CN114106206B - 一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法。包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白。本发明解决了现有技术中，免疫原性低的问题。通过采用了重组疫苗蛋白和锚定多肽形成的融合蛋白，使得重组疫苗的免疫原性明显升高。

Description

一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法
技术领域
本发明涉及重组DNA技术领域，尤其涉及一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法。
背景技术
目前，临床使用的重组蛋白类药物大多数来自于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达生产平台，少部分来自酵母和昆虫细胞。与哺乳动物细胞类似，植物细胞同样拥有内膜系统，因此可以利用分子伴侣折叠和组装重组蛋白。而与动物表达系统相比，植物表达系统缺少动物病原性的污染物、培养基价格低廉(Schillberg等,Journal of plant physiology258(2021):153359.)。
作为生物反应器来生产外源蛋白的植物生产平台，可以是转基因植株，也可以是悬浮培养细胞，可以是稳定表达，也可以是瞬时表达。稳定表达系统是利用稳定转化的方式将外源基因及其相关转录和翻译调控元件整合到植物核基因组或质体基因组进行重组蛋白质的表达和生产；瞬时表达是指引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合，但是可以在载体进入细胞后约12小时表达，并且可以在2到8天内检测到基因产物。
当前，人以及牲畜所用的疫苗来源主要是灭活疫苗、减毒疫苗和通过基因工程技术得到的亚单位疫苗、类病毒颗粒，以及编码疫苗表面抗原的核酸类疫苗。作为真核生物，植物作为生产亚单位疫苗、类病毒颗粒的宿主已被广泛报到(LeBlanc等，2021，Viruses 13(1):5)。高等植物叶绿体作为表达体系是一种新的重组蛋白表达系统，目前已有相关研究报道。比如Svab等利用基因枪法在烟草叶绿体中成功转化rrn16基因，并获得rrn16蛋白的表达。Rubio-Infante等以HIV病毒膜蛋白gp120上的V3环和C4结构域序列作为外源基因，在烟草叶绿体中成功表达C4V3抗原蛋白。但大多数叶绿体遗传转化相关研究仅限于实验室研究阶段，很少用于大规模种子和重组蛋白的规模化生产。这可能是由于在田间光照强度、复杂的环境条件下叶绿体工程植物与实验室中的表现会有所差异。另外，现有技术中，均使将病毒表面蛋白或类病毒颗粒表达在植物细胞或细胞器内部，其免疫原性有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，其解决了现有技术中存在重组疫苗免疫原性有待进一步提高的问题。
本发明一方面，提供一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白。
其中，所述植物膜包括质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体中的一种或几种。
质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体均是植物细胞的膜结构，将重组疫苗蛋白表达在这些植物膜系统，经动物口服后可刺激肠道黏膜免疫而产生免疫反应，进而预防相关疾病的发生。
其中，所述锚定多肽来自膜蛋白的跨膜区。
优选地，所述锚定多肽包括：定位至质膜的CPK34蛋白N端多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1；定位至叶绿体外膜的OEP14跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，定位至叶绿体外膜的TOC34跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；定位至线粒体外膜的Tom70p蛋白N末端序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；定位至液泡膜的SYP22蛋白C端跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；定位至内质网膜的AtP24跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；定位至高尔基体膜的GALT跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
Toc34是位于叶绿体表面的GTP酶，可以与前体蛋白识别并通过二硫键与Toc75相互作用。OEP14位于叶绿体外膜，与Toc75共同参与将叶绿体外蛋白输入叶绿体内部。CPK34蛋白是位于质膜的钙依赖蛋白激酶34，是钙信号的感受器和效应因子。Tom70p蛋白是重要的TOM复合物成员之一，是线粒体外膜中蛋白质易位机制的主要表面受体。SYP22蛋白参与同型液泡的融合，对液泡发生起重要作用。GalT为半乳糖苷转移酶，定位于高尔基体反面。
其中，所述重组疫苗包括重组亚单位疫苗、类病毒颗粒疫苗中的一种。
重组疫苗既包括人用重组疫苗，也包括兽用重组疫苗。本发明方法制备的重组疫苗包括但不限于猪轮状病毒疫苗、犊牛肺肠炎病毒疫苗、流感病毒疫苗、呼吸道融合细胞病毒疫苗、诺瓦克病毒疫苗、埃博拉病毒疫苗、HIV病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、手足口病毒疫苗、新型冠状病毒疫苗，列举的这些疫苗的制备均适用于本发明，但并不局限于此，还包括其他重组疫苗。
优选地，所述重组疫苗为猪细小病毒疫苗。
其中，所述融合蛋白的编码基因由强启动子驱动，所述强启动子包括CaMV 35S启动子、增强型CaMV 35S启动子、NOS启动子。
其中，所述表达包括稳定表达、瞬时表达中的一种。
其中，所述植物包括烟草、生菜、浮萍、苜蓿、烟草悬浮细胞、拟南芥悬浮细胞、胡萝卜悬浮细胞。
具体地，在本发明的一个实施例中，利用植物膜系统生产重组疫苗的方法包括以下步骤：
1)构建重组疫苗表达载体，所述重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白；
2)转化植物；优选地，采用叶盘法进行转化。
本发明另一方面，提供一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法生产的重组疫苗。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、通过重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成融合蛋白，使得重组疫苗具有更高的免疫原性，产生更多的免疫蛋白抗体。
2、本发明利用植物膜系统生产重组疫苗蛋白，口服后可直接到达肠内粘膜诱导部位，刺激肠道免疫组织，激活粘膜和全身免疫反应。传统免疫途径必须经过非口服途径接种才能诱导机体产生循环性抗体IgG，几乎不能产生特异的粘膜免疫，在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接用抗原诱发免疫反应可大大提高其有效性。IgG不能阻挡毒素从黏膜吸收进入机体，而口服免疫可以产生分泌型IgA，能阻挡毒素从黏膜吸收进入机体。
3、与现有技术中将外源基因插入叶绿体基因组相比，本发明将外源基因插入到核基因组，经过传代后可以保持很好的遗传学稳定性能，适合大规模生产。
4、与现有技术中将疫苗表达于叶绿体腔体中或叶绿体内膜相比，本发明的疫苗蛋白表达于叶绿体外膜具有更好的免疫原性。
5、本发明比传统疫苗更易于储存和分发，不需要冷藏和低温运输，给药范围更广。
6、本发明比传统免疫途径更安全。在大规模细胞培养或繁殖过程中，不会发生病原微生物特别是霉形体的污染。
7、本发明生产成本更低廉，操作简单方便，无需提取纯化，易大规模生产。疫苗抗原基因转入可食用的植物后，通过简单的无性繁殖可获得大批植物疫苗，生产成本显著降低。
附图说明
图1为本发明实施例1中的1132-PPV-TOC34的表达载体图谱，其中，PPV：猪细小病毒表面抗原；TOC34：叶绿体外膜蛋白TOC34片段。
图2为本发明实施例2中转基因烟草愈伤组织诱导及植株再生的效果图。
图3为本发明实施例3中PPV-TOC融合蛋白在叶绿体外膜的亚细胞定位，左图为未转基因的野生型烟草；右图为稳定转化PPV-TOC的转基因烟草；左、右图各有四张图片，四张图片由左到右、由上到下依次为FITC荧光(488nm激发，490nm-510nm发散)、叶绿体荧光(488nm激发，680nm-700nm发散)、白场以及重叠图。
图4为本发明实施例3中PPV的蛋白质印迹分析，其中，PC为阳性对照(大肠杆菌表达的PPV与TrxA融合蛋白，83.6kDa)；1-5为转有PPV-TOC融合蛋白的转基因烟草；M为Marker所在泳道；NC为非转基因烟草；框内为PPV所在条带。
图5为本发明实施例3中ELISA测定小鼠血液中抗PPV抗体IgG的含量(左)及肠液中抗PPV抗体IgA的含量(右)。PBS：仅溶剂灌胃的对照；Control：非转基因烟草；PPV-TOC：转有PPV-TOC重组蛋白的烟草。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
术语解释：
“质膜”是每个细胞把自己的内容物包围起来的一层界膜又称细胞膜，可保持着细胞内外的物质浓度差异，控制营养成分的进入细胞和废物、分泌物排出细胞。同时可感受细胞外界信号，介导细胞外因子对细胞引发的各种反应。
“叶绿体外膜”是位于叶绿体最外围的一层单位膜，叶绿体包括3种不同的膜，外膜、内膜、类囊体膜，形成3个腔，分别为膜间隙、基质和类囊体腔。叶绿体外模渗透性大，含有孔蛋白结构。
“线粒体外膜”是位于线粒体最外围的一层单位膜，该结构在脂质的相互交换和线粒体与内质网间的钙离子信号传导等过程中都有重要作用。
“液泡膜”是细胞质与液泡相隔处的一层薄膜,组成和特性与细胞质膜相同。
“内质网”是细胞质的膜系统，外与细胞膜相连,内与核膜的外膜相通,将细胞内的各种结构有机地联结成一个整体,有效地增加细胞内的膜面积,具有承担细胞内物质运输的作用。
“高尔基体”是由单位膜构成的扁平囊叠加在一起所组成，是真核细胞中内膜系统的组成之一，主要功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、分拣、与运输，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。
“膜蛋白的跨膜区”是指膜蛋白序列中跨越植物膜的区域，膜蛋白的跨膜区倾向于发挥调控功能，可能作用于配体结合、互作蛋白的招募、第五的选择、通道的开关等。每种植物膜含有多种不同的膜蛋白，反映了植物膜具有不同的功能。
实施例1猪细小病毒表面抗原与叶绿体外膜蛋白融合载体的构建与农杆菌转化
1、载体构建
合成猪细小病毒表面抗原与叶绿体外膜蛋白TOC34跨膜区融合的基因序列PPV-TOC34(SEQ ID NO.8)，双酶切连接至pYBA1132植物表达载体中，得到重组质粒DNA(1132-PPV-TOC34)。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，卡那霉素筛选得到阳性克隆。菌液PCR验证PPV-TOC34的插入，并测序进一步验证序列正确性，1132-PPV-TOC34表达载体图谱如图1所示。
2、农杆菌转化
取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞(100μL)放冰上融化。将步骤1制备的重组质粒DNA稀释成0.1μg/μL，每100μL感受态细胞中加入2μL重组质粒DNA，移液枪抽吸混匀，冰上放置20分钟，拿出后放入液氮中5分钟，37℃水浴5分钟，冰浴5分钟。向感受态细胞中加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃摇床振荡培养3小时。5000rpm离心2分钟，弃掉上清液，留大约100μL上清液用移液枪抽吸混匀后涂布于加有卡那霉素的LB平板上，28℃放于培养箱中培养2-3天。培养完成后挑菌，取灭过菌的离心管加入含卡那霉素的LB培养基，用枪头挑取培养皿中的单菌落置于液体培养基中，摇床28℃、200rpm震荡培养16小时。培养完成后，取菌液进行PCR验证。
实施例2猪细小病毒表面抗原与叶绿体外膜蛋白融合表达
1、农杆菌准备
将构建完成的冻存农杆菌进行复苏，取加入终浓度为50mg/L卡那霉素的LB培养基5mL于10mL离心管中，按接种量1％即50μL的菌液接入LB培养基中，28℃、200rpm于摇床过夜震荡培养。然后进行扩大培养，取加入终浓度为50mg/L卡那霉素的LB培养基20mL于50mL离心管中，按接种量1％即200μL的菌液接入LB培养基中，28℃、200rpm于摇床震荡培养，一直培养农杆菌OD值至0.5-1.0左右。加入20μL 100mmol/L乙酰丁香酮，继续摇床震荡培养2小时。
2、叶盘法转化
选取第一片完全展开的健康烟草叶片(4-5周)，用手术刀切成0.5cm见方大小(切掉叶缘避开主脉，20片/皿)，叶片上表面朝下在MS固体培养基上25℃暗培养2-3d(以外植体膨大至两到三倍为准)；将预培养过的烟草叶片加入到步骤1中准备好的菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没，静止5-10min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；将侵染过的叶片上表面朝下置于MS固体培养基上28℃暗培养3d；将叶片上表面朝上转移至含有抗生素(200mg/L头孢霉素以及50mg/L卡那霉素)的MS固体培养基(含0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA)上，25℃，16h光照/8h黑暗培养两周，诱导愈伤组织。当叶缘长出芽并可以分离时(1cm以上)，将芽切下转移至含有抗生素(200mg/L头孢霉素以及50mg/L卡那霉素)的MS固体培养基(含0.5mg/L IAA)中，两周后长出根，打开育苗盒的盖子练苗一周后转为盆栽，结果如图2所示。
实施例3猪细小病毒表面抗原与叶绿体外膜蛋白融合表达的验证与活性测定
1、免疫组织化学
将烟草叶片切成细丝，放入加有酶解液(1.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES，10mM CaCl2)的培养皿中，70rpm条件下黑暗过夜。将原生质体过滤，60g离心，离心后弃上清保留沉淀。将沉淀用5mL的WA缓冲液(东盛生物)溶液重新悬浮。悬浮后采用60g，离心10min，弃去上清液，保留沉淀。沉淀中加入含有4％多聚甲醛的WA缓冲液1mL，室温60rpm孵育1h。固定化后孵育鼠源FITC标记的抗PPV单克隆抗体(VMRD，USA)。TBST溶液洗涤后，至黏附载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察。结果如图3所示。
结果显示，本实验通过使用亚细胞定位鉴定PPV-TOC34融合蛋白定位于叶绿体外膜。FITC绿色荧光展示的是PPV抗原所在的亚细胞定位(图中显示为白色)，红色是叶绿体所在的位置(图中显示未灰色)，经过合并之后可见绿色荧光物质位于红色荧光周围，这表明PPV抗原定位于叶绿体外膜。
2、蛋白质印迹分析
提取转基因烟草及对照烟草叶片(未转染融合蛋白质粒)的总蛋白，经SDS-PAGE分离后转印至NC膜。将膜用TBS从下向上浸湿后，再将其放到含有封闭液的平皿中，最后放置于摇床摇动封闭1h。鼠源抗PPV单克隆抗体(VMRD，USA)与二抗分别孵育后，向膜上均匀加入ECL底物混合液，于化学发光仪中拍照。
经检测，五株阳性烟草植株的叶片中检测到了PPV，大小为理论值，即PPV与TOC融合的大小73.3kDa。阳性对照采用的是大肠杆菌表达的PPV与TrxA(硫氧还蛋白A，大肠杆菌表达的标准品)融合的蛋白83.6kDa，而非转基因烟草中并未检测到PPV，结果如图4所示。通过不同浓度标准PPV-TrxA的条带亮度，对转基因烟草叶片中PPV-TOC的含量进行测定，得出不同株系中PPV-TOC的含量在1.4～9.3μg/g鲜重之间。
3、转基因烟草免疫原性的测定
烟草叶片冻干后研磨成粉，将200mg粉末(约含有2μg PPV-TOC抗原)重悬于200μLPBS缓冲液中。三十只7周龄雌性小鼠分成三组，分别灌胃转基因烟草、野生型烟草以及静脉注射PPV-TrxA纯品(含量在98％左右)。每周免疫一次，持续10周。分别在第2周、5周和10周通过尾端取血进行抗体反应测定。
抗原特异型抗体的分析采用ELISA法进行。用含5μg/mL PPV-TrxA标准品的0.05M碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)包被96孔板过夜。孵育样品血清(50μL)后，将辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(碧云天，中国)稀释2000倍后加入孔板中，使用TMB底物检测(碧云天，中国)。450nm下采用酶标仪读取数据。
最后一次免疫后，取出小鼠小肠，注入1mL含有50mM EDTA，5％胎牛血清(GIBCO，USA)以及10mM PMSF的PBS缓冲液洗肠。洗液经3000g离心10min后取上清液冻存。用含5μg/mL PPV-TrxA标准品的0.05M碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)包被96孔板过夜。肠液样品孵育后，一抗选用鼠源抗PPV单克隆抗体(VMRD，USA)，二抗选用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(碧云天，中国)，使用TMB底物检测(碧云天，中国)。450nm下采用酶标仪读取数据。
结果表明，小鼠口服野生型烟草后抗PPV抗体的含量与空白对照组之间的差异不显著，而喂食含PPV-TOC蛋白的转基因烟草后，小鼠血液中的IgG以及肠液中的IgA含量显著增加。结果如图5所示。这证明叶绿体外膜展示的PPV激起了小鼠肠道免疫，进而产生抗PPV的免疫反应。
对比例1
载体的构建方法和表达方法与实施1、2类似，不同之处在于，所用载体为1132-PPV，表达猪细小病毒抗毒定位于胞质。
对比例2
载体的构建方法和表达方法与实施1、2类似，不同之处在于，所用载体为1132-PPV-rbcs-cTP，(rbcs-cTP为核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的叶绿体转运肽，定位于叶绿体类囊体膜)，表达猪细小病毒抗毒，并定位于叶绿体类囊体膜。
将实施例3步骤3中的方法用于对比例1和对比例2制备的重组疫苗的免疫检测，意外发现对比例1、对比例2的小鼠肠道免疫效果要低于实施例3中1132-PPV-TOC34的免疫效果，总体上来说，对比例1的免疫效果最低，对比例2次之，实施例3的免疫效果最好。发明人推测，这可能是由于叶绿体可能是由一种异养原生生物吞噬蓝藻后进化形成，故其在基因转录、翻译等方面具有原核特性(Bock R.etc.Annu Rev Plant Biol,2015)，且叶绿体大小与细菌大小一致，将抗原展示在细胞器表面可以模拟细菌表面抗原，可能更好地激起免疫反应；发明人进一步推测，叶绿体可能在肠道内是以完整叶绿体的形式存在，本发明制备的重组抗原可表达于叶绿体外膜，更能激起肠道的免疫反应，使小鼠体内的产生更强的抗PPV的免疫反应。
发明人进一步将猪细小病毒表面抗原分别与CPK34蛋白N端多肽(SEQ ID NO.1)、OEP14跨膜区(SEQ ID NO.2)、Tom70p蛋白N末端(SEQ ID NO.4)、SYP22蛋白C端跨膜区(SEQID NO.5)、AtP24跨膜区(SEQ ID NO.6)、GALT跨膜区(SEQ ID NO.7)进行融合表达，取得了与实施例3类似的免疫效果。因此，本发明将重组疫苗蛋白与定位于植物膜系统的锚定多肽融合表达，得到了一种全新的制备重组疫苗的方法，并且该方法简单易操作，适用于大规模生产，并且生产出的重组疫苗蛋白免疫原性高，具有良好的遗传稳定性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 猎境（嘉兴）生物科技有限公司
<120> 一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法
<130> JX202110030
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Asn Cys Cys Ser His Gly Arg Asp Ser Asp Asp Asn Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Arg Pro Glu Asn Gly Gly Gly Gly Val Gly Ala Ala Glu Ala
20 25 30
Ser Val Arg Ala Ser Lys His Pro Pro Ala Ser Pro Pro Pro Ala Thr
35 40 45
Lys Gln Gly Pro Ile Gly Pro Val Leu Gly Arg Pro Met Glu Asp Val
50 55 60
Lys Ser Ser Tyr Thr Leu Gly Lys Glu Leu Gly Arg
65 70 75
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gly Lys Ala Lys Glu Ala Val Val Val Ala Gly Ala Leu Ala Phe
1 5 10 15
Val Trp Leu Ala Ile Glu Leu Ala Phe Lys Pro Phe Leu Ser Gln Thr
20 25 30
Arg Asp Ser Ile Asp Lys Ser
35
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Pro Asn Pro Asn Gln Arg Gly Lys Leu Trp Ile Pro Leu Ile Phe
1 5 10 15
Ala Leu Gln Tyr Leu Phe Leu Ala Lys Pro Ile Glu Ala Leu Ile Arg
20 25 30
Arg Asp Ile Ala Thr
35
<210> 4
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Leu Ala Leu Lys Asp Lys Gly Asn Gln Phe Phe Arg Asn Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Asp Asp Ala Ile Lys Tyr Tyr Asn Trp Ala Leu Glu Leu Lys Glu
20 25 30
Asp Pro Val Phe Tyr Ser Asn Leu Ser Ala Cys Tyr Val Ser Val Gly
35 40 45
Asp Leu Lys Lys Val Val Glu Met Ser Thr Lys Ala Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Asp Tyr Ser Lys Val Leu Leu Arg Arg Ala Ser Ala Asn Glu Gly
65 70 75 80
Leu Gly Lys Phe Ala Asp Ala Met Phe Asp Leu Ser Val Leu Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Asp Phe Asn Asp Ala Ser Ile Glu Pro Met Leu Glu Arg Asn
100 105 110
Leu Asn Lys Gln Ala Val Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Ile
115 120 125
Asp Thr Ala Thr Ala Thr Pro Thr Glu Leu Ser Thr Gln Pro Ala Lys
130 135 140
Glu Arg Lys Asp Lys Gln Glu Asn Leu Pro Ser Val Thr Ser Met Ala
145 150 155 160
Ser Phe Phe Gly Ile
165
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Leu Thr Cys Leu Leu Leu Val Ile Phe Gly Ile Val Leu Leu Ile Val
1 5 10 15
Ile Ile Val Leu Ala Ala
20
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Val Ala Trp Phe Ser Ile Met Ser Leu Gly Val Cys Val Val Val Val
1 5 10 15
Gly Ser Gln Ile Leu
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Val Ile Met Ala Ile Gly Phe Leu Tyr Leu Val Ile Val Ser Val Glu
1 5 10 15
Ile Pro Leu Val Phe
20
<210> 8
<211> 1869
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgtctgaga atgttgaaca acataaccca attaatgctg ctactgagct ttcagctact 60
ggtaatgagt ctggtggtgg tggaggtgga ggaggaggta gaggtgctgg aggagttggt 120
gtttcaacag gttcattcaa taatcaaact gaattccaat acctcggaga gggacttgtt 180
agaattactg ctcatgcttc aagacttatt catcttaata tgccagagca tgaaacatat 240
aagagaattc atgttctcaa ctcagaatct ggttctgctg gtcaaatggt tcaagatgat 300
gctcatacac aaatggttac tccttggtct ttgattgatg ctaatgcttg gggtgtttgg 360
tttaatcctg ctgattggca acttatttct aataatatga ccgagatcaa ccttgtttct 420
tttgaacaag ctattttcaa cgttgttttg aaaacaatca ccgagtctgc tacttcacct 480
ccaactaaga tatataataa cgatttgacc gcttcactta tggttgctct tgatactaat 540
aatactcttc catatacccc tgctgctcca agatcagaga ctttgggttt ttatccttgg 600
ttgccaacta aacctacaca atatagatat tacctctctt gtatcagaaa ccttaatcct 660
cctacatata caggacaatc tcaaccaaat aatagactta ataccaacag acttcactct 720
gatattatgt tttacacaat cgagaacgct gttcctattc atcttttgag aacaggtgac 780
gaattttcta ctggaatata tcatttcgac actaagccat tgaaacttac tcattcatgg 840
caaacaaata gatcacttgg acttccacca aaattgctta cagaacctac tacagaggga 900
gatcaacatc ctggaacatt gcctgctgct aatactagaa aaggatatca tcaaacaatc 960
aacaactctt ataccgaagc tacagctatt agaccagctc aagttggata taatacacct 1020
tatatgaact tcgagtactc taatggaggt ccatttctta ctccaattgt tccaacagct 1080
gatactcaat ataatgatga tgagccaaat ggtgctatta gattcactat ggattatcaa 1140
catggacatt tgacaacttc ttctcaagag ttggagagat atacattcaa tcctcaatca 1200
aagtgtggta gagctccaaa acaacaattc aatcaacaag ctcctttgaa tttggaaaat 1260
acaaataacg gaaccttgct tccttctgat ccaattggag gaaaatcaaa tatgcatttt 1320
atgaacaccc tcaatactta tggtcctctt actgctctta ataatactgc tcctgttttt 1380
ccaaatggac aaatttggga taaagagctt gatacagatt tgaagccaag attgcatgtt 1440
actgctccat ttgtttgtaa gaataatcct cctggtcaac tttttgttaa aattgctcca 1500
aatctcacag atgattttaa tgctgattca ccacaacaac ctagaattat tacatattca 1560
aacttctggt ggaagggaac tcttacattc actgctaaaa tgagatcttc aaatatgtgg 1620
aatcctattc aacaacatac aactacagct gaaaatattg gaaaatacat cccaactaac 1680
atcggtggaa ttaagatgtt tcctgagtat tctcaattga ttcctagaaa gctttactct 1740
agaactagtg gatccggtcc taatccaaat caaagaggta aattgtggat tccacttatt 1800
tttgctttgc aatatctctt tctcgctaaa cctattgagg ctcttattag aagagatatt 1860
gctacttaa 1869

Claims (7)

1.一种利用植物膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，包括表达编码重组疫苗的重组DNA，该重组疫苗包括重组疫苗蛋白和定位到植物膜上的锚定多肽形成的融合蛋白,
所述植物膜包括质膜、叶绿体外膜、线粒体外膜、液泡膜、内质网、高尔基体中的一种，所述锚定多肽来自膜蛋白的跨膜区，
所述锚定多肽包括：定位至质膜的CPK34蛋白N端多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1；定位至叶绿体外膜的OEP14跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，定位至叶绿体外膜的TOC34跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；定位至线粒体外膜的Tom70p蛋白N末端序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；定位至液泡膜的SYP22蛋白C端跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；定位至内质网膜的AtP24跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；定位至高尔基体膜的GALT跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述重组疫苗包括重组亚单位疫苗、类病毒颗粒疫苗中的一种。
3.如权利要求2所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述重组疫苗为猪细小病毒疫苗。
4.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述融合蛋白的编码基因由强启动子驱动，所述强启动子包括CaMV 35S启动子、增强型CaMV35S启动子、NOS启动子。
5.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述表达包括稳定表达、瞬时表达中的一种。
6.如权利要求1所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法，其特征在于，所述植物包括烟草、生菜、浮萍、苜蓿。
7.权利要求1-6任一项所述的一种利用植物细胞膜系统生产重组疫苗的方法生产的重组疫苗。
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