CN104372015B

CN104372015B - 花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用

Info

Publication number: CN104372015B
Application number: CN201410604319.5A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 郑春花; 王亚; 赵春梅; 孔祥远; 王晶珊; 乔利仙
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104372015A

Abstract

本发明提供了花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用，将该基因在花生中超量表达后，得到总维生素C和还原态维生素C（AsA）含量显著提高的转基因植株。实验证明，将本发明的AhPMM基因超量表达可显著提高花生叶片的维生素C含量，且对花生的正常生长没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物维生素C合成机制的研究，以及提高植物的维生素C含量的改良和抗逆性具有重要的理论及实际意义，应用前景广阔。

Description

花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用。

背景技术

维生素C即抗坏血酸，在生物体的氧化还原代谢反应中起调节作用，人类缺乏它可引起坏血病。除此之外,它还具有其他的作用。例如，缺乏维生素C胆固醇就不能羟基化变成胆酸排出体外；它的氧化酶会影响某些氨基酸（一般是芳香族）的代谢；还有解毒作用等。一般，在动物体内和植物体内，维生素C都可以自己合成，但是，在人体却无法合成抗坏血酸。这是由于，在人体内缺乏古洛内酯氧化酶。植物体自身所合成的维生素C，不仅可以为人类所用，对植物体本身生理功能也具有重要作用。一般来说，抗坏血酸与植物的抗逆性是呈正相关的，随着植物细胞内的抗坏血酸的含量增加，其本身及其代谢相关酶类在清除活性氧方面的作用也增强，使得抗坏血酸在植物耐炎热、寒冷和盐碱环境等逆境的机制中起到了重要的作用。而且抗坏血酸还与植物细胞的分裂、伸长和植株生长有关。

迄今为止已经发现在植物中可能存在4种维生素C合成途径：半乳糖途径、糖醛酸途径、古洛糖途径以及肌醇途径。其中在维生素C的主要的生物合成途径当中，磷酸甘露糖变位酶(PMM)可以促进D-6-磷酸甘露糖转化为D-1-磷酸甘露糖，从而进一步合成维生素C。

目前在拟南芥、烟草、大豆、水稻、番茄、小麦等已经被克隆了PMM基因，但在花生中还没有克隆的报道，该基因在花生中的功能性研究和转基因调控的报道尚存空白。

发明内容

本发明提供了花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用，本发明通过将AhPMM基因转入花生中，可以显著提高花生转基因植株的维生素C含量和花生种子的耐盐性。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

花生维生素C合成相关基因AhPMM，其序列表如SEQ ID No:1所示。

所述基因AhPMM有11个外显子。

所述11个外显子对应的碱基分别为第3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472位。

克隆所述基因AhPMM的引物名称与序列如下：

P1 (5'- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3')；

P2 (5'- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3')，

上述引物序列分别与基因AhPMM第1-22碱基、第3482-3507碱基对应。

本发明还提供了所述的花生维生素C合成相关基因AhPMM编码产生的蛋白质，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。

本发明还提供了所述的基因AhPMM在提高维生素C含量的应用。

转AhPMM基因花生叶片总维生素C含量达8.64 umol g^-1，还原态维生素C含量达5.38 umol g^-1。

本发明还提供了所述的基因AhPMM在提高耐盐性中的应用。

将花生AhPMM基因在花生中超量表达，花生转基因种子在1% NaCl溶液中发芽率最高达到50%。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从花生中克隆了PMM基因（AhPMM），测序结果表明该基因有11个外显子，分别对应的碱基为3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472。

2、将所述AhPMM基因转入花生植株中，转AhPMM基因花生植株形态发育正常，转基因花生叶片总维生素C含量可达到8.64 umol g^-1 (FW)，为对照(5.31 umol g^-1)的1.6倍；还原态维生素C含量可达到5.38 umol g^-1 (FW)，为对照(2.83 umol g^-1)的1.9倍。所以本发明将AhPMM基因在花生过量表达可显著提高叶片维生素C含量。

3、本发明通过实验证明AhPMM基因受盐胁迫诱导表达，24 h时可达到对照的4.96倍。

4、转AhPMM基因花生种子在1% NaCl的发芽率最高可达到50%，而非转基因种子的发芽率只有20%；本发明将AhPMM基因在花生过量表达可显著提高种子的耐盐性。

本发明以花生这一重要的油料作物为实验材料，克隆了抗坏血酸生物合成途径中的重要基因AhPMM，并对其进行分析。可以为以后通过基因工程调控花生的维生素C含量和提高花生植株的抗逆能力奠定基础。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明本发明中花生的遗传转化，a: 在SIM培养基上共培养3d的子叶外植体；b:在SIM+cef培养基上培养2w的子叶外植体；c: 添加100 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性芽（培养4w）；d: 150 mg /L卡那霉素的SEM+cef培养基上筛选的抗性苗（培养6w）；e:在SEM+cef恢复培养基上继续培养两周的抗性苗（培养8 w）；f：抗性苗嫁接图；g：嫁接苗移栽到大田后的收获图。

图2是本发明中200 mM NaCl胁迫处理花生幼苗后AhPMM基因在不同时间段的相对表达量。

图3是本发明中对照莒南小红种和T₂代转基因花生种子在1%的NaCl溶液中的发芽情况；a: 莒南小红种；b-c: T₂代转基因花生种子。

图4是本发明中用高效液相色谱测定对照莒南小红种和T₂代转基因植株叶片的维生素C含量。a: 维生素C含量的标准曲线；b: 莒南小红种叶片的维生素C含量的测定结果；c: T₂代转基因植株叶片的维生素C含量的测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：花生维生素C合成相关基因AhPMM及其在提高维生素C含量和耐盐性中的应用

一、实验材料

1. 基因、菌种与花生品种

本发明克隆了花生PMM基因(AhPMM)，大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌菌株EHA105由青岛农业大学遗传研究室实验室保存，也可以采用生物公司商业化的工程菌株。转基因的受体材料为花生品种 “莒南小红种”（青岛农业大学遗传研究室实验室提供）。

所述克隆的花生AhPMM基因序列表如SEQ ID No:1所示，编码产生的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

克隆所述花生AhPMM基因的引物名称与序列如下：

P1 (5'- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3')（SEQ ID No:4）；

P2 (5'- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3')（SEQ ID No:5）。

SEQ ID No:1序列如下：

AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGG ACTCTTACAGCCCCAAGGAAGGTACTTCTTTCTTCTTGAGCCAATGGCATTACTATAACAAAATAATATATTAATGGAGCAATTTGATGT GTTCTGAGTC AGATTTATTG TCTACAGGTA GTTTAAGGTT

ACTAATTAGGGTTTGGATTCGGTAGCCTCTCCAAAGAAAGCTACTAGTAGCCTCTTCAAATTCAATTATAAAATATACCCCATGCATATCTTTTAATATTTGAAAGTATTCCTTCTTTATTTTTATTTTATTTCTTTTTTAACACGCATCATCCCAAACTTGAGATACAACGCAGCTTCATTTCTGCCTTCACTATTGCAACTTCCATGAACATTCTTCAGTAGTTTCATTTGTTTGGCTTGGAATTGTGTGAATAATTTTTAGCTCCATGAGAAGTCCATAAAAGTAAGTTCTATATTCCAACTGTGCCCACTCTCAACCAAGAAAAAGAAAAACATTCTCACTTCCAACAGCCACAAATGCTGCATAAACTAATTAAAATGAGCTGAATGTGCTGTGGAATTGGGTCATCAATGTTGAATTTGACTGTGGCAATCTTTATGAAACTAGATAATCTTTAACAAATTAATGAGTTGATTGAATAACCTGGGTTATTCAAAATGTGAAGAGCATACTCATATGAATAAAGACACCAATAATTATCATATATTTCAATAATTAAAGAGCAACGAGAAGGAATAATAATGACAAAAGAGAAACAAGAGGAAGAGGAAGAAGTGAGCCCATGTTGCTCAATCAGCACTCCACAGATTGTTCACCAAGATCATCCATCAATCACCACCATTGTCAATGTTTATATTGGACATGATGGAGGTGGATCAAAATTTATTAATGGTGTTGCAGTTCTTAGAAAGGATAAGGCAGCAATGAGATGTGGCAGTACTTCCTTTTCCTCTTATTTGAACAGTGAATAGCTGAAAAGAAATAAAAAAACAAAGCATGAGTACTTTTTAAATATGAGAAAAAGTATGCATTGGGTTATTTTATAATTAAGTATGAAGAGGCTACCAATAGCCTCTCTTTGGAGAAGGCTACTGAATCCAAAGCCTACTAATTATAGCATGCTATAACATCATAATGCTGAAGAAAACTAGAAAATTTTGATTTATTATGATTGTTTAGTCTTGCATCACCTTTATTTATTGTTTCGTACTCGAATTCAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTAAATGAGCCAGATTTTATTTTTGGAAAAAAAAAAGTTTACATGCATTTGTTTTCTTAATCCATACCTGACAATTCATAGAACCTGCTTTAAAAGTCCTTTCCTTTTTCCTGGTACAGGTTGTAACAGTTGGAGTTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGGTTAGCTACAAGCATCTCTCTGATTTCTGATGCTATAATTTCGTTATGTGAAACCACTTGGAGAAAATTGATTGTAGTGTTCCGTCTCATTGCTTAATGCTAATTAATTCTATTATGTGGTTTCTTTTTCATGT TTGTTTTGTTTCTTCTTTGC TATTGGCTGAAGTTGGGAAT TATGTTTGCT GATATAAGCT GAGAATTCAATTTTTACTTT TCTCTACTTTTGTCAAATCATGCATCTTTG ATAAGCTATT AGAATGAAATCAAAAGGATC TATCTTTTTG AATATACCCC TTATTTGTTGCAGTTACCAA TGACTATGGTTATGTATTTT CTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGGTACACCTCATAAACCTCAATCCTTGATAGAATCAAATTACAACGATCAGATGTAAGTTGAAAAAGTTGTGATGATCCTTTTGTTATCGAAAGAACAAAACTAGTACCATCATGGTGTCGCTTGTAAAACACCTCCCGGCGGGCCTTCTGTTAATGTAGCAATGTAAAATTTTGATCTAATACACCATGA CAAGTTGTAATTTCCCTGTTTACAGAGCTTGAAATCATTC CTTGGTGATGAAAAGCTCAA GGTAAGCCCCGAATTTCCATTCGAGCCATATTGTTTGAGGCTGAGGCAACCATGCTGATT ACCTCCTAAC TGCATTTAGA GATAATTTTG TTGTAGGAAT TTATTAATTTCACACTTCAT TACATTGCTG ACTTGGATAT CCCTATTAAG AGGTCAGCCA TATTCAGAGGTTAATCATATACTGTTCATT TTTATTGCAG AAAACTTATA AATCCTGTTT TTGACATAATCTTTTCAGGGGAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTAGCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGGTGAGACATCTTGGTCATGTGAATATTAATTAGAATTTTCTG TCTCTATAAT TTGATAGGTC CTATATTTCTTTTAAAAGTT TGCAACACATGTTCTCAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTAAGT GATGATCTTCATCCCGATGT GGCGAATTTC TTGATGGCCA AGTTATAAGTGAGCATGTCTTAATTTGAATCTTCTCTTCA GGTTTTCCCC CAAGGTTGGG ATAAAACATACTGCCTTAGATACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTC TTTGGTGACA AAACTTACAAGGTTAGTCCT TTAGAGTATCAAACAAATAT CTGTAACTCT GTACCATTAT AGATTTTTGAATTCTATAAC GCCAGTTGCT ACCGGATCCTTTTGATTTAT CAATGTGACA CATTTTTATGAAAAATCCTT AAAGTGAGTTGGGGCAAACAATTTCTGTAACAAGCAAATAATTGTCTGTTTTATGGAGACTGCATGAACCTTTTTTCTCCATTTTGAAACTTGTTTCAAATATTCACCAAAATGATCATG CTTTTAGAAA TGATATGTTG CAACAGTATA TCAGTCCCAAAATTGAAGCTATATGCCTAC TTTAGGTGTT ATCAAAGGAT GAAGATTGAT TAATTTCCTACAATAACTTTATTTTGTAAT TTTCTTTGAGCAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGGTTAGTTGCTTCCTAACTTTAAATCATAATATGTGAAAAAAATGACTCAGTTTTGGTTACAATGGCATGCTGAAACAATTCCATTTTAAATTAAGACCGAATTATCCAAGGTAAATAATTGTTGCTGCAGTGCTTATAATTTGTATTCATTCCTT TTTCAGTTACAAGCCCTGAA GATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCTCTTCCTTAAAAATTGAATTTGCTGAAGCAATGTT TCCATTGAGA ACCACCA。

SEQ ID No:2序列如下：

MAARKPGLIALFDVDGTLTAPRKVVTPEMLAFMQDLRKVVTVGVVGGSDL VKISEQLGST

VTNDYGYVFS ENGLVAHKEG NLIGTQSLKS FLGDEKLKEF INFTLHYIAD LDIPIKRGTF

IEFRSGMLNV SPIGRNCSQE ERDEFEKYDK IQNIRPKMVE VLREKFAHFN LTFSIGGQIS

FDVFPQGWDKTYCLRYLEDF NEIHFFGDKT YKGGNDHEIY ESERTIGHTV TSPEDTMKQC

TALFLKN。

2. 植物培养基

花生转化中采用的培养基有：

基本培养基：为MS无机盐+B₅有机成分（简称MSB₅），添加3%蔗糖、0.8%琼脂，pH=5.8，在121℃、105Kpa条件下灭菌20min；

SIM诱导培养基：MSB₅+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2,4-D；

SEM芽伸长培养基：MSB₅+5 mg/L BAP；

cef: 头孢霉素。

二、实验方法

本发明包括以下具体实验步骤：

1、AhPMM基因植物表达载体的构建

(1) 扩增AhPMM基因

花生品种“莒南小红种” 由青岛农业大学遗传研究室实验室提供，通过RT-PCR扩增了AhPMM基因的编码区（其序列表如SEQ ID No:3所示），引物如下：

P3 (5'-GGTACCAAATGGCTGCCCGGAAACCTGG-3')(KpnI)；（SEQ ID No:6）

P4 (5'- GAGCTCTCAATTTTTAAGGAAGAGAGC-3')(SacI) （SEQ ID No:7）。

上述引物序列除去酶切接头（下划线对应的碱基）外分别与AhPMM基因的第1-22碱基、第3452-3472碱基对应。

SEQ ID No:3序列如下：

AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGGACTCTTACAG

CCCCAAGGAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGTAACAGTTGGAGTTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGTTACCAATGACTATGGTTATGTATTTTCTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGAGCTTGAAATCATTCCTTGGTGATGAAAAGCTCAAGGAATTTATTAATTTCACACTTCATTACATTGCTGACTTGGATATCCCTATTAAGAGGGGAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTAGCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTTTTCCCCCAAGGTTGGGATAAAACATACTGCCTTAGATACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTCTTTGGTGACAAAACTTACAAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGTTACAAGCCCTGAAGATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCT CTTCCTTAAA AATTGA。

(2) AhPMM基因与克隆载体pUC18及植物表达载体pBI121的连接。

回收PCR产物，并在T₄ DNA连接酶作用下与克隆载体pUC18 (购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和SacI进行双酶切，回收含AhPMM基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体pBI121-AhPMM。

3、将表达载体转化花生，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pBI121-AhPMM重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB（利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L）液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD₆₀₀=0.5~0.8时，取2mL菌液转移到50mL YEB（利福平50mg/L，卡那霉素 50mg/L）培养基中，培养到OD₆₀₀=0.6~0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MSB₅悬浮备用。

b、花生子叶外植体的分离：选取饱满的花生种子，在70%酒精中浸泡1min，0.1%升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-6次。去种皮和胚轴，将每片子叶纵向切成2半。

c、农杆菌介导的遗传转化：切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250 mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。

将形成丛生芽的外植体转移外到250 mg/L头孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培养基上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500-2000lx、光照12h、温度为26℃±1℃。

培养2w后，切下不定芽部分转移到250 mg/L头孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培养基上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培养4w左右，期间继代培养2-3次。

以2w左右的“花育23”实生苗为砧木，切除距子叶节约 2cm 以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约 0.5~1cm。当转基因植株长到约2~3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约 0.5~1cm 的 V 形伤口。将接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于MS-B₅培养基中无菌培养3~4天；然后移栽于灭菌的育苗基质中进行驯化3w，之后移栽到田间，直至转基因植株结实（花生的遗传转化如图1所示）。

4、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述载体序列和AhPMM基因序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、30 s，56℃、35s，72℃、40 s，35个循环；72℃、10min。转基因植株PCR阳性率达到42.3%。

将花生AhPMM基因在花生中过量表达，对花生转基因植株进行PCR检测的引物为：

P5 (5'-GCTCCTACAAATGCCATCA -3')（SEQ ID No:8）；

P6 (5'- GATAGTGGGATTGTGCGTCA - 3')（SEQ ID No:9）。

5、荧光定量PCR，包括以下步骤：

a、用200 mM NaCl处理生长3w的‘莒南小红种’幼苗，在不同时间段取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取不同时间段胁迫处理的花生幼叶0.05 g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

b、样品在ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20 µL反应体系包括：10 µL 2× SybrGreen qPCR Master Mix，20 µmol/L正反向引物各0.25 µL，20 ng反转录产物。扩增程序为：先95℃预变性2 min；接着进入40个循环反应，每个循环中95℃变性10 s，60℃延伸33 s；循环结束后，缓慢升至95℃，制备熔解曲线。每个反应设2个复孔。

c、PMM基因定量PCR的正向引物序列为5'- CATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGT -3'（SEQID No:10）；反向引物序列为5'- GGAATGATTTCAAGCTCTGGGT -3'（SEQ ID No:11）。

以花生Actin基因为内标，扩增正向引物序列为5'- GTGGCCGTACAACTGGTATCGT -3'（SEQ ID No:12）；反向引物序列为5'- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3'（SEQ ID No:13）。

如图2所示，200 mM NaCl胁迫处理后花生幼苗后，AhPMM基因表达量先略微下降，后迅速上升，在24 h时达到对照的4.96倍，48 h时又迅速降低，只有对照的1.22倍。

6、T₂代转基因种子的耐盐性鉴定

以T₂代种子转基因花生种子和莒南小红种种子（对照）为材料，挑选饱满种子，加1%NaCl充分浸泡4 h，倒掉多余NaCl溶液至适量，于光照培养箱中进行培养，培养箱条件设置为25℃、暗培养24h，处理期间每1 d更换一次NaCl溶液。5 d后统计发芽率，胚根长度≥种子长度为发芽标准。每个处理设两个重复。

如图3所示，花生转基因植株的花生种子在1% NaCl的发芽率最高可达到50%，而对照只有20%。

7、T₂代转基因植株维生素C含量的测定

AsA的测定：取T₂代转基因植株叶片0.5 g用液氮研磨，加0.1%草酸适量转移至棕色容量瓶中，避光浸泡1 h，混匀，超声处理25 min，冷却后定容10 mL。12,000 rmp离心10min，取上清，0.22 μm滤膜过滤，进样分析。

AsA+DHA（总维生素测定）：取上述离心后上清液1ml，分别加入25μL DTT（25mmolL^-1）和25μL K₂HPO₄(160 mmol L^-1)，室温下避光静置15 min将DHA完全还原成AsA，12,000rpm离心15 min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤后进样分析。

如图4所示，用高效液相色谱测定对照莒南小红种和T₂代转基因植株叶片的维生素C含量，转基因花生叶片总维生素C含量最高可达到8.64 umol g^-1 (FW)，为对照(5.31umol g^-1)的1.6倍；还原态维生素C含量最高可达到5.38 umol g^-1 (FW)，为对照(2.83umol g^-1)的1.9倍。

通过上述实验数据说明，本发明通过将AhPMM基因转入花生中，可以显著提高花生转基因植株的维生素C含量和花生种子的耐盐性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 花生维生素C合成相关基因AhPMM及其应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3507

<212> DNA

<213> 花生

<400> 1

aaatggctgc ccggaaacct ggtttgattg cattgtttga tgttgatggg actcttacag 60

ccccaaggaa ggtacttctt tcttcttgag ccaatggcat tactataaca aaataatata 120

ttaatggagc aatttgatgt gttctgagtc agatttattg tctacaggta gtttaaggtt 180

actaattagg gtttggattc ggtagcctct ccaaagaaag ctactagtag cctcttcaaa 240

ttcaattata aaatataccc catgcatatc ttttaatatt tgaaagtatt ccttctttat 300

ttttatttta tttctttttt aacacgcatc atcccaaact tgagatacaa cgcagcttca 360

tttctgcctt cactattgca acttccatga acattcttca gtagtttcat ttgtttggct 420

tggaattgtg tgaataattt ttagctccat gagaagtcca taaaagtaag ttctatattc 480

caactgtgcc cactctcaac caagaaaaag aaaaacattc tcacttccaa cagccacaaa 540

tgctgcataa actaattaaa atgagctgaa tgtgctgtgg aattgggtca tcaatgttga 600

atttgactgt ggcaatcttt atgaaactag ataatcttta acaaattaat gagttgattg 660

aataacctgg gttattcaaa atgtgaagag catactcata tgaataaaga caccaataat 720

tatcatatat ttcaataatt aaagagcaac gagaaggaat aataatgaca aaagagaaac 780

aagaggaaga ggaagaagtg agcccatgtt gctcaatcag cactccacag attgttcacc 840

aagatcatcc atcaatcacc accattgtca atgtttatat tggacatgat ggaggtggat 900

caaaatttat taatggtgtt gcagttctta gaaaggataa ggcagcaatg agatgtggca 960

gtacttcctt ttcctcttat ttgaacagtg aatagctgaa aagaaataaa aaaacaaagc 1020

atgagtactt tttaaatatg agaaaaagta tgcattgggt tattttataa ttaagtatga 1080

agaggctacc aatagcctct ctttggagaa ggctactgaa tccaaagcct actaattata 1140

gcatgctata acatcataat gctgaagaaa actagaaaat tttgatttat tatgattgtt 1200

tagtcttgca tcacctttat ttattgtttc gtactcgaat tcaaggtggt gactccagag 1260

atgttggcat tcatgcaaga tctaaggaag gtaaatgagc cagattttat ttttggaaaa 1320

aaaaaagttt acatgcattt gttttcttaa tccatacctg acaattcata gaacctgctt 1380

taaaagtcct ttcctttttc ctggtacagg ttgtaacagt tggagttgtg ggtggttctg 1440

accttgtaaa gatatctgag caactgggca gcacaggtta gctacaagca tctctctgat 1500

ttctgatgct ataatttcgt tatgtgaaac cacttggaga aaattgattg tagtgttccg 1560

tctcattgct taatgctaat taattctatt atgtggtttc tttttcatgt ttgttttgtt 1620

tcttctttgc tattggctga agttgggaat tatgtttgct gatataagct gagaattcaa 1680

tttttacttt tctctacttt tgtcaaatca tgcatctttg ataagctatt agaatgaaat 1740

caaaaggatc tatctttttg aatatacccc ttatttgttg cagttaccaa tgactatggt 1800

tatgtatttt ctgagaatgg tcttgtggct cataaggaag gaaacctcat tggaacccag 1860

gtacacctca taaacctcaa tccttgatag aatcaaatta caacgatcag atgtaagttg 1920

aaaaagttgt gatgatcctt ttgttatcga aagaacaaaa ctagtaccat catggtgtcg 1980

cttgtaaaac acctcccggc gggccttctg ttaatgtagc aatgtaaaat tttgatctaa 2040

tacaccatga caagttgtaa tttccctgtt tacagagctt gaaatcattc cttggtgatg 2100

aaaagctcaa ggtaagcccc gaatttccat tcgagccata ttgtttgagg ctgaggcaac 2160

catgctgatt acctcctaac tgcatttaga gataattttg ttgtaggaat ttattaattt 2220

cacacttcat tacattgctg acttggatat ccctattaag aggtcagcca tattcagagg 2280

ttaatcatat actgttcatt tttattgcag aaaacttata aatcctgttt ttgacataat 2340

cttttcaggg gaacattcat agagttccgt agtggaatgc tgaatgtgtc gccaattggg 2400

cgaaactgta gccaagaaga aagagatgaa tttgagaagt atgacaaggt gagacatctt 2460

ggtcatgtga atattaatta gaattttctg tctctataat ttgataggtc ctatatttct 2520

tttaaaagtt tgcaacacat gttctcagat tcagaacatt cgtccaaaaa tggttgaggt 2580

gcttcgtgaa aagtttgctc attttaatct gacattttcc attggagggc agataagctt 2640

tgatgtaagt gatgatcttc atcccgatgt ggcgaatttc ttgatggcca agttataagt 2700

gagcatgtct taatttgaat cttctcttca ggttttcccc caaggttggg ataaaacata 2760

ctgccttaga taccttgaag attttaatga aattcacttc tttggtgaca aaacttacaa 2820

ggttagtcct ttagagtatc aaacaaatat ctgtaactct gtaccattat agatttttga 2880

attctataac gccagttgct accggatcct tttgatttat caatgtgaca catttttatg 2940

aaaaatcctt aaagtgagtt ggggcaaaca atttctgtaa caagcaaata attgtctgtt 3000

ttatggagac tgcatgaacc ttttttctcc attttgaaac ttgtttcaaa tattcaccaa 3060

aatgatcatg cttttagaaa tgatatgttg caacagtata tcagtcccaa aattgaagct 3120

atatgcctac tttaggtgtt atcaaaggat gaagattgat taatttccta caataacttt 3180

attttgtaat tttctttgag cagggtggaa atgaccatga aatctatgaa tcagaaagga 3240

ctattggtca cacaggttag ttgcttccta actttaaatc ataatatgtg aaaaaaatga 3300

ctcagttttg gttacaatgg catgctgaaa caattccatt ttaaattaag accgaattat 3360

ccaaggtaaa taattgttgc tgcagtgctt ataatttgta ttcattcctt tttcagttac 3420

aagccctgaa gataccatga agcagtgcac agctctcttc cttaaaaatt gaatttgctg 3480

aagcaatgtt tccattgaga accacca 3507

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 花生

<400> 2

Met Ala Ala Arg Lys Pro Gly Leu Ile Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ala Pro Arg Lys Val Val Thr Pro Glu Met Leu Ala Phe

20 25 30

Met Gln Asp Leu Arg Lys Val Val Thr Val Gly Val Val Gly Gly Ser

35 40 45

Asp Leu Val Lys Ile Ser Glu Gln Leu Gly Ser Thr Val Thr Asn Asp

50 55 60

Tyr Gly Tyr Val Phe Ser Glu Asn Gly Leu Val Ala His Lys Glu Gly

65 70 75 80

Asn Leu Ile Gly Thr Gln Ser Leu Lys Ser Phe Leu Gly Asp Glu Lys

85 90 95

Leu Lys Glu Phe Ile Asn Phe Thr Leu His Tyr Ile Ala Asp Leu Asp

100 105 110

Ile Pro Ile Lys Arg Gly Thr Phe Ile Glu Phe Arg Ser Gly Met Leu

115 120 125

Asn Val Ser Pro Ile Gly Arg Asn Cys Ser Gln Glu Glu Arg Asp Glu

130 135 140

Phe Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Gln Asn Ile Arg Pro Lys Met Val Glu

145 150 155 160

Val Leu Arg Glu Lys Phe Ala His Phe Asn Leu Thr Phe Ser Ile Gly

165 170 175

Gly Gln Ile Ser Phe Asp Val Phe Pro Gln Gly Trp Asp Lys Thr Tyr

180 185 190

Cys Leu Arg Tyr Leu Glu Asp Phe Asn Glu Ile His Phe Phe Gly Asp

195 200 205

Lys Thr Tyr Lys Gly Gly Asn Asp His Glu Ile Tyr Glu Ser Glu Arg

210 215 220

Thr Ile Gly His Thr Val Thr Ser Pro Glu Asp Thr Met Lys Gln Cys

225 230 235 240

Thr Ala Leu Phe Leu Lys Asn

245

<210> 3

<211> 746

<212> DNA

<213> 花生

<400> 3

aaatggctgc ccggaaacct ggtttgattg cattgtttga tgttgatggg actcttacag 60

ccccaaggaa ggtggtgact ccagagatgt tggcattcat gcaagatcta aggaaggttg 120

taacagttgg agttgtgggt ggttctgacc ttgtaaagat atctgagcaa ctgggcagca 180

cagttaccaa tgactatggt tatgtatttt ctgagaatgg tcttgtggct cataaggaag 240

gaaacctcat tggaacccag agcttgaaat cattccttgg tgatgaaaag ctcaaggaat 300

ttattaattt cacacttcat tacattgctg acttggatat ccctattaag aggggaacat 360

tcatagagtt ccgtagtgga atgctgaatg tgtcgccaat tgggcgaaac tgtagccaag 420

aagaaagaga tgaatttgag aagtatgaca agattcagaa cattcgtcca aaaatggttg 480

aggtgcttcg tgaaaagttt gctcatttta atctgacatt ttccattgga gggcagataa 540

gctttgatgt tttcccccaa ggttgggata aaacatactg ccttagatac cttgaagatt 600

ttaatgaaat tcacttcttt ggtgacaaaa cttacaaggg tggaaatgac catgaaatct 660

atgaatcaga aaggactatt ggtcacacag ttacaagccc tgaagatacc atgaagcagt 720

gcacagctct cttccttaaa aattga 746

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaatggctgc ccggaaacct gg 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggtggttct caatggaaac attgct 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtaccaaat ggctgcccgg aaacctgg 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagctctcaa tttttaagga agagagc 27

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcctacaa atgccatca 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatagtggga ttgtgcgtca 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catgcaagat ctaaggaagg ttgt 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggaatgattt caagctctgg gt 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtggccgtac aactggtatc gt 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggatggct ggaagagaac t 21

Claims

1.花生维生素C合成相关基因AhPMM在提高花生耐盐性中的应用，其特征在于：所述花生维生素C合成相关基因AhPMM，其序列表如SEQ ID No:1所示；所述基因AhPMM有11个外显子，所述11个外显子对应的碱基分别为第3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472位。

2.根据权利要求1所述的基因AhPMM在提高花生耐盐性中的应用，其特征在于将花生AhPMM基因在花生中超量表达，花生转基因种子在1% NaCl溶液中发芽率最高达到50%。