JP2017515508A - 慢性b型肝炎ウイルス(hbv)感染症を予防または処置するためのウイルス様ベシクル(vlv)ベースのワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月16日に出願された米国特許仮出願第61/994,166号に対して米国特許法第119条(e)の下で優先権を主張し、その出願はこれによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、National Institute of Healthにより授与された助成金R37 AI040357およびR01 AI45510の下で、政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
肝炎は、「肝臓の炎症」を意味する一般用語であり、主としてウイルス起源からの数多くの原因を有する。B型肝炎は、世界において最も一般的な重症の肝臓感染症である。それは、血液および体液を通して伝達されるB型肝炎ウイルス(HBV)によって引き起こされる。感染は、直接の血液間接触、無防護性交、汚染された針の使用を通して、および、分娩過程中に感染した女性から彼女の新生児へ起こり得る。
本発明は、慢性B型肝炎の処置用の治療的免疫化のための組成物および方法の発見に関連する。本明細書に記載されている種々の態様において、本発明の方法は、高力価のウイルス様ベシクル(VLV)を産生する、B型肝炎ウイルス(HBV)構造タンパク質を発現する進化したハイブリッドウイルスワクチンベクターを生じさせる工程を含む。加えて、本発明は、HBVを発現する本発明のVLVを投与した対象において、HBVを処置および/もしくは予防する、またはそれに対する免疫性を与える方法、ならびに、HBV感染症に対するメモリーT細胞およびB細胞の免疫応答を生じさせる方法を含む。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の試験の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。本発明を説明および特許請求する中で、以下の用語法を使用することになる。
組成物
本発明は、図1A〜図1Bに示されている高力価ハイブリッドウイルスベクターの発見に、一部基づく。ベクターは、表2に示されているような、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含む、セムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されている第1のプロモーター配列を含む、DNA配列を含む。これらの配列は、SFVサブゲノムRNAプロモーターに対応する第2のプロモーター配列を特定するDNAに機能的に連結されている。この配列は、次に、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。ベクターは、SFV構造タンパク質をコードする機能的なヌクレオチド配列を欠いている。ベクターを細胞培養において増やす際には、高力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られ、例えば、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価が得られる。
本発明は、HBVの感染に対する免疫性を対象に与える方法を含む。方法は、高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該高力価ハイブリッドウイルスベクターは、HBV遺伝子またはその断片をコードするDNAを含む。異種遺伝子の発現は、対象において、それによりコードされるHBVタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘導する。1つの局面において、本発明は、対象においてHBVタンパク質またはその断片に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法を含む。別の局面において、対象においてHBVタンパク質またはその断片に対する適応B細胞免疫応答を生じる。
本発明の高力価ハイブリッドHBVベクターは、薬学的組成物として製剤化され得る。
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。例えば、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、単一用量で、いくつかの分割された投薬量で、対象に投与されてもよく、および、時差的な投薬量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または、用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、投薬量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増大または減少させてもよい。
1つより多い経路を投与のために使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時のかつ有効な反応を提供できることを、当業者は認識しているであろう。本発明の組成物のいずれかの投与の経路は、吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜(例えば、舌下、舌、(経)頬、(経)尿道、膣(例えば、経膣的および膣周囲的)、鼻(内)、および(経)直腸)、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、クモ膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載されているような、HBV関連疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を処置、予防、または改善するためのキットであって、a)本明細書に記載されているような化合物または組成物;および任意でb)本明細書に記載されているような追加の作用物質または療法を含むキットが、提供される。キットは、HBV関連疾患、障害、または状態を処置、予防、または改善するようにキットを使用するための説明書または標識を、さらに含むことができる。さらなる態様において、本発明は、バリアントHBVについてのアッセイのためのキットである。そのようなキットは、例えば、PCRもしくは他の核酸ハイブリダイゼーション技術(マイクロアレイ)由来の試薬、または免疫学に基づく検出技術(ELISpot、ELISA)用の試薬を含有し得る。
細胞株、ハイブリッド水疱性口内炎ウイルス/セムリキ森林ウイルスワクチンベクター(VLV)の生成
ハムスターBHK-21(BHK)上皮細胞を、10%ウシ胎児血清、50 U/mlペニシリン、および2 mM L-グルタミンを補給したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において維持した。
酵素Pac1およびSbf1での消化後に、PCR産物をプラスミドpCMV-SFVT2AG中にクローニングして、それぞれpCMV-SFVHBcT2AGおよびpCMV-SFVmST2AGを作製した。pCMV-SFVT2AGは、SFVサブゲノムRNAプロモーターの下流にPac1-Sbf1クローニング部位を有するように操作されている、pCMV-SFVG-p50Rベクター(SEQ ID NO: 5、本明細書中の他の場所で実施例セクションの終わりに提供されている)に由来するプラスミドである。このプラスミドはまた、クローニング部位の下流であるがインディアナセロタイプVSV糖タンパク質(VSV G)の上流に、リボソームT2Aスキッピング部位もコードする。ニュージャージーセロタイプVSV糖タンパク質をコードする同様のプラスミド(pCMV-SFVT2AGNJ)もまた、HBVタンパク質および代替糖タンパク質を発現するウイルス様ベシクル(VLV)を産生するために、クローニングに使用した。VLV-MHBs(インディアナセロタイプ)、VLV-HBcAg、またはVLVNJ-MHBsを、それぞれ、プラスミドpCMV-SFVmST2AG、pCMV-SFVHBcT2AG、またはpCMV-SFVmST2AGNJをBHK細胞にトランスフェクトすることによって回収した。VLVの回収のためには、10 cmディッシュ中のBHK-21細胞(2×106細胞)に、Lipofectamine(Invitrogen)およびOpti-MEM培地を用いて製造業者のプロトコルにしたがい、10μgのプラスミドをトランスフェクトした。5時間後に、トランスフェクション培地を、5%FBSを加えた10 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で置換した。次いで、細胞を37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。次いで、上清を収集した。いくつかの場合には、VLVを、100 kDa Amicron(登録商標)Ultra filter(EMD Millipore Corporation)を通した遠心分離により濃縮した。アリコートを、-80℃で保存した。
VLVストックの力価を、以前に記載されているように決定した(Rose et al., 2008, PNAS 105:5839-43)。簡潔に言うと、ストックを連続希釈し、カバーガラス上に播種したBHK-21細胞に21時間感染させるために使用した。次いで、細胞を、3%パラホルムアルデヒドで固定し、VSV糖タンパク質に対する一次抗体、およびその後のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Invitrogen)で染色した。次いで、感染細胞の蛍光プラークを計数し、力価を計算した。HBVタンパク質の免疫蛍光法については、細胞に、SFVG41-MHBsまたはSFVG41-HBcAgをトランスフェクトして、3%パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、HBVコアに対する抗体(Dako)またはプレS2に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology)で染色した。適切な二次抗体を使用し、CoolSnap EZデジタルカメラを装備したNikon Eclipse 80i顕微鏡を用いて、細胞を画像化した。
肝臓組織を収集して、10%緩衝リン酸ホルマリン(Fisher Scientific)中で固定した。パラフィン包埋後に、HBVコアを、抗コアポリクローナルウサギ抗体(Dako)を用いてYale University Research Histologyにより行われた免疫組織化学染色によって検出した。
BHK-21細胞を、VLV-MHBsまたはVLV-HBcAg(10のMOI)に24時間感染させた。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、2×SDS試料緩衝液で溶解した。試料を、10%SDSゲル上で泳動し、ニトロセルロース膜に転写して、抗プレS2(Santa Cruz Biotechnology)、抗コア(Dako)、抗VSV、または抗アクチン(Santa Cruz Biotechnology)抗体のいずれかをプローブとし、次いで、化学発光を用いて二次抗体で検出した。
ガンマインターフェロン(IFN-γ)酵素結合免疫スポット(ELISPOT)セット(BD Biosciences)を用いて、製造業者のプロトコルにしたがい、HBV特異的T細胞応答を定量した。簡潔に言うと、免疫化/抗原投与後の7日目に、マウスを安楽死させて、脾臓を収集した。脾細胞を、70μmストレーナー(BD Falcon)の通過およびACK溶解緩衝液(Lonza)での処置によって精製した。細胞を、ハンクス平衡塩溶液(HBSS;Invitrogen)で洗浄し、10%ウシ胎児血清、100μg/mlペニシリン、および2 mM l-グルタミンを補給したDMEMに懸濁して、精製抗マウスIFN-γ抗体(1:200)でコーティングした96ウェルプレートに2×105細胞/ウェルで播種した。次いで、細胞を、一晩、37℃で、10μg/mlの濃度のHBV特異的ペプチド(MHBsおよびHBcAg、下記の表1)で刺激した。細胞を、PBS-Tween(0.05%[体積/体積])を用いてプレートから洗浄し、提供されたビオチン化抗マウスIFN-γ抗体(1:250)を、10%ウシ胎児血清、100μg/mlペニシリン、および2 mM L-グルタミンを補給したDMEMを用いて2時間、25℃で添加した。洗浄後に、ストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)(1:100)をウェルに添加し、1時間、25℃でインキュベートした。最終的な洗浄後に、3-アミノ-9-エチル-カルバゾール(AEC)色素体基質(BD Biosciences)をウェルに添加して、25℃で20〜40分間顕色させた。蒸留水を添加して反応を停止し、プレートを風乾させた後、スポット形成細胞(SFC)を数えた。
6〜8週齢のC57BL/6×Balb/c F1(CB6F1J)マウスを、Jackson Labs(Farmington, CT)から入手した。トランスジェニック(Tg)マウス実験のために、1.3.32 HBV Tgマウス(15)とBalb/cマウス(Charles River; Wilmington, MA)とを一世代交配して、HBV.CB6F1マウスを入手した。導入遺伝子発現の測定単位として血清HBeAgレベルについて、マウスを5〜6週間でスクリーニングした。
マウスを、筋肉内への107免疫蛍光単位(IFU)のVLV-MHBsもしくはVLV-HBcAg、107 PFUのVSV-MHBs、または50μgの pCMV-S2.Sで免疫化した。いくつかの場合には、免疫化の4週間後、マウスに、107 PFUのVSV-MHBs、VLV-MHBs、またはVLVNJ-MHBsのいずれかをブーストした。
MHBsおよびHBcAgに対する抗体応答、ならびに血清HBeAgレベルを検出するために、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA、International Immunodiagnostics)を、製造業者のプロトコルにしたがい、血清試料をFBSにおいて1:50に希釈して行った。
肝臓内白血球を、以前に記載されているように単離した(Cobleigh et al., 2010, Journal of virology 84:7513-7522)。簡潔に言うと、肝臓片を70μm孔のストレーナーに通過させ、結果として生じた懸濁液を、37℃で30分間、0.5 mg/mLコラゲナーゼD(Roche)で処置した。次いで、細胞をHBSSで洗浄し、HBSS中の44% Percoll(体積/体積)に再懸濁して、PBS中の56% Percoll(体積/体積)の上に重層化した。850×gで30分間、勾配を遠心分離した後、相間の細胞を収集した。次いで、細胞をHBSSで洗浄し、さらなる解析のためにDMEMに再懸濁した。
抗原投与後に、HBV RNAおよびDNAを、ノーザンブロット解析およびサザンブロット解析によって検出した。肝臓由来の全ゲノムDNAを、以前に記載されているように精製した(Guidotti et al., 1995)。次いで、サザンブロット解析を、30μgの全肝臓DNAをHindIIIで消化し、アガロースゲル上で分離することによって行った。ノーザンブロット解析のためには、全肝臓RNAを、RNeasy minikit(Qiagen)を用いて製造業者のプロトコルにしたがい、単離した。変性したRNA(20μg)を、(5%ホルムアルデヒドを含有する)アガロースゲル電気泳動によって分離した。10×SSC(0.015 Mクエン酸ナトリウムを含む0.15 M NaCl)でのキャピラリートランスファー法を用いて、核酸を、ナイロン膜に一晩転写した。次いで、核酸を、UV照射によって膜に架橋させ、32P標識dCTPおよびRoche random-primed DNA labeling kitで3.2-kb HBV DNAから調製したプローブにハイブリダイズさせた。シグナルを、PhosophorImager(Fuji)を用いて検出した。
スチューデントのt-検定を用いて、正常マウスおよびトランスジェニックマウスにおけるCD8 T細胞応答の有意な差を決定した。0.05未満のp値を、統計学的に有意とみなした。
組織培養における大規模な継代を通して、進化後に高力価になるVLVを生じさせるために、図1A〜図1Bに図示した出発DNA構築物を使用した。この構築物を用いて生じさせたSFVレプリコンは、第1のサブゲノムプロモーターからVSV Gを、および第2のプロモーターからSFVキャプシドタンパク質を発現する。この構築物から感染性粒子が導き出され、VLVに典型的な低力価(約105感染単位/ml)を呈することが見出された。より高い力価になるであろう粒子を進化させることが可能であるかどうかを判定するために、BHK細胞上でのVLVの継代を1年の期間にわたって追跡した。最初の継代において、細胞変性効果(CPE)を示す細胞由来の培地の5%を、6 cmディッシュ上の新鮮なBHK細胞の上に移し、次いで、強いCPEが3〜5日までに発生した。SFVキャプシドタンパク質の発現は、継代8までに完全に失われ、その発現が粒子産生を阻害していたことが示唆された。連続した継代に伴って、粒子力価の増大、および24時間未満でのずっとより急速なCPE発生が認められた。継代50までに、VLVは、5×107 i.u./mlより高い力価に達するように進化し、2日後にBHK細胞上に変動するサイズの目に見えるプラークを形成した。この時点で、大きなプラークを選択し、その後「p50 VLV」と呼ばれることになるクローン化したVLVストックを生じさせるために使用した。このp50 VLVは、出発ベクターをおよそ1000倍上回る増大である、およそ5×108 pfu/mlの力価になる。
p50 VLVゲノムのコンセンサス配列を決定するために、逆転写およびPCRを行って、ゲノム全体をカバーする、オーバーラップするDNA断片を生じ、次いで、これらの断片を配列決定した。アセンブルした配列は、(ヌクレオチド13333と13334との間に位置するベクター欠失において)1672ヌクレオチドの大きな欠失を示し、これにより、第2のSFVプロモーター、キャプシド遺伝子全体、および、ポリ(A)の前のSFV配列の187ヌクレオチド以外のすべてが除去されていた(図1A〜図1B)。
*アミノ酸は、SFV nsP1〜4ポリタンパク質において、またはVSV Gタンパク質において番号づけされている。太字で下線のテキストは、変化したアミノ酸を示す。
HBV(aywセロタイプ)コア抗原(HBcAg)およびミドルバージョンのHBVエンベロープタンパク質(MHBs)のオープンリーディングフレームを、PCRを用いて増幅し、それぞれ5'端および3'端にPac1およびSbf1用のクローニング部位を付加した。次いで、遺伝子を、プラスミドpCMV-SFVT2AG中にクローニングして、それぞれpCMV-SFVHBcT2AGおよびpCMV-SFVmST2AGを作製した。pCMV-SFVT2AGは、SFVサブゲノムRNAプロモーターの下流にPac1-Sbf1クローニング部位を有するように操作されている、pCMV-SFVG-P50Rに由来するプラスミドである。このプラスミドはまた、クローニング部位の下流であるがインディアナセロタイプVSV糖タンパク質(VSV G)の上流に、リボソームT2Aスキッピング部位(Doronina et al., 2008, Molecular and cellular biology 28:4227-4239)もコードする(図2A)。ニュージャージーセロタイプVSV糖タンパク質をコードする同様のプラスミド(pCMV-SFVT2AGNJ)もまた、HBVタンパク質および代替糖タンパク質を発現するウイルス様ベシクル(VLV)を産生するために、クローニングに使用した。
ミドルB型肝炎表面(MHBs)タンパク質を発現するVLVベクター(VLV-MHBs)またはコア抗原B型肝炎抗原(HBcAg)タンパク質を発現するVLVベクターのいずれかを生じさせた(図2)。HBV抗原特異的なCD8 T細胞応答を誘導するこれらのベクターの能力を、マウスにおいて検討した。動物を、筋肉内への1×107プラーク形成単位(PFU)のVLV-MHBsまたはVLV-HBcAgで免疫化し、CD8 T細胞応答を、公知のMHBsまたはHBcAg CD8 T細胞エピトープに対応するペプチドを用いて、IFN-γELISpotアッセイにより7日後に測定した(図3A)。CD8 T細胞応答は、VLV-MHBs免疫化マウスにおいて、4種のMHBsエピトープに対して特異的に誘発された(図3A)。対照的に、このアッセイにより測定可能な応答は、VLV-HBcAg免疫化マウスにおいてHBcAgに対して生じなかった。
VLV-MHBsにより誘導されるCD8 T細胞が防御的であるかどうかを判定するために、急性HBV感染症のモデルとなるHBV流体力学的注射プロトコル(Yang et al., 2002, PNAS 99:13825-13830)を使用した。このモデルは、マウスの体重の9%とほぼ同等の体積におけるHBV1.3ゲノム長DNA発現プラスミドのマウスの尾静脈中への注射を含む。この体積過剰負荷は、マウスの肝細胞による当該DNAの取り込みを強要し、したがって、HBVタンパク質および複製中間体の発現を結果としてもたらす。このプロトコルにはウイルス侵入工程が存在しないため、防御は、HBV感染症を一掃するT細胞媒介性の機序に依存する。マウスを、DMEM、107 IFUのVLV-MHBs もしくはVLV-HBcAg、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。免疫化の6週間後に、流体力学的注射を行って、HBV複製についてマウスをモニターした。
CD8 T細胞応答を、VLV-MHBsで免疫化したマウスと、MHBsを発現する組み換えDNA(rDNA)または組み換えHBsAgタンパク質(rHBsAg)で免疫化したマウスにおいて、MHBsの間で比較した(図6)。マウスを、筋肉内への1×107 PFUのVLV-MHBs、50μgのrDNA、または10μgのrHBsAgで免疫化し、4種のMHBsエピトープに対するCD8 T細胞応答を7日後に測定した。対照PBSまたはrDNAで免疫化したマウスは、測定可能な応答を誘発しなかった。マウスのあるサブセットはHBsAgタンパク質免疫化に応答したが、VLV-MHBs免疫化によって誘導されたCD8 T細胞応答は、概して、規模がより大きく、かつ特異性がより広かった。したがって、マウスにおいてVLV-MHBsによって生じたCD8 T細胞応答は、rDNAまたはrHBsAgと比較して、より一貫して検出可能であり、かつ概してより強かった。さらに、応答が検出されたマウスの中で、応答は、VLV-MHBsで免疫化したマウスにおいてより多くのエピトープに対して向けられていた(図6)。これらのデータにより、VLV-MHBs免疫化は、他の試験した免疫化戦略よりも良好なCD8 T細胞応答を誘発することが示される。
VLV-MHBs粒子は、単一用量で防御的T細胞応答を誘発するが、慢性感染症の間の免疫寛容の克服は、複数回の免疫化を必要とし得る。重要なことに、VSV Gタンパク質に対する抗体は、同じセロタイプのVLVブーストベクターを中和する可能性が高いであろう。したがって、VLVワクチンプラットホームを用いてプライム・ブースト戦略を調査するために、追加のVLV構築物を最初に生成した。この構築物もまた、MHBsを発現するが、VSV Gタンパク質(インディアナセロタイプ)を、ニュージャージーセロタイプVSV Gで置換させた(VLVNJ-MHBs;図7A)。VLVNJ-MHBsを構築した後、VLV-MHBsまたは50μgのMHBsを発現するDNAプラスミド(pCMV-S2.S)で筋肉内にプライミングして、プライム・ブースト実験を行った。次いで、マウスを、4週間後に、VLV-HBcAg、VLV-MHBs、またはVLVNJ-MHBsでブーストした。ブーストの7日後に、IFN-γELISPOTアッセイを行うことによってCD8 T細胞応答を解析した。VLV-HBcAgまたはVLV-MHBsでのブーストは、期待されたように、測定可能な応答を誘導しなかった(図7B)。VLVNJ-MHBsでのブーストは、測定可能なHBV特異的応答をもたらした;しかし、観察された応答は、VLV-MHBs免疫化で観察された一次応答より大きくはなく、ブーストが無効であったことを示唆した。DNAでのプライミング、およびその後のVLV-MHBsでのブーストは、一次免疫化単独で観察されたものよりも大きい応答をもたらす傾向があった(図7B)。これらの結果により、組み合わせ免疫戦略は、VLV単独を用いるよりも強いT細胞応答を誘導し得ることが示唆される。
VLV-MHBs免疫化の治療的潜在能力を試験するために、1.3.32HBVトランスジェニックマウスを慢性感染症のモデルとして使用した。これらのマウスは、変動するレベルのHBV導入遺伝子を発現し、これは血清HBeAgレベルによって測定することができる(Guidotti et al., 1995, Journal of virology 69:6158-6169)。HBV治療用ワクチン接種は、抗ウイルス薬または他の免疫調節薬などの他の処置様式と組み合わせて使用できる可能性が高い。長期の抗ウイルス療法を受けている人に存在し得る、より低い抗原負荷のモデルとするために、HBeAg低マウスを免疫化した。VLV-MHBsでの単一の免疫化は、いかなるHBV特異的免疫応答も誘導しなかった。しかし、DNAでのプライミングおよびその後のVLV-MHBsでのブーストは、少なくとも1つのエピトープに対するT細胞応答を誘導した(図8)。免疫応答がHBeAg低マウスにおいて検出されたが、VLV-MHBsワクチン接種は、HBeAg高マウスにおいてT細胞応答を誘発しなかった。これらの結果により、VLVワクチン接種とより低い抗原血症に対する他の処置戦略との組み合わせは、HBV免疫療法のための新規アプローチになり得ることが示唆される。
VLVベースのワクチンは、現在利用可能なHBVワクチンまたは他の可能性のあるウイルスベースのワクチンベクターと比較して、数多くの利点を有する。これらは、a)単一用量において長続きする免疫を誘導する潜在能力;b)ヒト集団において、ベクター構成要素に対する既存の免疫がないこと;c)組み換えタンパク質またはDNAワクチンと比較して増大したT細胞生成の効力;d)他のウイルスワクチンベクターと比較して増大した安全性;およびe)産生の相対的な容易さを含むが、これらに限定されない。
全体的に、本発明のMHBsを発現するVLVワクチンは、ウイルスワクチンシステムが、他のワクチン戦略と組み合わせて、有効なHBV治療法につながり得ることを実証する。さらなる最適化がこのワクチン戦略に有益性を与え得るが、他の前臨床モデルにおける調査は、VLVシステムの潜在能力を強調し得る。さらに、トランスジェニックマウスの寛容原性環境において応答を誘導するVLVシステムの能力により、当該システムは、他の病原体に対するワクチンを設計する場合に有用である可能性が高いことが示唆される。実際に、VLVは、HIV分野における有望性を既に示している(Rose et al., 2008, PNAS 105:5839-5843;Schell et al., 2011, Journal of virology 85:5764-5772)。他の病原体および疾患に対するワクチンへのさらなる調査により、VLVワクチンシステムの融通性および有用性が強調され得る。
Claims (26)
- セムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、SFVサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス(HBV)ベクターであって、
該SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、SFV構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる、
高力価ハイブリッドHBVベクター。 - プロモーター配列が構成性プロモーターを含む、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
- プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターを含む、請求項2記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
- 少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
- 少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項4記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
- HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎ウイルスタンパク質X(HBx)、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
- B型肝炎表面抗原(HBsAg)がミドルB型肝炎表面(MHBs)タンパク質である、請求項6記載のHBV抗原。
- 請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む、組成物。
- HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎ウイルスタンパク質X(HBx)、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項8記載の組成物。
- B型肝炎表面抗原(HBsAg)がミドルB型肝炎表面(MHBs)タンパク質である、請求項9記載のHBV抗原。
- HBV抗原がB型肝炎ウイルス(HBV)感染症と関連している、請求項8記載の組成物。
- HBV感染症に対する免疫性を対象に与える方法であって、少なくとも107 pfu/mlの請求項8記載のVLVを含む組成物を該対象に投与する工程を含み、HBV抗原の発現が該対象において免疫応答を誘導する、方法。
- HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎ウイルスタンパク質X(HBx)、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
- 対象において疾患を処置および/または予防する方法であって、治療的有効量の請求項8記載の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
- 疾患がB型肝炎ウイルス(HBV)感染症である、請求項14記載の方法。
- HBV感染症が慢性感染症である、請求項15記載の方法。
- 対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の請求項8記載の組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法。
- 組成物が予防用ワクチンである、請求項17記載の方法。
- 組成物が治療用ワクチンである、請求項18記載の方法。
- 組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、請求項17記載の方法。
- アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 対象においてHBV抗原またはその断片に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法であって、(a)請求項8記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程;(b)第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項8記載の組成物を投与する工程を含み、該HBV抗原またはその断片に対するTメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
- 対象においてHBV抗原またはその断片に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法であって、(a)請求項8記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程;(b)第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項8記載の組成物を投与する工程を含み、該HBV抗原またはその断片に対するBメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項12、14、17、22、および23のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項24記載の方法。
- アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス(HBV)ベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる、
高力価ハイブリッドHBVベクター。
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