CN103173484A

CN103173484A - 薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体及其应用

Info

Publication number: CN103173484A
Application number: CN2012105512806A
Authority: CN
Inventors: 李维林; 王海棠; 梁呈元; 于盱
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了一种提高薄荷挥发油主要成分含量的载体pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS。该载体是含有薄荷柠檬烯合酶(limonene synthase)基因MhLS的植物过量表达载体。本发明首次从国产薄荷品种738中克隆得到MhLS基因全长编码序列，利用农杆菌介导法遗传转化薄荷，通过该基因在薄荷挥发油合成途径中的过量表达，促进薄荷醇和薄荷酮的合成，提高薄荷挥发油中主要成分的含量。由本发明的表达载体转化获得的薄荷新品质，其后代薄荷油中单萜成分的含量提高，对薄荷品种的遗传改良中具有很大的应用潜力。

Description

薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及薄荷柠檬烯合酶基因MhLS及其植物过量表达载体的具体构建方法和应用。

背景技术

薄荷属植物不仅是全世界重要的药用植物之一，也是仅次于橘类的第二大香料植物。薄荷油是薄荷的主要化学成分，在食品、制药、香料、化妆品工业上具有大量用途。

单萜是薄荷挥发油主要成分。单萜是由两个异戊二烯结构单元组成的C10类萜类化合物及其衍生物。单萜类化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆虫和植食性动物方面有着重要的作用，在吸引昆虫传粉和植物种群竞争中也很重要(Pichersky and Gershenzon，2002)。薄荷挥发油合成途径被视为是植物单萜合成途径的典型模式(Jonathan et al.，2000)。挥发油最主要的成分薄荷脑的形成需要经过很多步反应，包括一系列不同类型的生化反应(Kjonaas and Croteau，1983；Kjonaas et al.，1985；Croteau andVenkatachalam，1986)。同时，催化每个反应的酶也都已经被阐明(Kjonaas et al.，1982，1985；Croteau andVenkatachalam，1986；Karp et al.，1990；Croteau et al.，1991；Alonso et al.，1992；Rajaonarivony et al.，1992；Colby et al.，1993)。

柠檬烯是最简单的环形单萜，广泛存在于植物挥发油中，如薄荷属、柑橘属、松科、伞形科植物等(Guenther，1972)。在薄荷中，柠檬烯是薄荷挥发油合成前提，不论在是薄荷酮化学型薄荷或在香芹酮化学型薄荷。柠檬烯合酶催化GPP环化为柠檬烯(Kjonas and Croteau，1983)，该反应决定薄荷油合成途径的整体反应速率(Gershenzon and Croteau，1991)。柠檬烯合酶是最典型的被子植物单萜环化酶。该酶大小为65 kDa，pI值大约为5.0，最佳反应pH为7.0左右。柠檬烯合酶需要与二价金属离子(如Mg2+或Mn2+)才能与底物结合并催化反应。此酶可以识别香叶基作为它的底物，还对半胱氨酸残基、甲硫氨酸残基、组氨基酸残基等较为敏感(David et al.，2007)。

农杆菌介导法是应用最广泛的植物遗传转化方法。将薄荷柠檬烯合酶基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导法进行植物遗传转化，可以获得单萜含量提高的新种质。对于薄荷新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供薄荷单萜合成途径中的关键调控酶-柠檬烯合酶的基因序列，使得可以对薄荷单萜合成途径进行调控和改造，提高目的产物的产量。

本发明同时提供了该基因的植物过量表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可以用于农杆菌介导的遗传转化，创造新的薄荷品质资源，可用于薄荷品种改良。

附图说明

图1薄荷MhLS基因的PCR扩增结果

图2薄荷MhLS基因植物表达载体构建双酶切过程

图3重组菌液PCR检测结果

图4重组质粒酶切验证

具体实施方式

实施例1薄荷柠檬烯合酶基因的克隆

从GenBank中查找柠檬烯合酶基因的cDNA序列，并设计引物序列如下：

上游引物5’-GAAAGAGAGCGGAAGGAAAGATT

下游引物5’-AGAATTACGTACGAACTATGCCTT

以薄荷第一链cDNA为模版扩增，得到MhLS基因的全长cDNA序列。

取100mg植物组织于液氮中仔细研磨，直至呈粉末状；快速转移样品至1.5ml RNase free离心管中，加入1ml的裂解液PL颠倒混匀，在65℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的RNase free过滤柱中；收集下滤液(含有总RNA)于收集管中；在收集管中加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)；10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；加入500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液；加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50μlRNase free water，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。在RNase-free的PCR管中加入以下试剂：RNA 2μg；Oligo dT-Adaptor Primer(100μM/μl)1μl；dNTP(10mM)1μl；以H2ODEPC补足至14μl。在PCR上进行：65℃，5min，后置于冰上急冷；在上述混合液中，加入以下反转录反应液：RNase Inhibitor(40U/μl)1μl；5×First-Strand Buffer 5μl；M-MLV逆转录酶(200U/μl)1μl；H₂ODEPC 4μl总共为25μl。在PCR仪上按以下条件进行cDNA第一条链的合成反应：30℃10min；42℃90min；72℃5min。将反转录产物稀释用于PCR反应模板。

将cDNA100ng、10×Buffer2.5μl、dNTP(10mM)0.5μl、MgC12(25mM)1.5μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl、ExTaq(5U/μl)0.1μl及ddWater共20μl混合物在PCR仪上进行以下反应94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min共35个循环；72℃10min；4℃1min终止反应。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶(含1％EB)，在1×TAE电泳缓冲液中，110V恒压电泳30分钟，检测目的片段。将检测到的目的条带用手术刀片切割下来，并使用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒进行回收。将回收产物进行pMD19-T Vector(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.，China)连接，反应体系参照pMD19-T Vector说明书。16℃进行连接数个小时。将5μl连接产物加到装有50μl感受态细胞(DH5α)的1.5ml离心管中，轻轻敲打混匀，冰浴30min，42℃热激90sec，迅速置于冰上并冰浴10min。加入950μl灭菌的液体LB培养基，37℃恒温培养1.5h。吸取200μl菌液混合X-gal(20mg/ml)和IPTG(200mg/ml)涂布含100mg/ml氨苄的LB固体培养基，37℃恒温倒置培养12-16h。每个平板挑取10个白色克隆，移入装有1ml灭菌灭菌的液体LB培养基(含有100mg/ml氨苄)的1.5ml离心管中，37℃，240rpm培养6个小时。吸取2μl菌液作为PCR检测模板。对菌液进行特异扩增引物和载体通用引物(M13)双重PCR检测，将两次检测结果均为阳性的菌液送测序，获得MhLS基因cDNA序列。

实施例2植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS的构建

以带有酶切位点的特异引物对，序列如下：

上游引物5’-GCTCTAGAATGGCTCTCAAAGTGTTTAGTG

下游引物5’-CGCGGATCCTGCAAAGGGCTCGAATAAGGTTC

以含有MhLS cDNA的重组质粒PMD-MhLS作为模板进行PCR扩增(条件同实施例1)，分别获得5’端带有Xba I酶切位点、3’端带有BamH I酶切位点的MhLS全长基因片段。将所获得目的片段转化DH5α，提取阳性克隆菌液的质粒DNA。同时用Xba I和BamH I两种限制性内切酶对重组质粒DNA和植物表达载体p2301进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收重组质粒酶切产物-带有酶切位点的基因片段和线形p2301。利用T4连接酶对带有酶切位点的基因片段和线形p2301进行连接，将连接产物转化DH5α，获得已构建好的MhLS植物表达载体的重组菌液。将已经获得的携有表达载体的重组菌液在含有卡那霉素抗性的培养基平板上涂布筛选菌落。随机挑取8个单克隆，然后用PCR扩增和限制性内切酶BamH I和Xba I酶切质粒DNA，来检测是否已经成功构建。PCR检测结果和酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测结果一致表明已经成功构建MhLS植物表达载体。

实施例3MhLS植物表达载体的薄荷农杆菌转化

1.无菌苗的制备

采集田间生长中薄荷的顶芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水冲洗30min。接种前用75％(V/V)酒精消毒30s，再用0.2％(m/V)HgCl2溶液浸泡15min，无菌水冲洗3次。吸干表面水份后，剥去外层叶片，切成0.5cm长的茎尖，接种在无菌苗培养培养基中。在室温25℃±2℃，光照时间8～10h，光照强度1500～2000lx条件下，进行培养。如果还需要继续培养，可在培养3周后选健康无菌的植株接种于同样培养基中进行继代培养。

2.农杆菌的培养

首先将-70℃冻存的农杆菌进行活化：分别挑取携带目的基因片段的农杆菌菌落接种于含抗生素(卡那霉素抗性)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，当OD600值在0.3-0.7时备用。将过夜培养的农杆菌在含抗生素(卡那霉素抗性)的LB固体培养基上划单菌落，28℃培养静置。挑取单菌落在同样条件下的LB液体培养基中培养过夜，待菌液进入对数生长期时(OD600值在0.4左右为宜)用于浸染外植体。

3.供体预培养

将之前培养好的无菌苗，取2～4节茎段按茎节切段，将长度在0.5cm-1.0cm的节间茎段平铺在供体预培养培养基(基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)中暗培养3天，以备农杆菌侵染实验。

4.农杆菌侵染和共培养

利用之前培养好的农杆菌菌液侵染准备的植物供体，侵染时间一般为15min，侵染结束后用灭菌滤纸将多余的农杆菌菌液吸干，茎段摆放在共培养基(基本培养基)上暗培养3天，使T-DNA区更有效地整合到薄荷基因组中。

5.再生植株的获得

共培养结束后，将茎段转到诱导不定芽再生培养基(基本培养基+3.0mg/L TDZ+0.2mg/L IAA+25％椰乳+卡那霉素50mg/L+500mg/L头孢霉素)上，在室温25℃±2℃，暗培养40天左右至分化产生不定芽。由于载体中携带nPtII为选择标记基因，所以诱导不定芽再生培养基中加入了预实验筛选出的50mg/L卡那霉素，作为抗生素选择压，对再生芽进行抗性筛选。

6.不定芽筛选培养

将培养40天茎段上分化出的不定芽切下，继续在不定芽筛选培养基(基本培养基+1.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+卡那霉素75mg/L+500mg/L头孢霉素)上培养，再次筛选抗性植株。有一部分幼苗由于没有卡那霉素抗性，会变黄，甚至会死亡。而阳性转基因植物由于nPtII的表达，具备一定得卡那霉素抗性。

Claims

1.薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS，该载体包含薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的完整编码序列及卡那霉素筛选标记基因nPtII和植物组成型启动子CaMV35S。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于MhLS基因序列来源于薄荷(M.haplocalyx Briq.)，GenBank登录号为JX555976。

3.薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的遗传转化体系，其特征在于：

1)将之前培养好的无菌苗，取2～4节茎段按茎节切段，将长度在0.5cm-1.0cm的节间茎段平铺在供体预培养培养基中暗培养3天；

2)侵染时间为15min；

3)诱导不定芽再生的条件为基本培养基(MS培养基)+3.0mg/L TDZ+0.2mg/L IAA+25％椰乳+卡那霉素50mg/L+500mg/L头孢霉素，在室温25℃±2℃，暗培养40天左右至分化产生不定芽；

4)不定芽筛选培养基组成为：基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+卡那霉素75mg/L+500mg/L头孢霉素。

4.权利要求1所述，薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体在提高植物单萜含量的转基因植物中的应用。