CN116963768A - 优化的通用流感疫苗的设计、其设计和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了一种通用流感病毒疫苗。用于通用流感病毒疫苗的组合物包含至少两种，优选地超过两种，不同的流感血凝素(HA)衍生抗原。衍生所述抗原的HA蛋白具有位于位置52和277处的保守半胱氨酸之间的高变区，并且所述高变区在所述抗原中缺失。所述至少两种抗原各自与超过一种流感血清型的HA分子具有超过60或70或80的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。

Description

优化的通用流感疫苗的设计、其设计和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月18日提交的临时申请号63/115.459的优先权并且是其非临时申请，所述临时申请以引用方式整体并入本文。
序列表的提交
含有名称为Sequence_Listing的文件的序列表在此提供并以引用方式整体并入，所述文件大小为18千字节(在MS-Windows中测量)并于2021年11月18日创建。
技术领域
本公开内容涉及含有流感HA衍生抗原的组合物，所述抗原与超过一种甲型流感血清型具有高度相似性。在另一个实施方式中，本公开内容涉及用于通用流感疫苗的组合物。
背景技术
季节性流感、大流行性流感和高致病性禽流感(HPAI)源自大量鸟类和哺乳动物宿主。新的流感病毒变体可以以不可预测的排列快速重组。由于HPAI的微小基因变化可能会大大增加其传染性并允许有效的人与人之间传染，大流行性传播确实可能成为现实。
例如，H5N1 HPAI于2003年通过鸟与人之间传染在亚洲爆发。它传播到世界各地，埃及是其热点。亚洲最初的H5N1 HPAI毒株属于进化枝1，而更新的埃及毒株属于进化枝2(进化枝2.2.1)。首例H7N9 HPAI于2013年出现，随后在2016年和2017年出现了更多变种。美国联邦政府一直储备着基于鸡蛋的常规H5N1和H7N9疫苗。它们的免疫原性，尤其是Sanofi-Pasteur进化枝1H5N1疫苗的免疫原性，显著低于标准季节性流感疫苗的免疫原性。疫苗以初免-加强方案提供，并且进化枝2H5N1 GSK疫苗通过佐剂增强。其他问题是进化枝1和进化枝2H5N1疫苗之间的异源保护水平降低，以及免疫反应的短暂性，其可能会在6个月内失效。
已经提出用广泛反应性疫苗——所谓的“通用”流感疫苗来应对流感病毒的不可预测性。最有效的抗流感抗体(Ab)与血凝素(HA)头部结合并物理阻断与特定细胞受体的相互作用。此HA结构域的高度可变性提供了特异性，但限制了交叉反应性。更罕见的Ab识别高度保守的HA茎区域。它们与几种甲型流感病毒亚型广泛结合。茎抗体可能不是通过抑制细胞受体结合而是通过抑制病毒-膜融合，包括感染细胞的ADCC和阻止病毒进入细胞核来发挥作用。然而，目前的双抗原茎疫苗可能仅提供基础免疫力。此类双抗原茎疫苗基于两种不同的“保守”抗原，所述抗原与来自不同血清型流感的HA仅具有相对较低的相似性或“序列重叠”。因此，可能有必要用基于特定流感毒株的疫苗来增强通过双分子通用抗原诱导的免疫反应。一些科学证据还表明，广泛反应性Ab可能会有一些问题，诸如诱导疾病增强Ab会加重后续流感感染。
目前严重缺乏针对季节性和大流行性流感以及HPAI(以及其他新出现的传染性威胁)的免疫预防方法，因为以下问题在现有解决方案中尚未得到充分解决：
(1)效力：现有流感疫苗(包括储备的HP Al疫苗)仅提供适度和短暂的免疫保护。
(2)开发速度：目前流感疫苗的开发和生产计划缓慢，并且无法应对快速出现的流感(和其他传染性威胁)的挑战。
(3)流感毒株的变异性：流感具有快速改变其抗原组成的能力，并且需要不断开发新疫苗以应对新毒株和解决新的特异性。
需要开发更一致的“通用”疫苗，其使用衍生自流感血凝素的保守抗原，与不同血清型流感中发现的蛋白质保持高度相似性或保守性，并诱导有效的免疫反应。
经典病毒疫苗是使用缓慢且容量受限的受精卵技术作为减毒、灭活病毒或病毒提取物生产的。最近的组织培养方法包括在流感和ZIKV(寨卡病毒)疫苗的情况下，在细胞培养肉汤中进行病毒扩增和特定抗原的合成。基于蛋白质的疫苗固有的低免疫原性可以且必须通过添加佐剂来增强。
基因免疫方法不是递送完整的疫苗，而是迫使宿主合成抗原并将其呈递至免疫系统。这些系统更接近于模仿自然病毒感染。正在研究不同的策略。裸DNA疫苗虽然生产简单且快速，但需要相对较高的剂量和专门的递送系统来克服其低免疫原性。基因疫苗通常利用工程化病毒，诸如Ad、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、黄热病病毒和α病毒。然而，它们的基础生物学限制了其效用。它们可能具有致病性，例如17D黄热病病毒毒株与严重但罕见的不良反应有关。
除了裸DNA、AAV和RNA病毒作为基因转移的基础和疫苗载体平台，可以使用基于腺病毒(Ad)的方法。Ad衍生载体已被证明是良性的，避免了整合到宿主基因组中，并且本质上是佐剂化的。许多疫苗是在复制缺陷型、最低修饰的早期生成(例如)Ad载体的基础上工程化的。在与其他疫苗系统的直接比较中，它们一再证明具有更高的免疫原性。此外，已经证明它们还对禽流感和ZIKV产生了有效的免疫反应。重要的是，与其他疫苗系统相比，它们可以在较长时间段内提供持续的免疫保护。因此，他们对针对ZIKV、埃博拉、肺结核和疟疾的疫苗重新产生了兴趣。
开发了整合不同策略以克服早期Ad系统的局限性的Ad载体系统。完全缺失的(fd)Ad载体平台将疫苗基因组包装成具有低流行率的人血清型，诸如人血清型Ad6。此类疫苗完全缺失(fd)所有内源性Ad基因。fdAd载体更好地将免疫系统集中于疫苗抗原，最大限度地减少抗Ad免疫反应的干扰，并实现初免-加强疫苗接种。使用辅助病毒进行封装的fdAd载体系统与辅助病毒和具有复制能力的腺病毒(RCA)的污染有关。这些杂质有可能诱导有效的抗Ad反应。产生了一种新的fdAd构造——独立于辅助病毒(辅助病毒非依赖性，hi)包装fdAd的fdAd载体。这些是完全缺失的辅助病毒非依赖性Ad载体(fdhiAd载体)。
fdhiAd疫苗平台建立在两个可独立修改的组件之上：(i)缺失所有内源性Ad基因的fdAd载体基因组模块，和(ii)不可包装的环状包装表达质粒，其反式递送必需的Ad晚期基因。
为了获得缺失了所有内源性Ad基因的fdAd载体基因组，组装了fdAd载体基础模块以适应多至33kb的不同转基因构建体。它们携带不同Ad的左ITR和右ITR以及包装信号(ψ)。
完整的fdAd载体基因组模块大小约为34kb，并且通过将不可包装的包装表达质粒共转染到宿主细胞中进行封装。包装表达质粒提供组装衣壳、复制fdAd载体基因组模块及其整合到衣壳中所必需的所有反式Ad基因。不同的环状包装表达质粒已在修饰的pBR322骨架上被工程化用于人Ad物种C和B(血清型35)的衣壳。它们提供关键的反式晚期基因(L1、L2、L3、L4、L5)与早期基因E2和E4，并且缺失了包装信号ψ和至少一个ITR。
fdAd技术具有很大的有效载荷，可用于递送大型转基因构建体。例如，可以在单个fdAd载体中递送全长人凝血因子VIII cDNA和免疫抑制基因CD8(组合为12kb)。两种转基因在转导到细胞中后得到有效表达。因此，fdAd载体可以用作生产优化的通用流感疫苗的基础，所述疫苗可以递送超过两种保守流感抗原构建体。
目前的通用流感疫苗建立在两种保守的流感血凝素构建体之上。最初的通用流感疫苗的设计遵循两种抗体CR6261和CR8020的反应性模式，所述两种抗体与茎区α螺旋结构中的表位结合。针对此区域的抗体中和病毒颗粒。这些抗体似乎通过阻止全长HA经历pH诱导的融合至膜所必需的构象变化来抑制HA功能。CR6261和CR8020中和范围广泛的HA靶标，因为这些区域因其功能而高度保守。显示CR6261中和第1组亚型1、2、5、6、9、13和16中的HA。显示CR8020结合第2组HA的3、4、7、10、14和15。在这两组之后设计两种保守的血凝素抗原导致约为55％的平均序列同一性。尽管无头构建体是一种很有前途的通用流感疫苗方法，但技术问题阻碍了这种方法的更广泛发展。双抗原构建体方法的低同一性分数导致低亲和力免疫反应。此外，增加抗原构建体的数量以克服低序列重叠使得此方法困难且昂贵。无头HA不能形成可以在鸡蛋培养物中繁殖以被灭活为疫苗的活流感病毒。因此，它们必须通过另外的方式生产。
fdAd载体系统克服了这些生产问题。无头HA不需要在流感病毒或病毒样颗粒中起作用，它们只需要在体内的转导细胞中表达。此外，fdAd可以轻松地以它们的大负载递送超过两个HA构建体。fdAd疫苗的多价性不会显著增加工程化或生产的复杂性。因此，可以经济高效地生产多价通用流感疫苗。
发明内容
在一个实施方式中，本公开内容提供了用于疫苗的组合物。根据本公开内容的实施方式，用于疫苗的组合物包含至少两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原，其中衍生所述抗原的HA蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。
在一个实施方式中，相似性为至少70，或至少80。
在一个实施方式中，所述高变区被所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的肽接头替代。
在一个实施方式中，所述至少两种不同的流感HA衍生抗原是蛋白质。在另一个实施方式中，所述至少两种不同的流感HA衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述HA蛋白的RNA和DNA中的一种。在又一个实施方式中，所述RNA和DNA中的一种在病毒载体中。
在一个实施方式中，使用血清型H3的流感HA的氨基酸编号定位所述高变区在位置52和277处的保守半胱氨酸之间。
在另一个实施方式中，所述组合物包含超过两种不同的流感HA衍生抗原。
在一个实施方式中，本公开内容提供了一种用于生产通用流感病毒疫苗的方法。根据本公开内容的实施方式，一种用于生产通用流感病毒疫苗的方法包括获得第一流感HA衍生抗原，其与第一多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过embossexplorer cons程序计算的；以及获得第二流感HA衍生抗原，其与第二多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的，其中所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同的血清型组成。
在一个实施方式中，所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同且不重叠的血清型组成。
在一个实施方式中，衍生所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原的所述HA蛋白含有高变区，并且所述高变区从所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原中缺失。
在一个实施方式中，相似性独立地为至少70，或至少80。
在一个实施方式中，所述高变区被肽接头替代。
在一个实施方式中，所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原是蛋白质。在另一个实施方式中，所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述HA蛋白的RNA和DNA中的一种。在又一个实施方式中，所述方法包括将编码所述HA蛋白的所述RNA和DNA中的一种封装到病毒载体中。
在一个实施方式中，所述方法包括获得至少第三流感HA衍生抗原，其与第三多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。
在一个实施方式中，本公开内容提供了一种针对至少两种不同的流感血清型对动物进行疫苗接种的方法。根据本公开内容的实施方式，所述方法包括提供疫苗组合物，其包含至少两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原，其中衍生所述抗原的HA蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的；以及将所述疫苗组合物递送至动物。
序列表说明
SEQ ID NO.1：示出了如图1所示的红色流感血清型的共有序列。
SEQ ID NO.2：示出了如图1所示的橙色流感血清型的共有序列。
SEQ ID NO.3：示出了如图1所示的黄色流感血清型的共有序列。
SEQ ID NO.4：示出了如图1所示的绿色流感血清型的共有序列。
SEQ ID NO.5：示出了如图1所示的蓝色流感血清型的共有序列。
SEQ ID NO.6：示出了如图1所示的紫色流感血清型的共有序列。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。专利局将根据请求和必要费用的支付提供有彩色附图的本专利或专利申请出版物副本。
图1是分为六个同源组的代表性甲型流感血凝素蛋白的序列同一性的图示。
图2是血凝素蛋白系统发育树的图示。
图3是作为蛋白质序列的保守血凝素茎转基因构建体的图示。
图4是具有六组共有保守茎蛋白的代表性甲型流感血凝素蛋白的序列相似性的图示。
图5是完全缺失的辅助病毒非依赖性腺病毒载体平台的图解示意图。
具体实施方式
在详细解释本公开内容的任何实施方式之前，应理解的是，本公开内容的应用不限于在以下描述中阐述或在附图中说明的组分的构建细节和布置细节。本公开内容能够有其他实施方式并且能够以各种方式实践或进行。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应认为具有限制性。本文使用“包括”、“包含”或“具有”及其变化形式意指涵盖下文所列出的项目及其等效物以及附加项。本文使用“基本上包括”和“基本上由...组成”及其变化形式是指涵盖其后列出的项目，以及等效物和附加项，前提是此类等效物和附加项不会本质上改变整体的特性、用途或制造。本文使用“由......组成”及其变化形式意指包含其后列出的项目并且仅包含那些项目。
参考附图，相同的数字始终指代相同的元件。应当理解，尽管术语第一、第二等可以在本文中用来描述各种元件、组件、区域和/或部分，但这些元件、组件、区域和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语可能仅用来区分一个元件、组件、区域和/或部分与另一个元件、组件、区域和/或部分。因此，第一元件、组件、区域或部分在不背离本公开内容的情况下可以称为第二元件、组件、区域或部分。
本公开内容中的数值范围是近似值，因此除非另外说明，否则可以包括此范围之外的值。数值范围包括较低值和较高值和之间以一个单位为增量的所有值(除非另外特别说明)，只要在任一较低值和任一较高值之间存在至少2个单位的间隔即可。例如，如果组成、物理或其他特性(例如像组分按重量计的量等)是10至100，其是指所有单个值(诸如10、11、12等)和子范围(诸如10至44、55至70、97至100等)被明确列举。对于含有明确值的范围(例如，1或2或3至5或6或7的范围)，包括任何两个明确值之间的任何子范围(例如，上述范围1-7包括子范围1-2；2至6；5至7；3至7；5至6等)。对于含有小于一的值或含有大于一的小数(例如，1.1、1.5等)的范围，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1，视情况而定。对于含有小于十的个位数的范围(例如，1至5)，一个单位通常被认为是0.1。这些仅仅是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为在本公开内容中明确陈述。
可在本文使用空间术语(诸如“下方”、“在…之下”、“下部”、“上方”、“上部”及其类似者)以用于方便描述，从而描述一个元件或特征与另一个元件或特征的关系，如图中所示，应当理解空间相对术语旨在根据使用或图示中的方向涵盖不同的方向。例如，如果翻转附图中的装置，那么描述为在其他元件或特征“下方”或“之下”的元件就将定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以涵盖上方和下方的两个方向。装置可以以其他方式来定向(旋转90°或处于其他方向)，并且本文所使用的空间相关的描述词可以相应地进行解释。
如本文所用，术语“和/或”包括相关列举项目中的一个或多个的任何和所有组合。例如，当在短语诸如“A和/或B”中使用时，术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。一般来说，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域中众所周知且通常采用的那些。标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成以及微生物培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。一般来说，酶促反应和纯化步骤是根据制造商的说明进行的。这些技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献进行(一般参见Sambrook等人Molecular Cloning：a Laboratory Manual.第2版，(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其以引用方式并入本文)，其在整个文件中提供。单位、前缀和符号可以以他们的SI接受的形式来表示。除非另外说明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来表示。除非另外提供，如本文所用的软件、电气和电子术语如The New IEEE Standard Dictionary of Electrical andElectronics Terms(第5版，1993)中所定义。
本文公开的实施方式涉及多价通用甲型流感疫苗的设计、构建和生产。
如在整个公开中所采用的，除非另外说明，否则应理解以下术语具有以下含义并且通过参考整个说明书来更充分地定义。
如本文所用的术语“腺病毒”、“腺病毒病毒粒子”和“腺病毒颗粒”包括可以归类为腺病毒的任何和所有病毒，包括感染人或动物的任何腺病毒，包括所有组、亚组、种和血清型。
如本文所用的术语“腺病毒载体”包括基于腺病毒并用于转移遗传物质的任何遗传构建体或病毒构建体。如本文所用的术语“缺失的腺病毒”或“缺失的腺病毒载体”包括具有从其缺失的一个或多个内源性基因或基因片段的任何和所有腺病毒或腺病毒载体。相反，如本文所用的术语“完全缺失的腺病毒”和“完全缺失的腺病毒载体”包括所有内源性腺病毒基因和遗传物质除内部末端重复序列(ITR)和包装信号(ψ)外都从其缺失的任何和所有腺病毒和腺病毒载体。如本文所用的术语“腺病毒载体基因组”包括在腺病毒载体中存在的遗传物质。
“抗原”是指一种分子，其含有一个或多个表位，所述表位将刺激宿主的免疫系统以产生细胞抗原特异性免疫反应或体液抗体反应。因此，抗原包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、寡糖、多糖等。此外，抗原可衍生自任何已知的病毒、细菌、寄生虫、植物原生动物或真菌，并且可以是整个生物体。此术语还包括肿瘤抗原。类似地，诸如在DNA免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在抗原的定义中。还包括合成抗原，例如多表位抗原、侧翼表位抗原和其他重组或合成衍生抗原(Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:27772781；Bergmann等人(1996)J.Immunol.157:3242 3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.AndCell Biol.75:402 408；Gardner等人(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，Jun.28-Jul.3，1998)。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列为当置于适当调节序列(或“控制元件”)的控制下时在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止序列将可以位于编码序列的3’。编码序列的转录和翻译通常受“控制元件”调控，所述控制元件包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、Shine和Delagamo序列、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、用于优化翻译起始的序列(位于编码序列的5')和翻译终止序列。
如本文所用的术语“保守抗原”是指显示与在超过一种血清型的病毒中表达的基因变体相似的抗原。
如本文所用的术语氨基酸残基的“保守变体”反映了蛋白质中给定位置的氨基酸变化，其中氨基酸具有相似的生化特性，诸如电荷、疏水性和大小。
术语“构建体”是指作为腺病毒基因组或作为包装构建体的遗传组合物或根据本公开内容的组合物中的至少一种。
如本文所用的术语“缺失”或“缺失的”意指删除、清除或去除。
如本文所用的术语“缺失的Ad(病毒)载体”和“被掏空的”、“微型的”、“缺失的”、“DELTA”或“伪载体”是指具有ITR的线性载体模块。这些载体还可以编码一些结构和/或非结构基因序列和/或一种或多种感兴趣的基因或转基因。
术语“表达”是指细胞中内源性基因、转基因或编码区的转录和/或翻译。
“基因递送载体”、“GDV”、“基因转移载体”或“基因转移媒介物”是包含本公开内容的包装载体模块的组合物。
如本文所用，术语“基因表达构建体”是指启动子、感兴趣基因的至少一个片段和聚腺苷酸化信号序列。本公开内容的载体模块可以包含基因表达构建体。
如本文所用的术语“感兴趣的基因”、“GOI”和“转基因”是指编码其功能具有医学意义的基因并且可能不是天然黄病毒基因的基因。感兴趣的基因可以是在RNA或蛋白质水平发挥其作用的基因。感兴趣的基因的实例包括但不限于治疗基因、免疫调节基因、病毒基因、细菌基因、蛋白质生产基因、抑制性RNA或蛋白质以及调节蛋白。
“基因序列”是指核苷酸的顺序。基因序列可以调节。基因表达的调节可以通过以下之一来完成：(1)改变基因结构：位点特异性重组酶(例如，基于Cre-loxP系统的Cre)可以通过去除启动子和基因之间的插入序列来激活基因表达；(2)改变转录：通过诱导(覆盖)或抑制解除；(3)改变mRNA稳定性：通过在mRNA中掺入特定序列或通过siRNA；以及(4)改变翻译：通过mRNA中的序列。缺失的腺病毒也称为“高容量”腺病毒。这些缺失的腺病毒可以容纳至多33kb的基因序列。
术语“无头血凝素”是指由血凝素茎组成的血凝素构建体。
术语“血凝素茎”或“茎区”是指流感血凝素蛋白的结构组分，其相对不变并且不含流感血凝素的遗传高变区。
术语“异源”用于通常不与自然密切相关的DNA序列的任何组合。
术语“同源”是指在一对结构或基因之间存在共同的祖先。
“宿主细胞”或“包装细胞”是能够包装腺病毒或腺病毒载体基因组或修饰的基因组以产生病毒颗粒的细胞。它可以被工程化以提供缺少的基因产物或其等同物。因此，包装细胞能够将腺病毒基因组包装成腺病毒颗粒。此类颗粒的产生需要复制基因组，并产生组装感染性病毒所必需的那些蛋白质。颗粒还可能需要病毒颗粒成熟所必需的某些蛋白质。此类蛋白质可以由载体、包装构建体或由包装细胞提供。可以用于制备根据本公开内容的ap包装细胞系的示例性宿主细胞(HC)包括但不限于A549、HeLa、MRC5、W138、CHO细胞、Vero细胞、人胚胎视网膜细胞或任何真核细胞，只要宿主细胞允许腺病毒生长。一些宿主细胞系包括脂肪细胞、软骨细胞、上皮细胞、成纤维细胞、胶质母细胞瘤、肝细胞、角质形成细胞、白血病、淋巴母细胞、单核细胞、巨噬细胞、成肌细胞和神经元。其他细胞类型包括但不限于衍生自原代细胞培养物的细胞，例如人原代前列腺细胞、人胚胎视网膜细胞、人干细胞。真核二倍体和非整倍体细胞系包括在本公开内容的范围内。包装细胞必须是能够以适合这些产物的水平表达本文所述的不同构建体的产物的细胞，以生成高滴度的重组病毒载体原液。
“免疫反应”是获得性免疫反应，诸如细胞或体液免疫反应。
在本公开内容的上下文中，“免疫调节分子”是一种多肽分子，其以抗原特异性方式调节(即增加或减少)针对靶细胞的细胞和/或体液宿主免疫反应，并且优选地是降低宿主免疫反应的一种。一般来说，根据本公开内容的教导，免疫调节分子将与靶细胞表面膜结合，例如，其在从本文所述的GDV表达后插入细胞表面膜或与其共价或非共价结合。
如本文所用的术语“流感病毒”、“流感病毒粒子”和“流感颗粒””包括可以归类为流感病毒的任何和所有病毒，包括感染人或动物的任何流感病毒，包括所有组、亚组和血清型。
如本文所用的术语“引入”或“转染”是指将表达载体递送至宿主细胞。可以通过以下方式将载体引入细胞：转染，这通常意指通过物理方式(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂转染)将异源DNA或RNA插入到细胞中；感染，这通常是指通过感染因子(即，病毒)引入；或转导，这通常意指用病毒稳定感染细胞或通过病毒剂(例如，噬菌体)将遗传物质从一种微生物转移到另一种微生物。载体可以是质粒病毒或其他载体。
术语“线性DNA”是指非环化DNA分子。术语“线性RNA”是指非环化RNA分子。
如本文所用的术语“天然地”是指在自然界中存在的事物；野生型；先天的或固有的。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且涵盖已知的具有天然核苷酸基本性质的类似物，除非另有限制，因为它们以类似于天然存在的核苷酸(例如，肽核酸)的方式与单链核酸杂交。当与另一个核酸序列处于功能关系中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的。然而，增强子不需要是连续的。连接是通过连接于适宜的限制位点处来达成。如果这些位点不存在，那么根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
如本文所用的术语“非结构基因”是指存在于腺病毒基因组中的一组基因。这些基因编码“非结构基因”。
术语“包装构建体”或“包装表达质粒”是指环状双链DNA分子的工程化质粒构建体，其中DNA分子包括至少一个亚组的在启动子控制下的腺病毒结构或非结构基因。“包装构建体”不包含超过一个ITR或遗传信息以使病毒能够独立复制以产生感染、病毒颗粒和/或此遗传物质的有效包装，所述遗传物质被包装到病毒颗粒中。
“允许的”细胞支持病毒的复制。
如本文所用的术语“质粒”是指与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情况下，它是圆形的并且是双链的。
术语“多接头”是指一小段人工合成的DNA，其携带许多独特的限制性位点，使得可以轻松插入任何启动子或DNA片段。
术语“启动子”意指促进特定基因转录的DNA调节区。“启动子”通常包含TATA框，所述TATA框能够引导RNA聚合酶II以在特定编码序列的适当转录起始位点处引发RNA合成。启动子可能另外包含其他识别序列，一般位于TATA框的上游或5'，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。“组成型启动子”是指允许其相关基因在许多细胞类型中连续转录的启动子。“诱导型启动子系统”是指使用调节剂(包括小分子诸如四环素、肽和类固醇激素、神经递质以及环境因素诸如热量和渗透压)以诱导或沉默基因的系统。此类系统是“模拟”的，因为它们的反应是渐进的，取决于调节剂的浓度。而且，此类系统随着调节剂的撤出是可逆的。这些启动子的活性是由生物或非生物因子的存在或不存在来诱导的。诱导型启动子是遗传工程化中的有用工具，因为可操作地连接至它们的基因的表达可以在有机体的特定发育阶段或在特定组织中被启动或停止。
如本文所用的术语“繁殖”或“繁殖的”是指通过任何过程在数量、量或程度上的复制、倍增或其他增加。
如本文所用的术语“纯化”是指纯化或除去基本上大部分、大部分、基本上所有或所有外来的、外部的或不合适的元件的过程。
“调节序列”、“调节区域”或“调节元件”是启动子、增强子或其他DNA区段，其中调节蛋白诸如转录因子优先结合。它们控制基因表达，从而控制蛋白质表达。
如本文所用的术语“重组酶”是指催化基因重组的酶。重组酶催化两条长DNA链之间的短DNA片段交换，特别是配对的母本和父本染色体之间同源区域的交换。
“限制性酶”或“限制性核酸内切酶”是切割双链DNA的酶。
术语“限制性位点”或“限制性识别位点”是指被限制性酶识别为切割DNA分子的位点的特定核苷酸序列。这些位点一般但不一定是回文的(因为限制性酶通常结合为同二聚体)，并且特定的酶可能会在其识别位点内或附近某处的两个核苷酸之间切割。
术语“复制”或“正在复制”意指制作对象的相同副本，所述对象例如但不限于病毒颗粒。
如本文所用，术语“复制缺陷型”是指病毒不能在自然环境中复制的特征。复制缺陷型病毒是已缺失其复制所必需的一个或多个基因(例如像但不限于El基因)的病毒。复制缺陷型病毒可以在实验室中在表达缺失基因的细胞系中繁殖。
如本文所用的术语“相似性”或“序列相似性”是指蛋白质序列之间的经验关系的量度。如本文所用的相似性分数描述了给定蛋白质内氨基酸残基之间的进化距离的近似值从而描述了氨基酸残基的相似性和/或鉴定。
如本文所用，术语“结构基因”,是指存在于腺病毒基因组中形成腺病毒衣壳的一组基因。
术语“填充片段”是指插入另一个DNA或RNA序列以增加其大小的DNA或RNA序列。填充片段通常不编码任何蛋白质，也不包含基因表达的调节元件，诸如转录增强子或启动子。
如本文所用的术语“靶标”或“靶向的”是指生物实体，例如像但不限于蛋白质、细胞、器官或核酸，其活性可通过外部刺激改变。根据刺激的性质，靶标可能没有直接变化，或者可能诱导靶标发生构象变化。
术语“转染”是指指令进入细胞遗传物质如DNA或RNA(例如，引入分离的核酸分子或本公开内容的构建体)。如本文所用的术语“转导”是指作为DNA或通过本公开内容的GDV的方式引入细胞DNA。本公开内容的GDV可以被转导到靶细胞中。
如本文所用的术语“通用流感疫苗”是指携带抗原的流感疫苗，所述抗原可以在人和动物中诱导针对超过一种血清型或多种流感血清型的流感病毒的免疫反应。
如本文所用的术语“非翻译区”是指不编码蛋白质的RNA部分。
术语“载体”是指用于感染宿主细胞并且多核苷酸可以插入其中的核酸。载体通常是复制子。表达载体允许转录插入其中的核酸。一些常见的载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体、重组表达盒和转座子。术语“载体”还可以指有助于将基因从一个位置转移到另一个位置的元件。
术语“载体模块”是指包装在腺病毒病毒粒子中的腺病毒遗传组合物。
如本文所用的术语“病毒DNA”或“病毒RNA”是指在病毒颗粒中存在的DNA或RNA序列。
如本文所用，“病毒基因组”是在病毒颗粒中存在的DNA或RNA的总和，并且其含有病毒复制所需的所有元件。基因组在病毒复制的每个周期被复制并传递给病毒后代。
如本文所用，术语“病毒粒子”是指病毒颗粒。每个病毒粒子都由保护性蛋白质衣壳内的遗传物质组成。
如本文所用，术语“野生型”是指自然界中存在的生物体、品系、基因、蛋白质、核酸或特征的典型形式。野生型是指自然群体中最常见的表型。术语“野生型”和“天然存在的”可互换使用。
根据本公开内容的实施方式，提供了通用流感疫苗。
在一个实施方式中，通用流感疫苗是包含一组抗原的多聚体疫苗，此组抗原含有至少两种，优选地超过两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原。血凝素是一种存在于流感病毒表面的糖蛋白，并且是病毒的传染性所必需的。
衍生自流感HA的抗原可以是编码所有或部分流感HA的DNA序列或RNA序列，或者是所有或部分流感HA本身的蛋白质序列。
流感HA具有位于在如使用血清型H3的流感血凝素的氨基酸编号编号的位置52和277处的保守半胱氨酸之间的高变区。在一个实施方式中，缺失对应于高变区的抗原的DNA、RNA或蛋白质序列。
在一个实施方式中，HA高变区被肽接头(或对应于肽接头的DNA或RNA序列)替代以增加无头血凝素构建体的稳定性和细胞表面表达。示例性非限制性肽接头是(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS(或(GGGGS)4)。
在一个实施方式中，流感HA衍生抗原基于无头流感血凝素蛋白。
在一个实施方式中，至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生抗原由与超过一种流感血清型的HA序列(DNA、RNA或蛋白质)具有相似性分数超过至少60，或65，或70，或75，或80，或85，或90的相似性的序列(DNA、RNA或蛋白质)组成，如通过embossexplorer cons程序计算的。相似性分数基于在不同HA的对应位置存在相同的氨基酸残基(或各自的编码DNA或RNA)以及在不同HA的对应位置存在氨基酸残基的保守变体(或各自的编码DNA或RNA)。图1通过根据HA茎区的序列同一性对HA进行比对和分组，提供了流感HA和相似性分数的视觉图示。
在一个实施方式中，甲型流感的某些血清型的代表性血凝素用于不同血凝素的比对。示例性代表性甲型流感血清型包括但不限于：
H1：A/California/48/2017(H1N1)
H2：A/Moscow/1019/1965(H2N2)
H3：A/Washington/16/2017(H3N2)No 8
H4：A/鸭/Guangdong/DGQTSJ147P/2015(H4N8)
H5：A/疣鼻天鹅/Belgium/1567/2017(H5N8)
H6：A/绿翅鸭/Tennessee/17OS0651/2017(H6N1)
H7：A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)
H8：美国黑鸭/Illinois/4119/2009(H8N4)
H9：A/日本鹌鹑/Vietnam/4/2009(H9N2)
H10：A/美国黑鸭/Alberta/118/2016(H10N7)
H11：A/鸭/Memphis/546/1974
H12：美国黑鸭/New Brunswick/00998/2010(H12N6)
H13：美国白鹈鹕/Minnesota/Sg-0611/2008(H13N9)
H14：A/琵嘴鸭/Missouri/16OS6248/2016(H14N7)
H15：A/鸭/Bangladesh/24704/2015(H15N9)
H16：A/灰翅鸥/Southcentral Alaska/l6MB03160/2016(H16N3)
H17：A|H17N10|09|2010|A/little_yellow_shouldered_bat/Guatemala/060/2010
H18：4|HA|A|A/dark_fruit_eating_bat/Bolivia/PBV780_781/2011
在另一个实施方式中，如本文所用的相似性分数描述了给定蛋白质之间的进化距离的近似值(从而描述了给定蛋白质内氨基酸残基的相似性和/或鉴定)。基于此数据，创建了不同血凝素血清型的系统树，其将不同血凝素的进化联系和距离描述为系统发育树(图2)。
在另一个实施方式中，基于这些相似性分数设计了几个保守的无头血凝素蛋白构建体。保守构建体的示例性肽序列示于图3，这些序列相对于甲型流感血凝素的序列相似性示于图4。
如本文所述，通用流感病毒疫苗包括一组抗原，其由至少两种或优选地超过两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原组成。在一个实施方式中，至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生抗原是至少两种，并且优选地超过两种保守的无头血凝素蛋白构建体，其选自图3中提供的序列或选自序列conHA1、conCHA2、conHA3、conH4、conH5和conH6。在一个实施方式中，至少两种或优选地超过两种地抗原以疫苗的形式提供给人和/或动物。
在一个实施方式中，至少两种或优选地超过两种流感HA衍生抗原作为蛋白质提供，与病毒样颗粒组合，以纳米颗粒递送，以乳液递送，它们的序列作为转基因整合到DNA或RNA中疫苗或它们的序列整合到病毒载体中。图5是病毒载体模型的示意图。
在另一个实施方式中，本公开内容的疫苗在存在或不存在免疫增强部分(诸如但不限于疫苗佐剂和白细胞介素)的情况下在使用疫苗配制的标准方法配制的合适的药物载剂中递送流感HA衍生抗原。
在另一个实施方式中，一种或多种流感HA衍生抗原构建体作为疫苗通过不同的应用途径递送至人和动物，所述应用途径包括但不限于肌内、鼻内、皮内、皮下、口服、直肠内或细支气管内。
在另一个实施方式中，一种或多种流感HA衍生抗原构建体作为腺病毒载体中的转基因构建体递送。
在另一个实施方式中，一种或多种流感HA衍生抗原构建体作为完全缺失的腺病毒载体(诸如但不限于完全缺失的辅助病毒非依赖性腺病毒载体)中的转基因构建体递送。
在另一个实施方式中，一种或多种流感HA衍生抗原构建体含有启动子和聚腺苷酸化位点。在另一个实施方式中，转基因构建体通过内部核糖体进入位点连接。在另一个实施方式中，转基因构建体编码超过一种流感HA衍生抗原构建体，其通过内部核糖体进入位点连接。在另一个实施方式中，转基因构建体编码超过一种流感HA衍生抗原构建体，其通过接头自消化酶连接或可被蛋白质消化酶消化。
在另一个实施方式中，流感HA衍生抗原构建体的转基因构建体在载体内编码，诸如但不限于作为复制有效RNA的腺病毒载体，诸如但不限于α病毒复制子。
在一个实施方式中，提供了生产通用流感疫苗的方法。在实施方式中，方法包括获得至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生抗原，其与超过一种流感血清型的HA分子具有相似性分数超过至少60，或65，或70，或75，或80，或85，或90的相似性。然后将至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生抗原提供为编码HA抗原的DNA序列、编码HA抗原的RNA序列或蛋白质序列以包含在疫苗组合物中。至少两种，并且优选地超过两种流感HA衍生抗原可以根据本文提供的任何实施方式或实施方式的组合。至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生抗原可以以病毒载体的形式提供以包含在疫苗组合物中。
在一个实施方式中，一种针对至少两种，并且优选地超过两种甲型流感病毒亚型对动物(包括例如人)进行疫苗接种的方法包括提供包含至少两种，并且优选地超过两种不同的流感HA衍生蛋白抗原的疫苗组合物。
实施例
实施例1-设计流感HA衍生抗原
比对不同血清型的流感HA的蛋白质序列实施例的蛋白质序列。实施例中使用的蛋白质序列来自以下甲型流感亚型：
H1：A/California/48/2017(H1N1)
H2：A/Moscow/1019/1965(H2N2)
H3：A/Washington/16/2017(H3N2)No 8
H4：A/鸭/Guangdong/DGQTSJ147P/2015(H4N8)
H5：A/疣鼻天鹅/Belgium/1567/2017(H5N8)
H6：A/绿翅鸭/Tennessee/17OS0651/2017(H6N1)
H7：A/Guangdong/HP001/2017(H7N9)
H8：美国黑鸭/Illinois/4119/2009(H8N4)
H9：A/日本鹌鹑/Vietnam/4/2009(H9N2)
H10：A/美国黑鸭/Alberta/118/2016(H10N7)
H11：A/鸭/Memphis/546/1974
H.12：美国黑鸭/New Brunswick/00998/2010(H12N6)
H13：美国白鹈鹕/Minnesota/Sg-0611/2008(H13N9)
H14：A/琵嘴鸭/Missouri/16OS6248/2016(H14N7)
H15：A/鸭/Bangladesh/24704/2015(H15N9)
H16：A/灰翅鸥/Southcentral Alaska/l6MB03160/2016(H16N3)
H17：A|H17N10|09/2010|A/1ittle_yellow_shouldered_bat/Guatemala/060/2010
H18：4|HA|A|A/dark_fruit_eating_bat/Bolivia/PBV780_781/2011
基于对不同HA血清型的相似性的分析，将血清型分为六个相似性组，如图1和2所示。从fludg.org下载HA序列。去除不完整的序列用于分析。使用MAFFT在线服务器第7版：https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/large.html？aug31对剩余序列进行比对。使用以下设置用于分析：
i.FFT-NS-2
ii.内存使用：正常
iii.氨基酸序列的评分矩阵：BLOSUM62
iv.空位开放罚分：5
基于这种比对，HA血清型被分为以下组：
通过这些比对，每个不同HA组的整个HA蛋白内氨基酸残基的同一性率超过所分析的HA蛋白的63.7％同一性值，如图1所示。
实施例2-流感HA衍生抗原的序列
基于实施例1的分析，针对HA的保守区域开发了不同HA血清型的共有蛋白质。H1至H18的每个HA血清型组的共有序列来源于emboss explorer cons：http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cons。使用以下设置：
i.多重校验设置为1
ii.位置所需的鉴定数量：1
在第1步中，开发了18种HA血清型中每一种的共有序列。所述序列可在fludb.org中找到。
以下数量的序列用于推导相应的HA血清型共有序列：
H1：22868
H2：622
H3：25600
H4：1932
H5：5694
H6：1745
H7：2743
H8：150
H9：3885
H10：1236
H11：670
H12：210
H13：6856
H14：31
H15：21
H16：268
H17：3
H18：2
第1步：一旦鉴定了HA共有序列，就可以通过以下方式确定六个组中每个组的共有序列的无头版本：
(a)将18个代表性共有序列用生物编辑中的clustal W比对
(b)普遍保守的半胱氨酸在60位被鉴定为缺失前的残基
(c)在287-290位附近(距普遍保守的GLFGAIA序列约100aa)的普遍保守的CxxxC被鉴定并用作无头缺失的末端
(d)(c)中两个半胱氨酸之间的区域缺失并替代为GGGG或(GGGGS)n，n≥1
在图3中，蛋白共有序列的大小与单体肽接头一起列出。
实施例3-保守的HA区域共有序列的相似性
将图3中示出的六个蛋白质共有序列与分配给每个共有序列的HA血清型的HA蛋白序列进行比对。相似率的计算考虑了氨基酸同一性以及给定位置氨基酸残基中保守氨基酸变化的相似性。分数是用emboss explorer cons程序计算的并提供于图4。值得注意的是，在所有情况下的分数都超过83。
实施例4-设计和构建六种保守的通用流感HA衍生抗原构建体的携带转基因的完 全缺失的Ad病毒载体
fdAd载体缺失所有内源性ad基因。Ad基因组中的空间可以容纳长度多至33kb的转基因构建体。fdAd载体基因组仅携带对应于腺病毒反向末端重复序列(ITR)和Ad包装信号的腺病毒序列，诸如腺病毒ψ。
fdAd病毒载体基因组被包装到宿主或包装细胞中的腺病毒衣壳中，所述宿主细胞或包装细胞具有通过第二遗传构建体封装所必需的基因组所必须的缺失的腺病毒基因。所述第二基因构建体可以由但不限于辅助病毒构建体或包装表达质粒提供。
在一个实施例中，一旦线性化，fdAd载体基因组就与携带编码人血清型6的Ad衣壳的基因的包装表达质粒共转染到宿主细胞中，诸如但不限于如图5所示的人胚肾细胞系HEK-293的细胞。封装的腺病毒载体一旦从细胞中释放出来就被纯化并用于例如疫苗接种。
在一个实施方式中，fdAd携带编码六个共有序列的转基因构建体。产生具有以下组成的三个转基因表达盒：
第1：巨细胞病毒启动子增强子序列，然后是编码H-I(红色)共有蛋白的转基因，然后是内部核糖体进入位点，然后是编码H-II(橙色)共有蛋白的转基因，然后是聚腺苷酸化位点。
第2：巨细胞病毒启动子增强子序列，然后是编码H-III(黄色)共有蛋白的转基因，然后是内部核糖体进入位点，然后是编码H-IV(绿色)共有蛋白的转基因，然后是聚腺苷酸化位点。
第3：巨细胞病毒启动子增强子序列，然后是编码H-V(蓝色)共有蛋白的转基因，然后是内部核糖体进入位点，然后是编码H-VI(紫色)共有蛋白的转基因，然后是聚腺苷酸化位点。
三个转基因构建体第1、第2和第3被移入完全缺失的腺病毒载体基因组中。
实施例5–用携带六种保守的通用无头HA蛋白构建体的转基因的fdAd载体免疫人 或动物的方案
携带六种共有保守HA蛋白的转基因的fdAd载体被封装成Ad转录物，如实施例4中所述。其悬浮在生理溶液中，并且用于免疫人和/或动物。为此目的，其通过但不限于经由肌内、皮内、皮下注射途径或通过其他途径，诸如但不限于鼻内或口服途径递送至接受者。
在已经暴露于此腺病毒载体的人和动物中诱导体液和细胞免疫反应。这些免疫反应保护人和动物免受属于任何甲型流感血清型成员的流感病毒的攻击。
虽然本文已经详细描述了通用流感疫苗和相关方法的多个实施实施方式，但显而易见的是，对其进行修改和变型是可能的，所有这些都落入本发明的实质精神和范围内。此外，因为许多修改和改变将容易被本领域技术人员考虑到，所以不希望将本发明限制于示出和描述的精确结构和操作，因此所有合适修改和等同物均可以被视为落入本公开内容的范围内。
序列表
<110> 格雷菲克斯公司(Greffex, Inc.)
<120> 优化的通用流感疫苗的设计、其设计和用途
<130> 543346.13
<150> US 63/115,459
<151> 2020-11-18
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 343
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 1
Met Asn Thr Gln Ile Leu Ala Phe Ala Leu Leu Gly Ile Ala Val Thr
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr
20 25 30
Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Lys Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Thr Val Glu Ser Thr Ser Leu Lys Asp Ile Cys Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Cys Glu Gly Glu Cys Phe Tyr Ser Gly Gly Thr Ile Asn Ser Lys Leu
65 70 75 80
Pro Phe Gln Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr
85 90 95
Val Lys Gln Lys Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro
100 105 110
Glu Val Ala Lys Arg Lys Arg Gln Ala Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile
115 120 125
Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr
130 135 140
Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg
165 170 175
Leu Ile Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe
180 185 190
Ser Glu Val Glu Gln Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp
195 200 205
Ser Ile Thr Glu Ile Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met
210 215 220
Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly
245 250 255
Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asn Cys Met Glu
260 265 270
Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Thr Gln Tyr Arg Glu Glu Ala
275 280 285
Leu Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr
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Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Val Leu
305 310 315 320
Leu Ala Ile Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn
325 330 335
Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile
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<211> 355
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 2
Met Leu Ser Ile Ile Val Leu Ser Leu Ile Leu Ala Glu Thr Ser Ala
1 5 10 15
Gln Lys Ile Ser Asn Asn Asp Thr Gly Asn Pro Val Ile Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Leu Thr Asn Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Val Ser Ala Gln Glu Leu Val Glu Ser Ser Asn Ile
50 55 60
Asp Glu Leu Cys Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ser Glu Cys Ile Thr Asp
65 70 75 80
Lys Gly Ser Ile Ser Ser Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Ser Arg Ile
85 90 95
Ala Ile Gly Asp Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Ser Ser Leu Lys Leu
100 105 110
Ala Thr Gly Met Arg Asn Ile Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe
115 120 125
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Gln Gly Leu Ile Asp
130 135 140
Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Glu Gly Thr Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys
165 170 175
Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Tyr His Gln Ile Glu
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210 215 220
Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Val Thr Asp Ser Glu Met
225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Glu Arg Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu
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<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 3
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1 5 10 15
Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys
20 25 30
Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
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50 55 60
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65 70 75 80
Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp
165 170 175
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195 200 205
Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu
210 215 220
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Val Arg Met Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys
245 250 255
Phe Glu Phe Tyr Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn
260 265 270
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg
275 280 285
Glu Lys Ile Glu Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile
290 295 300
Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Met
305 310 315 320
Ile Ala Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
325 330 335
Arg Ile Cys Ile Ile Cys Glu Leu Arg Leu Leu
340 345
<210> 4
<211> 339
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 4
Met Glu Lys Phe Ile Leu Ile Ser Ile Leu Leu Ala Ala Thr Val Ala
1 5 10 15
Asn Tyr Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asn Thr Leu Ile Glu Gln Asn Val Pro Val Thr Gln Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Val His Thr Glu Lys Asn Pro Val Leu Cys Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Cys Thr Thr Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Ala Leu Asn Thr Ser Lys
65 70 75 80
Pro Phe Gln Asn Val Ser Lys His Tyr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr
85 90 95
Ile Pro Ser Ala Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro
100 105 110
Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
115 120 125
Gly Gly Trp Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser
130 135 140
Asn Ser Glu Gly Thr Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met
165 170 175
Asn Lys Gln Phe Glu Val Val Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Ser
180 185 190
Arg Ile Asn Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile
195 200 205
Trp Ala Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr
210 215 220
Leu Asp Glu His Asp Ala Asn Val Arg Asn Leu Tyr Asp Lys Val Lys
225 230 235 240
Arg Ala Leu Ser Ser Asn Ala Ile Asp Thr Gly Asn Gly Cys Phe Glu
245 250 255
Ile Leu His Lys Cys Asp Asn Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly
260 265 270
Thr Tyr Asn His Arg Glu Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln
275 280 285
Lys Ile Asn Gly Val Lys Leu Glu Glu Asn Ser Thr Tyr Lys Ile Leu
290 295 300
Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Leu Met Ile
305 310 315 320
Ala Gly Gly Leu Ile Phe Gly Met Gln Asn Gly Ser Cys Arg Cys Thr
325 330 335
Phe Cys Ile
<210> 5
<211> 340
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 5
Met Glu Val Lys Leu Leu Phe Ile Leu Ile Ile Val Tyr Gly Val Lys
1 5 10 15
Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Leu Ser Asn Asn Ser Thr Asp Lys
20 25 30
Val Asp Thr Leu Ile Glu Asn Asn Val Pro Val Thr Ser Ser Val Asp
35 40 45
Leu Val Glu Thr Asn His Thr Gly Thr Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Cys
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Asn Thr Lys Cys Gln Thr Ser Val Gly Gly Ile Asn Thr Asn Lys Thr
65 70 75 80
Phe Gln Asn Ile Glu Arg Asn Ala Ile Gly Asp Cys Pro Lys Tyr Ile
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Lys Ser Gly Gln Leu Lys Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser
100 105 110
Ile Ala Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Phe Ile Glu
115 120 125
Gly Gly Trp Pro Gly Leu Ile Asn Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Gln
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Asn Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys
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Ala Ile Asp Gln Ile Thr Thr Lys Ile Asn Asn Ile Ile Glu Lys Met
165 170 175
Asn Gly Asn Tyr Asp Ser Ile Arg Gly Glu Phe Asn Gln Val Glu Glu
180 185 190
Arg Ile Asn Met Leu Ala Asp Arg Val Asp Asp Ala Val Thr Asp Val
195 200 205
Trp Ser Tyr Asn Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Asp Lys Thr
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Leu Asp Leu His Asp Ala Asn Val Arg Asn Leu His Asp Gln Val Arg
225 230 235 240
Arg Ala Leu Lys Asn Asn Ala Ile Asp Glu Gly Asn Gly Cys Phe Asn
245 250 255
Leu Leu His Lys Cys Asn Asp Ser Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly
260 265 270
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275 280 285
Glu Ile Glu Gly Ile Lys Leu Lys Ser Glu Asp Asn Val Tyr Lys Ile
290 295 300
Leu Ser Ile Tyr Ser Cys Ile Ala Ser Ser Val Val Leu Val Gly Leu
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Ile Leu Ala Phe Ile Met Trp Ala Cys Ser Ser Gly Asn Cys Arg Phe
325 330 335
Asn Ile Cys Ile
340
<210> 6
<211> 339
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 6
Met Glu Leu Ile Val Leu Leu Ile Leu Leu Asn Pro Tyr Thr Phe Val
1 5 10 15
Leu Gly Asp Arg Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ala Asn Gln Asn Asn Gln
20 25 30
Thr Val Asn Thr Leu Leu Glu Gln Asn Val Pro Val Thr Gly Ala Gln
35 40 45
Glu Ile Leu Glu Thr Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Cys Ser Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Leu Asn Ser Thr Leu
65 70 75 80
Pro Phe Gln Asn Val His Gln Gln Thr Ile Gly Asn Cys Pro Lys Tyr
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100 105 110
Gln Met Glu Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
115 120 125
Gly Gly Trp Gln Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Glu
130 135 140
Asn Gln Glu Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ala Thr Gln Lys
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Ala Val Asp Ala Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met
165 170 175
Asn Ser Gln Phe Glu Ser Asn Ile Lys Glu Phe Asn Arg Leu Glu Leu
180 185 190
Arg Ile Gln His Leu Ser Asp Arg Val Asp Asp Ala Leu Leu Asp Ile
195 200 205
Trp Ser Tyr Asn Thr Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Leu Asp Phe His Asp Ala Asn Val Lys Asn Leu Phe Glu Lys Val Lys
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Ala Gln Leu Lys Asp Asn Ala Ile Asp Glu Gly Asn Gly Cys Phe Leu
245 250 255
Leu Leu His Lys Cys Asn Asn Ser Cys Met Asp Asp Ile Lys Asn Gly
260 265 270
Thr Tyr Lys Tyr Met Asp Tyr Arg Glu Glu Ser His Ile Glu Lys Gln
275 280 285
Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Thr Asp Tyr Ser Arg Tyr Tyr Ile Met
290 295 300
Thr Leu Tyr Ser Thr Ile Ala Ser Ser Val Val Leu Gly Ser Leu Ile
305 310 315 320
Ile Ala Ala Phe Leu Trp Gly Cys Gln Lys Gly Ser Ile Gln Cys Lys
325 330 335
Ile Cys Ile

Claims (20)

1.一种用于疫苗的组合物，所述组合物包含：
至少两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原，其中衍生所述抗原的HA蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述相似性为至少70。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述相似性为至少80。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述高变区被所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的肽接头替代。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原是蛋白质。
6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述HA蛋白的RNA和DNA中的一种。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述RNA和DNA中的一种在病毒载体中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中使用血清型H3的流感HA的氨基酸编号定位所述高变区在位置52和277处的保守半胱氨酸之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其包含超过两种不同的流感HA衍生抗原。
10.一种用于生产通用流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：
获得第一流感HA衍生抗原，其与第一多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的；以及
获得第二流感HA衍生抗原，其与第二多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的，
其中所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同的血清型组成。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同且不重叠的血清型组成。
12.如权利要求10-11中任一项所述的方法，其中衍生所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原的所述HA蛋白含有高变区，并且所述高变区从所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原中缺失。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述相似性独立地为至少70。
14.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述相似性独立地为至少80。
15.如权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述高变区被肽接头替代。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原是蛋白质。
17.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述第一流感HA衍生抗原和所述第二流感HA衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述HA蛋白的RNA和DNA中的一种。
18.如权利要求17所述的方法，其包括将编码所述HA蛋白的所述RNA和DNA中的一种封装到病毒载体中。
19.如权利要求10-18中任一项所述的方法，其包括获得至少第三流感HA衍生抗原，其与第三多种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过embossexplorer cons程序计算的。
20.一种针对至少两种不同的流感血清型对动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括：
提供疫苗组合物，其包含至少两种不同的流感血凝素(HA)衍生抗原，其中衍生所述抗原的HA蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感HA衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的HA分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的；
以及将所述疫苗组合物递送至动物。
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