮＡ鋳型、並びに転写及び翻訳用の試薬と共に細胞抽出物中にある標的に結合する。結合部位は、無細胞系又はインビトロで発現される標的の結合部分に結合し得る。ある場合において、標的の結合部分は、無細胞系又はインビトロで発現される。例えば、標的の結合部分は、細胞抽出物中にある。ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型、並びに転写及び翻訳用の試薬と共に細胞抽出物中にある。使用され得る細胞抽出物の例示的な供給源としては、小麦胚芽、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、超好熱菌、ハイブリドーマ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。標的ポリペプチドを発現させる（例えば、アレイ上に標的ポリペプチドを生成する）のに使用され得る例示的な無細胞方法としては、タンパク質インサイチュアレイ（ＰＩＳＡ）、複数スポッティング技術（ＭＩＳＴ）、自己集合ｍＲＮＡ翻訳、核酸プログラム可能タンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）、ナノウェルＮＡＰＰＡ、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイ（ＤＡＰＡ）、膜フリーＤＡＰＡ、ナノウェルコピー及びμＩＰ－マイクロインタリオプリント、及びｐＭＡＣ－タンパク質マイクロアレイコピーが挙げられる（Ｋｉｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１４，１４，３５２－３６４を参照されたい）。
ある場合において、結合部位は、ＤＮＡ鋳型からインサイチュで（例えば、並んだ固体基質上で）合成される標的に結合する。結合部位は、インサイチュで合成される標的の結合部分に結合し得る。ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型からインサイチュで（例えば、並んだ固体基質上で）合成される。ある場合において、複数の結合部分は、並行して又は単一の反応において、複数の対応するＤＮＡ鋳型からインサイチュで合成される。インサイチュの標的ポリペプチド発現のための例示的な方法としては、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８（９）：Ｒ１７７－Ｒ１８５（２０００）；Ｋａｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：１５０－６．（２００５）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１）：４－９．（２００８）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８０）：８６－９０．（２００４）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１５）：Ｅ７３－３（２００１）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（９）：１６５８－６６（２００６）；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１０）：１２５３－４（２００６）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６（７）：１８４４－９（２００４）；Ｋｉｎｐａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６（２）：１４９－５４（２００４）；Ｔａｋｕｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（８）：４３８２－９１（２０１２）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１７５－７（２００８）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ及びＪ．ＬａＢａｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７（４）：３３４－３３６（２００６）；Ｈｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２４（４）：３７５－８０（２００７）；及びＨｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７４（１－２）：２６５－７０（２００３）に記載されるものが挙げられる。
ある場合において、結合部位は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドの範囲を含む核酸標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ヌクレオチドの連続した区間を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ヌクレオチドの不連続の区間を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、核酸配列中のヌクレオチドの欠失、付加、交換（ｓｗａｐ）、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む核酸標的に結合する。結合部位は、核酸標的の結合部分に結合し得る。ある場合において、核酸標的の結合部分は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドの範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの不連続の区間を含む。ある場合において、核酸標的の結合部分は、核酸配列中のヌクレオチドの欠失、付加、交換、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある場合において、結合部位は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸の範囲を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、アミノ酸の連続した区間を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、アミノ酸の不連続の区間を含むタンパク質標的に結合する。ある場合において、結合部位は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含むタンパク質標的に結合する。結合部位は、タンパク質標的の結合部分に結合し得る。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸の範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の不連続の区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある実施形態において、結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは膜結合タンパク質の一部に結合する。結合部位は、膜結合タンパク質の結合部分に結合し得る。ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは膜結合タンパク質の一部の上にあるか又はそれらを含む。例示的な膜結合タンパク質としては、限定はされないが、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、非興奮性及び興奮性チャネル、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、成長因子及びホルモン受容体（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）、及びその他が挙げられる。結合部位は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜結合タンパク質の突然変異体若しくは修飾変異体の一部に結合し得る。結合部位は、膜結合タンパク質の突然変異体若しくは修飾変異体の結合部分に結合し得る。結合部分はまた、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜結合タンパク質の突然変異体若しくは修飾変異体の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。例えば、ＧＰＣＲのある１つ又は複数の点突然変異は、機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Ｓｔａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １８：４３０－３７を参照されたい）。
結合部位は、例えば、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はユビキチンリガーゼの一部に結合する。結合部位は、例えば、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はユビキチンアダプター、プロテアソームアダプター、若しくはプロテアソームタンパク質の一部に結合する。結合部位は、例えば、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はエンドサイトーシス、食作用、リソソーム経路、オートファジー経路、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロンを介したオートファジー、多小胞体経路、若しくはそれらの組合せに関与するタンパク質の一部に結合する。
ＲＮＡ結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節するＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡのための配列）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、ＲＮＡを安定させるか若しくは分解を標的にすることなどによってＲＮＡを不安定にする配列、又はＤＮＡ－又はＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合するアプタマー配列を含む。アプタマー配列は、内在性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡのための配列）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外因性核酸、ＲＮＡ、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、ＲＮＡを安定させるか若しくは分解を標的にすることなどによってＲＮＡを不安定にする配列、又はＤＮＡ－又はＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合し得る。アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合し得る。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへのアプタマー配列の結合によって、ＲＮＡと複合体を形成し得る。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のうちの１つであり得る。ＲＮＡ結合部位は、当業者に周知である。
特定のＲＮＡ結合部位が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に、１５～５０塩基対（約１８～２５塩基対など）を有し、且つ細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）若しくはほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有するＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、及びダイサー基質（ｄｉｃｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が挙げられる。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡ遺伝子のプロセシング経路中の中間体に類似している。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて、標的遺伝子を下方制御し得るが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によってタンパク質出力を減少させる。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ３’－ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである。この領域は、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御することができる。３’－ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強い下方制御を与えることができる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’－ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、又はｍｉＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、任意のｍｉＲＮＡに対応し得る。
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対するワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８又は２～７位を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。
ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補性であり得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。
環状ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５～約２５連続ヌクレオチドと同一のｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０％～７０％、約３０％～６０％、約４０％～６０％、又は約４５％～５５％のＧＣ－含量を含み、例えば、標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を調節するために、環状ポリリボヌクレオチドから出るように操作され得る（すなわち、そのような環状ポリリボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、導入若しくは除去又は１つ若しくはいくつかのｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位は、細胞における核酸活性を与える）を通して行われ得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞ｓ（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。ＭｉＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、このようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、環状ポリリボヌクレオチドからの発現を調整するために除去又は導入され得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ－７を含む。
様々な細胞型のｍｉＲＮＡの発現パターンの理解により、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、環状ポリリボヌクレオチドは、組織において又は生物学的条件に関連して最適なタンパク質発現のために設計され得る。
さらに、ｍｉＲＮＡシード部位は、環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この例は、ｍｉＲ－１４２部位の組み込みである。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすこともできる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に対して相補的な配列との少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを含む。
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、長鎖ノンコーディングＲＮＡを含む。長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を含む。より長い長さは、ｌｎｃＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び他の短鎖ＲＮＡなどの小分子調節ＲＮＡと区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡは、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡが、近傍の遺伝子の転写を調節し得る。
ＲＮＡ結合部位の長さは、約５～３０ヌクレオチド、約１０～３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、若しくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。対象とする標的とのＲＮＡ結合部位の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の大きい遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。ＬｉｎｃＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成する。ＬｉｎｃＲＮＡは、ノンコーディング転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌクレオチドを超える長さである。ある実施形態において、ｌｉｎｃＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子と類似のエクソン－イントロン－エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレームを包含せず、タンパク質をコードしない。ＬｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく組織特異的であり得る。ＬｉｎｃＲＮＡは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にではあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状化ｌｉｎｃＲＮＡを含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ、例えば、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ００３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１－７３４、ＬＩＮＣ０１６０８、ＣＣ－４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、及びＲＰ１１－１９１を含む。
公知のｌｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄｉａｍａｎｔｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、及びＳｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＬｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的な配列は、イントロンとエクソンとの間の境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。相補的な配列は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって遺伝子に特異的であり得、その翻訳を防止し得る。ＲＮＡ結合部位は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドなどの、内在性遺伝子又は遺伝子産物の全て又はフラグメントに対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含み得る。
ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的な配列は、イントロンとエクソンとの間の境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。相補的な配列は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって遺伝子に特異的であり得、その翻訳を防止し得る。ＲＮＡ結合部位は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドなどの、内在性遺伝子又は遺伝子産物の全て又はフラグメントに対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含み得る。
ＲＮＡ結合部位は、線状ポリリボヌクレオチドの領域に対して実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的な配列は、線状ポリリボヌクレオチドへの環状ポリリボヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための線状ポリリボヌクレオチドの領域に対して特異的であり得る。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、細胞における受容体などのタンパク質への結合のための領域も含む。ある実施形態において、細胞受容体に結合する線状ポリリボヌクレオチドの領域は、結合後に、細胞への、環状ポリリボヌクレオチドにハイブリダイズされた線状ポリリボヌクレオチドの内在化をもたらす。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に、約５～５０００塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えば、ｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００～５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ結合部位を含む。
ＤＮＡ結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のための配列などのＤＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列に対する相補体を含む。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。ガイドＲＮＡ配列は、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であり得る。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用され得る。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて行われ得る。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であり得る。
ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー、若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
ある実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得る。ｇＲＮＡ配列は、ＤＮＡを切断するために、Ｃａｓ９又は他のエキソヌクレアーゼとの相互作用のために、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のヌクレオチドを含み得、例えば、Ｃｐｆ１が、検出可能なＤＮＡ切断のために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドと相互作用する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡに結合し得るアプタマー配列を含む。アプタマー配列の二次構造は、ＤＮＡに結合し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡへのアプタマー配列の結合によって、ＤＮＡと複合体を形成する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡにおける主溝に結合する配列を含む。１つのこのような場合、環状ポリリボヌクレオチド及び二本鎖ＤＮＡによって生じる三つ組構造の特異性及び安定性は、フーグスティーン型水素結合によって得られ、これは、二本鎖ＤＮＡにおける古典的なワトソン・クリック塩基対合において形成されるものと異なる。一例において、環状ポリリボヌクレオチドは、主溝を介して標的二本鎖のプリンリッチ鎖に結合する。
ある実施形態において、三つ組形成は、標的二本鎖のプリンリッチ鎖と比べて、環状ポリリボヌクレオチドの配向によって区別される２つのモチーフにおいて起こる。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中のポリピリミジン配列区間が、平行に（すなわち、二本鎖のプリンリッチ鎖と同じ５’から３’の配向で）フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖ＤＮＡのポリプリン配列区間に結合する一方、ポリプリン区間（Ｒ）は、逆フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖のプリン鎖に逆平行に結合する。逆平行において、プリンモチーフは、Ｇ：Ｇ－Ｃ、Ａ：Ａ－Ｔ、又はＴ：Ａ－Ｔの三つ組を含む一方；平行において、ピリミジンモチーフは、Ｃ＋：Ｇ－Ｃ又はＴ：Ａ－Ｔ三つ組（ここで、Ｃ＋が、Ｎ３位におけるプロトン化シトシンを表す）の標準的な三つ組を含む。環状ポリリボヌクレオチド中の逆平行ＧＡ及びＧＴ配列は、中性ｐＨで安定した三つ組を形成し得る一方、環状ポリリボヌクレオチド中の平行ＣＴ配列は、酸性ｐＨで結合し得る。環状ポリリボヌクレオチド中のシトシンにおけるＮ３は、プロトン化され得る。５－メチル－ＣによるＣの置換は、５－メチル－Ｃがシトシンより高いｐＫを有するため、生理的ｐＨで、環状ポリリボヌクレオチド中のＣＴ配列の結合を可能にし得る。プリン及びピリミジンモチーフの両方について、少なくとも１０塩基対の連続したホモプリン－ホモピリミジン配列区間は、二本鎖ＤＮＡへの環状ポリリボヌクレオチドの結合を補助するが、これは、より短い三つ組は、生理的条件下で不安定であり得、配列の中断は、三つ組構造を不安定にし得るためである。ある実施形態において、三つ組形成のためのＤＮＡ二本鎖標的は、１つの鎖中に連続したプリン塩基を含む。ある実施形態において、三つ組形成のための標的は、ＤＮＡ二本鎖の１つの鎖中にホモプリン配列及び相補鎖中にホモピリミジン配列を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三つ組は、安定した構造である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三つ組は、例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上増加される、増加した半減期、例えば、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって持続性を示す。
タンパク質結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、タンパク質結合部位は、アプタマー配列を含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、タンパク質結合部位を欠いた環状ポリリボヌクレオチド、例えば、線状ＲＮＡによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるタンパク質結合部位を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームに結合する１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクする、例えば、ＣＴＬ応答を回避するために、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを非内在性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに、第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列を含む。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合し、例えば、２つ以上のタンパク質を近接させる足場として働く１つ以上のタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合し、それによって、標的タンパク質を近接させる２つのタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合し、それによって、３つの標的タンパク質を近接させる３つのタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合し、それによって、４つの標的タンパク質を近接させる４つのタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合し、それによって、５つ以上の標的タンパク質を近接させる５つ以上のタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、標的タンパク質は、同じである。ある実施形態において、標的タンパク質は、異なる。ある実施形態において、標的タンパク質を近接させることは、タンパク質複合体の形成を促進する。例えば、本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０又はそれ以上の標的タンパク質を含む複合体の形成を促進するために、足場として働き得る。ある実施形態において、２つ以上の標的タンパク質を近接させることは、２つ以上の標的タンパク質の相互作用を促進する。ある実施形態において、２つ以上の標的タンパク質を近接させることは、酵素反応を、調節、促進、又は阻害する。ある実施形態において、２つ以上の標的タンパク質を近接させることは、シグナル伝達経路を、調節、促進、又は阻害する。
ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ｐ５３、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＦＯＸ３、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
ある実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合する核酸配列、例えば、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヒストン、又はＤＮＡに結合する任意の他のタンパク質に結合し得る配列である。ある実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合するアプタマー配列である。ある実施形態において、アプタマー配列の二次構造は、タンパク質に結合する。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、アプタマー配列をタンパク質に結合することによって、タンパク質と複合体を形成する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、小分子又はその一部にコンジュゲートされ、ここで、小分子又はその一部は、タンパク質などの標的に結合する。小分子は、例えばクリック化学によって、修飾ヌクレオチドを介して環状ＲＮＡにコンジュゲートされ得る。タンパク質に結合し得る小分子の例としては、限定はされないが、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、ＡＣ２２０、アファチニブ、アミノピラゾール類似体、ＡＲアンタゴニスト、ＢＩ－７２７３、ボスチニブ、セリチニブ、クロロアルカン、ダサチニブ、フォレチニブ、ゲフィチニブ、ＨＩＦ－１α由来（Ｒ）－ヒドロキシプロリン、ＨＪＢ９７、ヒドロキシプロリン系リガンド、ＩＡＣＳ－７ｅ、イブルチニブ、イブルチニブ誘導体、ＪＱ１、ラパチニブ、ＬＣＬ１６１誘導体、レナリドミド、ニュートリン小分子、ＯＴＸ０１５、ＰＤＥ４阻害剤、ポマリドミド、ｒｉｐｋ２阻害剤、ＲＮ４８６、Ｓｉｒｔ２阻害剤３ｂ、ＳＮＳ－０３２、造血幹細胞因子、ＴＢＫ１阻害剤、サリドマイド、サリドマイド誘導体、チアゾリジンジオン系リガンド、ＶＨ０３２誘導体、ＶＨＬリガンド２、ＶＨＬ－１、ＶＬ－２６９、及びそれらの誘導体が挙げられる。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の小分子にコンジュゲートされる。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の異なる小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０つ、又はそれ以上の異なる小分子にコンジュゲートされる。ある実施形態において、環状ＲＮＡにコンジュゲートされる２つ以上の小分子は、それらのそれぞれの標的タンパク質を近接させて動員するように構成され、これは、標的タンパク質、及び／又は他の分子の間の相互作用、及び細胞変化をもたらし得る。例えば、環状ＲＮＡは、ＪＱ１及びサリドマイド、又はその誘導体の両方にコンジュゲートされ得、これは、ひいては、ＪＱ１の標的タンパク質、例えば、ＢＥＴファミリータンパク質、及びサリドマイドの標的タンパク質、例えば、Ｅ３リガーゼを動員し得る。ある場合において、ＪＱ１及びサリドマイドにコンジュゲートされる環状ＲＮＡは、ＪＱ１、又はその誘導体を介してＢＥＴファミリータンパク質を動員し、サリドマイド又はその誘導体によって動員されるＥ３リガーゼによってユビキチンでＢＥＴファミリータンパク質をタグ化し、したがって、タグ化ＢＥＴファミリータンパク質の分解をもたらす。
他の結合部位
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ＲＮＡ又は非ＤＮＡ標的への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、結合部位は、小分子、アプタマー、脂質、炭水化物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、又はその任意のフラグメント結合部位のうちの１つであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、脂質への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、膜への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、多成分複合体、例えば、リボソーム、ヌクレオソーム、転写機構などへの１つ以上の結合部位を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含む。アプタマー配列は、本明細書に記載される任意の標的（例えば、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、脂質など）に結合し得る。アプタマー配列は、標的に結合し得る二次構造を有する。ある実施形態において、アプタマー配列は、標的に結合し得る三次構造を有する。ある実施形態において、アプタマー配列は、標的に結合し得る四次構造を有する。環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を介して標的に結合して、複合体を形成し得る。ある実施形態において、複合体は、少なくとも５日間にわたって検出可能である。ある実施形態において、複合体は、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間にわたって検出可能である。
標的
少なくとも１つの結合部位は、標的に結合し得る。少なくとも１つの結合部位は、標的に結合する少なくとも１つのアプタマー配列を含み得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上の標的のための１つ以上の結合部位を含む。標的としては、限定はされないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬剤、蛍光体、代謝物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞小器官、細胞、他の細胞部分、それらのいずれかのフラグメント、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。（例えば、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：４７３－７７；Ｇｕｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＰＮＡＳ、１０１：８４２０－２４を参照されたい）。例えば、標的は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、１つ以上の二本鎖領域及び１つ以上の一本鎖領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗体の混合物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せである。
ある実施形態において、標的は、ポリペプチド、タンパク質、又はその任意のフラグメントである。例えば、標的は、精製ポリペプチド、単離ポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞の膜若しくはウイルス若しくはビリオンに結合されたか又はそれにわたるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ホスホジエステラーゼ、シクラーゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外基質タンパク質、リガーゼ、ユビキチンリガーゼ、翻訳後修飾に影響を与える任意のリガーゼ、イオン輸送体、チャネル、細孔（ｐｏｒｅ）、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常発現するタンパク質、転写因子、転写制御因子、翻訳タンパク質、エピジェネティック因子、エピジェネティック制御因子、クロマチン制御因子、シャペロン、分泌タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、成長因子受容体、核内受容体、ホルモン受容体、シグナル伝達物質、抗体、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、繊維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せであり得る。ある実施形態において、標的は、異種ポリペプチドである。ある実施形態において、標的は、トランスフェクションなどの分子技術を用いて、細胞内で過剰発現されるタンパク質である。ある実施形態において、標的は、組み換えポリペプチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生されるサンプル（例えば、生物によって過剰発現されるタンパク質）である。ある実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリペプチドである。ある実施形態において、標的は、細胞（例えば、健常な細胞又は疾患若しくは病態に関連する細胞）によって自然に発現されるポリペプチドである。ある実施形態において、標的は、生物に免疫を与えるか、又は抗体産生などの、生物における免疫応答を生成するために使用される、ポリペプチドなどの抗原である。
ある実施形態において、標的は、抗体である。抗体は、別の分子の特定の空間的及び極性構造に特異的に結合し得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組み換え抗体であり得、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の収集などの当該技術分野において周知の技術によって、又は連続ハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を収集することによって、又は少なくとも、天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその突然変異形態をクローニングし、発現させることによって、調製され得る。天然の抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質であり得る。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域を含み得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成され得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１及びｌｇＡ２）、サブクラス又はその修飾形態のものであり得る。抗体は、完全な免疫グロブリン又はそのフラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、抗原などの結合部分に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指し得る。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、免疫グロブリン又はそれらのフラグメントの凝集体、ポリマー、及びコンジュゲートも含まれる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－４６）；並びに単離ＣＤＲ及びＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価分子を形成する一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９－８３を参照されたい）が挙げられる。したがって、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどが挙げられる。２つのドメインＶＬ及びＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え方法を用いて、それらが単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする人工ペプチドリンカーによって結合され得る。このような一本鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。抗体は、多価抗体、例えば、２価、３価、４価、５価、６価、７価、又は８価抗体であり得る。抗体は、多重特異性抗体であり得る。例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、又は八重特異性抗体は、例えば、いずれか２つ以上の抗原結合剤（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＩｇＧ）の組合せを組み換えにより結合することによって生成され得る。多重特異性抗体は、２つ以上の標的を近接させ、例えば、分解機構及び標的基質を分解させ、又はユビキチンリガーゼ及び基質をユビキチン化するのに使用され得る。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得ることができ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じように実用性についてスクリーニングされ得る。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離された、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、任意の植物、動物、又は哺乳動物であり得る。
ある実施形態において、標的は、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、若しくはシトシン）のポリマー形態、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。ＤＮＡは、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド標的は、一本鎖、二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、ノンコーディングゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化ゲノムＤＮＡ）、精製ポリヌクレオチド、単離ポリヌクレオチド、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成されたポリヌクレオチド、ライゲートされたポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチド、核酸類似体を含有するポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、標的は、組み換えポリヌクレオチドである。ある実施形態において、標的は、異種ポリヌクレオチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生されるポリヌクレオチド（例えば、生物に対して異種のポリヌクレオチド）である。ある実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリヌクレオチドである。
ある実施形態において、標的は、アプタマーである。アプタマーは、高い特異性及び親和性で、タンパク質などの標的分子の結合部分に結合する単離核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的に特異的に結合するための化学的接触を提供する特定の立体配座内に保持される３次元構造である。アプタマーは、核酸ベースの分子であるが、アプタマーと、遺伝子及びｍＲＮＡなどの他の核酸分子との間には根本的な相違がある。後者の場合、核酸構造は、その線状塩基配列を介して情報をコードし、したがって、この配列は、情報記憶の機能にとって重要である。完全に対照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存された線状塩基配列（ノンコーディング配列）に完全に依存するわけではなく、特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得る任意のコーディングポテンシャルは、偶発的なものであり、その同族標的へのアプタマーの結合においていかなる役割も果たさない。アプタマーはまた、特定のタンパク質に結合する天然の核酸配列と区別される。これらの後者の配列は、天然の核酸（例えば、核酸結合タンパク質）の転写、翻訳、及び輸送に関与するタンパク質の特殊な下位群に結合する、生物のゲノム内に埋め込まれた天然の配列である。他方で、アプタマーは、非天然の核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーが特定され得るが、ほとんどの場合、このようなアプタマーは、自然における核酸結合タンパク質によって認識される配列に対する配列同一性をほとんど又は全く有さない。さらに重要なことに、アプタマーは、実質的に全てのタンパク質（核酸結合タンパク質だけではない）並びに小分子、炭水化物、ペプチドなどを含む該当するほぼ全てのパートナーに結合し得る。ほとんどのパートナーについて、タンパク質でさえ、それが結合する天然の核酸配列は存在しない。このような配列を有するパートナー、例えば、核酸結合タンパク質について、このような配列は、しっかりと結合するアプタマーと比較して、自然に使用される比較的低い結合親和性の結果として、アプタマーと異なる。アプタマーは、選択されたパートナーに特異的に結合し、パートナーの活性又は結合相互作用を調節することが可能であり、例えば、結合を介して、アプタマーは、それらのパートナーが機能する能力を遮断し得る。パートナーへの特異的結合の機能的特性は、アプタマーの固有の特性である。アプタマーは、６～３５ｋＤａであり得る。アプタマーは、２０～５００ヌクレオチドであり得る。アプタマーは、マイクロモル濃度からナノモル濃度以下の親和性でそのパートナーに結合し、密接に関連する標的を区別し得る（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーからの関連タンパク質に選択的に結合し得る）。ある場合において、アプタマーは、１つの分子に結合するに過ぎない。ある場合において、アプタマーは、対象とする分子のファミリーメンバーに結合する。アプタマーは、ある場合において、複数の異なる分子に結合する。アプタマーは、特定のパートナーと結合するために、水素結合、静電相補性、疎水性接触、及び立体排除などの一般的に見られる分子間相互作用を使用することが可能である。アプタマーは、高い特異性及び親和性、低い免疫原性、生物学的効力、及び優れた薬物動態特性を含む、治療剤及び診断剤として使用するためのいくつかの望ましい特徴を有する。アプタマーは、共有結合された相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステム及びループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含み得る。ステムは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的なポリヌクレオチドを共有結合する領域である。アプタマーは、アプタマー配列を含む線状リボ核酸（例えば、線状アプタマー）又はアプタマー配列を含む環状ポリリボ核酸（例えば、環状アプタマー）であり得る。
ある実施形態において、標的は、小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬剤、又は化学化合物であり得る。ある実施形態において、小分子は、５つ以下の水素結合供与体を含有する。ある実施形態において、小分子は、１０個以下の水素結合受容体を含有する。ある実施形態において、小分子は、５００ダルトン以下の分子量を有する。ある実施形態において、小分子は、約１８０～５００ダルトンの分子量を有する。ある実施形態において、小分子は、５以下のオクタノール－水分配係数ｌｏｐ Ｐを含む。ある実施形態において、小分子は、－０．４～５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを含む。ある実施形態において、小分子は、４０～１３０のモル屈折率を有する。ある実施形態において、小分子は、約２０～約７０個の原子を含有する。ある実施形態において、小分子は、１４０オングストローム２以下の極性表面積を有する。
ある実施形態において、環状ＲＮＡは、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上）標的への結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、単一の標的のための２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の異なる結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、単一の標的のための２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の同じ結合部位を含む。一実施形態において、単一の環状ＲＮＡは、１つ以上の異なる標的のための２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の異なる結合部位を含む。一実施形態において、標的の混合物又はライブラリーなどの２つ以上の標的は、サンプル中にあり、サンプルは、２つ以上の標的に結合する２つ以上の結合部位を含む環状ＲＮＡを含む。
ある実施形態において、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上）標的は、複数の結合部分を有する。一実施形態において、単一の標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の結合部分を有し得る。一実施形態において、標的の混合物又はライブラリーなどの２つ以上の標的は、サンプル中にあり、サンプルは、２つ以上の結合部分を含む。ある実施形態において、単一の標的又は複数の標的は、複数の異なる結合部分を含む。例えば、複数の標的は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、又は３０，０００の結合部分を含み得る。
標的は、少なくとも２つの異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。例えば、結合部分は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、又は２５，０００の異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。
環状ポリリボヌクレオチド要素
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）及び／又は少なくとも１つの結合部位をコードする配列を含むことに加えて、本明細書に記載される要素の１つ以上を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテイルを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製要素を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットに開示される任意の特徴又は特徴の任意の組合せを含む。
例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、上に開示されるものに加えて、１つ以上のポリペプチド又はペプチドをコードする配列を含む。いくつかの例としては、限定はされないが、蛍光タグ若しくはマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペプチド、及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるさらなる治療用タンパク質をコードする発現配列をさらに含む。調節要素のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５１］～［０１５３］に記載されている。
例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。ある実施形態において、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。ある実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）及び／又は少なくとも１つの結合部位をコードする配列を含み、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド中に含むのに好適なＩＲＥＳ要素は、核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列であり得る。ＩＲＥＳのさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６６］～［０１６８］に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列（例えば、治療用タンパク質）を含み得、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。終止要素のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み得る。「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えば、ペプチド及び／又はポリペプチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
スタガー要素の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７２］～［０１７５］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の調節核酸配列を含み、又は調節核酸、例えば、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する核酸をコードする１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡなどの、ノンコーディングＲＮＡのような調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
例示的な調節核酸が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７７］～［０１９４］に記載されている。
ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、参照、例えば、線状同等物、線状発現配列、又は線状環状ポリリボヌクレオチドより高い。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論的比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生成する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
例示的な非翻訳領域が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含み得る。例示的なポリＡ配列が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０２］～［０２０５］に記載されている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。例示的なリボスイッチが、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２３２］～［０２５２］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。例示的なアプタザイムが、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２５３］～［０２５９］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡであり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書において教示されるものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。ＲＮＡ結合部位のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０６］～［０２１５］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２１８］～［０２２１］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において、細胞に送達されると（例えば、接触）、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす環状ポリリボヌクレオチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性を有する。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。ＵＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリプトゲンに含まれ得る。
ある実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
ある実施形態において、発現配列、例えば、翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の修飾の除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節するだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパク質が、ＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾、及び環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明される。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば修飾を欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡを区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡのための１つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉを標的にし、ＲＩＧ－Ｉの発現を低下させる。ＲＩＧ－Ｉは、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。したがって、ＲＩＧ－Ｉ－標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば、宿主細胞免疫を低下させ得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避する際に環状ポリリボヌクレオチドを補助する配列、要素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基、又はそれらの任意の組合せを欠き得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。ある実施形態において、ポリリボヌクレオチドの要素は、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てられ得る。スペーサー配列の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２９３］～［０３０２］に記載されている。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得る。例示的な非核酸リンカーが、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０３０３］～［０３０７］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくは他のＲＮＡｉ分子をコードする配列が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチド中に存在する遺伝子発現産物と異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いていることは、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されないか、又は例えばエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼの存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内在性遺伝子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節核酸、及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ＲＮＡと区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質転換試薬（例えば、抗体応答を引き起こす抗原及び／又はエピトープ）としてより有用になる。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電気泳動によって）試験され得る。
さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが、仔牛小腸ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリン（アデニン及び／又はグアノシン）リッチ領域を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンプア領域を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の反復要素を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。
環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含み得る。例えば、親ポリリボヌクレオチドに対して１つ以上の挿入、付加、欠失、及び／又は共有結合修飾を有する環状ポリリボヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。例示的な修飾が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０３１０］～［０３２５］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば二次又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントが二本鎖セグメントに折り畳まれ、対間、例えば、Ａ－Ｕ及びＣ－Ｇの水素結合で結合される。ある実施形態において、末端ループに連結された二本鎖セグメントを有する、ステムとしても知られているらせんが分子内に形成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、実質的に一本鎖対二本鎖領域を含む。ある実施形態において、一本鎖対二本鎖の比率は、環状ポリリボヌクレオチドの機能性に影響を与え得る。
ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列である。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、タンパク質－又はＲＮＡ－結合部位を含み得る。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、増大した相互作用を可能にするために立体配座柔軟性であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、結合するか又はタンパク質若しくは核酸結合を増加させるために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列である。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、立体配座認識部位、例えば、リボスイッチ又はアプタザイムを含み得る。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体配座的に固定され得る。あるこのような場合において、立体配座的に固定された配列は、環状ポリリボヌクレオチドを、タンパク質又は核酸の結合から立体的に遮蔽し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減するために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
１６の可能な塩基対合があるが、これらの６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと呼ばれ、らせん中に非常に低い頻度で存在する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能に対する影響及び致命的な結果なしに容易に破壊することができず、それにより二次構造を維持する選択を与える。ある実施形態において、ステム（すなわちそれらのヌクレオチド配列）の一次構造は、らせん領域を依然として維持しながら、依然として変化し得る。塩基の性質は、より高次の構造に伴い、置換は、それらが二次構造を保つ限り可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上）を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を促進する分子内三重疑似らせん構造を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの疑似らせん構造（例えば、ホスホジエステル結合によって隔てられる）を有し、それらの末端塩基対がスタックし、疑似らせん構造が同一直線上になり、「同軸上にスタックされた」部分構造をもたらすようになっている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のモチーフ、例えばシュードノット、グアニン四重鎖、らせん、及び同軸的スタッキングを有する三次構造を含む。
本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドの構造のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０３２６］～［０３３３］に記載されている。
ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、化合物（例えば、小分子）、抗体又はそのフラグメント、ペプチド、タンパク質、アプタマー、薬剤、又はそれらの組合せへの環状ポリリボヌクレオチドの共役のための共役部分を含む。ある実施形態において、小分子は、環状ＲＮＡにコンジュゲートされ、それによって、小分子を含む環状ＲＮＡを生成し得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、少なくとも２つの共役部分、例えば、第１の小分子（例えば、ＪＱ１）に結合する第１の共役部分及び第２の小分子（例えば、サリドマイド）に結合する第２の共役分子を含む。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、小分子（例えば、サリドマイド）に結合する共役部分及びタンパク質（例えば、ＢＲＤ４）に結合する結合部位を含む。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るときに環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングし、標的に送達する能力によって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せにおいて複製することが可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せである。
安定性及び半減期
ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えば、エキソヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドの安定性及び半減期のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０３０８］～［０３０９］に記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等物、例えば、線状発現配列、又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより増加した半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増加される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分裂している間、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分裂後に、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間超～約３０日間、又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、分割している細胞内での半減期又は持続性を有する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％が、細胞内で少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、又は１６日間の期間にわたって持続する。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。
生成方法
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質、例えば、複数の抗原及び／又はエピトープを含む融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本開示の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）、又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法がまた、当該技術分野において記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、精製され、例えば、遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などが除去される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げられる。
環状化
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテマー化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。
細胞外環状化
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
ある実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成し得る。例の反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。ある実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状環状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
ある実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドが線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌクレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状環状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。例示的なスプライシング要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２７０］～［０２７５］に記載されている。
他の環状化方法
ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
ある実施形態において、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。例示的な複製要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２８０］～［０２８６］に記載されている。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、複製要素を欠いている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列及び複製要素を欠いている。
方法投与において本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを使用することは、本開示の範囲内であり、本方法は、第１の用量の環状ポリリボヌクレオチドを、複数の細胞に提供した後、第２の用量の環状ポリリボヌクレオチドを、複数の細胞に提供する工程を含む。組成物投与において本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを使用することも本開示の範囲内である。環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列、調節要素、又は非翻訳領域の１つ以上を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列の少なくとも１つの３’末端にスタガー要素を含み得る。ある実施形態において、スタガー要素は、ローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させる。スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘが、任意のアミノ酸を表す）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードし得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、発現配列の１つ以上は、コザック開始配列を含む。環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素、例えば終止コドンを含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲン、調節要素、複製要素、又は疑似二本鎖二次構造の１つ以上を含む。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば、線状同等物より高い翻訳効率、複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性、線状同等物より増加した半減期、又は細胞分裂中の持続性を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を可能にする複製ドメインを含み得る。
医薬組成物
本発明の方法は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を提供又は投与する工程を含む。環状ポリリボヌクレオチドの組成物は、本明細書に記載される投与、再投与、又は時間差投与方法のいずれかを用いて、医薬組成物として使用又は投与され得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド組成物は、様々な異なる投与量及び様々な異なる濃度で、提供又は投与され得る。環状ポリリボヌクレオチド組成物は、医薬組成物として提供又は投与され得る。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に関連する担体又は賦形剤を含み得る。医薬組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含み得る。
薬学的に許容される賦形剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤は、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、及びそれらの混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、細胞透過効果を示さないＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅに列挙された非有効成分のいずれかであり得る。医薬組成物は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。
本明細書に記載される医薬組成物は、治療及び獣医学において使用され得る。ある実施形態において、本明細書において提供される医薬組成物（例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む）は、対象への投与に好適であり、ここで、対象は、例えば、獣医学的使用に好適な非ヒト動物である。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；商業的に関連する哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどのペット及び家畜動物；及び／又はオウム、家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、めんどり若しくはおんどり及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含む鳥類；動物園の動物、例えば、猫科の動物を含む哺乳動物；非哺乳動物、例えば、は虫類、魚類、両生類などの任意の動物が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
ある実施形態において、薬学的に許容される担体又は賦形剤は、糖（例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、マルトース、ソルビトール又はフルクトース）、中性塩（例えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、カリウム酸ホスフェート、又は酢酸ナトリウム）、酸性成分（例えば、フマル酸、マレイン酸、アジピン酸、クエン酸又はアスコルビン酸）、アルカリ性成分（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、メグルミン、ナトリウム若しくはカリウムの三塩基性若しくは二塩基性ホスフェート）、又はアミノ酸（例えば、グリシン又はアルギニン）である。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドはまた、送達担体と共に医薬組成物に含まれ得る。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬品賦形剤又は担体を含むように製剤化され得る。医薬担体は、膜、脂質二重層、及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム、例えば、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子であり得、修飾環状ポリリボヌクレオチドの部分的又は完全な封入などによる公知の方法によって、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（ｆｕｇｅｎｅ）、直接音波負荷、細胞スクイージング、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、エキソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０にも記載されている。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又は医薬組成物は、ネイキッド送達製剤として送達される。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、共有結合修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしで、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態において、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助けるタンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されない。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まなくてもよい。
ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、不活性成分を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油であり得る。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）を含み得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態において、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤であり得る。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。
本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免疫系による応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による応答を生成することができない。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
ある実施形態において、宿主又は宿主細胞が環状ポリリボヌクレオチドと接触される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物、又はその両方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。
細胞
本発明の方法における細胞は、真核細胞であり得る。ある実施形態において、細胞は、動物細胞である。ある実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。ある実施形態において、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せである。
ある実施形態において、細胞は、器官、組織、又は生物に由来する。細胞は、本明細書に開示される方法において使用する前に対象から取り出され得、例えば、静脈穿刺などによって外科的に切除され得る。細胞は、細胞培養物に由来し得る。本明細書に開示される方法は、対象中の細胞において使用され得、例えば、本明細書に開示される組成物が、細胞を含む対象に投与される。細胞を含む対象は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）、哺乳動物、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）、又はヒトであり得る。ある実施形態において、対象は、それを必要とする対象であり、本明細書に開示される方法の環状ポリリボヌクレオチドによって生成されるタンパク質が、対象を治療する。
ある実施形態において、細胞は、複数の細胞である。本発明の方法における複数の細胞は、複数の真核細胞であり得る。ある実施形態において、複数の細胞は、複数の動物細胞である。ある実施形態において、複数の細胞は、複数の哺乳類細胞である。ある実施形態において、複数の細胞は、複数のヒト細胞である。ある実施形態において、複数の細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）、哺乳動物、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する複数の細胞、ヒト、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せである。細胞は、対象中の複数の細胞であり得る。対象は、動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、ヒトであり得る。
ある実施形態において、複数の細胞は、器官、組織、又は生物に由来する細胞である。複数の細胞は、本明細書に開示される方法において使用する前に対象から取り出され得、例えば、静脈穿刺などによって外科的に切除され得る。複数の細胞は、細胞培養物に由来し得る。本明細書に開示される方法は、対象中の複数の細胞において使用され得、例えば、本明細書に開示される用量が、複数の細胞を含む対象に投与される。複数の細胞を含む対象は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）、哺乳動物、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）、又はヒトであり得る。ある実施形態において、対象は、それを必要とする対象であり、本明細書に開示される方法の環状ポリリボヌクレオチドによって生成されるタンパク質が、対象を治療する。
対象
本発明の方法における対象は、動物であり得る。ある実施形態において、対象は、動物細胞である。ある実施形態において、対象は、哺乳動物である。ある実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、対象は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）、哺乳動物、例えば、ペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類（例えば、オウム）、ライオン、トラ及びクマなど）、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ（例えば、乳牛及び肉牛）ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、めんどり又はおんどり、ヤギ、ヒツジなど）、又はヒトである。
ある実施形態において、本明細書に開示される細胞は、本明細書に開示される対象中にある。
ある実施形態において、対象は、それを必要とする対象であり、本明細書に開示される方法の環状ポリリボヌクレオチドによって生成されるタンパク質が、対象を治療する。
番号付けされた実施形態＃１
［１］細胞内でタンパク質を発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；
それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［２］細胞内でタンパク質を発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［３］細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；
それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［４］細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［５］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法。
［６］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法。
［７］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法。
［８］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法。
［９］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１０］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞において５０％超低下する前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１１］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後に細胞に提供し、それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１２］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１３］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１４］環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１５］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物を提供することによって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１６］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後に細胞に提供し、それによって、第３の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを、少なくとも第１のレベルに維持する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１７］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１８］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、５０％超低下する前に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１９］環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を、細胞に提供する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２０］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物及び第１の組成物によって発現される細胞におけるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２１］第２の組成物は、第１の組成物によって発現される細胞におけるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞に提供される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２２］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物の後及び第１の組成物によって生成される細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２３］第２の組成物は、第１の組成物によって生成される複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、１０か月、又は１年間、細胞に提供される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２４］第１の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２５］第２の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２６］第３の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２７］第１の組成物及び第２の組成物が、ほぼ同じ量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２８］第１の組成物が、第２の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２９］第１の組成物が、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３０］第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量の１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下だけ変化する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３１］第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下少ない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３２］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３３］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３４］タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３５］タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３６］第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３７］第２の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３８］第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３９］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４０］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４１］第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４２］第３の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４３］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４４］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４５］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後、環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４６］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４７］環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４８］環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［４９］第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５０］第２の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５１］第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５２］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５３］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５４］第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５５］第３の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５６］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５７］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５８］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［５９］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６０］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６１］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６２］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６３］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６４］タンパク質が、治療用タンパク質である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６５］タンパク質が、細胞内タンパク質、膜タンパク質、又は分泌タンパク質である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６６］治療用タンパク質が、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又は輸送活性を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６７］治療用タンパク質が、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒト第ＩＸ因子、ＲＥＰ１、アデノシンデアミナーゼ、ヒトＮＧＦ、核にコードされたＮＤ４、ＳＥＣＲＡ２ａ、ＳＵＭＯ１、ＶＥＧＦ、ＰＤＥ６Ａ、ｐ５３、ＰＢＦＤ、ＡＲＳＡ、ＡＢＣＤ１、ＡＰＯＥ４、ＲＰＧＲ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＶＥＧＦ １６５、ＰＤＧＦ－Ｂ、γ－サルコグリカン、ジストロフィン、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＣＮＧＢ３、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節剤、又はＣＬＮ６である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６８］細胞が、真核細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［６９］細胞が、動物細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７０］細胞が、哺乳動物細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７１］細胞が、ヒト細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７２］細胞が、対象における複数の細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７３］対象が、動物である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７４］対象が、哺乳動物である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７５］対象が、ヒトである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７６］環状ポリリボヌクレオチドが、発現配列の３’末端にスタガー要素をさらに含み、終止要素を欠いている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［７７］スタガー要素が、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させる、実施形態［７６］に記載の方法。
［７８］スタガー要素が、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、実施形態［７６］又は［７７］に記載の方法。
［７９］環状ポリリボヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位を欠いている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［８０］１つ以上の発現配列が、コザック開始配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［８１］環状ポリリボヌクレオチドが、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［８２］環状ポリリボヌクレオチドが、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増加した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［８３］終止要素が、終止コドンを含む、実施形態［７６］に記載の方法。
［８４］環状ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介するように構成される複製ドメインをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［８５］環状ポリリボヌクレオチドが、細胞分裂中に持続する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
番号付けされた実施形態＃２
［１］細胞内でタンパク質を発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；
それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［２］細胞内でタンパク質を発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、タンパク質の第２のレベルを発現し、第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［３］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法。
［４］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、細胞に提供した後、細胞においてタンパク質のレベルを発現する方法であって、
タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後、タンパク質のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化するタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞におけるタンパク質のレベルの発現を維持する工程を含む、方法。
［５］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［１］又は［２］のいずれか１つに記載の方法。
［６］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、細胞において５０％超低下する前に行われる、実施形態［１］～［２］のいずれか１つに記載の方法。
［７］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後に細胞に提供し、それによって、細胞におけるタンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程をさらに含む、実施形態［１］～［２］又は［５］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［７］に記載の方法。
［９］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって発現されるタンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる、実施形態［７］に記載の方法。
［１０］環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［１１］第２の組成物は、第１の組成物によって発現される細胞におけるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月、細胞に提供される、実施形態［３］又は［４］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルである、実施形態［１］、［２］、又は［５］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である、実施形態［１］、［２］、又は［５］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］タンパク質の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［１３］に記載の方法。
［１５］タンパク質の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［１３］又は［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現されるタンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後のタンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［１５］に記載の方法。
［１７］第２の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［１］、［２］、又は［５］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１８］第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後のタンパク質の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［１］、［２］、又は［５］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１９］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される、実施形態［１］、［２］、［５］、［７］、又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２０］タンパク質の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される、実施形態［７］、［８］、又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２１］第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［１］、［２］、［５］、［７］、［８］、又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２］第３の組成物を提供した後の細胞において生成されるタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［７］、［８］又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［１］、［２］、［５］、［７］、［８］、又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２４］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［７］、［８］、又は［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される、実施形態［３］、［４］、［１０］、又は［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３］、［４］、［１０］、又は［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［２７］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞におけるタンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３］、［４］、［１０］、又は［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［２８］タンパク質が、治療用タンパク質である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［２９］タンパク質が、細胞内タンパク質、膜タンパク質、又は分泌タンパク質である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
［３０］治療用タンパク質が、ａ）酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又は輸送活性を有し；ｂ）分子機能調節剤であり；又はｃ）タンパク質タグとして機能する、実施形態［２８］又は［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１］治療用タンパク質が、ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒト第ＩＸ因子、ＲＥＰ１、アデノシンデアミナーゼ、ヒトＮＧＦ、核にコードされたＮＤ４、ＳＥＣＲＡ２ａ、ＳＵＭＯ１、ＶＥＧＦ、ＰＤＥ６Ａ、ｐ５３、ＰＢＦＤ、ＡＲＳＡ、ＡＢＣＤ１、ＡＰＯＥ４、ＲＰＧＲ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＶＥＧＦ １６５、ＰＤＧＦ－Ｂ、γ－サルコグリカン、ジストロフィン、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＣＮＧＢ３、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節剤、又はＣＬＮ６である、実施形態［２８］～［３０］のいずれか１つに記載の方法。
［３２］細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、少なくとも第１のレベルと同程度である、工程；
それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［３３］細胞内で環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
それによって、細胞における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［３４］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、少なくとも、第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法。
［３５］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内であるレベルの環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドのレベルを含む、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、第２の組成物を提供した後のタンパク質のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における線状同等物のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法。
［３６］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物を提供することによって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［３２］又は［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３７］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物の後及び第１の組成物によって生成される細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］のいずれか１つに記載の方法。
［３８］第２の組成物は、第１の組成物によって生成される複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月、細胞に提供される、実施形態［３２］、［３３］、［３６］又は［３７］のいずれか１つに記載の方法。
［３９］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後に細胞に提供し、それによって、第３の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを、少なくとも第１のレベルに維持する工程をさらに含む、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［３８］のいずれか１つに記載の方法。
［４０］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、５０％超低下する前に行われる、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４０］に記載の方法。
［４２］環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を、細胞に提供する工程をさらに含む、実施形態［３２］～［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４３］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物の後及び第１の組成物によって発現される細胞におけるタンパク質のレベルが、実質的に検出不可能になった後に行われる、実施形態［３４］又は［３５］のいずれか１つに記載の方法。
［４４］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後に、環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルである、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４５］第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４６］第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４７］環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［３９］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４８］第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［４９］第２の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５０］第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５１］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、維持される、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５２］環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した後、維持される、実施形態［３９］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５３］第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５４］第３の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３９］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５５］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３２］、［３３］、又は［３６］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５６］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３９］～［４２］のいずれか１つに記載の方法。
［５７］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される、実施形態［３４］、［３５］、又は［４３］のいずれか１つに記載の方法。
［５８］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３４］、［３５］、又は［４３］のいずれか１つに記載の方法。
［５９］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の複数における環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［３４］、［３５］、又は［４３］のいずれか１つに記載の方法。
［６０］環状ポリリボヌクレオチドが、標的のための結合部位を含み、タンパク質をコードし、又はその両方である、実施形態［３２］～［５９］のいずれか１つに記載の方法。
［６１］細胞内の標的を結合する方法であって、
結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、標的が、第１のレベルで結合部位に結合する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、標的が、第２のレベルで結合部位に結合し、及び第２のレベルが、第１のレベルと少なくとも同程度である、工程；
それによって、細胞における標的の結合を、少なくとも結合の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［６２］細胞内の標的を結合する方法であって、
結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、標的が、第１のレベルで結合部位に結合する、工程；及び
環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、細胞に提供する工程であって、標的が、第２のレベルで結合部位に結合し、及び第２のレベルが、第１のレベルの２０％以下だけ変化し；
それによって、細胞における標的の結合を、少なくとも結合の第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
［６３］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内の標的を結合する方法であって、
結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の標的への結合のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の標的への結合のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルを比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルを維持する工程を含む、方法。
［６４］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を細胞に提供した後、細胞内の標的を結合する方法であって、
結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞に提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の標的への結合のレベルを含む、工程；及び
第１の組成物を細胞に提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程であって、細胞が、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化する標的への結合のレベルを含む、工程；
それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルを比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における標的への結合のレベルを維持する工程を含む、方法。
［６５］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物による結合の第１のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［６１］又は［６２］のいずれか１つに記載の方法。
［６６］第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物を提供した後及び第１の組成物による結合の第１のレベルが、細胞において５０％超低下する前に行われる、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］のいずれか１つに記載の方法。
［６７］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、第２の組成物の後に細胞に提供し、それによって、細胞における標的の結合を、少なくとも結合の第１のレベルに維持する工程をさらに含む、実施形態［６１］、［６２］、［６５］、又は［６６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び第１及び第２の組成物による細胞における標的の結合の第２のレベルが、細胞において実質的に検出不可能である前に行われる、実施形態［６７］に記載の方法。
［６９］第３の組成物を提供する工程が、第２の組成物を提供した後及び細胞における第１及び第２の組成物による結合の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる、実施形態［６７］又は［６８］のいずれか１つに記載の方法。
［７０］環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む、実施形態［６１］～［６９］のいずれか１つに記載の方法。
［７１］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供する工程が、第１の組成物の後及び第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる、実施形態［６３］、［６４］、又は［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７２］第２の組成物は、第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月、細胞に提供される、実施形態［６３］、［６４］、［７０］、又は［７１］のいずれか１つに記載の方法。
［７３］結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後、結合の最高のレベルである、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７４］結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７５］結合の第２のレベルが、第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７６］結合の第３のレベルが、第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［６７］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７７］第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後の結合のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日間にわたって、第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７８］第２の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、結合の平均レベルが、第２の組成物を提供した１日後から、結合が実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７９］第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、結合の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、結合が実質的に検出不可能である日まで測定される、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８０］結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、維持される、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８１］結合の第１のレベルが、第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持される、実施形態［６７］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８２］第２の組成物を提供した後の細胞における結合の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の細胞における結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８３］第３の組成物を提供した後の細胞における結合の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の複数における結合の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６７］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８４］環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の結合の第２のレベルが、第１の組成物を提供した後の結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６１］、［６２］、又は［６５］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８５］環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後の結合の第３のレベルが、第１の組成物を提供した後の結合の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６７］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［８６］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持される、実施形態［６３］、［６４］、又は［７０］～［７２］のいずれか１つに記載の方法。
［８７］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６３］、［６４］、又は［７０］～［７２］のいずれか１つに記載の方法。
［８８］環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、又は４５日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、実施形態［６３］、［６４］、又は［７０］～［７２］のいずれか１つに記載の方法。
［８９］第１の組成物及び第２の組成物が、ほぼ同じ量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、実施形態［１］～［８８］のいずれか１つに記載の方法。
［９０］第１の組成物が、第２の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、実施形態［１］～［８９］のいずれか１つに記載の方法。
［９１］第１の組成物が、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物より多い量の環状ポリリボヌクレオチドを含む、実施形態［１］～［９０］のいずれか１つに記載の方法。
［９２］第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量の１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下だけ変化する、実施形態［１］～［９１］のいずれか１つに記載の方法。
［９３］第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下少ない、実施形態［１］～［９２］のいずれか１つに記載の方法。
［９４］第１の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、実施形態［１］～［９３］のいずれか１つに記載の方法。
［９５］第２の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、実施形態［１］～［９４］のいずれか１つに記載の方法。
［９６］第３の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、実施形態［１］～［９５］のいずれか１つに記載の方法。
［９７］細胞が、真核細胞である、実施形態［１］～［９６］のいずれか１つに記載の方法。
［９８］細胞が、動物細胞である、実施形態［１］～［９７］のいずれか１つに記載の方法。
［９９］細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態［１］～［９８］のいずれか１つに記載の方法。
［１００細胞が、ヒト細胞である、実施形態［１］～［９９］のいずれか１つに記載の方法。
［１０１］細胞が、対象における複数の細胞である、実施形態［１］～［１００］のいずれか１つに記載の方法。
［１０２］対象が、動物である、実施形態［１］～［１０１］のいずれか１つに記載の方法。
［１０３］対象が、哺乳動物である、実施形態［１］～［１０２］のいずれか１つに記載の方法。
［１０４］対象が、ヒトである、実施形態［１］～［１０３］のいずれか１つに記載の方法。
［１０５］環状ポリリボヌクレオチドが、発現配列の３’末端にスタガー要素をさらに含み、終止要素を欠いている、実施形態［１］～［１０４］のいずれか１つに記載の方法。
［１０６］スタガー要素が、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させる、実施形態［１０５］に記載の方法。
［１０７］スタガー要素が、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、実施形態［１０５］又は［１０６］に記載の方法。
［１０８］環状ポリリボヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位、ポリＡテイル、複製要素、又はそれらの任意の組合せを欠いている、実施形態［１］～［１０７］のいずれか１つに記載の方法。
［１０９］１つ以上の発現配列が、コザック開始配列を含む、実施形態［１］～［１０８］のいずれか１つに記載の方法。
［１１０］環状ポリリボヌクレオチドが、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、実施形態［１］～［１０９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１１］環状ポリリボヌクレオチドが、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増加した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、実施形態［１］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１１２］終止要素が、終止コドンを含む、実施形態［１０５］に記載の方法。
［１１３］環状ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介するように構成される複製ドメインをさらに含む、実施形態［１］～［１１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１１４］環状ポリリボヌクレオチドが、細胞分裂中に持続する、実施形態［１］～［１１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１１５］環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象における応答レベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を対象に提供した後、対象における応答レベルを誘導する方法であって、
タンパク質をコードし、及び／又は応答レベルを誘導する結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、対象に提供する工程であって、対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を提供した後の応答レベルを含む、工程；及び
タンパク質をコードし、及び／又は結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、第１の組成物の後、対象に提供する工程であって、対象が、少なくとも、環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を提供した後の応答レベルを含む、工程；
［１１６］それによって、環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象における応答レベルと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の対象における応答レベルの発現を維持する工程を含む、方法。対象における応答レベルを誘導する方法であって、
（ａ）タンパク質をコードするか、及び／又は応答を誘導する結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象に提供する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードするか、及び／又は結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象に提供し、
それによって、第１の組成物を提供した後及び第２の組成物を提供した後、対象における応答を誘導する工程を含む、方法。
［１１７］対象における応答を誘導する方法であって、
（ａ）タンパク質をコードするか、及び／又は応答を誘導する結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、対象に提供することであって、応答が第１のレベルにある、工程；及び
（ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、タンパク質をコードするか、及び／又は応答を誘導する結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、対象に提供する工程を含む、方法。
［１１８］タンパク質が、エリスロポエチンである、実施形態［１１５］～［１１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１１９］応答が、赤血球を生成するためのものであり、又は応答レベルが、生成された赤血球のレベルである、［１１５］～［１１８］のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。
実施例１：環状ＲＮＡがインビボで投与され、より長い半減期／増加した安定性を示した
この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ及びＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、環状ＲＮＡをＮｌｕｃ ＯＲＦ、又は対照としての線状ＲＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５μｇのＲＮＡを投与した。
マウスを殺処分し、肝臓を投与の３、４及び７日後の時点で採取した（ｎ＝２マウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で貯蔵した。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためのフェノール系ＲＮＡ抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存在を測定した。
組織におけるＲＮＡ検出をｑＰＣＲによって行った。線状及び環状ＲＮＡを検出するために、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環状ＲＮＡのみを検出するために、５’－３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
環状ＲＮＡは、注入の３、４－及び７日後の時点でマウスの肝臓中において線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図１）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、投与後少なくとも７日間にわたってインビボで検出可能であった。
実施例２：環状ＲＮＡのインビボ発現、半減期、及び非免疫原性
この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。それは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは、環状ＲＮＡがインビボで非免疫原性であるように操作されたことを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図２Ａ及び図２Ｂ）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
１６日目に肝臓を３匹の動物から切除し、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図３に示されるように、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図４に示されるように、線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマーカーＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの増加した発現を示さなかった。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクトされた肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
この実施例は、環状ＲＮＡが、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。マウス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２－５９１を参照されたい）、同様の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
実施例３：環状ＲＮＡのインビボ再投与
この実施例は、２つの用量の環状ＲＮＡを用いて、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップシステムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントスプリントＤＮＡ（ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡをＵｒｅａ－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）において再懸濁させた。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ、又は対照としての線状ＲＮＡと共に０．２５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、０日目に担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化され、第２の用量は、５６日目に投与された。
投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量の環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図５）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出された（図５）。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、第２の用量の環状ＲＮＡの投与の２、３、８、及び１５日後の時点で血漿中において再度検出された（図５）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１、２、３日後の時点でのみ検出された。
この実施例は、環状ＲＮＡが、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。さらに、それは、環状ＲＮＡの再投与が、同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例４：環状ＲＮＡのインビボ時間差投与
この実施例は、環状ＲＮＡの連続する時間差投与を用いて、インビボで環状ＲＮＡからより高い発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ、又は対照としての線状ＲＮＡと共に０．２５ｐｍｏｌの環状ＲＮＡの尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、０日、２日及び５日の時点で担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
血液サンプル（５０μｌ）を、投与の６時間、１、２、３、５、７、１４、２１、２８、３５、４２日後の時点で、各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼの活性、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの単回投与の６時間、１、２、３、５、７、１４、２１、２８日後の時点で血漿中において検出された（図６及び図７）。ガウシアルシフェラーゼ活性は、３回投与を投与されるとき、第１の用量の環状ＲＮＡの投与の６時間、１、２、３、５、７、１４、２１、２８、３５日後の時点で血漿中において検出された（図６及び図７）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の６時間、１、２、３日後の時点でのみ血漿中において検出され、発現レベルは、その最初の用量を超えて増加しなかった。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、ｘ日の時点でバックグラウンドレベルを超えて、又はさらなる線状ＲＮＡが投与された場合でさえ、検出されなかった（図６及び図７）。
この実施例は、複数回の注入後に血漿中のタンパク質活性の増加したレベルを伴い、環状ＲＮＡが、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。さらに、それは、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡの反復投与が発現をもたらすことを実証する。
実施例５：静脈内送達による環状ＲＮＡのネイキッド及び担体投与及び再投与
この実施例は、静脈内に投与される２つの用量の環状を用いて、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップシステムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを、Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再度濁させた。
この実施例において、修飾ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってカスタム合成され、上に列挙される全てのモチーフを含んでいた。この実施例において、ＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、ポリアデニル化されたシュードウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換された（１２０Ａ）。
非配合ＲＮＡを生成するために、次に、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、１００μＬのＰＢＳ中で、０．２５ピコモルの最終濃度になるまで希釈した。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡはまた、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例において、１５％のＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び７．５％のブースト（Ｂｏｏｓｔ）は、製造業者の説明に従い、ＲＮＡと複合体を形成した。
マウスに、各製剤中のガウシアルシフェラーゼＯＲＦと共に０．２５ピコモルの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与えた。注入を０日目で行い、第２の用量を４９日目に投与した。ビヒクルのみを対照として使用した。
血液サンプル（５０μＬ）を、投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で顎下穿刺によってＥＤＴＡチューブに採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量の非配合及びＴｒａｎｓＩＴ配合環状ＲＮＡの両方の投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図８）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合及びＴｒａｎｓＩＴ配合修飾ｍＲＮＡの両方の投与の１及び２日後の時点でのみ、血漿中において検出された（図８）。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合及びＴｒａｎｓＩＴ配合環状ＲＮＡの両方の第２の用量の投与の１、２、３、８、１４及び２１日後の時点で血漿中において再度検出された（図８）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合及びＴｒａｎｓＩＴ配合修飾ｍＲＮＡの両方の投与の１、２、３日後の時点でのみ血漿中において検出された（図８）。
それぞれの場合、ガウシアルシフェラーゼ活性が、ビヒクルのみの対照より高かった。
この実施例は、静脈内に投与された環状ＲＮＡが、担体を用いて及び用いずに、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。さらに、それは、環状ＲＮＡの再投与が、同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例６：筋肉内注射による環状ＲＮＡのネイキッド投与及び再投与
この実施例は、筋肉内に投与された２つの用量の環状を用いて、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、実施例５に記載されるように生成した。
非配合ＲＮＡを生成するために、次に、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、１００μＬのＰＢＳ中の２．５ピコモルの最終濃度になるまで希釈した。
マウスの後肢に、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦと共に２．５ピコモルの用量の環状ＲＮＡの単回の筋肉内注射を与えた。注入を０日目で行い、第２の用量を４９日目に投与した。ビヒクルのみを対照として使用した。
血液サンプル（５０μＬ）を、投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で、顎下穿刺によってＥＤＴＡチューブに採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量の非配合環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６、及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図９）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合ｍＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出された（図９）。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合環状ＲＮＡの第２の用量の投与の２、３、８、及び１５日後の時点で血漿中において再度検出された（図９）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、非配合修飾ｍＲＮＡの投与の１、２、３日後の時点でのみ血漿中において検出された（図９）。
それぞれの場合、ガウシアルシフェラーゼ活性が、ビヒクルのみの対照より高かった。
この実施例は、筋肉内に投与された環状ＲＮＡが、担体なしで、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。さらに、それは、環状ＲＮＡの再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例７：５回反復される静脈注射による環状ＲＮＡの担体再投与が、機能的タンパク質の発現をもたらす
この実施例は、静脈内に投与された環状ＲＮＡの５回の投与を用いて、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、実施例５に記載されるように生成した。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例において、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び５％のブースト（Ｂｏｏｓｔ）は、製造業者の説明に従い、ＲＮＡと複合体を形成した。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦを含む０．２５ピコモルの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与えた。注入を、０日、７１日、１２０日、１９６日、及び３５９日目に行った。ビヒクルのみを対照として使用した。
血液サンプル（５０μＬ）を、投与の０．２５、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で、顎下穿刺によってＥＤＴＡチューブに採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合環状ＲＮＡを投与されるとき、ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量の投与の１、２、３、７、１４、２１及び２８日後；第２の用量の投与の１、２、３、７、１４及び２１日後；第３の用量の投与の１、２、３、７、１４及び２１日後；第４の用量の投与の１、２、３、７、１４、２１及び２８日後；並びに、第５の用量の投与の１、２、３、７、１４及び２１日後の時点で、血漿中において検出された（図１０）。
対照的に、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合修飾ｍＲＮＡを投与されるとき、ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量の投与の０．２５、１及び２日後；第２の用量の投与の０．２５、１及び２日後；第３の用量の投与の０．２５、１及び２日後；第４の用量の投与の０．２５、１及び２日後；並びに、第５の用量の投与の０．２５、１及び２日後の時点で、血漿中において検出された（図１０）。
いずれの場合も、ガウシアルシフェラーゼ活性、ひいては発現は、ｍＲＮＡより環状ＲＮＡで高かった。
この実施例は、静脈内に投与された環状ＲＮＡが、注入の複数日後の時点での血漿中のタンパク質活性のレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現し、少なくとも５回再投与され得ることを実証した。さらに、それは、環状ＲＮＡの長期間の再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例８：担体再投与（５回）静脈内（ＩＶ）－毒性
この実施例は、２年以上にわたって５回の環状ＲＮＡの静脈内投与の非毒性効果を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、実施例５に記載されるように生成した。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例において、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び５％のブースト（Ｂｏｏｓｔ）は、製造業者の説明に従い、ＲＮＡと複合体を形成した。
マウスに、各製剤中のガウシアルシフェラーゼをコードする０．２５ピコモルの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与えた。注入を、０日、７１日、１２０日、１９６日、及び３５９日目に行った。ビヒクルのみを対照として使用した。
マウスを３９９日目に殺処分し、肝臓、脾臓、肺、及び胆嚢を、ホルマリン中で固定した。ブロック当たり１つのスライドを切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ガラススライドを、光学顕微鏡法を用いてＡＣＶＰボード認定の獣医病理学者によって評価した。各組織の組織学的所見を、重症度０～５について採点した。０＝なし、１＝最小、２＝軽度、３＝中程度、４＝顕著、５＝重度。
Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合環状ＲＮＡを５回投与される場合、最小ないし軽度の組織学的変化が、肝臓、脾臓、肺、及び胆嚢において観察された。ほぼ全ての組織病理学的所見（表１）が、両方の対照（担体対照及び／又は非処理の対照）、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを注入された動物に存在していた。全ての所見は、いずれかのバックグラウンド、検死（ｐｅｒｉｍｏｒｔｅｍ）、又は試験されるＲＮＡ毒性に関連しない非特異的変化と一致していた。
この実施例は、環状ＲＮＡが、組織病理学的毒性の兆候なく、２年以上にわたって反復投与され得ることを実証した。
Figure 2022536951000002
実施例９：担体時間差再投与（Ｘ２）－ＧＬｕｃ活性
この実施例は、環状ＲＮＡの連続する時間差投与を再投与することによって、環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、実施例５に記載されるように生成した。
環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡがまた、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例において、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び５％のブースト（Ｂｏｏｓｔ）は、製造業者の説明に従い、ＲＮＡと複合体を形成した。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦと共に０．２５ピコモルの製剤化された環状ＲＮＡ及び修飾ｍＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与えた。注入をバッチで行った：０日、２日、及び５日で第１のバッチ；並びに７１日、７３日及び７６日で第２のバッチ。ビヒクルのみを対照として使用した。
血液サンプル（５０μＬ）を、投与の０．２５、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で、顎下穿刺によってＥＤＴＡチューブに採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１×Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合環状ＲＮＡを投与されるとき、ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量のバッチ１の投与の１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後；並びに次に、第１の用量のバッチ２の投与の１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で血漿中において検出された（図１１）。
対照的に、Ｔｒａｎｓ－ＩＴ配合修飾ｍＲＮＡを投与されるとき、ガウシアルシフェラーゼ活性は、第１の用量のバッチ１の投与の０．２５、１、２及び３日後；並びに次に、第１の用量のバッチ２の投与の０．２５、１及び２日後の時点で血漿中において検出された（図１１）。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、ｍＲＮＡ同等物と比較して、環状ＲＮＡから発現されるときに、より高かった。
この実施例は、環状ＲＮＡが、複数回の連続注入後に血漿中のタンパク質活性の増加したレベルで、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証した。それは、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡの反復投与が発現をもたらすことを実証する。さらに、それは、環状ＲＮＡの長期間の再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例１０：静脈内（ＩＶ）投与された治療的に関連する環状ポリリボヌクレオチドのＴｒａｎｓＩＴ投与及び再投与
この実施例は、静脈内に投与された２つの用量の治療的に関連する環状ＲＮＡを用いて、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明書に従ってＲＮＡ ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップシステムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを、Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再度濁させた。
この実施例において、修飾ｍＲＮＡは、環状ＲＮＡにおいてコードされる同じＥＰＯ ＯＲＦヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’グロビンＵＴＲを含んでいた。ｍＲＮＡヌクレオチドを、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、ポリアデニル化されたシュードウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換した（９０Ａ）。
１つの製剤中で、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡを、カチオン性脂質担体を用いて製剤化した。この実施例において、１５％のＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）及び７．５％のブースト（Ｂｏｏｓｔ）を、１００ｕＬの最終注入体積で、製造業者の説明に従い、２５ｐｍｏｌのＲＮＡと複合体を形成した。
非配合環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡも試験した。この実施例において、２５ｐｍｏｌの各ＲＮＡを、ＰＢＳを用いて１００ｕＬの最終体積になるまで希釈した。
マウスに、０日目に２５ピコモルの単回の尾静脈注入投与を与え、第２の用量を、７９日目に投与した。ビヒクルのみを対照として使用した。
血液サンプル（４０ｕＬ）を、第１の投与の１、２、３、５、７、２１、２８及び３５日後並びに第２の投与の１、２、３、５及び７日後に、マウス尾部からＥＤＴＡチューブに採取した。全血を、３０分間にわたってＲｅｔｉｃ－Ｃｏｕｎｔ試薬（ＢＤ）で染色し、フローサイトメーターにおいて取得した。分析を、５００００イベントを取得する前方散乱（ＦＳＣ）対側方散乱（ＳＳＣ）ゲート内に含まれる赤血球（ＲＢＣ）集団に限定した。網状赤血球が、全ＲＢＣ集団中の陽性染色された細胞のパーセントとして報告される。
増加した数の網状赤血球が、第１の用量の投与の３、５、７、１４、２１及び２８日後の時点で、全血中で検出され、その後、網状赤血球数が、マウス集団中で３～５％の正常範囲に戻った（非配合については図１２及びＴｒａｎｓＩＴ配合については図１３）。
第２の用量の投与後、網状赤血球数の増加が、ビヒクルのみの対照と比較して、ＴｒａｎｓＩＴが配合された場合、環状ＲＮＡ投与及びｍＲＮＡ投与について検出された。この増加は、治療的に関連するＥＰＯＧＥＮ投与と比較して、ｍＲＮＡ及び環状ＲＮＡの両方についてより大きく、より持続し；増加は、ｍＲＮＡ投与より環状ＲＮＡについてより大きく、より持続する（図１４）。
さらに、第２の用量の投与後、網状赤血球数の増加が、ビヒクルのみの対照と比較して、配合されない場合、環状ＲＮＡ投与及びｍＲＮＡ投与について検出された。５及び７日目に、環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡによって誘導される網状赤血球数は、治療的に関連するＥＰＯＧＥＮ投与より多く、これは、より持続する治療効果を示している（図１５）。環状ＲＮＡによって誘導される治療効果は、ｍＲＮＡのものより大きい。
この実施例は、ｈＥＰＯをコードする環状ＲＮＡが、同等の用量のｍＲＮＡについて見られるものを超える生物学的効果を引き起こすことを示す。各治療に対する応答の大きさは、第１及び第２の投与間で非常に類似しており、環状ＲＮＡについて約２５％、ｍＲＮＡについて１８～２０％である。
この実施例は、静脈内に投与された治療的に関連するＯＲＦをコードする環状ＲＮＡが、担体と共に、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現し、注入後複数の日数にわたって観察される生理学的効果をもたらすことを実証する。さらに、それは、環状ＲＮＡの再投与が同様の発現プロファイルをもたらすことを実証する。
実施例１１：インビトロ環状ＲＮＡ生成
この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を記載する。
図１６に示されるように、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて設計される。環状化は、ローリングサークル型翻訳、別個のＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガー要素を有する複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を弱めるか又は軽減するためのエンクリプトゲン及びポリ－Ａ配列なしでリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にする任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
この実施例において、環状ＲＮＡは、以下のように生成される。非修飾線状ＲＮＡは、５’－及び３’－ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されたＧＦＰをコードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡがＲＮＡ精製システム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製され、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）で処理され、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製される。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を用いて転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成され、環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理による富化後、単離される。ＲＮＡ品質がアガロースゲル又は自動化電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって評価される。
実施例１２：インビボ環状ＲＮＡ生成、細胞培養
この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を記載する。
ＧＦＰ（配列番号２）が発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングされる。図１７に示されるように、このベクターは、細胞内での環状ＲＮＡ生成を誘発するように突然変異誘発される（配列番号６及びＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５によって記載される）。
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。１マイクログラムの上記の発現プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトし、トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離する。
ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。要するに、ＲＴ－ｑＰＣＲのために、同じ供給源からのＨｅｌａ細胞の全ＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｒ－消化ＲＮＡがＲＴ－ＰＣＲのための鋳型として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するために、逆転写反応は、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ：ＲＮａｓｅ Ｈ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマーを用いて行われる。増幅されたＰＣＲ産物が６％のＰＡＧＥを用いて分析され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。富化因子を推定するために、ＰＣＲ産物がデンシトメトリー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化され、全ＲＮＡサンプルの濃度がＵＶ吸光度によって測定される。
さらなるＲＮＡ測定がノーザンブロット分析を用いて行われる。簡潔には、全細胞抽出物を、フェノール系試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を用いて得るか、又は核及び細胞質タンパク質抽出物を市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞の分画によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を阻害するために、細胞を３７℃で０～６時間にわたってフラボピリドール（１ｍＭの最終濃度；Ｓｉｇｍａ）で処理する。ＲＮａｓｅ Ｒ処理のために、１０ｍｇの全ＲＮＡを３７℃で１時間にわたって２０ＵのＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
オリゴヌクレオチドプローブを用いたノーザンブロットが以下のように行われる。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーが標準的なプライマー設計ツールを用いて設計される。Ｔ７プロモータ配列がリバースプライマーに加えられて、インビトロ転写反応におけるアンチセンスプローブが得られる。インビトロ転写は、製造業者の説明に従ってＤＩＧ－ＲＮＡ標識用ミックスを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる。ＤＮＡ鋳型がＤＮＡ Ｉ消化によって除去され、ＲＮＡプローブがフェノールクロロホルム抽出及びその後の沈殿によって精製される。プローブは、５０ｎｇ／ｍｌで使用される。全ＲＮＡ（２μｇ～１０μｇ）を、グリオキサールローディングダイ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中１．２％のアガロースゲル上で分解させる。ゲルを２０分間にわたって１×ＴＢＥに浸漬させ、セミドライブロッティングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１時間（１５Ｖ）にわたってＨｙｂｏｎｄ－Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移す。膜を乾燥させ、１２０，０００μＪ ｃｍ－２で１回、（２６５ｎｍで）ＵＶ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを１時間にわたって６８℃で行い、ＤＩＧで標識したインビトロで転写されたＲＮＡプローブを一晩ハイブリダイズする。膜を３０分間にわたって６８℃において２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３回洗浄した後、６８℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３０分間３回洗浄する。免疫検出は、アルカリホスファターゼ抗体と直接共役された抗ＤＩＧを用いて行われる。免疫活性ビースは、化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量化システムＬＡＳ－４０００検出システム）を用いて視覚化される。
実施例１３：環状ＲＮＡの調製及びインビトロ翻訳
この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子産物の遺伝子発現及び検出を記載する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＧＦＰ ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来エンクリプトゲン（配列番号４）を用いて、且つＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて若しくは用いずに設計される（図１８を参照されたい）。この実施例において、環状ＲＮＡは、実施例１０及び１１に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（日本東京のアトー（Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（ＢｉｏＲａｄ）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
ＧＦＰタンパク質が細胞溶解物中で視覚化され、ローリングサークル型翻訳の結果として、線状ＲＮＡより環状ＲＮＡ中で多い量で検出されることが予測される。
実施例１４：環状ＲＮＡからの化学量論的タンパク質発現
この実施例は、タンパク質を化学量論的に発現する環状ＲＮＡの能力を記載する。
この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）及びＲＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号７）を、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図１９Ａを参照されたい）。別の環状ＲＮＡが同様に設計されるが、隣接する２Ａ配列の代わりに、それは、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦ間に終止及び開始コドンを有する（図１９Ｂを参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１１及び１２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（日本東京のアトー（Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（ＢｉｏＲａｄ）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦが終止及び開始コドンによって隔てられていない環状ＲＮＡは、いずれのタンパク質も等量で有する一方、ＯＲＦ間に開始及び終止コドンを含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、いずれのタンパク質も異なる量で有することが予測される。
実施例１５：合成環状ＲＮＡは、細胞における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
この実施例は、線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有するように操作された環状ＲＮＡを実証する。
治療用タンパク質をコードする環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピエント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ－β）の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲによるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似した線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された。
環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素を有さない３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配列、続いて終止要素（終止コドン）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列のいずれかをコードするように設計した。
この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
図２０に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
実施例１６：インビボ発現
この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからタンパク質を発現する能力を記載する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）又はＲＦＰ（配列番号７）又はルシフェラーゼ（配列番号８）を、ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図２１を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１１及び実施例１２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３００ｍｇ／ｋｇ（６ｍｇ）の環状ＲＮＡ（５０ｕＬ ｖｏｌ）を、本明細書に記載されるＧＦＰ、ＲＦＰ若しくはルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与によって投与する。動物に単回投与又は３回の注入（１日目、３日目、５日目）を与える。
血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓及び皮膚注入部位を非投与対照マウスから、且つ投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８及び２６４時間後の時点（ｎ＝４匹のマウス／時点）で採取する。血液サンプルを試験の終了時に頸静脈穿刺から採取する。
血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮＡ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。タンパク質発現（ＲＦＰ又はＧＦＰ）は、前の実施例に記載されるように、各組織におけるＦＡＣＳ又はウエスタンブロットによって評価される。
ルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与されたマウスの別の群に３ｍｇのルシフェリンを投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で注入し、動物をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
マウスは、処理された組織においてＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼを発現することが予測される。
実施例１７：インビボ生体内分布
この実施例は、インビボの環状ＲＮＡの生体内分布を制御及び測定する能力を記載している。
この実施例において、マウスを、実施例８に記載されるように、ルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡで処理する。要するに、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びルシフェラーゼをコードするＯＲＦ（配列番号８）を、ルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図２２を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１１及び１２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
マウスにルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与し、投与の６、２４、４８、７２、及び９６時間後の時点で３ｍｇのルシフェリンを注入し、動物をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮＡ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。
６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの別の群に筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）投与によって４つの用量レベル：１０、２、０．４、及び０．０８ｍｇでルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与する（１群当たりｎ＝６）。投与の６、２４、４８、７２、及び９６時間後の時点で、動物に３ｍｇのルシフェリンを注入し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。また、マウスからの組織を、実施例８に記載されるように、ルシフェラーゼ発現について評価し、この発現の組織分布を分析する。
マウスは、処理された組織においてルシフェラーゼの発現を示すことが予測される。
実施例１８：インビボ非免疫原性
この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を記載している。
この実施例は、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡの投与後の免疫応答の定量化及び比較を記載している（図２３を参照されたい）。一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡのいずれも、対照と比較して、環状ＲＮＡの１回以上の投与後、免疫原性応答を低下させる（例えば、対照ＲＮＡの投与と比較して低下させる）。
環状ＲＮＡについての免疫原性の指標は、血清中のサイトカインレベルである。
この実施例において、サイトカイン血清濃度が環状ＲＮＡの１回以上の投与後に調べられる。前の実施例のいずれか１つからの環状ＲＮＡが皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、又は静脈内（ＩＶ）を介して６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与される。血清が異なるコホートから抜き取られる：エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡ及びエンクリプトゲンを有さない環状ＲＮＡの注射を全身及び／又は局所的に注入されたマウス。
採取された血清サンプルをＰＢＳ中で１～１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着法（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により、マウスＩＦＮ－αについて分析する。
血清中のサイトカインレベルに加えて、炎症マーカーの発現は、免疫原性の別の指標である。この実施例において、ビヒクル（環状ＲＮＡなし）、線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡで処理されたマウスからの脾臓組織を投与の１、４及び２４時間後に採取する。サンプルを、以下の技術、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ノーザンブロット又はＦＡＣＳ分析を用いて分析する。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析の場合、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＴＮＦ－α及びＰＫＲについてのｍＲＮＡレベルを上述されるように定量化する。
ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるようにＩＦＮ－α １３、ＩＦＮ－β（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ－α、又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）について分析する。
ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３に対する直接共役抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６で染色し、フローサイトメーターにおいて分析する。
一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡは、対照ＲＮＡと比較して、１回又は複数回の投与後、サイトカインレベルを低下させるであろう（ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ及び／又はｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される際）。
実施例１９：環状ＲＮＡの単離及び精製
この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
特定の実施形態において、前の実施例に記載される環状ＲＮＡが単離され、コードされたタンパク質産物の発現前に精製され得る。この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を用いた単離を記載している。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡを単離し、精製した。
環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配列を有する（配列番号１１０）。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号１１）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号９）なしで、スタガー要素（２Ａ配列）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有することを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１２）をコードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列番号１３）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子、及び終止要素（三重終止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮＡ４、環状ＲＮＡ５、及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮＡ４、環状ＲＮＡ５、及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析した（図２４を参照されたい）。
単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視覚化した。
実施例２０：タンパク質発現の検出
この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
タンパク質発現は、ｍＲＮＡから特定のタンパク質を生成するプロセスである。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペプチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
以下の実施例に示されるように、タンパク質を環状ＲＮＡ配列からインビトロで発現させた。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを、２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２５を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
蛍光が検出され、発現産物が存在することが示された。したがって、環状ＲＮＡがタンパク質の発現を駆動することが示された。
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
Figure 2022536951000003
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：ｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔ
Ｔ２Ａ：ｇａｇｇｇｃａｇｇｇｇａａｇｔｃｔａｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｇｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃａ
Ｅ２Ａ：ｃａｇｔｇｔａｃｔａａｔｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｔｇａａａｔｔｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇｔｔｇａｇａｇｃａａｃｃｃａｇｇｔｃｃｃ
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
Figure 2022536951000004
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Figure 2022536951000005
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋）Ｌａｃｃａｓｅ２ ＭＣＳ Ｅｘｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ６９２６ ｂｐｓ
Figure 2022536951000006
Figure 2022536951000007
Figure 2022536951000008
Figure 2022536951000009
配列番号７（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
Figure 2022536951000010
配列番号８（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
Figure 2022536951000011
配列番号９
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022536951000012
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１０
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022536951000013
 ５－１３：コザック配列
１４－２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022536951000014
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１２
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（８７３ｂｐ）
Figure 2022536951000015
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２６５：Ｔ２Ａ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１３
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２ｂｐ）
Figure 2022536951000016
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２１１：三重終止コドン
２１２～７５１：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２～７６０：三重終止コドン
ｈＥＰＯ ＯＲＦ
Figure 2022536951000017

Claims (49)

  1. 哺乳動物におけるタンパク質の発現を維持する方法であって、
    （ａ）前記タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、前記哺乳動物に提供する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、前記タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、前記哺乳動物に提供し、それによって、前記哺乳動物における前記タンパク質の発現を維持する工程を含む、方法。
  2. 前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物を提供した後及び
    （ｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、前記哺乳動物において実質的に検出不可能である前に；又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の前記第１のレベルが、前記哺乳動物において実質的に検出不可能になった後；又は
    （ｉｉｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、前記哺乳動物において５０％超低下する前に行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記環状ポリリボヌクレオチドが、（ｉ）外因性の合成環状ポリリボヌクレオチドであり；及び／又は（ｉｉ）ポリＡ配列、複製要素、又は両方を欠いている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第１の組成物が、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、前記第２の組成物が、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで：
    （ｉ）前記第１の環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、同じであるか；又は
    （ｉｉ）前記第１の環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、異なる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、前記第２の組成物の後、前記哺乳動物に提供し、それによって、前記哺乳動物における前記タンパク質の発現を維持する工程、又は
    （ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、前記第２の組成物の後、前記哺乳動物に提供し、それによって、前記哺乳動物における前記タンパク質の発現を回復させる工程であって；
    任意選択的に、前記第３の組成物を提供する工程が、前記第２の組成物を提供した後及び（ａ）前記第１及び第２の組成物によって発現される前記タンパク質の第２のレベルが、前記哺乳動物において実質的に検出不可能である前に；又は（ｂ）前記哺乳動物において前記第１及び第２の組成物によって発現される前記タンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われること；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程
    をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｉ）前記第１の組成物によって発現される前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した１～２日後の前記タンパク質の最高のレベルであるか；又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物によって発現される前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり；任意選択的に、
    （ｉｉｉ）前記タンパク質の第２のレベルが、前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；任意選択的に、
    （ｉｖ）タンパク質の第３のレベルが、前記第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｖ）前記第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される前記タンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第２の組成物を提供した後の前記タンパク質の平均レベルが、前記第１の組成物からのタンパク質の第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、前記タンパク質の平均レベルが、（ｉ）前記第２の組成物を提供した１日後から、前記タンパク質が実質的に検出不可能である日まで；又は（ｉｉ）各後続の組成物を提供した後、前記タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. （ｉ）前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、６時間～９０日間にわたって、前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、６時間～２７０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物、前記第２の組成物、及び前記第３の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、６時間～３５日間にわたって、前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、実質的に検出不可能である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. （ｉ）前記第２の組成物を提供した後の前記哺乳動物におけるタンパク質の第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の前記哺乳動物におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｉ）前記第３の組成物を提供した後、前記哺乳動物において生成されるタンパク質の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後のタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日間、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後のタンパク質の第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の前記タンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｖ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後のタンパク質の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の前記タンパク質の前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記タンパク質が、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチンであり；及び／又は
    前記タンパク質（例えば、エリスロポエチン）の発現が、前記哺乳動物における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 細胞又は対象におけるタンパク質の発現を維持する方法であって、
    （ａ）前記タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）の６時間～９０日後、前記タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供し、
    それによって、前記細胞又は対象における前記タンパク質の発現を維持する工程を含み；任意選択的に、前記第１の組成物を提供する工程が、前記対象における第１の細胞に対してであり、前記第２の組成物を提供する工程が、前記対象における第２の細胞に対してであり、ここで、前記第１の細胞及び第２の細胞が、同じ細胞又は異なる細胞である、方法。
  12. 細胞又は対象においてタンパク質を発現する方法であって、
    （ａ）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、前記細胞又は前記対象に提供する工程であって、前記細胞又は前記対象が、コードされたタンパク質の第１のレベルを発現する、工程；及び
    （ｂ）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、前記細胞又は前記対象に提供する工程であって、前記細胞又は前記対象が、コードされたタンパク質の第２のレベルを発現し、
    （ｉ）前記第２のレベルが、少なくとも前記第１のレベルと同程度であり、又は
    （ｉｉ）前記第２のレベルが、前記第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
    それによって、前記細胞又は前記対象におけるコードされたタンパク質の発現を、少なくとも、前記タンパク質の前記第１のレベルに維持する工程を含み；任意選択的に、前記第１の組成物を提供する工程が、前記対象における第１の細胞に対してであり、前記第２の組成物を提供する工程が、前記対象における第２の細胞に対してであり、ここで、前記第１の細胞及び第２の細胞が、同じ細胞又は異なる細胞である、方法。
  13. 環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後、細胞又は対象におけるタンパク質のレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供した後、前記細胞又は対象においてあるレベルの前記タンパク質を発現する方法であって、
    （ａ）タンパク質をコードする環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物を提供した後、あるレベルの前記タンパク質を含む、工程；及び
    （ｂ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、前記第１の組成物の後、前記細胞又は対象に提供する工程を含み、前記細胞又は対象が、
    （ｉ）少なくとも、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後の前記タンパク質のレベル、又は（ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化する前記タンパク質のレベルを含む、工程；
    それによって、前記環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルの発現を維持する工程を含み；及び任意選択的に、前記第１の組成物を提供する工程が、前記対象における第１の細胞に対してであり、前記第２の組成物を提供する工程が、前記対象における第２の細胞に対してであり、ここで、前記第１の細胞及び第２の細胞が、同じ細胞又は異なる細胞である、方法。
  14. 前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物を提供した後及び
    （ｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に；及び／又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、前記細胞又は対象において５０％超低下する前に；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の組成物によって発現されるタンパク質の第１のレベルが、前記細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる、請求項１１又は１２に記載の方法。
  15. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、前記第２の組成物の後、前記細胞又は対象に提供し、それによって、前記細胞又は対象における前記タンパク質の発現を、少なくともタンパク質の第１のレベルに維持する工程をさらに含み、任意選択的に、前記第３の組成物を提供する工程が、前記第２の組成物を提供した後及び（ｉ）前記第１及び第２の組成物によって発現される前記タンパク質の第２のレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に、又は（ｉｉ）前記細胞又は対象における前記第１及び第２の組成物によって発現される前記タンパク質の第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第２の組成物が、
    （ｉ）前記第１の組成物によって発現される前記細胞又は対象におけるタンパク質のレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、若しくは２２か月、又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物の少なくとも１４日後及び前記第１の組成物の９０日以下後に、前記細胞又は対象に提供される、請求項１３、１５又は１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記タンパク質の第１のレベルが、
    （ｉ）前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベル、及び／又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％である、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. （ｉ）前記タンパク質の第２のレベルが、前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、若しくは１３０％であり；及び／又は
    （ｉｉ）前記タンパク質の第３のレベルが、前記第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、若しくは１３０％であり；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される前記タンパク質のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の前記タンパク質の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、若しくは１３０％であり；及び／又は
    （ｉｖ）前記第２の組成物を提供した後の前記タンパク質の平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、前記タンパク質の平均レベルが、前記第２の組成物を提供した１日後から、前記タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｖ）前記第１の組成物の後に各後続の組成物を提供した後の前記タンパク質の平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、前記タンパク質の平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、前記タンパク質が実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｖｉ）前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｖｉｉ）前記タンパク質の第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物、前記第２の組成物、及び前記第３の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｖｉｉｉ）前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象におけるタンパク質の第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、前記細胞又は対象におけるタンパク質の前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｘ）前記第３の組成物を提供した後、前記細胞又は対象において生成されるタンパク質の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、複数におけるタンパク質の第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｘ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、又は４５日後のタンパク質の第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、前記タンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｘｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後のタンパク質の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、前記タンパク質の第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項１８に記載の方法。
  20. （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルが、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルが、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記タンパク質のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項１３又は１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記タンパク質が、治療用タンパク質、例えば、エリスロポエチンであり、及び／又は前記タンパク質（例えば、エリスロポエチン）の発現が、前記細胞又は対象における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 細胞又は対象において環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
    （ａ）前記環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、前記第１の組成物を提供した後、環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルを含む、工程；及び
    （ｂ）環状ポリリボヌクレオチドの第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルを含み、
    （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２のレベルが、少なくとも前記第１のレベルと同程度であり、又は
    （ｉｉ）環状ポリリボヌクレオチドの前記第２のレベルが、前記第２の組成物を提供した後の前記第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
    それによって、前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドを、少なくとも前記第１のレベルに維持する工程を含み；任意選択的に、前記第１の組成物が、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含み、前記第２の組成物が、第２の環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで：
    （ｉ）前記第１の環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、同じであるか；又は
    （ｉｉ）前記第１の環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、異なり；
    任意選択的に、前記第１の環状ポリリボヌクレオチドが、第１の結合部位を含み、及び／又は第１のタンパク質をコードし、前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、第２の結合部位を含み、及び／又は第２のタンパク質をコードし、ここで、前記第１の結合部位及び前記第２の結合部位が、同じであるか、又は異なる結合部位であり、及び／又は前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質が、同じタンパク質又は異なるタンパク質をコードする、方法。
  23. 環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物のレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び第２の組成物を細胞又は対象に提供した後の前記細胞又は対象においてあるレベルの前記環状ポリリボヌクレオチドを生成する方法であって、
    （ａ）前記環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、前記第１の組成物を提供した後、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記レベルを含む、工程；及び
    （ｂ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、（ｉ）少なくとも、前記第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベル、又は（ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドのレベルの２０％以下だけ変化する、前記第２の組成物を提供した後の前記タンパク質のレベルを含む、工程；
    それによって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記線状同等物のレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、前記細胞又は対象における前記環状ポリリボヌクレオチドのレベルを維持する工程を含む、方法。
  24. 前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物を提供した後及び前記第１の組成物を提供することによって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物の後、及び前記第１の組成物によって生成される前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後に行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第２の組成物が、
    （ｉ）前記第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが実質的に検出不可能になった後、少なくとも１分間、１時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、若しくは２２か月、又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物の少なくとも１４日後及び前記第１の組成物の９０日以下後に、前記細胞又は対象に提供される、請求項２３又は２５に記載の方法。
  27. 環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、前記第２の組成物の後、前記細胞又は対象に提供し、それによって、前記第３の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルを、少なくとも前記第１のレベルに維持する工程をさらに含み、任意選択的に、前記第３の組成物を提供する工程が、前記第２の組成物を提供した後及び
    （ｉ）前記細胞又は対象において前記第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に、又は
    （ｉｉ）前記細胞又は対象において前記第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、５０％超低下する前；又は
    （ｉｉｉ）前記細胞又は対象において前記第１及び第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる、請求項２２又は２４に記載の方法。
  28. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程をさらに含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した１日後に、環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルであり；及び／又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後に発現される環状ポリリボヌクレオチドのその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２の組成物を提供した後の前記環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、前記環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、前記第２の組成物を提供した１日後から、前記環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の前記環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり、前記環状ポリリボヌクレオチドの平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、前記環状ポリリボヌクレオチドが実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｉｖ）前記環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｖ）前記第２の組成物を提供した後、前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記環状ポリリボヌクレオチドの第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｖｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の前記環状ポリリボヌクレオチドの第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項２２、２４、２７、又は２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の前記環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記第１の組成物を提供した１日後の前記環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第２の組成物によって生成される環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｉｖ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｖ）環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドのレベルが、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項２３、２５、２６、又は２８のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第３のレベルが、前記第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の環状ポリリボヌクレオチドの最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. （ｉ）環状ポリリボヌクレオチドの前記第１のレベルが、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間又は３０日間にわたって、環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記第３の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における環状ポリリボヌクレオチドの前記第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、前記複数における環状ポリリボヌクレオチドの前記第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の環状ポリリボヌクレオチドの前記第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の環状ポリリボヌクレオチドの前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項２７～２９又は３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記タンパク質（例えば、エリスロポエチン）が、前記対象における応答（例えば、網状赤血球の産生）を誘導する、請求項２２～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 細胞又は対象における標的を結合する方法であって、
    （ａ）標的のための結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記標的が、第１のレベルで前記結合部位に結合する、工程；及び
    （ｂ）標的のための結合部位を含む前記環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記標的が、第２のレベルで前記結合部位に結合し、（ｉ）前記第２のレベルが、前記第１のレベルと少なくとも同程度であり、又は（ｉｉ）前記第２のレベルが、前記第１のレベルの２０％以下だけ変化する、工程；
    それによって、前記細胞又は対象における前記標的の結合を、少なくとも、結合の前記第１のレベルに維持する工程を含む、方法。
  36. 環状ポリリボヌクレオチドの線状同等物の第１の組成物及び第２の組成物を提供した後の細胞又は対象における標的に結合するレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物及び第２の組成物を、前記細胞又は対象に提供した後の細胞又は対象における標的を結合する方法であって、
    （ａ）結合部位を含む前記環状ポリリボヌクレオチドの第１の組成物を、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物を提供した後、前記標的の結合のレベルを含む、工程；及び
    （ｂ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を、前記第１の組成物の後、前記細胞又は対象に提供する工程であって、前記細胞又は対象が、（ｉ）少なくとも、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後の前記標的への結合のレベル、又は（ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後のレベルの２０％以下だけ変化する標的への結合のレベルを含む、工程；それによって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記標的への結合のレベルと比較して、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における標的への結合のレベルを維持する工程を含む、方法。
  37. 前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物を提供した後及び（ｉ）前記第１の組成物による結合の前記第１のレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に、又は（ｉｉ）前記第１の組成物による結合の前記第１のレベルが、前記細胞又は対象において５０％超低下する前に、又は（ｉｉｉ）前記第１の組成物による結合の前記第１のレベルが、前記細胞又は対象において２５％～７５％低下する前に行われる前に行われる、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第３の組成物を、前記第２の組成物の後、前記細胞又は対象に提供し、それによって、前記細胞又は対象における前記標的の結合を、少なくとも、結合の前記第１のレベルに維持する工程をさらに含み、任意選択的に、前記第３の組成物を提供する工程が、前記第２の組成物を提供した後及び前記第１及び第２の組成物による前記細胞又は対象における前記標的の結合の前記第２のレベルが、前記細胞又は対象において実質的に検出不可能である前に行われる、請求項３５又は３７に記載の方法。
  39. 前記第３の組成物を提供する工程が、前記第２の組成物を提供した後及び前記細胞又は対象における前記第１及び第２の組成物による結合の前記第２のレベルが、５０％超低下する前に行われる、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記環状ポリリボヌクレオチドの第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物を提供する工程をさらに含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. （ｉ）環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供する工程が、前記第１の組成物の後、及び前記第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった後に行われ；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２の組成物が、前記第１の組成物による結合のレベルが実質的に検出不可能になった少なくとも６時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、又は２２か月後に、前記細胞又は対象に提供され；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第２の組成物が、前記第１の組成物の１４日後及び前記第１の組成物の９０日以下後に、前記細胞又は対象に提供される、請求項３６又は３８に記載の方法。
  42. （ｉ）結合の前記第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルであり；及び／又は
    （ｉｉ）結合の前記第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％であり；及び／又は
    （ｉｉｉ）結合の前記第２のレベルが、前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｉｖ）結合の前記第３のレベルが、前記第３の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｖ）前記第１の組成物の後に提供される各後続の組成物について、各後続の組成物の後の結合のその後のレベルが、各後続の組成物を提供した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、又は３０日間にわたって、前記第１の組成物を提供した１日後の結合の最高のレベルの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％であり；及び／又は
    （ｖｉ）前記第２の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、結合の前記平均レベルが、前記第２の組成物を提供した１日後から、前記結合が実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｖｉｉ）前記第１の組成物の後、各後続の組成物を提供した後の結合の平均レベルが、前記第１のレベルの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１１０％であり、結合の前記平均レベルが、各後続の組成物を提供した１日後から、前記結合が実質的に検出不可能である日まで測定され；及び／又は
    （ｖｉｉｉ）結合の前記第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｉｘ）前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合の前記第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く、
    （ｘ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の結合の前記第２のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の結合の前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項３５又は３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. （ｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合のレベルが、少なくとも１時間、１２時間、１８時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合のレベルが、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合のレベルが、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第２の組成物を提供した後、少なくとも１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記線状同等物の前記第１の組成物及び前記第２の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項３６又は４１に記載の方法。
  44. （ｉ）結合の前記第１のレベルが、前記第１の組成物を提供した後、少なくとも６時間、１日、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、又は３０日間にわたって、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第１の組成物、第２の組成物、及び第３の組成物を提供した後、維持され；及び／又は
    （ｉｉ）前記第３の組成物を提供した後の前記細胞又は対象における結合の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の結合の前記第１のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高く、
    （ｉｉｉ）前記環状ポリリボヌクレオチドの前記第３の組成物を提供した１時間、１２時間、１８時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、又は３０日後の結合の第３のレベルが、前記第１の組成物を提供した後の結合の前記第１のレベルより少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％高い、請求項３８～４０、又は４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. （ｉ）前記第１の組成物の前記環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の組成物の前記環状ポリリボヌクレオチドが、同じであり；又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物の前記環状ポリリボヌクレオチド及び前記第２の組成物の前記環状ポリリボヌクレオチドが、異なる、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. （ｉ）前記第１の組成物及び前記第２の組成物が、ほぼ同じ量の前記環状ポリリボヌクレオチドを含み；又は
    （ｉｉ）前記第１の組成物が、前記第２の組成物より多い量の前記環状ポリリボヌクレオチドを含み；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の組成物が、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、又は第１０の組成物より多い量の前記環状ポリリボヌクレオチドを含み；及び／又は
    （ｉｖ）前記第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、前記第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量の１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下だけ変化し、
    （ｖ）前記第２の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量が、前記第１の組成物の環状ポリリボヌクレオチドの量より１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％以下少なく；及び／又は
    （ｖｉ）前記第１の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含み；及び／又は
    （ｖｉｉ）前記第２の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含み；及び／又は
    （ｖｉｉｉ）前記第３の組成物が、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含み；及び／又は
    （ｘ）前記細胞が、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）であり；及び／又は
    （ｘｉ）前記細胞が、対象における複数の細胞であり、
    （ｘｉｉ）前記第１の組成物及び／又は前記第２の組成物が、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌ以下の線状ポリリボヌクレオチド分子を含み；
    （ｘｉｉｉ）前記第１の組成物及び／又は前記第２の組成物が、前記第１の組成物及び／又は前記第２の組成物中の総リボヌクレオチド分子に対して、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）の環状ポリリボヌクレオチド分子を含み；及び／又は
    （ｘｉｖ）第１の組成物及び／又は前記第２の組成物中の総リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、又は９９％（ｗ／ｗ）が、環状ポリリボヌクレオチド分子である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記対象が、動物（例えば、哺乳動物）である、請求項１１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記対象が、ヒトである、請求項１１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記タンパク質が、抗原（例えば、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原）である、請求項１、１１、１２及び２２のいずれか一項に記載の方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200127152A (ko) 2017-12-15 2020-11-10 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
KR20220097875A (ko) 2019-09-03 2022-07-08 마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크. 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
TW202340460A (zh) 2021-12-17 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於在變性條件下富集環狀ｒｎａ之方法
CN117070564A (zh) * 2023-03-30 2023-11-17 安可来(重庆)生物医药科技有限公司 一种用于合成环形rna的质粒及其构建方法与一种环形rna及其体外合成方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266684A (en) 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1992001813A1 (en) 1990-07-25 1992-02-06 Syngene, Inc. Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
WO1993006121A1 (en) 1991-09-18 1993-04-01 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5639603A (en) 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
EP0623171A4 (en) 1992-01-13 1997-02-12 Univ Duke ENZYMATIC RNA MOLECULES.
US5541061A (en) 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5721099A (en) 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5773244A (en) 1993-05-19 1998-06-30 Regents Of The University Of California Methods of making circular RNA
US5440016A (en) 1993-06-18 1995-08-08 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Peptides of the formula (KFmoc) ZZZ and their uses
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5688997A (en) 1994-05-06 1997-11-18 Pharmacopeia, Inc. Process for preparing intermediates for a combinatorial dihydrobenzopyran library
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5688696A (en) 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE69619825T2 (de) 1995-06-21 2002-10-10 Martek Biosciences Corp Kombinatorische bibliotheken aus markierten biochemischen verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung
US5766903A (en) * 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US5731423A (en) 1996-03-21 1998-03-24 Transcell Technologies, Inc. Process for preparing sulfoxides
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
US6210931B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
IL161100A0 (en) 2001-09-28 2004-08-31 Max Planck Gesellschaft Identification of novel genes coding for small temporal rnas
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2010084371A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
US10407683B2 (en) * 2014-07-16 2019-09-10 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
AU2016271519B2 (en) * 2015-06-05 2021-09-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for transient gene therapy with enhanced stability
WO2018191722A1 (en) * 2017-04-14 2018-10-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for transient gene therapy with enhanced stability
WO2018231990A2 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
KR20200127152A (ko) 2017-12-15 2020-11-10 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
WO2019236673A1 (en) * 2018-06-06 2019-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Circular rna for translation in eukaryotic cells
IL288284B1 (en) * 2019-05-22 2024-02-01 Massachusetts Inst Technology Circular Rana preparations and methods

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