JP2019501945A - インフルエンザワクチン接種のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
インフルエンザAおよびBウイルスに対する幅広い免疫応答を生成し、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する個体における複数回のワクチン接種を可能にすることにおける使用のための、複数のインフルエンザ抗原遺伝子を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンを構築および生成するための方法が記載される。具体的には、上記組換えアデノウイルスベースのベクターは、初期2b(E2b)遺伝子において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクターである。
Description
本出願は、2016年1月15日に出願された米国仮特許出願第62/279,267号および2016年2月12日に出願された米国仮特許出願第62/294,840号の利益を請求し、その全体の内容が参照によって組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)、米国国立アレルギー・感染研究所(NIAID)によって授与された研究助成金RO1AI111364の下、政府支援によってなされた。政府は、本発明における特定の利益を有し得る。
背景
ワクチンは、有害な物質および病的な細胞を認識しかつ破壊するために免疫系を訓練することによって、身体が疾患と闘うために役立つ。ワクチンは、大きく2つのタイプ、予防ワクチンおよび処置ワクチンに分類され得る。予防ワクチンは、健康な人々に与えられて、特定の疾患の発生を防止する一方で、処置ワクチン(免疫療法ともいわれる)は、疾患を有すると診断された人に与えられて、その疾患が成長し、拡がるのを抑えるかまたは予防剤として役立つ。
ワクチンは、有害な物質および病的な細胞を認識しかつ破壊するために免疫系を訓練することによって、身体が疾患と闘うために役立つ。ワクチンは、大きく2つのタイプ、予防ワクチンおよび処置ワクチンに分類され得る。予防ワクチンは、健康な人々に与えられて、特定の疾患の発生を防止する一方で、処置ワクチン(免疫療法ともいわれる)は、疾患を有すると診断された人に与えられて、その疾患が成長し、拡がるのを抑えるかまたは予防剤として役立つ。
ウイルスワクチンは、感染性疾患およびがんと闘うことに役立つように現在開発されている最中である。これらのウイルスワクチンは、宿主細胞内で疾患と関連する遺伝子の小さな画分の発現を誘導することによって機能し、それは翻って、宿主の免疫系が病的な細胞を同定しかつ破壊するよう強化する。よって、ウイルスワクチンの臨床的応答は、ワクチンが高レベルの免疫原性を得、持続した長期発現を有する能力に依存し得る。
感染性疾患のような複雑な疾患に対する増強された治療的応答のための方法および組成物を開発する必要が未だにある。
要旨
種々の局面において、本開示は、E2b遺伝子領域において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクター;ならびにインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
種々の局面において、本開示は、E2b遺伝子領域において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクター;ならびにインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、インフルエンザウイルスAの標的抗原である。さらなる局面において、上記インフルエンザA標的抗原および上記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザウイルスAおよびインフルエンザウイルスBに共通する標的抗原である。
いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域において欠失をさらに含む。さらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E4領域において欠失をさらに含む。いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3およびE4領域において欠失をさらに含む。
いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む。他の局面において、上記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザB/YamagataウイルスおよびインフルエンザB/Victoriaウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む。
他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2、マトリクスタンパク質M2のM2e部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。いくつかの局面において、上記インフルエンザB標的抗原は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。
いくつかの局面において、上記欠失は、塩基対を含む。さらなる局面において、上記欠失は、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、または少なくとも150の塩基対を含む。
なおさらなる局面において、上記欠失は、150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対を含む。
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザA標的抗原をコードする核酸を含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザA標的抗原をコードする核酸を含む。他の局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む。
さらなる局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザA標的抗原、インフルエンザB標的抗原、または両方の発現を増加させるエレメントをさらに含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、少なくとも1種のエレメント、少なくとも2種のエレメント、少なくとも3種のエレメント、少なくとも4種のエレメント、または少なくとも5種のエレメントを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、構成的プロモーターを含む。他の局面において、上記エレメントは、誘導性プロモーターを含む。
他の局面において、上記エレメントは、転写エンハンサーを含む。いくつかの局面において、上記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである。いくつかの局面において、上記エレメントは、パリンドローム配列を含まない。
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザA標的抗原、インフルエンザB標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、guttedベクターではない。いくつかの局面において、上記組成物または複製欠損アデノウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。さらなる局面において、上記共刺激分子は、B7、ICAM−1、LFA−3、またはこれらの組み合わせを含む。なおさらなる局面において、上記共刺激分子は、B7、ICAM−1、およびLFA−3の組み合わせを含む。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって5×1010 VP以下を含む。他の実施形態において、上記組成物は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって1×1012 VP以下を含む。
種々の局面において、本開示は、インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成することを必要とする個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、上記の組成物のうちのいずれかに従う組成物を投与するステップを包含する。
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびにインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む、第1のアデノウイルスベクターを投与するステップ;上記個体に、(a)E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、および(b)インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む、第2のアデノウイルスベクターを投与するステップを包含し;それによって、1種または複数種のインフルエンザAおよびB標的抗原に対する免疫応答を生成する。
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、a)上記個体に、(i)E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに(ii)第1のインフルエンザA標的抗原および第1のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む、第1のベクターを投与するステップ;ならびに(b)その後上記個体に、第2のベクターであって、(i)ステップ(a)の複製欠損アデノウイルスベクター、および(ii)第2のインフルエンザA標的抗原および第2のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸であって、ここで上記第2のベクターの第2のインフルエンザA標的抗原が、上記第1のベクターの第1のインフルエンザA標的抗原と同じであるかまたは異なり、上記第2のベクターの第2のインフルエンザB標的抗原が、上記第1のベクターの第1のインフルエンザB標的抗原と同じであるかまたは異なる核酸を含む、第2のベクターを投与するステップを包含し;それによって、上記第1の標的抗原および上記第2の標的抗原に対する免疫応答を生成する。
種々の局面において、本開示は、個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、ならびにインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを投与するステップ;ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与するステップを包含し;それによって、上記インフルエンザAおよびB標的抗原に対する免疫応答を生成する。
種々の局面において、本開示は、ユニバーサルインフルエンザワクチンベクターを構築するための方法を提供し、上記方法は、インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を複製欠損アデノウイルスベクターに挿入するステップであって、ここで上記アデノウイルスベクターは、E2b領域において欠失を有する、ステップを包含する。
いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザB/YamagataウイルスおよびインフルエンザB/Victoriaウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む。
他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2、マトリクスタンパク質M2のM2e部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。さらに他の局面において、上記インフルエンザB標的抗原は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である。
いくつかの局面において、上記個体は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する。いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、guttedベクターではない。
他の局面において、第1のベクターは、guttedベクターではない。さらなる局面において、第2のベクターは、guttedベクターではない。なおさらなる局面において、上記第1のおよび第2のアデノウイルスベクターは、guttedベクターではない。いくつかの局面において、上記個体は、アデノウイルス5に対して既存の免疫を有する。
いくつかの局面において、上記第1のおよび第2のベクターの上記第1のおよび第2の標的抗原は、同じ感染性生物(infectious organism)に由来する。他の局面において、上記第1のおよび第2のベクターの上記第1のおよび第2の標的抗原は、異なる感染性生物に由来する。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原および上記インフルエンザB標的抗原は、異なる標的抗原である。
いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、インフルエンザウイルスAの標的抗原である。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原および上記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザウイルスAおよびインフルエンザウイルスBに共通する標的抗原である。
いくつかの局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域において欠失をさらに含む。さらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E4領域において欠失をさらに含む。なおさらなる局面において、上記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3およびE4領域において欠失をさらに含む。
いくつかの局面において、上記欠失は、塩基対を含む。さらなる局面において、上記欠失は、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、または少なくとも150の塩基対を含む。
なおさらなる局面において、上記欠失は、150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対を含む。
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザAおよびB標的抗原をコードする核酸配列を含む。
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザAおよびインフルエンザB標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、少なくとも1種のエレメント、少なくとも2種のエレメント、少なくとも3種のエレメント、少なくとも4種のエレメント、または少なくとも5種のエレメントを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む。他の局面において、上記エレメントは、構成的プロモーターを含む。いくつかの局面において、上記エレメントは、誘導性プロモーターを含む。他の局面において、上記エレメントは、転写エンハンサーを含む。さらなる局面において、上記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである。いくつかの局面において、上記エレメントは、パリンドローム配列を含まない。
いくつかの局面において、上記アデノウイルスベクターは、インフルエンザA標的抗原、インフルエンザB標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、Mを含み、上記インフルエンザB標的抗原は、BM2を含む。
他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原、上記インフルエンザB標的抗原、または両方は、ヘマグルチニンを含む。いくつかの局面において、上記ヘマグルチニンは、HA1ドメインを含む。いくつかの局面において、ここで上記ヘマグルチニンは、HA2ドメインを含む。他の局面において、ここで上記ヘマグルチニンは、ストークドメインを含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原、上記インフルエンザB標的抗原、または両方は、ノイラミニダーゼを含む。
他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原、上記インフルエンザB標的抗原、または両方は、核タンパク質(NP)を含む。さらに他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M1を含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2を含む。他の局面において、上記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2eを含む。いくつかの局面において、上記インフルエンザA標的抗原、上記インフルエンザB標的抗原、または両方は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、マトリクスタンパク質M2またはこれらの任意の組み合わせをコードする配列と少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、99.5%、または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、上記方法は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって5×1010 VP以下を投与するステップを包含する。他の実施形態において、上記方法は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって1×1012 VP以下を投与するステップを包含する。
本明細書で記載される方法および/または組成物との関連において考察される実施形態は、本明細書で記載される任意の他の方法または組成物に関して使用され得る。従って、1つの方法または組成物に関する実施形態は、他の方法および組成物にも同様に適用され得る。
他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および具体例は、特定の実施形態を示しながら、例証によって与えられるに過ぎないことは、理解されるべきである。なぜなら本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。
図1Aは、Ad5[E1−、E2b−]への挿入のために使用される、インフルエンザAのマトリクス1(M1)タンパク質、核タンパク質(NP)タンパク質、ヘマグルチニン(HA)、および各タンパク質遺伝子の間にGly−Ser−Glyリンカーを含む三重遺伝子挿入物を図示する。
図1Bは、それぞれ、ブタテッショウウイルス−1およびThosea asignaウイルスに由来する、単一の「自己切断」2Aペプチドによって離された2種の抗原遺伝子配列を含むAd5[E1−、E2b−]を図示する。
図8Aは、インフルエンザA HA抗体応答の定量を図示する。
図8Bは、インフルエンザB HA抗体応答の定量を図示する。
図9Aは、IFN−γ発現CD8+脾細胞のパーセンテージを図示する。
図9Bは、IFN−γ発現CD4+脾細胞のパーセンテージを図示する。
図10Aは、IFN−γ分泌脾細胞の定量を図示する。
図10Bは、IL−2分泌脾細胞の定量を図示する。
詳細な説明
以下の節では、より詳細に本発明の種々の局面を記載する。本発明の各局面は、そうでないと明確に示されなければ、本発明の任意の他の1つまたは複数の局面と組み合わせられ得る。特に、好ましいまたは有利であると記載される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の1つまたは複数の特徴(feature of features)と組み合わされ得る。
以下の節では、より詳細に本発明の種々の局面を記載する。本発明の各局面は、そうでないと明確に示されなければ、本発明の任意の他の1つまたは複数の局面と組み合わせられ得る。特に、好ましいまたは有利であると記載される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される任意の他の1つまたは複数の特徴(feature of features)と組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、冠詞「a(1つの、ある)」は、別段明示的に提供されなければ、1もしくはこれより多くを意味する。
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、「含む、含有する(contain)」、「含む、含有する(containing)」、「含む、包含する(include)」、「含む、包含する(includinig)」などのような用語は、「含む、包含する(comprising)」を意味する。
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、用語「または(or)」は、接続語または離接語であり得る。
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、別段示されなければ、本明細書中のいくつかの発明的実施形態は、数値範囲を企図する。種々の本発明の局面は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記載は、便宜のためおよび簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきではないことは、理解されるべきである。よって、範囲の記載は、あり得る部分範囲全てならびに明示的に書き記されているかのようなその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見做されるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、部分範囲(例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など)、ならびにその範囲内の個々の数値(例えば、1、2、3、4、5、および6)を具体的に開示していると見做されるべきである。これは、範囲の幅とは関係なく当てはまる。範囲が存在する場合、その範囲は、範囲の端点を含む。
用語「アデノウイルス」または「Ad」とは、アデノウイルス科のエンベロープのないDNAウイルスの群をいう。ヒト宿主に加えて、これらのウイルスは、トリ、ウシ、ブタおよびイヌの種において見出され得るが、これらに限定されない。アデノウイルス科の4つの属(例えば、アビアデノウイルス属、マストアデノウイルス属、アタデノウイルス属およびシアデノウイルス属)のうちのいずれかに由来する任意のアデノウイルスの使用が、E2b欠失ウイルスベクター、または本明細書で記載されるとおりの他の欠失を含むベクターの基礎として企図され得る。さらに、いくつかの血清型は、各種において見出される。Adはまた、これらのウイルス血清型のうちのいずれかの遺伝的派生物(genetic derivative)(遺伝的変異、同種または異種のDNA配列の欠失または転位が挙げられるが、これらに限定されない)に関する。
「ヘルパーアデノウイルス」または「ヘルパーウイルス」とは、特定の宿主細胞が供給できないウイルス機能を供給し得る(その宿主は、E1タンパク質のようなAd遺伝子生成物を提供し得る)Adをいう。このウイルスは、第2のウイルス、またはヘルパー依存性ウイルス(例えば、guttedウイルスまたはgutlessウイルス、またはE2bもしくは本明細書で記載されるとおりの他の領域などの特定の領域が欠失したウイルス)で欠いている機能(例えば、タンパク質)をトランスで供給するために使用される;その第1の複製能力のないウイルスは、その第2の、ヘルパー依存性ウイルスを「助ける」といわれ、それによって、細胞中でのその第2のウイルスゲノムの生成を可能にする。
用語「アデノウイルス5ヌル(Ad5null)」は、本明細書で使用される場合、発現のためのいかなる異種核酸配列をも含まない複製しないAdをいう。
用語「第1世代アデノウイルス」とは、本明細書で使用される場合、初期領域1(E1)が欠失したAdをいう。さらなる場合には、非必須初期領域3(E3)もまた、欠失され得る。
用語「gutted」または「gutless」とは、本明細書で使用される場合、全てのウイルスコード領域が欠失しているアデノウイルスベクターをいう。
用語「トランスフェクション」とは、本明細書で使用される場合、真核生物細胞へと外来核酸を導入することをいう。トランスフェクションは、当該分野で公知の種々の手段(リン酸カルシウム−DNA共沈殿、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティックが挙げられる)によって達成され得る。
用語「安定なトランスフェクション」または「安定してトランスフェクトされる」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来核酸、DNAまたはRNAの導入および組み込みをいう。用語「安定なトランスフェクタント」とは、ゲノムDNAへと安定して組み込まれた外来DNAを有する細胞に言及する。
用語「レポーター遺伝子とは、レポーター分子(酵素を含む)をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」とは、種々の検出システム(酵素ベースの検出アッセイ(例えば、ELISA、ならびに酵素ベースの組織化学アッセイ)、蛍光システム、放射活性システム、およびルミネッセントシステムが挙げられるが、これらに限定されない)のうちのいずれかにおいて検出可能である。
一実施形態において、E.coli β−ガラクトシダーゼ遺伝子(Pharmacia Biotech(Pistacataway, N.J.)から入手可能)、緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech(Palo Alto, Calif.)から市販されている)、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子または当該分野で公知の他のレポーター遺伝子が、使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「〜をコードする核酸分子(nucleic acid molecule encoding)」、「〜をコードするDNA配列」、および「〜をコードするDNA」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿った、デオキシリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。その核酸配列は、このようにして、アミノ酸配列をコードする。
用語「異種核酸配列」とは、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列であって、それが天然ではライゲートしていないか、またはそれが天然では異なる位置でライゲートしている核酸配列にライゲートしているか、またはライゲートする状態になるように操作されるヌクレオチド配列をいう。異種核酸は、それが導入される細胞の中に天然に見出されるヌクレオチド配列を含み得るか、またはその異種核酸は、天然に存在する配列に対して一部の改変を含み得る。
用語「導入遺伝子」とは、試験被験体の細胞またはゲノムに導入される、天然のもしくは異種の核酸配列または縮合された同種もしくは異種の核酸配列のいずれかの任意の遺伝子コード領域をいう。本発明において、導入遺伝子は、被験体の細胞に導入遺伝子を導入するために使用される任意のウイルスベクターで運ばれる。
用語「第2世代アデノウイルス」とは、本明細書で使用される場合、そのウイルスから、E1、E2、E3のDNA遺伝子配列の全てまたは一部、およびある種の実施形態では、E4のDNA遺伝子配列が欠失された(除去された)Adをいう。
用語「被験体」とは、本明細書で使用される場合、任意の動物、例えば、哺乳動物または有袋動物をいう。被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザルまたはマカクの他のタイプ)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび任意の種類の家禽が挙げられるが、これらに限定されない。
ある種の局面において、インフルエンザウイルスに対して広く反応性の免疫応答を生成するために複数回のワクチン接種を可能にするアデノウイルスベクターを使用して、種々のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を生成するワクチンを生成するための方法が提供され得る。
一局面は、個体においていくつかのインフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、アデノウイルスベクターであって、a)E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびb)複数のインフルエンザ標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを投与するステップ;ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与するステップ、を包含し;それによって、上記インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
別の局面は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する個体においていくつかのインフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し、上記方法は、上記個体に、アデノウイルスベクターであって、a)E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびb)複数のインフルエンザ標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを投与するステップ;ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与するステップを包含し;それによって、上記インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成する。
さらなる局面において、上記標的抗原は、インフルエンザAおよびBウイルスタンパク質に由来する抗原から構成される。この点において、上記インフルエンザタンパク質は、任意のインフルエンザAおよびBウイルスに由来し得る(H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、インフルエンザB/Yamagata、およびインフルエンザB/Victoriaが挙げられるが、これらに限定されない)。ある種の実施形態において、上記インフルエンザウイルスタンパク質は、任意のインフルエンザタンパク質であり得る(BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、およびマトリクスタンパク質M2が挙げられるが、これらに限定されない)。
ユニバーサルインフルエンザワクチンの開発の必要性および免疫応答の重要性
パンデミックインフルエンザ大発生は、世界的な公衆衛生に対する大きな脅威である。このような大発生は、ヒトがほとんどまたは全く免疫を持っていないウイルス株の突然の出現および爆発的な伝播の潜在性を示す。これらのウイルス株のうちの大部分は、入院を要する重度のまたは生命を脅かす病気を引き起こす。重度のインフルエンザを防止する最も効率的な方法は、感受性集団のワクチン接種である。従来のインフルエンザワクチンは、高度に可変性の表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)に対する抗体(Ab)を誘導することによって機能し、そして大部分は、ウイルス感染性を低減しそして感染個体において拡がることによって作用する。このタイプのワクチンは現在、潜在的なパンデミック株が一旦同定された後に、調製して流通させるのに少なくとも6〜12ヶ月かかってしまい、これは非常に長すぎる。これは、2010年4月に新たに出現したウイルスが同定されたが、大規模免疫のために十分なワクチンが10月まで入手できなかった2009年のH1N1パンデミックによって強調された。同時に、そのウイルスの拡がりおよびワクチンの必要性は明らかであった。このことは、特に、インフルエンザに対する細胞性および体液性両方の免疫応答の防御効果を誘導するワクチンを必要とする高リスク集団における使用のために、迅速に生産することができるインフルエンザワクチンの必要性を示す。
パンデミックインフルエンザ大発生は、世界的な公衆衛生に対する大きな脅威である。このような大発生は、ヒトがほとんどまたは全く免疫を持っていないウイルス株の突然の出現および爆発的な伝播の潜在性を示す。これらのウイルス株のうちの大部分は、入院を要する重度のまたは生命を脅かす病気を引き起こす。重度のインフルエンザを防止する最も効率的な方法は、感受性集団のワクチン接種である。従来のインフルエンザワクチンは、高度に可変性の表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)に対する抗体(Ab)を誘導することによって機能し、そして大部分は、ウイルス感染性を低減しそして感染個体において拡がることによって作用する。このタイプのワクチンは現在、潜在的なパンデミック株が一旦同定された後に、調製して流通させるのに少なくとも6〜12ヶ月かかってしまい、これは非常に長すぎる。これは、2010年4月に新たに出現したウイルスが同定されたが、大規模免疫のために十分なワクチンが10月まで入手できなかった2009年のH1N1パンデミックによって強調された。同時に、そのウイルスの拡がりおよびワクチンの必要性は明らかであった。このことは、特に、インフルエンザに対する細胞性および体液性両方の免疫応答の防御効果を誘導するワクチンを必要とする高リスク集団における使用のために、迅速に生産することができるインフルエンザワクチンの必要性を示す。
インフルエンザ抗原
ある種の実施形態において、インフルエンザ抗原(例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、およびマトリクス構成成分)は、例えば、ワクチン組成物またはアデノウイルスベクターを含む組成物において使用され得る。
ある種の実施形態において、インフルエンザ抗原(例えば、ヘマグルチニン、核タンパク質、およびマトリクス構成成分)は、例えば、ワクチン組成物またはアデノウイルスベクターを含む組成物において使用され得る。
例えば、ヘマグルチニン抗原が使用され得る。天然のインフルエンザ感染に対する防御の主要な相関物は、血清および粘膜におけるHAに特異的なAbのレベルである。季節性インフルエンザワクチンは、血球凝集阻害(HAI)アッセイによって測定される場合にHAに対する体液性応答の誘導に基づいて承認される。そのHA抗原は、インフルエンザ亜型と交叉反応するステム領域において保存された抗原エピトープを含むようである(Nabel GJ Trans Am Clin Climatol Assoc. 2012;123:9−15)。
M2タンパク質および核タンパク質(NP)はまた、ある種の局面において使用され得る。研究からは、インフルエンザM2タンパク質および核タンパク質(NP)がまた、実験的ワクチン(Ad5ベクターを使用するものを含む)において使用される場合に広い範囲のインフルエンザ亜型非依存性防御を提供する保存された領域を含むことが示されている(Epstein SLら Vaccine. 2005 23:5404−10; Tompkins SMら Emerg Infect Dis. 2007 13:426−35; Price GEら PLoS One. 2010 5(10):e13162; Osterhaus A Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011 366(1579):2766−73)。
ワクチン接種ストラテジーは、免疫応答を誘導するために抗原としてNPを使用してきた。なぜならNPは、インフルエンザウイルス亜型にわたって十分に保存されているからである(Altstein ADら Arch Virol. 2006 151:921−31; Saha Sら Virology. 2006 354:48−57; Goodman AGら PloS One. 2011 6(10):e25938)。
さらに、M2タンパク質内の高度に保存された膜外部ドメイン(M2e)は、インフルエンザAワクチン開発の魅力的な標的として研究されてきた(Tompkins SMら Emerg Infect Dis. 2007 13:426−35; Neirynck Sら Nat Med. 1999 5:1157−63; Roose Kら Drug News Perspect. 2009 22:80−92; Turley CBら Vaccine. 2011 29:5145−52)。M2eへの体液性応答は、Ab依存性細胞媒介性細胞傷害性を潜在的に伴うおよび/または補体カスケードを誘発する機構(複数可)によって、インフルエンザ感染を阻害し得、細胞溶解を生じ得る(El Bakkouri Kら J Immunol. 2011 186:1022−31)。1つの研究グループ(Zhou Dら Mol Ther. 2010 18:2182−9)は、タンデムで、H1N1 NPに融合したインフルエンザAウイルスの多様な株(H1N1、H5N1、およびH7N2)に由来する3種のM2e配列を発現するE1欠失アデノウイルス(Ad)ベクターをチンパンジー血清型C68(AdC68)またはC6(AdC6)から生成した。M2eおよびNPを発現するそのAdワクチンは、マウスにおいてロバストなNP特異的CD8+ T細胞応答および3種のM2e配列に対する中程度の抗体応答を誘起した。興味深いことに、ワクチン接種した若いマウスは、高用量の、種々のインフルエンザウイルスによるチャレンジ後の死ぬべき運命(mortality)に対して防御される。インフルエンザBウイルスは、ゆっくりと変異し、そのBM2タンパク質は、幅広いワクチン(broad−based vaccine)の理想的な候補である、インフルエンザ株B型の中で高度に保存された領域を含む(Hiebert SW., Williams MA, Lamb RA Virology. 1986 155:747−51)。保存されたインフルエンザ構成成分(例えば、BM2、M2、NP、および異種インフルエンザウイルスに対する防御を生じるコンセンサスHA)に対して体液性およびCMI両方の応答を誘導する能力は、広く反応性のインフルエンザワクチンの開発において素晴らしい潜在性を保持する。
新しいユニバーサルインフルエンザワクチンの開発において、全てのこれらの上記の局面は、インフルエンザA型およびB型の高度に保存されかつ交叉反応性の抗原を利用して、複数株交叉反応性インフルエンザワクチンを開発する際に利用される。
アデノウイルスベクター
ある種の局面において、アデノウイルスベクターは、インフルエンザ抗原の送達のための組成物および方法において使用され得る。
ある種の局面において、アデノウイルスベクターは、インフルエンザ抗原の送達のための組成物および方法において使用され得る。
ウイルスDNAポリメラーゼ(pol)および/またはプレターミナルタンパク質(pTP)遺伝子を除去する初期遺伝子2b(E2b)領域においてさらなる欠失を有する組換えAd5[E1−、E2b−]ベクターワクチンプラットフォームは新しく、E.C7ヒト細胞株において増殖される(Amalfitano A, Begy CR, Chamberlain JS Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93:3352−6; Amalfitano A, Chamberlain JS Gene Ther. 1997 4:258−63; Amalfitano Aら J Virol. 1998 72:926−33; Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521−31)。そのベクターは、現在のAd5[E1−]ベクターの7kb能力(capacity)(これは、複数の遺伝子の包含を可能にするために十分である)と比較して、最大12kbの拡大された遺伝子運搬/クローニング能力を有する(Amalfitano Aら J Virol. 1998 72:926−33; Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521−31)。E2b領域のさらなる欠失は、Ad5ウイルスタンパク質への免疫応答を最小限にしながら特異的抗原に対する強力な免疫応答を誘起するなどの有益なアデノウイルス免疫特性を付与する。
重要なことには、がんおよび感染性疾患における前臨床および臨床研究は、Ad5[E1−、E2b−]ベースのベクターが、Ad5免疫の存在下ですら、ベクター化した抗原(vectored antigen)に対して強力なCMI応答およびAb応答を誘導することを示す(Osada Tら Cancer Gene Ther. 2009 16:673−82; Gabitzsch ESら Vaccine. 2009 27:6394−8; Gabitzsch ESら Immunol Lett. 2009 122:44−51; Gabitzsch ESら Cancer Immunol Immunother. 2010 59:1131−5; Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35; Gabitzsch ESら Vaccine 2011 29:8101−7; Jones FRら Vaccine 2011 29:7020−6; Gabitzsch ES, Jones FR J Clin Cell Immunol. 2011 S4:001. doi:10.4172/2155−9899. S4−001; Gabitzsch ESら Vaccine 2012 30:7265−70; Wieking BGら Cancer Gene Ther. 2012 19:667−74; Morse MAら Cancer Immunol Immunother. 2013 62:1293−1301; Balintら Cancer Immunol Immunother. 2015 64:977−87; Rice AEら Cancer Gene Ther. 2015 22:454−62; Gabitzsch ESら Oncotarget 2015 Sept 7 印刷前に電子出版した(epub ahead of print))。
進歩した組換えアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクタープラットフォームは、インフルエンザのための新規な広く交叉反応性のワクチンを開発する機会を与える。このベクターは、強力な免疫応答を誘導する抗原提示細胞(APC)への規定されたインフルエンザ抗原の曝露のために、皮下注射によって直接送達され得る。重要なことには、そのAd5組換えベクターは、エピソームで複製し、宿主細胞ゲノムへとゲノムを挿入せず、それによって、遺伝子組み込みおよび不可欠な細胞遺伝子機能の破壊が存在しないことを確実にする(Imler JL Vaccine. 1995 13:1143−51; Ertl HC, Xiang Z J Immunol. 1996 156:3579−82; Amalfitano, A Curr Opin Mol Ther. 2003 5:362−6)。
不運なことに、現在のAd5ベースのベクターが直面している大きな難題は、Ad5に対する既存の免疫の存在である。大部分の人々は、Ad5(ヒトワクチンに関して最も広く使用される亜型)に対する中和Abを示し、人々の2/3は、Ad5に対するリンパ増殖性応答を有すると調査された(Chirmule Nら Gene Ther. 1999 6:1574−83)。この免疫は、インフルエンザワクチンのプラットフォームとしての現在の初期遺伝子1(E1)領域欠失Ad5ベクター(Ad5[E1−])の使用を妨げる。Ad5免疫は、免疫すること、特に、組換えAd5ベクターでの再免疫を阻害し、第2の疾患抗原に対するワクチンの免疫も同様に排除する。既存のAd5ベクター免疫の問題を克服することは、熱心な調査の主題であった。しかし、他のAd血清型またはさらには非ヒト形態のAdの使用は、重要なケモカインおよびサイトカインの産生の変化、遺伝子調節不全を直接もたらし得、有意に異なる生体分布および組織毒性を有する(Appledorn DMら Gene Ther. 2008 15:885−901; Hartman ZCら Virus Res. 2008 132:1−14)。これらのアプローチが初回免疫において成功したとしても、そのAd亜型に対する免疫応答が誘導されたことに起因して、その後のワクチン接種は問題になる。Ad免疫バリアを回避し、現在のAd5[E1−]ベクターの有害な状態を回避することを助けるために、改善されたAd5ベクタープラットフォームが、上記のように構築された。
さらに、Ad5[E1−、E2b−]ベクターは、現在のAd5[E1−]ベクターと比較して、注射後最初の24〜72時間の間に炎症の低下を示す(Nazir SA, Metcalf JP J Investig Med. 2005 53:292−304; Schaack J Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 101:3124−9; Schaack J Viral Immunol. 2005 18:79−88)。Ad5[E1−、E2b−]後期遺伝子発現の欠如は、感染細胞を抗Ad5活性に対してあまり脆弱にせず、その感染細胞が長期間にわたって導入遺伝子を生成および発現することを可能にする(Gabitzsch ES, Jones FR J Clin Cell Immunol. 2011 S4:001. doi:10.4172/2155−9899. S4−001; Hodges BL J Gene Med. 2000 2:250−9)。Ad5[E1−、E2b−]ウイルスタンパク質に対する炎症応答の低下および得られた、既存のAd5免疫の回避は、Ad5[E1−、E2b−]がAPC細胞に感染する能力を増大させ得、被接種者(inoculee)においてより高い免疫を生じ得る。さらに、他の細胞型の感染の増加は、強力なCD4+およびCD8+ T細胞応答のために必要とされる高レベルの抗原提示を提供し得、記憶T細胞発生をもたらす。従って、E2b領域の欠失は、既存のAd5免疫の存在下ですら、Ad5タンパク質に対する免疫応答を最小限にしながら有利な免疫特性(例えば、特異的抗原への強力な免疫応答を誘起する)を付与することは明らかである。
がん(結腸直腸、乳房、およびHPV)(Osada Tら Cancer Gene Ther. 2009 16:673−82; Gabitzsch ESら Cancer Immunol Immunother. 2010 59:1131−5; Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35; Wieking BGら Cancer Gene Ther. 2012 19:667−74; Rice AEら Cancer Gene Ther. 2015 22:454−62; Gabitzsch ESら Oncotarget 2015 Sept 7 epub ahead of print)および感染性疾患(HIV、SIV、およびH1N1インフルエンザ)(Gabitzsch ESら Vaccine. 2009 27:6394−8; Gabitzsch ESら Vaccine 2011 29:8101−7; Jones FRら Vaccine 2011 29:7020−6; Gabitzsch ESら Vaccine 2012 30:7265−70)の動物モデルにおいて、強力な免疫応答が、Ad5超免疫の存在下ですら発現された抗原遺伝子に対して誘導されることが報告された。進行ステージの結腸直腸がん患者における免疫療法のための新しいAd5[E1−、E2b−]−CEA(癌胎児性抗原)プラットフォームワクチンでの研究は、特に関連性がある。CEA指向性CMI応答は、既存のAd5免疫にも関わらず誘導された;処置は、十分に寛容され、安全に投与され、重大な有害作用は観察されなかった(Morse MAら Cancer Immunol Immunother. 2013 62:1293−1301; Balintら Cancer Immunol Immunother. 2015 64:977−87)。
結果は、組換えAd5[E1−、E2b−]プラットフォームベースのワクチンが既存の免疫および/またはAd5ベクター誘導性の免疫を克服しかつ有意な防御免疫応答を誘導する能力を示した。これらの研究は、新しいAd5[E1−、E2b−]ベクターベースのワクチンが、1)現在のAd5[E1−]ベクターと比較して、有意により高いCMI応答を誘導し得る、2)強力なCMI応答を誘導するように設計された複数回免疫レジメンのために利用され得る、3)既存のAd5免疫を有する動物において有意な抗原特異的CMI応答を誘導し得る、および4)高レベルの既存のAd5免疫を有する動物において、有意な抗腫瘍応答を誘導し得るかまたは感染性疾患から防御し得る、ことを確立した。
ある種の実施形態において、新しいAd5[E1−、E2b−]組換えプラットフォームの革新的属性は、広く交叉反応性のインフルエンザワクチンを開発するために使用され得る。これは、組換えAd5[E1−、E2b−]プラットフォームの中に、インフルエンザAおよびB株のHA、BM2、M2およびNPタンパク質に由来する保存されかつ交叉反応性の抗原を発現する複数の導入遺伝子を組み込むことによって達成され得、そして新しいユニバーサルインフルエンザワクチンとして利用されるべきである。
ある種の局面は、インフルエンザ標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法およびアデノウイルスベクターに関する。特に、ある種の局面は、1より多くの抗原性標的実体に対する複数回のワクチン接種が達成され得るように、改善されたAdベースのワクチンを提供し得る。重要なことには、ワクチン接種は、Adに対する既存の免疫の存在下で行われ得、そして/または本明細書で記載されるとおりのアデノウイルスベクターまたは他のアデノウイルスベクターで以前に複数回免疫した被験体に投与され得る。上記アデノウイルスベクターは、種々のインフルエンザAおよびB抗原に対する免疫応答(インフルエンザAおよびBウイルスに対する幅広い抗体および細胞媒介性免疫応答の生成が挙げられるが、これらに限定されない)を誘導するために被験体に複数回投与され得る。
ある種の局面は、E2b欠失アデノウイルスベクター(例えば、米国特許第6,063,622号;同第6,451,596号;同第6,057,158号:および同第6,083,750号(全てそれらの全体において本明細書に参考として援用される)に記載されるもの)の使用を提供する。’622特許に記載されるように、ウイルスタンパク質発現をさらに失わせるために、および同様に複製能力のあるAd(RCA)を生成する頻度を減少させるために、E2b領域における欠失を含むアデノウイルスベクターは、ある種の局面において提供され得る。これらE2b欠失アデノウイルスベクターの増殖は、その欠失されたE2b遺伝子生成物を発現する細胞株を要する。
さらなる局面において、パッケージング細胞株;例えば、HEK−203細胞株に由来するE.C7(以前はC−7と称されていた)(Amalfitano Aら Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:3352−56; Amalfitano Aら Gene Ther 1997 4:258−63)が提供され得る。
さらに、E2b遺伝子生成物、DNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質は、E.C7または類似の細胞において、E1遺伝子生成物とともに構成的に発現され得る。Adゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移入は、直接的な利益を有する:(1)理論的に欠失され得るDNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質の組み合わされたコード配列が、4.6kbにほぼ等しいので、組換えDNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質が欠失したアデノウイルスベクターの運搬能力(carrying capacity)が増大する;ならびに(2)2またはこれより多くの非依存性組換え事象がRCAを生成するために必要とされるので、RCA生成の潜在性が減少する。
従って、E1、Ad DNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質を発現する細胞株は、ヘルパーウイルス混入の必要なしに、13kbにほぼ等しい運搬能力を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にし得る(Mitaniら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995 92:3854; Hodgesら J Gene Med 2000 2:250−259; Amalfitano and Parks Curr Gene Ther 2002 2:111−133)。
さらに、ウイルスの生活環に極めて重要な遺伝子が欠失される場合(例えば、E2b遺伝子)、Adが他のウイルス遺伝子タンパク質を複製または発現することをさらに失うことが起こる。これは、ウイルス感染細胞の免疫認識を低下させ、外来導入遺伝子発現の長期の持続を可能にする。
しかし、E1、DNAポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質が欠失したベクターの重要な属性としては、そのベクターがE1およびE2b領域からそれぞれのタンパク質を発現できないこと、ならびにウイルス構造タンパク質のうちの大部分の発現を欠くと推定されることが挙げられる。例えば、Adの主要後期プロモーター(MLP)は、L1からL5までの後期構造タンパク質の転写を担う(Doerfler, In Adenovirus DNA, The Viral Genome and Its Expression (Martinus Nijhoff Publishing Boston, 1986)。そのMLPは、Adゲノム複製の前に最小限に活性であるが、高度に毒性のAd後期遺伝子は、主に、ウイルスゲノム複製が起こった後にのみ、MLPから転写および翻訳される(Thomas and Mathews Cell 1980 22:523)。後期遺伝子転写のこのシス依存性活性化は、一般に、ポリオーマおよびSV−40の増殖におけるようなDNAウイルスの特徴である。上記DNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質は、Ad複製に絶対的に必要とされ(E4またはタンパク質IXタンパク質とは異なる)、従って、それらの欠失は、アデノウイルスベクター後期遺伝子発現およびAPCなどの細胞でのその発現の毒性作用にとって極めて有害である。
ある種の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域およびE1領域において欠失を有するが、Adゲノムのいかなる他の領域は欠失していない、E2b欠失アデノウイルスベクターを含む。別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失をならびにE1およびE3領域において欠失を有するが、他の領域は欠失していない、E2b欠失アデノウイルスベクターを含み得る。さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を、ならびにE1、E3において欠失をおよびE4領域の部分的または完全な除去を有するが、他の欠失は有しない、アデノウイルスベクターを含み得る。
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を、ならびにE1およびE4領域において欠失を有するが、他の欠失は有しない、アデノウイルスベクターを含む。さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2a、E2bおよびE4領域において欠失を有するが、他の欠失を有しない、アデノウイルスベクターを含み得る。
一実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、E1領域およびE2b領域のDNAポリメラーゼ機能が欠失しているが、他の欠失を有しないベクターを含む。さらなる実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、E1領域およびE2b領域のプレターミナルタンパク質機能が欠失し、他は欠失していない。
別の実施形態において、本明細書での使用のためのアデノウイルスベクターは、E1、DNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質機能が欠失し、そして他は欠失していない。1つの特定の実施形態において、本明細書での使用が企図されるアデノウイルスベクターは、E2b領域の少なくとも一部、およびE1領域が欠失しているが、「gutted」アデノウイルスベクターではない。この点において、そのベクターは、E2b領域のDNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質機能の両方が欠失され得る。
用語「E2b欠失(E2b deleted)」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも1つのE2b遺伝子生成物の発現および/または機能を妨げるような方法で変異される特異的DNA配列に言及する。従って、ある種の実施形態において、「E2b欠失」とは、Adゲノムから欠失(除去)された特異的DNA配列に言及する。E2b欠失または「E2b領域内で欠失を含む」とは、AdゲノムのE2b領域内で少なくとも1つの塩基対の欠失に言及する。従って、ある種の実施形態において、1より多くの塩基対が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、または150の塩基対が欠失される。別の実施形態において、その欠失は、AdゲノムのE2b領域内で150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対の欠失である。E2b欠失は、少なくとも1つのE2b遺伝子生成物の発現および/または機能を妨げる欠失であり得、従って、E2b特異的タンパク質の一部をコードするエキソン内で欠失を、ならびにプロモーターおよびリーダー配列内で欠失を含む。ある種の実施形態において、E2b欠失は、E2b領域のDNAポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質のうちの一方または両方の発現および/または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態において、「E2b欠失」とは1またはこれより多くのコードされるタンパク質が非機能的であるように、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1もしくはこれより多くの点変異に言及する。このような変異は、異なる残基で置き換えられた残基を含み、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列の変化をもたらす。
本開示を読んで当業者によって理解されるように、Adゲノムの他の領域が欠失され得る。従って、Adゲノムの特定の領域で「欠失される(deleted)」とは、本明細書で使用される場合、その領域によってコードされる少なくとも1つの遺伝子生成物の発現および/または機能を妨げるような方法で変異される特異的DNA配列に言及する。ある種の実施形態において、特定の領域で「欠失される」とは、その領域によってコードされる発現および/または機能(例えば、DNAポリメラーゼまたはプレターミナルタンパク質機能というE2b機能)を妨げるような方法でAdゲノムから欠失(除去)される特異的DNA配列に言及する。特定の領域内で「欠失される」または「欠失を含む」とは、Adゲノムのその領域内での少なくとも1つの塩基対の欠失に言及する。従って、ある種の実施形態において、1より多くの塩基対が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、または150の塩基対が、特定の領域から欠失される。別の実施形態において、その欠失は、Adゲノムの特定の領域内での150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対である。
これらの欠失は、その領域によってコードされる遺伝子生成物の発現および/または機能が妨げられ得るようなものである。従って、欠失は、タンパク質の一部をコードするエキソン内での欠失、ならびにプロモーターおよびリーダー配列内での欠失を包含する。さらなる実施形態において、Adゲノムの特定の領域において「欠失される」とは、1またはこれより多くのコードされるタンパク質が非機能的であるように、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1またはこれより多くの点変異に言及する。このような変異は、異なる残基で置き換えられた残基を含み、非機能的タンパク質を生じるアミノ酸配列の変化をもたらす。
1またはこれより多くの欠失を含むアデノウイルスベクターは、当該分野で公知の組み換え技術を使用して生成され得る(例えば、Amalfitanoら J. Virol. 1998 72:926−33; Hodges,ら, J Gene Med 2000 2:250−59を参照のこと)。当業者によって認識されるように、使用のためのアデノウイルスベクターは、E2b遺伝子生成物および欠失されている可能性のある必須遺伝子のうちのいずれかの生成物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して高力価へと成功裡に成長され得る。ある種の実施形態において、E1およびDNAポリメラーゼタンパク質を構成的に発現するのみならず、Ad−プレターミナルタンパク質をも発現するHEK−293に由来する細胞が、使用され得る。一実施形態において、E.C7細胞は、アデノウイルスベクターの高力価ストックを成功裡に成長させるために使用される(例えば、Amalfitanoら J. Virol. 1998 72:926−33; Hodgesら J Gene Med 2000 2:250−59を参照のこと)。
自己増殖アデノウイルスベクターから極めて重要な遺伝子を欠失させるために、標的とされる遺伝子によってコードされるタンパク質は、E1タンパク質とともに、HEK−293細胞または類似の細胞でまず共発現されなければならない。従って、構成的に共発現される場合に非毒性であるそれらタンパク質のみ(または誘導して発現される毒性タンパク質)が、利用され得る。E1およびE4遺伝子のHEK−293細胞における共発現は、(誘導性(構成的ではない)プロモーターを利用して)示されてきた(Yehら J. Virol. 1996 70:559; Wangら Gene Therapy 1995 2:775;およびGorzigliaら J. Virol. 1996 70:4173)。E1およびタンパク質IX遺伝子(ビリオン構造タンパク質)は、共発現され(Caravokyri and Leppard J. Virol. 1995 69:6627)、E1、E4、およびタンパク質IX遺伝子の共発現がまた、記載されている(Krougliak and Graham Hum. Gene Ther. 1995 6:1575)。E1および100k遺伝子は、E1およびプロテアーゼ遺伝子を有するので、トランス補完する(transcomplementing)細胞株において成功裡に発現されている(Oualikeneら Hum Gene Ther 2000 11 :1341−53; Hodgesら J. Virol 2001 75:5913−20)。
高力価のE2b欠失Ad粒子を成長させることにおいて使用するためのE1およびE2b遺伝子生成物を共発現する細胞株は、米国特許第6,063,622号に記載される。E2b領域は、Adゲノム複製に絶対的に必要とされるウイルス複製タンパク質をコードする(Doerfler(前出)およびPronkら Chromosoma 1992 102:S39−S45)。有用な細胞株は、およそ140kDaのAd−DNAポリメラーゼおよび/またはおよそ90kDaのプレターミナルタンパク質を構成的に発現する。特に、毒性なしに、E1、DNAポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質の高レベルの構成的共発現を有する細胞株(例えば、E.C7)は、複数回のワクチン接種における使用のためのAdを増殖させることにおける使用に望ましい。これらの細胞株は、E1、DNAポリメラーゼ、およびプレターミナルタンパク質が欠失されたアデノウイルスベクターの増殖を可能にする。
組換えAdは、当該分野で公知の技術を使用して増殖され得る。例えば、ある種の実施形態において、E.C7細胞を含む組織培養プレートは、適切なMOI(例えば、5)のアデノウイルスベクターウイルスストックで感染され、37.0℃において40〜96時間インキュベートされる。その感染した細胞が採取され、10mM Tris−CI(pH8.0)中に再懸濁され、超音波処理され、そのウイルスは、2回の塩化セシウム密度遠心分離によって精製される。ある種の技術において、そのウイルス含有バンドは、Sephadex CL−6Bカラム(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を通して脱塩され、スクロースまたはグリセロールが添加され、アリコートが−80℃で貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのウイルスは、その安定性を増強するようにデザインされた溶液(例えば、A195(Evansら J Pharm Sci 2004 93:2458−75))中に入れられる。そのストックの力価が測定される(例えば、SDS溶解後のウイルスのアリコートの260nmでの光学密度の測定によって)。別の実施形態において、組換えE2b欠失アデノウイルスベクター全体を含むプラスミドDNA(線状または環状のいずれか)は、E.C7または類似の細胞へとトランスフェクトされ得、ウイルス生成の証拠(例えば、細胞変性効果)が示されるまで37.0℃でインキュベートされ得る。これら細胞からの馴化培地は、次いで、より多くのE.C7または類似の細胞を感染させて、精製前に、生成されるウイルスの量を拡大するために使用され得る。
精製は、2回の塩化セシウム密度遠心分離または選択的濾過によって達成され得る。ある種の実施形態において、そのウイルスは、市販の製品(例えば、Puresyn, Inc.(Malvem, PA)のAdenopure)または特注で作ったクロマトグラフィーカラムを使用する、カラムクロマトグラフィーによって精製され得る。
ある種の実施形態において、組換えAdは、感染させるべき細胞が、ある数のウイルスと直面することを確実にするために十分なウイルスを含み得る。従って、組換えAdのストック、特に、組換えAdのRCA非含有ストックが提供され得る。Adストックの調製および分析は、当該分野で周知である。ウイルスストックは、ウイルス遺伝子型ならびにウイルスストックを調製するために使用されるプロトコルおよび細胞株に大きく依存して、力価がかなり変動する。そのウイルスストックは、少なくとも約106pfu/ml、107pfu/ml、または10δpfu/mlの力価を有し得、多くのそのようなストックは、高力価を有し得る(例えば、少なくとも約109pfu/ml、1010pfu/ml、1011pfu/ml、または1012pfu/ml)。
異種核酸
アデノウイルスベクターはまた、目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物をコードする異種核酸配列を含み、該目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物に対して免疫応答を生成することが望ましい。いくつかの実施形態において、そのアデノウイルスベクターは、免疫応答を調節し得るいくつかのタンパク質、その融合物もしくはそのフラグメントをコードする異種核酸配列を含む。従って、ある種の局面は、異種核酸配列を含む第2世代のE2b欠失アデノウイルスベクターを提供する。
アデノウイルスベクターはまた、目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物をコードする異種核酸配列を含み、該目的のいくつかの標的抗原、そのフラグメントもしくは融合物に対して免疫応答を生成することが望ましい。いくつかの実施形態において、そのアデノウイルスベクターは、免疫応答を調節し得るいくつかのタンパク質、その融合物もしくはそのフラグメントをコードする異種核酸配列を含む。従って、ある種の局面は、異種核酸配列を含む第2世代のE2b欠失アデノウイルスベクターを提供する。
よって、ある種の局面は、核酸配列(本明細書において、目的のいくつかのインフルエンザ標的抗原をコードするポリヌクレオチドともいわれる)を提供する。よって、ある種の局面は、本明細書でさらに記載されるとおりの任意の供給源に由来する標的抗原をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むベクターならびにこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で本質的に交換可能に使用される。また、当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、1本鎖(コードまたはアンチセンス)または2本鎖であり得、DNA(ゲノム、cDNAまたは合成)分子またはRNA分子であり得る。RNA分子は、HnRNA分子(これは、イントロンを含み、1対1の様式でDNA分子に相当する)およびmRNA分子(これは、イントロンを含まない)を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、ポリヌクレオチド内に存在し得るが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持物質に連結され得るが、その必要はない。単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離されたDNA分子は、本明細書で使用される場合、関連しないコードDNA(例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域)の大きな部分を含まない。当然のことながら、これは、元々単離されているとおりのDNA分子に言及し、実験室において組換えでセグメントに後に付加される遺伝子またはコード領域を排除しない。
当業者によって理解されるように、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外のおよびプラスミドにコードされる配列、ならびに本明細書で記載されるとおりの標的抗原、抗原のフラグメント、ペプチドなどを発現するか、または発現するように適合され得るより小さな工学技術で作製された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、天然に単離されてもよいし、または人の手による合成で改変されてもよい。
ポリヌクレオチドは、天然の配列(すなわち、標的抗原ポリペプチド/タンパク質/エピトープまたはその一部をコードする内因性の配列)を含み得るか、またはこのような配列のバリアントまたは誘導体をコードする配列を含み得る。ある種の実施形態において、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載されるとおりの標的抗原タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド配列またはバリアントから実質的に変化し得るが、類似のタンパク質抗原をコードし得る特定の細胞型(すなわち、ヒト細胞株)における発現のために最適化された新規な遺伝子配列を表す。
他の関連する実施形態において、本明細書で記載されるとおりのタンパク質(例えば、目的の標的抗原)をコードする天然の配列と実質的同一性を有するポリヌクレオチドバリアント、例えば、本明細書で記載される方法(例えば、以下で記載されるように、標準的パラメーターを使用するBLAST分析)を使用して、ポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも70%配列同一性、特に、少なくとも75%から99%までまたはそれより高い配列同一性を含むもの、が提供され得る。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置付けなどを考慮に入れることによって、2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の相当する同一性を決定するために適切に調節され得ることを認識する。
ある種の局面において、ポリヌクレオチドバリアントは、特に、そのバリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性または異種標的タンパク質の免疫原性が、天然のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されないように、1またはこれより多くの置換、付加、欠失および/または挿入を含む。本明細書中の他の箇所で記載されるように、そのポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアント、またはそのフラグメント(例えば、エピトープ)をコードし得、ここで抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応するそのバリアントポリペプチドまたはそのフラグメント(例えば、エピトープ)の性質(propensity)は、天然のポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「バリアント」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することは理解されるべきである。
ある種の局面は、本明細書で記載されるとおりのポリペプチド(標的タンパク質抗原を含む)をコードする、少なくとも約5から1000まで、またはそれより多くの連続ヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さのものを含むかあるいはそれからなるポリヌクレオチドを提供し得る。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ(例えば、16、17、18、19など;21、22、23など;30、31、32など;50、51、52、53など;100、101、102、103など;150、151、152、153など;200から500まで;500から1,000までなどのすべての整数を含む)を意味することは、容易に理解される。本明細書で記載されるとおりのポリヌクレオチド配列は、本明細書で記載されるとおりのポリペプチド(例えば、エピトープまたは異種標的タンパク質)をコードする天然の配列において見出されないさらなるヌクレオチドによって、一方の末端または両方の末端において伸長され得る。このさらなる配列は、その開示されるいずれかの末端において、またはその開示される配列の両方の末端において、1から20までのヌクレオチドまたはそれより多くからなり得る。
ある種の実施形態において、上記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、それらの全体的な長さがかなり変動し得るように、他のDNA配列(例えば、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど)と組み合わされ得る。従って、ほぼ任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが企図されるが、全体の長さは、意図された組換えDNAプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限され得る。例えば、全体の長さが約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、約500、約200、約100、約50塩基対の長さなど(全ての中間の長さを含む)である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、多くの実施において有用であることが企図される。
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、2つの配列は、以下で記載されるように、最大の一致のために整列される場合にその2つの配列中のヌクレオチドの配列が同じであれば、「同一」であるといわれる。2つの配列の間の比較は、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われ得る。「比較ウインドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約20の連続する位置、通常は30〜約75、40〜約50のセグメントをいい、ここで配列は、その2つの配列が最適に整列された後に連続する位置の同じ数の参照配列に対して比較され得る。
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェア(DNASTAR, Inc., Madison, WI)のLasergeneスイートの中のMegalignプログラムを使用して、デフォルトパラメーターを使用して行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを具現化する:Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins − Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff MO (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345− 358; Hein J Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626−645 (1990); Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins DG and Sharp PM CABIOS 1989 5:151−53; Myers EW and Muller W CABIOS 1988 4:11−17; Robinson ED Comb. Theor 1971 11A 05; Saitou N, Nei M Mol. Biol. Evol. 1987 4:406−25; Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy − the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur WJ and Lipman DJ Proc. Natl. Acad., Sci. USA 1983 80:726−30)。
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman, Add. APL. Math 1981 2:482の局所的同一性アルゴリズム(local identity algorithm)によって、Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 1970 48:443の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)(575 Science Dr., Madison, WI)のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA)によって、または目視によって、行われ得る。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの一例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschulら, Nucl. Acids Res. 1977 25:3389−3402、およびAltschulら J. MoI. Biol. 1990 215:403−10に記載される。BLASTおよびBLAST 2.0は、ポリヌクレオチドに関するパーセント配列同一性を決定するために、例えば、本明細書で記載されるパラメーターとともに使用され得る。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。1つの例証的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターM(マッチする残基の対の報酬スコア;常に>0)およびN(ミスマッチの残基のペナルティースコア;常に<0)を使用して計算され得る。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大の達成される値から量Xだけ低下するか;1またはこれより大きな負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアがゼロまたはそれより小さくなるか;あるいはいずれかの配列の末端に達する場合に、停止される。BLASTアルゴリズムパラメーター、W、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列に関する)は、デフォルトとして、ワード長(W)11、および期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 89:10915を参照のこと)アラインメント、(B)50、期待値(E)10、M=5、N=−4および両方の差の比較を使用する。
ある種の局面において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも20の位置の比較ウインドウにわたって2つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここでその比較ウインドウの中のポリヌクレオチド配列の部分は、その2つの配列の最適なアラインメントのための参照配列(これは付加も欠失も含まない)と比較して、20パーセントまたはこれより小さい(通常は、5〜15パーセント、または10〜12パーセント)の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。そのパーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、そのマッチした位置の数を、参照配列における位置の総数(すなわち、ウインドウサイズ)で除算し、その結果に100をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書で記載されるとおりの目的の特異的抗原またはそのフラグメントをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかが、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。にもかかわらず、コドン使用法における差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、ある種の局面において具体的に企図される。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子もまた、企図される。対立遺伝子は、1またはこれより多くの変異(例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換)の結果として変化する内因性遺伝子である。その得られたmRNAおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および/またはデーターベース配列比較)を使用して同定され得る。
従って、別の実施形態において、変異誘発アプローチ(例えば、部位特異的変異誘発)は、本明細書で記載されるとおりの標的抗原配列またはそのフラグメントのバリアントおよび/または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列中の特異的改変が、ポリペプチドをコードする基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介して行われ得る。これらの技術は、例えば、1またはこれより多くのヌクレオチド配列変化をそのポリヌクレオチドの中に導入することにより、前述の考慮事項のうちの1またはこれより多くを組み込む、配列バリアントを調製して試験するための簡単なアプローチを提供する。
部位特異的変異誘発は、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供して、横断する欠失接合点の両側で安定な二重鎖を形成するために、所望の変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用による変異体ならびに隣接するヌクレオチドの十分な数の生成を可能にする。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、低下させるか、改変するか、もしくは別の方法で変化させる、および/またはそのコードされるポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性、もしくは一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施されるように、化学的手段によってそのフラグメントを直接合成することによって容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術(例えば、米国特許第4,683,202号のPCRTM技術)の適用によって、選択された配列を組換え生成のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学分野の当業者に一般に公知の他の組換えDNA技術(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY参照のこと)によって、得られ得る。
本明細書で記載されるように所望の標的抗原ポリペプチドもしくはそのフラグメント、または上記のうちのいずれかを含む融合タンパク質を発現するために、そのポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知の組換え技術を使用する、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの適切なAdに挿入される。適切なアデノウイルスベクターは、その挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントならびに任意の所望のリンカーを含む。当業者に周知の方法は、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含むこれらアデノウイルスベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。このような技術は、例えば、Amalfitanoら J. Virol. 1998 72:926−33; Hodgesら J Gene Med 2000 2:250−259; Sambrook Jら (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., およびAusubel FMら (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Yに記載される。
種々のベクター/宿主システムは、ポリヌクレオチド配列を含みおよび生成するために利用され得る。これらとしては、微生物(例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNAベクターで形質転換された細菌;酵母ベクターで形質転換された酵母;ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞システム;ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)または細菌ベクター(例えば、TiまたはpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞システム;あるいは動物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。
アデノウイルスベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」とは、ベクターのそれらの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、5’および3’非翻訳領域(これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う)である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性において変動し得る。利用されるベクターシステムおよび宿主に依存して、任意の数の適切な転写および翻訳エレメント(構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む)が使用され得る。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列(tripartite leader sequence)からなるAd転写/翻訳複合体へとライゲートされ得る。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入は、感染した宿主細胞におけるポリペプチドを発現し得る生存可能なウイルスを得るために使用され得る(Logan J and Shenk T (1984) Proc. Natl. Acad. Sci 1984 87:3655−59)。さらに、転写エンハンサー(例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサー)は、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるために使用され得る。
特異的開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。このようなシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。そのポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳制御シグナルは、全く必要とされないこともある。しかし、コード配列またはその一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、その開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム中にあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源のもの(天然および合成の両方)であり得る。発現の効率は、使用される特定の細胞システム(例えば、文献中に記載されるもの)に適したエンハンサーの包含によって増強され得る(Scharf D.ら Results Probl. Cell Differ. 1994 20:125−62)。特異的終結配列(specific termination sequence)(転写または翻訳いずれかのため)はまた、その選り抜きのポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために組み込まれ得る。
ポリヌクレオチドコード生成物(例えば、目的の標的抗原)の発現を、その生成物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化セルソーティング(FACS)が挙げられる。所定のポリペプチド上の2つの干渉しないエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースのイムノアッセイは、いくつかの適用のために使用され得るが、競合的結合アッセイもまた、使用され得る。これらおよび他のアッセイは、とりわけ、Hampton Rら(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.)およびMaddox DEら J. Exp. Med. 1983 758:1211−16)に記載される。アデノウイルスベクターは、目的のいくつかのインフルエンザ抗原をコードする核酸配列を含み得る。
ある種の実施形態において、所望の標的抗原の発現を増加させるエレメントは、本明細書で記載されるアデノウイルスベクターの核酸配列へと組み込まれる。このようなエレメントとしては、内部リボソーム結合部位(IRES; Wang and Siddiqui Curr. Top. Microbiol. Immunol 1995 203:99; Ehrenfeld and Semler Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995 203:65; Reesら, Biotechniques 1996 20:102; Sugimotoら Biotechnology 1994 2:694)が挙げられる。IRESは、翻訳効率を増加させる。同様に、他の配列も発現を増強し得る。いくつかの遺伝子に関しては、特に5’末端にある配列は、転写および/または翻訳を阻害する。これらの配列は通常、ヘアピン構造を形成し得るパリンドロームである。送達されるべき核酸の中の任意のこのような配列は、欠失されてもよいし、欠失されなくてもよい。
転写または翻訳生成物の発現レベルは、どの配列が発現に影響を及ぼすかを確認または確かめるためにアッセイされ得る。転写レベルは、任意の公知の方法(ノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNaseプローブ保護などが挙げられる)によってアッセイされ得る。タンパク質レベルは、任意の公知の方法(ELISAが挙げられる)によってアッセイされ得る。当業者によって認識されるように、異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、当該分野で公知の組換え技術(例えば、Maioneら Proc Natl Acad Sci USA 2001 98:5986−91; Maioneら Hum Gene Ther 2000 1:859−68; Sandigら Proc Natl Acad Sci USA, 2000 97:1002−07; Haruiら Gene Therapy 2004 11:1617−26; Parksら Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:13565−570; DelloRussoら Proc Natl Acad Sci USA 2002 99:12979−984; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NYに記載されるもの)を使用して生成され得る。
上記で注記されるように、アデノウイルスベクターは、目的のいくつかのインフルエンザ標的タンパク質または抗原をコードする核酸配列を含む。この点において、そのベクターは、目的の1〜4種またはこれより多くの異なる標的抗原をコードする核酸を含み得る。その標的抗原は、全長タンパク質であってもよいし、そのフラグメント(例えば、エピトープ)であってもよい。そのアデノウイルスベクターは、目的の1種の標的タンパク質に由来する複数のフラグメントまたはエピトープをコードする核酸配列を含んでいてもよいし、目的の多くの異なる標的インフルエンザ抗原タンパク質に由来する1またはこれより多くのフラグメントまたはエピトープを含んでいてもよい。
ある種の実施形態において、免疫原性フラグメントは、MHCクラスIまたはクラスIl分子に結合する。本明細書で使用される場合、免疫原性フラグメントは、このような結合が、当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出される場合に、MHCクラスIまたはクラスIl分子「に結合する」といわれる。例えば、ポリペプチドがMHCクラスIに結合する能力は、MHCクラスl/β2m/ペプチドヘテロ三量体複合体への125I標識β2−ミクログロブリン(β2m)の組み込みを促進する能力をモニタリングすることによって、間接的に評価され得る(Parkerら, J. Immunol. 752:163, 1994を参照のこと)。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイが、使用され得る。ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、一般に、周知の技術(例えば、Paul, Fundamental Immunology, 第3版, 243−247(Raven Press, 1993)およびその中で引用される参考文献中にまとめられるもの)を使用して同定され得る。免疫原性フラグメントを同定するための代表的技術としては、抗原特異的抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応する能力に関してポリペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、全長標的ポリペプチドの反応性より実質的に低くないレベルで(例えば、ELISAおよび/またはT細胞反応性アッセイにおいて)このような抗血清および/またはT細胞と反応するフラグメントである。言い換えると、免疫原性フラグメントは、全長ポリペプチドの反応性に類似するかまたはこれより高い反応性のレベルでこのようなアッセイ内で反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、当業者に周知の方法(例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されるもの)を使用して行われ得る。
標的抗原としては、インフルエンザAおよびBウイルスのうちのいずれかに由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的抗原は、本明細書で記載される感染性インフルエンザウイルスのうちのいずれかによって生成されるタンパク質(例えば、ウイルス抗原タンパク質、すなわち、インフルエンザBM2タンパク質、ヘマグルチニン、マトリクスタンパク質M1、マトリクスタンパク質M2、核タンパク質、およびノイラミニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない)を含み得る。本明細書で使用される場合、「感染性因子(infectious agent)」とは、宿主に感染し得る任意の生きている生物である。感染性因子としては、例えば、インフルエンザAおよびBウイルスの任意の変種が挙げられる。
アデノウイルスベクターはまた、標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。この点において、このようなタンパク質を含むアデノウイルスベクターで免疫した後に生成されるタンパク質は、目的の標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質に融合された目的の標的抗原を含む融合タンパク質であり得る。
使用方法
アデノウイルスベクターは、本明細書で記載されるとおりの1種もしくは複数種の標的抗原に対する免疫応答を生成するための多くのワクチンの状況において使用され得る。アデノウイルスベクターは、これらがAdに対して既存の免疫を有する被験体において免疫応答を生成するために使用され得、アデノウイルスベクターを使用する複数回の免疫を含むワクチン接種レジメン(前の世代のアデノウイルスベクターを使用することが不可能であるレジメン)において使用され得るという予測外の知見が原因で特に重要である。
アデノウイルスベクターは、本明細書で記載されるとおりの1種もしくは複数種の標的抗原に対する免疫応答を生成するための多くのワクチンの状況において使用され得る。アデノウイルスベクターは、これらがAdに対して既存の免疫を有する被験体において免疫応答を生成するために使用され得、アデノウイルスベクターを使用する複数回の免疫を含むワクチン接種レジメン(前の世代のアデノウイルスベクターを使用することが不可能であるレジメン)において使用され得るという予測外の知見が原因で特に重要である。
一般に、免疫応答の生成は、体液性応答および/または細胞媒介性応答の誘導を含む。ある種の実施形態において、目的の標的抗原に対する免疫応答を増大させることは、望ましい。よって、「免疫応答を生成することまたは「免疫応答を誘導すること」とは、任意の統計的に有意な変化、例えば、1種もしくは複数種の免疫細胞(T細胞、B細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など)の数の増加またはこれら免疫細胞のうちの1種もしくは複数種の活性(CTL活性、HTL活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌のプロフィールの変化など)の増加を含む。
当業者は、免疫応答の変化が起こったかどうかを確立するための多くの方法が利用可能であることを容易に認識する。免疫応答(例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性)の変化を検出するための種々の方法は、当該分野で公知であり、本発明との関連において有用である。例示的方法は、Current Protocols in Immunology, 編者: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001 John Wiley & Sons, NY, NY)、Ausubelら(2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY);Sambrookら(1989 Molecular Cloning, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatisら(1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)および他の箇所に記載される。この状況において有用な例示的方法としては、細胞内サイトカイン染色(ICS)、ELISpot、増殖アッセイ、細胞傷害性T細胞アッセイ(クロム放出もしくは等価なアッセイが挙げられる)、および任意の数のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくはRT−PCRベースのアッセイを使用する遺伝子発現分析が挙げられる。
ある種の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較して、アデノウイルスベクターを投与される被験体において、約1.5〜20倍またはこれより大きな倍数(少なくとも、約、または多くて1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、またはそこから得られる任意の範囲もしくは数)の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較してアデノウイルスベクターを投与される被験体において約1.5〜20倍、またはこれより多くの倍数の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、サイトカイン分泌(例えば、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、インターロイキン−2(IL−2)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)、グランザイム、または他のサイトカイン)を測定するELISpotアッセイによって測定される場合に、コントロールと比較して約1.5〜20倍、またはこれより多くの倍数の標的抗原特異的細胞媒介性免疫活性の増加を含む。
さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、適切なコントロールと比較して、アデノウイルスベクターを投与した被験体において、1.5〜5倍の間の標的特異的抗体生成の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、コントロールと比較してアデノウイルスベクターを投与した被験体において、約1.5〜20倍、またはこれより多くの倍数の標的特異的抗体生成の増加を含む。
従って、ある種の局面は、目的のインフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法を提供し得、上記方法は、a)E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、およびb)標的抗原をコードする核酸を含む、アデノウイルスベクターを上記個体に投与するステップ;ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与するステップを包含し;それによって、上記標的抗原に対する免疫応答を生成する。ある種の実施形態において、投与される上記ベクターがguttedベクターではない方法が提供され得る。
さらなる実施形態において、a)E2b領域において欠失を有する複数欠損アデノウイルスベクター、およびb)インフルエンザウイルス標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを、Adに対して既存の免疫を有する個体に投与するステップ;ならびに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与するステップによって、該個体においてインフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得;それによって、インフルエンザウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する。
Adに対する既存の免疫に関して、これは、当該分野で公知の方法(例えば、Ad抗体の存在に関して試験するための抗体ベースのアッセイ)を使用して決定され得る。さらに、ある種の実施形態において、上記方法は、先ず、個体がAdに対して既存の免疫を有することを決定するステップ、次いで、本明細書で記載されるとおりのE2b欠失アデノウイルスベクターを投与するステップを包含し得る。
ある種の局面において、インフルエンザ標的抗原(例えば、本明細書の他の箇所で記載されるもの)に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得る。
特定の局面において、インフルエンザAおよびBウイルス(例えば、本明細書の他の箇所で記載されるもの)に対する免疫応答を生成するための方法が提供され得る。
本明細書の他の箇所で注記されるように、アデノウイルスベクターは、感染性因子であって、それに対して免疫応答が生成されるべき感染性因子のうちのいずれか1種または複数種に由来する目的の1種または複数種の標的抗原をコードする核酸配列を含む。例えば、標的抗原としては、ウイルス抗原タンパク質、すなわち、インフルエンザBM2タンパク質、ヘマグルチニン、マトリクスタンパク質M1、マトリクスタンパク質M2、核タンパク質、およびノイラミニダーゼが挙げられ得るが、これらに限定されない。
投与のために、アデノウイルスベクターストックは、適切な緩衝液、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤などと組み合わせられ得る。ある種の実施形態において、適切な数のアデノウイルスベクター粒子は、適切な緩衝液(例えば、滅菌PBS)中で投与される。
ある種の環境において、本明細書で開示されるアデノウイルスベクター組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが、望ましい場合がある。ある種の実施形態において、遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としてのその活性化合物の溶液は、界面活性剤(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース)と適切に混合された水で調製され得る。分散液剤(dispersion)はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物で、ならびに油で調製され得る。他の実施形態において、E2b欠失アデノウイルスベクターは、丸剤形態で送達され得るか、嚥下によってまたは坐剤によって送達され得る。
注射用途に適した例示的な薬学的形態としては、滅菌水性液剤または分散液剤、および滅菌注射用液剤または分散液剤の即座の調製のための滅菌散剤・粉剤(sterile powder)が挙げられる(例えば、米国特許第5,466,468号を参照のこと)。全ての場合において、その形態は、滅菌されていなければならず、そしてその製剤が容易に引き抜かれかつシリンジを通して押し出される程度までの、流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、汚染する微生物(例えば、細菌、糸状菌および真菌)の活動に対して保護されていなければならない。そのキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、これらの適切な混合物、および/または植物性油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング(例えば、レシチン)の使用によって、分散液剤の場合には必要とされる粒径の維持によっておよび/または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進され得る。多くの場合、それは、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含み得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中で吸収を遅延させる剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を使用することによってもたらされ得る。
一実施形態において、水性液剤での非経口投与のために、その液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、その液体希釈剤は、まず十分な塩類またはグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この点について、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に鑑みて、当業者に公知である。例えば、1投与量は、1mlの等張性NaCl溶液中に溶解され得、そして1000mlの皮下注入液に添加されるか、または提唱される注入部位に注射されるかのいずれかであり得る(例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」 第15版, 第1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照のこと)。投与量におけるいくらかのバリエーションは、処置されている被験体の状態に依存して必然的に起こる。さらに、ヒト投与のために、調製物は、FDA当局の生物学基準によって要求されるとおりの無菌、発熱原性、および一般的な安全性および純度基準を満たすことを必要とし得る。
そのキャリアは、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファ、キャリア溶液、懸濁液(suspension)、およびコロイドなどをさらに含み得る。薬学的に活性な物質のこのような媒体および剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と不適合である範囲を除いて、治療用組成物におけるその使用は、企図される。補助活性成分はまた、その組成物に組み込まれ得る。語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応または類似の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物に言及する。
本明細書で記載される治療用組成物の投与経路および投与頻度、ならびに投与量は、個体毎で、疾患毎で変動し、標準的技術を使用して容易に確立され得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって(例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下)、鼻内に(例えば、吸引によって)、丸剤形態で(例えば、嚥下、膣または直腸送達様の坐剤)、投与され得る。ある種の実施形態において、1〜3用量の間が、6週間の期間にわたって投与され得、さらなるブースターワクチン接種が、その後周期的に与えられ得る。
適切な用量は、上記で記載されるように投与される場合に、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの標的抗原免疫応答を促進し得るアデノウイルスベクターの量である。ある種の実施形態において、その免疫応答は、基底(すなわち、非処置)レベルを少なくとも10〜50%上回る。このような応答は、患者における標的抗原の抗体(target antigen antibody)を測定することによって、またはインフルエンザ感染細胞をインビトロで殺滅し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、または免疫応答をモニタリングするための当該分野で公知の他の方法によって、モニターされ得る。
一般に、適切な投与量および処置レジメンは、予防上の利益を提供するために十分な量のアデノウイルスベクターを提供する。防御的免疫応答は、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して一般に評価され得、これらのアッセイは、免疫(ワクチン接種)の前および後に、患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
1つの利点は、特に、Adに対して既存の免疫を有する個体において、同じアデノウイルスベクターで複数回のワクチン接種を施すことができる一方で、そのアデノウイルスワクチンはまた、初回抗原刺激レジメンおよび追加免疫レジメンの一部として投与され得る。プライミングおよびブースター接種スキームの混合モダリティーは、免疫応答の増強を生じ得る。
従って、一局面は、プラスミドワクチン(例えば、目的の標的抗原を含むプラスミドベクター)で被験体をプライミングするための方法であり、上記方法は、そのプラスミドワクチンを少なくとも1回投与し、所定の時間の長さを経過させるステップ、次いで、そのアデノウイルスベクターを投与することによって追加免疫するステップによるものである。複数回のプライミング(例えば、1〜3回)が使用され得るが、より多くが使用されてもよい。プライミングと追加免疫の間の時間の長さは、約6ヶ月から1年まで変動し得るが、他の時間枠が使用されてもよい。
ある種の実施形態において、上記組成物または複製欠損ウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。ある種の実施形態において、上記共刺激分子は、B7、ICAM−1、LFA−3、またはこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、上記共刺激分子は、B7、ICAM−1、およびLFA−3の組み合わせを含む。ある種の局面において、上記組成物は、同じ複製欠損ウイルスベクター中に配置された複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。ある種の局面において、上記組成物は、別個の複製欠損ウイルスベクター中に配置された複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。
特定の局面において、上記組成物は、本明細書で記載されるとおりのインフルエンザウイルス標的抗原をコードする核酸配列を含み、B7、ICAM−1、LFA−3、またはこれらの組み合わせをコードする1種または複数種の核酸配列をさらに含む複製欠損ウイルスベクターを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって1×1010 VP以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。他の実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 VPであって5×1011 VP以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 VPであって1×1012 VP以下の用量で、標的抗原を含む複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 VPであって1×1010 VP以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。他の実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 VPであって5×1011 VP以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも1×108 VPであって1×1012 VP以下の用量で、複製欠損アデノウイルスベクターを投与するための方法を提供する。
さらなる実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、少なくとも、約、または多くて、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018 、1019、1020のウイルス粒子、またはそこから導き出せる任意の数もしくは範囲を含み得る。特定の実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、少なくとも、約、または多くて、109、1010、1011のウイルス粒子またはそこから導き出せる任意の数もしくは範囲を含み得る。
ある種の実施形態において、本明細書で記載されるワクチンまたは薬学的組成物は、1時間ごと、1日ごと、1週間ごと、2週間ごと、3週間ごと、1ヶ月ごと、2ヶ月ごと、3ヶ月ごと、四半期ごと、6ヶ月ごと、9ヶ月ごと、1年ごと、または10年ごと、またはそこから導き出せる任意の間隔もしくは範囲の所定の間隔で、例えば、少なくとも、約、または多くて、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、30回、40回、50回、100回、120回、130回、140回、150回、投与され得る。
上記で記載される種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書中で言及される、および/または出願データシート中に列挙される米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されたのと同程度まで、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
上記実施形態の局面は、なおさらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願および刊行物の概念を使用することが必要であれば、改変され得る。
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に鑑みて上記実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、請求項を、本明細書および特許請求の範囲において開示されるその具体的実施形態へと限定すると解釈されるべきではなく、このような特許請求項の範囲が権利を与えられるその均等物の全範囲とともに、全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
本発明はさらに、以下の実験例への参照によって詳細に記載される。これらの例は、例証目的で提供されるに過ぎず、別段特定されなければ、限定であるとは意図されない。従って、本発明は、以下の実施例に限定されるとは決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全てのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
実施例1
Ad5[E1−、E2b−]ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築を記載する。複数のインフルエンザ抗原を含むAd5[E1−、E2b−]を生成するために、その個々のインフルエンザ抗原遺伝子配列を、それぞれ、ブタテッショウウイルス−1およびThosea asignaウイルスに由来する「自己切断」2Aペプチドによって離す(図1Aを参照のこと)(de Felipe P and Ryan M Traffic 2004 5(8), 616-26; Holst Jら Nature Immunol. 2008 9:658-66; Kim JHら PloS One, 2011 6(4), e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556)。2Aペプチドは、リボソーム上で翻訳されるので、その2Aペプチドの最後の2残基の間のペプチド結合は決して形成されず、1回のリボソーム通過(one ribosomal pass)に別個に発現されるタンパク質を生じる。3種の遺伝子を離す2つの2Aペプチド配列の使用は、その3種のタンパク質のほぼ化学量論的発現を生じる。同様に、ブタテッショウウイルス−1およびThosea asignaウイルスにそれぞれ由来する単一の「自己切断」2Aペプチドによって離される、2種の抗原遺伝子配列を含むAd5[E1−、E2b−]が構築され得る(図1B)。
Ad5[E1−、E2b−]ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]ベクターへの挿入のための複数のインフルエンザ抗原遺伝子の構築を記載する。複数のインフルエンザ抗原を含むAd5[E1−、E2b−]を生成するために、その個々のインフルエンザ抗原遺伝子配列を、それぞれ、ブタテッショウウイルス−1およびThosea asignaウイルスに由来する「自己切断」2Aペプチドによって離す(図1Aを参照のこと)(de Felipe P and Ryan M Traffic 2004 5(8), 616-26; Holst Jら Nature Immunol. 2008 9:658-66; Kim JHら PloS One, 2011 6(4), e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556)。2Aペプチドは、リボソーム上で翻訳されるので、その2Aペプチドの最後の2残基の間のペプチド結合は決して形成されず、1回のリボソーム通過(one ribosomal pass)に別個に発現されるタンパク質を生じる。3種の遺伝子を離す2つの2Aペプチド配列の使用は、その3種のタンパク質のほぼ化学量論的発現を生じる。同様に、ブタテッショウウイルス−1およびThosea asignaウイルスにそれぞれ由来する単一の「自己切断」2Aペプチドによって離される、2種の抗原遺伝子配列を含むAd5[E1−、E2b−]が構築され得る(図1B)。
実施例2
Ad5[E1−、E2b]−M1/NP/HAでの細胞感染後のインフルエンザタンパク質の発現
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAでの細胞感染後の、インフルエンザタンパク質の発現を記載する。A549細胞を、マトリクス1(M1)タンパク質、核タンパク質(NP)、およびヘマグルチニン(HA)を含むAd5[E1−、E2b]ベクターに感染させた。M1、NP、およびHAの発現を、ウェスタンブロットによって確認した。図2に示されるように、インフルエンザAに由来する遺伝子挿入物の、ヘマグルチニン(HA)、核タンパク質(NP)、およびマトリクス1(M1)タンパク質、3種(3)全てを含むAd5[E1−、E2b−]ベースのプラットフォーム(Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA)を、構築し、生成した。実施例3および実施例4に示されるように、このワクチンは、マウスにおいて免疫原性であり、HA、NP、およびM1指向性の免疫応答を誘導した。
Ad5[E1−、E2b]−M1/NP/HAでの細胞感染後のインフルエンザタンパク質の発現
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAでの細胞感染後の、インフルエンザタンパク質の発現を記載する。A549細胞を、マトリクス1(M1)タンパク質、核タンパク質(NP)、およびヘマグルチニン(HA)を含むAd5[E1−、E2b]ベクターに感染させた。M1、NP、およびHAの発現を、ウェスタンブロットによって確認した。図2に示されるように、インフルエンザAに由来する遺伝子挿入物の、ヘマグルチニン(HA)、核タンパク質(NP)、およびマトリクス1(M1)タンパク質、3種(3)全てを含むAd5[E1−、E2b−]ベースのプラットフォーム(Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA)を、構築し、生成した。実施例3および実施例4に示されるように、このワクチンは、マウスにおいて免疫原性であり、HA、NP、およびM1指向性の免疫応答を誘導した。
実施例3
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する抗体応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含む Ad5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回の免疫後の、インフルエンザヘマグルチニン(HA)抗原に対する抗体応答を記載する。各5匹のマウスの群を、1×108、1×109、または1×1010 ウイルス粒子(VP)Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAの用量で毎週の間隔で皮下に2回免疫した。コントロールマウスに、Ad5−ヌル(空のベクター)を同じ用量で注射した。最後の免疫(ワクチン接種)の2週間後に血清を個々のマウスから得、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗HA抗体の存在について評価した(Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35)。図3に示されるように、抗HA抗体応答は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫マウスにおいて用量依存性様式で生成されたが、Ad5−ヌル(空のベクター)を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する抗体応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含む Ad5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回の免疫後の、インフルエンザヘマグルチニン(HA)抗原に対する抗体応答を記載する。各5匹のマウスの群を、1×108、1×109、または1×1010 ウイルス粒子(VP)Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAの用量で毎週の間隔で皮下に2回免疫した。コントロールマウスに、Ad5−ヌル(空のベクター)を同じ用量で注射した。最後の免疫(ワクチン接種)の2週間後に血清を個々のマウスから得、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗HA抗体の存在について評価した(Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35)。図3に示されるように、抗HA抗体応答は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫マウスにおいて用量依存性様式で生成されたが、Ad5−ヌル(空のベクター)を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
実施例4
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターで複数回免疫した後のインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答を記載する。各々5匹のマウスの群に、1×108、1×109、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAの用量を毎週の間隔で2回、皮下に免疫した。コントロールマウスに、Ad5−ヌル(空のベクター)を同じ用量で注射した。最後の免疫(ワクチン接種)の2(2)週間後に個々のマウスから脾臓を得、IFN−γ分泌脾細胞に関してELISpotアッセイを使用してCMIについて評価した(Gabitzsch ESら Cancer Immunol Immunother. 2010 59:1131−35; Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35; Jones FRら Vaccine 2011 29:7020−26)。図4に示されるように、CMI応答は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫マウスにおいて生成されたが、Ad5−ヌル(空のベクター)を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターで複数回免疫した後のインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答を記載する。各々5匹のマウスの群に、1×108、1×109、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAの用量を毎週の間隔で2回、皮下に免疫した。コントロールマウスに、Ad5−ヌル(空のベクター)を同じ用量で注射した。最後の免疫(ワクチン接種)の2(2)週間後に個々のマウスから脾臓を得、IFN−γ分泌脾細胞に関してELISpotアッセイを使用してCMIについて評価した(Gabitzsch ESら Cancer Immunol Immunother. 2010 59:1131−35; Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35; Jones FRら Vaccine 2011 29:7020−26)。図4に示されるように、CMI応答は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫マウスにおいて生成されたが、Ad5−ヌル(空のベクター)を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
実施例5
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回免疫した後の、インフルエンザ抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を記載する。CTL応答を、ELISpotアッセイでグランザイムB分泌を測定することによって定量した。
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回免疫した後の、インフルエンザ抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を記載する。CTL応答を、ELISpotアッセイでグランザイムB分泌を測定することによって定量した。
各々5匹のマウスの群に、1×108、1×109、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAの用量で毎週の間隔で2回、皮下に免疫した。コントロールマウスに、Ad5−ヌル(空のベクター)を同じ用量で注射した。最後の免疫(ワクチン接種)の2(2)週間後に個々のマウスから脾臓を得、グランザイムB分泌脾細胞に関してELISpotアッセイを使用して細胞傷害性Tリンパ球(CTL)活性について評価した。図5に示されるように、CTL応答は、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫マウスにおいて生成されたが、Ad5−ヌル(空のベクター)を注射したコントロールマウスでは生成されなかった。
実施例6
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対するCMI応答の時間経過評価
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回免疫した後の種々の時点でのインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答を記載する。各マウス群を、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAで1回(群1)、2週間空けて2回(群2)、1ヶ月空けて2回(群3)および2ヶ月空けて2回(群4)、免疫した。免疫(ワクチン接種)後の種々の時点で個々のマウスから脾臓を得、IFN−γ分泌脾細胞に関するELISpotアッセイを使用することによって、NPおよびHAに対するCMI応答に関して評価した。図6に示されるように、CMI応答は、最後の免疫の1週間後で概して最大であり、次いで、その後低下していった。
Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HA免疫に対するCMI応答の時間経過評価
この実施例は、M1タンパク質、NPタンパク質、およびHAタンパク質を含むAd5[E1−、E2b−]ベクターでの複数回免疫した後の種々の時点でのインフルエンザ抗原に対する細胞媒介性免疫(CMI)応答を記載する。各マウス群を、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAで1回(群1)、2週間空けて2回(群2)、1ヶ月空けて2回(群3)および2ヶ月空けて2回(群4)、免疫した。免疫(ワクチン接種)後の種々の時点で個々のマウスから脾臓を得、IFN−γ分泌脾細胞に関するELISpotアッセイを使用することによって、NPおよびHAに対するCMI応答に関して評価した。図6に示されるように、CMI応答は、最後の免疫の1週間後で概して最大であり、次いで、その後低下していった。
実施例7
m1タンパク質、NPタンパク質、およびヘマグルチニンを含むAd5[E1−、E2b−]ベクターの投与
この実施例は、種々の時点でm1タンパク質、npタンパク質、およびヘマグルチニンを含むAd5[E1−、E2b−]ベクターを注射して、インフルエンザヘマグルチニン抗原に対する抗体応答が生成することを記載する。各マウス群を、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAで1回(群1)、2週間空けて2回(群2)、1ヶ月空けて2回(群3)および2ヶ月空けて2回(群4)、免疫した。免疫(ワクチン接種)後の種々の時点で個々のマウスから血清を得、抗HA抗体の存在に関して定量的ELISA技術によって評価した。図7に示されるように、抗HA抗体応答は、免疫後の58〜85日にピークに達し、その後、抗体応答は僅かに低くなることが観察された。
m1タンパク質、NPタンパク質、およびヘマグルチニンを含むAd5[E1−、E2b−]ベクターの投与
この実施例は、種々の時点でm1タンパク質、npタンパク質、およびヘマグルチニンを含むAd5[E1−、E2b−]ベクターを注射して、インフルエンザヘマグルチニン抗原に対する抗体応答が生成することを記載する。各マウス群を、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/HAで1回(群1)、2週間空けて2回(群2)、1ヶ月空けて2回(群3)および2ヶ月空けて2回(群4)、免疫した。免疫(ワクチン接種)後の種々の時点で個々のマウスから血清を得、抗HA抗体の存在に関して定量的ELISA技術によって評価した。図7に示されるように、抗HA抗体応答は、免疫後の58〜85日にピークに達し、その後、抗体応答は僅かに低くなることが観察された。
実施例8
Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAを組み合わせた免疫に対する抗体応答
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせでの免疫後の、インフルエンザA(InfA)およびインフルエンザB(InfB)抗原に対する抗体応答を記載する。Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eを、1×1010 ウイルス粒子(VP)の用量で投与し、Ad5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンを、1×1010 VPの用量で投与した。
Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAを組み合わせた免疫に対する抗体応答
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせでの免疫後の、インフルエンザA(InfA)およびインフルエンザB(InfB)抗原に対する抗体応答を記載する。Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eを、1×1010 ウイルス粒子(VP)の用量で投与し、Ad5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンを、1×1010 VPの用量で投与した。
5匹のマウスの群を、2週間間隔を空けて2回、陰性コントロールとしての1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−ヌル(空のベクター)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザA(InfA)−ヘマグルチニン(HA)/マトリクス2e(M2e)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfB−HA、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよび1×1010 VPs Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザB(InfB)−HAを含むワクチン混合物で免疫した。2回目の免疫の2週間後、個々のマウスの血清を、以前に記載される(Gabitzsch ESら Cancer Gene Ther. 2011 18:326−35)ように定量的ELISAを使用して、インフルエンザA−HAまたはインフルエンザB−HAに対する抗体の存在に関して分析した。
図8は、Ad5[E1−、E2b−]インフルエンザワクチンでのマウスの免疫後に酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定される場合の血清中のインフルエンザAまたはインフルエンザB HA抗体応答の定量を図示する。図8Aは、インフルエンザA HA抗体応答の定量を図示する。図8Bは、インフルエンザB HA抗体応答の定量を図示する。
インフルエンザAおよびBの両方に対する抗体は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ad5[E1−、E2b−]−ヌルを注射したコントロールマウスでは検出されなかった。これらの応答は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2e単独で免疫したマウスがインフルエンザB−HAに対する抗体を生成せず、かつAd5[E1−、E2b−]−InfB単独で免疫したマウスがインフルエンザA−HAに対する抗体を生成しなかったので、特異的であった。
実施例9
再刺激した脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答のフローサイトメトリー分析
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞を、インフルエンザHAペプチド、インフルエンザM2ペプチド、インフルエンザB HAペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のフローサイトメトリー分析を記載する。
再刺激した脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答のフローサイトメトリー分析
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞を、インフルエンザHAペプチド、インフルエンザM2ペプチド、インフルエンザB HAペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のフローサイトメトリー分析を記載する。
5匹のマウスの群を、2週間の間隔で2回、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−ヌル(空のベクター)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザA(InfA)−ヘマグルチニン(HA)/マトリクス2e(M2e)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfB−HA、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよび1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザB(InfB)−HAを含むワクチン混合物で免疫した。2回目の免疫の2週間後、個々のマウスの脾臓を、特異的ペプチドプールへの曝露後に、インターフェロンガンマ(IFN−γ)発現CD8+(A)および/またはCD4+(B) T細胞によって明らかにされるように、CMI活性に関してフローサイトメトリーによって分析した。
図9は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウス由来の再刺激脾細胞におけるIFN−γ発現エフェクターTリンパ球の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。図9Aは、IFN−γ発現CD8+脾細胞のパーセンテージを図示する。図9Bは、IFN−γ発現CD4+脾細胞のパーセンテージを図示する。
インフルエンザAおよびB両方に対するCMI応答は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ad5[E1−、E2b−]−ヌルを注射したコントロールマウスでは検出されなかった。インフルエンザHA抗原に対してバックグラウンド応答が観察されたが、有意に(P<0.05 マンホイットニー検定)より高いCMI応答が、免疫したマウスにおいて観察された。これらの応答は、ワクチン免疫したマウスのT細胞が培地または無関係の抗原(SIV−nef)ペプチドプールへの曝露後にCMI応答を生成しなかったので、特異的であった。
実施例10
再刺激脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答のELISpot分析
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞をインフルエンザHAペプチド、インフルエンザM2ペプチド、インフルエンザB HAペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のELISpot分析を記載する。
再刺激脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答のELISpot分析
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウスに由来する脾細胞をインフルエンザHAペプチド、インフルエンザM2ペプチド、インフルエンザB HAペプチドで、エキソビボで再刺激した後の細胞媒介性免疫応答のELISpot分析を記載する。
5匹のマウスの群を、2週間の間隔で2回、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−ヌル(空のベクター)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザA(InfA)−ヘマグルチニン(HA)/マトリクス2e(M2e)、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfB−HA、または1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよび1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−インフルエンザB(InfB)−HAを含むワクチン混合物で免疫した。2回目の免疫の2週間後、個々のマウスの脾臓を、特異的ペプチドプールへの曝露後にインターフェロン−ガンマ(IFN−γ)(A)またはIL−2(B)を分泌するスポット形成細胞(SFC)に関するELISpotアッセイを使用して、CMI活性に関して分析した。
図10は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eワクチンおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAワクチンの組み合わせで免疫したマウスのサイトカイン分泌再刺激脾細胞の定量によって測定される場合の細胞媒介性免疫応答を図示する。図10Aは、IFN−γ分泌脾細胞の定量を図示する。図10Bは、IL−2分泌脾細胞の定量を図示する。
インフルエンザAおよびB両方に対するCMI応答は、Ad5[E1−、E2b−]−InfA−HA/M2eおよびAd5[E1−、E2b−]−InfB−HAの混合物でワクチン接種したマウスにおいて検出されたが、Ad5[E1−、E2b−]−ヌルを注射したコントロールマウスにおいて検出されなかった。これらの応答は、ワクチン免疫したマウスの脾臓細胞が無関係の抗原(SIV−Nef)ペプチドプールへの曝露後にCMI応答を生成しなかったので、特異的であった。
実施例11
Ad5[E1−、E2b−]ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究を記載する。10匹のマウスの群を、2週間の間隔で2回、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−ヌル(空のベクター)または本願の図1Bで構築されるとおりの1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/InfA−HAを含むワクチンで免疫した。2回目の免疫の30日後に、マウスをインフルエンザウイルスのH1N1株(インフルエンザA/California/07/2009株)でチャレンジし、チャレンジ後に生存に関して評価した。
Ad5[E1−、E2b−]ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究
この実施例は、Ad5[E1−、E2b−]ベースのインフルエンザワクチンでのチャレンジ研究を記載する。10匹のマウスの群を、2週間の間隔で2回、1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−ヌル(空のベクター)または本願の図1Bで構築されるとおりの1×1010 VP Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/InfA−HAを含むワクチンで免疫した。2回目の免疫の30日後に、マウスをインフルエンザウイルスのH1N1株(インフルエンザA/California/07/2009株)でチャレンジし、チャレンジ後に生存に関して評価した。
図11は、60日の期間にわたって、コントロール(ヌル)ワクチンと比較して、Ad5[E1−、E2b−]−M1/NP/InfA−HAワクチンで免疫したマウスにおけるチャレンジ研究からの生存曲線を図示する。
ワクチン接種したマウスは、僅か20%生存を経験したAd5[E1−、E2b−]−ヌルを注射したコントロールマウスと比較して、ウイルスチャレンジから完全な防御が付与され、この差異は有意であった(ログランク マンテル−コックス検定, P=0.0003)。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示されかつ記載されてきたその一方で、このような実施形態が例示によって提供されるに過ぎないことは、当業者に明らかである。多くのバリエーション、変化、および置換は、今や本発明から逸脱することなく当業者に想起されよう。本明細書で記載される本発明の実施形態に対する種々の変更は、本発明を実施するにあたって使用され得ることは、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、本特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、それによって網羅されることは、意図される。
Claims (84)
- 組成物であって、
E2b遺伝子領域において欠失を含む複製欠損アデノウイルスベクター;および
インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸配列、
を含む、組成物。 - 前記インフルエンザA標的抗原は、インフルエンザウイルスAの標的抗原である、請求項1に記載の組成物。
- 前記インフルエンザA標的抗原および前記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザウイルスAおよびインフルエンザウイルスBに共通する標的抗原である、請求項1に記載の組成物。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域において欠失をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3領域において欠失をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E4領域において欠失をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3およびE4領域において欠失をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザB/YamagataウイルスおよびインフルエンザB/Victoriaウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2、マトリクスタンパク質M2のM2e部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記インフルエンザB標的抗原は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記欠失は、塩基対を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記欠失は、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、または少なくとも150の塩基対を含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記欠失は、150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対を含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザA標的抗原をコードする核酸を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザA標的抗原をコードする核酸を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、複数のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方の発現を増加させるエレメントをさらに含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記エレメントは、少なくとも1種のエレメント、少なくとも2種のエレメント、少なくとも3種のエレメント、少なくとも4種のエレメント、または少なくとも5種のエレメントを含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む、請求項19または20に記載の組成物。
- 前記エレメントは、構成的プロモーターを含む、請求項19または20に記載の組成物。
- 前記エレメントは、誘導性プロモーターを含む、請求項19または20に記載の組成物。
- 前記エレメントは、転写エンハンサーを含む、請求項19または20に記載の組成物。
- 前記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである、請求項24に記載の組成物。
- 前記エレメントは、パリンドローム配列を含まない、請求項19〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、guttedベクターではない、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物または前記複製欠損アデノウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜28のいずれかに記載の組成物。
- 前記共刺激分子は、B7、ICAM−1、LFA−3、またはこれらの組み合わせを含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記共刺激分子は、B7、ICAM−1、およびLFA−3の組み合わせを含む、請求項30または31に記載の組成物。
- 前記アデノウイルスベクターは、インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸配列を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって、5×1011 VP以下を含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって1×1012 ウイルス粒子VP以下を含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の組成物。
- インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成することを必要とする個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、該個体に請求項1〜34のいずれかに記載の組成物を投与するステップを包含する、方法。
- 個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、
該個体に、
E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸、
を含む、第1のアデノウイルスベクターを投与するステップ;
該個体に、
(a)E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
(b)インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸、
を含む、第2のアデノウイルスベクターを投与するステップ;
を包含し、それによって、1種または複数種のインフルエンザAおよびB標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。 - 個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、
(a)該個体に、
(i)E2b領域において欠失を有する、複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
(ii)第1のインフルエンザA標的抗原および第1のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸、
を含む、第1のベクターを投与するステップ;ならびに
(b)その後、該個体に、第2のベクターであって、
(i) ステップ(a)の複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに
(ii)第2のインフルエンザA標的抗原および第2のインフルエンザB標的抗原をコードする核酸であって、ここで該第2のベクターの該第2のインフルエンザA標的抗原は、該第1のベクターの該第1のインフルエンザA標的抗原と同じであるかまたは異なり、該第2のベクターの該第2のインフルエンザB標的抗原は、該第1のベクターの該第1のインフルエンザB標的抗原と同じかまたは異なる、核酸、
を含む、第2のベクターを投与するステップ;
を包含し、それによって、該第1の標的抗原および該第2の標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。 - 個体においてインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原に対する免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、該個体に、E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクターならびにインフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを投与するステップ;ならびに該アデノウイルスベクターを少なくとも1回該個体に再投与するステップを包含し;それによって、該インフルエンザAおよびB標的抗原に対する免疫応答を生成する、方法。
- ユニバーサルインフルエンザワクチンベクターを構築するための方法であって、該方法は、インフルエンザA標的抗原およびインフルエンザB標的抗原をコードする核酸を、E2b領域において欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクターへと挿入するステップ、を包含する方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、H3N2、H9N1、H1N1、H2N2、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスの抗原を含む、請求項36〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザB/YamagataウイルスおよびインフルエンザB/Victoriaウイルスから選択されるウイルスの抗原を含む、請求項36〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2、マトリクスタンパク質M2のM2e部分、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項36〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザB標的抗原は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質に由来する抗原である、請求項36〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個体は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する、請求項36〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターは、guttedベクターではない、請求項36〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のベクターは、guttedベクターではない、請求項36〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のベクターは、guttedベクターではない、請求項36〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のおよび第2のアデノウイルスベクターは、guttedベクターではない、請求項36〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個体は、アデノウイルス5に対して既存の免疫を有する、請求項36〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のおよび前記第2のベクターの前記第1のおよび第2の標的抗原は、同じ感染性生物に由来する、請求項36〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のおよび前記第2のベクターの前記第1のおよび第2の標的抗原は、異なる感染性生物に由来する、請求項36〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原および前記インフルエンザB標的抗原は、異なる標的抗原である、請求項36〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、インフルエンザウイルスAの標的抗原である、請求項36〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原および前記インフルエンザB標的抗原は、インフルエンザウイルスAおよびインフルエンザウイルスBに共通する標的抗原である、請求項36〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域において欠失をさらに含む、請求項36〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3領域において欠失をさらに含む、請求項36〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E4領域において欠失をさらに含む、請求項36〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複製欠損アデノウイルスベクターは、E3およびE4領域において欠失をさらに含む、請求項36〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失は、塩基対を含む、請求項36〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失は、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、または少なくとも150の塩基対を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記欠失は、150より多い、160より多い、170より多い、180より多い、190より多い、200より多い、250より多い、または300より多い塩基対を含む、請求項60に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターは、少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種または少なくとも10種のインフルエンザAおよびB標的抗原をコードする核酸配列を含む、請求項36〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザAおよびインフルエンザB標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む、請求項36〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エレメントは、少なくとも1種のエレメント、少なくとも2種のエレメント、少なくとも3種のエレメント、少なくとも4種のエレメント、または少なくとも5種のエレメントを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記エレメントは、内部リボソーム結合部位を含む、請求項63に記載の方法。
- 前記エレメントは、構成的プロモーターを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記エレメントは、誘導性プロモーターを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記エレメントは、転写エンハンサーを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである、請求項68に記載の方法。
- 前記エレメントは、パリンドローム配列を含まない、請求項63〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アデノウイルスベクターは、前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方の免疫原性を増加させるポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項36〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、Mを含み、前記インフルエンザB標的抗原は、BM2を含む、請求項36〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方は、ヘマグルチニンを含む、請求項36〜72のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘマグルチニンは、HA1ドメインを含む、請求項73に記載の方法。
- ここで前記ヘマグルチニンは、HA2ドメインを含む、請求項73に記載の方法。
- ここで前記ヘマグルチニンは、ストークドメインを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方は、ノイラミニダーゼを含む、請求項36〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方は、核タンパク質(NP)を含む、請求項36〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M1を含む、請求項36〜78のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2を含む、請求項36〜79のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原は、マトリクスタンパク質M2eを含む、請求項36〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インフルエンザA標的抗原、前記インフルエンザB標的抗原、または両方は、BM2タンパク質、ヘマグルチニン、ヘマグルチニンストーク、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、マトリクスタンパク質M1、マトリクスタンパク質M2またはこれらの組み合わせをコードする配列と少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、99.5%、または100%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項36〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって5×1011 VP以下を投与するステップを包含する、請求項36〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、少なくとも1×108 ウイルス粒子(VP)であって1×1012 ウイルス粒子VP以下を投与するステップを包含する、請求項36〜82のいずれか1項に記載の方法。
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