ES2662118T3 - Expresión de proteínas virales en las plantas - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un polipéptido H5 del virus de influenza en una planta que comprende las etapas de: i) clonar un gen del virus de influenza H5 o ácido nucleico que codifica un polipéptido H5 en un vector adaptado para dirigir un componente presente en la planta, en el que el componente de la planta es el retículo endoplasmático; ii) infiltrar al menos una porción de la planta con el vector o transformar el tejido vegetal con el vector para expresar de forma transitoria el polipéptido del virus de influenza H5; y iii) recuperar el polipéptido H5 del virus de influenza expresado por la planta.

Description

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verificaron los clones positivos por medio del aislamiento del ADN plasmídico de colonias recombinantes de Agrobacterium, y la nueva transformación del ADN plasmídico en células DH5α de E. coli y selección sobre 100 µg/ml de ampicilina.
Tabla A. Resumen de los recombinantes de Agrobacterium utilizados
Clon
Vector Inserción Compartimento celular dirigido Cepa de Agrobacterium
pTRA-SAL1
pTRAc SAL1 (aislado L1 de HPV-16 sudafricano) citoplasma GV3101
pTRA-SYNL1
pTRAc SYNL1 (L1 del HPV-16 optimizado por el codón de la planta) citoplasma GV3101
pTRA-HL1
pTRAc HL1 (L1 del HPV-16 optimizado por codón humano) citoplasma GV3101
pTRA-GFP
pTRAc Gfp citoplasma GV3101
pTRACTP-SAL1
pTRAkcrbcs1-cTP SAL1 plastos GV3101
pTRACTP-SYNL1
pTRAkorbcs1-cTP SYNL1 plastos GV3101
pTRACTP-HL1
pTRAkcrbcs1-cTP HL1 plastos GV3101
pTRACTP-HL1∆C22
pTRAkcrbcs1-cTP HL1∆C22 (truncamiento de la señal de localización nuclear) plastos GV3101
pTRACTP-GFP
pTRAkcrbcs1-cTP Gfp plastos GV3101
pTRAERH-SAL1
pTRAkc-ERH SAL1 RE GV3101
pTRAERH-SYNL1
pTRAkc-ERH SYNL1 RE GV3101
pTRAERH-HL1
pTRAkc-ERH HL1 RE GV3101
pTRAERH-GFP
pTRAkc-ERH Gfp RE GV3101
pBIN-NSs
pBIN NSs citoplasma LBA4404
Preparación de Agrobacterium para infiltración
Se obtuvo Agrobacterium LBA4404 (pBIN-NSs), que contenía los genes supresores del silenciamiento de NSs de
10 TSWV, de Marcel Prins (Laboratory of Virology, Wageningen, Países Bajos). Se complementaron los cultivos de Agrobacterium GV3101 que contenían plásmidos basados en los vectores pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP-y pTRAkc-ERH con 50 µg.ml-1 de carbenicilina y 50 µg.ml-1 de rifampicina. Se complementaron los cultivos de Agrobacterium LBA4404 (pBIN-NSs) con 50 µg.ml-1 de rifampicina y 30 µg.ml-1 de kanamicina. Los cultivos de Agrobacterium se desarrollaron con agitación a 27 ºC hasta fase logarítmica (OD600≈0,8) en caldo LB, que contenía los antibióticos
15 apropiados. Se recogieron las células por centrifugación a 4000 g, se resuspendieron en medio de inducción (caldo LB a pH 5,6 que contenía ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico [MES] 10 mM, acetosiringona 20 mM, y MgSO4 2 mM) con los antibióticos apropiados, y se cultivaron como anteriormente. Las células se recogieron por centrifugación, como anteriormente, y se suspendieron de nuevo en medio de infiltración (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, sacarosa al 2% y 150 µg.ml-1 de acetosiringona, pH 5,6). Para la infiltración al vacío se reemplazó el MgCl2 con 4 g de sales
20 MS.l-1. Se diluyeron las suspensiones de Agrobacterium en medio de infiltración hasta una OD600 de 1,0, y se mantuvieron a 22 °C durante 2-3 h.
Agroinfiltración
25 Inyección: Se diluyeron suspensiones de Agrobacterium-L1 y Agrobacterium (pBIN-NSs) y se combinaron en un medio de infiltración, ambos a una OD600 final de 0,25. Cuando se coinfiltró Agrobacterium (pTRA-GFP) con la suspensión anterior, se utilizó a una OD600 final de 0,0125. Se infiltraron hojas de plantas de N. benthamiana de 2-4 semanas de edad mediante inyección de la suspensión de Agrobacterium en los espacios aéreos abaxiales de la parte inferior de la hoja. Se agroinfiltraron seis hojas con cada mezcla agrobacteriana (3 plantas, 2 hojas/planta). Las
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Se recubrió una placa de microtitulación con las VLP de L1 del HPV-16 producidas por baculovirus (2 µg.ml-1), se bloqueó durante 2 h a 4 ° C con PVA al 0,5% en PBS, y luego se lavó 6 veces con PBS. Se diluyeron en serie los sueros en PVA al 0,5% (1:40 a 1:40960) y se incubaron sobre la placa a 37 °C durante 1 h. Después de lavar 6 veces con PBS, se añadió el conjugado de HRP anti-ratón de conejo (1:2000; DAKO) durante 30 min a 37 °C. La
5 detección se realizó con sustrato OPD (DAKO).
El ensayo del anticuerpo neutralizante del pseudovirus de HPV-16 se realizó de acuerdo con el método de (Pastrana et al., 2004). Los plásmidos necesarios para el ensayo se obtuvieron de John Schiller (Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute, Bethesda, Estados Unidos).
10
Transformación y regeneración de la planta
Las hojas de L. cv. Petite Havana SR1 de N. tabacum se cortaron en trozos de ±1 cm2, se esterilizaron en lejía al 10% y se aclararon en agua estéril. Se sumergieron los discos de hoja en el cultivo de Agrobacterium relevante 15 recombinante y crecieron sobre un medio de cultivo conjunto (Tabla 2) bajo luz constante durante dos días. Los discos de hojas se colocaron entonces en medio de regeneración fresco (Tabla 2) cada dos semanas hasta que aparecieron brotes pequeños (4-6 semanas). Los brotes de 1,5-2 cm se transfirieron a medio de enraizamiento (Tabla 2). Los brotes se incubaron hasta que fue evidente el crecimiento fuerte de la raíz, y luego se transplantaron a una mezcla de suelo/vermiculita (2:1), se cubrieron con bolsas de plástico y se mantuvieron alejados de la luz directa
20 durante tres días antes de trasladarse a la luz directa. Las plantas transgénicas se seleccionaron por medio de PCR usando el kit Extract-N-Amp Plant PCR (Sigma) e cebadores específicos de L1.
Tabla B: Medios para la transformación y regeneración de tabaco. Todos los medios contenían MS con vitaminas (Highveld Biological, Sudáfrica), sacarosa al 1% y agar al 0,8%.
Co-cultivo
Regeneración Enraizamiento
ácido α-naftalenoacético
0,1 mg.l-1 0,1 mg.l-1
Bencilaminopurina
1 mg.l-1 1 mg.l-1
Cefotaxima
250 mg.l-1 250 mg.l-1
Kanamicina
300 mg.l-1 100 mg.l-1
25 El método de inyección de infiltración demostró ser útil para la comparación rápida de numerosas construcciones de Agrobacterium, y para la optimización de las concentraciones de cultivo para infiltración. El análisis de transferencia de Western de muestras de N. benthamiana (Figura 4), después de la infiltración con Agrobacterium que portaba el gen L1 del HPV-16 optimizado por codón humano (HL1), demostró la expresión exitosa del monómero de L1 de 55
30 kDa. La expresión de HL1 del vector pTRA-HL1 (localización citoplasmática de L1) no pudo ser detectada después de 6 días, a menos que se produjera coinfiltración de Agrobacterium (pBIN-NSS). Por otro lado, HL1 dirigido al cloroplasto (vector pTRACTP-HL1) produjo niveles detectables de HL1 sin Agrobacterium (pBIN-NSs), que fueron reforzados con la coinfiltración de Agrobacterium (pBIN-NSs).
35 Los resultados anteriores fueron confirmados por medio de ELISA de captura (Figura 5). Además, el ELISA estableció que L1 se ensambló en las estructuras multiméricas necesarias para la generación de anticuerpos de neutralización, ya que el mAb H16.V5 utilizado para este ELISA de captura es específico para un epítopo conformacional formado por pentámeros y las VLP. La formación de VLP se confirmó por medio de microscopía electrónica (Figura 6) de un extracto en bruto de una hoja de N. benthamiana que había sido infiltrada con
40 Agrobacterium GV3101 (pTRACTP-HL1).
La optimización del codón y el direccionamiento del compartimiento de la planta afectó significativamente la acumulación de L1 (Figura 7). Los niveles de acumulación de SYNL1 y SAL1 en hojas agroinfiltradas fueron a menudo bajos, o indetectables, sin embargo, HL1 se acumuló hasta niveles altos (hasta ~600 mg de L1/kg de 45 material de la hoja; -17% de TSP). Fue sorprendente que L1 optimizado por el codón de la planta (SYNL1) se expresara en niveles inferiores que L1 nativo (SAL1). El direccionamiento de L1 a los cloroplastos aumentó su acumulación significativamente tanto sobre L1 citoplasmático como el dirigido al RE, y puede ser un resultado de la protección de las proteasas presentes en el citoplasma. La expresión de L1 fue más baja cuando se dirigió al RE. Se utilizó Agrobacterium (pTRA-GFP) para medir las desviaciones de eficiencia de la infiltración entre las hojas (que
50 generalmente se encontró que eran pequeñas, con una diferencia del 14% entre las infiltraciones más y menos eficientes).
Se demostró el potencial para la expresión a media escala o posiblemente a gran escala de HPV-L1 en N. benthamiana y N. tabacum L. cv. Petite Habana SR1 por la infiltración al vacío. La infiltración al vacío de plantas de
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durante 10 min a TA y se resuspendieron en medio de infiltración (MES 10 mM, MgCl2 10 mM, 2,2105 g/l de sales de Murashige Skoog [MS], 35 g/l de sacarosa, acetosiringona 150 M, a pH 5,6). Se midió la densidad óptica de las células y se diluyó hasta una OD600 de entre 0,4 y 1,0. Las células se incubaron durante 3 h en el medio de infiltración antes de la infiltración.
TABLA 2. Un resumen de las cepas de Agrobacterium, los vectores que se usaron, los plásmidos fabricados, las inserciones que contienen, y donde se dirige la proteína heteróloga
Cepa de Agrobacterium
Vector de Agrobacterium Nombre del plásmido Inserción Compartimento celular dirigido
GV3101
pTRAc pTRA-saL2-C HPV-16 saL2 citoplasma
GV3101
pTRAkc-ERH pTRA-saL2-E HPV-16 saL2 retículo endoplasmático
GV3101
pTRAkc-rbcs1-cTP pTRA-saL2-P HPV-16 saL2 cloroplasto
GV3101
pTRAc pTRA-pL2-C HPV-16 pL2 citoplasma
GV3101
pTRAkc-rbcs1-cTP pTRA-pL2-P HPV-16 pL2 cloroplasto
GV3101
pTRAc pTRA-hL2-C HPV-16 hL2 citoplasma
GV3101
pTRAkc-A pTRA-hL2-A HPV-16 hL2 espacio apoplásico
GV3101
pTRAkc-ERH pTRA-hL2-E HPV-16 hL2 retículo endoplasmático
GV3101
pTRAkc-rbcs1-cTP pTRA-hL2-P HPV-16 hL2 cloroplasto
*GV3101
pTRAc pTRA-HL1 HPV-16 HL1 citoplasma
*GV3101
pTRAc pTRA-p19 p19 citoplasma
*Cepas de Agrobacterium suministradas por James MacLeau ORF de L2 de tipo silvestre del HPV-16 saL2. ORF de L2 del HPV-16 pL2 optimizado para expresión en Nicotiana. ORF de L1 de tipo silvestre del HPV-16 saL1b. ORF de L1 del HPV-16 hL1 optimizado para expresión en Homo sapiens.
Procedimiento de infiltración
10 Un gen L1 del HPV-16 optimizado de mamífero en GV3101 clonado en el vector dirigido al citoplasma (pTRA-hL1) se donó amablemente por el Dr. James McLean (UCT, Ciudad del Cabo, Sudáfrica). Las cepas de Agrobacterium GV3101 que contenían las construcciones L1 o L2 se infiltraron en solitario o mezcladas con cantidades iguales de GV3101 (pTRA-p19) que codifican un supresor silenciador p19; esta cepa también fue donada por el Dr. James
15 McLean (UCT, Ciudad del Cabo, Sudáfrica). Se usaron dos protocolos de infiltración diferentes: infiltración por inyección o infiltración al vacío. Para la infiltración por inyección se utilizó una jeringa de 2 ml para inyectar el Agrobacterium suspendido en un medio de infiltración en los espacios aéreos abaxiales de hojas de N. benthamiana.
Para la infiltración al vacío se suspendieron plantas enteras de N. benthamiana en medio para infiltración que
20 contenía las cepas de Agrobacterium y se colocaron en placas al vacío a 60 mbar durante 5 min. Agrobacterium se infiltró con la liberación del vacío. El protocolo difiere del usado por Vaquero et al. (1999) (7). Se desarraigaron las plantas enteras, se infiltraron al vacío y se plantaron de nuevo. Vaquero et al. (1999) infiltraron al vacío hojas enteras de plantas Petite Havanna. El uso de plantas enteras no sólo es más fácil, sino que se pueden administrar nutrientes adicionales a las hojas para aumentar la expresión del transgén. Las plantas se incuban posteriormente a 28 ºC en
25 una habitación con control de humedad.
Extracción de proteínas y transferencias de Western
Se realizó la homogeneización moliendo el material en nitrógeno líquido. Se suspendió la muestra homogeneizada
30 en 2 µl/mg de urea 8 M. Se separaron los restos celulares y otras moléculas más grandes por medio de dos rondas de centrifugación (10.000 x g, 10 min a TA). Se añadió el tampón de carga dodecil sulfato sódico (SDS)-PAGE a las muestras y se hirvió durante 10 minutos. Se cargó la muestra sobre SDS-PAGE al 10% y se procesó a 100 V durante ~2,5 h. La proteína se transfirió a una membrana de nylon (Nitrobind, Nitrocelulosa fundida y pura, 0,45 micrómetros, OSMONICS INC.) por medio de transferencia semiseca a 15 V, 400 mA, durante 2 h (Trans Blot®
35 semiseca, BioRad® con la fuente de alimentación Electrophoresis Power Supply, AMERSHAM®). El éxito de la transferencia se midió mediante tinción con azul Coomassie del gel después de la transferencia. La membrana se bloqueó durante una noche en leche desnatada al 5% suspendida en PBS con Tween-20 al 0,05%. La membrana se
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incubó durante 4 horas más a temperatura ambiente con antisuero policlonal de conejo surgido contra L2 del HPV16 (1:3.000), anticuerpos monoclonales de ratón contra L1 del HPV-16 (J4) (1:5.000). Las membranas se incubaron con anticuerpos anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma®-Aldrich) diluidos a 1:10.000 durante 2 h a TA. La inmunodetección se realizó utilizando fosfato de 5-bromo-4-cloro-3
5 indolilo/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT) elaborado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche® Diagnostics).
Expresiones de L2 por expresión transitoria en plantas de N. benthamiana.
10 Se infiltraron plantas de N. benthamiana con las nueve cepas de Agrobacterium que contenían los diferentes ORF de L2. La expresión de L2 no pudo ser detectada por transferencia de Western de ninguna de las cepas que contenían el ORF de pL2 o el ORF de saL2 (datos no mostrados). Esto podría deberse al uso de codones como se ha publicado previamente para L1. (8) Sin embargo, se observó la expresión al expresarse a partir de cualquiera de los clones que tienen el gen hL2 (Figura 15). Se observó una expresión similar de L2 a través del conjunto de
15 vectores. Se observaron también cantidades similares de productos de degradación en los diferentes vectores. Esto indica que posiblemente L2 se localiza en la misma región de la célula de la planta a pesar de las moléculas de señalización dentro del vector. Se espera un cierto grado de protección, en particular por las proteínas dirigidas al cloroplasto. Estas cifras contradicen otros hallazgos realizados con estos vectores, por ejemplo, la expresión de L1 es notablemente menor con el vector dirigido al RE que en los vectores dirigidos al cloroplasto o al citoplasma. (Dr.
20 James MacLean, comunicación personal)
L2 parece ser altamente expresado.
El material vegetal de cada infiltración se pesó y, por lo tanto, se añadió la misma cantidad de tampón (urea 8 M).
25 Esto permite la posibilidad de determinar empíricamente el peso original del material vegetal que se cargó en una transferencia de Western (Figura 3). Esta inmunotransferencia mostró que L2 aún se puede detectar hasta 0,4 mg del material vegetal original. Sólo podemos especular la cantidad de L2 que está presente en relación con la proteína soluble total, se intentó un nuevo análisis por ELISA, pero fracasó debido a que sólo un anticuerpo policlonal estaba disponible.
30
Coexpresión de L1 y L2 en la misma región.
L2 y L1 se coinfiltraron simultáneamente en plantas de N. benthamiana. La expresión tanto de L1 como de L2 pudo ser detectada en estas muestras de hojas, sin embargo, a partir de estos resultados, no es concluyente si L1 y L2 se
35 expresan en la misma célula. La bibliografía sugiere que es más que probable que se expresen en la misma célula, habiéndose probado con expresión de anticuerpos con múltiples subunidades que las forman (29)
Se ha mostrado que las respuestas inmunes contra L1 producen anticuerpos de tipo específico, con el advenimiento de la vacunas contra el VPH de GSK y HPV, esto ha abierto el camino para vacunas de segunda generación que
40 muy probablemente incorporarán L2 y sus propiedades de neutralización cruzadas. La producción de proteínas heterólogas, y en particular vacunas de subunidades en las plantas, ha demostrado ser más rentable que otros sistemas de expresión. En conclusión, una unión de estos dos ideales sencillos pero importantes podría conducir a lo más necesario en la lucha contra el cáncer del cuello del útero: una vacuna barata y eficaz.
45 Ejemplo 4
Proteína quimérica L1 del VPH expresada a altos niveles
El método descrito en el documento WO2003/097673 se usa para la expresión de alto nivel de proteínas quiméricas 50 L1 del VPH como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
FIGURAS
La memoria descriptiva debe leerse con referencia a las siguientes figuras, en las que:
55 La Figura 1 muestra vectores de Agrobacterium pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP y pTRAkc-ERH. La Figura 2 muestra L1 del HPV-16 optimizado por codón humano (HL1) (SEQ ID NO. 13). La Figura 3 muestra L1 del HPV-16 optimizado por codón humano (SYNL1) (SEQ ID NO. 14). La Figura 4 muestra una transferencia tipo Western de muestras de hojas de N. benthamiana después de la
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Claims (1)

  1. imagen1
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