KR20140068260A - 식물에서 바이러스-유사 입자 수득율을 증가시키는 방법 - Google Patents

식물에서 바이러스-유사 입자 수득율을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

식물에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 제1 핵산 및 제2 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계를 포함한다. 제1 핵산은 식물에서 활성이고 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함한다. 제2 핵산은 식물에서 활성이고 채널 단백질, 예를 들어, 하지만 제한 없이, 양성자 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함한다. 식물 또는 식물의 일부는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배양되고, 이로 인해 VLP를 생산한다.

Description

식물에서 바이러스-유사 입자 수득율을 증가시키는 방법{INCREASING VIRUS-LIKE PARTICLE YIELD IN PLANTS}
본 발명은 식물에서 바이러스 단백질을 생산하는 것과 관련된다. 더 구체적으로는, 본 발명은 식물에서 바이러스-유사 입자를 생산하고 이의 생산을 증가시키는 것과 관련된다.
인플루엔자(influenza)는 오르토믹소비리대(orthomyxoviridae)과의 RNA 바이러스에 의해 유발된다. 이들 바이러스에는 세 가지 타입이 있고 그것들은 세 가지 다른 타입의 인플루엔자, 타입 A, B 및 C를 유발한다. 인플루엔자 바이러스 타입 A 바이러스는 포유동물(사람, 돼지, 페릿, 말) 및 조류를 감염시킨다. 이것은 전 세계적 유행병을 유발했던 바이러스의 타입이기 때문에, 인류에게 매우 중요하다. 인플루엔자 바이러스 타입 B(간단하게 인플루엔자 B로도 알려짐)는 사람만을 감염시킨다. 그것은 가끔 독감의 국소적 발생을 유발한다. 인플루엔자 C 바이러스 또한 사람만을 감염시킨다. 그것들은 어릴 때 대부분의 사람을 감염시키고 심각한 질병을 유발하지 않는다.
백신 접종은 감염 전에 대상체가 방어를 증가시키도록 유도함으로써 유사 약제에 의해 유발된 질환에 대한 보호를 제공한다. 통상적으로, 이것은 면역원으로서 살아있는 약화된 또는 전체 불활성화된 형태의 감염원의 사용을 통해 달성되었다. 백신으로서 전체 바이러스(예를 들어, 살해된 또는 약화된 바이러스) 사용의 위험을 방지하기 위해, 재조합 바이러스 단백질, 예를 들어, 서브유닛이 백신으로 추구되었다. 펩티드 및 서브유닛 백신 둘 다는 많은 잠재적 제한을 받는다. 서브유닛 백신은 불량한 면역원성을 나타낼 수도 있는데, 부정확한 폴딩(folding) 또는 불량한 항원 전달 과정 때문이다. 중대한 문제는 조작된 단백질의 형태가 천연 환경에서 항원의 그것을 모방한다는 것을 보장하기 어려운 것이다. 적합한 보조제 및, 펩티드의 경우에, 담체 단백질은 면역 반응을 촉진하기 위해 사용되어야 한다. 게다가, 이들 백신은 주로 체액 반응을 유도하고, 따라서 효과적인 면역력을 불러 일으키는 데 실패할 수도 있다. 서브유닛 백신은 전체 불활성화된 바이러스가 보호를 제공하는 것으로 입증될 수 있는 질환에 대하여 종종 효과가 없다.
바이러스-유사 입자(VLP)는 면역원성 조성물에 포함되는 잠재적 후보물질이다. VLP는 성숙한 비리온과 매우 유사하지만, 그것들은 바이러스 유전 물질을 함유하지 않는다. 그러므로, VLP는 자연에서 복제할 수 없으며, 이것은 그것들을 백신으로서 투여하기에 안전하게 한다. 게다가, VLP는 VLP의 표면상의 바이러스 당단백질을 발현하도록 조작될 수 있으며, 이것은 가장 기본적인 생리학적 배취 형태이다. 게다가, VLP는 온전한 비리온과 유사하고 다원자가 미립자 구조이기 때문에, VLP는 항체를 당단백질로 중화하는 것을 유도하는데 있어서 가용성 외피 단백질 항원보다 더 효과적일 수도 있다.
VLP는 식물에서(WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522; WO 2010/148511; 이것은 본원에 참고로 포함됨), 및 곤충 및 포유동물계(Noad, R. and Roy, P., 2003, Trends Microbiol 11: 438-44; Neumann et al., 2000, J. Virol., 74, 547-551)에서 생산되었다. Latham과 Galarza(2001, J. Virol., 75, 6154-6165)는 헤마글루티닌(HA), 뉴라민다제(NA), M1, 및 M2 유전자를 동시 발현하는 재조합 바큘로바이러스(baculovirus)로 감염된 곤충 세포에서의 인플루엔자 VLP의 형성을 보고하였다. 이 연구는 인플루엔자 비리온 단백질은 진핵 세포에서 동시 발현시 자가 조립되고 M1 기질 단백질은 VLP 생산에 필요하다는 것을 입증하였다. 하지만, Gomez-Puertas 등 (1999, J. Gen. Virol, 80, 1635-1645)은 M2의 과발현이 MDCK 배지로의 CAT RNA 전염을 완벽히 차단한다는 것을 또한 나타냈다.
M2는 이온 채널 단백질로서 기능하고 이 단백질이 과발현될 때, 동시 발현된 HA의 세포 내 전송이 억제되고 원형질막에서 헤마글루티닌(HA)의 축적이 75 - 80%만큼 감소된다는 것으로 나타났다(Sakaguchi et al., 1996; Henkel & Weisz, 1998). 게다가, M2를 과발현함으로써, 원형질막에서 바이러스 막 단백질의 축적이 감소되고 이로 인해 생산된 기능적 VLP의 수의 급격한 감소가 있다.
M2 단백질은 인플루엔자 A 감염된 세포의 세포 표면에서 풍부하게 발현된다(Lamb et al. (1985) Cell, 40, 627 내지 633). 단백질은 바이러스 입자 자체의 막에서도 발견되지만, 극소량, 비리온 당 14 내지 68개의 M2 분자로 발견된다(Zebedee and Lamb(1988) J. Virol. 62, 2762 내지 72). M2 단백질은 위치 50의 시스테인 상에서 팔미트산의 추가에 의해 번역 후에 변형된다(Sugrue et al. (1990) Virology 179, 51 내지 56).
M2 단백질은 두 개의 이황화 결합된 다이머로 구성된 호모테트라머이며, 이것은 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된다(Sugrue and Hay(1991) Virology 180, 617 내지 624). 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해, Holsinger and Lamb, (1991) Virology 183, 32 내지 43은 위치 17 및 19의 시스테인 잔기가 이황화 브리지(bridge) 형성에 수반된다는 것을 입증하였다. 위치 17의 시스테인만이 분석된 모든 바이러스에 존재한다. 시스테인 19도 존재하는 바이러스 균주에서는, 제2 이황화 브리지가 같은 다이머에서(Cys 17-Cys 17에 의해 이미 결합됨) 또는 다른 다이머와 함께 형성되는지 알려져 있지 않다.
Smith 등 (미국 특허 출원 2010/0143393) 및 Song 등 (p10s ONE 2011 6(1):e14538)은 인플루엔자 M2 단백질을 포함하는 백신 및 VLP를 설명한다. VLP는 적어도 M1과 같은 바이러스 코어 단백질을 포함한다. 이 코어 단백질은 버딩(budding) 및 곤충 숙주 세포로부터 입자의 방출을 구동한다.
Szecsi 등 (Virology Journal, 2006, 3:70)은 쥐 백혈병 바이러스(murine leukaemia virus; MLV)로부터 유래된 복제-결함 코어 입자에서 VLP를 조립한다. 조작된 인플루엔자 VLP는 세포 표면(HA, NA, M2) 및 내부 바이러스 성분(Gag, GFP 마커 게놈) 및 그것들의 표면 HA, HA 및 NA 또는 M2의 하버(harbour), 또는 H7N1 또는 H5N1 바이러스로부터 유래된 세 가지 단백질 모두를 일시적으로 동시 발현함으로써 유래된다. Szecsi 등에 따르면, 독감-VLP 생산 중에 M2의 발현은 HA 또는 NA의 바이러스 입자로의 통합에 영향을 미치지 않았다(Szecsi et al.의 페이지 2, 오른쪽 컬럼, 두 번째 단락).
본 발명은 식물에서 바이러스 단백질을 생산하는 것과 관련된다. 더 구체적으로는, 본 발명은 식물에서 바이러스-유사 입자를 생산하고 이의 생산을 증가시키는 것과 관련된다.
식물에서 바이러스 유사 입자 생산을 증가시키기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명에 따르면, 다음을 포함하는, 식물에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법 (A)가 제공된다,
a) 식물에서 활성이고 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계,
b) 식물에서 활성이고 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함하고 제2 핵산을 도입하는 단계. 및
c) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양함으로써, VLP를 생산하는 단계.
식물에서 활성인 제1 조절 영역, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다.
상기 설명된 방법 (A)의 채널 단백질은 양성자 채널 단백질일 수도 있다. 양성자 채널 단백질은 M2 또는 BM2로부터 선택될 수도 있다. 게다가, 양성자 채널 단백질은 양성자 채널 서명 서열 HXXXW를 포함할 수도 있다. M2 단백질은 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID NO: 14) 또는 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999(SEQ ID NO: 11)로부터 얻어진 M2 단백질일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A)를 제공하며, 구조 바이러스 단백질은 트리머화된 도메인을 포함한다. 게다가, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 연속적으로, 항원성 바이러스 단백질 또는 이들의 단편, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 암호화하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구조 바이러스 단백질은 인플루엔자 HA 단백질을 포함할 수도 있다. 게다가 인플루엔자 HA 단백질 중 하나 이상의 단백질 가수 분해 루프가 결실될 수도 있다.
본 발명은 상기 설명된 방법 (A)를 제공하며, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 B HA, C, HA, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 및 H16으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수도 있다. 예를 들어, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 타입 B HA 또는 H3일 수도 있다. 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Wisconsin/1/2010의 HA, 또는 인플루엔자 A/Perth/16/2009 또는 A/Victoria/361/2011의 H3일 수도 있다. 게다가, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57 또는 61과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 구조 바이러스 단백질의 서열은 또한 SEQ ID NO: 25, 30, 41, 48, 54, 58 또한 64의 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A)를 포함하며, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 코모바이러스(comovirus) 인핸서(enhancer), 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 하나 이상의 제미니바이러스(geminivirus) 증폭 요소와 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고, 제미니 바이러스 레플리카제를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부로 도입된다. 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR, 예를 들어, CPMV-HT 5' 및/또는 3'UTR과 같은 동부 모자이크 바이러스(Cowpea Mosaic Virus) 과번역 가능한(CPMV-HT) UTR일 수도 있다. 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소는 황고병 바이러스(Bean Yellow Dwarf Virus) 긴 유전자 간 영역(BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자 간 영역(BeYDV SIR)으로부터 선택될 수도 있다. 게다가, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 타입 B HA 또는 H3일 수도 있으며, 예를 들어, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57 또는 61과 적어도 70%의 서열 동일성을 가질 수도 있다. 구조 바이러스 단백질의 서열은 또한 SEQ ID NO: 25, 30, 41, 48, 54, 58 또한 64의 서열을 포함할 수도 있다.
상기 설명된 방법(A)은 또한 침묵 억제자, 예를 들어 HcPro 또는 p19를 암호화하는 또 다른 핵산 서열을 도입하는 단계를 수반할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A)을 포함하며, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 일시적으로 발현된다. 대안으로, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 안정하게 발현된다.
상기 설명된 방법(A)은 다음의 단계를 더 포함할 수도 있다:
d) 식물을 수확하고 VLP를 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법(A)을 포함하며, VLP는 바이러스 기질 또는 코어 단백질을 함유하지 않는다.
본 발명은 상기 설명된 방법(A)에 의해 생산된 VLP를 제공한다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 더 포함할 수도 있다. VLP는 또한 채널 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 할 수도 있다. 게다가, VLP의 구조 바이러스 단백질은 HA0 단백질일 수도 있다. VLP로 구성된 하나 이상의 바이러스 단백질은 식물-특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함할 수도 있다. 본 발명은 또한 VLP를 사용하여 제조된 다클론성 항체를 제공한다.
본 발명은 면역 반응을 유발하기 위해 앞서 설명된 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에 대해서만 설명된 VLP를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는 방법을 포함한다. VLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법(A)에 의해 생산된 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는, 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법((B)를 제공한다,
식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하고 구조 바이러스 단백질을 식물, 또는 식물의 일부로 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 핵산, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하고 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하는 단계,
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양함으로써, VLP를 생산하는 단계.
식물에서 활성인 제1 조절 영역, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다.
상기 설명된 방법((B)의 채널 단백질은 양성자 채널 단백질일 수도 있다. 양성자 채널 단백질은 M2 또는 BM2로부터 선택될 수도 있다. 게다가, 양성자 채널 단백질은 양성자 채널 서명 서열 HXXXW를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법((B)를 제공하며, 구조 바이러스 단백질은 트리머화 도메인을 포함한다. 게다가, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 연속적으로, 항원성 바이러스 단백질 또는 이들의 단편, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리를 암호화하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구조 바이러스 단백질은 인플루엔자 HA 단백질을 포함할 수도 있다. 게다가 인플루엔자 HA 단백질의 하나 이상의 단백질 가수 분해 루프가 결실될 수도 있다.
본 발명은 상기 설명된 방법((B)를 제공하며, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 B HA, C, HA, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 및 H16으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수도 있다. 예를 들어, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 타입 B HA 또는 H3일 수도 있다. 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Wisconsin/1/2010의 HA, 또는 인플루엔자 A/Perth/ 16/2009 또는 A/Victoria/361/2011의 H3일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법((B)를 포함하며, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 코모바이러스 인핸서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소와 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고, 제미니바이러스 레플리카제를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부로 도입된다. 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR, 예를 들어, CPMV-HT 5' 및/또는 3'UTR과 같은 동부 모자이크 바이러스 과번역 가능한(CPMV-HT) UTR일 수도 있다. 추가적으로, 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소는 황고병 바이러스 긴 유전자 간 영역(BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자 간 영역(BeYDV SIR)으로부터 선택될 수도 있다.
상기 설명된 방법((방법 B)은 또한 침묵 억제자, 예를 들어, HcPro 또는 p19를 암호화하는 또 다른 핵산 서열을 도입하는 단계를 수반할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법((B)를 포함하며, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 일시적으로 발현된다. 대안으로, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 안정하게 발현된다.
상기 설명된 방법 (B)는 다음 단계를 더 포함할 수도 있다:
d) 식물을 수확하고 VLP를 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (B)를 포함하며, VLP는 바이러스 기질 또는 코어 단백질을 함유하지 않는다.
본 발명은 상기 설명된 방법 (B)에 의해 생산된 VLP를 제공한다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 더 포함할 수도 있다. VLP는 또한 채널 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 할 수도 있다. 게다가, VLP의 구조 바이러스 단백질은 HA0 단백질일 수도 있다. VLP로 구성된 하나 이상의 바이러스 단백질은 식물 특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함할 수도 있다. 본 발명은 또한 VLP를 사용하여 제조된 다클론성 항체를 제공한다.
본 발명은 면역 반응을 유발하기 위한 앞서 설명된 방법 (B)에 의해 제조된 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에 앞서 설명된 VLP를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는 방법을 포함한다. VLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (B)에 의해 생산된 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명은 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열(단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA), 및 SEQ ID NO: 41의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 핵산 서열은 SEQ ID NO: 43의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명은 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 VLP를 제공한다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 더 포함할 수도 있다. VLP는 또한 채널 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 할 수도 있다. VLP는 식물 특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함할 수도 있다. 본 발명은 면역 반응을 유발하기 위한, SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에 SEQ ID NO: 41의 아미노산을 포함하는 VLP를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는 방법을 포함한다. VLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여될 수도 있다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
구조 바이러스 단백질을, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질과 함께 동시 발현함으로써, 구조 바이러스 단백질 및 VLP의 증가된 수득율이 관찰된다. HA'는 pH-의존적 형태 변화를 경험하는 것으로 알려져 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 성숙화 및 이동 중에 HA를 생산하는 세포의 골지체 내의 pH는 HA 폴딩(folding)에 영향을 미칠 수도 있고, HA의 안정성을 초래하고 분해를 증가시키거나, 이들의 조합에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 HA와 함께 동시 발현함으로써, 골지체 내의 pH는 증가할 수도 있고, 안정성의 증가, 분해의 감소, 또는 이들의 조합을 일으킬 수도 있고, HA 수득율을 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 개요는 반드시 본 발명의 모든 특징을 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참조하여 다음 설명으로부터 더 분명해 질 것이다:
도 1A는 프라이머 IF-H5A-I-05.s1+3c(SEQ ID NO: 2)를 나타낸다. 도 1B는 프라이머 IF-H5dTm.r(SEQ ID NO: 3)을 나타낸다. 도 1C는 구조물 1191의 개략도를 나타낸다. 도 1D는 구조물 1191(SEQ ID NO 4)을 나타낸다. 도 1E는 발현 카세트 번호 489(SEQ ID NO 5)를 나타낸다. 도 1F는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005의 H5(H5N1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6)을 나타낸다. 도 1G는 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005(H5N1)의 H5를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 42)을 나타낸다.
도 2A는 프라이머 IF-S1-M1+M2ANC.c(SEQ ID NO: 7)를 나타낸다. 도 2B는 프라이머 IF-S1-4-M2ANC.r(SEQ ID NO: 8)을 나타낸다. 도 2C는 합성된 M2 유전자(Genbank 수납 번호 DQ508860의 715-982에 결합된 nt 1-26에 해당함)에 대한 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 9)을 나타낸다. 도 2D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1261을 나타낸다. 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 10). 도 2E는 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2(H1N1)의 아미노산(SEQ ID NO: 11)을 나타낸다.
도 3A는 합성된 M2 유전자(Genebank 수납 번호 EF467824의 nt 740-1007에 결합된 nt 26-51에 해당함)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 12)을 나타낸다. 도 3B는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 859를 나타낸다. 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)의 M2는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 13). 도 3C는 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2(H1N1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 14)을 나타낸다.
도 4A는 프라이머 IF-H1A-C-09.s2+4c(SEQ ID NO: 15)를 나타낸다. 도 4B는 프라이머 IF-H1A-C-09.s1-4r(SEQ ID NO: 16)을 나타낸다. 도 4C는 합성된 H1 유전자(Genbank 수납 번호 FJ966974)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 17)을 나타낸다. 도 4D는 구조물 1192의 개략도를 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 도면에 주석이 달려 있다. 도 4E는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조물 1192를 나타낸다(밑줄 그어져 있음). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQ ID NO: 18). 도 4F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 484를 나타낸다. 인플루엔자 A/California/7/2009의 PDISP/H1(H1N1)은 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 19). 도 4G는 인플루엔자 A/California/7/2009의 PDISP-H1(H1N1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 20)을 나타낸다.
도 5A는 프라이머 IF-S2+S4-H3 Per.c(SEQ ID NO: 21)를 나타낸다. 도 5B는 프라이머 IF-S1a4-H3 Per.r(SEQ ID NO: 22)을 나타낸다. 도 5C는 합성된 H3 유전자(Genbank 수납 번호 GQ293081의 nt 26-1726에 해당함)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 23)을 나타낸다. 도 5D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1019를 나타낸다. 인플루엔자 A/Perth/ 16/2009의 PDISP/H3(H3N2)은 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 24). 도 5E는 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 PDISP/H3(H3N2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 25)을 나타낸다.
도 6A는 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c(SEQ ID NO: 26)를 나타낸다. 도 6B는 프라이머 IF-S1a4-B Bris.r(SEQ ID NO: 27)을 나타낸다. 도 6C는 합성된 HA B Brisbane 유전자(Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 28)을 나타낸다. 도 6D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1029의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 29). 도 6E는 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 30)을 나타낸다. 도 6F는 구조물 1194의 개략도를 나타낸다. 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 도면에 주석이 달려 있다. 도 6G는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조물 1194를 나타낸다(밑줄 그어져 있음). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템 내의 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQ ID NO: 31). 도 6H는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR까지의 발현 카세트 번호 1008을 나타낸다. 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 32).
도 7A는 프라이머 dTmH5I-B Bris.r(SEQ ID NO: 33)을 나타낸다. 도 7B는 프라이머 B Bris-dTmH5I.c(SEQ ID NO: 34)를 나타낸다. 도 7C는 프라이머 IF-S1aS4-dTmH5I.r(SEQ ID NO: 35)을 나타낸다. 도 7D는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR까지의 발현 카세트 번호 1009를 나타낸다. PDISP/HA B Brisbane/H5Indo TMCT는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 36). 도 7E는 PDISP/HA B Brisbane/H5Indo TMCT의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 37)을 나타낸다.
도 8A는 프라이머 1039+1059.r(SEQ ID NO: 38)을 나타낸다. 도 8B는 프라이머 1039+1059. c(SEQ ID NO: 39)를 나타낸다. 도 8C는 BeYDV 왼쪽 LIR에서 BeYDV 오른쪽 LIR까지의 발현 카세트 번호 1059를 나타낸다. 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 40). 도 8D는 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 41)을 나타낸다. 도 8E는 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 43)을 나타낸다.
도 9는 구조물 번호 1008의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 1008은 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현을 지시한다. 이 구조물은 DNA 증폭을 위한 BeYDV-유래된 요소를 포함한다.
도 10은 구조물 번호 1009의 플라스미드 맵을 나타내다. 구조물 번호 1009는 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 인플루엔자 A/Indonesia/05/2005의 H5의 것으로 대체된 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 키메라 HA의 발현을 지시한다. 이 구조물은 DNA 증폭을 위한 BeYDV-유래된 요소를 포함한다.
도 11은 구조물 번호 1029의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 1029는 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현을 지시한다.
도 12는 구조물 번호 1059의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 1059는 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 균주 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현을 지시한다. 이 구조물은 DNA 증폭을 위한 BeYDV-유래된 요소를 포함한다.
도 13은 구조물 번호 1019의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 1019는 인플루엔자 균주 A/Perth/16/2009의 야생형 H3(H3N2)의 발현을 지시한다.
도 14는 구조물 번호 484의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 484는 인플루엔자 균주 A/California/07/2009의 야생형 H1(H1N1)의 발현을 지시한다.
도 15는 구조물 번호 489의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 489는 인플루엔자 균주 A/Indonesia/05/2005의 야생형 H5(H5N1)의 발현을 지시한다.
도 16은 구조물 번호 1261의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 1261은 인플루엔자 균주 A/New Caledonia/20/99의 야생형 M2(H1N1)의 발현을 지시한다.
도 17은 구조물 번호 859의 플라스미드 맵을 나타낸다. 구조물 번호 859는 인플루엔자 균주 A/Puerto Rico/8/34의 야생형 M2(H1N1)의 발현을 지시한다.
도 18은 아그로인필트레이션된(agroinfiltrated) 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. B/Brisbane/60/2008의 HA는 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현된다. "C+": 양성 대조군, Therapeutic Goods Administration, Australia의 반 정제된 B/Brisbane/60/2008 바이러스; "C-": 음성 대조군, 목(mock)-침윤 식물; "1008": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현; "1008+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 M2와의 동시 발현; "1009+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 키메라 HA의 M2와의 동시 발현; "1029": 증폭 요소(BeYDV)의 부재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현; "1029+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 부재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현. 비율(ratio)은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움(agrobacterium) 배양의 비율(proportion)을 나타낸다.
도 19는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 "C+": 양성 대조군, Therapeutic Goods Administration, Australia의 반 정제된 A/Wisconsin/15/2009(H3N2) 바이러스; "C-": 음성 대조군, 목-침윤 식물; "'1019": A/Perth/16/2009의 야생형 HA(H3N2)의 발현; "1019+1261": A/Perth/16/2009의 야생형 HA(H3N2)의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현. 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다.
도 20은 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 "C+": 양성 대조군, NIBSC 바이러스의 반 정제된 A/California/7/2009(H1N1) NYMC X-179A(NIBSC 코드 09/146); "C-": 음성 대조군, 목-침윤 식물; "484": A/California/7/2009의 야생형 HA A/California/7/2009(H1N1)의 발현; "484+1261": A/California/7/2009(H1N1)의 야생형 HA의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현. 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다.
도 21은 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 "C+": 양성 대조군, A/Indonesia/05/2005의 정제된 재조합 H5, Immune Technology Corporation(제품 번호 IT-003-052p); "C-": 음성 대조군, 목-침윤 식물; "489": A/Indonesia/5/05의 야생형 HA(H5N1)의 발현; "489+1261": A/Indonesia/5/05의 야생형 HA(H5N1)의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현.
도 22A는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. "1008": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 발현; "1008+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 야생형 HA의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현; "1059": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현; "1059+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현. 세 번 별도로 침윤된 식물이 분석되었다(A, B 및 C). 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다. 도 22B는 HA-생산 식물의 조단백질 추출물의 적혈구 응집 능력의 비교를 나타낸다.
도 23은 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 23A: "1059": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 발현; "1059+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현. "1059+859": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Brisbane/60/2008의 돌연변이 HA의 A/Puerto Rico/8/34의 M2와의 동시 발현. 세 번 별도로 침윤된 식물이 분석되었다(A, B 및 C). 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다. 도 23B: "1019": A/Perth/ 16/2009의 야생형 HA(H3N2)의 발현; "1019+1261": A/Perth/16/2009의 야생형 HA(H3N2)의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현; "1019+859": A/Perth/16/2009의 야생형 HA(H3N2)의 A/Puerto Rico/8/34의 M2의 동시 발현. 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다.
도 24는 인플루엔자의 여러 균주의 HA의 서열 정렬을 나타낸다. 전구체 HA0의 분할 부위는 화살표로 표시된다.
도 25A는 프라이머 IF-H3V36111.S2+4c(SEQ ID NO: 44)를 나타낸다. 도 25B는 프라이머 IF-H3V36111.s1-4r(SEQ ID NO: 45)을 나타낸다. 도 25C는 합성된 H3 유전자(GISAID 분리 번호 EPI_ISL-101506 HA 서열의 nt 25 내지 1725에 해당함)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 46)을 나타낸다. 도 25D는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1391의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 PDISP/H3(H3N2)은 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 47). 도 25E는 인플루엔자 A/ Victoria/361/2011의 PDISP-H3(H3N2)의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 48)을 나타낸다. 도 25F는 구조물 1391의 개략도를 나타낸다.
도 26A는 프라이머 IF-HAB110.s1+3c(SEQ ID NO: 49)를 나타낸다. 도 26B는 프라이머 IF-HAB110.s1-4r(SEQ ID NO: 50)을 나타낸다. 도 26C는 합성된 HA B Wisconsin(Genbank 수납 번호 JN993010)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 51)을 나타낸다. 도 26D는 구조물 193의 개략도를 나타낸다. 도 26E는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조물 193을 나타낸다(밑줄 그어져 있음). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내의 2X35 S/CPMV-HT/NOS(SEQ ID NO: 52). 도 26F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1462의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA는 밑줄 그어져 있다(SEQ ID NO: 53). 도 26G는 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 54)을 나타낸다. 도 26H는 구조물 1462의 개략도를 나타낸다.
도 27A는 프라이머 HAB110(PrL-).r(SEQ ID NO: 55)을 나타낸다. 도 27B는 프라이머 HAB110(PrL-).c(SEQ ID NO: 56)를 나타낸다. 도 27C는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1467의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA는 밑줄 그어져 있다(SEQ ID NO: 57). 도 27D는 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 58)을 나타낸다. 도 27E는 구조물 1467의 개략도를 나타낸다.
도 28A는 프라이머 IF-HB-M-04.s2+4c(SEQ ID NO: 59)를 나타낸다. 도 28B는 프라이머 IF-HB-M-04.s1-4r(SEQ ID NO: 60)을 나타낸다. 도 28C는 합성된 HA B Malaysia의 뉴클레오티드 서열(Genbank 수납 번호 EU124275의 nt 31-1743에 해당함)을 나타내며, T759C 및 C888G 돌연변이는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 61). 도 28D는 구조물 194의 개략도를 나타내며, 플라스미드 선형화에 사용된 SacII 및 StuI 제한 효소 부위는 도면에 주석이 달려 있다. 도 28E는 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 구조물 194를 나타낸다(밑줄 그어져 있음). 플라스토시아닌-P19-플라스토시아닌 침묵 억제자 발현 카세트가 있는 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내의 2X35 S/CPMV-HT/NOS(SEQ ID NO: 62). 도 28F는 2X35S 프로모터에서 NOS 종결자까지의 발현 카세트 번호 1631의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 PDISP-HA는 밑줄 그어져 있다. (SEQ ID NO: 63). 도 28G는 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 PDISP-HA의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 64)을 나타낸다. 도 28H는 구조물 1631의 개략도를 나타낸다.
도 29는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. B/Malaysia/2506/2004의 HA는 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현된다. 20 미크로그램의 단백질 추출물이 레인마다 로딩되었다. "C+": 양성 대조군, National Institute for Biological Standards and Control, United Kingdom의 반 정제된 B/Malaysia/2506/2004 바이러스; "1631": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Malaysia/2506/2004의 야생형 HA의 발현; "1631+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Malaysia/2506/2004의 야생형 HA의 M2와의 동시 발현. 비율은 동시 발현 실험에 사용된 아그로박테리움 배양의 비율을 나타낸다.
도 30A는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. B/Wisconsin/1/2010의 HA는 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현된다. 10 미크로그램의 단백질 추출물이 레인마다 로딩되었다. "C+": 양성 대조군, National Institute for Biological Standards and Control, United Kingdom의 반 정제된 B/Wisconsin/1/2010 바이러스; "1462": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Wisconsin/1/2010의 야생형 HA의 발현; "1467": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 돌연변이 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 발현; "1462+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 B/Wisconsin/1/2010의 야생형 HA의 M2와의 동시 발현; "1467+1261": 증폭 요소(BeYDV)의 존재시 돌연변이 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 M2와의 동시 발현. 비율은 발현 및 동시 발현 실험에 사용된 각각의 아그로박테리움 배양에 대한 흡광도를 나타낸다. 도 30B는 AGL1/1462, AGL1/1467, AGL1/1462+AGL1/1261 및 AGL1/1467+AGL1/1261로 형질전환된 식물의 조단백질 추출물의 적혈구 응집 능력의 비교를 나타낸다.
도 31은 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 HA 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. H3/Victoria/361/2011의 HA는 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현된다. 20 미크로그램의 단백질 추출물이 레인마다 로딩되었다. "C+": 양성 대조군, Therapeutic Goods Administration, Australia의 반 정제된 H3/Wisconsin/15/2009 바이러스; "1391": H3/Victoria/361/2011의 야생형 HA의 발현; "1391+1261": H3/Victoria/361/2011의 야생형 HA의 M2와의 동시 발현. 비율은 발현 및 동시 발현 실험에 사용된 각각의 아그로박테리움 배양에 대한 흡광도를 나타낸다.
다음 설명은 바람직한 구체예에 대한 것이다.
본 발명은 바이러스-유사 입자(VLP) 및 생산 방법 및 식물에서 VLP 수득율 및 생산을 증가시키는 방법과 관련된다.
본 발명은, 부분적으로, 식물, 또는 식물의 일부에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 제1 핵산 및 제2 핵산을 식물에 도입하는 단계를 수반한다. 제1 핵산은 식물 또는 식물의 일부에서 활성이고, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함한다. 제2 핵산은 식물에서 활성이며, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함한다. 제1 조절 영역 및 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다. 식물 또는 식물의 일부가 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양됨으로써, VLP를 생산한다. 원하면, 식물 또는 식물의 일부가 수확될 수도 있고 VLP가 정제될 수도 있다. 바람직하게는, VLP는 M1, 바이러스 기질 또는 코어 단백질을 함유하지 않는다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생산된 VLP를 제공한다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 포함할 수도 있다. VLP는 면역 반응을 유발하기 위한 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 제1 및 제2 핵산을 발현함으로써 생산된 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
또한 상기 설명된 바와 같이 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 제공하고, 제1 및 제2 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양하여, VLP를 생산함으로써 본 발명의 VLP가 생산될 수도 있다. VLP는 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 포함할 수도 있다. VLP는 면역 반응을 유발하기 위한 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 또한 제1 및 제2 핵산을 발현함으로써 생산된 VLP를 포함하는 식물성 물질을 제공한다. 식물성 물질은 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물성 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명의 VLP는 하나 이상의 바이러스 단백질을 포함한다. 예를 들어, 제한적인 것으로 간주되어서는 안 되는, 하나 이상의 바이러스 단백질은 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)과 같은 구조 바이러스 단백질 또는, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는, 예를 들어, M2와 같은 채널 단백질일 수도 있다. HA는 어떤 HA, 예를 들어, WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/003235; WO 2011/03522에 설명된 H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 또는 타입 B HA일 수도 있다(이것은 본원에 참고로 포함됨).
하기 더 상세히 설명된 바와 같이, VLP는 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산과 동시 발현시킴으로써 식물에서 생산될 수도 있다. 제1 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물에 도입될 수도 있거나, 그것들은 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다. 제1 및 제2 핵산은 일시적인 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다. 게다가, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산 모두가 식물에서 동시발현 되도록, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질(제2 핵산)로 형질전환될 수도 있다. 대안으로, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질(제2 핵산)을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산 모두가 식물에서 동시 발현 되도록 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산으로 형질전환될 수도 있다. 추가적으로, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 제1 식물은, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 발현하는 제2 식물과 교배되어, 바이러스 단백질 및, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산을 동시 발현하는 자손 식물을 생산할 수도 있다.
본 발명은 또한 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산과 동시 발현함으로써 식물에서 바이러스 단백질의 발현 및 수득율을 증가시키는 방법을 제공한다. 제1 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물에 도입될 수도 있거나, 그것들은 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다. 제1 및 제2 핵산은 일시적인 방식으로, 또는 안정한 방식으로 식물에 도입될 수도 있다. 게다가, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 식물은 식물에서 제1 및 제2 핵산이 동시 발현되도록, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질(제2 핵산)로 형질전환될 수도 있다. 대안으로, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질(제2 핵산)을 발현하는 식물은 제1 및 제2 핵산 모두가 식물에서 동시 발현되도록 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산으로 형질전환될 수도 있다. 추가적으로, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산을 발현하는 제1 식물은, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산을 발현하는 제2 식물과 교배되어, 바이러스 단백질 및, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산을 동시 발현하는 자손 식물을 생산할 수도 있다.
채널 단백질
"채널 단백질"은 막을 통해 이온 및/또는 소분자의 교차를 허용하는 인지질 막에 걸쳐 채널을 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 채널 단백질은 이온 및/또는 소분자의 크기 및/또는 전하에 대하여 선택적일 수도 있다. 채널 단백질의 비 제한 예는 저분자량 화합물에 대한 막의 투과성이 달라지는 비-특이적 채널 단백질 및, 예를 들어, 염화물 채널, 칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널 및 양성자 채널과 같은 이온 채널 단백질이다.
"양성자 채널 단백질"은 인지질 이중층에 걸쳐 양성자 선택적 채널을 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 양성자 채널 단백질은 소수성 도메인에 의해 플랭크된(flanked) 막관통(TM) 도메인을 갖는 단일 패스 막 단백질일 수도 있다. 양성자 채널의 TM 도메인은 서열 HXXXW(SEQ ID NO. 1)을 포함할 수도 있다.
HA0의 분할 이후, HA는 pH에 민감해지며, 엔도솜의 pH에서(<pH 6.0) 비가역적 형태 변화를 경험한다. 전구체 HA0의 형태는 낮은 pH에서 안정하지만, 분할된 HA1-HA2 형태는 준 안정하다(Bullough PA et. al., 1994, Nature. Vol 371:37-43). 다른 HA의 형태 변화를 유발하는 pH 역가에 대한 연구는 이 역가가 B 균주에서 대략 pH 5.8-5.9인 반면에, 타입 A HA에서는 더 산성(pH 5.1 내지 5.3)이라는 것을 나타낸다(Beyer WEP et al, 1986, Archives Virol, vol 90: 173). 식물 바이오매스(biomass)의 추출 중에(pH 5-6), HA1-HA2의 형태 변화는 또한 타입 B HA와 함께 일어날 수도 있다.
그러므로 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 골지체를 포함하여, HA를 포함하는 세포 구획의 pH는 HA의 폴딩, 안정성 및/또는 단백질 가수 분해에 중요할 수도 있다. 예를 들어, 인플루엔자 M2 및 BM2 단백질과 같은 양성자 채널 단백질은 세포 구획의 pH를 조절할 수도 있다. 예를 들어, M2는 인플루엔자 바이러스 복제의 후기 및 초기 둘 다에서 세포 내 구획을 완충함으로써 막 융합의 상승 작용을 조절한다. 바이러스 입자의 식균 작용 섭취 후 새로운 세포의 감염 초기에, M2 양성자 채널 활성의 활성화는 탈 외피 과정(uncoating process) 중에 비리온의 내부의 산성화로 이어진다. 바이러스 생산 중에 감염의 후기에, M2는 트랜스-골지 망(trans-Golgi network)를 통한 수송 중에 pH를 증가시키는 작용을 하고 인플루엔자의 경우에는 HA와 같이, 공동 수송된 단백질의 낮은 pH-유발 불활성화를 방지한다. 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질과 함께 구조 바이러스 단백질을 동시 발현함으로써, 구조 바이러스 단백질 및 VLP의 증가된 수득율이 관찰된다. HA는 pH-의존적 형태 변화를 경험하는 것으로 알려져 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 성숙화 및 이동 중에 HA를 생산하는 세포의 골지체 내의 pH는 HA 폴딩에 영향을 미칠 수도 있고, HA의 안정성을 초래하고 분해를 증가시키거나, 이들의 조합에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 HA와 함께 동시 발현함으로써, 골지체 내의 pH는 증가할 수도 있고, 안정성의 증가, 분해의 감소, 또는 이들의 조합을 일으킬 수도 있고, HA 및/또는 VLP의 발현 수준 및 수득율을 증가시킬 수도 있다.
식물에서 구조 바이러스 단백질을, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질과 함께 동시 발현함으로써, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 동시 발현하지 않고 구조 바이러스 단백질만 발현하는 식물과 비교할 때 구조 바이러스 단백질 및/또는 VLP의 증가된 수득율이 관찰된다.
게다가, 식물에서 HA와 같은 구조 바이러스 단백질을, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질과 동시 발현함으로써, HA 단백질은, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질과 동시 발현되지 않는 HA 단백질과 비교할 때, 더 큰 적혈구 응집 능력에 의해 표시된 증가된 활성을 나타낼 수도 있다. 활성의 증가는, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질의 부재시 생산된 같은 HA 단백질의 활성과 비교할 때, 약 2% 내지 약 100%, 또는 업계의 표준 기술을 사용하여 결정된 그 사이의 어떤 양, 예를 들어, 약 10% 내지 약 50% 또는 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 약 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%만큼의 적혈구 응집 능력의 증가를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "M2", "M2 단백질", "M2 서열" 및 "M2 도메인"은 어떤 자연 발생한 또는 인공적으로 생산된 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리체로부터 분리되거나, 이를 기반으로 하거나 이에 존재하는 M2 단백질 서열의 모두 또는 일부를 나타낸다. 따라서, 용어 M2 등은 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 선택압에 반응하여 생산된 자연 발생한 M2 서열 변이체(예를 들어, 약물 요법, 숙주 세포 친화성 또는 감염성의 확대, 등), 뿐만 아니라 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산된 M2 서열도 포함한다. 사용될 수도 있는 채널 단백질의 예는 양성자 채널 단백질, 예를 들어, 표 1에 나열된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는 A/Puerto Rico/8/1934의 M2 및 A/New Caledonia/20/1999의 M2를 포함한다. 전형적인 M2 단백질은 SEQ ID NO: 11 또는 14에 나타난 아미노산 서열로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "BM2", "BM2 단백질", "BM2 서열" 및 "BM2 도메인"은 어떤 자연 발생한 또는 인공적으로 생산된 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리체로부터 분리되거나, 이를 기반으로 하거나 이에 존재하는 BM2 단백질 서열의 모두 또는 일부를 나타낸다. 따라서, 용어 BM2 등은 바이러스 생활 주기 동안 성숙화에 의해 생산되거나 선택압에 반응하여 생산된 자연 발생한 BM2 서열 변이체(예를 들어, 약물 요법, 숙주 세포 친화성 또는 감염성의 확대, 등), 뿐만 아니라 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산된 BM2 서열도 포함한다. 사용될 수도 있는 채널 단백질의 예는 양성자 채널 단백질, 예를 들어, 표 2에 나열된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가의 전형적인 양성자 채널 단백질 서열은 표 1 및 표 2에 나타난 GenBank 수납 번호 하에 기탁된 서열로 구성된다.
표 1: 아미노산 서열 M2 양성자 채널 단백질에 대한 수납 번호
표 2: 아미노산 서열 BM2 양성자 채널 단백질에 대한 수납 번호
구조 바이러스 단백질
구조 바이러스 단백질(구조 바이러스성 단백질로도 불림)은 바이러스 항원성 단백질 또는 이들의 단편일 수도 있지만, 예를 들어, 바이러스 당단백질 또는 바이러스 외피 단백질에 제한되지 않는다. 구조 바이러스 단백질은 키메라 바이러스 단백질일 수도 있다. 바이러스 단백질은 모노머, 다이머, 트리머, 또는 이들의 조합으로서 존재할 수도 있다. 트리머는 세 개의, 보통은 비-공유 결합된 단백질에 의해 형성된 고분자 복합체이다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 단백질의 트리머화 도메인은 이러한 트리머의 형성에 중요할 수도 있다. 그러므로 구조 바이러스 단백질 또는 이들의 단편은 트리머화 도메인을 포함할 수도 있다. 구조 바이러스 단백질의 비-제한 예는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA), 또는 HA의 단편이다. 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 HA의 비-제한 예, 또는 HA의 단편은 WO 2009/009876, WO 2009/076778; WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2011/03522, WO 2010/006452, WO 2010/148511, WO 2011/035422에 설명된 것들을 포함한다(이것은 본원에 참고로 포함됨).
게다가 구조 바이러스 단백질은 HA의 미가공된 전구체 단백질일 수도 있다. HA 단백질은 약 75 kDa의 전구체 단백질(HA0)로서 합성되며, 이것은 표면에서 신장된 트리머 단백질로 조립된다. 전구체 단백질은 보존 활성화 분할 부위에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩티드 사슬, HA1 및 HA2(막관통 영역을 포함)으로 분할된다.
단백질 가수 분해 루프(분할 부위) 변형
구조 바이러스 단백질은 헤마글루티닌 단백질 내의 단백질 가수 분해 루프(분할 부위)가 결실되거나 변형된 인플루엔자 B 헤마글루티닌 또는 인플루엔자 A 헤마글루티닌 단백질일 수도 있다. 단백질 가수 분해 루프의 결실 또는 변형은 HA 분자가 대부분 HA0 전구체로서 유지된다는 것을 확실하게 한다.
HA는 전구체 단백질 HA0로서 합성되며, 이것은 이황화 브리지에 의해 서로 결합된 두 개의 서브유닛(HA1 및 HA2)으로의 단백질 가수 분해 가공을 경험한다. 포유동물 및 비병원성 조류 인플루엔자 바이러스 균주는 HA0 전구체를 분할할 수 있는 프로테아제를 세포 밖으로 분비하는 세포의 제한된 범위의 결과로서 해부학적으로 국소화된 감염을 유발한다(Chen J, et. al. 1998, Cell. Vol 95:409-417). 사람의 인플루엔자 감염시 HA0의 분할의 원인이 되는 프로테아제는 기도의 세포에 의해, 또는 박테리아 또는 미코플라스마(mycoplasma)를 동시 감염시킴으로써 분비되거나, 그것들은 감염에 대한 염증 반응에서 생산될 수도 있다. 주요 프로테아제 후보물질은 트립타제 클라라이며, 이것은 세기관지 상피(bronchiolar epithelium)의 클라라 세포(Clara cell)에 의해 생산되고, 제한된 조직 분포(상기도)를 가진다. 프로테아제는 H1, H2, H3, 및 H6의 분할 부위에서 발견된 일 염기 서열 Q/E-X-R에 특이적이다. H9 및 B 균주의 HA는 각각 SSR 및 KER 서열과 약간 다른 일 염기 분할 부위를 나타낸다(도 24를 참고하면 된다). 물새에서 보이는 장내 감염 및 호흡기 감염을 유발하는 인플루엔자 바이러스의 대부분에 대해 어떤 프로테아제도 확인되지 않았다. 실험실에서는, 대부분의 세포주는 외인성 프로테아제(보통 트립신)가 추가되지 않으면 다수의 주기의 복제를 지원하지 않는다.
하지만, 매우 병원성인 조류 균주는 더 광범위한 세포 내 프로테아제의 과에 의해 분할되며, 전신성 감염을 일으킨다. 병원성의 이 차이는 HA0 분할 부위에서의 구조적 차이와 관련이 있다. 병원성 균주는 일 염기 부위 내, 또는 그 다음의 다 염기 아미노산이 삽입된다. 이 경우에 분할은 세포 내에서 일어나고 수반된 프로테아제는 퓨린, 및 다른 서브틸리신-유사 효소로 확인되었으며, 골지에서 발견되었고 호르몬 및 성장 인자 전구체의 번역 후 가공에 수반되었다. 퓨린 인식 서열 R-X-R/K-R은 H5 및 H7의 HA0 분할 부위의 빈번한 삽입 아미노산이다(도 24를 참고하면 된다). 효소의 넓은 조직 분포, 및 세포 내 분할의 효율은 이들 바이러스에 의해 유발된 광범위하고 악성인 전신성 감염에 기여한다.
Horimoto T, et.al. (2006, Vaccine, Vol 24: 3669-3676)은 H5에서 H5의 다 염기 분할 부위(RERRRKKRJ↓G)의 폐기를 설명한다. 선택된 돌연변이가 마우스에서의 면역원성 연구에 제출되었으며, 처음 4개의 전하를 띈 아미노산(RERR)이 결실되고 다 염기 분할 부위를 불활성화하기 위해 변형되는(RKKR을 TETR로) 돌연변이를 포함한다. 분할 부위의 폐지는 돌연변이 H5의 면역원성 성질에 영향을 미치지 않았다. 돌연변이 NIBSC 05/240 NIBSC 인플루엔자 참조 바이러스 NIBG-23을 생산하기 위한 다 염기 부위의 폐지(RETR에 의해 대체된 GERRRKKRJ↓G)가 또한 보고되었다. Hoffman et. al. (2002, 2002, Vaccine, Vol 20:3165-3170)은 에그(egg)에서 발현을 촉진하기 위해 H5 HA의 다 염기 분할 부위를 H6의 일 염기 부위로 대체하였다. 처음 4개의 잔기가 결실되었고 다 염기 부위의 마지막 4개의 아미노산은 IETR에 의해 대체되었다(RERRRKKRJ↓G의 IETRJ↓G로의 대체). 이 돌연변이 H5는 낮은 pH에서 높은 발현 수준, 잠재적 가수 분해 및 형태 변화를 나타냈고, 면역원성 데이터는 보고되지 않았다. 이들 연구는 분할 부위의 변형이 바이러스 입자의 병독성을 감소시키기 위해 이용될 수 있으며(진짜 바이러스가 복제되는 경우에), 바이러스가 숙주 에그를 죽이지 않고 복제하게 한다는 것을 나타낸다. 이러한 돌연변이가 없으면, 바이러스는 높은 역가에 도달하기 전에 에그를 죽인다.
HA의 폴딩(folding) 및 골지를 통한 분비 중에, 헤마글루티닌 전구체 분할 부위는 HA의 표면의 루프에 위치하며, 프로테아제에 의한 단백질 가수 분해에 접근 가능하다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 전구체 HA0의 단백질 가수 분해가 ER에서 HA의 폴딩 중에 일 염기 또는 다 염기 부위에서 발생하는 경우, 단백질의 형태 변화는 분비 중에 골지체에서 일어날 수도 있는데, 식물의 골지 내부 및 아포플라스트에서의 pH 환경이 약간 산성이기 때문이다. 낮은-pH 형태 HA가 생산되어, 입자의 발현 수준 및 고유한 안정성 둘 다를 감소시킬 수도 있다. 따라서, 대부분의 분할되지 않은 HA0 전구체 단백질은 원형질막의 버딩일 것이다.
"단백질 가수 분해 루프" 또는 "분할 부위"는 전구체 HA0 분할에 수반된 단백질 가수 분해 부위의 공통 서열을 의미한다. "공통" 또는 "공통 서열"은 본원에 사용된 바와 같이 다수의 서열의 정렬, 예를 들어, 특정 인플루엔자 HA0 서열의 서브타입의 분석을 기반으로 하는 관련 서열의 서열 가변성을 포함하는 서열(아미노산 또는 뉴클레오티드 서열)을 의미한다. 인플루엔자 HA0 분할 부위의 공통 서열은 인플루엔자 A 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열을 포함할 수도 있으며, 예를 들어 공통 H1, 공통 H3, 또는 인플루엔자 B 공통 헤마글루티닌 아미노산 서열을 포함한다. 공통 서열의 비 제한 예는 도 24에 나타난다.
HA의 아미노산 서열에서 단백질 가수 분해 루프는 HA2 부분의 처음 20개의 아미노산으로 구성된 융합 펩티드 이전에 위치한다. A/Hong Kong/68의 HA0의 결정 구조가 결정되었다(Chen, J., 1998. Cell 95:409-417; 본원에 참고로 포함됨). 용매에 노출된 잔기는 일반적으로 연장된, 매우 노출된 표면 루프를 형성하는 분할 부위의 일부인 것으로 생각된다. 이 특이적 펩티드 서열에서부터, 공통 서열은 이 선택된 영역에서 결정될 수도 있다(Bianchi et al., 2005, Journal of Virology, 79:7380-7388; 본원에 참고로 포함됨).
단백질 가수 분해 루프를 폐지하기 위해, B HA의 구조를 조사하였다. HA의 단백질 가수 분해 분할 부위만의 결실은 HA1의 C-말단 및 HA2의 N-말단을 떼어놓을 것이고 긴 결합자가 설계될 필요가 있을 것이다. 하지만 융합 펩티드의 결실 부분은 단백질 가수 분해 분할 부위와 함께 완벽한 단백질 가수 분해 루프를 제거하고 2개의 아미노산의 최소 펩티드 결합자에 의해 남아있는 HA1 및 HA2 서열을 연결하는 것을 허용하였다. 요약하면, B 변이체는 HA2의 N-말단 아미노산 GFFGAIAGFLEG의 결실에 더하여 HA1의 C-말단에서 서열 ALKLLKER의 결실을 함유한다. 짧아진 HA1-HA2는 GG 결합자에 의해 서로 결합되었다.
도 22B에 나타난 바와 같이, HA0의 단백질 가수 분해 루프를 결실시킴으로써, 결과에 따른 HA0 단백질은, 단백질 가수 분해 루프가 제거되지 않은 HA 단백질과 비교할 때, 더 큰 적혈구 응집 능력에 의해 나타난 바와 같이 증가된 활성을 나타낸다. 활성의 증가는, 단백질 가수 분해 루프가 제거되지 않은 같은 HA 단백질의 활성과 비교할 때, 약 2% 내지 약 100%, 또는 업계의 표준 기술을 사용하여 결정된 그 사이의 어떤 양, 예를 들어, 약 10% 내지 약 50%, 또는 그 사이의 어떤 값, 예를 들어, 약 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%만큼의 적혈구 응집 능력의 증가를 의미한다.
"키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩티드"로도 불리는, "키메라 바이러스 단백질" 또는 "키메라 바이러스 폴리펩티드"는, 예를 들어, 둘 이상의 인플루엔자 타입 또는 서브타입, 또는 다른 기원의 인플루엔자에 제한되지 않는 둘 이상의 공급원의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 이것들은 단일 폴리펩티드로서 융합된다. 키메라 단백질 또는 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 나머지와 같거나, 이종 기원인 신호 펩티드를 포함할 수도 있다. 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 키메라 뉴클레오티드 서열의 전사물로서 생산될 수도 있고, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 합성 후에 분할될 수도 있고, 필요하면, 멀티머 단백질을 형성하기 위해 결합될 수도 있다. 그러므로, 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드는 또한 이황화 브리지를 통해 결합된 서브유닛을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드(즉, 멀티머 단백질)를 포함한다. 예를 들어, 둘 이상의 공급원의 아미노산을 포함하는 키메라 폴리펩티드는 서브유닛으로 가공될 수도 있고, 서브유닛은 이황화 브리지를 통해 결합되어 키메라 단백질 또는 키메라 폴리펩티드를 생산할 수도 있다. 키메라 바이러스 단백질은 또한 첫 번째 인플루엔자 바이러스의 항원성 단백질 또는 이들의 단편, 및 막관통 도메인 및 세포질 꼬리 도메인(TM/CT)을 포함하는, 두 번째 바이러스 인플루엔자 HA의 막관통 도메인 복합체(TDC)를 포함할 수도 있다. 폴리펩티드는 헤마글루티닌(HA)일 수도 있고, 폴리펩티드를 구성하는 둘 이상의 아미노산 서열 각각은 키메라 HA, 또는 키메라 인플루엔자 HA를 생산하기 위해 다른 HA들로부터 얻어질 수도 있다. 키메라 HA는 또한 단백질 합성 후에 또는 그동안에 분할되는 이종 기원 신호 펩티드(키메라 HA 전구 단백질)을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 키메라 폴리펩티드, 또는 키메라 인플루엔자 HA는 자연 발생한 것이 아니다. 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 "키메라 핵산", 또는 "키메라 뉴클레오티드 서열"로 설명될 수도 있다. 키메라 HA로 구성된 바이러스-유사 입자는 "키메라 VLP"로 설명될 수도 있다.
키메라 단백질 또는 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 나머지와 같거나, 이종 기원인 신호 펩티드를 포함할 수도 있다. 용어 "신호 펩티드"는 업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 아미노산의 짧은(약 5-30개의 아미노산) 서열을 말하며, 일반적으로 새롭게 번역된 폴리펩티드의 특정 세포 기관으로의 위치 이동을 지시하거나, 다른 것에 관하여 폴리펩티드 사슬의 특이적 도메인의 위치 결정을 도울 수도 있는 폴리펩티드의 N-말단에서 발견된다. 비-제한 예로서, 신호 펩티드는 단백질의 소포체(endoplasmic reticulum)로의 위치 이동을 표적으로 할 수도 있고 및/또는 성숙한 단백질의 분할 및 폴딩을 돕기 위한 신생 폴리펩티드의 막-고정 도메인에 관하여 N-말단 근위 도메인의 위치 결정을 도울 수도 있으며, 예를 들어, 이것은 성숙한 HA 단백질을 제한하는 것으로 생각되어서는 안 된다.
본 발명에 따라 사용될 수도 있는 키메라 바이러스 단백질 또는 키메라 바이러스 핵산의 비 제한 예는 WO 2009/076778, WO 2010/003235, 또는 WO 2010/148511에 설명된다(이것은 본원에 참고로 포함됨).
신호 펩티드
신호 펩티드(SP)는 항원성 단백질 또는 바이러스 단백질에 고유할 수도 있거나, 신호 펩티드는 발현되는 항원성 단백질 또는 바이러스 단백질의 1차 서열에 대하여 이종 기원일 수도 있다. 항원성 단백질 또는 바이러스 단백질은 하나 이상의 다른 인플루엔자 타입, 서브타입 또는 균주의 HA가 균형잡힌 제1 인플루엔자 타입, 서브타입 또는 균주의 신호 펩티드를 포함할 수도 있다. 예를 들어, HA 서브타입 H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 또는 인플루엔자 타입 B의 고유한 신호 펩티드는 식물 시스템에서 키메라 바이러스 단백질을 발현하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, SP는 인플루엔자 타입 B, H1, H3 또는 H5의 것; 또는 서브타입 H1/Bri, H1/NC, H5/Indo, H3/Bri 또는 B/Flo의 것일 수도 있다.
신호 펩티드는 또한, 예를 들어, 항원성 단백질, 바이러스 단백질 또는 바이러스 단백질 이외에 바이러스의 헤마글루티닌, 또는 식물, 동물 또는 박테리아 폴리펩티드에 고유하지 않을 수도 있다. 사용될 수도 있는 신호 펩티드의 비 제한 예는 알팔파(alfalfa) 단백질 이황화 이소머라제의 것이다("PDISP"; 수납 번호 Z1 1499의 뉴클레오티드 32-103; 또한 WO 2009/076778; WO 2010/148511, 또는 WO 2010/003235를 참고하면 되며, 이것은 본원에 참고로 포함됨). 그러므로 본 발명은 고유한, 또는 비-고유한 신호 펩티드, 및 이러한 키메라 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 키메라 바이러스 단백질을 제공한다.
그러므로 본 발명은 또한 식물에서 키메라 VLP를 생산하는 방법을 제공하며, 키메라 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산은, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산과 동시 발현된다. 제1 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물에 도입될 수도 있거나, 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다.
HA
인플루엔자 바이러스에 관하여, 용어 "헤마글루티닌" 또는 "HA"는 본원에 사용된 바와 같이 인플루엔자 바이러스 입자의 외부에서 발견되는 당단백질을 나타낸다. HA는 호모트리머 막 타입 I 당단백질이며, 일반적으로 신호 펩티드, 즉, C-말단의 막-신장 고정 부위 및 작은 세포질 꼬리를 포함하는 HA1 도메인, 및 HA2 도메인을 포함한다. HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 잘 알려져 있고 이용 가능하다 - 예를 들어, 생체방어 공중 보건 본부(BioDefence Public Health base)(Influenza Virus; URL: biohealthbase.org를 참고하면 된다) 또는 미국 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(URL: ncbi.nlm.nih.gov를 참고하면 된다)을 참고하면 되고, 이것들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
용어 "호모트리머" 또는 "호모트리머의"는 올리고머가 세 개의 HA 단백질 분자에 의해 형성된다는 것을 나타낸다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, HA 단백질은 동물 세포에서 약 75 kDa의 모노머 전구체 단백질(HA0)로 합성되며, 이것은 표면에서 신장된 트리머 단백질로 조립된다. 트리머화가 일어나기 전에, 전구체 단백질은 보존 활성화 분할 부위(융합 펩티드로도 불림)에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 폴리펩티드 사슬, HA1 및 HA2(막관통 영역을 포함)로 분할된다. HA1 세그먼트는 길이가 328개의 아미노산일 수도 있고, HA2 세그먼트는 길이가 221개의 아미노산일 수도 있다. 이 분할은 바이러스 감염성에 중요할 수도 있지만, 단백질의 트리머화에 필수적이지 않을 수도 있다. 숙주 세포의 소포체(ER) 막 내의 HA의 삽입, 신호 펩티드 분할 및 단백질 글리코실화는 동시 번역 이벤트이다. HA의 올바른 리폴딩(refolding)은 단백질의 글리코실화 및 6개의 사슬 내 이황화 결합의 형성이 필요하다. HA 트리머는 씨스(cis)- 및 트랜스(trans)-골지 복합체 내에서 조립되고, 막관통 도메인은 트리머화 공정에서 역할을 한다. 브로멜라인-처리된 HA 단백질의 결정 구조는, 막관통 도메인이 부족하며, 인플루엔자 균주 사이에서 고도로 보존된 구조를 나타낸다. HA는 감염 공정 중에 주요 형태 변화를 경험하며, 이것이 전구체 HA0이 2개의 폴리펩티드 사슬 HA1 및 HA2로 분할되는 것을 필요로 한다는 것이 또한 확립되었다. HA 단백질은 가공될 수도 있거나(즉, HA1 및 HA2 도메인을 포함함), 미가공될 수도 있다(즉, HA0 도메인을 포함함). HA 단백질은 식물, 또는 식물 세포, 발현 시스템을 사용하는 VLP의 생산 또는 형성에 사용될 수도 있다.
본 발명의 HA는 어떤 서브타입으로부터 얻어질 수도 있다. 예를 들어, HA는 서브타입 H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 또는 인플루엔자 타입 B HA의 것일 수도 있다. 본 발명의 재조합 HA는 또한 업계에 알려진 어떤 헤마글루티닌의 서열에 기초한 아미노산 서열도 포함할 수 있다 - 예를 들어, 생체방어 공중 보건 본부(Influenza Virus; URL: biohealthbase.org를 참고하면 된다) 또는 미국 생명공학 정보 센터(URL: ncbi.nlm.nih.gov를 참고하면 된다)를 참고하면 된다. 게다가, HA는 하나 이상의 최근에 생기거나 새롭게 확인된 인플루엔자 바이러스로부터 분리된 헤마글루티닌의 서열에 기초할 수도 있다.
HA, 또는 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 HA의 단편의 비-제한 예는 WO 2009/009876, WO 2009/076778; WO 2010/003225, WO 2010/003235, WO 2010/006452, WO 2011/035422 또는 WO 2010/148511에 설명된 것들을 포함한다(이것은 본원에 참고로 포함됨).
도 18에 나타난 바와 같이, B/Brisbane/60/2008의 HA는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 불량하게 발현된다(레인 "1008" 또는 "1029"를 참고하면 된다). 하지만, HA-타입 B의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현은 HA 발현의 큰 증가를 일으킨다(레인 "1008+1261"; "1009+1261" 및 1029+1261"을 참고하면 된다). HA 발현의 증가는 두 가지 고유한 타입 B HA 또는 키메라 HA 타입 B에서 관찰되었다. HA 발현은 증폭 요소(BeYDV)의 존재 또는 부재시, 및 아그로박테리움의 다양한 희석을 통해 관찰되었다. A/Perth/16/2009의 H3이 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현되었을 때, H3 발현의 비슷한 증가가 관찰되었다(도 19; 레인 "1019" H3 단독을 M2와 동시 발현된 "1019+1261" H3과 비교하면 됨).
VLP
용어 "바이러스 유사 입자(VLP)", 또는 "바이러스-유사 입자" 또는 "VLP"는 자가 조립되고 바이러스 단백질, 예를 들어, 인플루엔자 HA 단백질과 같은 구조 바이러스 단백질 또는 예를 들어, M2와 같은 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질 또는 이들 단백질의 조합을 포함하는 구조를 나타낸다. VLP는 일반적으로 감염시 생산되는 비리온과 형태적으로 및 항원과 관련하여 유사하지만, 복제하기에 충분한 유전 정보가 부족하고 따라서 비-감염성이다. 일부 예에서, VLP는 단일 단백질 종, 또는 하나 이상의 단백질 종을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 단백질 종을 포함하는 VLP에 대하여, 단백질 종은 같은 종의 바이러스의 것일 수도 있거나, 바이러스의 다른 종, 속, 아과 또는 과의 단백질을 포함할 수도 있다(ICTV 명명법에 의해 지정됨). 다른 예에서, VLP를 포함하는 단백질 종 중 하나 이상은 자연 발생한 서열로부터 변형될 수도 있다. VLP는 식물 및 곤충 숙주 세포를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생산될 수도 있다. 적합한 조건 하에 숙주 세포로부터 추출 후 및 분리 및 추가의 정제시, VLP는 온전한 구조로 정제될 수도 있다.
게다가, HA의 서브타입의 조합을 포함하는 VLP가 생산될 수도 있다. 예를 들어, VLP는 서브타입 H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 서브타입 B HA 또는 이들의 조합으로부터 하나 이상의 HA를 포함할 수도 있다. HA의 조합의 선택은 VLP로부터 제조된 백신의 의도된 사용에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 조류를 접종하는데 사용되는 백신은 HA 서브타입의 어떤 조합도 포함할 수 있는 한편, 사람을 접종하는데 유용한 VLP는 서브타입 H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 서브타입 B HA 중 하나 이상의 서브 타입을 포함할 수도 있다. 하지만, 다른 HA 서브타입 조합은 VLP의 사용에 의존하여 제조될 수도 있다. HA 서브타입의 조합을 포함하는 VLP를 생산하기 위해서, 원하는 HA 서브타입이 같은 세포, 예를 들어, 식물 세포 내에서 동시 발현될 수도 있다.
하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 B/Brisbane/60/2008의 타입 B HA 또는 H3의 발현은 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현될 때 증가된다(도 18 및 19를 참고하면 된다). H1 또는 H5 발현의 높은 수준이 M2의 존재시 또는 부재시 관찰되기 때문에(각각 도 20 및 21), 유사한 증가는 H1 또는 H5가 M2와 동시 발현될 때 관찰되지 않는다. HA는 pH-의존적 방식으로 가공되고(Reed M. L. et. al. Journal of Virology, February 2010, p. 1527-1535, Vol. 84, No. 3을 참고하면 된다), pH-의존적 형태 변화를 경험하는 것으로 알려져 있다(Skehel J.J. et. al. 1982, PNAS79: 968-972). H1 및 H5는 H3 및 타입 B HA에서 관찰된 것보다 더 낮은 pH에서 형태 변화를 나타낸다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 성숙화 및 이동 중에 골지체 내의 pH는 H1 또는 H5 폴딩에 대하여 영향을 미치지 않을 수도 있지만, 골지체 내의 낮은 pH는 H3 및 타입 B HA 폴딩에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 H3 또는 타입 B HA와 함께 동시 발현시킴으로써, 골지체 내의 pH는 증가할 수도 있고 HA 폴딩을 일으킨 후 이어서 HA 수득율을 증가시킬 수도 있다. 게다가, H1 및 H5는 H3 및 타입 B HA보다 더 낮은 pH에서 더 안정할 수도 있다. 그러므로, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 H3 또는 타입 B HA와 함께 동시 발현시킴으로써, 더 적은 HA가 골지체 내에서 분해된다.
인플루엔자 유래 단백질로부터 생산된 VLP은 본 발명에 따라 M1 단백질을 포함하지 않는다. M1 단백질은 NLP 조제물의 오염물질인 RNA에 결합하는 것으로 알려져 있으며(Wakefield and Brownlee, 1989). RNA의 존재는 VLP 생산에 대한 규제 승인을 얻을 때 바람직하지 않고, 그러므로 RNA가 없는 VLP 조제물이 유리할 수도 있다.
본원에 설명된 바와 같이 생산된 VLP는 전형적으로 뉴라민다제(NA)를 포함하지 않는다. 하지만, VLP가 HA 및 NA를 포함하는 경우 NA는 HA와 동시 발현될 수도 있다.
본 발명은 또한 VLP 단백질이 발현되는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻는 바이러스 유래 VLP를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, VLP가 식물-기반 시스템에서 발현되는 경우, VLP는 세포의 원형질막으로부터 지질 외피를 얻을 수도 있다.
일반적으로, 용어 "지질"은 지용성(친유성) 자연 발생한 분자를 나타낸다. 용어는 또한 지방산 및 그들의 유도체(트리-, 디-, 및 모노글리세리드 및 인지질), 뿐만 아니라 다른 지용성 스테롤-함유 대사산물 또는 스테롤을 나타내기 위해 더 특이적으로 사용된다. 인지질은, 당지질, 스테롤 및 단백질과 함께, 모든 생체막의 주요 성분이다. 인지질의 예는 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 등을 포함한다. 스테롤의 예는 주스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 피토스테롤을 포함한다. 200개가 넘는 피토스테롤이 다양한 식물 종에서 확인되었으며, 가장 일반적인 것은 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 델타-7-스티그마스테롤, 델타-7-아베나스테롤, 다우노스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이다. 당업자가 이해한 바와 같이, 세포의 원형질막의 지질 조성물은 세포 또는 세포가 얻어지는 유기체의 배양 또는 성장 조건에 의해 달라질 수도 있다.
세포막은 일반적으로 지질 이중층, 뿐만 아니라 다양하게 기능하는 단백질을 포함한다. 특정 지질의 국소적 농도는 지질 이중층에서 발견될 수도 있으며, '지질 뗏목(lipid raft)'으로 불린다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 지질 뗏목은 세포 내 섭취(endocytosis) 및 세포 외 유출(exocytosis), 바이러스 또는 다른 감염원의 진입 또는 배출, 세포 사이 신호 전달, 세포 내 및 세포 외 기질과 같은 세포 또는 유기체의 다른 구조적 성분과의 상호작용에서 중요한 역할을 할 수도 있다.
식물에서, 인플루엔자 VLP 버드(bud)는 원형질막으로부터 버딩되고 그러므로 VLP의 지질 조성물은 그것들의 기원을 반영한다. 본 발명에 따라 생산된 VLP는 인플루엔자의 하나 이상의 타입 또는 서브타입의 HA를 포함하며, 식물 유래 지질과 복합체를 형성한다. 식물 지질은 특이적 면역 세포를 자극할 수 있고 유발된 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 식물 막은 지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)으로 이루어져 있고 글리코스핑고지질, 사포닌, 및 피토스테롤을 함유한다. 추가적으로, 지질 뗏목은 또한 식물 원형질막에서 발견된다 - 이들 미크로도메인은 스핑고지질 및 스테롤에 풍부하다. 식물에서, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤 및 콜레스테롤을 포함하는 다양한 피토스테롤이 발생한 것으로 알려져 있다(Mongrand et al., 2004).
PC 및 PE, 뿐만 아니라 글리코스핑고지질은 항원-제공 세포(antigen-presenting cell: APC) 유사 수지상세포 및 대식세포 및 흉선 및 간에서 B 및 T 림프구를 포함하는 다른 세포와 같은 포유동물 면역 세포에 의해 발현된 CD1 분자에 결합할 수 있다(Tsuji M,. 2006). CD1 분자는 등급 I의 주요 조직 적합 복합체(histocompatibility complex: MHC) 분자와 구조적으로 유사하고 그것들의 역할은 NKT 세포(자연 살해 T 세포)에 당지질 항원을 제공하는 것이다. 활성화시, NKT 세포는 NK 세포 및 수지상세포와 같은 선천적 면역 세포를 활성화하고 또한 항체-생산 B 세포 및 T-세포와 같은 후천적 면역 세포를 활성화한다.
다양한 피토스테롤이 원형질막에서 발견될 수도 있다 - 특이적 보체는 몇 가지 인자의 이름을 지정하기 위해 종, 성장 조건, 영양 자원 또는 병원체 상태에 따라 달라질 수도 있다. 일반적으로, 베타-시토스테롤이 가장 풍부한 피토스테롤이다.
혈장-막 유래 외피와 같이, 지질 이중층과 복합체가 형성된 인플루엔자 VLP에 존재하는 피토스테롤은 이로운 백신 조성물을 제공할 수도 있다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 혈장-막 유래 외피와 같이, 지질 이중층과 복합체를 형성한 식물에서 만들어진 VLP는 다른 발현 시스템에서 만들어진 VLP보다 더 강한 면역 반응을 유발할 수도 있고, 살아있거나 약화된 전체 바이러스에 의해 유발된 면역 반응과 유사할 수도 있다.
그러므로, 일부 구체예에서, 본 발명은 식물-유래 지질 이중층과 복합체가 형성된 VLP를 제공한다. 일부 구체예에서, 식물-유래 지질 이중층은 VLP의 외피를 포함한다. 식물 유래 지질은 VLP가 생산되는 식물의 원형질막의 지질 성분을 포함할 수도 있으며, 스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 글리코스핑고지질, 피토스테롤 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물-유래 지질은 대안으로 '식물 지질'로 불릴 수도 있다. 피토스테롤의 예는 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 24-메틸콜레스테롤 및 콜레스테롤을 포함한다 - 예를 들어, Mongrand et al., 2004를 참고하면 된다.
VLP는, 예를 들어, 적혈구 응집 검정, 전자 현미경에 의해, 또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
크기 배제 크로마토그래피를 위해, 전체 가용성 단백질은 추출 버퍼에서 냉동-분쇄된 식물 재료의 샘플을 균질화함으로써(Polytron) 식물 조직으로부터 추출될 수도 있고, 불용성 재료는 원심분리에 의해 제거될 수도 있다. PEG를 이용한 침전이 사용될 수도 있다. 가용성 단백질은 정량되고, 추출물은 예를 들어, Sephacryl™에 제한되지 않는 크기 배제 기질을 통과하였다. 크로마토그래피 후에, 분획은 분획의 단백질 보체를 결정하기 위해 면역블롯에 의해 더 분석될 수도 있다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 다른 동물의 RBC에 결합하는 HA의 능력은 시알산 α2,3 또는 α2,3에 대한 HA의 친화도 및 RBC의 표면에 이들 시알산의 존재에 의해 구동된다. 인플루엔자 바이러스의 말류 및 조류 HA는 칠면조, 닭, 오리, 기니피그, 사람, 양, 말 및 소를 포함하는, 여러 종 모두의 적혈구를 응집시키는 반면에; 사람 HA는 칠면조, 닭, 오리, 기니피그, 사람 및 양의 적혈구에 결합할 것이다(또한 Ito T. et al, 1997, Virology, vol 227, p493-499; 및 Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p.74-85를 참고하면 된다).
폴딩(샤페론(Chaperon ))
발현된 바이러스 단백질의 올바른 폴딩은 다른 특성들 중에서 단백질의 안정성, 멀티머의 형성, VLP의 형성, 바이러스 단백질의 기능 및 항체에 의한 바이러스 단백질의 인식에 중요할 수도 있다. 단백질의 폴딩 및 축적은 단백질의 서열, 단백질의 상대 빈도, 세포 사이의 과밀 정도, 세포 구획의 pH, 폴딩된, 부분적으로 폴딩된 또는 폴딩되지 않은 단백질과 결합할 수도 있거나 일시적으로 결합된 보조인자의 이용 가능성, 하나 이상의 샤페론 단백질의 존재, 또는 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 인자에 의해 영향을 받을 수도 있다.
열 충격 단백질(Hsp) 또는 스트레스 단백질은 샤페론 단백질의 예이며, 이것은 단백질 합성, 세포 내 트래피킹(trafficking), 미스폴딩의 방지, 단백질 응집의 방지, 단백질 복합체의 조립 및 해체(disassembly), 단백질 폴딩, 및 단백질 분해(disaggregation)를 포함하는 다양한 세포 공정에 참여할 수도 있다. 이러한 샤페론 단백질의 예는 Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, Hsp 100, Hsp20-30, Hsp 10, Hsp 100-200, Hsp 100, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, 시클로필린, ClpP, GrpE, 유비퀴틴, 칼넥신, 및 단백질 이황화 이소머라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496(1993); 미국 특허 번호 5,232,833을 참고하면 된다). 본원에 설명된 바와 같이, 예를 들어, Hsp40 및 Hsp70에 제한되지 않는 샤페론 단백질은 바이러스 단백질의 폴딩을 확실히 하기 위해 사용될 수도 있다.
Hsp70의 예는 포유동물 세포의 Hsp 72 및 Hsc73, 박테리아, 특히 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)와 같은 미코박테리아(mycobacteria)의 DnaK(예를 들어, 바실-칼메트 구에린(Bacille-Calmette Guerin): 본원에서 Hsp 71로도 불림)를 포함한다. 대장균(Escherichia coli), 효모 및 다른 원핵생물의 DnaK, 및 에이. 탈리아나(A. thaliana)와 같은 진핵생물의 BiP 및 Grp78(Lin et al. 2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208)). Hsp70의 특정 예는 에이. 탈리아나 Hsp70이다(Genbank 참조: AY 120747.1에 의해 암호화됨). Hsp70은 ATP, 뿐만 아니라 폴딩되지 않은 폴리펩티드 및 펩티드에 특이적으로 결합함으로써, 단백질 폴딩 및 언폴딩(unfolding), 뿐만 아니라 단백질 복합체의 조립 및 해체에 참여할 수 있다.
Hsp40의 예는 대장균 및 미코박테리아와 같은 원핵생물의 DnaJ 및 알팔파와 같은 진핵생물의 HSJ1, HDJ1 및 Hsp40을 포함한다(Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Hsp40의 특정 예는 엠. 사티바(M. sativa) MsJ1이다(Genbank 참조번호: AJ000995.1). Hsp40은 다른 세포 활성 중에서, 단백질 폴딩, 열 내성 및 DNA 복제에서 분자 샤페론의 역할을 한다.
Hsps, Hsp70 및 그것의 보조샤페론 중에서, Hsp40은 번역의 안정화에 수반되고 합성이 완료되기 전에 새롭게 합성된 폴리펩티드이다. 어떤 이론에도 결부되지 않으면서, Hsp40은 폴딩되지 않은(신생 또는 새롭게 전송된) 폴리펩티드의 소수성 패치에 결합하고, 따라서 폴리펩티드와 Hsp70-ATP 복합체의 상호작용을 용이하게 한다. ATP 가수분해는 폴리펩티드, Hsp70 및 ADP 사이에서 안정한 복합체의 형성, 및 Hsp40의 방출로 이어진다. Hsp70-ADP 복합체의 폴리펩티드의 소수성 패치와의 결합은 다른 소수성 패치와의 상호작용을 방지하며, 부정확한 폴딩 및 다른 단백질과의 응집체의 형성을 방지한다(Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579에서 재검토됨).
고유한 샤페론 단백질은 낮은 수준의 조합 단백질의 올바른 폴딩을 용이하게 할 수도 있지만, 발현 수준이 증가하기 때문에, 고유한 샤페론의 풍부함은 제한 인자가 될 수도 있다. 아그로인필트레이션된 잎에서 바이러스 단백질의 높은 수준의 발현은 세포 기질에서 바이러스 단백질의 축적으로 이어질 수도 있고, Hsp70, Hsp40 또는 Hsp70 및 Hsp40 둘 다와 같은 하나 이상의 샤페론 단백질의 동시 발현은 잘못 폴딩되거나 응집된 단백질의 수준을 감소시킬 수도 있고, 바이러스-유사 입자의 형성을 허용하는 3차 및 4차 구조적 특성을 나타내는 단백질의 수를 증가시킬 수도 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 식물에서 바이러스 단백질 VLP를 생산하는 방법을 제공하며, 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산은 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화하는 제2 핵산, 및 샤페론을 암호화하는 제3 핵산과 동시 발현된다. 제1, 제2 및 제3 핵산은 같은 단계에서 식물에 도입될 수도 있거나, 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다.
N- 글리칸
식물 내에서 생산된 VLP는 식물 특이적 N-글리칸을 포함하는 바이러스 단백질을 유도할 수도 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 식물 특이적 N-글리칸을 갖는 바이러스 단백질을 포함하는 VLP를 제공한다.
게다가, 식물에서 N-글리칸의 변형이 알려져 있고(예를 들어 WO 2008/151440; WO 2010/006452; 또는 U.S. 60/944,344를 참고하면 된다; 이것은 본원에 참고로 포함됨) 변형된 N-글리칸을 갖는 바이러스 단백질이 생산될 수도 있다. 변형된 글리코실화 패턴을 포함하는, 예를 들어, 감소된 푸코실화된, 자일로실화된, 또는 푸코실화 및 자일로실화 둘 다된 N-글리칸을 갖는 바이러스 단백질이 얻어질 수도 있거나, 푸코실화, 자일로실화, 또는 둘 다가 없는, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 바이러스 단백질이 얻어질 수도 있다. 게다가, 번역 후 변형의 조절, 예를 들어, 말단 갈락토스의 추가는 바이러스 단백질을 발현하는 야생형 식물과 비교할 때 발현된 바이러스 단백질의 푸코실화 및 자일로실화의 감소를 일으킬 수도 있다.
예를 들어, 제한하는 것으로 생각되어서는 안 되는, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 바이러스 단백질의 합성은 원하는 단백질을, 예를 들어, 포유동물 GalT, 또는 사람 GalT에 제한되지 않는 베타-1.4갈락토실트랜스퍼라제(GalT)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 동시 발현시킴으로써 달성될 수도 있지만 또 다른 공급원의 GalT 또한 사용될 수도 있다. GalT의 촉매 도메인은 또한 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제(GNT1)의 CTS 도메인(즉, 세포질 꼬리, 막관통 도메인, 줄기 영역)에 융합되어 GNT1-GalT 하이브리드(hybrid) 효소를 생산할 수도 있고, 하이브리드 효소는 바이러스 단백질과 동시 발현될 수도 있다. 바이러스 단백질은 또한, 예를 들어, 포유동물 GnT-III 또는 사람 GnT-III에 제한되지 않는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 III(GnT-III)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 함께 동시 발현될 수도 있지만 다른 공급원의 GnT-III가 또한 사용될 수도 있다. 추가적으로, GNT-III에 융합된 GNT1의 CTS를 포함하는 GNT1-GnT-III 하이브리드 효소도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 변형된 N-글리칸을 갖는 하나 이상의 바이러스 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다.
서열
본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는 다음을 포함한다:
핵산 분자에 의해 암호화된 H2 단백질은 A/Singapore/1/57(H2N2) 균주의 것일 수도 있다;
핵산 분자에 의해 암호화된 H3 단백질은 A/Brisbane 10/2007(H3N2), A/Wisconsin/67/2005(H3N2) 균주, A/Victoria/361/2011(H3N2) 또는 A/Perth/ 16/2009(H3N2)의 것일 수도 있다;
핵산 분자에 의해 암호화된 H6 단백질은 A/Teal/HongKong/W312/97(H6N1) 균주의 것일 수도 있다;
핵산 분자에 의해 암호화된 H7 단백질은 또한 A/Equine/Prague/56(H7N7) 균주의 것일 수도 있다;
핵산 분자에 의해 암호화된 H9 단백질은 A/HongKong/1073/99(H9N2) 균주의 것일 수도 있다;
핵산에 의해 암호화된 B 서브타입의 HA 단백질은 B/Florida/4/2006, B/Malaysia/2506/2004, B/Wisconsin/1/2010, 또는 B/Brisbane/60/2008 균주의 것일 수도 있다.
본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는 또한 WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/148511; WO 2010/003235; WO 2010/006452에 설명된 것들을 포함하며, 이것들은 본원에 참고로 포함된다. H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 및 타입 B HA의 이러한 HA 단백질을 암호화하는 아미노산 분자의 서열의 예는 업계에 알려져 있다. 예를 들어, H3 또는 B 서브타입은 SEQ ID NO: 25 또는 30을 포함한다. 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 서열은, 예를 들어, 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Wisconsin/1/2010의 HA, 또는 인플루엔자 A/Perth/16/2009 또는 A/Victoria/361/2011의 H3일 수도 있다. 다른 예는 HA 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 서열을 포함하며 SEQ ID NO: 41에 의해 정의된 서열과 같이, 하지만 이에 제한되지 않는, HA 단백질의 단백질 가수 분해 루프는 결실되었다.
본 발명은 또한, 예를 들어, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16의 HA 또는 타입 B HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, SEQ ID NO: 28, 43, 23은 B, 단백질 가수 분해 루프가 결실된 B 또는 H3의 HA를 암호화한다. 엄격한 잡종화 조건 하에 SEQ ID NO: 28, 43, 23에 대하여 잡종화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 잡종화 조건 하에 SEQ ID NO: 28, 43, 23의 보체에 대하여 잡종화하는 뉴클레오티드 서열 각각은 발현될 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하고 VLP는 항체의 생산을 유발한다. 예를 들어, 식물 세포 내의 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 B 또는 H3의 성숙한 HA를 포함하는 HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. VLP는 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다. 뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 9, 12, 엄격한 잡종화 조건 하에 SEQ ID NO: 9, 12에 대하여 잡종화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 잡종화 조건 하에 SEQ ID NO: 9, 12의 보체에 대하여 잡종화하는 뉴클레오티드 서열에 제한되지 않는, 제2 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동시 발현될 수도 있으며, 제2 뉴클레오티드 서열은 양성자 채널 단백질을 암호화하고 VLP를 형성한다. 바람직하게는, VLP는 항체의 생산을 유발하고 VLP는 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다.
예를 들어, 식물 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 바이러스 단백질, 예를 들어, HA0, 단백질 가수 분해 루프가 결실되거나 변형된 HA0 단백질, 예를 들어, 서브타입 H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, 서브타입 B HA에 제한되지 않는, 하나 이상의 인플루엔자 타입 또는 서브타입의 HA1 또는 HA2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. VLP는 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다.
엄격한 잡종화 조건 하에서 잡종화는 업계에 알려져 있다(예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 and supplements; Maniatis et al., in Molecular Cloning(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001을 참고하면 된다; 이것들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 이러한 엄격한 잡종화 조건의 예는 65℃에서 4 X SSC에서 약 16-20시간 잡종화 후, 이어서 65℃에서 0.1 X SSC에서 한 시간 동안 세척하거나, 65℃에서 0.1 X SSC에서 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척하는 것일 수도 있다. 대안으로, 전형적인 엄격한 잡종화 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 4 X SSC에서 하룻밤 동안(16-20시간) 이후, 이어서 65℃에서 0.1 X SSC에서 한 시간 동안 세척하거나, 65℃에서 0.1 X SSC에서 각각 20 또는 30분 동안, 또는 하룻밤 동안(16-20시간) 두 번 세척하는 것, 또는 65℃에서 처치(Church) 수성 포스페이트 버퍼(7% SDS; 0.5M NaP04 버퍼 pH 7.2; 10 mM EDTA)에서 잡종화 후, 50℃에서 0.1 X SSC, 0.1% SDS에서 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척, 또는 2 X SSC, 0.1% SDS에서 65℃에서 각각 20 또는 30분 동안 두 번 세척하는 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 B(SEQ ID NO: 28), 단백질 가수 분해 루프가 결실되거나 변형된 B(SEQ ID NO: 43), H3(SEQ ID NO: 23)의 HA, 또는 SEQ ID NO: 23, 28, 43, 46, 51, 57, 또는 61 중 하나 이상에 의해 암호화된 HA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%) 또는 그 사이의 서열 동일성, 또는 서열 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 뉴클레오티드 서열은 발현될 때 VLP를 형성하는 헤마글루티닌 단백질을 암호화하고, VLP는 항체의 생산을 유발한다. 예를 들어, 식물 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는 B 또는 H3의 미가공된 및/또는 성숙한 HA, 또는 단백질 가수 분해 루프가 결실된 미가공된 및/또는 성숙한 HA를 포함하는 HA에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. VLP는 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다.
본 발명은 또한 M2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 9, 12)과 약 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 사이의 서열 동일성, 또는 서열 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 뉴클레오티드 서열은 구조 바이러스 단백질과 동시 발현될 때 VLP를 형성하는, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질을 암호화한다. 바람직하게는, VLP는 항체의 생산을 유발하고 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다.
서열 동일성 또는 서열 유사성은 DNASIS(예를 들어, 다음 파라미터를 사용하지만, 이에 제한되지 않음: 갭 패널티(GAP penalty) 5, 상단 대각선의 # 5, 고정된 갭 패널티 10, k-투플(tuple) 2, 플로팅 갭(floating gap) 10, 및 창 크기 5) 내에서 제공되는 것과 같은 뉴클레오티드 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수도 있다. 하지만, 비교되는 서열 정렬의 다른 방법이 업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 Smith & Waterman(1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman(1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 알고리즘, 및 이들 알고리즘의 전산화 실행(예를 들어 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST), 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의한 것이다. 인플루엔자의 다른 균주의 HA의 서열 정렬의 예는 도 24에서 발견될 수 있다.
"면역 반응"은 일반적으로 후천적 면역 시스템의 반응을 나타낸다. 후천적 면역 시스템은 일반적으로 체액 반응, 및 세포-매개 반응을 포함한다. 체액 반응은 분비된 항체에 의해 매개되는 면역성의 양태이며, B 림프구 계통의 세포(B 세포)에서 생산된다. 분비된 항체는 침입하는 미생물(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아)의 표면상의 항원에 결합하며, 그것들을 파괴하기 위해 표시를 한다. 체액 면역성은 일반적으로 항체 생산 및 이를 동반하는 공정, 뿐만 아니라 Th2 세포 활성화 및 시토킨 생산, 기억 세포 발생, 식균작용의 옵소닌 촉진, 병원체 제거 등을 포함하는, 항체의 효과기 기능을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "조절하다" 또는 "조절" 등은 일반적으로 알려져 있거나 사용되는 몇 가지 검정 중 어느 것에 의해서도 결정되는 특정 반응 또는 파라미터의 증가 또는 감소를 나타내며, 이것들 중 일부는 본원에 예시된다.
세포-매개된 반응은 항체를 수반하지 않지만, 대식세포, 자연 살해 세포(NK), 항원-특이적 세포 독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 반응하여 다양한 시토킨의 방출을 수반한다. 세포-매개된 면역성은 일반적으로 몇 가지 Th 세포 활성화, Tc 세포 활성화 및 T-세포 매개된 반응을 나타내기 위해 사용된다. 세포 매개된 면역성은 바이러스 감염에 반응하는데 있어서 특히 중요하다.
예를 들어, 항원 특이적 CD8 양성 T 림프구의 유발은 ELISPOT 검정을 사용하여 측정될 수도 있다; CD4 양성 T-림프구의 자극은 증식 검정을 사용하여 측정될 수도 있다. 항-인플루엔자 항체 역가는 ELISA 검정을 사용하여 정량될 수도 있다; 항원-특이적 또는 교차 반응성 항체의 이소타입은 또한 항-이소타입 항체(예를 들어, 항-IgG, IgA, IgE 또는 IgM)를 사용하여 측정될 수도 있다. 이러한 검정을 수행하기 위한 방법 및 기술은 업계에 잘 알려져 있다.
교차 반응 HAI 역가는 또한 백신 서브타입에 관련된 바이러스의 다른 균주에 대한 면역 반응의 효능을 입증하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들어, 제1 균주(예를 들어 A/Indonesia 5/05의 VLP)의 백신 조성물로 면역화된 대상체의 혈청은 전체 바이러스 또는 바이러스 입자의 제2 균주(예를 들어 A/Vietnam/1194/2004)와 함께 HAI 검정에 사용될 수도 있고, HAI 역가가 결정된다.
시토킨 존재 또는 수준이 또한 정량될 수도 있다. 예를 들어, T-보조 세포 반응(Th1/h2)은 ELISA(예를 들어 BD Biosciences OptEIA 키트)를 사용하여 IFN-γ 및 IL-4를 분비하는 세포의 측정을 특징으로 할 것이다. 대상체로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PMBC) 또는 비장 세포가 배양되어, 상층액이 분석될 수도 있다. T 림프구는 또한 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)에 의해, 마커 특이적 형광 표지 및 업계에 알려진 방법을 사용하여 정량될 수도 있다.
미세중화 검정은 또한 대상체의 면역 반응을 특성화하기 위해 실행될 수도 있고, 예를 들어, Rowe et al., 1973의 방법을 참고하면 된다. 바이러스 중화 역가는 1) 세포의 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 고정/채색 후 용해 플라크(plaque)의 열거(플라크 검정); 2) 배양물에서 세포 용해의 현미경 관찰; 3) NP 바이러스 단백질의 ELISA 및 분광 광도 법적 검출(숙주 세포의 바이러스 감염과 관련됨)을 포함하는 여러 방법으로 얻어질 수도 있다.
구조물
본 발명은 상기 설명된 바와 같이, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질 또는 식물에서 작동 가능한 조절 요소에 작동 가능하게 결합된 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 구조물과 더 관련된다.
식물 세포에서 작동 가능한 조절 요소 및 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 것의 예는 플라스토시아닌 조절 영역(US 7,125,978; 이것은 본원에 참고로 포함됨), 또는 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제의 조절 영역(RuBisCO; US 4,962,028; 이것은 본원에 참고로 포함됨), 클로로필 a/b 결합 단백질(CAB; Leutwiler et al; 1986; 이것은 본원에 참고로 포함됨), ST-LS1(광계 II의 산소-전개 복합체와 결합되고 Stockhaus et al 1987, 1989에 의해 설명됨; 이것은 본원에 참고로 포함됨)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조절 요소
본 출원에서 용어 "조절 영역", "조절 요소" 또는 "프로모터"의 사용은 항상은 아니지만, 전형적으로 유전자의 단백질 암호화 영역의 상류에 있는 핵산의 일부를 반영하는 것을 의미하며, 이것은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA 및 RNA 둘 다로 구성될 수도 있다. 조절 영역이 활성이고, 원하는 유전자와 작동 가능한 결합에 있거나, 이와 작동 가능하게 결합될 때, 이것은 원하는 유전자의 발현을 일으킬 수도 있다. 조절 요소는 기관 특이성을 매개하거나, 발생적 또는 일시적 유전자 활성화를 제어할 수 있을 수도 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소를 포함할 수도 있으며, 코어 프로모터 요소는 기초 프로모터 활성을 나타내고, 요소는 외부 자극에 대한 반응을 유발할 수 있고, 요소는 음성 조절 요소 또는 전사 인핸서와 같이 프로모터 활성을 매개한다. "조절 영역"은 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 전사 후에 활성인 요소, 예를 들어, 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 억제자, 상류 활성화 서열, 및 mRNA 불안정화 결정 요인과 같이 유전자 발현을 조절하는 조절 요소들을 포함할 수도 있다. 이들 후자 요소 중 몇 가지는 암호화 영역에 가깝게 위치할 수도 있다.
본 개시의 맥락에서, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 전형적으로 항상은 아니지만, 보통 구조 유전자의 암호화 서열에 대해 상류에 있는 DNA의 서열을 나타내며, 이것은 특정 부위에서 시작하기 위해 전사에 필요한 RNA 폴리머라제 및/또는 다른 인자에 대한 인식을 제공함으로써 암호화 영역의 발현을 제어한다. 하지만, 인트론 내에 위치한 다른 뉴클레오티드 서열, 또는 서열의 3'이 원하는 암호화 영역의 발현의 조절에 기여할 수도 있는 것으로 이해되어야 한다. 특정 부위에서 개시를 보장하기 위한 RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자에 대한 인식을 제공하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 모두는 아니지만, 대부분의 프로모터 요소는 TATA 박스, 보통 전사 시작 부위의 상류의 대략 25 염기쌍에 위치한 아데노신 및 티미딘 뉴클레오티드 염기 쌍으로 구성된 보존된 핵산 서열을 함유한다. 프로모터 요소는 전사의 개시의 원인이 되는 기초 프로모터 요소, 뿐만 아니라 유전자 발현을 변형시키는 다른 조절 요소(상기 나열됨)를 포함한다.
여러 타입의 조절 영역이 있는데, 발생적으로 조절되거나, 유발성 또는 구성적인 것들을 포함한다. 발생적으로 조절되거나, 제어 하에 유전자의 차등적 발현을 제어하는 조절 영역은 특정 기관 또는 기관의 조직 내에서 상기 기관 또는 조직의 발달 중의 특정 시간에 활성화된다. 하지만, 발달 적으로 조절되는 몇몇 조절 영역은 바람직하게 특정 발달 단계에서 특정 기관 또는 조직 내에서 활성일 수도 있고, 그것들은 또한 발생적으로 조절되는 방식으로, 또는 식물 내의 다른 기관 또는 조직의 기초 수준에서 활성일 수도 있다. 조직-특이적 조절 영역의 예, 예를 들어, 특이적 조절 영역은 나핀(napin) 프로모터, 및 크루시페린 프로모터를 포함한다(Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 플라스토시아닌 프로모터를 포함한다(US 7,125,978을 참고하면 되며, 이것은 본원에 참고로 포함됨).
유발성 조절 영역은 유발 물질(inducer)에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 유발 물질의 부재시, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 유발성 조절 영역에 특이적으로 결합하여 전사를 활성화하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재할 수도 있으며, 이것은 유발 물질에 의해 활성 형태로 직접적으로 또는 간접적으로 전환된다. 하지만, 단백질 인자는 또한 없을 수도 있다. 유발 물질은 단백질, 대사 산물, 성장 조절 물질, 제초제 또는 페놀 화합물과 같은 화학 작용제 또는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 바이러스와 같은 병원체 또는 질병 인자의 작용을 통해 간접적으로 도입된 생리학적 스트레스일 수 있다. 유발성 조절 영역을 함유하는 식물 세포는 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 외부에서 유발 물질을 세포 또는 식물에 적용함으로써 유발 물질에 노출될 수도 있다. 유발성 조절 요소는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유래될 수도 있다(예를 들어 Gatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358을 참고하면 되고; 이것은 참고로 포함된다). 잠재적 유발성 프로모터의 예는 테트라시클린-유발성 프로모터(Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48,89-108; 이것은 참고로 포함된다), 스테로이드 유발성 프로모터(Aoyama. T. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404; 이것은 참고로 포함된다) 및 에탄올-유발성 프로모터(Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 이것은 참고로 포함된다), 시토킨 유발성 IB6 및 CKI 1 유전자(Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; 이것은 참고로 포함된다) 및 옥신 유발성 요소, DR5(Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; 이것은 참고로 포함된다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구성적 조절 영역은 식물의 다양한 부분을 통해 및 계속해서 식물 발달을 통해 유전자의 발현을 지시한다. 알려진 구성적 조절 요소의 예는 CaMV 35S 전사물(Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), 쌀 액틴 1(Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), 액틴 2(An et al, 1996, Plant J., 10: 107-121), 또는 tms 2(U.S. 5,428,147, 이것은 본원에 참고로 포함됨), 및 트리오스포스페이트 이소머라제 1(Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자(Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 애기장대 유비퀴틴 1 및 6 유전자(Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 및 담배 번역 개시 인자 4A 유전자(Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004)와 결합된 프로모터를 포함한다.
용어 "구성적"은 본원에 사용된 바와 같이 반드시 구성적 조절 영역의 제어 하에 유전자는 모든 세포 타입에서 같은 수준으로 발현되지만, 풍부함의 변화가 종종 관찰된다 하더라도 광범위한 세포 타입에서 발현된다는 것을 나타내지 않는다. 구성적 조절 요소는 다른 서열과 커플링되어 그것들이 작동 가능하게 결합되는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 더 향상시킬 수도 있다. 예를 들어, CPMV-HT 시스템은 동부 모자이크 바이러스(CPMV)의 번역되지 않은 영역으로부터 유래되고 관련된 암호화 서열의 향상된 번역을 입증한다. "고유한"은 핵산 또는 아미노산 서열이 자연 발생하거나, "야생형"인 것을 의미한다. "작동 가능하게 결합된"은 특정 서열, 예를 들어, 원하는 조절 요소 및 암호화 영역이 직접적으로 또는 간접적으로, 유전자 발현의 매개 또는 조절과 같은 의도된 기능을 수행하기 위해 상호작용한다는 것을 의미한다. 작동 가능하게 결합된 서열의 상호작용은, 예를 들어, 작동 가능하게 결합된 서열과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수도 있다.
구조 바이러스 단백질과 같은 하나 이상의 바이러스 단백질 또는, 예를 들어, 양성자 채널 단백질에 제한되지 않는 채널 단백질은, 예를 들어, 코모바이러스-기반 발현 카세트 및 제미니바이러스-기반 증폭 요소에 제한되지 않는, 바이러스 기반 DNA 또는 RNA 발현 시스템을 포함하는 발현 시스템에서 발현될 수도 있다.
본원에 설명된 발현 시스템은 이립형(bipartite) 바이러스에 기초한 발현 카세트, 또는 이립형 게놈을 갖는 바이러스를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이립형 바이러스는 코모비리대(Comoviridae) 과의 것일 수도 있다. 코모비리대 과의 속은 코모바이러스, 네포바이러스(Nepovirus), 파바바이러스(Fabavirus), 체라바이러스(Cheravirus) 및 사드와바이러스(Sadwavirus)를 포함한다. 코모바이러스는 동부 모자이크 바이러스(CPMV), 중증 동부 모자이크 바이러스(Cowpea severe mosaic virus: CPSMV), 호박 모자이크 바이러스(Squash mosaic virus: SqMV), 붉은 클로버 반점 바이러스(Red clover mottle virus: RCMV), 콩 껍질 반점 바이러스(Bean pod mottle virus: BPMV), 순무 원형반점 바이러스(Turnip ringspot virus: TuRSV), 잠두 진성 모자이크 바이러스(Broad bean true mosaic virus; BBtMV), 잠두 얼룩 바이러스(Broad bean stain virus: BBSV), 무 모자이크 바이러스(Radish mosaic virus: RaMV)를 포함한다. 본 발명의 다양한 양태에 유용할 수도 있는 인핸서 요소를 포함하는 코모바이러스 RNA-2 서열의 예는 CPMV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 003550), RCMV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 003738), BPMV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 003495), CPSMV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 003544), SqMV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 003800), TuRSV RNA-2(GenBank 수납 번호 NC 013219.1), BBtMV RNA-2(GenBank 수납 번호 GU810904), BBSV RNA2(GenBank 수납 번호 FJ028650), RaMV(GenBank 수납 번호 NC 003800)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이립형 코모바이러스 RNA 게놈의 세그먼트는 RNA-1 및 RNA-2로 불린다. RNA-1은 복제에 수반되는 단백질을 암호화하는 한편, RNA-2는 세포-대-세포 이동 및 두 개의 캡시드(capsid) 단백질에 필요한 단백질을 암호화한다. CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV, 또는 BPMV를 포함하는 어떤 적합한 코모바이러스-기반 카세트가 사용될 수도 있으며, 예를 들어, 발현 카세트는 CPMV에 기초할 수도 있다.
"발현 카세트"는 숙주 세포에서 원하는 핵산의 전사에 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에, 및 이에 작동 가능하게(또는 작동 가능하게) 결합된 원하는 핵산을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
CPMV의 게놈 RNA 둘 다의 전체 길이 복제-컴피턴트(competent) cDNA 카피로 니코티아나 벤타미아나의 형질전환이 생산적인 감염을 일으킬 수 있다는 것이 나타났다(Liu et al., 2004, Virology 323, 37-48, 본원에 참고로 포함됨). CPMV-기반 발현 카세트의 예는 WO 2007/135480; WO 2009/087391; 및 Sainsbury F. et al., (2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218; Sainsbury F. et al., (2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; 이 문서는 본원에 참고로 포함됨)에서 설명된다. 제한하는 것으로 생각되지 않아야 하는 예로서, 5' 선도 서열에서 발견된 처음 두 개의 번역 개시 코돈이 결실되는 동부 모자이크 바이러스(CPMV)의 게놈 RNA 2로부터 얻은 번역되지 않은 영역(UTR)은 WO 2009/087391에 설명된 바와 같이 사용될 수도 있다. CaMV 35S 프로모터 및 노팔린 신타제(NOS) 종결자에 결합될 때, 변형된 CPMV UTR은 플랭킹(flanking) 암호화 영역의 번역을 향상시켰다. CPMV-기반 발현 시스템은 CPMV-HT로 지명되었다(과번역 가능함). 그러므로 본 발명의 발현 카세트, 발현 구조물 및 발현 시스템은 또한 예를 들어, CPMV-HT 발현 시스템과 같은 CPMV-기반 발현 시스템을 포함할 수도 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 표적 개시 부위가 돌연변이된, 코모바이러스와 같은 이립형 RNA 바이러스의 RNA-2 게놈 세그먼트로부터 유래된(또는 이와 상동성을 공유하는) 발현 인핸서 서열은 원하는 핵산 서열을 발현하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 이립형 바이러스의 RNA-2 게놈 세그먼트로부터 유래된 서열의 발현을 증가시키는 과정, 또는 이의 번역 향상 활성을 더 제공하며, 이 과정은 그 안에 표적 개시 부위가 돌연변이 되게 하는 단계를 포함한다.
"인핸서" 서열(또는 인핸서 요소)은 표적 개시 부위가 돌연변이된, 코모바이러스와 같은 이립형 RNA 바이러스의 RNA-2 게놈 세그먼트로부터 유래된(또는 이와 상동성을 공유하는) 서열을 포함한다. 이러한 서열은 그것들이 부착되는 이종 기원 ORF의 하류 발현을 향상시킬 수 있다. 제한 없이, 이러한 서열은 전사된 RNA에 존재할 때, 그것들이 부착되는 이종 기원 ORF의 번역을 향상시킬 수 있다고 생각된다.
발현 시스템은 또한 제미니바이러스의 증폭 요소, 예를 들어, 황고병 바이러스(BeYDV)의 증폭 요소를 포함할 수도 있다. BeYDV는 쌍자엽 식물에 적응된 매스트레바이러스(Mastrevirus) 속에 속한다. BeYDV은 단일 가닥 원형 DNA 게놈을 갖는 단립형이고 롤링 서클 메카니즘(rolling circle mechanism)에 의해 매우 많은 카피 수로 복제할 수 있다. BeYDV-유래된 DNA 레플리콘(replicon) 벡터 시스템이 식물에서 신속한 고수율 단백질 생산에 사용되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 구절 "증폭 요소"는 제미니바이러스 게놈의 하나 이상의 긴 유전자 간 영역(LIR)의 적어도 일부를 포함하는 핵산 세그먼트를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "긴 유전자 간 영역"은 제미니바이러스 Rep 단백질에 의한 절제 및 복제를 매개할 수 있는 rep 결합 부위를 함유하는 긴 유전자 간 영역의 영역을 나타낸다. 일부 양태에서, 하나 이상의 LIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 제미니 바이러스 게놈의 짧은 유전자 간 영역(SIR)을 더 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "짧은 유전자 간 영역"은 상보성 가닥(매스트레바이러스의 짧은 IR(SIR))을 나타낸다. 어떤 적합한 제미니바이러스-유래 증폭 요소도 본원에 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 2000/20557; WO 2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bio engineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)을 참고하면 되고; 이것은 본원에 참고로 포함된다. 하나 이상의 LIR, 예를 들어, 두 개의 LIR이 구조물에 사용되면, 원하는 프로모터, CMPV-HT 영역 및 핵산 서열 및 종결자는 두 개의 LIR 각각에 의해 나누어진다.
본원에 설명된 바와 같이, 니코티아나 벤타미아나 잎의 아그로인필트레이션에 의한 황고병 바이러스(BeYDV)-유래된 벡터 및 Rep/RepA-공급 벡터의 동시 전달은 효율적인 증폭 및 왕성한 단백질 생산을 일으킨다.
코모바이러스-기반 발현 카세트 및 제미니바이러스-유래된 증폭 요소는 각각 제1 및 제2 벡터에 포함될 수도 있거나, 구성 성분은 하나의 벡터에 포함될 수도 있다. 두 개의 벡터가 사용되면, 제1 및 제2 벡터는 식물 세포로 동시에 또는 개별적으로 도입될 수도 있다. 바이러스 레플리카제는 또한 원하는 핵산의 발현을 증가시키기 위해 본원에 설명된 발현 시스템에 포함될 수도 있다. 레플리카제의 비-제한 예는 BeYDV Rep 및 RepA를 암호화하는 BeYDV 레플리카제(pREP110)이다(C2/C1; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714; 이것은 본원에 참고로 포함됨).
전사 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing: PTGS)은 식물에서 이식 유전자의 제한적 발현에 수반될 수도 있고, 토마토 덤불 성장 위축 바이러스(Tomato bushy stunt virus)의 p19 또는 감자 바이러스 Y(HcPro)로부터 침묵 억제자의 동시 발현은 이식 유전자 mRNA의 특이적 분해에 대응하기 위해 사용될 수도 있다(Brigneti et al., 1998).
대안의 침묵 억제자는 업계에 잘 알려져 있고 본원에 설명된 바와 같이 사용될 수도 있으며(Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; 이것은 본원에 참고로 포함된다), 예를 들어, TEV-p1/HC-Pro(담배 식각 바이러스(Tobacco etch vrus)-p1/HC-Pro), BYV-p21, 토마토 주름 바이러스(Tomato crinkle virus)의 캡시드 단백질(TCV -CP), 오이 모자이크 바이러스의 2b(CMV-2b), 감자 바이러스 X의 p25(PVX-p25), 감자 바이러스 M의 p11(PVM-p11), 감자 바이러스 S의 p11(PVS-p11), 블루베리 스코치 바이러스(Blueberry scorch virus)의 p16(BScV-p16), 갈색 줄무늬 오갈병(Citrus tristeza virus)의 p23(CTV-p23), 포도 덩굴 잎말이병-관련 바이러스(Grapevine leafroll-associated virus)-2의 p24(GLRaV-2 p24), 포도 덩굴 바이러스 A의 p10(GVA-p10), 포도 덩굴 바이러스 B의 p14(GVB-p14), 헤라클레움 잠복성 바이러스(Heracleum latent virus)의 p10(HLV-p10), 또는 마늘 일반 잠복성 바이러스(Garlic common latent virus)의 p16(GCLV-p16)에 제한되지 않는다. 그러므로, 예를 들어, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 또는 GVA-p10에 제한되지 않는 침묵 억제자는 식물 내에서 높은 수준의 단백질 생산을 더 확인하기 위해 원하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 함께 동시 발현될 수도 있다.
"동시 발현됨"은 식물 내에서, 및 식물의 같은 조직 내에서 둘, 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열이 거의 동시에 발현된다는 것을 의미한다. 하지만, 뉴클레오티드 서열은 정확히 동시에 발현될 필요는 없다. 오히려, 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 암호화된 생성물이 상호작용할 기회를 갖는 방식으로 발현된다. 예를 들어, 원하는 단백질의 글리코실화를 변형시키는 단백질은 원하는 단백질의 글리코실화의 변형이 일어나도록 원하는 단백질이 발현되는 기간 전에 또는 도중에 발현될 수도 있다. 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 둘 이상의 서열이 두 서열 모두가 발현되는 조건 하에 거의 동시에 식물 내에 도입되는 경우, 일시적인 발현 시스템을 사용하여 동시 발현될 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열 중 하나, 예를 들어, 원하는 단백질의 글리코실화 프로파일을 변형시키는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 플랫폼(platform) 식물은, 일시적으로 또는 안정한 방식으로, 원하는 단백질을 암호화하는 추가적인 서열로 형질전환될 수도 있다. 이 경우에, 원하는 단백질의 글리코실화 프로필을 변형시키는 단백질을 암호화하는 서열은, 원하는 발달의 단계 중에, 원하는 조직 내에서 발현될 수도 있거나, 그것의 발현은 유발성 프로모터를 사용하여 유발될 수도 있고, 원하는 단백질을 암호화하는 추가적인 서열은 유사한 조건 하에 및 같은 조직에서, 뉴클레오티드 서열이 동시 발현되는 것을 확인하기 위해 발현될 수도 있다.
하나 이상의 바이러스 단백질은 뉴클레오티드 서열의 전사물로서 생산될 수도 있고, 단백질은 합성 후에 분할될 수도 있고, 필요하면, 결합되어 멀티머 단백질을 형성할 수도 있다. 그러므로, 하나 이상의 바이러스 단백질은 또한 이황화 브리지를 통해 결합된 서브유닛을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드(즉 멀티머 단백질)를 포함한다. 예를 들어, 둘 이상의 공급원의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서브유닛으로 가공될 수도 있고, 서브유닛은 이황화 브리지를 통해 결합되어 단백질을 생산할 수도 있다.
본 발명의 하나 이상의 핵산 서열 또는 유전적 구조물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 구조물, 또는 벡터에 의해 형질전환된 적합한 식물 숙주에서도 발현될 수 있다. 적합한 숙주의 예는 알팔파, 카놀라(canola), 브라시카(Brassica) 종, 옥수수, 니코티아나 종, 감자, 인삼, 완두콩, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기, 목화 등을 포함하는 농작물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 유전적 구조물은 3' 번역되지 않은 영역을 더 포함할 수 있다. 3' 번역되지 않은 영역은 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현을 초래할 수 있는 어떤 다른 조절 신호도 함유하는 DNA 세그먼트를 포함하는 유전자의 일부를 나타낸다. 폴리아데닐화 신호는 보통 mRNA 전구체의 3' 끝에 폴리아데닐 산의 트랙(track)의 추가를 초래하는 것을 특징으로 한다. 폴리아데닐화 신호는 보통 기본형 5' AATAAA-3'에 대한 상동성의 존재에 의해 인식되지만 변화가 드문 일은 아니다. 적합한 3' 영역의 비-제한 예는 노팔린 신타제(NOS) 유전자와 같은 아그로박테리움 종양 유발(Ti) 플라스미드 유전자, 대두 저장 단백질 유전자와 같은 식물 유전자, 리불로스-I,5-비스포스페이트 카르복실라제 유전자의 작은 서브유닛(ssRUBISCO; US 4,962,028; 이것은 본원에 참고로 포함됨), US 7,125,978에 설명된, 플라스토시아닌 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터(이것은 본원에 참고로 포함됨)의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 전사된 번역되지 않은 영역이다.
본 발명의 유전적 구조물 중 하나 이상은 또한, 필요하면, 추가의 인핸서, 번역 또는 전사 인핸서를 더 포함할 수도 있다. 인핸서는 전사되는 서열에 대하여 5' 또는 3'에 위치할 수도 있다. 인핸서 영역은 당업자에게 잘 알려져 있고, ATG 개시 코돈, 인접한 서열 등을 포함할 수도 있다. 개시 코돈은, 존재하면, 전사된 서열의 올바른 번역을 제공하기 위해 암호화 서열의 리딩 프레임 상에 있을 수도 있다("인 프레임(in-frame)").
"형질전환"은 유전자 형으로, 표현형으로 또는 둘 다로 나타나는 유전 정보(뉴클레오티드 서열)의 이종 간(interspecific) 이동을 의미한다. 구조물에서 숙주로의 유전 정보의 이종 간 이동은 일시적일 수도 있고 유전 정보의 이동은 유전되지 않거나 이동은 유전적이고 유전 정보의 이동은 안정한 것으로 생각된다.
본 발명의 구조물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세주입, 전기천공법 등을 사용하여 식물 세포로 도입될 수 있다. 이러한 기술의 재검토를 위해, 예를 들어 Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463(1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); and Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell(eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579(1997)을 참고하면 된다. 다른 방법은 직접적인 DNA 흡수, 리포솜의 사용, 예를 들어, 원생동물, 미세주입, 미세투사 또는 위스커(whisker), 및 진공 침윤를 사용하는 전기천공법을 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250(1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73(1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff(J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), 미국 특허 번호 4,945,050; 5,036,006; 및 5,100,792, 1995년 5월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 08/438,666, 및 1992년 9월 25일에 출원된 07/951,715를 참고하면 된다(이것들 모두가 본원에 참고로 포함된다).
하기 설명된 바와 같이, 일시적인 발현 방법은 본 발명의 구조물을 발현하기 위해 사용될 수도 있다(Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348을 참고하면 되고; 이것은 본원에 참고로 포함됨). 대안으로, Kapila et al., 1997에 의해 설명된 진공-기반 일시적 발현 방법이 사용될 수도 있다(이것은 본원에 참고로 포함됨). 이들 방법은 예를 들어, 아그로-접종 또는 아그로-침윤, 주사기 침윤의 방법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않지만, 다른 일시적인 방법이 또한 상기 지정된 바와 같이 사용될 수도 있다.
아그로-접종, 아그로-침윤, 또는 주사기 침윤로, 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아(Agrobacteria)의 혼합물은 조직의 세포 내 공간, 예를 들어, 잎, 식물의 지상부(줄기, 잎 및 꽃), 식물의 다른 부분(줄기, 뿌리, 꽃), 또는 전체 식물에 들어간다. 표피를 통과한 후 아그로박테리아는 DNA 카피를 감염시키고 이를 세포로 이동시킨다. t-DNA는 에피솜에 의해 형질전환되고 mRNA는 번역되어, 감염된 세포에서 원하는 단백질의 생산으로 이어지지만, 핵 내부로 t-DNA의 통과는 일시적이다.
형질전환된 식물 세포의 확인을 돕기 위해, 본 발명의 구조물은 식물 선택 가능 마커를 포함하도록 더 조작될 수도 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 항생제, 예를 들어, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 또는 제초제, 예를 들어, 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로술푸론, 등과 같은 화학물질에 대한 저항성을 제공하는 효소를 포함한다. 유사하게는, GUS(베타-글루쿠로니다제)와 같이 색깔 변화, 또는 루시퍼라제 또는 GFP와 같이, 형광발광에 의해 확인 가능한 화합물의 생산을 제공하는 효소가 사용될 수도 있다.
용어 "식물성 물질"은 식물로부터 유래된 어떤 재료도 의미한다. 식물성 물질은 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이들의 어떤 분획도 포함할 수 있다. 게다가, 식물성 물질은 세포 내 식물 성분, 세포 외 식물 성분, 식물의 액체 또는 고체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 게다가, 식물성 물질은 잎, 줄기, 과실, 뿌리 또는 이들의 조합의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 식물성 물질은 어떤 가공 단계의 대상이 되지 않는 식물 또는 이들의 일부를 포함할 수도 있다. 하지만, 또한 하기 정의된 최소한의 가공 단계, 또는 크로마토그래피, 전기영동 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 업계 내에 흔히 알려진 기술을 사용하는 부분적 또는 실질적 단백질 정제를 포함하는, 더 엄격한 가공 단계의 대상이 될 수도 있다고 생각된다.
용어 "최소 가공"은 식물성 물질, 예를 들어, 식물 추출물, 균질액, 식물 균질액의 분획 등을 수득하기 위해 부분적으로 정제된(즉 최소한으로 가공된) 원하는 단백질을 포함하는 식물 또는 이들의 일부를 의미한다. 부분적 정제는 식물 세포 구조물을 붕괴시킴으로써 가용성 식물 성분, 및, 예를 들어, 원심분리, 여과 또는 이들의 조합으로 제한되지 않는 것들에 의해 분리될 수도 있는 불용성 식물 성분을 포함하는 조성물을 생성하는 것을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이 점에서, 잎 또는 다른 조직의 세포 외 공간 내에서 분비된 단백질은 진공 또는 원심분리 추출법을 사용하여 쉽게 얻어질 수 있거나, 조직은 세포 외 공간 내로부터 자유로운 단백질을 짜내거나 해방시키기 위한 롤러(roller) 또는 그라인딩(grinding) 등을 통과하는 압력 하에서 추출될 수 있다. 최소 가공은 또한 가용성 단백질의 조추출물(crude extract)의 조제물을 수반할 수 있는데, 이들 조제물은 2차 식물 생성물의 미량의 오염물질을 가질 것이기 때문이다. 게다가, 최소 가공은 잎의 가용성 단백질의 수성 추출 후, 이어서 어떤 적합한 염으로의 침전을 수반할 수도 있다. 다른 방법은 추출물의 직접적인 사용을 허용하기 위해 대규모 침출법(maceration) 및 착즙법(juice extraction)을 포함할 수도 있다.
식물 재료 또는 조직의 형태인 식물성 물질은 대상체에 경구로 전달될 수도 있다. 식물성 물질은, 다른 식품과 함께, 식이요법 보충제의 일부로서 투여되거나, 캡슐화될 수도 있다. 식물성 물질 또는 조직은 기호성을 개선하거나 증가시키기 위해 농축될 수도 있거나, 필요하면, 다른 재료, 성분, 또는 약학적 부형제와 함께 제공될 수도 있다.
원하는 단백질을 포함하거나, 원하는 단백질을 포함하는 VLP를 발현하는 식물은 필요 및 상황에 따라 다양한 방법으로 대상체 또는 표적 유기체에 투여될 수도 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 식물로부터 얻어진 원하는 단백질은 원래의 형태, 부분적으로 정제되거나, 정제된 형태로 사용되기 전에 추출될 수도 있다. 단백질이 정제되어야 하면, 그것은 식용 또는 비식용 식물에서 생산될 수도 있다. 게다가, 단백질이 경구로 투여되면, 식물 조직은 수확되고 대상체에 직접적으로 공급될 수도 있거나, 수확된 조직은 공급하기 전에 건조될 수도 있거나, 동물은 수확이 일어나지 않은 식물 위에서 방목하는 것이 허용될 수도 있다. 또한 동물성 사료 내의 식품 보충제로서 제공되기 위한 수확된 식물 조직에 대하여 본 발명의 범위 내에서 생각된다. 거의 또는 전혀 추가 가공되지 않은 식물 조직이 대상체 또는 동물에 공급되면, 투여되는 식물 조직이 식용인 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 생산된 VLP는 식물, 식물의 일부 또는 식물성 물질로부터 정제되거나 부분적으로 전제될 수도 있거나, 당업자에게 알려진 방법을 사용하여, 경구 백신으로서 투여될 수도 있다. 정제는 WO 2011/035422에 설명된 바와 같이 아포플라스트 분획의 생산을 포함할 수도 있다(이것은 본원에 참고로 포함됨). 예비 크기 배제 크로마토그래피를 위해서, VLP를 포함하는 조제물이 얻어질 수도 있고 불용성 물질은 원심분리에 의해 제거될 수도 있다. PEG로 침전이 또한 사용될 수도 있다. 회수된 단백질은 통방법(인 방법 (예를 들어, 브래드포드 검정(Bradford Assay), BCA)을 사용하여 정량될 수도 있고, 추출물은, 예를 들어, SEPHACRYL™, SEPHADEX™, 또는 유사한 배지, 및 수거된 분획을 사용하여 크기 배제 컬럼을 통과할 수도 있다. Blue Dextran 2000 또는 적합한 단백질은 보정 기준으로서 사용될 수도 있다. 추출물은 또한 양이온 교환 컬럼 및 수거된 활성 분획을 통과할 수도 있다. 크로마토그래피 후에, 분획은 VLP의 존재 및 분획의 단백질 보체를 확인하기 위해 단백질 전기 영동, 면역블롯, 또는 둘 다에 의해 더 분석될 수도 있다.
또한 본 발명의 일부로 간주된 것은 유전자 이식 식물, 식물 세포, 씨앗 또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 이들의 분획이다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생하는 방법이 또한 업계에 알려져 있다. 일반적으로, 형질전환된 식물 세포는 적절한 배지에서 배양되며, 이것은 형질전환된 식물 세포의 확인을 용이하게 하기 위해 선택 가능 마커가 사용되는 경우, 항생제와 같은 선택적 약제를 함유할 수도 있다. 캘러스(callus)가 형성되면, 순의 형성은 알려진 방법에 따른 적절한 식물 호르몬을 이용하여 촉진될 수 있고 식물의 재생을 위해 발근 배지(rooting medium)로 옮겨질 수도 있다. 그 후 식물은 씨앗으로부터 또는 식물 증식 기술을 사용하는 반복적 발생을 확립하기 위해 사용될 수도 있다. 유전자 이식 식물은 또한 조직 배양을 사용하지 않고 발생될 수 있다.
도 18에 나타난 바와 같이, B/Brisbane/60/2008의 HA는 아그로인필트레이션된 니코티아나 벤타미아나 잎에서 불량하게 발현된다(레인 "1008" 또는 "1029"를 참고하면 된다). 하지만, HA 타입 B의 A/New Caledonia/20/99의 M2와의 동시 발현은 HA 발현의 큰 증가를 일으킨다(레인 "1008+1261"; "1009+1261" 및 "1029+1261"을 참고하면 된다). HA 발현의 증가는 고유한 타입 B HA 또는 키메라 HA 타입 B 모두와 함께 관찰되었다. HA 발현은 증폭 요소(BeYDV)의 존재 또는 부재시, 및 아그로박테리움의 다양한 희석에 걸쳐 관찰되었다. H3 발현의 유사한 증가는 A/Perth/16/2009의 H3이 A/New Caledonia/20/99의 M2와 동시 발현되었을 때 관찰되었다(도 19; 레인 "1019" H3 단독을 M2와 동시 발현된 "1019+1261" H3과 비교하면 된다).
본 발명은 표 3에 설명된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
표 3: 서열 식별 번호의 목록
본 발명은 다음 실시예에서 더 예시될 것이다.
실시예
재료 및 방법: 발현 카세트의 인플루엔자 단백질과의 조립
A-2 X35S / CPMV - HT / H5 Indonesia / NOS( 구조 번호 4891)
인플루엔자 A/Indonesia/5/2005의 H5(H5N1)를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 완벽한 H5 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-H5A-I-05.s1+3c(도 1A, SEQ ID NO: 2) 및 IF-H5dTm.r(도 1B, SEQ ID NO: 3)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 구조물 번호 972를 사용하였다(구조물 번호 972의 서열에 대하여, WO 2010/003225의 도 94, SEQ ID NO: 134를 참고하면 되고, 이것은 본원에 참고로 포함됨). PCR 생성물을 인-퓨전(In-Fusion) 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하는 2X35 S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조물 1191(도 1D, SEQ ID NO: 4)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응을 위해 사용하였다. 구조물 번호 1191은 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV p19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 포함한다. 백본(backbone)은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 1D에서 제공된다(SEQ ID NO: 4). 결과의 구조물은 지정된 번호 489였다(도 1E, SEQ ID NO: 5). 인플루엔자 A/Indonesia/5/2005의 H5(H5N1)의 아미노산 서열은 도 1F에서 제공된다(SEQ ID NO: 6). 플라스미드 489의 도면은 도 15에서 제공된다.
B-2 X35S / CPMV - HT / M2 New Caledonia / NOS( 구조 번호 1261)
인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2(H1N1)를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 완벽한 M2 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S1-M1+M2ANC.C(도 2A, SEQ ID NO: 7) 및 IF-S1-4-M2ANC.r(도 2B, SEQ ID NO: 8)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 M2 유전자(GenBank 수납 번호 DQ508860의 nt 715-982에 결합된 nt 1-26에 해당함)(도 2C, SEQ ID NO: 9)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조물 1191(도 1C)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1191은 CPMV HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 1D에서 제공된다(SEQ ID NO: 4). 결과의 구조물은 지정된 번호 1261이었다(도 2D, SEQ ID NO: 10). 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2(H1N1)의 아미노산 서열은 도 2E에서 제공된다(SEQ ID NO: 11). 플라스미드 1261의 도면은 도 16에서 제공된다.
C-2 X35S / CPMV - HT / M2 Puerto Rico / NOS( 구조 번호 859)
인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2(H1N1)를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 완벽한 M2 암호화 서열을 함유하는 단편을 IF-S1-M1+M2ANC.C(도 2A, SEQ ID NO: 7) 및 IF-S1-4-M2ANC.r(도 2B, SEQ ID NO: 8)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 M2 유전자(GenBank 수납 번호 EF467824의 nt 740-1007에 결합된 nt 26-51에 해당함)(도 3 A, SEQ ID NO: 12)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조물 1191(도 1C)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1191은 CPMV HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 1D에서 제공된다(SEQ ID NO: 4). 결과의 구조물은 지정된 번호 859였다(도 3B, SEQ ID NO: 13). 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2(H1N1)의 아미노산 서열은 도 3C에서 제공된다(SEQ ID NO: 14). 플라스미드 859의 도면은 도 17에서 제공된다.
D-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / H1 California / NOS( 구조 번호 484)
인플루엔자 A/California/7/2009의 H1(H1N1)을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 H1 암호화 서열을 함유하는 단편을 IF-H1A-C-09.s2+4c(도 4A, SEQ ID NO: 15) 및 IF-H1A-C-09.s1-4r(도 4B, SEQ ID NO: 16)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 H1 유전자(GenBank 수납 번호 FJ966974)(도 4C, SEQ ID NO: 17)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템에서 클로닝하였다. 구조물 1192(도 4D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1192는 원하는 유전자의, CPMV HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로의 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 4E에서 제공된다(SEQ ID NO: 18). 결과의 구조물은 지정된 번호 484였다(도 4F, SEQ ID NO: 19). 인플루엔자 A/California/7/2009의 PDISP/H1(H1N1)의 아미노산 서열은 도 4G에서 제공된다(SEQ ID NO: 20). 플라스미드 484의 도면은 도 14에서 제공된다.
E-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / H3 Perth / NOS( 구조 번호 1019)
인플루엔자 A/Perth/16/2009 H3(H3N2)을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 H3 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-H3 Per.c(도 5A, SEQ ID NO: 21) 및 IF-S1a4-H3 Per.r(도 5B, SEQ ID NO: 22)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 H3 유전자(GenBank 수납 번호 GQ293081의 nt 26-1726에 해당함)(도 5C, SEQ ID NO: 23)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1192(도 4D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1192는 원하는 유전자의, CPMV HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로의 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 4E에서 제공된다(SEQ ID NO: 18). 결과의 구조물은 지정된 번호 1019였다(도 5D, SEQ ID NO: 24). 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 PDISP/H3(H3N2)의 아미노산 서열은 도 5E에서 제공된다(SEQ ID NO: 25). 플라스미드 1019의 도면은 도 13에서 제공된다.
F-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / HA B Brisbane / NOS( 구조 번호 1029)
인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 IF-S1a4-B Bris.r(도 6B, SEQ ID NO: 27)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자(GenBank 수납 번호 FJ766840의 34-1791에 해당함)(도 6C, SEQ ID NO: 28)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1192(도 4D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1192는 원하는 유전자의 CPMV HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로의 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 4E에서 제공된다(SEQ ID NO: 18). 결과의 구조물은 지정된 번호 1029였다(도 6D, SEQ ID NO: 29). 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 6E에서 제공된다(SEQ ID NO: 30). 플라스미드 1029의 도면은 도 11에서 제공된다.
BeYDV + 레플리카제 증폭 시스템 내의 G-2 X35S / CPMV - HT / PDISP / HA B Brisbane/NOS(구조 번호 1008)
인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 IF-S1a4-B Bris.r(도 6B, SEQ ID NO: 27)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자(GenBank 수납 번호 FJ766840의 34-1791에 해당함)(도 6C, SEQ ID NO: 28)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1194(도 6F 및 6G를 참고하면 됨)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1194는 원하는 유전자의, BeYDV 증폭 시스템 내의 CPMV HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로의 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 6G에서 제공된다(SEQ ID NO: 31). 결과의 구조물은 지정된 번호 1008이었다(도 6H SEQ ID NO: 32). 인플루엔자 B/Brisbane/60/08의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 6E에서 제공된다(SEQ ID NO: 30). 플라스미드 1008의 도면은 도 9에서 제공된다.
H-2 X35 S/ CPM V- HT / PDI SP / HA B Brisbane / H5 Indonesia 막관통 도메인 및 세포질 꼬리( BeYDV + 레플리카제 증폭 시스템 내의 H5Indo TMCTVNOS( 구조 번호 1009)
A/Indonesia/5/2005의 H5(H5N1)의 막관통 및 세포 기질 도메인에 융합된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008 엑토도메인의 HA를 암호화하는 서열을 다음과 같이 Darveau 등에 의해 제공된 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35 S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995)). PCR의 첫 번째 라운드에서, 고유한 신호 펩티드, 막관통 및 세포질 도메인이 없는 HA B Brisbane 엑토도메인 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 dTmH5I-B Bris.r(도 7A, SEQ ID NO: 33)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자(Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)(도 6C, SEQ ID NO: 28)를 사용하였다. H5 Indonesia의 막관통 및 세포질 도메인을 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 B Bris-dTmH5I.c(도 7B, SEQ ID NO: 34) 및 IF-S1aS4-dTmH5I.r(도 7C, SEQ ID NO: 35)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 구조물 번호 489을 사용하였다(도 1E, SEQ ID NO: 5를 참고하면 된다). 두 번의 증폭의 PCR 생성물을 혼합하였고 프라이머로서 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 IF-H5dTm.r(도 7C, SEQ ID NO: 34)를 사용하는 증폭의 두 번째 라운드를 위한 주형으로서 사용하였다. 결과의 단편을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV 증폭 시스템 내의 2X35 S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1194(도 6F 및 6G)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1194는 원하는 유전자의, BeYDV 증폭 시스템 내의 CPMV HT -기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 6G에서 제공된다(SEQ ID NO: 31). 결과의 구조물은 지정된 번호 1009였다(도 7D, SEQ ID NO: 36). PDISP/HA B Brisbane/H5indo TMCT의 아미노산 서열은 도 7E에서 제공된다(SEQ ID NO: 30). 플라스미드 1009의 도면은 도 10에서 제공된다.
BeYDV + 레플리카제 증폭 시스템 내의 단백질 가수 분해 루프가 결실된 I-2X35S/CPMV-HT/PDISP-HA B Brisbane( 구조 번호 1059)
단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008의 HA를 암호화하는 서열을 Darveau 등에 의해 제공된 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995)). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 46으로부터 nt 1065로의 HA B Brisbane 엑토도메인 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 1039+1059.r(도 8A, SEQ ID NO: 38)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자(Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)(도 6C, SEQ ID NO: 28)를 사용하였다. nt 1123으로부터 nt 1758로의 HA B Brisbane 암호화 서열을 함유하는 두 번째 단편은 프라이머 1039+1059.C(도 8B, SEQ ID NO: 39) 및 IF-S1a4-B Bris.r(도 6B, SEQ ID NO: 27)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Brisbane 유전자(Genbank 수납 번호 FJ766840의 nt 34-1791에 해당함)(도 6C, SEQ ID NO: 28)를 사용하였다. 두 번의 증폭의 PCR 생성물을 혼합하였고 프라이머로서 IF-S2+S4-B Bris.c(도 6A, SEQ ID NO: 26) 및 IF-H5dTm.r IF-S1a4-B Bris.r(도 6B, SEQ ID NO: 27)을 사용하는 증폭의 두 번째 라운드를 위한 주형으로서 사용하였다. 결과의 단편(단편 사이의 GG 결합자로 HA B/Brisbane/60/2008 Δa.a. 356-374를 암호화함)을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1194(도 6F 및 6G)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1194는 원하는 유전자의, BeYDV 증폭 시스템 내의 CPMV-HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 6G에서 제공된다(SEQ ID NO: 31). 결과의 구조물은 지정된 번호 1059였다(도 8C, SEQ ID NO: 40). 단백질 가수 분해 루프가 결실된 PDISP-HA B/Brisbane/60/2008의 아미노산 서열은 도 8D에서 제공된다(SEQ ID NO: 41). 플라스미드 1059의 도면은 도 12에서 제공된다.
A-2X35S/CPMV-HT/PDI SP/H3 Victoria/NOS(구조 번호 1391)
인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 H3(H3N2)을 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS 발현 시스템으로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 H3 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-H3V36111.S2+4c(도 25A, SEQ ID NO: 44) 및 IF-H3V36111.s1-4r(도 25B, SEQ ID NO: 45)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 H3 유전자(GISAID EPI_ISL 101506 분리체 HA 서열의 nt 25 내지 1725에 해당함)(도 25C, SEQ ID NO: 46)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 2X35S/CPMV-HT/NOS 발현 시스템의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 1192(도 4D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 1192는 원하는 유전자의, CPMV-HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 4E에서 제공된다(SEQ ID NO: 18). 결과의 구조물은 지정된 번호 1391이었다(도 25D, SEQ ID NO: 47). 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 PDISP/H3(H3N2)의 아미노산 서열은 도 25E에서 제공된다(SEQ ID NO: 48). 플라스미드 1391의 도면은 도 25F에서 제공된다.
BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내의 B-2X35S/CPMV-HT/HA B Wisconsin/NOS(구조 번호 1462)
인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35 S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다. 완벽한 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-HAB110.s1+3c(도 26A, SEQ ID NO: 49) 및 IF-HAB110.s1-4r(도 26B, SEQ ID NO: 50)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자(Genbank 수납 번호 JN993010)(도 26C, SEQ ID NO: 51)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV(m) 증폭 시스템 내의 2X35 S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트에 클로닝하였다. 구조물 193(도 26D)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 193은 BeYDV(m) 증폭 시스템 내의 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 26E에서 제공된다(SEQ ID NO: 52). 결과의 구조물은 지정된 번호 1462였다(도 26F, SEQ ID NO: 53). 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 26G에서 제공된다(SEQ ID NO: 54). 플라스미드 1462의 도면은 도 26H에서 제공된다.
BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내의 단백질 가수 분해 루프가 결실된 -2X35S/CPMV-HT/HA B Wisconsin(구조 번호 1467)
가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA를 암호화하는 서열을 Darveau 등에 의해 제공된 PCR-기반 결찰 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/NOS로 클로닝하였다(Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995)). PCR의 첫 번째 라운드에서, nt 1 내지 nt 1062의 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-HAB110.s1+3c(도 26A, SEQ ID NO: 49) 및 HAB110(PrL-).r(도 27A, SEQ ID NO: 55)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자(Genbank 수납 번호 JN993010)(도 26C, SEQ ID NO: 51)를 사용하였다. nt 1120 내지 nt 1755의 HA B Wisconsin 암호화 서열을 함유하는 두 번째 단편을 프라이머 HAB110(PrL-).c(도 27B, SEQ ID NO: 56) 및 IF-HAB110.s1-4r(도 26B, SEQ ID NO: 50)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Wisconsin 유전자(Genbank 수납 번호 JN993010)(도 26C, SEQ ID NO: 51)을 사용하였다. 두 번의 증폭의 PCR 생성물을 혼합하였고 프라이머로서 IF-HAB110.s1+3c(도 26A, SEQ ID NO: 49) 및 IF-HAB110.s1-4r(도 26B, SEQ ID NO: 50)을 사용하는 증폭의 두 번째 라운드를 위한 주형으로서 사용하였다. 결과의 단편(단편 사이에서 GG 결합자와 함께 HA B/Wisconsin/1/2010 Δa.a. 340-358을 암호화)을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV(m) 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPM V-HT/NOS 발현 카세트에서 클로닝하였다. 구조물 193(도 26D)을 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 193은 BeYDV(m) 증폭 시스템 내의 CPMV-HT-기반 발현 카세트에서 원하는 유전자의 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 26E에서 제공된다(SEQ ID NO: 52). 결과의 구조물은 지정된 번호 1467이었다(도 27C, SEQ ID NO: 57). 단백질 가수 분해 루프가 결실된 인플루엔자 B/Wisconsin/1/2010의 HA의 아미노산은 도 27D에서 제공된다(SEQ ID NO: 58). 플라스미드 1467의 도면은 도 27E에서 제공된다.
BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템 내의 D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B Malaysia/NOS(구조 번호 1631)
인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 HA를 암호화하는 서열을 다음 PCR-기반 방법을 사용하여 Plasto_pro/P19/Plasto_ter 발현 카세트를 함유하는 플라스미드에서 BeYDV(m)+레플리카제 증폭 시스템을 포함하는 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS로 클로닝하였다. 야생형 신호 펩티드 없이 HA B Malaysia 암호화 서열을 함유하는 단편을 프라이머 IF-HB-M-04.s2+4c(도 28A, SEQ ID NO: 59) 및 IF-HB-M-04.s1-4r(도 28B, SEQ ID NO: 60)을 사용하여 증폭하였으며, 주형으로서 합성된 HA B Malaysia 유전자(Genbank 수납 번호 EU124275의 nt 31-1743에 해당함. 침묵 돌연변이 T759C 및 C888G를 DraIII 및 BamHI 제한 효소 인식 부위를 변형시키기 위해 합성된 서열에 삽입하였다)(도 28C, SEQ ID NO: 61)를 사용하였다. PCR 생성물을 인-퓨전 클로닝 시스템(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 BeYDV(m) 증폭 시스템 내의 2X35 S/CPMV-HT/NOS 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인-프레임 클로닝하였다. 구조물 194(도 28D)를 SacII 및 StuI 제한 효소로 분해하였고 선형화된 플라스미드를 인-퓨전 조립 반응에 사용하였다. 구조물 번호 194는 원하는 유전자의, BeYDV(m) 증폭 시스템 내의 CPMV-HT-기반 발현 카세트의 알팔파 PDI 신호 펩티드로 인 프레임 "인 퓨전" 클로닝을 위해 의도된 수용 플라스미드이다. 그것은 또한 알팔파 플라스토시아닌 유전자 프로모터 및 종결자 하에 TBSV P19 침묵 억제자의 동시 발현을 위한 유전자 구조물을 통합한다. 백본은 pCAMBIA 2진수 플라스미드이고 왼쪽 t-DNA 보더에서 오른쪽 t-DNA 보더로의 서열은 도 28E에서 제공된다(SEQ ID NO: 62). 결과의 구조물은 지정된 번호 1631이었다(도 28F, SEQ ID NO: 63). 인플루엔자 B/Malaysia/2506/2004의 PDISP/HA의 아미노산 서열은 도 28G에서 제공된다(SEQ ID NO: 64). 플라스미드 1631의 도면은 도 28H에서 제공된다.
아그로박테리움 트랜스펙션(transfection )
아그로박테리움 균주 AGL1을 D'Aoust et al 2008에 의해 설명된 방법을 사용하여 전기천공에 의해 DNA 구조물로 트랜스펙션하였다(Plant Biotechnology Journal 6:930-940). 트랜스펙션된 아그로박테리움을 10 mM 2-(N-모폴리노)에탄술폰 산(MES), 20 μM 아세토시링곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml의 카르베니실린으로 보충된 pH 5.6의 YEB 배지에서 0.6 내지 1.6의 OD600로 키웠다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심분리하였고 침윤 배지(10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)에서 재현탁하였다.
식물 바이오매스의 제조, 접종 및 아그로인필트레이션
용어 "바이오매스" 및 "식물성 물질"은 본원에 사용된 바와 같이 식물로부터 유래된 어떤 재료도 반영하는 것을 의미한다. 바이오매스 또는 식물성 물질은 전체 식물, 조직, 세포, 또는 이들의 어떤 분획도 포함할 수 있다. 게다가, 바이오매스 또는 식물성 물질은 세포 내 식물 성분, 세포 외 식물 성분, 식물의 액체 또는 고체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 게다가, 바이오매스 또는 식물성 물질은 식물 잎, 줄기, 과실, 뿌리 또는 이들의 조합의 식물, 식물 세포, 조직, 액체 추출물, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 식물의 일부는 식물성 물질 또는 바이오매스를 포함할 수도 있다.
니코티아나 벤타미아나 식물을 상업적 피트 모스(peat moss) 기질로 채워진 평판에서 씨앗으로부터 키웠다. 식물은 16/8 광주기 및 25℃ 낮/20℃ 밤의 온도 영역 하에 온실에서 키우는 것이 허용되었다. 파종 후 3주에, 개개의 묘목을 선택하였고, 화분에 옮겨심었고 같은 환경 조건 하에 추가로 3주 동안 온실에서 성장하게 하였다.
각각의 구조물로 트랜스펙션된 아그로박테리아를 10 mM 2-(N-모폴리노)에탄술폰 산(MES), 20 μM 아세토시링곤, 50 μg/ml 카나마이신 및 25 μg/ml의 카르베니실린으로 보충된 pH 5.6의 YEB 배지에서 0.6 내지 1.6의 OD600에 도달할 때까지 키웠다. 아그로박테리움 현탁액을 사용 전에 원심분리하였고 침윤 배지(10 mM MgCl2 및 10 mM MES pH 5.6)에서 재현탁하였고 4℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 침윤의 날에, 배양물 배취(batch)를 2.5 배양물 부피로 희석하였고 사용 전에 따뜻하게 하였다. 엔. 벤타미아나의 전체 식물을 20-40 Torr의 진공하에 2분 동안 밀폐된 스테인레스 강 탱크의 박테리아 현탁액에서 거꾸로 두었다. 식물을 수확할 때까지 2-6일 배양기간 동안 온실에 되돌려놓았다.
잎 수확 및 총 단백질 추출
배양 후에, 식물의 지상부를 수확하였고, -80℃에서 얼렸고 조각으로 분쇄하였다. 3배 부피의 차가운 50 mM Tris pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.1% Triton X-100 및 1 mM 페닐메탄술포닐 플루오라이드 중에서 냉동 분쇄된 식물 재료의 각 샘플을 균질화함으로써(Polytron) 총 가용성 단백질을 추출하였다. 균질화 후에, 슬러리(slurry)를 4℃에서 10분 동안 10,000g로 원심분리하였고 이들 정화된 조추출물(상층액)은 분석을 위해 유지하였다. 균질화 후에, 슬러리를 4℃에서 10분 동안 10,000 g에서 원심분리하였고 이들 정화된 조추출물(상층액)은 추가의 분석을 위해 유지하였다.
단백질 분석 및 면역블롯팅
정화된 조추출물의 총 단백질 함량을 참고 기준으로서 소 혈청 알부민을 사용하는 브래드포드 검정(Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 결정하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 면역 검출을 위해 폴리비닐렌 디플루오라이드(PVDF) 막(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)으로 전기 이동시켰다. 면역블롯팅 전에, 막을 4℃에서 16-18h 동안 Tris-완충된 식염수(TBS-T) 중의 5% 탈지유 및 0.1% Tween-20로 블로킹하였다.
면역블롯팅을 TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지유에서 2 μg/ml의 1차 항체로 첫 번째 배양과 함께 수행하였다. 화학 발광 검출에 사용되는 2차 항체는 표 4에 지시된 바와 같았고, TBS-Tween 20 0.1% 중의 2% 탈지유에서 지시된 바와 같이 희석되었다. 면역 반응성 복합체를 기질로서 루미놀을 사용하는 화학 발광에 의해 검출하였다(Roche Diagnostics Corporation). 사람 IgG 항체의 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-효소 콘쥬게이션(conjugation)을 EZ-Link Plus® Activated Peroxidase 콘쥬게이션 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 수행하였다.
표 4: 발현된 단백질의 면역블롯팅을 위한 전기영동 조건, 항체, 및 희석배수
JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA;
CBER: Center for Biologies Evaluation and Research, Rockville, MD, USA.
SiNO: Sino Biological inc., Beijing, China.
TGA: Therapeutic Goods Administration, Australia.
NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control, United Kingdom
적혈구 응집 검정
적혈구 응집 검정은 Nayak and Reichl(2004)에 의해 설명된 방법을 기반으로 하였다. 간단히 말하면, 테스트 샘플(100 μL)의 일련의 이중 희석은 100 μL PBS를 함유하는 V자 바닥의 96-웰 미세역가 플레이트에서 이루어졌으며, 웰 당 희석된 샘플의 100 μL를 놔두었다. 100 미크로리터의 0.25% 칠면조 적혈구 현탁액(Bio Link Inc., Syracuse, NY)을 각 웰에 추가하였고, 플레이트를 상온에서 2h 동안 배양하였다. 완벽한 적혈구 응집을 나타내는 가장 높은 희석 배수의 역수를 HA 활성으로 기록하였다. 동시에, 재조합 HA 표준(A/Vietnam/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation, Meriden, CT)을 PBS에서 희석하였고 각 플레이트에서 대조군으로서 실행하였다.
실시예 1: B HA 및 H3 의 축적 수준에 대한 인플루엔자 M2 동시 발현의 효과
다른 인플루엔자 균주의 HA의 축적 수준에 대한 인플루엔자 M2 동시 발현의 효과를 아그로인필트레이션-기반 일시적 형질전환 시스템에서 HA의 발현을 구동하는 구조물을 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2(H1N1)의 발현을 위한 구조물과 동시에 이동시킴으로써 분석하였다.
M2-발현 구조물(구조물 번호 1261)의 존재 또는 부재시 인플루엔자 B HA(B/Brisbane/60/2008의 것)의 발현을 구동하는 유전자 구조물들(구조물 번호 1008, 1009 및 1029)로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2 동시 발현이 인플루엔자 B HA의 증가된 축적을 발생시킨다는 것을 나타냈다(도 18). 유사하게, M2의 인플루엔자 A/Perth/16/2009의 H3(구조물 번호 1019+1261)과의 동시 발현은 도 19에 나타난 바와 같이 H3-발현 구조물(구조물 번호 1019)만으로 형질전환된 식물과 비교할 때 형질전환된 식물에서 H3의 증가된 축적을 발생시켰다.
M2를 인플루엔자 A/California/07/2009의 H1과 동시 발현하는 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2의 H1과의 동시 발현이 H1 축적 수준의 약간의 감소를 발생시킨다는 것을 나타냈다(도 20, 484 대 484+1261). M2의 인플루엔자 A/Indonesia/05/2005의 H5와의 동시 발현은 또한 단독으로 발현된 H5와 비교할 때 감소된 H5 축적을 발생시켰다(도 21, 489 대 489+1261).
M2의 동시 발현을 변형된 인플루엔자 B HA의 축적 수준에 대한 그것의 영향에 대하여 더 평가하였다. 구조물 번호 1059는 단백질 가수 분해 루프가 2개의 아미노산 결합자(aa 341-359의 위치의 GG)로 대체되는 인플루엔자 B HA를 암호화한다. 도 22A에 나타난 웨스턴 블롯 분석의 결과는
단백질 가수 분해 루프의 제거가 증가된 인플루엔자 B HA 축적 수준을 발생시키고(1008을 1059와 비교하면 된다) M2의 변형된 인플루엔자 B HA와의 동시 발현은 HA 축적 수준을 더 증가시킨다(도 22A, 1059 대 1059+1261)는 것을 나타낸다. 변형되거나 되지 않고 M2가 동시 발현되거나 그렇지 않으면서 인플루엔자 B HA로 형질전환된 식물의 조단백질 추출물에 대한 적혈구 응집 활성의 분석은 고유한 인플루엔자 B HA(도 22B, 1008 대 1008+1261) 및 변형된 인플루엔자 B HA(도 22B, 1059 대 1059+1261)의 축적 수준에 대한 M2 동시 발현의 긍정적 효과를 확인하였다.
변형된 인플루엔자 B HA 및 H3의 축적을 증가시키기 위한 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2의 효능은 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2의 그것과 비교하였다. 변형된 인플루엔자 B HA에 대하여, 구조물 1059, 1059+1261 및 1059+859로 트랜스펙션된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 비교에 착수하였다. H3에 대하여, 유사한 비교를 1019, 1019+1261 및 1019+859로 형질전환된 식물의 단백질 추출물에서 수행하였다. 얻어진 결과는 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934의 M2(구조물 번호 859에 의해 암호화됨)의 동시 발현이 변형된 인플루엔자 B HA(도 23A) 및 H3(도 23B) 둘 다의 축적을 증가시키는데 있어서 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999의 M2(구조물 번호 1261에 의해 암호화됨)의 동시 발현만큼 효율적이라는 것을 입증하였다.
실시예 2: B HA 및 H3 의 다른 균주의 축적 수준에 대한 인플루엔자 M2 동시 발현의 효과
M2-발현 구조물(구조물 번호 1261)의 존재 또는 부재시 인플루엔자 B HA(B/Malaysia/2506/2004의 것)의 발현을 구동하는 유전자 구조물(구조물 번호 1631)로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2 동시 발현이 인플루엔자 B HA의 증가된 축적을 발생시킨다는 것을 나타낸다(도 29).
M2-발현 구조물(구조물 번호 1261)의 존재 또는 부재시 인플루엔자 B HA(B/Wisconsin/1/2010의 것) 의 발현을 구동하는 유전자 구조물(구조물 번호 1462)로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2 동시 발현이 인플루엔자 B HA의 증가된 축적을 발생시킨다는 것을 나타낸다(도 30).
M2의 동시 발현을 변형된 인플루엔자 B GA의 축적 수준에 대한 영향에 대하여 더 평가하였다. 구조물 번호 1467은 단백질 가수 분해 루프가 2개의 아미노산 결합자(aa 341-359의 위치에서 GG)에 의해 대체되는 인플루엔자 B HA를 암호화한다. 도 30A에서 제공된 웨스턴 블롯 분석의 결과는 단백질 가수 분해 루프의 제거가 증가된 인플루엔자 B HA 축적 수준을 발생시켰고(1462를 1467과 비교하면 됨) M2의 변형된 인플루엔자 B HA와의 동시 발현은 HA 축적 수준을 더 증가시켰다(도 30A, 1467 대 1467+1261)는 것을 나타낸다. 변형되거나 되지 않고 M2가 동시 발현되거나 그렇지 않으면서 인플루엔자 B HA로 형질전환된 식물의 조단백질 추출물에 대한 적혈구 응집 활성의 분석은 고유한 인플루엔자 B HA(도 30B, 1462 대 1462+1261) 및 변형된 인플루엔자 B HA(도 26B, 1467 대 1467+1261)의 축적 수준에 대한 M2 동시 발현의 긍정적 효과를 확인하였다.
M2-발현 구조물(구조물 번호 1261)의 존재 또는 부재시 인플루엔자 H3(H3/Victoria/361/2011의 것)의 발현을 구동하는 유전자 구조물로 형질전환된 식물의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 M2 동시 발현이 인플루엔자 H3의 증가된 축적을 발생시킨다는 것을 나타낸다(도 31).
모든 인용된 것들은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 설명되었다. 하지만, 청구 범위에 의해 한정된 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Medicago Inc. <120> Increasing Virus Like Particle Yield in Plants <130> V83991WO <150> US 61/541,780 <151> 2011-09-30 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proton channel signature sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 His Xaa Xaa Xaa Trp 1 5 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IF-H5A-I-05.s1+3c <400> 2 aaatttgtcg ggcccatgga gaaaatagtg cttcttcttg c 41 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IF-H5dTm.r <400> 3 actaaagaaa ataggccttt aaatgcaaat tctgcattgt aacgatccat 50 <210> 4 <211> 4903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct 1191 <400> 4 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc 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tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 1800 caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 1860 ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 1920 tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 1980 tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2034 <210> 14 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 14 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Pro Leu Thr Ile Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Thr Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Lys Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Gly His Phe Val Ser Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IF-H1A-C-09.s2+4c <400> 15 tctcagatct tcgccgacac attatgtata ggttatcatg cgaaca 46 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IF-H1A-C-09.s1-4r <400> 16 actaaagaaa ataggccttt aaatacatat tctacactgt agagaccca 49 <210> 17 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of synthesized H1 gene <400> 17 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60 tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct 300 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 360 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 420 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 480 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 540 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 600 actagtgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg 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aaatgggact 1500 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta 1560 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620 ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680 cagtgtagaa tatgtattta a 1701 <210> 18 <211> 4897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct 1192 <400> 18 tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60 gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120 aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180 aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240 ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160 cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 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tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga 3960 tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt 4020 ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagcgatc 4080 gctcaccatc accatcacca tcaccatcac cattaaaggc ctattttctt tagtttgaat 4140 ttactgttat tcggtgtgca tttctatgtt tggtgagcgg ttttctgtgc tcagagtgtg 4200 tttattttat gtaatttaat ttctttgtga gctcctgttt agcaggtcgt cccttcagca 4260 aggacacaaa aagattttaa ttttattaaa aaaaaaaaaa aaaaagaccg ggaattcgat 4320 atcaagctta tcgacctgca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 4380 atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 4440 taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 4500 cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 4560 tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atctctagag tctcaagctt ggcgcgccca 4620 cgtgactagt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 4680 cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 4740 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 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agccaacaaa ccgtaagccc 1980 gaatatcgga tctagaccca gagtaaggaa tatccctagc agaataagca tctattggac 2040 aatagtaaaa ccgggagaca tacttttgat taacagcaca gggaatctaa ttgctcctag 2100 gggttacttc aaaatacgaa gtgggaaaag ctcaataatg agatcagatg cacccattgg 2160 caaatgcaat tctgaatgca tcactccaaa tggaagcatt cccaatgaca aaccattcca 2220 aaatgtaaac aggatcacat acggggcctg tcccagatat gttaagcaaa acactctgaa 2280 attggcaaca gggatgcgaa atgtaccaga gaaacaaact agaggcatat ttggcgcaat 2340 cgcgggtttc atagaaaatg gttgggaggg aatggtggat ggttggtacg gtttcaggca 2400 tcaaaattct gagggaagag gacaagcagc agatctcaaa agcactcaag cagcaatcga 2460 tcaaatcaat gggaagctga atagattgat cgggaaaacc aacgagaaat tccatcagat 2520 tgaaaaagaa ttctcagaag tcgaagggag aattcaggac cttgagaaat atgttgagga 2580 cactaaaata gatctctggt catacaacgc ggagcttctt gttgccctgg agaaccaaca 2640 tacaattgat ctaactgact cagaaatgaa caaactgttt gaaaaaacaa agaagcaact 2700 gagggaaaat gctgaggata tgggcaatgg ttgtttcaaa atataccaca aatgtgacaa 2760 tgcctgcata ggatcaatca gaaatggaac ttatgaccac gatgtataca gagatgaagc 2820 attaaacaac cggtttcaga tcaagggagt tgagctgaag tcagggtaca aagattggat 2880 cctatggatt tcctttgcca tatcatgttt tttgctttgt gttgctttgt tggggttcat 2940 catgtgggcc tgccaaaaag gcaacattag gtgcaacatt tgcatttgaa ggcctatttt 3000 ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 3060 tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 3120 cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 3180 ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 3240 ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3300 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3360 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3420 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3465 <210> 25 <211> 574 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 25 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn 20 25 30 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taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 3240 ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 3300 ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3360 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3420 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3480 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3525 <210> 30 <211> 594 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 30 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val Ser Ile Leu His Glu Val Arg 100 105 110 Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His 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ttagatcggc catccactca 4560 aggtcagatt gtgcttgatc gtaggagaca ggatgtatga aagtgtaggc atcgatgctt 4620 acatgatata ggtgcgtctc tctccagttg tgcagatctt cgtggcagcg gagatctgat 4680 tctgtgaagg gcgacacgta ctgctcaggt tgtggaggaa ataatttgtt ggctgaatat 4740 tccagccatt gaagctttgt tgcccattca tgagggaatt cttctttgat catgtcaaga 4800 tactcctcct tagacgttgc agtctggata atagttcgcc atcgtgcgtc agatttgcga 4860 ggagagacct tatgatctcg gaaatctcct ctggttttaa tatctccgtc ctttgatatg 4920 taatcaagga cttgtttaga gtttctagct ggctggatat tagggtgatt tccttcaaaa 4980 tcgaaaaaag aaggatccct aatacaaggt tttttatcaa gctggataag agcatgatag 5040 tgggtagtgc catcttgatg aagctcagaa gcaacaccaa ggaagaaaat aagaaaaggt 5100 gtgagtttct cccagagaaa ctggaataaa tcatctcttt gagatgagca cttggggtag 5160 gtaaggaaaa catatttaga ttggagtctg aagttcttgc tagcagaagg catgttgttg 5220 tgactccgag gggttgcctc aaactctatc ttataaccgg cgtggaggca tggaggcaag 5280 ggcattttgg taatttaagt agttagtgga aaatgacgtc atttacttaa agacgaagtc 5340 ttgcgacaag gggggcccac gccgaatttt aatattaccg gcgtggcccc accttatcgc 5400 gagtgcttta gcacgagcgg tccagattta aagtagaaaa gttcccgccc actagggtta 5460 aaggtgttca cactataaaa gcatatacga tgtgatggta tttgatggag cgtatattgt 5520 atcaggtatt tccgtcggat acgaattatt cgtac 5555 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer dTmH5I-B Bris.r <400> 33 ttgacagtat ttggtaatta tccaatccat cgtcatttaa agatgcagca 50 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B Bris-dTmH5I.c <400> 34 catctttaaa tgacgatgga ttggataatt accaaatact gtcaatttat 50 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IF-S1aS4-dTmH5I.r <400> 35 actaaagaaa ataggccttt aaatgcaaat tctgcattgt aacgatccat 50 <210> 36 <211> 5555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette number 1009 <400> 36 ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct caaactctat cttataaccg 60 gcgtggaggc atggaggcaa gggcattttg gtaatttaag tagttagtgg aaaatgacgt 120 catttactta aagacgaagt cttgcgacaa ggggggccca cgccgaattt taatattacc 180 ggcgtggccc caccttatcg cgagtgcttt agcacgagcg gtccagattt aaagtagaaa 240 agttcccgcc cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt 300 atttgataaa gcgtatattg tatcaggtat ttccgtcgga tacgaattat tcgtacaagc 360 ttcttaagcc ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 420 atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 480 acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct attcttgtcg gtgtggtctt 1380 gggaaaagaa agcttgctgg aggctgctgt tcagccccat acattacttg ttacgattct 1440 gctgactttc ggcgggtgca atatctctac ttctgcttga cgaggtattg ttgcctgtac 1500 ttctttcttc ttcttcttgc tgattggttc tataagaaat ctagtatttt ctttgaaaca 1560 gagttttccc gtggttttcg aacttggaga aagattgtta agcttctgta tattctgccc 1620 aaatttgtcg ggcccatggc gaaaaacgtt gcgattttcg gcttattgtt ttctcttctt 1680 gtgttggttc cttctcagat cttcgccgat cgaatctgca ctggaataac atcgtcaaac 1740 tcaccacatg tcgtcaaaac tgctactcaa ggggaggtca atgtgactgg tgtaatacca 1800 ctgacaacaa cacccaccaa atctcatttt gcaaatctca aaggaacaga aaccaggggg 1860 aaactatgcc caaaatgcct caactgcaca gatctggacg tagccttggg cagaccaaaa 1920 tgcacgggga aaataccctc ggcaagagtt tcaatactcc atgaagtcag acctgttaca 1980 tctgggtgct ttcctataat gcacgacaga acaaaaatta gacagctgcc taaccttctc 2040 cgaggatacg aacatatcag gttatcaacc cataacgtta tcaatgcaga aaatgcacca 2100 ggaggaccct acaaaattgg aacctcaggg tcttgcccta acattaccaa tggaaacgga 2160 tttttcgcaa caatggcttg ggccgtccca aaaaacgaca aaaacaaaac agcaacaaat 2220 ccattaacaa tagaagtacc atacatttgt acagaaggag aagaccaaat taccgtttgg 2280 gggttccact ctgacaacga gacccaaatg gcaaagctct atggggactc aaagccccag 2340 aagttcacct catctgccaa cggagtgacc acacattacg tttcacagat tggtggcttc 2400 ccaaatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagtggta gaattgttgt tgattacatg 2460 gtgcaaaaat ctgggaaaac aggaacaatt acctatcaaa ggggtatttt attgcctcaa 2520 aaggtgtggt gcgcaagtgg caggagcaag gtaataaaag gatccttgcc tttaattgga 2580 gaagcagatt gcctccacga aaaatacggt ggattaaaca aaagcaagcc ttactacaca 2640 ggggaacatg caaaggccat aggaaattgc ccaatatggg tgaaaacacc cttgaagctg 2700 gccaatggaa ccaaatatag acctcctgca aaactattaa aggaaagggg tttcttcgga 2760 gctattgctg gtttcttaga aggaggatgg gaaggaatga ttgcaggttg gcacggatac 2820 acatcccatg gggcacatgg agtagcggtg gcagcagacc ttaagagcac tcaagaggcc 2880 ataaacaaga taacaaaaaa tctcaactct ttgagtgagc tggaagtaaa gaatcttcaa 2940 agactaagcg gtgccatgga tgaactccac aacgaaatac tagaactaga tgagaaagtg 3000 gatgatctca gagctgatac aataagctca caaatagaac tcgcagtcct gctttccaat 3060 gaaggaataa taaacagtga agatgaacat ctcttggcgc ttgaaagaaa gctgaagaaa 3120 atgctgggcc cctctgctgt agagataggg aatggatgct ttgaaaccaa acacaagtgc 3180 aaccagacct gtctcgacag aatagctgct ggtacctttg atgcaggaga attttctctc 3240 cccacctttg attcactgaa tattactgct gcatctttaa atgacgatgg attggataat 3300 taccaaatac tgtcaattta ttcaacagtg gcgagttccc tagcactggc aatcatgatg 3360 gctggtctat ctttatggat gtgctccaat ggatcgttac aatgcagaat ttgcatttaa 3420 aggcctattt tctttagttt gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta tgtttggtga 3480 gcggttttct gtgctcagag tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt gtgagctcct 3540 gtttagcagg tcgtcccttc agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat taaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaag accgggaatt cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt tcaaacattt 3660 ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 3720 ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 3780 gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 3840 tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatctct 3900 agagtctcaa gcttggcgcg gggtaccgag ctcgaattcc gagtgtactt caagtcagtt 3960 ggaaatcaat aaaatgatta ttttatgaat atatttcatt gtgcaagtag atagaaatta 4020 catatgttac ataacacacg aaataaacaa aaaaacacaa tccaaaacaa acaccccaaa 4080 caaaataaca ctatatatat cctcgtatga ggagaggcac gttcagtgac tcgacgattc 4140 ccgagcaaaa aaagtctccc cgtcacacat atagtgggtg acgcaattat cttcaaagta 4200 atccttctgt tgacttgtca ttgataacat ccagtcttcg tcaggattgc aaagaattat 4260 agaagggatc ccacctttta ttttcttctt ttttccatat ttagggttga cagtgaaatc 4320 agactggcaa cctattaatt gcttccacaa tgggacgaac ttgaagggga tgtcgtcgat 4380 gatattatag gtggcgtgtt catcgtagtt ggtgaagtcg atggtcccgt tccagtagtt 4440 gtgtcgcccg agacttctag cccaggtggt ctttccggta cgagttggtc cgcagatgta 4500 gaggctgggg tgtctgaccc cagtccttcc ctcatcctgg ttagatcggc catccactca 4560 aggtcagatt gtgcttgatc gtaggagaca ggatgtatga aagtgtaggc atcgatgctt 4620 acatgatata ggtgcgtctc tctccagttg tgcagatctt cgtggcagcg gagatctgat 4680 tctgtgaagg gcgacacgta ctgctcaggt tgtggaggaa ataatttgtt ggctgaatat 4740 tccagccatt gaagctttgt tgcccattca tgagggaatt cttctttgat catgtcaaga 4800 tactcctcct tagacgttgc agtctggata atagttcgcc atcgtgcgtc agatttgcga 4860 ggagagacct tatgatctcg gaaatctcct ctggttttaa tatctccgtc ctttgatatg 4920 taatcaagga cttgtttaga gtttctagct ggctggatat tagggtgatt tccttcaaaa 4980 tcgaaaaaag aaggatccct aatacaaggt tttttatcaa gctggataag agcatgatag 5040 tgggtagtgc catcttgatg aagctcagaa gcaacaccaa ggaagaaaat aagaaaaggt 5100 gtgagtttct cccagagaaa ctggaataaa tcatctcttt gagatgagca cttggggtag 5160 gtaaggaaaa catatttaga ttggagtctg aagttcttgc tagcagaagg catgttgttg 5220 tgactccgag gggttgcctc aaactctatc ttataaccgg cgtggaggca tggaggcaag 5280 ggcattttgg taatttaagt agttagtgga aaatgacgtc atttacttaa agacgaagtc 5340 ttgcgacaag gggggcccac gccgaatttt aatattaccg gcgtggcccc accttatcgc 5400 gagtgcttta gcacgagcgg tccagattta aagtagaaaa gttcccgccc actagggtta 5460 aaggtgttca cactataaaa gcatatacga tgtgatggta tttgatggag cgtatattgt 5520 atcaggtatt tccgtcggat acgaattatt cgtac 5555 <210> 37 <211> 594 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 37 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Pro Ser Ala Arg Val Ser Ile Leu His Glu Val Arg 100 105 110 Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile 115 120 125 Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu His Ile Arg Leu Ser 130 135 140 Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Asn Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys 145 150 155 160 Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ile Thr Asn Gly Asn Gly Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys Asn Asp Lys Asn Lys Thr 180 185 190 Ala Thr Asn Pro Leu Thr Ile Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly 195 200 205 Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Glu Thr Gln 210 215 220 Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser 225 230 235 240 Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro 245 250 255 Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val 260 265 270 Asp Tyr Met Val Gln Lys Ser Gly Lys Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Gln 275 280 285 Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser 290 295 300 Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu 305 310 315 320 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn 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Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr 530 535 540 Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn Tyr Gln Ile Leu Ser 545 550 555 560 Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Met Ala 565 570 575 Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile 580 585 590 Cys Ile <210> 38 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1039+1059.r <400> 38 cttcccatcc tccaccagga ggtctatatt tggttccatt ggccagcttc aa 52 <210> 39 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1039+1059.c <400> 39 caaatataga cctcctggtg gaggatggga aggaatgatt gcaggttggc ac 52 <210> 40 <211> 5504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette number 1059 from BeYDV left LIR to BeYDV right LIR. PDISP/HA from influenza B/Brisbane/60/2008 with deleted proteolytic loop <400> 40 ctagcagaag gcatgttgtt gtgactccga ggggttgcct caaactctat cttataaccg 60 gcgtggaggc atggaggcaa gggcattttg gtaatttaag tagttagtgg aaaatgacgt 120 catttactta aagacgaagt cttgcgacaa ggggggccca cgccgaattt taatattacc 180 ggcgtggccc caccttatcg cgagtgcttt agcacgagcg gtccagattt aaagtagaaa 240 agttcccgcc cactagggtt aaaggtgttc acactataaa agcatatacg atgtgatggt 300 atttgataaa gcgtatattg tatcaggtat ttccgtcgga tacgaattat tcgtacaagc 360 ttcttaagcc ggtcaacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 420 atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 480 acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 540 aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 600 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 660 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 720 cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 780 cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 840 actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 900 aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 960 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1020 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1080 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggta ttaaaatctt aataggtttt 1140 gataaaagcg aacgtgggga aacccgaacc aaaccttctt ctaaactctc tctcatctct 1200 cttaaagcaa acttctctct tgtctttctt gcgtgagcga tcttcaacgt tgtcagatcg 1260 tgcttcggca ccagtacaac gttttctttc actgaagcga aatcaaagat ctctttgtgg 1320 acacgtagtg cggcgccatt aaataacgtg tacttgtcct attcttgtcg gtgtggtctt 1380 gggaaaagaa agcttgctgg aggctgctgt tcagccccat acattacttg ttacgattct 1440 gctgactttc ggcgggtgca atatctctac ttctgcttga cgaggtattg ttgcctgtac 1500 ttctttcttc ttcttcttgc tgattggttc tataagaaat ctagtatttt ctttgaaaca 1560 gagttttccc gtggttttcg aacttggaga aagattgtta agcttctgta tattctgccc 1620 aaatttgtcg ggcccatggc gaaaaacgtt gcgattttcg gcttattgtt ttctcttctt 1680 gtgttggttc cttctcagat cttcgccgat cgaatctgca ctggaataac atcgtcaaac 1740 tcaccacatg tcgtcaaaac tgctactcaa ggggaggtca atgtgactgg tgtaatacca 1800 ctgacaacaa cacccaccaa atctcatttt gcaaatctca aaggaacaga aaccaggggg 1860 aaactatgcc caaaatgcct caactgcaca gatctggacg tagccttggg cagaccaaaa 1920 tgcacgggga aaataccctc ggcaagagtt tcaatactcc atgaagtcag acctgttaca 1980 tctgggtgct ttcctataat gcacgacaga acaaaaatta gacagctgcc taaccttctc 2040 cgaggatacg aacatatcag gttatcaacc cataacgtta tcaatgcaga aaatgcacca 2100 ggaggaccct acaaaattgg aacctcaggg tcttgcccta acattaccaa tggaaacgga 2160 tttttcgcaa caatggcttg ggccgtccca aaaaacgaca aaaacaaaac agcaacaaat 2220 ccattaacaa tagaagtacc atacatttgt acagaaggag aagaccaaat taccgtttgg 2280 gggttccact ctgacaacga gacccaaatg gcaaagctct atggggactc aaagccccag 2340 aagttcacct catctgccaa cggagtgacc acacattacg tttcacagat tggtggcttc 2400 ccaaatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagtggta gaattgttgt tgattacatg 2460 gtgcaaaaat ctgggaaaac aggaacaatt acctatcaaa ggggtatttt attgcctcaa 2520 aaggtgtggt gcgcaagtgg caggagcaag gtaataaaag gatccttgcc tttaattgga 2580 gaagcagatt gcctccacga aaaatacggt ggattaaaca aaagcaagcc ttactacaca 2640 ggggaacatg caaaggccat aggaaattgc ccaatatggg tgaaaacacc cttgaagctg 2700 gccaatggaa ccaaatatag acctcctggt ggaggatggg aaggaatgat tgcaggttgg 2760 cacggataca catcccatgg ggcacatgga gtagcggtgg cagcagacct taagagcact 2820 caagaggcca taaacaagat aacaaaaaat ctcaactctt tgagtgagct ggaagtaaag 2880 aatcttcaaa gactaagcgg tgccatggat gaactccaca acgaaatact agaactagat 2940 gagaaagtgg atgatctcag agctgataca ataagctcac aaatagaact cgcagtcctg 3000 ctttccaatg aaggaataat aaacagtgaa gatgaacatc tcttggcgct tgaaagaaag 3060 ctgaagaaaa tgctgggccc ctctgctgta gagataggga atggatgctt tgaaaccaaa 3120 cacaagtgca accagacctg tctcgacaga atagctgctg gtacctttga tgcaggagaa 3180 ttttctctcc ccacctttga ttcactgaat attactgctg catctttaaa tgacgatgga 3240 ttggataatc atactatact gctttactac tcaactgctg cctccagttt ggctgtaaca 3300 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ttcaaagtaa tccttctgtt gacttgtcat tgataacatc cagtcttcgt caggattgca 4200 aagaattata gaagggatcc caccttttat tttcttcttt tttccatatt tagggttgac 4260 agtgaaatca gactggcaac ctattaattg cttccacaat gggacgaact tgaaggggat 4320 gtcgtcgatg atattatagg tggcgtgttc atcgtagttg gtgaagtcga tggtcccgtt 4380 ccagtagttg tgtcgcccga gacttctagc ccaggtggtc tttccggtac gagttggtcc 4440 gcagatgtag aggctggggt gtctgacccc agtccttccc tcatcctggt tagatcggcc 4500 atccactcaa ggtcagattg tgcttgatcg taggagacag gatgtatgaa agtgtaggca 4560 tcgatgctta catgatatag gtgcgtctct ctccagttgt gcagatcttc gtggcagcgg 4620 agatctgatt ctgtgaaggg cgacacgtac tgctcaggtt gtggaggaaa taatttgttg 4680 gctgaatatt ccagccattg aagctttgtt gcccattcat gagggaattc ttctttgatc 4740 atgtcaagat actcctcctt agacgttgca gtctggataa tagttcgcca tcgtgcgtca 4800 gatttgcgag gagagacctt atgatctcgg aaatctcctc tggttttaat atctccgtcc 4860 tttgatatgt aatcaaggac ttgtttagag tttctagctg gctggatatt agggtgattt 4920 ccttcaaaat cgaaaaaaga aggatcccta atacaaggtt ttttatcaag ctggataaga 4980 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ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3300 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3360 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3420 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3465 <210> 48 <211> 574 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 48 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr 35 40 45 Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr 50 55 60 Glu Leu Val Gln Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Cys Asp Ser Pro His 65 70 75 80 Gln Ile Leu Asp Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly 85 90 95 Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val 100 105 110 Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp 115 120 125 Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe 130 135 140 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gcaacatttg agaaaatttt 300 gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaga cgcgttgttg ttgtgactcc gaggggttgc 2160 ctcaaactct atcttataac cggcgtggag gcatggaggc aggggtattt tggtcatttt 2220 aatagatagt ggaaaatgac gtggaattta cttaaagacg aagtctttgc gacaaggggg 2280 ggcccacgcc gaatttaata ttaccggcgt ggccccccct tatcgcgagt gctttagcac 2340 gagcggtcca gatttaaagt agaaaatttc ccgcccacta gggttaaagg tgttcacact 2400 ataaaagcat atacgatgtg atggtatttg gtcgacaagc ttgcatgccg gtcaacatgg 2460 tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 2520 gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 2580 cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 2640 atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 2700 atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 2760 agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 2820 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 2880 ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 2940 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 3000 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 3060 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 3120 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 3180 catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga acgtggggaa 3240 acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa cttctctctt 3300 gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac cagtacaacg 3360 ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc ggcgccatta 3420 aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa gcttgctgga 3480 ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg gcgggtgcaa 3540 tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct tcttcttgct 3600 gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 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aaaaaggaag agggagaata 360 aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420 aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480 taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540 aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600 atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660 taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720 tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780 gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840 acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900 ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960 accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020 gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080 aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140 gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200 actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260 aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320 gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380 tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440 agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500 tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560 tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620 ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680 tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740 ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800 cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860 gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920 tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980 ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040 ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100 cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaga cgcgttgttg ttgtgactcc gaggggttgc 2160 ctcaaactct atcttataac cggcgtggag gcatggaggc aggggtattt tggtcatttt 2220 aatagatagt ggaaaatgac gtggaattta cttaaagacg aagtctttgc gacaaggggg 2280 ggcccacgcc gaatttaata ttaccggcgt ggccccccct tatcgcgagt gctttagcac 2340 gagcggtcca gatttaaagt agaaaatttc ccgcccacta gggttaaagg tgttcacact 2400 ataaaagcat atacgatgtg atggtatttg gtcgacaagc ttgcatgccg gtcaacatgg 2460 tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 2520 gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 2580 cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 2640 atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 2700 atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 2760 agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata 2820 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 2880 ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 2940 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 3000 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 3060 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 3120 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 3180 catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga acgtggggaa 3240 acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa cttctctctt 3300 gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac cagtacaacg 3360 ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc ggcgccatta 3420 aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa gcttgctgga 3480 ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg gcgggtgcaa 3540 tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct tcttcttgct 3600 gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg tggttttcga 3660 acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg gcccatggcg 3720 aaaaacgttg cgattttcgg cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc ttctcagatc 3780 ttcgccgcgg ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat 3840 ctgctgccca aactaactcc atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg 3900 agccagtgac agtgacctgg aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag 3960 ctgtcctgca gtctgacctc tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct 4020 ggcccagcga gaccgtcacc tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca 4080 agaaaattgt gcccagggat tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat 4140 catctgtctt catcttcccc ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta 4200 aggtcacgtg tgttgtggta gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt 4260 ttgtagatga tgtggaggtg cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca 4320 gcactttccg ctcagtcagt gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg 4380 agcgatcgct caccatcacc atcaccatca ccatcaccat taaaggccta ttttctttag 4440 tttgaattta ctgttattcg gtgtgcattt ctatgtttgg tgagcggttt tctgtgctca 4500 gagtgtgttt attttatgta atttaatttc tttgtgagct cctgtttagc aggtcgtccc 4560 ttcagcaagg acacaaaaag attttaattt tattaaaaaa aaaaaaaaaa aagaccggga 4620 attcgatatc aagcttatcg acctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 4680 agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 4740 aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 4800 agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 4860 gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc tctagagtct caagcttggc 4920 gcgccataaa atgattattt tatgaatata tttcattgtg caagtagata gaaattacat 4980 atgttacata acacacgaaa taaacaaaaa aagacaatcc aaaaacaaac accccaaaaa 5040 aaataatcac tttagataaa ctcgtatgag gagaggcacg ttcagtgact cgacgattcc 5100 cgagcaaaaa aagtctcccc gtcacacata tagtgggtga cgcaattatc tttaaagtaa 5160 tccttctgtt gacttgtcat tgataacatc cagtcttcgt caggattgca aagaattata 5220 gaagggatcc caccttttat tttcttcttt tttccatatt tagggttgac agtgaaatca 5280 gactggcaac ctattaattg cttccacaat gggacgaact tgaaggggat gtcgtcgatg 5340 atattatagg tggcgtgttc atcgtagttg gtgaaatcga tggtaccgtt ccaatagttg 5400 tgtcgtccga gacttctagc ccaggtggtc tttccggtac gagttggtcc gcagatgtag 5460 aggctggggt gtcggattcc attccttcca ttgtcctggt taaatcggcc atccattcaa 5520 ggtcagattg agcttgttgg tatgagacag gatgtatgta agtataagcg tctatgctta 5580 catggtatag atgggtttcc ctccaggagt gtagatcttc gtggcagcga agatctgatt 5640 ctgtgaaggg cgacacatac ggttcaggtt gtggagggaa taatttgttg gctgaatatt 5700 ccagccattg aagttttgtt gcccattcat gagggaattc ttccttgatc atgtcaagat 5760 attcctcctt agacgttgca gtctggataa tagttctcca tcgtgcgtca gatttgcgag 5820 gagagacctt atgatctcgg aaatctcctc tggttttaat atctccgtcc tttgatatgt 5880 aatcaaggac ttgtttagag tttctagctg gctggatatt agggtgattt ccttcaaaat 5940 cgaaaaaaga aggatcccta atacaaggtt ttttatcaag ctggagaaga gcatgatagt 6000 gggtagtgcc atcttgatga agctcagaag caacaccaag gaagaaaata agaaaaggtg 6060 tgagtttctc ccagagaaac tggaataaat catctctttg agatgagcac ttgggatagg 6120 taaggaaaac atatttagat tggagtctga agttcttact agcagaaggc atgttgttgt 6180 gactccgagg ggttgcctca aactctatct tataaccggc gtggaggcat ggaggcaggg 6240 gtattttggt cattttaata gatagtggaa aatgacgtgg aatttactta aagacgaagt 6300 ctttgcgaca agggggggcc cacgccgaat ttaatattac cggcgtggcc cccccttatc 6360 gcgagtgctt tagcacgagc ggtccagatt taaagtagaa aatttcccgc ccactagggt 6420 taaaggtgtt cacactataa aagcatatac gatgtgatgg tatttgacta gtggcactgg 6480 ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 6540 cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 6600 cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg 6660 tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc 6720 taagagaaaa gagcgttta 6739 <210> 63 <211> 3525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette number 1631 <400> 63 gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360 tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420 agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480 aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540 atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720 taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780 acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840 cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900 cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960 ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020 gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080 gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140 tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200 tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260 gcccatggcg aaaaacgttg cgattttcgg cttattgttt tctcttcttg tgttggttcc 1320 ttctcagatc ttcgccgatc gaatctgcac tgggataaca tcgtcaaact caccacatgt 1380 tgtcaaaact gctactcaag gggaggtcaa tgtgactggt gtaataccac tgacaacaac 1440 acccaccaaa tctcattttg caaatctcaa aggaacagaa accagaggga aactatgccc 1500 aaaatgcctc aactgcacag atctggacgt ggccttgggc agaccaaaat gcacggggaa 1560 cataccctcg gcaagagttt caatactcca tgaagtcaga cctgttacat ctgggtgctt 1620 tcctataatg cacgacagaa caaaaattag acagctgcct aaacttctca gaggatacga 1680 acatatcagg ttatcaactc ataacgttat caatgcagaa aatgcaccag gaggacccta 1740 caaaattgga acctcagggt cttgccctaa cgttaccaat ggaaacggat ttttcgcaac 1800 aatggcttgg gccgtcccaa aaaacgacaa caacaaaaca gcaacaaatt cattaacaat 1860 agaagtacca tacatttgta cagaaggaga agaccaaatt accgtttggg ggttccactc 1920 tgataacgaa acccaaatgg caaagctcta tggggactca aagccccaga agttcacctc 1980 atctgccaac ggagtgacca cacattacgt ttcacagatt ggtggcttcc caaatcaaac 2040 agaagacgga ggactaccac aaagcggtag aattgttgtt gattacatgg tgcaaaaatc 2100 tgggaaaaca ggaacaatta cctatcaaag aggtatttta ttgcctcaaa aagtgtggtg 2160 cgcaagtggc aggagcaagg taataaaagg atcgttgcct ttaattggag aagcagattg 2220 cctccacgaa aaatacggtg gattaaacaa aagcaagcct tactacacag gggaacatgc 2280 aaaggccata ggaaattgcc caatatgggt gaaaacaccc ttgaagctgg ccaatggaac 2340 caaatataga cctcctgcaa aactattaaa ggaaaggggt ttcttcggag ctattgctgg 2400 tttcttagaa ggaggatggg aaggaatgat tgcaggttgg cacggataca catcccatgg 2460 ggcacatgga gtagcggtgg cagcagacct taagagcact caagaggcca taaacaagat 2520 aacaaaaaat ctcaactctt tgagtgagct ggaagtaaag aatcttcaaa gactaagcgg 2580 tgccatggat gaactccaca acgaaatact agaactagac gagaaagtgg atgatctcag 2640 agctgataca ataagctcac aaatagaact cgcagtcctg ctttccaatg aaggaataat 2700 aaacagtgaa gatgagcatc tcttggcgct tgaaagaaag ctgaagaaaa tgctgggccc 2760 ctctgctgta gagataggga atggatgctt tgaaaccaaa cacaagtgca accagacctg 2820 tctcgacaga atagctgctg gtacctttga tgcaggagaa ttttctctcc ccacttttga 2880 ttcactgaat attactgctg catctttaaa tgacgatgga ttggataatc atactatact 2940 gctttactac tcaactgctg cctccagttt ggctgtaaca ttgatgatag ctatctttgt 3000 tgtttatatg gtctccagag acaatgtttc ttgctccatc tgtctataaa ggcctatttt 3060 ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg 3120 tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt 3180 cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 3240 ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt 3300 ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 3360 tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 3420 atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 3480 aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagat 3525 <210> 64 <211> 594 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 64 Met Ala Lys Asn Val Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val 35 40 45 Asn Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His 50 55 60 Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys 65 70 75 80 Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys 85 90 95 Thr Gly Asn Ile Pro Ser Ala Arg Val Ser Ile Leu His Glu Val Arg 100 105 110 Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile 115 120 125 Arg Gln Leu Pro Lys Leu Leu Arg Gly Tyr Glu His Ile Arg Leu Ser 130 135 140 Thr His Asn Val Ile Asn Ala Glu Asn Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys 145 150 155 160 Ile Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Val Thr Asn Gly Asn Gly Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Lys Asn Asp Asn Asn Lys Thr 180 185 190 Ala Thr Asn Ser Leu Thr Ile Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Glu Gly 195 200 205 Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Glu Thr Gln 210 215 220 Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser 225 230 235 240 Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro 245 250 255 Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val 260 265 270 Asp Tyr Met Val Gln Lys Ser Gly Lys Thr Gly Thr Ile Thr Tyr Gln 275 280 285 Arg Gly Ile Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser 290 295 300 Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu 305 310 315 320 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly 325 330 335 Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro 340 345 350 Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu 355 360 365 Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly 370 375 380 Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala 385 390 395 400 His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile 405 410 415 Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys 420 425 430 Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile 435 440 445 Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser 450 455 460 Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn 465 470 475 480 Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met 485 490 495 Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys 500 505 510 His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe 515 520 525 Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr 530 535 540 Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu 545 550 555 560 Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala 565 570 575 Ile Phe Val Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile 580 585 590 Cys Leu

Claims (60)

  1. a) 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하고 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계,
    b) 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하고 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 핵산을 도입하는 단계,
    c) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양함으로써, VLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 식물에서 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 채널 단백질은 양성자 채널 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, 양성자 채널 단백질은 M2 또는 BM2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2 항에 있어서, 양성자 채널 단백질은 양성자 채널 서명 서열 HXXXW를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질은 트리머화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 HA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6 항에 있어서, 인플루엔자 HA 단백질의 하나 이상의 단백질 가수 분해 루프가 결실된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 B HA, C, H2, H3, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 및 H16으로 구성된 그룹으로부터 선택된 인플루엔자 구조 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 B HA 또는 인플루엔자 H3인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 인플루엔자 B HA는 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Wisconsin/1/2010의 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 인플루엔자 B HA 단백질의 하나 이상의 단백질 가수 분해 루프는 결실된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9 항에 있어서, 인플루엔자 H3은 인플루엔자 A/Perth/16/2009 또는 인플루엔자 A/Victoria/361/2011의 것임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 51 및 SEQ ID NO: 61로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54 및 SEQ ID NO: 64 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 43 및 SEQ ID NO: 57의 밑줄 그어져 있는 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 41 및 SEQ ID NO: 58 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 48 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 코모바이러스 인핸서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소와 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고, 제미니바이러스 레플리카제를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20 항에 있어서, 코모바이러스 UTR은 동부 모자이크 바이러스(CPMV) UTR인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19 항에 있어서, 하나 이상의 제미니 바이러스 증폭 요소는 황고병 바이러스 긴 유전자 간 영역(BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자 간 영역(BeYDV SIR)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 B HA 또는 인플루엔자 H3인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23 항에 있어서, 인플루엔자 B HA는 인플루엔자 B/Brisbane/60/2008, B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Wisconsin/1/2010의 것임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24 항에 있어서, 인플루엔자 B HA 단백질의 하나 이상의 단백질 가수 분해 루프는 결실된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23 항에 있어서, 인플루엔자 H3은 인플루엔자 A/Perth/16/2009 또는 A/Victoria/361/2011의 것임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 51 및 SEQ ID NO: 61로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질은 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 54 및 SEQ ID NO: 64 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 43 및 SEQ ID NO: 57의 밑줄 그어져 있는 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 41 및 SEQ ID NO: 58 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 46으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제19 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 48 중 적어도 하나에 나타난 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 연속적으로, 구조 바이러스 단백질 또는 이들의 단편, 인플루엔자 막관통 도메인, 및 세포질 꼬리를 암호화하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1 항에 있어서, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 일시적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1 항에 있어서, 도입 단계(단계 a)에서, 핵산은 식물에서 안정하게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1 항에 있어서,
    d) 식물을 수확하고 VLP를 정제하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1 항에 있어서, VLP는 바이러스 기질 또는 코어 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. a) 식물에서 활성이고 구조 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산, 및 식물에서 활성이고 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 식물 또는 식물의 일부를 식물, 또는 식물의 일부에 제공하는 단계,
    b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 식물 또는 식물의 일부를 배양함으로써, VLP를 생산하는 단계
    를 포함하는, 바이러스 유사 입자(VLP)를 생산하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 채널 단백질은 양성자 채널 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 양성자 채널 단백질은 M2 또는 BM2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1 항의 방법에 의해 생산된 VLP.
  42. 제38 항의 방법에 의해 생산된 VLP.
  43. 제41 항 또는 제42 항에 있어서, 식물로부터 유래된 하나 이상의 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  44. 제41 항 또는 제42 항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 식물 특이적 N-글리칸, 또는 변형된 N-글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 VLP.
  45. 면역 반응을 유발하는 제41 항 또는 제42 항의 VLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  46. 제41 항 또는 제42 항의 VLP를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는 방법.
  47. 제46 항에 있어서, VLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제41 항 또는 제42 항에 설명된 바와 같이 VLP를 사용하여 제조되는 다클론성 항체.
  49. 제1 항 또는 제38 항의 방법에 의해 생산된 VLP를 포함하는 식물성 물질.
  50. 제49 항에 있어서, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 면역성을 유발하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 식물성 물질.
  51. 제50 항의 식물성 물질을 포함하는 식품 보충제.
  52. 제1 항에 있어서, 제3 핵산 서열을 도입하는 단계를 더 포함하며, 제3 핵산 서열은 침묵 억제자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제19 항에 있어서, 제4 핵산 서열을 도입하는 단계를 더 포함하며, 제4 핵산 서열은 침묵 억제자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52 항 또는 제53 항에 있어서, 침묵 억제자는 그룹 HcPro 및 p19로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1 항 또는 제38 항에 있어서, VLP는 채널 단백질을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1 항 또는 제38 항에 있어서, 구조 바이러스 단백질은 HA0 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제3 항에 있어서, M2 단백질은 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/1934 및 인플루엔자 A/New Caledonia/20/1999를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. SEQ ID NO: 41 및 SEQ ID NO: 58로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
  59. 제58 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열.
  60. 제59 항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 43 및 SEQ ID NO: 57의 밑줄 그어져 있는 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
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