CN102580118A - 志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，具体包括克隆志贺样毒素Stx1B基因，构建含Stx1B基因的重组表达载体；然后制备转基因植株；最后制备志贺样毒素Stx1B口服疫苗，制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗，能够直接口服免疫，有效预防大肠杆菌O157：H7感染，降低猪水肿病的发病率，同时降低死亡效率。

Description

志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及其产品

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及制得的Stx1B口服疫苗。

背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli）O157 ：H7是肠出血性大肠埃希菌的一个血清型，大肠杆菌O157：H7感染后能产生毒素使vero细胞死亡，产生的毒素志贺样毒素 ( Stx)，主要作用于猪或者人的结肠和回肠细胞，感染猪后的主要症状是猪水肿病。Stx 包含有1 个A 亚单位和5 个B 亚单位，组成了A-5B 结构的复合毒素。其中A 亚单位是Stx 的毒力单位，它具有RNA-N 端糖苷酶的活性，能够干扰细胞内蛋白质的合成，导致细胞损伤死亡。而B 亚单位是无毒性的， 但能与具有特定受体(Gb3) 的细胞结合，产生特异性抗体，再与A 亚单位结合发挥作用。由于志贺样毒素B亚基（简称为Stx1B）不具有致病性，又能有效的诱导免疫应答，因此Stx1B可以作为理想的疫苗，用于预防大肠杆菌O157 ：H7感染。

大肠杆菌O157 ：H7主要入侵途径是消化道，因此注射免疫途径的疫苗往往不能有效诱导肠道内的特异免疫反应，但是使用没有经过特殊的处理口服疫苗抗原而直接进行口服免疫时，能够有效到达肠道并激起肠道内淋巴系统特异反应的抗原量太低，也不能有效诱导肠道内的免疫反应。因此，急需一种口服疫苗的制备方法，制得的疫苗能够到达肠道并能激起肠道特异免疫反应的，可以用于预防大肠杆菌O157 ：H7感染。

发明内容

  本发明目的之一在于提供志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其制备方法简单，成本低。

为实现上述目的，技术方案为：

志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，具体步骤如下：

（1）克隆志贺样毒素Stx1B基因

根据大肠杆菌O157 ：H7志贺样毒素Stx1B基因序列设计上游引物和下游引物，再提取大肠杆菌O157 ：H7基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板，用设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得志贺样毒素Stx1B基因；

（2）构建含Stx1B基因的重组表达载体

将步骤（1）所得的志贺样毒素Stx1B基因进行酶切，并将志贺样毒素Stx1B基因连入经同样酶切的双元表达载体，得含Stx1B基因的重组表达载体；

（3）制备志贺样毒素Stx1B口服疫苗

将步骤（2）所得重组表达载体转化农杆菌，得含重组表达载体的农杆菌，将制得的含重组表达载体的农杆菌用于转化植物细胞，经诱导，筛选，鉴定，得转基植株，收集转基因植株，干燥，粉碎，得志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

进一步，所述步骤（1）中，所述上游引物核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述步骤（2）是用限制性内切酶BamH I和SacⅠ酶切步骤（1）所得志贺样毒素Stx1B基因，同时用BamH I和SacⅠ酶切双元表达载体，将回收的Stx1B基因与酶切后的双元表达载体连接。 

进一步，所述双元载体为改良pCAMBA1301载体。

进一步，所述步骤（3）中，所述农杆菌为EHA105。

进一步，所述植物细胞为烟草细胞。

本发明目的之二在于提供制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗，

由所述制备方法制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

本发明的有益效果在于：本发明公开的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，方法简单，通过常规的植物转基因方法即能制得，可以通过转基因植物的繁殖获得大量的志贺样毒素Stx1B口服疫苗，烟草还具有生长快，产量高的特点，因此生产成本低，产量高；制得的志贺样毒素Stx1B位于植物细胞内，植物细胞的细胞壁具有与“胶囊”相似功能，对表达的志贺样毒素Stx1B蛋白在胃中具有保护作用，因此本发明公开的志贺样毒素Stx1B口服疫苗不需要经过特殊处理，可以直接添加到饲料中进行口服免疫；口服免疫后志贺样毒素Stx1B在细胞壁的保护下在胃中进行初步消化，然后进入小肠，与小肠中具有特定受体(Gb3) 的细胞结合，进而作为抗原诱导免疫应答，产生抗体，达到预防大肠杆菌O157：H7感染的效果；使用口服疫苗具有免疫成本低，免疫途径简单，免疫效果可靠的特点，便于疫苗的推广；经志贺样毒素Stx1B口服疫苗免疫后能够有效预防大肠杆菌O157：H7感染，降低猪水肿病的发病率，同时降低死亡效率。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明Stx1B基因的PCR电泳图；

图2为本发明转基因烟草Western blot鉴定图（1为非转基因烟草； 2、3为转基因烟草）。

 

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明使用的植物材料为烟草(Nicotiana tabacum L. var. W38) 由本室保存；大肠杆菌DH5α、质粒pET-30a(+)、根癌农杆EHA105均由本实验室保存；改良pCAMBA1301载体由pCAMBIA1301载体与pCHF1载体改造而来，即采用限制性内切酶EcoR I和Hind III将pCHF1载体中包括CaMV35S启动子及多克隆位点Sac I、Kpn I、Smal I、BamH I、Sal I和Pst I的片段切下，再连接至同样经EcoR I和Hind III双酶切的pCAMBIA1301载体上（申请号为201010177056.6中国专利，申请日为2010年5月19日公开了改良pCAMBA1301载体及其具体制备方法）；质粒pMD19-T， PremixEX TaqDNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶，Sac I、BamH I 限制性内切酶， DNA Maker、质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司；大肠杆菌O157:H7购买自北京流行病研究所；小鼠抗Stx1B 单克隆抗体购自Vir ostat 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司。

实施例1、志贺样毒素Stx1B基因的克隆

根据报道的大肠杆菌O157:H7 Stx1B基因序列（GenBank：NC_002655.2），设计Stx1B基因特异引物，上游引物为 Stx1B-F :5'- cgagctcgatgaaaaaaacat-3'（SEQ ID No.1），下划线为SacⅠ酶切位点，下游引物为Stx1B-R:5'- cgcggatccgcgtcaacgaaaaataac -3'（SEQ ID No.2），下划线为BamHⅠ酶切位点；同时提取大肠杆菌O157:H7基因组DNA，以提取的大肠杆菌O157:H7基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性10分钟循环1次；再95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸50秒，循环35 次，最后72℃后延伸 8分钟，得Stx1B基因。 PCR反应产物使用质量体积分数为1%的琼脂凝胶电泳，结果如图1所示。结果显示，在靠近200bp处有特异条带，即Stx1B基因，回收Stx1B基因片段，将回收的Stx1B基因片段连接pMD19-T载体，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，得pMD19- Stx1B载体。将pMD19- Stx1B载体转化大肠杆菌DH5α感受态菌，筛选阳性克隆进行测序，经侧序表明Stx1B基因长度为270bp，核酸序列如SEQ ID No.3所示。

实施例2、志贺样毒素Stx1B重组表达载体的构建

用限制性内切酶BamH I和SacⅠ酶切所得的pMD19- Stx1B载体，回收Stx1B基因(此处也可以直接用实施例1中PCR扩增所得Stx1B基因直接用BamH I和SacⅠ进行双酶切)；同时用BamH I和SacⅠ酶切改良pCAMBA1301载体，回收改良pCAMBA1301载体大片段，将回收的Stx1B基因与改良pCAMBA1301载体大片段连接，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，得改良pCAMBA1301-Stx1B载体。

将所得改良pCAMBA1301-Stx1B载体采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，获得含有改良pCAMBA1301-Stx1B载体根癌农杆菌（EHA105），命名为Stx1B-EHA105。

实施例3、转基因烟草的制备

用获得的Stx1B- EHA105农杆菌采用叶盘法转化烟草，在含有1.0mg/L 6-BA、50mg/L 卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的MS固体培养基上诱导再生烟草，并将生长2-3cm高的再生烟草转移至含有50mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的1/2 MS培养基上生根培养，培养期间取少许烟草叶片用CTAB法提取再生烟草基因组DNA，并用Stx1B基因特异引物Stx1B-F（SEQ ID No.1）和Stx1B-R（SEQ ID No.2）进行PCR检测，筛选转Stx1B基因烟草，并将生根后的转基因烟草转移至土中生长。取转基因烟草叶片约2g，在冰上加入预冷的1ml Tris-HCl 缓冲液(25mmol/L，pH8.0)冰浴研磨后，再加入3 ml提取液（7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、0.4％CHAPS、10 mmol /L DTT），研磨至匀浆后，转移至离心管中在4℃、12 000 转/分钟，离心30分钟，收集上清液，即制得可溶性蛋白。将提取的蛋白进行SDS-PAGE，然后转移至硝酸纤维素膜转移好的硝酸纤维素膜用含5%脱脂奶粉的PBS进行封闭，然后分别与鼠抗Stx1B 单克隆抗体和HRP标记的兔抗小鼠IgG 进行孵育。用PBST缓冲液洗涤后，经DAB 显色，观察条带，结果如图2所示。结果显示在转基因烟草中能够检测到志贺样毒素Stx1B蛋白，而非转基因烟草中不能检测到志贺样毒素Stx1B蛋白，表明了志贺样毒素Stx1B蛋白能够在转基因烟草中成功表达。

实施例4、志贺样毒素Stx1B疫苗的预防猪水肿病效果

取转基因烟草叶片，在25℃条件下，避光干燥处理，粉碎，得志贺样毒素Stx1B口服疫苗，备用。

    猪水肿病发生又名大肠杆菌毒血症，大肠杆菌O157:H7为猪水肿病的病原菌之一。分别在重庆市合川区、长寿区和江津区猪水肿病发生率较高的农户和养殖场进行了预防试验，实验以16 日龄断奶猪为对象，每个实验点分别设置实验组和对照组，实验组饲喂预防饲料，预防饲料为在普通饲料中加入相当于普通饲料重量0.1倍的志贺样毒素Stx1B疫苗；对照组 饲喂与对照组相同量的普通饲料（普通饲料组份重量百分比为，玉米67%、豆粕16.5%、血球蛋白3%、鱼粉3%、麦麸6%、油脂0.5%、磷酸氢钙1.5%、预混料1.5%、食盐0.3%、赖氨酸0.16%和华芬HF-Ⅱ复合酶0.1%，余量为水）。贺样毒素Stx1B疫苗的预防猪水肿病效果如表1所示：

表1. 志贺样毒素Stx1B疫苗的预防猪水肿病效果

 由表1可知，饲喂普通饲料的对照组，共有649头猪，其中有97头猪发病，发病猪里面有39头猪死亡，猪发病率达14.95%，发病猪死亡率为340.21%；而饲喂预防饲料的实验组，60 窝共645 头猪中只有8头发病，发病猪中有3头死亡，发病率仅为1.24%。表明了本发明公开的志贺样毒素Stx1B疫苗具有降低猪水肿病的发病率，并且降低死亡率，预防猪水肿病的效果好。因此本发明制得得志贺样毒素Stx1B疫苗能够有效到达肠道并能激起肠道特异免疫反应的，可以作为口服疫苗使用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  重庆大学

<120>  志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及其产品

 

<160>  3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增Stx1B基因的特异引物Stx1BF

<400>  1

cgagctcgat gaaaaaaaca t    21

 

<210>  2

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增基因Stx1B基因的特异引物Stx1BR

<400>  2

cgcggatccg cgtcaacgaa aaataac     27

 

<210>  3

<211>  270

<212>  DNA

<213>  大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7

<220> 

<223>  大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Stx1B基因

<400>  3

 

atgaaaaaaa cattattaat agctgcatcg ctttcatttt tttcagcaag tgcgctggcg  60

acgcctgatt gtgtaactgg aaaggtggag tatacaaaat ataatgatga cgataccttt 120

acagttaaag tgggtgataa agaattattt accaacagat ggaatcttca gtctcttctt 180

ctcagtgcgc aaattacggg gatgactgta accattaaaa ctaatgcctg tcataatgga 240

gggggattca gcgaagttat ttttcgttga                                  270

 

Claims (7)

1.志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）克隆志贺样毒素Stx1B基因

根据大肠杆菌O157 ：H7志贺样毒素Stx1B基因序列设计上游引物和下游引物，再提取大肠杆菌O157 ：H7基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板，用设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得志贺样毒素Stx1B基因；

（2）构建含Stx1B基因的重组表达载体

将步骤（1）所得的志贺样毒素Stx1B基因进行酶切，并将志贺样毒素Stx1B基因连入经同样酶切的双元表达载体，得含Stx1B基因的重组表达载体；

（3）制备志贺样毒素Stx1B口服疫苗

将步骤（2）所得重组表达载体转化农杆菌，得含重组表达载体的农杆菌，将制得的含重组表达载体的农杆菌用于转化植物细胞，经诱导，筛选，鉴定，得转基植株，收集转基因植株，干燥，粉碎，得志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

2.根据权利要求1所述的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述上游引物核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）是用限制性内切酶BamH I和SacⅠ酶切步骤（1）所得志贺样毒素Stx1B基因，同时用BamH I和SacⅠ酶切双元表达载体，将回收的Stx1B基因与酶切后的双元表达载体连接。

4.根据权利要求3所述的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述双元载体为改良pCAMBA1301载体。

5.根据权利要求1-4任一项所述的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述农杆菌为EHA105。

6.根据权利要求5所述的志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法，其特征在于：所述植物细胞为烟草细胞。

7.由权利要求1-6任一项所述制备方法制得的志贺样毒素Stx1B口服疫苗。

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