CN103305538A - 枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用 - Google Patents

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CN103305538A
CN103305538A CN2013101739853A CN201310173985A CN103305538A CN 103305538 A CN103305538 A CN 103305538A CN 2013101739853 A CN2013101739853 A CN 2013101739853A CN 201310173985 A CN201310173985 A CN 201310173985A CN 103305538 A CN103305538 A CN 103305538A
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王罡
季静
吴广霞
关春峰
张旭强
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Tianjin University
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Tianjin University
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Abstract

本发明涉及一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用。它具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过同源克隆的策略和3'RACE技术克隆枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX，得到完整的编码基因序列为753bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-Lm APX，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX编码的酶活性进行了鉴定，该重组蛋白对底物抗坏血酸（AsA）和H2O2都具有较高的活性。同时构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmAPX，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，用于后续的逆境胁迫研究。

Description

枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用
技术领域
本发明涉及一种枸杞（Lycium chinense Miller）细胞质中抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的克隆，具体为一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用。
背景技术
抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX，EC1.11.1.11）是一种亚铁血红素蛋白，也叫做维生素C过氧化物酶，它属于末端氧化酶的一种，主要存在于高等植物、真核藻类及某些蓝细菌中，但在某些昆虫中也检测到该酶活性。APX是清除H2O2的关键酶，以还原型抗坏血酸为反应底物，它催化H2O2还原为H2O的反应，对抗坏血酸具有很高的特异性和亲和性，消耗H2O2产生单脱氢抗坏血酸，单脱氢抗坏血酸可通过不同的途径被还原成抗坏血酸(AsAda, 1992; Shigeoka et al.,1980a; 1980b)。在高等植物中，APX是一个多基因家族，根据其在细胞内的定位不同可分为：叶绿体中的基质APX(sAPX)、类囊体膜APX(tAPX)、微体(乙醛酸循环体和过氧化物酶体)膜结合型APX(mAPX)、胞质APX(cAPX)和线粒体APX(mitAPX)。
APX的分子和酶学特点不同于其它的血红素过氧化物酶。APX对电子供体AsA具有高度的特异性，尤其是叶绿体APX(chlAPX)和mitAPX。APX的一个最大特点是在没有电子供体AsA时很不稳定，AsA低于20μmol/L时APX的活性迅速降低，适当内源浓度的AsA(≥20 mol/L)对于APX作用的发挥至关重要，这不仅表明AsA可以调节APX的活性，而且为AsA作为植物重要的抗氧化剂提供了证据。
在逆境条件(盐渍、干旱、高温、低温、真菌侵染等)下，植物由于细胞代谢过程不协调会导致各种活性氧的升高从而造成氧化胁迫。氧化胁迫是由ROS，如单线态的氧、超氧负离子、过氧化氢及羟自由基的形成导致的。过量的ROS对植物细胞具有较强的毒害作用，使细胞产生细胞水平和分子水平上的不可逆损伤，膜系统遭到破坏，导致组织结构和细胞区隔化丧失，胞膜系统产生变性，最终导致细胞损伤和死亡。APX在植物生长发育和逆境胁迫响应等生理过程中都发挥着非常重要的作用，尤其是植物受到逆境胁迫时，APX可以快速清除细胞中产生的过量的H2O2，对于保护叶绿体和其他细胞组分免受H2O2及其所产生的羟自由基的破坏是必不可少的。APX能提高氧化耐受性的作用已在许多植物中有报道，目前多种植物的APX基因已克隆并应用于植物转基因的研究（孙卫红等，2005）。由于APX在清除ROS、抵抗逆境胁迫方面具有重要作用，植物体内主要的过氧化物清除酶APX已成为当今植物耐逆性研究中的一个热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因。
本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。
本发明提供了一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。
本发明提供了一种上述枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
本发明提供了一种上述枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX重组克隆载体pMD18-T-LmAPX。
本发明提供了一种上述枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX重组植物表达载体pCAMBIA2300- LmAPX。
含有上述的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的重组载体，这些重组载体包括质粒。
所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX。
所述的质粒表达载体双元植物表达载体pCAMBIA2300- LmAPX。
含有上述枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。
本发明提供了一种含有LmAPX基因工程菌。
上述枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的应用包括该LmAPX基因编码的蛋白在大肠杆菌和植物中的应用；
本发明的技术方案具体概述如下：
本发明提供的一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
本发明提供的一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX编码的蛋白，如序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本发明的克隆方法由下述步骤组成：
从枸杞叶片中提取总RNA，根据NCBI中已登录的番茄（DQ096286）、辣椒（DQ002888）、马铃薯（AB041343）、烟草（U15933）的保守核苷酸序列分别从5’端和中间保守区域设计上游简并引物APX-JF：5’-CAATTRCTATGGGTAAGT-3’和中间特异性上游引物APX-BF：5’-AGGATATTGTTGCACTCTCTGGTG-3’。中间特异上游引物APX-BF与3' RACE试剂盒中下游Outer引物利用RACE技术扩增得到其3’端末端全长序列；同时根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物，通过PCR扩增获得LmAPX基因的全长序列。
本发明构建含枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX，由下述步骤组成：
Figure 201453DEST_PATH_IMAGE001
构建含有枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的中间载体pMD18-T-LmAPX：
设计由SEQ ID NO.3所示的上游引物P1（P1：5’-ATGGGTAAGT GCTATCCT-3’），和由SEQ ID NO.4所示的下游引物P2（P2：5’-GCCACTACTCCCACCCT-3’），以枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQ ID NO.1所示的LmAPX基因的中间载体pMD18-T-LmAPX。
Figure 340310DEST_PATH_IMAGE002
构建大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX：
设计由SEQ ID NO.5所示的上游引物P3（P3：5’-CGCGGATCCATGGGTAAGTGCTATCCTA-3’），和由SEQ ID NO.6所示的下游引物P4（P4：5’-ACGCGTCGACCACCCTTCAGAATCACCAT-3’），以质粒pMD18-T-LmAPX为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和SalI酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经BamHI和SalI双酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX。
本发明提供了一种枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmAPX基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。
本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'-RACE技术克隆了枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX，得到完整的编码基因序列为753bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX，对克隆的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX编码的酶活性进行了鉴定，通过pET-28a原核表达载体构建的重组蛋白在大肠杆菌中异源表达表明LmAPX重组蛋白对底物抗坏血酸（AsA）和H2O2都具有较高的活性。同时构建了双元植物表达载体 pCAMBIA2300-LmAPX，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，用于后续的逆境胁迫研究。
附图说明
图1 pMD18-T-LmAPX载体示意图。
图2 pET28a-LmAPX载体示意图。
图3 pET28a-LmAPX酶切验证结果。
图4 LmAPX重组蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图。
图5 双倒数法求LmAPX基因重组蛋白的Km和Vm值。(a)、(b)分别以AsA和H2O2为底物双倒数法作图。
图6 pCAMBIA2300-LmAPX载体示意图。
图7 pCAMBIA2300-LmAPX酶切验证结果。
图8转基因烟草基因组PCR验证结果。
具体实施方式
对本发明作进一步的阐述，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1
枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmAPX的克隆： 
以RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，German）试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据NCBI中已登录的番茄（DQ096286）、辣椒（DQ002888）、马铃薯（AB041343）、烟草（U15933）的保守核苷酸序列分别从5’端和中间部分设计上游简并引物APX-JF：5’-CAATTRCTATGGGTAAGT-3’和中间特异性上游引物APX-BF：5’-AGGATATTGTTGCACTCTCTGGTG-3’。利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0 （TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：
①以Total RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如下：
RNA：                                   2μl
3' RACE Adaptor：                         1μl
5×M-MLV Buffer：                         2μl
2.5mM dNTP Mixture：                      1μl
RNase Inhibitor：                          0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV：              0.25μl
RNase Free dH2O：                        3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer： 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
1st PCR产物：                           1μl
2.5mM dNTP Mixture：                    2μl
APX-BF：                               0.5μl
3' RACE out primer：                      0.5μl
10×LA PCR Buffer：                       2.5μl
TaKaRa LA Taq：                          0.25μl
ddH2O：                                 18.25μl
Total volume                              25μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。
Figure 986055DEST_PATH_IMAGE003
根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物P2。以1st Strand cDNA为模板，以5’端特异引物P1和3’端特异引物P2为上下游引物，进行PCR反应，扩增基因的全长。反应体系如下：
1st PCR产物：                           1μl
2.5mM dNTP Mixture：                    4μl
P1：                                     1μl
P2：                                    1μl
10×LA PCR Buffer：                       5μl
TaKaRa LA Taq：                          0.5μl
ddH2O：                                 37.5μl
Total volume                              50μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。
实施例2
克隆载体pMD18-T-LmAPX的构建过程
将序列表所示的LmAPX基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：
目的PCR片段：                          4μl
pMD18-T载体：                           1μl
SolutionI：                               5μl
反应条件：16℃，30min。连接产物转化E.Coli TOP10，涂布于含Amp抗性的LB平板。以目的基因为引物进行PCR（反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。）得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。
实施例3
大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX的构建过程
首先，以pMD18-T-LmAPX为模版，P3和P4分别为上下游引物用高保真Pfu 酶扩增LmAPX片段，其反应条件为94℃，4min；94℃，30sec；57℃，30sec；72℃，1min50sec；72℃，8min，32个循环。在P3中引入BamHI酶切位点（CGCGGATCC），在P4中引入SalI酶切位点（ACGCGTCGAC）。然后，PCR产物与pET28a质粒分别经BamHI和SalI双酶切，将二者酶切产物连接：22℃，2 hrs，连接（2 μl载体DNA，5μl外源DNA，2 μl 5×T4 buffer，1 μl T4 DNA连接酶）。连接产物转化E. coli BL21( DE3) 感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到约750 bp左右产物条带，酶切鉴定得到目的条带如图3所示，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmAPX构建正确。
实施例4
LmAPX基因在大肠杆菌中的功能验证
（1）LmAPX在BL21中的诱导表达以及纯化，具体步骤为：
Figure 235771DEST_PATH_IMAGE004
挑取空载体pET28a和重组载体pET28a-LmAPX转化成功的BL21单菌落，37℃过夜培养；
Figure 221044DEST_PATH_IMAGE005
将菌液按l/100比例稀释，200ml菌液于37℃，200rpm培养至OD600=0.5，取出lml菌液作为对照保存于4℃；
Figure 91655DEST_PATH_IMAGE003
加入IPTG（终浓度为l mmol/L）于28℃诱导表达12h后，先取出lml菌液作为对照保存于4℃；剩下的用于后续细菌蛋白抽提和目的蛋白纯化。其中，细菌蛋白抽提试剂盒(Cat. No. CW0888)和Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒(Cat. No. CW0009)均购于康为世纪公司。
取IPTG诱导前后保存的菌液、抽提的细菌总蛋白和纯化后的LmAPX蛋白进行SDS-PAGE电泳。结果如图4所示：1泳道是标准蛋白分子量Mrker；2泳道是IPTG诱导后的空载体pET-28a；3泳道是IPTG诱导前的重组载体pET-28a-LmAPX；4泳道是抽提的细菌总蛋白；5泳道是纯化后的LmAPX蛋白。结果表明，诱导的空载体没有目的条带，未诱导的重组蛋白目的蛋白的表达量比较低，为本底水平的表达，诱导后的重组蛋白的目的条带表达量较高，纯化后的目的蛋白条带单一，分子量大小约27KDa。
（2）LmAPX蛋白的酶学特性分析
Figure 162379DEST_PATH_IMAGE004
3mL酶反应混合液(50 mmol/L PBS PH7.0，0.1 mmol/L EDTA，0.4 mmol/L AsA)中加入适量纯化后的蛋白，然后再加入0.16mmol/L H2O2启动反应，通过测定290nm吸收值变化大小来初步检验纯化后的蛋白是否有活性；
Figure 215786DEST_PATH_IMAGE005
分别测定底物AsA和H2O2的不同梯度浓度下酶的活性，测三次取其平均值，计算APX两种底物对应的Km和Vm值；
Figure 117883DEST_PATH_IMAGE003
用Bradford法测蛋白含量，测三次取平均值。APX的摩尔吸光系数ε290=2.8 mM-1cm-1。用室温下每分钟氧化1 mmol/L AsA的酶量作为一个酶活性单位。
Figure 598543DEST_PATH_IMAGE006
双倒数法求Km和Vm值
H2O2浓度过量(0.16mmol/L)时取不同浓度的AsA (0.1、0.2、0.4、0.5、0.75、1.0 mmol/L)，测定2min内A290的降低(每20s记录读数)，反应以加入H2O2为起始。
AsA浓度过量(0.4mmol/L)时取不同浓度的H2O2 (0.12、0.2、0.3、0.4、0.8 mmol/L)，测定2min内A290的降低(每20s记录读数)，反应以加入H2O2为起始。
用酶促反应的速度的倒数(l/V)对底物浓度的倒数(1/[S])的作图。x和y轴上的截距分别代表米氏常数的倒数l/Km和最大反应速度的倒数1/Vm。公式为：l/V=Km/Vm×1/[S」+1/Vm，分别对两个底物AsA和H2O2双倒数法作图。如图5所示，pET28a-LmAPX重组蛋白在大肠杆菌中异源表达表明该重组蛋白对底物抗坏血酸（AsA）和H2O2都具有较高的活性。在AsA的浓度过量时，对H2O2的Km和Vmax分别是0.17± 0.02 mM 和11.78±1.88 mmol/min mg，在H2O2的浓度过量时，对AsA的Km和Vmax分别是2.19 ± 0.40 mM 和58.82 ±3.51 mmol/min mg。
实施例5
双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmAPX的构建及转化农杆菌工程菌种C58
pET28a-LmAPX质粒和pCAMBIA2300空载体质粒分别经BamHI和SalI双酶切，酶切体系为：60μl质粒，2μl BamHI内切酶，2μl SalI内切酶，20μl 10×FastDigest Buffer，116μl ddH2O2，反应条件为37℃，3hrs。分别切胶回收目的片段LmAPX和载体片段pCAMBIA2300，然后将二者连接，连接体系同实施例3。连接产物转化E.Coli.TOP10，涂布于含100mg/L 浓度Kana抗性的LB平板。阳性克隆经酶切验证正确，如图7所示。构建成功的pCAMBIA2300-LmAPX载体通过电击转化农杆菌工程菌C58，通过菌落PCR验证正确的阳性转化子存于-80℃，用于后续的植物转基因。
实施例6
农杆菌感受态细胞的制备和电转化过程
(1)将根癌农杆菌C58活化，划板，28℃培养2天后长出单克隆。挑取单克隆接种于10 ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养至对数期0D600=0.5。
(2)冰浴30 min，5000 rpm离心10 min，收集菌体。并用冰预冷的1 mmol/L的HEPES/KOH(pH7.0) 溶液重悬，并重复以上步骤2~3次。
(3)将农杆菌重悬于20 ml 预冷的10%甘油中，分装成每管100 μl预冷过的1.5 ml离心管中，液氮速冻，存于-80℃备用。
电击转化过程（冰上操作）
(1) 向含有100 μl感受态农杆菌中加入1μl质粒（约100ng），轻轻混合后冰浴1 min
(2) 转移到冰预冷的电击杯中（电击杯直径型号为1mm），电击转化。电击条件为：1.5 KV，200Ω，25 μF。
(3) 立即加入0.5 ml 不含抗生素的YEP培养基，28℃ 180 rpm，培养2~4 h。
(4) 直接取50 μl 转化后的菌液涂布于含卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2~3 d。挑取单菌落做菌落PCR验证阳性克隆。
实施例7
农杆菌介导的烟草遗传转化
本实验用到的培养基：
无菌苗培养基：MS固体培养基，pH5.8；
侵染培养基：MS液体培养基，pH5.8；
共培培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA
脱菌筛选培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+100mg/L卡那霉素+400mg/L的头孢霉素，pH5.8；
抗性苗生根培养基：MS+100 mg/卡那霉素+400mg/l的头孢霉素，pH5.8；
Figure 953301DEST_PATH_IMAGE001
烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用75%乙醇浸泡lmin，25%的安替福明(有效氯2.5%)水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次，将种子放在MS培养基中，25℃光培养，16h/8h光周期。
Figure 810398DEST_PATH_IMAGE002
烟草的农杆菌转化
Figure 504685DEST_PATH_IMAGE004
侵染菌液的制备
挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养。
Figure 218563DEST_PATH_IMAGE005
次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD600=0.6-0.9)时，将菌液倒入50ml离心管，在3500r/min，4℃下离心15min，弃上清液，收集菌体。
Figure 263879DEST_PATH_IMAGE003
用等量的MS液体培养基重悬，使OD600=0.9-1。
Figure 659088DEST_PATH_IMAGE007
外植体浸染
Figure 771663DEST_PATH_IMAGE004
将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。
Figure 859705DEST_PATH_IMAGE005
将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。
Figure 126738DEST_PATH_IMAGE008
转基因苗移栽
将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在营养土：蛭石：珍珠岩=4:5:1的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。
Figure 387955DEST_PATH_IMAGE009
转基因烟草基因组DNA的PCR检测
Figure 791255DEST_PATH_IMAGE004
CTAB法提取烟草总DNA;
Figure 50198DEST_PATH_IMAGE005
以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为P3、P4，反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，45sec；72℃，8min，30个循环。
取上述PCR产物5μl进行电泳检测，图8说明LmAPX基因已成功转入烟草。 
 序列表
<110>  天津大学
<120>  枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用
<130>  2013420
<160>  6     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  965
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(965)
<400>  1
atgggtaagt gctatcctac cgtgagcgag gagtacctca aggctgttga caaatgtaaa   60
aggaaactca gaggactcat tgctgagaag aattgtgctc ctattatgct ccgtcttgca    120
tggcactctg ctggtacgta tgatgtgtgt tccaaaactg gaggtccttt cggtaccatg     180
aggttcaaag ctgaacaagg acatggagca aacaatggtc ttgacattgc tctgagactc   240
ttggagccca ttagggagca gtttcctatc ctctcccatg ctgatttcta ccaattggct      300
ggtgtcgttg ctgttgaagt tactggagga cctgatgttc cctttcaccc tggtagagag     360
gacaagccag aaccacctgt tgaaggtcgc ttgcctgatg ccaccaaggg ctgtgaccac   420
ttgagggatg tgttcgtgaa acaaatgggc ctttctgaca aggatattgt tgcgctctct      480
ggtgcccata ccttgggaag gtgccacaag gagcggtctg gttttgaggg accttggact   540
gccaatcccc ttgtctttga caactcatac tttaaggaac ttttgagtgg tgaaaaggaa      600
gggcttctgc agttgccatc agacaaggct ctactctgtg atcccgcttt ccgtcccctt      660
gttgagaaat atgctgcgga tgaagatgcc ttctttgctg actatgccga ggctcacttg     720
aagctctgtg aattggggtt tgctgaagct taagatggtg attctgaagg gtgggagtag    780
tggcttgttt ttgtttatgt ttcacttttg aaaagctagc tggagttgtt ggattttgtc         840
ttcttttgct gctcttacat catgatataa atttggcagc tatattagac gattatattg        900
tcactctctt ccagcttaat aagtttctat ttcctttttg ataaaaaaaa aaaaaaaaaa       960
aaaaa                                                    965
<210>  2
<211>  250
<212>  PRT
<213>  人工系列
<400>  2
Met Gly Lys Cys Tyr Pro Thr Val Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Ala Val 
1              5               10               15      
Asp Lys Cys Lys Arg Lys Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Lys Asn Cys 
           20                25              30          
Ala Pro Ile Met Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp 
       35               40              45              
Val Cys Ser Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Arg Phe Lys Ala 
    50               55              60                  
Glu Gln Gly His Gly Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Leu Arg Leu 
65                70               75               80  
Leu Glu Pro Ile Arg Glu Gln Phe Pro Ile Leu Ser His Ala Asp Phe 
              85              90              95      
Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Asp 
           100             105              110         
Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Val Glu 
       115              120              125             
Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Cys Asp His Leu Arg Asp Val 
    130               135              140                 
Phe Val Lys Gln Met Gly Leu Ser Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Ser 
145              150               155             160 
Gly Ala His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu 
              165              170              175     
Gly Pro Trp Thr Ala Asn Pro Leu Val Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys 
           180              185              190         
Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp 
        195              200               205             
Lys Ala Leu Leu Cys Asp Pro Ala Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr 
    210               215              220                 
Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Leu 
225               230              235              240 
Lys Leu Cys Glu Leu Gly Phe Ala Glu Ala 
              245               250 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(18)
<400>  3
atgggtaagt gctatcct                                                   18
<210>  4
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(17)
<400>  4
gccactactc ccaccct                                                    17
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(28)
<400>  5
cgcggatcca tgggtaagtg ctatccta                                        28
<210>  6
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(29)
<400>  6
acgcgtcgac cacccttcag aatcaccat                                       29  。
序列表
<110>  天津大学
 
<120>  枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因及应用
 
<130>  2013420
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  965
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(965)
 
<400>  1
atgggtaagt gctatcctac cgtgagcgag gagtacctca aggctgttga caaatgtaaa   60
 
aggaaactca gaggactcat tgctgagaag aattgtgctc ctattatgct ccgtcttgca    120
 
tggcactctg ctggtacgta tgatgtgtgt tccaaaactg gaggtccttt cggtaccatg     180
 
aggttcaaag ctgaacaagg acatggagca aacaatggtc ttgacattgc tctgagactc   240
 
ttggagccca ttagggagca gtttcctatc ctctcccatg ctgatttcta ccaattggct      300
 
ggtgtcgttg ctgttgaagt tactggagga cctgatgttc cctttcaccc tggtagagag     360
 
gacaagccag aaccacctgt tgaaggtcgc ttgcctgatg ccaccaaggg ctgtgaccac   420
 
ttgagggatg tgttcgtgaa acaaatgggc ctttctgaca aggatattgt tgcgctctct      480
 
ggtgcccata ccttgggaag gtgccacaag gagcggtctg gttttgaggg accttggact   540
 
gccaatcccc ttgtctttga caactcatac tttaaggaac ttttgagtgg tgaaaaggaa      600
 
gggcttctgc agttgccatc agacaaggct ctactctgtg atcccgcttt ccgtcccctt      660
 
gttgagaaat atgctgcgga tgaagatgcc ttctttgctg actatgccga ggctcacttg     720
 
aagctctgtg aattggggtt tgctgaagct taagatggtg attctgaagg gtgggagtag    780
 
tggcttgttt ttgtttatgt ttcacttttg aaaagctagc tggagttgtt ggattttgtc         840
 
ttcttttgct gctcttacat catgatataa atttggcagc tatattagac gattatattg        900
 
tcactctctt ccagcttaat aagtttctat ttcctttttg ataaaaaaaa aaaaaaaaaa       960
 
aaaaa                                                    965
 
<210>  2
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<212>  PRT
<213>  人工系列
 
<400>  2
 
Met Gly Lys Cys Tyr Pro Thr Val Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Ala Val
1              5               10               15     
 
Asp Lys Cys Lys Arg Lys Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Lys Asn Cys
           20                25              30         
 
Ala Pro Ile Met Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp
       35               40              45             
 
Val Cys Ser Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Arg Phe Lys Ala
    50               55              60                 
 
Glu Gln Gly His Gly Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Leu Arg Leu
65                70               75               80 
 
Leu Glu Pro Ile Arg Glu Gln Phe Pro Ile Leu Ser His Ala Asp Phe
              85              90              95     
 
Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Asp
           100             105              110        
 
Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Val Glu
       115              120              125            
 
Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Cys Asp His Leu Arg Asp Val
    130               135              140                
 
Phe Val Lys Gln Met Gly Leu Ser Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Ser
145              150               155             160
 
Gly Ala His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu
              165              170              175    
 
Gly Pro Trp Thr Ala Asn Pro Leu Val Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys
           180              185              190        
 
Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp
        195              200               205            
 
Lys Ala Leu Leu Cys Asp Pro Ala Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr
    210               215              220                
 
Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Leu
225               230              235              240
 
Lys Leu Cys Glu Leu Gly Phe Ala Glu Ala
              245               250
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(18)
 
<400>  3
atgggtaagt gctatcct                                                   18
 
 
<210>  4
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(17)
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gccactactc ccaccct                                                    17
 
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工系列
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<221>  gene
<222>  (1)..(28)
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cgcggatcca tgggtaagtg ctatccta                                        28
 
<210>  6
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工系列
<220>
<221>  gene
<222>  (1)..(29)
<400>  6
acgcgtcgac cacccttcag aatcaccat                                       29  。
 

Claims (9)

1.一个枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因，其特征在于该基因魏SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因全序列或部分片段。
4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmAPX。
5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组载体的大肠杆菌BL21。
6.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pCAMBIA2300- LmAPX。
7.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因全序列或部分片段。
8.一种权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、烟草细胞、玉米细胞或者大豆细胞。
9.一种权利要求1所述的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因（LmAPX）的应用，其特征在于它用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。
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