KR20240104032A - 이중나선 dna가 결합된 금 나노 입자 운반체를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
이중나선 dna가 결합된 금 나노 입자 운반체를 포함하는 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 금 나노 입자를 통해 세포 내로 운반되는 이중나선 DNA를 포함하는 백신 조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로 상기 이중나선 DNA는 바이러스, 박테리아 혹은 암 유전자로부터 유래되어, 항원을 발현하여 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물에 대한 것이다.
Description
본 발명은 금 나노 입자 및 상기 금 나노 입자 표면에 결합된 이중나선 DNA를 포함하는 유전자 운반체의 백신(vaccine)으로서의 용도에 대한 것이다.
세포 내로 유전 물질을 전달하여 치료 또는 예방을 위한 항원이나 단백질을 생산하기 위한 기술은 특히 최근 팬더믹에 의해 최근 눈에 띄게 성장 하였으며, 이에 따라 항원 백신 이외에도 DNA 백신이나 mRNA(메신저RNA) 백신, 바이러스 백터 백신과 같은 다양한 유전자 백신이 개발되고 있다.
DNA는 가장 단순한 유전 물질로서, 유전학적 변형이 용이하여 백신 등의 치료제로 활용하기 위한 개발 기간을 단축할 수 있다. 또한 다른 백신 후보 물질인 바이러스, 단백질, RNA 보다 생산 설비 구축 및 생산 비용 측면에서 매우 경제적이며, 안정성이 우수하여 보관 및 유통이 용이한 장점을 가진다. 그러나, DNA 백신은 세포의 핵까지 전달되어 핵 내에서 직접 mRNA를 생산하도록 하는 과정이 필요하며, 전달을 위하여 주로 플라스미드와 같은 벡터를 사용한다. 핵 내로 주입된 DNA는 지속적으로 mRNA를 생산하며 항원 단백질을 꾸준히 생산할 수 있으나, 이를 운반하기 위해 우리 몸 속 세포핵에 다른 유전자 형질을 주입하기 때문에 선천성 면역 반응 등의 부작용이 생길 우려가 있다. 즉, DNA의 운반을 위해 주로 사용되는 플라스미드의 경우 세균 유래 유전자를 전달할 가능성이 있어 부작용 발생의 위험이 존재한다. 이에, 치료물질의 전달 및 발현을 위하여, 유전자를 세포 내로 안전하게 위한 운반체에 대해 운반체에 대한 다양한 연구가 진행 중에 있으며, 특히 운반 효율을 높이고 치료물질의 안정적 발현을 위한 전달 물질의 개발이 필요하다.
특히 최근 코로나, 독감과 같은 질환의 대규모 전염성 질환의 발병으로 인해, 감염병에 대응한 신속한 백신의 개발이 매우 중요하게 되었다. 특히 최근 코로나 팬더믹에 대응하여, 기존의 항원 백신 뿐만 아니라 DNA 백신, mRNA 백신 등 다양한 형태의 백신이 개발되었으며, 이를 효과적으로 전달하기 위한 백신 전달체 또한 다양한 형태로 개발되었다. 특히 DNA 백신은 온도에 민감하고, 구조적으로 불안정한 mRNA 백신에 비해 안전성이 확보된다는 장점을 가지나, 핵 내로 전달되어야 하므로, 효과적인 전달 기술에 대한 개발이 요구되었다.
이에 본 발명자들은 세포 독성이 없고, 세포 내에서 발현될 수 있는 이중나선 DNA (double stranded DNA; dsDNA)를 세포 내 핵으로 효율적으로 전달하기 위하여 이중나선 DNA 전달 기술을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 금 나노 입자(AuNP) 표면에 티올화된 이중나선 DNA를 공유결합으로 부착하여 세포 내 핵까지 유전자를 전달할 수 있는 운반 시스템을 발명하였으며, 상기 이중나선 DNA가 세포 내로 유입되어 단독으로 항원을 발현시켜 백신으로서 사용될 수 있는 유전자 운반체에 대한 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 금 나노 입자; 하나 이상의 작용기성을 포함하는 잔기를 통해 상기의 금 나노 입자의 표면에 결합되며, 세포 내에서 단독으로 항원을 발현하는 이중 나선 DNA를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금 나노 입자; 하나 이상의 작용기성을 포함하는 잔기를 통해 상기의 금 나노 입자의 표면에 결합되며, 세포 내에서 단독으로 항원을 발현하는 이중 나선 DNA를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 금 나노 입자, 하나 이상의 티올화된 잔기를 통해 상기의 금 나노 입자의 표면에 결합되며, 세포 내에서 단독으로 항원을 발현하는 이중나선 DNA를 포함하는 백신 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 상기 이중나선 DNA는 세포 내로 유입되어 발현되는 것을 목적으로 한다. 상기 이중나선 DNA는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로는 cDNA, gDNA, 플라스미드DNA 및 PCR DNA를 포함할 수 있다.
상기 이중나선 DNA는 이중나선 형태로 금 나노 입자에 결합되는 것이며, 상기 이중나선 DNA를 세포 내로 운반하기 위한 것으로, 이는 단일 가닥의 DNA가 금 나노 입자에 결합된 후, 세포 내로 유입되어 상기 단일 가닥과 상보적인 서열과 혼성화되는 것과는 차이가 있다. 특히 상기 이중나선 DNA는 항원을 발현할 수 있는 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 항원 발현 유전자는 바이러스, 박테리아 또는 암(cancer) 세포로부터 유래된 것일 수 있다.
또한 상기 이중나선 DNA는 하나 이상의 유전자를 포함하여 세포 내로 유입된 후 단독으로 발현될 수 있다. 본 발명에서 상기 '단독으로 발현'된다는 것은 주입된 세포의 게놈으로 통합되지 않고 상기 이중나선 DNA가 단독으로 전사 및/또는 번역되는 과정을 진행하는 것을 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 단독으로 발현되기 위하여 상기 이중나선 DNA는 하나 이상의 프로모터, 오픈리딩프레임(open reading frame), 또는 터미네이터를 포함할 수 있다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 이중나선 DNA는 전사 및/또는 번역되어 이로 인한 결과물을 생산할 수 있다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 이중나선 DNA가 금 나노 입자 표면에 결합되어 있는 유전자 전달체를 포함한다. 상기 이중나선 DNA는 금 나노 입자 표면 결합을 위하여 하나 이상의 작용기성(functionality)을 포함한다. 상기 작용기성은 티올기 또는 아민기일 수 있으며, 이중나선 DNA의 하나 이상의 잔기에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 이중나선 DNA는 티올화된 잔기를 포함하며, 이를 통해 금 나노 입자 표면에 직접 결합한다. 상기 티올화된 잔기는 3'말단, 5' 말단 또는 이중나선 DNA 서열 내 하나 이상의 염기일 수 있다.
또한, 상기 이중나선 DNA는 금 나노 입자 표면에 하나 이상 결합되며, 이에 제한되는 것은 아니나, 발현을 위하여 동일 또는 상이한 1 내지 20개의 이중나선 DNA가 금 나노 입자의 표면에 결합될 수 있다. 또한, 상기 결합되는 이중나선 DNA는 그 크기에 제한되는 것은 아니나, 10 bp 이상, 100 bp 이상 또는 500 bp 이상의 사이즈를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 이중나선 DNA는 720 bp의 SARS-CoV 백신 유래의 RBD DNA 서열, 1500 bp 이상의 인간 파필로마 바이러스(HPV) 유래의 DNA 서열이며, 상기 종류에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 용어 '백신'은 개체에 면역을 주는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 질환 예방을 위하여 사람이나 동물에게 누여, 예컨대 주사하거나 경구 투여함으로써 면역을 발생시키는 면역 원성 또는 항원성 물질을 말한다.
본 발명의 상기 백신은 DNA 백신일 수 있다. 상기 'DNA 백신'이라 함은, 병원균이나 바이러스 등의 유전자들 중 일부를 인공적으로 복제한 후 이를 투여함으로써 면역 반응을 야기하는 백신을 의미한다. 이러한 DNA 백신은 기존 단백질 백신에 비해 다양한 장점을 갖는다: i) 순수한 표적 병원체 항원의 유전 정보만으로 합성 제작이 가능하므로 위험한 병원체를 직접 취급할 필요가 없으며, ii) 독성 유발에 필요한 유전자들 중 일부만을 사용하므로 투여체에 투여되더라도 별다른 독성을 나타낼 염려가 없고, iii) DNA만으로 구성되는 단순함 때문에 갑자기 발생하는 다양한 감염병에 대해 신속하게 대응하여 백신을 개발하는 것이 가능하다.
상기 백신 조성물은 다양한 감염병, 또는 암에 대한 면역능을 형성하는 것일 수 있다. 상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 주입될 수 있다. 상기 '주입'은 피하주사, 근육 내 주사, 피하 내 주사, 복강 내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 DNA 백신의 투여에 적합한 임의의 경로로서, 예를 들면 피하, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 또는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 면역 반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성 물질 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예로써, 상기 백신 조성물에 포함되는 이중나선 DNA는 코로나 바이러스(SARS-CoV2)의 단백질, 펩티드, 또는 그의 단편이 포함되는 항원을 암호화하기 위한 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 코로나 바이러스 항원은 SARS-CoV2 스파이크 단백질, SARS-CoV2 뉴클레오캡시드 단백질, SARS-CoV2 외피 단백질, SARS-CoV2 매트릭스 단백질, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 항원은 임의의 수의 SARS-CoV2 균주를 방지하고 치료함으로써, SARS-CoV-2기반 병리를 치료, 예방 및/또는 방지하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 투여된 대상체의 면역 반응을 유의하게 유도하며, 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 유도할 수 있고, 결과적으로 SARS-CoV-2 감염을 방지하고 치료하는 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 상기 금 나노 입자는 나노 단위의 직경, 바람직하게는 5-500 nm, 보다 바람직하게는 10-200 nm의 직경을 가지는 금 입자로서, 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬우며, 크기 조절이 용이하고, 망간, 알루미늄, 카드늄, 납, 수은, 코발트, 니켈, 베릴륨 등의 중금속과 달리 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가진다. 금 나노 입자는 직경이 500 nm 이상으로 커질 경우 나노 입자로서의 특성이 소멸될 뿐 아니라, 나노 물질의 특성이 없는 금 표면과 티올기 등의 작용기와의 결합이 약해지기 때문에 금 나노 입자를 이용한 전달체를 제조하기 어려운 단점을 가진다.
본 발명은 금 나노 입자를 통해 세포 내로 운반되는 이중나선 DNA를 포함하는 백신 조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로 상기 이중나선 DNA는 항원을 발현하여 면역 반응을 유발하는 것으로, 다양한 바이러스성, 박테리아성 감염 질환 및 암에 대한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노 입자에 결합된 관심 유전자를 포함하는 핵산 분자의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 금 나노 입자에 티올화된 잔기를 통해 결합된 SARS-CoV-2-RBD를 발현하는 핵산 분자의 결합 효율을 확인한 결과이다.
도 3은 SARS-CoV-2-RBD를 발현하는 이중나선 DNA를 세포에 전달하여 발현한 결과를 확인한 것이다.
도 4는 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 SARS-CoV-2-RBD DNA가 주입되어 항원이 발현되는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 SARS-CoV-2-RBD DNA가 주입되어 SARS-CoV-2 항체를 생성하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 금 나노 입자에 티올화된 잔기를 통해 결합된 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1을 발현하는 핵산 분자의 결합 효율을 확인한 결과이다.
도 7은 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1의 이중나선 DNA를 세포 내로 전달하여 발현여부를 확인한 결과이다.
도 8은 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1 DNA가 주입되어 항체를 생성하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 금 나노 입자에 티올화된 잔기를 통해 결합된 SARS-CoV-2-RBD를 발현하는 핵산 분자의 결합 효율을 확인한 결과이다.
도 3은 SARS-CoV-2-RBD를 발현하는 이중나선 DNA를 세포에 전달하여 발현한 결과를 확인한 것이다.
도 4는 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 SARS-CoV-2-RBD DNA가 주입되어 항원이 발현되는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 SARS-CoV-2-RBD DNA가 주입되어 SARS-CoV-2 항체를 생성하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 금 나노 입자에 티올화된 잔기를 통해 결합된 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1을 발현하는 핵산 분자의 결합 효율을 확인한 결과이다.
도 7은 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1의 이중나선 DNA를 세포 내로 전달하여 발현여부를 확인한 결과이다.
도 8은 in vivo에서 금 나노 입자에 결합된 HPV 16_L1 및 HPV 18_L1 DNA가 주입되어 항체를 생성하는지 여부를 확인한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. dsDNA(SARS-CoV2)가 결합된 금 나노 입자 제조
코로나 바이러스(SARS-CoV2)로부터 유래된 이중나선 DNA를 금 나노 입자에 결합시켜 세포 내 전달 및 발현이 가능한 NES DNA를 제조하였으며, 이의 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다.
1-1. 세포 내 항원 발현이 가능한 dsDNA 제조
플라스미드 pcDNA3.1를 이용하여, 상기 플라스미드의 CMV 프로모터와 bGH 터미네이터 사이에 전달 대상 유전자를 클로닝하였다. 상기 유전자의 티올화된 잔기는 각각 티올화된 프라이머(thiolated primer)를 이용하여 PCR을 통해 각각 5'말단, 3'말단 또는 내부 잔기가 티올화된 이중나선 DNA를 합성하였다.
상기 합성에 사용한 이중나선 DNA는 SARS-CoV2(δ)의 상기 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 암호화하는 서열(서열번호 1)이다. 상기 전달 대상 유전자로서, 상기 방법을 통해 서열번호 1의 SARS-CoV2(δ) RBD 유전자를 클로닝하고, 티올화된 이중나선 DNA는 티올화된 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 합성한다.
1-2. 티올화된 이중나선 DNA 전처리
합성한 상기 티올화된 이중나선 DNA를 최종 농도가 1μM이 되도록 물에 녹인 후, 150 μl의 티올화된 이중나선 DNA에 20 μl의 3 M sodium acetate (pH 5.2)와 30 μl의 1 N DTT(dithiothreitol)를 넣고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 원하지 않은 티올기 분자를 포함한 DTT를 제거하기 위해, 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 200 μl를 넣고 섞은 후, 원심 분리 하여 상층액을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 이후, 에탄올 침전법(EtOH precipitating method)을 이용하여 티올화된 이중나선 DNA를 침전시켰다.
1-3. 금 나노 입자의 이중나선 dsDNA 기능화 (NES DNA) 제조
상기 1-2 과정을 통해 전처리되어 침전된 티올화된 이중나선 DNA를 물에 녹인 후, 금 나노 입자에 첨가한 후 salt aging 방법으로 결합시켰다. 구체적으로, 7 nM의 금 나노 입자에 티올화된 이중나선 DNA를 넣고 (AuNP : 티올화된 이중나선 DNA= 1:40) 충분히 섞은 후, 농도가 0.1 M 이 되도록 NaCl을 첨가하여 4시간 혼합하였다. 4시간 후 농도가 0.2 M 이 되도록 NaCl을 첨가하여 4시간 혼합하였다. 4시간 후 농도가 0.3 M 이 되도록 NaCl을 첨가하여 12시간 혼합하였다.
12시간 후 티올화된 이중나선 DNA와 금 혼합물은 ~10,000 x g에서 20 분간 원심 분리하여 모은 뒤 상층액에 있는 반응하지 않은 이중나선 DNA를 제거하였고, 이 과정을 3회 반복하였다.
최종 AuNP-티올화된 이중나선 DNA 결합물(AuNP-thiolated dsDNA)은 0.1 M NaCl를 포함하는 10 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.4)에 넣고 분산시켰다. 제조된 AuNP-티올화된 이중나선 DNA 결합물은 1% 아가로스 겔에 전기 영동으로 분석하였고, 한 개의 금 나노 입자 당 10~15개의 티올화된 이중나선 DNA 가 결합됨을 확인하였다 (도 2).
실시예 2. in vitro에서 RBD 유전자에 의한 단백질 발현량 확인
상기 실시예 1에서 제작한 이중나선 DNA의 세포내 발현을 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 먼저 플라스미드 DNA 및 상기 실시예 1의 티올화된 이중나선 DNA를 리포펙타민 3000(Invitrogen)을 사용하여 HeLa 세포에 형질 감염하였다. 24시간 후 세포를 1X PBS로 wash하고 스크래퍼를 이용해서 모은 뒤 1X Protease inhibitor cocktail (GenDEPOT)이 첨가된 NP-40 lysis buffer(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40)로 lysis하였다.
이후, 이를 원심 분리한 후, 시료의 상층액 내 총 단백질의 농도는 BCA assay kit (Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였고, 샘플 당 총 단백질량 30 μg를 protein dye(6X기준, 0.3 M Tris-HCl (pH 6.8), 12% SDS, 60% glycerol, 0.6 M β-mercaptoethanol, 0.0025% bromophenol blue)와 혼합하여 12% SDS-PAGE gel에 전기 영동하였으며, 이를 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
그 결과 티올화된 이중나선 DNA가 세포 내에서 RBD 단백질을 정상적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다. [도 3]
실시예 3. 소동물 모델에서 NES DNA(SARS-CoV2 RBD δ)에 의한 유전자의 전달 및 발현 확인
금 나노 운반체에 결합되어 세포 내로 전달된 이중나선 DNA(SARS-CoV2 RBD δ: NES DNA)의 항원 발현능을 확인하기 위한 실험을 아래와 같이 진행하였다.
6주령 Balb/c 마우스 (Central Lab Animal Inc, Korea)의 비복근에 NES DNA(SARS-CoV2 RBD δ)를 주입하였다. 36시간 후, 비복근을 분리하여 4% PFA로 고정시키고, 수크로오스가 각각 10%, 20%, 30%로 첨가된 1X PBS에 순차적으로 조직을 두어 동결 보존시켰다. 동결 보존된 조직을 FSC22 OCT compound (Leica Microsystems)에 넣어 급랭 시킨 뒤, 20 μm 두께로 동결 절편하였다.
이를 면역형광염색을 통하여 절편 내 단백질 발현을 형광현미경으로 확인하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, NES DNA(SARS-CoV2 RBD δ)가 주입된 비복근 조직에서 RBD δ 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 4. In vivo에서 NES DNA(SARS-CoV2 RBD δ)에 의해 생성된 항체 확인
결합 항체가의 농도와 중화 항체가 활성 검출을 위한 경쟁적 결합 분석을 측정하기 위하여 in vivo 실험을 진행하였다. 먼저, NES DNA(SARS-CoV2 RBD δ) 백신을 Balb/c 마우스에 2주 간격으로 2회 접종시켰으며, 상기 마우스로부터 안와 채혈하고, 혈액을 상온에서 응고시킨 뒤 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
마우스 혈액에 생성된 spike RBD δ에 대한 결합 항체를 측정하기 위하여, 분리된 혈청을 대상으로 RBD 단백질이 코팅된 96 well plate에 적용하여 이를 확인하였다. 혈청 내 항체의 경쟁적 결합 분석은 인간 ACE2 단백질이 코팅된 96 well plate와 HRP가 결합된 RBD δ 단백질을 이용하여 ELISA방식으로 검출하였다.
그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 본원 발명의 NES DNA를 접종한 마우스 혈청에서는 RBD에 대한 결합 항체 및 중화 항체가 모두 검출됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 이중나선 DNA(HPV)가 결합된 금 나노 입자 제조
인간 파필로마 바이러스(HPV)로부터 유래된 이중나선 DNA를 금 나노 입자에 결합시켜 세포 내 전달 및 발현이 가능한지 여부를 확인하기 위하여 아래와 같이 실험하였다.
먼저, 서열번호 2 및 서열번호 3의 HPV 바이러스 유래 DNA 서열인 HPV 16_L1, HPV 18_L1을 각각 합성하였으며(표 2), 실시예 1과 같은 방법으로 금 나노 입자 표면에 기능화하여 NES DNA-HPV 16_L1, NES DNA-HPV 18_L1를 각각 제조하였다. 이의 개략적인 모식도는 도 1에 도시된 바와 같다.
상기 금 나노 입자 표면에 결합된 DNA의 결합 효율성을 확인한 결과, 상기 HPV 유래 DNA의 경우, 한 개의 금 나노 입자 당 10~15개의 티올화된 이중나선 DNA가 결합됨을 확인하였다 [도 6].
실시예 6. In vitro에서 HPV16 L1, HPV18 L1 유전자에 의한 단백질 현량 확인
상기 실시예 5에서 제조된 이중나선 DNA인 HPV 16_L1, HPV 18_L1의 세포내 발현을 확인하기 위해 플라스미드 DNA 및 티올화된 이중나선 DNA를 리포펙타민 3000(Invitrogen)을 사용하여 HeLa 세포에 혈질 감염하였다. 이로부터 발현된 HPV16 L1, HPV 18 L1 단백질은 12% SDS PAGE gel 로 사용하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, HPV16 L1, HPV18 L1 단백질이 정상적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. In vivo에서 NES DNA(HPV16 L1, HPV18 L1)에 의해 생성된 항체 확인
상기 실시예 5에서 합성한 금 나노 입자 결합 DNA(NES DNA-HPV 16_L1, NES DNA-HPV 18_L1)결합 항체가의 농도 분석을 위하여 아래와 같이 실험하였다.
Balb/c 마우스에 NES DNA(HPV16 L1, HPV18 L1) 백신을 2주 간격으로 2회 접종시킨 후, 상기 마우스로부터 안와 채혈하고, 혈액을 상온에서 응고시킨 뒤 원심 분리하여 혈청을 분리하였다.
마우스 혈액에 생성된 HPV L1에 대한 결합 항체는 상기의 혈청을 대상으로 HPV16 L1 VLP와 HPV18 L1 VLP 단백질이 코팅된 96 well plate을 이용하여 마우스의 혈액에 생성된 항체를 ELISA방식으로 검출하였다.
그 결과, 도 8에서 보듯이, NES DNA(HPV16 L1, HPV18 L1) 백신 투여 마우스의 경우, 비투여군(control)과 비교하여 항체가 형성되었음을 확인할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 금 나노 입자; 및
하나 이상의 작용기성을 포함하는 잔기를 통해 상기 금 나노 입자 표면에 결합되며, 세포 내에서 단독으로 항원을 발현하는 이중나선 DNA를 포함하는 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 항원은 바이러스, 박테리아 또는 암(cancer) 항원을 포함하는 것인 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 이중나선 DNA는 주입된 세포의 게놈으로 통합되지 않고 단독으로 항원을 발현하는 것인 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 이중나선 DNA는 SARS-CoV2 바이러스로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 이중나선 DNA는 인간 인두유종 바이러스(Human papillomavirus, HPV)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 작용기성을 포함하는 잔기는 티올기 또는 아민기를 포함하는 것인 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 작용기성을 포함하는 잔기는 3'말단, 5'말단 또는 상기 이중나선 DNA의 염기 서열 내에 포함되는 하나 이상의 잔기인 백신 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 금 나노 입자는 5 내지 500 nm의 크기를 갖는 것인 백신 조성물.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220184295 | 2022-12-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240104032A true KR20240104032A (ko) | 2024-07-04 |
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