CN103695444B

CN103695444B - 花生紫黄质脱环氧化酶基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN103695444B
Application number: CN201410015635.9A
Authority: CN
Inventors: 杨莎; 万书波; 李新国; 郭峰; 孟静静; 张佳蕾; 黄超; 杨连群
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-01-14
Also published as: CN103695444A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及花生紫黄质脱环氧化酶基因，核苷酸序列见序列表中序列1。花生紫黄质脱环氧化酶基因的氨基酸序列，氨基酸序列见序列表中序列2。花生紫黄质脱环氧化酶在保护光合机构中的应用。将花生紫黄质脱环氧化酶基因转染到烟草得到转基因植株，在过剩光能胁迫下，转基因植株有着比野生型植株更高的NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态，表明在过剩光能条件下，<i>AhVDE</i>的过量表达使叶黄素循环组分相对含量发生改变从而导致了脱环氧化状态的改变，提高了叶黄素循环的热耗散能力。转基因植株耗散过剩光能的能力增强使PSII激发能压力减少，从而减轻了PSII和PSI在过剩光能胁迫下光抑制程度，最终保护了光合机构。

Description

花生紫黄质脱环氧化酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及花生紫黄质脱环氧化酶基因（AhVDE）和氨基酸序列及其在光系统保护方面的应用。

背景技术

花生是重要的油料作物和经济作物，在我国农业生产乃至整个国民经济中具有重要地位。高温和强光往往会引起光抑制，影响了花生光合产物的积累，进而影响荚果的发育，产量降低。随着环境的不断恶化，如何提高作物防御光破坏能力已成为主要目标之一。当前发展迅速的基因工程技术为植物遗传改良提供了新的途径，利用在热耗散过程中起重要作用的基因进行遗传转化是获得新种质的重要手段。因此，发掘缓解光抑制方面的重要基因资源对提高花生产量和品质具有重要的意义，将为花生的遗传改良奠定坚实基础。

光能被捕获以后，主要有三条相互竞争的出路：光化学电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散。叶绿素荧光猝灭与光合作用的量子效率呈负相关，表明了一种调节机理，即降低光饱和条件下的PSII的光化学效率，可以避免光抑制、光破坏的发生。但由于叶绿素荧光只消耗捕获光能的很少一部分，因此光化学反应受阻时，热耗散就成了消耗过剩光能的重要途径，其中，依赖叶黄素循环的热耗散在逆境胁迫中对植物起着非常重要的保护作用。叶黄素循环在自然界中广泛存在，主要定位于所有高等植物、蕨类植物、苔藓以及部分藻类植物的类囊体膜上。其过程是指叶黄素三个组分（紫黄质、花药黄质和玉米黄质）依光照条件的改变而相互转化的过程。当光合机构吸收的光能不能全部用于碳同化时，含双环氧的紫黄质（Viofaxanthin；V）在紫黄质脱环氧化酶（violaxanthinde-epoxidase，VDE）的催化下，通过单环氧的花药黄质（Antheraxanthin；A）转化为无环氧的玉米黄质（zeaxanthin；Z）；而在弱光条件下，Z会在玉米黄质环氧化酶（zeaxanthinepoxidase，ZE）的催化下，通过A转化为Z。其中A和Z的形成能够诱导捕光复合物形成耗散状态，有利于耗散过剩的激发能，使光合机构免受过量光能破坏，提高植物的抗逆性。成熟的VDE属于类囊体腔蛋白，这类蛋白前体在核糖体被合成后，需要通过转运肽的运输作用，连续通过叶绿体外膜、内膜进入基质，再通过类囊体膜，最后到达类囊体腔内，与类囊体膜结合后催化由紫黄质（V）向玉米黄质（Z）的脱环氧化反应。目前在花生中还未见VDE基因克隆及其功能研究的报道。

发明内容

为了进一步研究各种植物的紫黄质脱环氧化酶对叶黄素循环过程的影响，本发明提供了一种花生紫黄质脱环氧化酶（AhVDE）基因。

本发明还提供了由花生紫黄质脱环氧化酶基因编码蛋白的氨基酸序列。

本发明通过将AhVDE基因转入烟草中，可以显著提高转基因植株的脱环氧化水平，保护光系统。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种花生紫黄质脱环氧化酶基因，碱基序列见序列表中序列1。

克隆所述花生AhRab7基因的引物名称与序列如下：

VDE-F：5'-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3'(XbaI)；

VDE-R：5'-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3'(BamHI)。

所述的花生紫黄质脱环氧化酶基因编码蛋白的氨基酸序列见序列表中序列2。

所述的表达蛋白在保护光合机构中的应用。

将花生AhVDE基因在烟草中超量表达，转基因幼苗的叶黄素循环脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）在高温强光胁迫条件下可达到80%；低温弱光条件下达到70%。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从花生中克隆了AhVDE基因并分析得到其氨基酸序列。

2、转基因植株有着比野生型植株更高的NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态；本发明将AhVDE基因在烟草过量表达后在高温强光胁迫下可显著提高叶黄素循环中的脱环氧化状态；Ah-4和Ah-9转基因株系中（A+Z）/（V+A+Z）分别增加到76%和80%；

3、在低温弱光条件下其（A+Z）/（V+A+Z）可增加至70%，与在烟草中超表达的番茄紫黄质脱环氧化酶基因（LeVDE）相比，其作用效果更加明显，提高了转基因植株依赖叶黄素循环的热耗散能力。

4、转基因植株耗散过剩激发能的能力增强，从而减轻了PSII和PSI在过剩光能胁迫下光抑制程度，最终保护了光合机构。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1为PCR产物经琼脂糖凝胶电泳图谱；A，AhVDE的中间保守区片段的PCR扩增；B，AhVDE3’端片段的PCR扩增；C，AhVDE5’端片段的PCR扩增；D，AhVDE基因全长的PCR扩增。

图2为花生紫黄质脱环氧化酶基因所编码蛋白的疏水性进行分析；

图3为酶蛋白为膜蛋白，有两个跨膜信号区；

图4AhVDE在不同器官中的表达；F：花;R:根；S：茎；L：叶片；Fr:果实

图5野生型花生植株在高温强光处理过程中AhVDE表达分析；

图6高温强光胁迫条件下野生型烟草和转基因株系叶片的NPQ值变化（A）及叶黄素循环的脱环氧化状态(B)。

图7低温弱光胁迫条件下野生型烟草和转基因株系叶片的叶黄素循环的脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.扩增花生紫黄质脱环氧化酶（AhVDE）

利用RNA试剂盒（购于天根生化科技有限公司）提取花生叶片RNA并反转录。根据已知同源基因的高度保守区，设计简并引物（5'-CCTGAYGARACKGAATGTC-3',5'-TACCAGTCATCYTGRTAGTG-3'），进行聚合酶链式反应（PCR），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段与估计的片段大小符合（489bp）（见图1A）。

将所得的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌。通过菌落PCR快速筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，利用载体内部的酶切位点切割质粒，得到与PCR产物大小相同的条带。将鉴定好的菌液寄往上海生物工程公司测序，用Blast，DNAman或DNAclub软件将所得片段序列与来源于其他植物的同源序列进行序列比较，确定该片段为所要克隆的目的基因的中间片段。

根据所得的AhVDE基因中间片段，设计特异引物VDE2（5'-ATTTCACACAGAAGACAAC-3'），和大连宝生物公司提供的接头引物B26进行PCR扩增，得到一条大小895bp的条带，与目的基因的3’端片段大小相符（见图1B）。连入pMD18-T克隆载体，经酶切鉴定，测序。

根据所得的AhVDE基因中间片段，设计特异引物VDE1（5'-CAAGTTTGTTGTCTTCTGTGTG-3），利用大连宝生物公司提供的5’RACE试剂盒进行克隆，得到一条为692bp的条带（见图1C）。同样的方法与pMD18-T克隆载体连接，提取质粒，酶切鉴定，测序。

根据所获得的中间片段、5’片段和3’片段拼接出AhVDE全长cDNA，据此设计特异引物VDE-F和VDE-R：

VDE-F：5'-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3'(XbaI)；

VDE-R：5'-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3'(BamHI)；

经PCR扩增出约1410bp带（图1D），连入pMD18-TSimple克隆载体，经酶切鉴定，测序。

2.AhVDE基因的序列分析

①AhVDE基因序列特征

*长度:1410碱基对

*类型:核酸

*链型:双链

*拓扑结构:线性

分子类型:cDNA

假设:否

反义:否

最初来源:花生

②AhVDE基因表达蛋白的序列特征

*长度：470氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

分子类型：蛋白质

序列描述

将该基因编码的氨基酸序列与GenBank中所有的氨基酸序列进行比对，结果显示花生的紫黄质脱环氧化酶与拟南芥、烟草、大豆、番茄、小麦等植物的紫黄质脱环氧化酶具有同源性。这表明我们已经成功地克隆到了花生紫黄质脱环氧化酶基因的序列。利用DNAman软件对这些植物的AhVDE基因进行聚类分析，同源性分别为77%,79%,72%,67%,71%。

3.基因编码蛋白的生化特性分析

3.1基因编码蛋白的疏水性分析

对花生紫黄质脱环氧化酶基因所编码蛋白的疏水性进行分析，结果表明其极性氨基酸和疏水性氨基酸所占的比例相差不大（图2）。其中亲水性氨基酸所占比例稍高，表明该蛋白为水溶性蛋白。

3.2AhVDE基因表达产物跨膜特性分析

通过向互联网上的在线PRED-TMR数据库提交AhVDE的氨基酸序列，预测到该酶蛋白为膜蛋白，有两个显著跨膜信号区（图3中箭头所示区域）。

4.AhVDE基因在花生植株中的表达分析

4.1AhVDE在花生不同器官中的表达

为了解AhVDE基因在不同器官中的内源表达情况，我们以花生AhVDE基因3’端的一段cDNA为引物进行了荧光定量PCR分析。结果表明，AhVDE基因在所有器官中均有表达，属于组成型表达，在叶片中的表达明显高于其他器官，在根中的表达量最低，说明AhVDE基因在叶绿体含量高的组织表达量较高（图4）。

4.2高温强光处理下AhVDE基因在花生叶片中的表达

以25℃正常光照条件下生长的花生植株为对照，将野生型花生植株在高温（40℃）和强光（1200μmolm^-2s^-1）下处理8小时。荧光定量PCR结果显示，高温强光处理过程中AhVDE表达量在2小时上升，随后逐渐降低，（图5）。表明AhVDE的表达受温度和光强的影响。

5.AhVDE基因植物表达载体的构建

5.1扩增AhVDE基因

花生品种“花育22”由山东省农业科学院提供，通过RT-PCR扩增了AhVDE基因的编码区。

VDE-F(5'-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3')(XbaI)；

VDE-R(5'-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3')(BamHI)；

上述引物序列分别与AhVDE基因第1-18碱基、第1460-1479碱基对应。

5.2AhVDE基因与克隆载体pMD18-TSimple及植物表达载体pBI121的连接

回收PCR产物，并在T4DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-TSimple(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌Trans5α获得了抗卡纳的菌落。提取重组质粒，用XbaI和BamHI进行双酶切，回收含AhVDE基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhVDE。

5.3根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化

感受态细胞的制备步骤如下：

（1）挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5mLLB液体培养基（含50mg/LSTR）中，28℃、200rpm培养过夜；

（2）取2mL培养物于LB液体培养基（含50mg/LSTR）中继续培养，直至OD800为0.5左右。

（3）培养物置冰浴中30min，4℃，5000rpm，离心5min，弃去上清液；

（4）用10mL冷的0.1mol/LNaCl悬浮菌液；

（5）4℃，5000rpm，离心5min，弃去上清液；

（6）用1mL冷的CaCl₂（20mmol/L）悬浮，分装成50μL/管，液氮中冷冻后至-80℃保存。

冻融法农杆菌转化步骤：

（1）冰浴中融化感受态细胞；

（2）在1.5mLEppendorf离心管中加入2μL表达载体pBI121-AhVDE质粒DNA，再加入50μL融化了的感受态细胞，混匀后冰浴30min，液氮中冷冻1min，接着在37℃水浴中放置5min；

（3）加入950mL无抗生素的LB液体培养基，28℃、200rpm振荡3h；

（4）8000rpm离心1min，倒掉上清液，用100μLLB回溶菌体；

（5）取50μL菌液涂到LB固体培养基上（含有50mg/LKan，100mg/LRif），28℃倒置培养2-3d。

6.利用农杆菌介导转化烟草

6.1农杆菌培养：

挑取上述步骤5得到的农杆菌单菌落于5mLLB液体培养基（含有100mg/LRif和50mg/LKan）中培养36h（28℃、200rpm），然后取1%接种至上述同样培养基，28℃、200rpm培养12h，取2mL菌液离心（4℃、4000rpm、10min），然后用20mLMS液体培养基悬浮菌体，用于转化试验。

6.2烟草转化、再生体系的建立：

（1）烟草Nc89种子，催芽后，播种于塑料盘中，常规管理，至2-3片真叶期，备用；

（2）取烟草叶片，用70%乙醇消毒30s，再0.1%HgCl₂消毒8-10min，用无菌水冲洗数次后，剪成小块（0.5*0.5cm²）；

（3）将剪好的烟草叶片置于MS分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000LX，预培养2天；

（4）将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS培养基；28℃暗培养2天；

（5）共培养后的外植体用含250mg/L头孢的灭菌水洗涤3次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，头孢250mg/L的分化培养基上，恒温培养（条件同预培养）；每15天更换一次培养基；

（6）待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基（附加卡那霉素50mg/L，头孢250mg/L）中，促其生根。待根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿2天后，温室常规管理。

6.3.转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhVDE基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，53℃、50s，72℃、1min30s，30个循环；72℃、10min。转基因植株PCR阳性率达到72.7%。荧光定量PCR的方法选出表达量较高的两个株系Ah-4和Ah-9。

7.AhVDE的过量表达明显减轻了高温强光胁迫下PSII和PSI光抑制的敏感性

7.1转基因烟草植株中叶黄素循环组分的变化

为了验证AhVDE基因的过量表达是否影响叶黄素循环的组分V、A、Z，我们分别测定了野生型，转基因株系Ah-4和Ah-9在高温（40℃）强光（1200μmol·m^-2·s^-1）胁迫下叶片中叶黄素循环各组分的相对含量（表1）。与野生型植株相比，转基因株系中A和Z的含量升高，但V含量降低，并且经高温强光处理后，转基因株系中V的含量仍低于野生型，A和Z含量高于野生型。这与AhVDE的过量表达增强了由V向Z的环氧化过程有关。这些结果表明，AhVDE基因的过量表达明显改变了叶黄素循环各组分的含量。

表1

7.2AhVDE的过量表达对叶黄素循环脱环氧化状态的影响

由前面的实验我们知道AhVDE的过量表达已经影响了叶黄素循环的各组分含量，我们进一步分析了野生型烟草和转基因株系叶片的NPQ值及脱环氧化状态的变化（图6）。结果表明，在高温强光胁迫过程中野生型烟草和转基因株系的（A+Z）/（V+A+Z）都升高，整体变化趋势与NPQ的趋势相一致，但转基因株系较野生型（A+Z）/（V+A+Z）增加更为明显，野生型的叶黄素循环脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）增加至53%，而Ah-4和Ah-9的（A+Z）/（V+A+Z）分别增加到76%和80%。在过剩光能胁迫下，转基因植株有着比野生型植株更高的NPQ和叶黄素循环的脱环氧化状态，表明在过剩光能条件下，AhVDE的过量表达使叶黄素循环组分相对含量发生改变从而导致了脱环氧化状态的改变，提高了叶黄素循环的热耗散能力，最终保护了光合机构。

8.AhVDE的过量表达对低温弱光胁迫下叶黄素循环脱环氧化状态的影响

分别对野生型和转基因株系进行低温弱光（4℃,100μmol·m^-2·s^-1）处理12h后，测定其叶黄素循环脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）变化情况。与野生型相比，超表达烟草株系的脱环氧化状态增加幅度较大，可增加至70%（图7），在相同胁迫处理条件下，与在烟草中超表达番茄紫黄质脱环氧化酶基因（LeVDE）相比，其作用效果更加明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>山东省农业科学院生物技术研究中心

<120>花生紫黄质脱环氧化酶基因及其编码蛋白和应用

<160>4

<210>1

<211>1410

<212>DNA

<213>落花生（Arachishypogaea）

<220>

<223>

<400>1

atggcaatcttgactgcaaattcaatgttattatcttgtcacgaatccacagtcataact60

aatgtaccattgataatgaagttaggtcaaataaggtttcacaaaacagtaggttttcac120

tccagtagtcttgttttcagactattctctactaccacaaatcgaactacacgcttcaac180

tccttagtatcttttagaaatcaatctctcactatcaaagccaaactccatcatcattcc240

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<210>2

<211>469

<212>PRT

<213>落花生（Arachishypogaea）

<220>

<223>

<400>2

MetAlaIleLeuThrAlaAsnSerMetLeuLeuSerCysHisGluSerThrValIleThrAsnValProLeuIle

5　　　　　　　10　　　　　　152025

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GluAlaThrGluValGluLysLeuPheGlyGlyAlaLeuProLeuArgLysLeuArg

455460465469

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT27

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG26

Claims

1.花生紫黄质脱环氧化酶基因，其碱基序列如序列表中序列1所示。

2.扩增花生紫黄质脱环氧化酶基因的引物，其特征在于引物名称与序列如下：

VDE-F：5'-TCTAGAATGGCAATCTTGACTGCAAAT-3'；

VDE-R：5'-GGATCCCTACCTTAGTTTTCGCAAAG-3'。

3.一种权利要求1所述的花生紫黄质脱环氧化酶基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

4.一种权利要求3所述的花生紫黄质脱环氧化酶编码蛋白在保护光合机构中的应用;将花生紫黄质脱环氧化酶基因转染到烟草中得到转基因烟草。