CN104711275B

CN104711275B - 花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN104711275B
Application number: CN201510141395.1A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 郑春花; 王亚; 赵春梅; 王晶珊; 乔利仙
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2035-03-30
Also published as: CN104711275A

Abstract

本发明提供了花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用，将该AhPK基因在花生中超量表达后，得到生育酚含量和活性最高的α生育酚含量显著提高的转基因植株。实验证明，将本发明的AhPK基因超量表达可显著提高花生叶片的维生素E含量，且可明显增强转基因花生种子的耐盐性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物维生素E合成机制的研究，以及提高植物的维生素E含量、活性和植株的抗逆性具有重要的理论及实际意义，应用前景广阔。

Description

花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用。

背景技术

维生素E是一种脂溶性的小分子抗氧化剂，分为生育酚和生育三烯酚两类，各包括α-、β-、γ-和δ-四种类型，其中以α-生育酚的活性最高，可以被人和动物高效吸收和利用。维生素E具有酚氧基结构，在植物光合组织中可使逆境胁迫产生的活性氧自由基失活，并通过与膜脂水解产物形成复合物，清除类囊体膜上的脂质过氧化产物，阻止膜脂过氧化的扩大，保护膜的完整性，从而增强植株的抗逆境胁迫能力。在非光合组织中，维生素E能淬灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂质免受单线态氧损伤；还可以被超氧阴离子自由基氧化，使不饱和油脂免受自由基攻击，从而抑制油脂的自动氧化，延长油脂的贮存期。另外维生素E还具有调节脂肪酸合成、糖类运输、茉莉酸和乙烯信号转导，促进种子萌发等功能

维生素E主要在高等植物的叶绿体内膜上合成，储存于植物的叶片和种子中，尤其是油料植物的种子。维生素E合成的第一步是前体—尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(PDP)的合成。其中PDP形成维生素E的疏水尾部，它可由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGDP)还原而成；也可由GGDP在聚合酶的作用下与叶绿素A聚合成牻牛儿基牻牛儿基叶绿素A，后者由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶(GGR)催化生成叶绿素A，叶绿素A在叶绿素酶的作用下脱去植醇，生成脱植基叶绿酸A，而植醇在植醇激酶的作用下形成植基一磷酸，之后生成PDP。

植醇激酶是影响维生素E含量的关键酶之一，它可催化植醇向植基一磷酸的生成，进而合成生育酚的前体PDP。Valentin等在拟南芥中发现一个突变体，维生素E含量只有野生型的20%，并通过图位克隆法得到了相关基因VTE5（PK），该基因编码植醇激酶。在集胞藻中敲除VTE5的同源基因slr1652后，相应突变体中维生素E含量减少了50%。而且进一步研究发现，在集胞藻和拟南芥叶、种子中积聚的大多数和生育酚合成中有关的PDP来自于植醇。目前通过遗传转化可使油料作物的生育三烯酚含量提高10-15倍，而生育酚含量最多只能提高2-2.5倍。很多学者认为，这种差异主要是由于PDP库的供给不足。而植醇激酶和绿色植物中PDP的合成有着密切的关系，因此它可能是维生素E生物合成途径中的一个限速酶，它的活性会直接影响维生素E的总体含量和活性。

发明内容

本发明提供了花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用，本发明将AhPK基因在花生中过量，可以显著提高转基因植株的维生素E含量、活性和种子的耐盐性。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

花生维生素E合成相关基因AhPK，其序列表如SEQ ID No:1所示。

所述基因AhPK有6个外显子，分别对应的碱基分别为第34-366、1316-1378、1498-1631、2011-2128、2270-2384、2685-2863位。

克隆所述基因AhPK的引物名称与序列如下：

P1：5＇- ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3＇；

P2：5＇- TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3＇；

所述引物序列分别与AhPK基因第1-25碱基、第2857-2881碱基对应。

本发明提供了所述的花生维生素E合成相关基因AhPK编码产生的蛋白质，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

本发明还提供了所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物维生素E含量中的应用。

进一步的，所述AhPK基因转入花生中超量表达，能提高转基因花生植株叶片的维生素E含量，维生素E含量中生育酚总量达到对照的2.81倍，活性最高的α生育酚含量达到对照2.8倍。

本发明还提供了所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物耐盐性中的应用。

进一步的，将花生AhPK基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率最高可达到40%。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从花生中克隆了AhPK基因（AhPK，测序结果表明该基因有6个外显子，分别对应的碱基为34-366，1316-1378，1498-1631，2011-2128，2270-2384，2685-2863。并对其进行了功能验证。

2、将AhPK基因转入花生中获得的转基因花生植株形态发育正常，其生育酚总量和活性最高的α生育酚含量均明显增加，所以可以证明本发明将AhPK基因在花生过量表达可显著提高叶片维生素E中生育酚和α生育酚含量。

3、AhPK基因经实验证明受盐胁迫诱导表达，48h时可达到对照的224倍。

4、转基因花生种子在0.7% NaCl的发芽率最高可达到40%，而非转基因种子的发芽率只有15%；本发明将AhPK基因在花生过量表达可显著提高种子的耐盐性。

本发明以花生这一重要的油料作物为实验材料，克隆了维生素E合成途径中的重要基因AhPK，并对其进行了功能验证，这将为以后通过基因工程调控花生的维生素E含量、活性和提高植株的抗逆能力奠定基础。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中花生的遗传转化，a: 共培养3 d的子叶外植体; b: 培养2 w的子叶外植体; c: 添加100 mg /L卡那霉素培养基上筛选的抗性芽（培养4 w）; d: 150 mg /L卡那霉素培养基上筛选的抗性苗（培养6 w）。

图2是本发明中拟转AhPK基因植株的PCR鉴定。M: Marker DL2000; 1: 未转基因植株（对照）; 2-6: 拟转基因植株。

图3是本发明中1.5% NaCl胁迫处理后幼苗后AhPK基因在不同时间段的相对表达量。

图4是本发明中对照花育23号和T₂代转基因花生种子在0.7%的NaCl溶液中的发芽情况；a: 花育23号种子; b-c: T₂代转基因花生种子。

图5是本发明中用高效液相色谱测定对照花育23号和T₂代转基因植株叶片的生育酚含量。a: 花育23号叶片的生育酚含量的测定结果；b: T₂代转基因植株叶片的生育酚含量的测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：花生维生素E合成相关基因AhPK

一、实验材料

1.基因、菌种与花生品种

本发明克隆了花生PK基因(AhPK)，大肠杆菌DH5α由青岛农业大学遗传研究室实验室保存，根癌农杆菌菌株EHA105（购自北京天恩泽基因科技有限公司），转基因的受体材料为花生品种“花育23号”（由山东农科院花生所育成，青岛农业大学遗传研究室实验室引进）。

2.植物培养基

花生转化中采用的培养基有：

基本培养基：为MS无机盐+B₅有机成分（简称MSB₅），添加3%蔗糖、0.8%琼脂，pH=5.8，在121℃、105 Kpa条件下灭菌20min；

SIM诱导培养基：MSB₅+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4-D；

SEM芽伸长培养基：MSB₅+5 mg/L BAP。

cef: 头孢霉素。

二、实验方法

本发明包括以下具体实验步骤：

1、扩增获得AhPK基因

花生维生素E合成相关基因AhPK，其序列表如SEQ ID No:1所示。

克隆所述基因AhPK的引物名称与序列如下：

P1：5＇- ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3＇（SEQ ID No:4）；

P2：5＇- TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3＇（SEQ ID No:5）；

P1 和P2引物序列分别与AhPK基因第1-25碱基、第2857-2881碱基对应。

克隆获得的所述基因AhPK有6个外显子，分别对应的碱基分别为第34-366、1316-1378、1498-1631、2011-2128、2270-2384、2685-2863位。

所述的花生维生素E合成相关基因AhPK编码产生的蛋白质，其氨基酸序列表如SEQID No:2所示。

2、AhPK基因植物表达载体的构建

(1)扩增AhPK基因

花生品种“花育23号”由青岛农业大学遗传研究室实验室引进，通过RT-PCR扩增了AhPK基因的编码区（其序列表如SEQ ID No:3所示）。

P3：5＇- GGTACCATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3＇(KpnI)（SEQ ID No:6）；

P4：5＇- GGTACCTACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3＇ (KpnI)（SEQ ID No:7）；

引物P3和P4是在引物P1和P2的基础上加了酶切位点，引物P3和P4对应扩增cDNA序列。上述引物序列除去酶切接头（下划线部分）外分别与AhPK基因cDNA序列的第1-25碱基、第969-993碱基对应。

(2) AhPK基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接

回收PCR产物，并在T₄ DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI进行酶切，回收含AhPK基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhPK。

3、将表达载体转化花生，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pBI121-AhPK重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB（利福平50 mg/L，卡那霉素50 mg/L）液体培养基中，28℃、180 rpm培养至OD₆₀₀=0.5~0.8时，取2 mL菌液转移到50 mL YEB（利福平50 mg/L，卡那霉素 50 mg/L）培养基中，培养到OD₆₀₀=0.6~0.8。将菌液于5000 rpm离心15 min后，用相同体积的液体MSB₅悬浮备用。

b、花生子叶外植体的分离：选取饱满的花生种子，在70%酒精中浸泡1 min，0.1%升汞浸泡20 min，无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴，将每片子叶纵向切成2半。

c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10 min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3 d。转移到添加250 mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2 w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000 lx、光照12 h、温度为26℃±1℃。

将形成丛生芽的外植体转移外到250 mg/L头孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2 w，培养条件：光强为1500-2000 lx、光照12 h、温度为26℃±1℃。

培养2 w后，切下不定芽部分转移到250 mg/L头孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4 w左右，期间继代培养2-3次（如图1所示）。

4、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhPK基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5 min；95℃、30 s，55℃、50 s，72℃、40 s，35个循环；72℃、10min。转基因植株PCR阳性率达到31.3%（如图2所示，图2中2-6泳道对应的样品为部分转基因植株样品）。

将花生AhPK基因在花生中过量表达，对花生转基因植株进行PCR检测的引物为：

P5：5＇- GCTCCTACAAATGCCATCA -3＇（SEQ ID No:8）；

P6：5＇-GAGTGTGAGTGAGAGACAT - 3＇（SEQ ID No:9）。

5、荧光定量PCR，包括以下步骤：

a、用1.5% NaCl处理‘花育23号’的幼苗，在不同时间段取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05 g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

b、样品在ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20 µL反应体系包括：10 µL 2× SybrGreen qPCR Master Mix，20 µmol/L正反向引物各0.25 µL，20 ng反转录产物。扩增程序为：先95℃预变性2 min；接着进入40个循环反应，每个循环中95℃变性10 s，60℃延伸33 s；循环结束后，缓慢升至95℃，制备熔解曲线。每个反应设2个复孔。

c、AhPK基因定量PCR的正向引物序列为5'- AAACAAGTCCTATGCTGGTTCA-3'（SEQ IDNo:10）；反向引物序列为5'- GCCGTGACAACAGACACAGT -3'（SEQ ID No:11）。

以花生Actin基因为内标，扩增正向引物序列为5'- GTGGCCGTACAACTGGTATCGT -3'（SEQ ID No:12）；反向引物序列为5'- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3'（SEQ ID No:13）。

如图3所示，AhPK基因受盐胁迫诱导表达，48h时可达到对照的224倍。

6、T₂代转基因种子的耐盐性鉴定

以T₂代种子转基因花生种子和花育23号种子（对照）为材料，挑选饱满种子，加0.7%NaCl充分浸泡4 h，倒掉多余NaCl溶液至适量，于光照培养箱中进行培养，培养箱条件设置为25℃、暗培养24 h，处理期间每1 d更换一次NaCl溶液。7 d后统计发芽率，胚根长度≥种子长度为发芽标准。每个处理设两个重复。

如图4所示，转基因花生种子在0.7% NaCl的发芽率最高可达到40%，而非转基因种子的发芽率只有15%；本发明将AhPK基因在花生过量表达可显著提高种子的耐盐性。

7、T₂代转基因植株生育酚含量的测定

挑选培养1个月的PCR阳性植株和未转基因的野生型植株的叶片各100 mg，用液氮研磨后转入到含600 μL 甲醇﹕氯仿（2﹕1）抽提液的1.5 mL 离心管中，充分震荡混匀，然后加入200 μL 氯仿和200 μL 无菌水，充分混匀。12 000 r/min 离心15 min，取下层有机相转入到新的离心管中，氮气吹干，溶于400 μL 的无水乙醇中。进行高效液相色谱仪分析。

分析条件：流动相为正己烷﹕异丙醚（90﹕10，V/V）；硅胶柱为粒度5 μL，4.6 cm×25cm；检测波长为激发波长：298 nm；发射波长：325 nm；柱温：40℃；流速：1.5 mL·min-1；分析时间：20 min。标准品α、β、γ、δ-生育酚的浓度均为10 ng·μL-1，上样体积为10 μL。

如图5所示，转AhPK基因花生植株形态发育正常，15份转基因材料的生育酚总量和活性最高的α生育酚含量均明显增加，生育酚总量最高达到514.4 µg/g鲜重，为对照（182.9µg/g鲜重）的2.81倍，α生育酚含量最高达到475.4 µg/g鲜重，为对照（169.6 µg/g鲜重）的2.8倍。本发明将AhPK基因在花生过量表达可显著提高叶片维生素E中生育酚和α生育酚含量。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应

用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2881

<212> DNA

<213> 花生

<400> 1

atgtctctca ctcacactcc cgttactctc accatgattt gtagaagcag caccaccacc 60

ctcacatgct gctttcaaag atttgaccca cttcaccgtt tcacacacat ttccattccc 120

atttctctca ctaaaccctc ctctttttca accccatttc taaccctttt caaaccctgt 180

tcttcttctt ctttgactct cacaacgcaa ccaccgcaag ctcgccggaa attcgccgtg 240

cctgcaacca tgctccacca aaaccctcta gtctccgaca tctgtgctct tgctgtgtct 300

ggtgctatcg ccttctcctt ccttaggttg tttgaagaga ccgctaaacg atccctcttt 360

gaccaggttt cttcaaacgc cttctttgga ttcttcaatt atctcaattt ttggggtatg 420

tagattaaaa aagagattct tttttttgct ttccccctct tttgcatttc ttgcaatttc 480

aatggtagct gggtttagtg tgacaatagg gttggttgga aagtggtaac aaaaaacatt 540

gtttaggaat catggcaagc taagcattaa tgaagtgttt cctttgttaa ttgaatgcat 600

atctgtcatc ctttgcataa tgaagaggaa ttttgaattc aattgtttag ttttagtcaa 660

ggttgacgca gagtagttag gtaggtcctt tttttttttt tcttcaaatt tcatcccaaa 720

agttcatgtc ctcttcaatg agtgatgtta ttttgaacat cttaaatatt gggtgttcaa 780

gaaacatctc ttgtcttatt tggtggttcc tagttccctc agttttcaga attcggtgaa 840

ccgaaagtag gaacaagaaa tagattttaa agattttttg tttccataat taagatagta 900

gaaaacaagt tatgaatcca aagcatttac tttgtttcta tgtcttttct tgacttcttt 960

tacagggaat agaaaaaatg tattattaga tgccttagta aaacttatta tgaatatgct 1020

gataggtctt ccccttcatc tgcattgtta catgtgcaag ttcattttga cacacattgc 1080

attttttcag agagattatt ggaacctgtc actgagattt ttgttggtat tagttcatga 1140

cttccttaga tattgttctc tattaaattc ataacttaag atttgtatta tctttcattg 1200

tgtagtaggc cggtagcatt tagtgagtgc tatctttcaa agatggtagt gcttggtttt 1260

tgaacatttt tgttcttcaa actatagatt tgtgatcaat tgtttctttt tttagaaatt 1320

gaataggaaa cttgtgcatg taagcattgg gctgatattc atgctctgct ggccactgta 1380

caggtaatgg catagttcat gaactaatga gctcaaaatt tattttattt tattttattt 1440

tattttattt ttttttaacg ctacaatttc cattgttgaa tcatgctgtt caatcattac 1500

agttctgatg gttggggacc catcttagct tctcttattc cgggtatcaa tataattcgg 1560

atgcttgtta tcgggcttgg aatatacaag gatgaggcca ccgtgaaatc aatgagtaga 1620

tttggagatt acaggtttca atattgtaga caataaaacc tgtgagaatc tttgattctg 1680

tgaaaaaaat aattgttagc tcattttaaa gttaattgta acaagaaagt tatctcttag 1740

tggttattat gatcgaaatg gaagcttctt atctgtagtt atggtatatc aagaaaagta 1800

agagaaggat atgtagtgaa aacagaagga atagattgag atgtaaatta cctgctatgc 1860

tacacgattt ggctgtgaca tgcccttttg gaggatgaag atgatggaaa tccattgttt 1920

gataacggat tgcatggttt tctaatgttt gataattgat ttcattcgtg tgctttattt 1980

ctcatccatt tctcagtgtt tcctctgtac cagggaactc cttaaaggac cactatatta 2040

tgctgctacc attactttgg catcggtaat atactggaga acttcaccta tttccatagc 2100

tgcaatttgc aatctgtgcg caggagatgg taatgtttct atgcccgatc acttataagc 2160

attaaattat tatttataat aataataatt aaacaatgtt atagctcgca ttaagttaaa 2220

gtttagagct tagggtttag agaaaaatct gattatatat gtgctgtcag gcctagctga 2280

cattgtcgga aggcgatttg gcgataaaaa gattccttac aatagaaaca agtcctatgc 2340

tggttcaatt gcaatggcag cagctggatt cttaacttcc gtcgggtaac ttcctatgga 2400

ctcttttcgt tccatgtggt tagatgacat tacacttgat gtctgtttgt ttgtaaaagt 2460

aaactaacct acctgagatt ttggttatat gatacttggc acactctctc ttttttaaaa 2520

ttcgacacta acctcgtaaa tatatcacga gcggaggttc ttgtcgtgta ctgtgtgata 2580

tcatctaact tgagaggagg tcaatgtaat ttacttttat ttgttttgca ctacaaggta 2640

agatctattt aatcacgccg ttgttaacgg ttactgtttt gacaggtata tgagttattt 2700

ttcgtggttt ggatacatgg agggaagctt gaagttggtt ctgggttttc taactgtgtc 2760

tgttgtcacg gcacttgtcg agtcccttcc tatcagcact gaactcgacg acaacctcac 2820

ggttcccctc acttccatat tggtcggaag tgtcattttt tgattgtaag accaaattgt 2880

a 2881

<210> 2

<211> 313

<212> PRT

<213> 花生

<400> 2

Met Ile Cys Arg Ser Ser Thr Thr Thr Leu Thr Cys Cys Phe Gln Arg

1 5 10 15

Phe Asp Pro Leu His Arg Phe Thr His Ile Ser Ile Pro Ile Ser Leu

20 25 30

Thr Lys Pro Ser Ser Phe Ser Thr Pro Phe Leu Thr Leu Phe Lys Pro

35 40 45

Cys Ser Ser Ser Ser Leu Thr Leu Thr Thr Gln Pro Pro Gln Ala Arg

50 55 60

Arg Lys Phe Ala Val Pro Ala Thr Met Leu His Gln Asn Pro Leu Val

65 70 75 80

Ser Asp Ile Cys Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Ile Ala Phe Ser Phe

85 90 95

Leu Arg Leu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Arg Ser Leu Phe Asp Gln Lys

100 105 110

Leu Asn Arg Lys Leu Val His Val Ser Ile Gly Leu Ile Phe Met Leu

115 120 125

Cys Trp Pro Leu Tyr Ser Ser Asp Gly Trp Gly Pro Ile Leu Ala Ser

130 135 140

Leu Ile Pro Gly Ile Asn Ile Ile Arg Met Leu Val Ile Gly Leu Gly

145 150 155 160

Ile Tyr Lys Asp Glu Ala Thr Val Lys Ser Met Ser Arg Phe Gly Asp

165 170 175

Tyr Arg Glu Leu Leu Lys Gly Pro Leu Tyr Tyr Ala Ala Thr Ile Thr

180 185 190

Leu Ala Ser Val Ile Tyr Trp Arg Thr Ser Pro Ile Ser Ile Ala Ala

195 200 205

Ile Cys Asn Leu Cys Ala Gly Asp Gly Leu Ala Asp Ile Val Gly Arg

210 215 220

Arg Phe Gly Asp Lys Lys Ile Pro Tyr Asn Arg Asn Lys Ser Tyr Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ile Ala Met Ala Ala Ala Gly Phe Leu Thr Ser Val Gly Tyr

245 250 255

Met Ser Tyr Phe Ser Trp Phe Gly Tyr Met Glu Gly Ser Leu Lys Leu

260 265 270

Val Leu Gly Phe Leu Thr Val Ser Val Val Thr Ala Leu Val Glu Ser

275 280 285

Leu Pro Ile Ser Thr Glu Leu Asp Asp Asn Leu Thr Val Pro Leu Thr

290 295 300

Ser Ile Leu Val Gly Ser Val Ile Phe

305 310

<210> 3

<211> 993

<212> DNA

<213> 花生

<400> 3

atgtctctca ctcacactcc cgttactctc accatgattt gtagaagcag caccaccacc 60

ctcacatgct gctttcaaag atttgaccca cttcaccgtt tcacacacat ttccattccc 120

atttctctca ctaaaccctc ctctttttca accccatttc taaccctttt caaaccctgt 180

tcttcttctt ctttgactct cacaacgcaa ccaccgcaag ctcgccggaa attcgccgtg 240

cctgcaacca tgctccacca aaaccctcta gtctccgaca tctgtgctct tgctgtgtct 300

ggtgctatcg ccttctcctt ccttaggttg tttgaagaga ccgctaaacg atccctcttt 360

gaccagaaat tgaataggaa acttgtgcat gtaagcattg ggctgatatt catgctctgc 420

tggccactgt acagttctga tggttgggga cccatcttag cttctcttat tccgggtatc 480

aatataattc ggatgcttgt tatcgggctt ggaatataca aggatgaggc caccgtgaaa 540

tcaatgagta gatttggaga ttacagggaa ctccttaaag gaccactata ttatgctgct 600

accattactt tggcatcggt aatatactgg agaacttcac ctatttccat agctgcaatt 660

tgcaatctgt gcgcaggaga tggcctagct gacattgtcg gaaggcgatt tggcgataaa 720

aagattcctt acaatagaaa caagtcctat gctggttcaa ttgcaatggc agcagctgga 780

ttcttaactt ccgtcgggta tatgagttat ttttcgtggt ttggatacat ggagggaagc 840

ttgaagttgg ttctgggttt tctaactgtg tctgttgtca cggcacttgt cgagtccctt 900

cctatcagca ctgaactcga cgacaacctc acggttcccc tcacttccat attggtcgga 960

agtgtcattt tttgattgta agaccaaatt gta 993

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtctctca ctcacactcc cgtta 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacaatttgg tcttacaatc aaaaa 25

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtaccatgt ctctcactca cactcccgtt a 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtacctaca atttggtctt acaatcaaaa a 31

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcctacaa atgccatca 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagtgtgagt gagagacat 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaacaagtcc tatgctggtt ca 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gccgtgacaa cagacacagt 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtggccgtac aactggtatc gt 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggatggct ggaagagaac t 21

Claims

1.花生维生素E合成相关基因AhPK，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.权利要求1所述的花生维生素E合成相关基因AhPK编码产生的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.权利要求1所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物维生素E含量中的应用。

4.根据权利要求3所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物维生素E含量中的应用，其特征在于：所述AhPK基因转入花生中超量表达，能提高转基因花生植株叶片的维生素E含量，维生素E含量中生育酚总量达到对照的2.81倍，活性最高的α生育酚含量达到对照2.8倍。

5.权利要求1所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物耐盐性中的应用。

6.根据权利要求5所述的花生维生素E合成相关基因AhPK在提高植物耐盐性中的应用，其特征在于：将花生AhPK基因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率最高可达到40%。