EA017638B1 - Модифицированный полипептид с дикамба-монооксигеназной активностью, кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты и способы их применения - Google Patents

Abstract

В изобретении предлагается молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дикамба-монооксигеназу (DMO), которая при введении в растение обеспечивает толерантность растения к гербициду дикамба. Предлагаются конструкции, содержащие указанную молекулу нуклеиновой кислоты, полипептид с дикамба-монооксигеназной активностью, клетка, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению, культура растительной ткани, содержащая такие клетки, трансгенное растение и способ получения такого растения. В изобретении предлагается способ получения продуктов из указанного трансгенного растения, а также способ контроля роста сорняков в окружении растения, толерантного гербициду дикамба. Изобретение расширяет спектр растений, которые могут расти в условиях применения гербицидов.

Description

Настоящее изобретение относится в основном к области биотехнологии. Более конкретно, изобретение относится к модифицированным ферментам дикамба-монооксигеназы, способным придавать толерантность к гербициду дикамба в трансгенных организмах.

Описание уровня техники

Способы получения полевых сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, соя и хлопок, серьезно изменились в течение последней декады благодаря введению таких свойств, как устойчивость к воздействию насекомых и гербицидная толерантность, посредством использования методов генетической инженерии растений. Указанные изменения привели в результате к увеличению продуктивности на гектар, к уменьшению стоимости, увеличению гибкости и эффективности режимов производства, уменьшению использования пестицидов и, в случае хлопка, устойчивого к воздействию насекомых, к улучшению здоровья фермеров. Таким образом, трансгенные сельскохозяйственные культуры получили широкое распространение, и сейчас выращиваются на миллионах акрах по всему миру. Однако для продолжения конкурентоспособности трансгенных сельскохозяйственных культур на рынке требуется введение дополнительных свойств.

Хотя новые свойства, улучшающие количество и качество сельскохозяйственных и садовых культур, появились и продолжают появляться с течением времени с возрастающей скоростью, при этом существует спрос на свойства, которые улучшают способы производства пищи, корма и других продуктов. Например, в то время как в настоящий момент являются доступными трансгенные растения, толерантные к обработкам гербицидами в виде глифосфата, бромоксинила, сульфонилмочевины и другими гербицидами, существуют пробелы по части контролируемых сорняков и свойств обработок, которые могут быть переадресованы по направлению развития дополнительных сельскохозяйственных культур, толерантных к гербицидам. Более того, появление сорняков, устойчивых к гербицидам, отмеченное выше, хотя в основном локализованное и переменно возникающее, накладывает ограничения в виде необходимости дополнительных или альтернативных мер контроля сорняков.

В то время как трансгенная толерантность к гербицидам доказала ценность с коммерческой точки зрения, появилась, таким образом, необходимость того, чтобы для растений, толерантных к другим гербицидам, избегали риска повышенного доверия к любому единственному гербициду и увеличивали свойства для управления трудными для контроля видами сорняков. Особенно необходимым является развитие толерантности к гербицидам, которые безвредны для окружающей среды и одновременно высокоэффективны при контроле сорняков. Дикамба представляет собой один такой пример эффективного и безвредного для окружающей среды гербицида, который использовался фермерами в течение более 40 лет. Дикамба в особенности используется для контроля однолетних и многолетних широколистных сорняков и некоторых травянистых сорняков в сельскохозяйственных культурах кукурузы, сорго, мелких зерновых, в кормовых культурах, культурах для сена, культурах на пастбищах, в культурах сахарного тростника, спаржи, дерна и культур семенной травы (Сгор. РгоГссГюп РсГсгспсс. 1995). К сожалению, дикамба может повреждать многие коммерческие сельскохозяйственные культуры и двудольные растения, такие как соя, хлопок, горох, картофель, подсолнечник и канола, которые особенно чувствительны даже к низкому уровню гербицида. Несмотря на это дикамба представляет собой высокоэффективное средство в контроле роста сорняков и, таким образом, является важным инструментом в сельском хозяйстве.

Недавно из Рксибошопак шаНорЫйа был выделен ген, кодирующий дикамба-монооксигеназу (ΏΜΟ), которая придает толерантность к дикамбе (патент И8 № 7022896). ΏΜΟ вовлечен в превращение гербицида дикамба (3,6-дихлор-о-анисовой кислоты) в нетоксичную 3,6-дихлорсалициловую кислоту. Указанный ген описан в патенте И8 № 7022896 как обеспечивающий толерантность к дикамбе в растениях, экспрессирующих ген ΏΜΟ. Однако разработка вариантов указанного гена могла бы принести огромную пользу. Такие варианты могли бы потенциально иметь различную эффективность экспрессии при определенных условиях окружающей среды. Таким образом, может быть выбран вариант, который оптимизируется для определенной окружающей среды, для которой предназначено его использование, и может демонстрировать особенно полезные динамические черты. Вариант, который демонстрирует конкретную эффективность при различных температурах или различных условиях рН, и таким образом, может быть выбран для конкретного вида сельскохозяйственной культуры в зависимости от внутриклеточных условий и/или от ожидаемых условий роста сельскохозяйственной культуры.

Сущность изобретения

В одном аспекте в изобретении предлагается выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из: а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид из 8ЕО ΙΟ ΝΟ: 1; Ь) последовательности нуклеиновой кислоты, включающей последовательность 8ЕО Ю ΝΟ: 2; и с) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности с полипептидом 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, где полипептид

- 1 017638 обладает дикамба-монооксигеназной активностью и включает цистеин в положении, соответствующем положению 112 аминокислоты 8ЕС ГО N0: 1. В других воплощениях предлагается конструкция ДНК, включающая заявленную нуклеиновую кислоту, кодирующую ΌΜ0, функционально связанную с промотором. Промотор может быть функциональным в растительной клетке. В определенных воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей дикамба-монооксигеназу, может быть функционально связана с хлоропластным транзитным пептидом.

В другом аспекте в изобретении предлагается полипептид, последовательность которого имеет по меньшей мере 90% идентичность с 8ЕС ГО N0: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью и включает цистеин в положении, соответствующем положению 112 аминокислоты 8ЕС ГО N0: 1.

Еще в одном аспекте в изобретении предлагается клетка-хозяин, трансформированная вушеуказанной нуклеиновой кислотой по изобретению, кодирующей дикамба-монооксигеназу. В определенных воплощениях клетка-хозяин может представлять собой растительную клетку. В следующих воплощениях указанная растительная клетка может быть определена как клетка двудольного растения или клетка однодольного растения. В определенных воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку растений сои, хлопчатника, маиса или рапса.

В следующих воплощениях предлагается тканевая культура, включающая указанную трансгенную клетку.

Еще в одном воплощении в изобретении предлагается трансгенное растение и его потомство, трансформированные заявленной нуклеиновой кислотой, кодирующей дикамба-монооксигеназу. В определенных воплощениях растение может быть определено как двудольное или однодольное растение. В определенных воплощениях растение представляет собой сою, хлопчатник, маис или рапс.

Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ получения растения, толерантного к дикамбе, включающий введение в растение трансформирующей ДНК конструкции. Введение трансформирующей конструкции может быть проведено путем стабильной трансформации исходных растительных клеток и регенерации клеток в растение, толерантное к дикамбе. В другом воплощении растение, толерантное к дикамбе, может быть получено путем скрещивания родительского растения с самим собой или со вторым растением, где родительское растение и/или второе растение включают трансформирующую конструкцию, и растение, толерантное к дикамбе, наследует трансформирующую конструкцию от родительского растения и/или от второго растения.

Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ получения пищевых или кормовых продуктов, включающий: а) получение растения по изобретению или его части и Ь) приготовление продукта из растения или его части. Частью растения может являться семя. В определенных воплощениях пищевой или кормовой продукт представляют собой масло, муку, белок, зерно, крахмал или белок.

В изобретении также предлагаются способы производства волокон, лекарственных средств, нутрицевтиков и химических веществ для производственных нужд, включая биотоплива, а также любой другой продукт, выделенный из растения по изобретению.

Еще в одном аспекте в изобретении предлагается способ контроля роста сорняков, которые окружают растущее растение по изобретению или его семя, причем способ включает применение эффективного для контроля роста сорняков количества гербицида дикамба вокруг растущих растений по изобретению или его семян. В определенных воплощениях изобретения гербицид дикамба может наноситься на верхние части растений, окружающих растущую сельскохозяйственную культуру, такую как растения по изобретению. При этом применяемое количество гербицида дикамба не повреждает растение по изобретению или его семя, но повреждает растение такого же генотипа, что и указанное растение, лишенное предлагаемой по изобретению нуклеиновой кислоты, кодирующей ΌΜ0.

Краткое описание чертежей

Следующие чертежи образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять со ссылкой на один или более из этих чертежей в комбинации с подробным описанием определенных воплощений, представленных в настоящем описании.

Фиг. 1. Схема кассеты, использованной для генетической инженерии гена дикамба-монооксигеназы (0М0е) для экспрессии в высших растениях с использованием промотора ЕЫ36 из вируса хлоротической полосатости арахиса, с использованием энхансерной последовательности трансляции (лидер ТЕУ) из вируса гравировки табака и участка терминации из малой субъединицы гена РнЬБсо гороха. Другая версия гена ИМ0е, полученная с использованием генетической инженерии, содержала участок, кодирующий транзитный пептид, из малой субъединицы гена КиЬщсо гороха для локализации ΌΜ0 в хлоропластах, между энхансерным участком трансляции ТЕУ и кодирующим участком для ИМ0с.

Фиг. 2. Панели блотов ДНК, РНК и белка, демонстрирующие присутствие и экспрессию полученного с помощью генетической инженерии гена ΌΜ0 в генерации Т₁ трансгенных растений табака. Дорожки 0-У показывают образцы ДНК, мРНК и ΌΜ0, выделенные из различных генераций Т₁ трансгенных растений табака. Экстракты из нетрансгенного растения табака показаны на дорожке ^Т, в то время как дорожка Ох демонстрирует гидролизованный с помощью рестрикции продукт клонированной конст

- 2 017638 рукции гена ΌΜΟ (верхняя панель) и сверхпродуцирование в Е. со11 приблизительно 37 кДа фермента ΌΜΟ (нижняя панель). Большая субъединица приблизительно 55 кДа КиЫзсо была детектирована с помощью белкового блота путем добавления антител КиЫзсо к антисыворотке ΌΜΟ, и детектирование КиЫзео служило в качестве внутреннего стандарта для сравнения общей загрузки белка в каждую дорожку. Равные количества РНК загружали в каждую дорожку, что оценивали с помощью окрашивания этидиум бромидом дубликата геля. Стрелки указывают локализацию полосы ДНК, мРНК или белка, соответствующей ΌΜΟ.

Фиг. 3. Эффект обработки с помощью дикамбы в количестве 2,2 кг/га двух Τι растений табака, одно содержало полученный с помощью генетической инженерии ген ΌΜΟ^ лишенный последовательности, кодирующей хлоропластный транзитный пептид (справа), и другое было лишено гена Э^НОс (второе справа). Трансгенное растение справа проявило слабое, если это вообще имело место, повреждение, вызванное от обработки с помощью дикамбы. Два растения слева не были подвержены обработке с помощью дикамбы и представляют собой нетрансгенное растение (слева) и трансгенное растение, содержащее ген Э^НОс (второе слева).

Фиг. 4. Образование ЭС8Л против времени с помощью ΌΜΟ^.

Фиг. 5. Определение оптимального анализа рН для ΌΜΟ^.

Фиг. 6. Определение оптимального анализа температуры для ΌΜΟ^.

Фиг. 7. Определение оптимального значения рН для ΌΜΟ^

Фиг. 8. Определение оптимального значения температуры для ΌΜΟ^

Фиг. 9. Суммирование оптимальных температурных и рН условий для ^ΜΟс и ΌΜΟ^.

Фиг. 10. Кинетика устойчивого состояния для ΌΜΟ^.

Фиг. 11. Кинетика устойчивого состояния для ΌΜΟ^

Фиг. 12. Эффекты предварительной инкубации ^ΜΟс в течение 45 мин при 30°С в растворе 50 мМ ΤΚΙ8 рН 7,5 и 100 мМ КР1 рН 7,0.

Фиг. 13. ^ΜΟс-анализы с ферментом проводили в течение одной недели и хранили при 4°С в буфере ΤΚΙ8 (два анализа слева; анализы перед хранением и после хранения соответственно) и в буфере КР1 (два анализа справа; анализы перед хранением и после хранения соответственно).

Фиг. 14. Конструкция гена дикамба-монооксигеназы, полученная с помощью генетической инженерии для гомологичной рекомбинации и экспрессии в хлоропластах табака.

Фиг. 15. Демонстрация гомопластидного статуса хлоропластного генома трансгенных линий табака, трансформированных геном ΌΜΟ, сконструированным для гомологичной рекомбинации и экспрессии в хлоропластах табака. На левой панели показана конструкция для интеграции ΌΜΟ в хлоропласты путем гомологичной рекомбинации (как показано на фиг. 14). Полоса выше левой обозначенной последовательности указывает фрагмент ДНК, амплифицированный для получения меченного дигоксигенином гибридизационного зонда. На панелях справа показаны ДНК-блоты: дорожка 1 содержит маркеры по размеру. Дорожка 2 содержит ДНК из нетрансгенных растений табака. Дорожки 3-11 содержат ДНК, выделенную из трансгенных растений сразу после первого раунда селекции и регенерации в присутствии спектиномицина (верхняя панель) и после нескольких раундов селекции и регенерации, когда получают очевидную гомопластидность хлоропластного генома (нижняя панель). ДНК для ДНК-блот анализов выделяли из трансгенных и нетрансгенных растений и подвергали рестриктному гидролизу ферментом ВатН I перед разделением с помощью электрофореза и гибридизацией ДНК-блота с меченым фрагментом ДНК, комплементарным левой последовательности-мишени трансформирующего вектора с хлоропластным геномом (то есть гибридизационным зондом, меченным дигоксигенином). 5,6-т.п.о. фрагмент ДНК соответствует фрагменту ДНК хлоропластов, содержащему ген ΌΜΟ, и 3,3-т.п.о. фрагмент ДНК соответствует гомологичному нативному фрагменту ДНК хлоропластов, лишенному вставленной конструкции гена ΌΜΟ.

Фиг. 16. Τ1 генерация гомопластидных растений табака, содержащих кодируемый в хлоропластах ген дикамба-монооксигеназы, обработанных с помощью дикамбы на уровне 28 кг/га (растения 1 и 2 и растения 3 и 4 были выделены из двух независимо трансформированных Я₀ растений.)

Фиг. 17. Экспрессия ΌΜΟ, чувствительность и устойчивость к обработке с помощью дикамбы в нетрансгенных и трансгенных растениях табака, содержащих ген ΌΜΟ в хлоропластном геноме. Белковый блот гибридизовали с ΌΜΟ-антителами: дорожка 1 содержит очищенный белок ΌΜΟ. Дорожка 2 является пустой и дорожка 3 содержит белковые экстракты из нетрансгенных растений табака. Дорожки 4 и 8 содержат белки, выделенные из ложноположительных растений табака, демонстрирующие устойчивость к антибиотикам во время селекции на спектиномицине, но лишенные интактного гена ΌΜΟ. Дорожки 5-7 содержат экстракты трансгенных растений, экспрессирующих ΌΜΟ, кодируемый геном ΌΜΟ, интегрированным в хлоропластный геном. 8 представляет собой растения, чувствительные к дикамбе при 0,56 кг/га; Я представляет собой растения, устойчивые к дикамбе при 0,56 кг/га. Почти равные количества экстрактов загружали в дорожки 4-8, что оценивали по количеству большой субъединицы белка КиЫзсо, который детектировался с помощью ЯиЫзсо-антител, в то время как значительно большее количество белка из нетрансгенных растений загружали в дорожку 3. Стрелками указано положение белка ΌΜΟ.

- 3 017638

Фиг. 18. Сравнение участка полипептидной последовательности ΌΜ0 дикого типа с консервативными участками других железосерных оксигеназ, показывающее, что ΌΜΘ является уникальным с низкой степенью идентичности с известными ферментами, но XV112 (стрелка) является консервативным в других железосерных оксигеназах, и граничит с двумя консервативными доменами, Кзезке негеминового Ее (8ЕС ГО N0: 4-23).

Подробное описание изобретения

В изобретении предлагаются варианты дикамба-монооксигеназы (ΌΜ0), включающие цистеин в положении, соответствующем положению 112 в ΌΜ0, показанные в 8ЕС ГО N0: 1, обозначенные в настоящем описании как ΌΜ0ο. Было продемонстрировано, что с помощью ΌΜ0ο получают высокий уровень толерантности к гербициду дикамба при экспрессии в трансгенных растениях. Результаты оказались неожиданными, поскольку другое положение аминокислоты является высококонсервативным в других железосерных оксигеназах. Из 78 проанализированных последовательностей железосерных оксигеназ из 45 образцов все из 52 последовательностей оксигеназ с идентичностью, составляющей по меньшей мере 15%, содержали аминокислоту V в положении, соответствующем положению аминокислоты 112 из 8ЕС ГО N0: 1, несмотря на то, что наибольшая идентичность составляла только 38%. Указанное положение также граничит с двумя консервативными функциональными доменами (фиг. 18). Поэтому высокий уровень толерантности к гербициду, полученный с помощью ΌΜ0ο, оказался неожиданным.

Анализ параметров Михаэлиса-Ментена для ΌΜ0ο по отношению к неизмененной последовательности (ΌΜ0^; патент И8 № 7022896) обнаружил, что ферменты отличались по части каталитических эффективностей: ΌΜ0ο был в пять раз более эффективней, чем ΌΜ0^, и, по-видимому, ΌΜ0ο обладает более высоким порядком обновления и более тесным связыванием с субстратом. Кроме того, ΌΜ0ο функционировал лучше при условиях, соответствующих более низким значениям рН и более высоким температурам по отношению к нативному. Полученные результаты указывают на потенциал для селекции 01^0-8314134308 для использования в конкретном трансгенном растении на основе ожидаемых условий использования, таких как условия растущей сельскохозяйственной культуры. Таким образом, один аспект изобретения включает идентификацию окружения растущей сельскохозяйственной культуры, по меньшей мере, для первого вида сельскохозяйственной культуры и идентификацию фермента ΌΜ0, наиболее подходящего для указанного окружения на основе динамики, например ΌΜ0ο и ΌΜ0^. Например, специалист в данной области может в конкретных воплощениях выбрать последовательность, кодирующую ΌΜ0ο, для использования в растениях, представляющих условия, соответствующие более низким значениям рН в растении, и/или в случае роста в условиях с более высокими температурами по отношению к другим видам растений или условиям роста соответственно. Дикамба может применяться путем введения в почву (предпосевное введение), путем орошения почвы (довсходовое введение) и путем обработки всходов (послевсходовая обработка), в то время как уровень толерантности к дикамбе может отличаться в различное время в течение роста растения.

Как указано выше, толерантность к экстремально высокому уровню гербицида дикамба была получена в трансгенных растениях, экспрессирующих ΌΜ0ο. В случае растения табака, например, которое обычно является чувствительным даже к очень низкому уровню дикамбы, были сконструированы трансгенные растения, экспрессирующие ΌΜ0ο, которые были толерантны к обработке с помощью дикамбы в количестве 5,6 кг/га или выше, например в 10-20 раз выше, чем обычная рекомендованная полевая доза для контроля широколистных сорняков. Когда ген ΌΜ0ο был вставлен в хлоропластный геном растений табака, получили толерантность к дикамбе, составляющую по меньшей мере 2,8 кг/га. Также были сконструированы трансгенные растения сои, томата и АгаЫбор818 (йаНапа, несущие кодируемый в ядре ген ΌΜ0ο, и обнаружили толерантность к высокому уровню дикамбы. Например, в результате вставки ΌΜ0ο в ядерный геном растений сои получают толерантность к обработкам в количестве 2,8 кг/га, таким образом разрешая использование дикамбы для контроля сорняков в полях с растениями, экспрессирующими ΌΜ0ο.

Таким образом, было продемонстрировано, что ΌΜ0ο является эффективным в придании толерантности к дикамбе без необходимости дополнительных кодирующих последовательностей, таких как ферредоксина или редуктазы из Р. шаЙорйШа, штамма ΌΙ-6. Модифицированный ген ΌΜ0 наследовался стабильно согласно правилу Менделя без видимой потери пенетрантности или экспрессии. В то время как получали чуть более высокий уровень экспрессии растений с хлоропластным транзитным пептидом, трансгенные растения с ΌΜ0, лишенные последовательности, кодирующей хлоропластный транзитный пептид, также демонстрировали высокий уровень послевсходовой толерантности к дикамбе.

А. Нуклеиновые кислоты и рекомбинантные конструкции.

1. Дикамба-монооксигеназа (ΌΜ0).

В одном воплощении настоящего изобретения предлагаются конструкции ДНК, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид дикамба-монооксигеназы, включающий цистеин в положении, соответствующем положению 112 из 8ЕС ГО N0: 1. Типичная последовательность, кодирующая ΌΜ0, предлагается в настоящем описании в виде 8ЕС ГО N0: 2. Указанная последовательность дополнительно к включению цистеина в положении 112 из 8ЕС ГО N0: 1 включает дополнительный кодон ССС (аланин), следующий за старт-кодоном АТС, с добавлением сайта рестрикции N00 I по отношению

- 4 017638 к нативной кодирующей последовательности, что облегчает клонирование. Таким образом, полипептид в 8ЕО ГО N0: 1 также включает дополнительный остаток А1а, следующий непосредственно за Ме1, кодируемым старт-кодоном. Последовательность транзитного пептида вырезали из плазмиды с помощью Вд1 II и ЕсоК I и затем клонировали по сайтам ВатН I и ЕсоВ I в вектор рВ1иекспр1 II К8+. Указанную конструкцию использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с праймерами, с помощью которых добавляли сайты рестрикции Уо I к каждому концу последовательности, кодирующей транзитный пептид. Гидролиз ПЦР-продукта с помощью Уо I давал возможность вставки последовательности, кодирующей транзитный пептид в сайт инициирующего кодона АТС модифицированного гена ΌΜ0.

Таким образом, в одном воплощении изобретения предлагаются последовательности, кодирующие полипептид из 8ЕЦ ГО N0: 1, включая, но не ограничиваясь, 8ЕЦ ГО N0: 2. Как хорошо известно из уровня техники, гомологичные последовательности и производные указанных последовательностей могут быть легко получены и использованы. Например, может быть использована нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид ΌΜ0, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности с полипептидом ЭМ0с из 8ЕЦ ГО N0: 1, включая по меньшей мере приблизительно 92, 94-99% или более идентичности с такой последовательностью. Также может использоваться нуклеиновая кислота, которая демонстрирует по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в виде 8ЕЦ ГО N0: 2, включая по меньшей мере приблизительно 92, 94-99% или более идентичности с такой последовательностью, и которая кодирует ΌΜ0, включающий цистеин в положении 112. В одном воплощении идентичность последовательности определяют с использованием пакета программного обеспечения Анализа Последовательности из пакета ССС ХУЕсопκΐη (Ассе1тук, 8ап О|едо. СА), МЕСАйдп (ЭУА81аг. Ею.. 1228 8. Рагк 81.. Майкоп, ХУУ 53715) со стандартными параметрами. Указанная программа выбирает подобные последовательности путем оценки степени подобия или идентичности.

Полинуклеотидная молекула, которая экспрессирует полипептид ΌΜ0, может быть получена с помощью методов, хорошо известных из уровня техники, принимая во внимание настоящее описание. Варианты ΌΜ0, представленные в настоящем описании, способные к деградации декамбы, можно, таким образом, получить и оценить на предмет активности согласно описанной в настоящем описании методологии. Такие последовательности также могут быть идентифицированы, например, из подходящих организмов, включая бактерии, которые подвергают деградации дикамбу (патент И8 № 5445962; Кгиедег е1 а1., 1989; Согк апб Кгиедег, 1991; Согк апб КйаШ, 1995). Один способ выделения клонированной последовательности ΌΜ0 представляет собой гибридизацию нуклеиновой кислоты, например, с библиотекой, сконструированной на основе организма-источника, или способ на основе РТ-ПЦР с использованием мРНК из организма-источника и праймеров на основе описанной последовательности ΌΜ0. Таким образом, изобретение охватывает использование гибридизации нуклеиновых кислот при жестких условиях с описанной в настоящем описании последовательностью, кодирующей ΌΜ0. Специалисту в данной области понятно, что условия могут быть заменены на менее жесткие путем увеличения концентрации соли и уменьшения температуры. Таким образом, условиями гибридизации легко манипулировать, и, таким образом, указанные условия, как правило, представляют собой метод выбора в зависимости от желаемых результатов. Примером условий высокой жесткости является 5Х 88С, 50% формамид и 42°С. При проведении отмывки при указанных условиях, например, в течение 10 мин, те последовательности, что не загибридизовались с конкретной последовательностью-мишенью при указанных условиях, могут быть удалены. Таким образом, одно воплощение изобретения включает применение нуклеиновой кислоты, кодирующей ΌΜ0, которую определяют как последовательность, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой согласно 8Е0 ГО N0: 2 при условиях отмывки в 5Х 88С, 50% формамиде и при 42°С в течение 10 мин.

Варианты также могут быть химически синтезированы с использованием полинуклеотидных последовательностей ΌΜ0, описанных в настоящем описании, согласно методам, хорошо известным из уровня техники. Например, последовательности ДНК могут быть синтезированы с помощью химии фосфоамидитов в автоматическом ДНК-синтезаторе. Химический синтез имеет ряд преимуществ. В частности, химический синтез является желательным, поскольку кодоны, предпочтительные для организмахозяина, в котором последовательность ДНК будет экспрессироваться, могут быть использованы для оптимизации экспрессии. Пример указанной последовательности, которая оптимизируется для экспрессии в двудольных растениях с использованием кодонов, используемых в АгаЫборк15 Лайапа, представляет собой последовательность ΌΜ0, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 3. Полипептид с предсказанными аминокислотами А1а, Тйт, Сук в положениях 2, 3, 112 соответственно представлен в 8ЕЦ ГО N0: 1. Остаток А1а в положении 2 был добавлен по отношению к дикому типу ΌΜ0 в результате вставки кодона для аланина непосредственно после инициирующего кодона АТС для облегчения создания векторной конструкции, как объяснено ниже.

Нет необходимости изменять все кодоны для получения улучшенной экспрессии, но предпочтительно изменять, по меньшей мере, кодоны, редкие в использовании в организме-хозяине, на кодоны, предпочтительные для организма-хозяина, например на кодоны, более часто используемые в организмехозяине и которые, как правило, более легко транслируются, чем редкие, непредпочтительные кодоны.

- 5 017638

Высокий уровень экспрессии может быть получен путем изменения более приблизительно 50% непредпочтительных кодонов, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% непредпочтительных кодонов на кодоны, предпочтительные для организма-хозяина. Предпочтительные кодоны большинства клеток-хозяев являются известными (РСТ \УО 97/31115; РСТ \УО 97/11086; ЕР 646643; ЕР 553494 и патенты И8 №№ 5689052; 5567862; 5567600; 5552299 и 5017 692). Предпочтительные кодоны других клеток-хозяев могут быть установлены с помощью методов, известных из уровня техники. Также, при использовании химического синтеза последовательность молекулы ДНК или ее кодируемый белок могут быть легко изменены, например, для оптимизации экспрессии (например, исключение вторичных структур мРНК, которые препятствуют транскрипции или трансляции), могут быть добавлены уникальные сайты рестрикции в подходящих положениях и могут быть делетированы сайты расщепления протеазами.

Модификация и изменения могут быть произведены с сохранением ферментативной активности с полипептидной последовательностью белка, такой как последовательности ΌΜΟ, представленные в настоящем описании. Дальнейшее представляет собой обсуждение, в основе которого лежит изменение аминокислот белка с созданием эквивалентного или даже улучшенного модифицированного полипептида и соответствующих кодирующих последовательностей. В конкретных воплощениях изобретения последовательности ΌΜΟ могут быть изменены таким образом и применены в способах по изобретению. Аминокислотные изменения могут быть достигнуты путем изменения кодонов последовательности ДНК.

Известно, например, что определенные аминокислоты могут быть заменены на другие аминокислоты в белковой структуре без заметной потери способности интерактивного связывания с такими структурами, как сайты связывания на молекулах субстрата. Благодаря указанной интерактивной способности и природе белка, которая определяет биологическую функциональную активность указанного белка, в белковой последовательности могут быть произведены определенные замены аминокислотных последовательностей, и, конечно, в соответствующей последовательности кодирующей ДНК, и, тем не менее, будет получен белок с подобными свойствами. Таким образом, предполагается, что в описанных в настоящем описании пептидных последовательностях ΌΜΟ и в соответствующих последовательностях кодирующей ДНК могут быть произведены разнообразные изменения без заметной потери их биологического применения или активности.

При осуществлении указанных изменений может учитываться гидропатический индекс аминокислот. Важность гидропатического индекса аминокислот в придании белку интерактивной биологической функции, как правило, понятна из уровня техники (Ку1е с1 а1., 1982). Считается, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру получаемого в результате белка, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и с подобными. Каждую аминокислоту оценивали на основе характеристик ее гидрофобности и заряда на предмет гидропатического индекса (Ку1е е1 а1., 1982), который составляет: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

Из уровня техники известно, что аминокислоты могут быть заменены на другие аминокислоты, имеющие подобный гидропатический индекс или коэффициент, и все равно приводят в результате к получению белка с подобной биологической активностью, т.е. к получению биологически функционального эквивалентного белка. При осуществлении таких изменений является предпочтительной замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют ±2, особенно предпочтительной является замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют ±1, и наиболее предпочтительной является замена аминокислот, чьи гидропатические индексы составляют ±0,5. В данном случае наблюдение того, что ΌΜΟ, имеющий замену триптофана в положении 112 на цистеин, обладает биологической активностью и приводит к получению в результате растений, толерантных к высокому уровню дикамбы, оказалось неожиданным, представляя различные гидропатические индексы между нативными и измененными аминокислотами, и таким образом, не использовалось специалистами в данной области для создания функциональных вариантов согласно известному уровню техники.

Из уровня техники понятно, что замена подобных аминокислот может быть эффективно осуществлена на основе гидрофильности. Патент И8 № 4554101 устанавливает, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, на которую влияет гидрофильность его соседних аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка. Как подробно описано в И8 патенте 4554101, для остатков аминокислот были определены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Понятно, что аминокислота может быть заменена на другую аминокислоту, имеющую подобное значение гидрофильности, и все равно будет получен биологически эквивалентный белок. При таких изменениях является предпочтительной за

- 6 017638 мена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют ±2, особенно предпочтительной является замена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют ±1 и наиболее предпочтительной является замена аминокислот, чьи значения гидрофильности составляют ±0,5. Типичные замены, которые принимают во внимание указанные и другие из вышеупомянутых характеристик, хорошо известны специалисту в данной области из уровня техники и включают аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; валин, лейцин и изолейцин. Кроме того, активность ΌΜΘε была неожиданной, представляя сильно отличающиеся гидрофильные значения между измененными и нативными аминокислотами, и указанная замена не использовалась специалистами в данной области для создания функциональных вариантов согласно известному уровню техники.

Модификация последовательности ΌΜΘ согласно изобретению может проводиться с рассмотрением консервативных доменов внутри фермента. Например, ниже демонстрируется, что фермент ΌΜΘ содержит функциональные домены, такие как железосерный кластер К1екке и сайт связывания для свободного железа (см., например, фиг. 18). Таким образом, указанная информация, объединенная со знанием из уровня техники, рассматривающим функциональные домены и модификацию белков, как правило, может использоваться в рамках настоящего изобретения для получения модифицированных ферментов ΌΜ0, тем не менее сохраняющих ферментативную активность (см., например, Макоп аиб Саттаск, 1992; Лаид е! а1., 1996).

2. Трансформирующие конструкции.

Полинуклеотид, кодирующий ΌΜΘ, применяемый согласно изобретению, обычно вводится в клетку в виде конструкции, включающей элементы контроля экспрессии, необходимые для контроля экспрессии. Методы функционального связывания элементов контроля экспрессии с кодирующими последовательностями хорошо известны из уровня техники е! а1., 1982; ЗатЬгоок е! а1., 1989). Последовательности контроля экспрессии представляют собой последовательности ДНК, вовлеченные любым способом в контроль транскрипции. Подходящие последовательности контроля экспрессии и методы их использования хорошо известны из уровня техники. Промотор, в частности, может использоваться вместе или в отсутствие энхансерных элементов, 5'-нетранслируемого участка, транзитного или сигнального пептидов для направления белка или продукта РНК в органеллу растения, в частности в хлоропласты, и З'-нетранслируемые участки, такие как сайты полиаденилирования. Специалисту в данной области будет известно, что разнообразные энхансеры, промоторы, интроны, транзитные пептиды, последовательности направления сигнала и 5'- и З'-нетранслируемые участки (ϋΤΡ) используются в дизайне эффективных векторов для экспрессии в растениях, таких как те, что описаны, например, в патентной заявке ИЗ 2003/01403641.

Промоторы, подходящие для настоящего и других применений, хорошо известны из уровня техники. Примеры, описывающие такие промоторы, включают патент И8 № 6437217 (промотор К.881 маиса), патент И8 № 5641876 (промотор актина риса), патент И8 № 6426446 (промотор КЗ324 маиса), патент И8 № 6429362 (промотор РК-1 маиса), патент И8 № 6232526 (промотор А3 маиса), патент И8 № 6177611 (конститутивные промоторы маиса), патенты И8 №№ 5322938, 5352605, 5359142 и 5530196 (промотор 358), патент И8 № 6433252 (промотор Ь3 олеозина маиса), патент И8 № 6429357 (промотор актина 2 риса, а также интрон актина 2 риса), патент И8 № 5837848 (промотор, специфичный для корня), патент ИЗ № 6294714 (промоторы, индуцируемые светом), патент ИЗ № 6140078 (промоторы, индуцируемые солью), патент ИЗ № 6252138 (промоторы, индуцируемые патогеном), патент ИЗ № 6175060 (промоторы, индуцируемые дефицитом фосфора), патент ИЗ № 6635806 (промотор гамма-коиксина) и патентную заявку ИЗ с серийным № 09/757089 (промотор альдолазы хлоропластов маиса). Дополнительные промоторы, которые могут найти свое применение, представляют собой промотор нопалин-синтазы (ЫОЗ) (ЕЬег! е! а1., 1987), промотор октопин-синтазы (ОСЗ) (который переносится на плазмидах, индуцирующих опухоль, из АдтоЬас!етшт ШтеЕашепк), промоторы колимовируса, такие как промотор 19З вируса мозаики цветной капусты (СаΜV) (Ьа^!оп е! а1., 1987), промотор 35З СаΜV (Обе11 е! а1., 1985), промотор 35З вируса мозаики норичника (\Уа1кег е! а1., 1987), промотор синтазы сахарозы (Уапд е! а1., 1990), промотор комплекса гена К (Сйапб1ет е! а1., 1989) и промотор гена, кодирующего белок связывания с хлорофиллом а/Ь, и т.д.

Особенно полезными для применения в настоящем изобретении могут быть промоторы СаΜV35З (патенты ИЗ №№ 5322938; 5352605; 5359142 и 5530196), ΕΜV35З (патенты ИЗ №№ 6051753; 5378619), промотор РС1ЗУ (например, патент ИЗ № 5850019 и ЗЕО ΙΌ N0: 24) и промоторы АСКЮ.пок (ОепБапк Ассеккюп У00087; Оерюкег е! а1., 1982; Веуап е! а1., 1983).

Может быть получена польза при экспрессии гетерологичных генов с использованием последовательности, кодирующей транзитный пептид. Транзитные пептиды, как правило, относятся к пептидным молекулам, которые при связывании с интересующим белком направляют белок в конкретную ткань, клетку, субклеточную локализацию или клеточную органеллу. Примеры включают, но не ограничены ими, хлоропластные транзитные пептиды, сигналы ядерной локализации и вакуольные сигналы. Хлоропластный транзитный пептид, в частности, применяется в настоящем изобретении для направления экспрессии фермента ΌΜ0 в хлоропластах. Ожидается, что функция ΌΜ0 будет облегчена эндогенными

- 7 017638 редуктазами и ферредоксинами, обнаруженными в растительной клетке, для деградации дикамбы. Хлоропласты растения особенно богаты редуктазами и ферредоксинами. Соответственно в предпочтительном воплощении для получения трансгенных растений, толерантных к дикамбе, может применяться последовательность, кодирующая пептид, которая будет направлять оксигеназу, деградирующую дикамбу, в хлоропласты. Альтернативно или дополнительно, гетерологичная редуктаза и/или ферредоксин также могут экспрессироваться в клетке.

ДНК, кодирующая последовательность, направляющую в хлоропласты, может предпочтительно располагаться выше (5') последовательности, кодирующей ΌΜ0, но может также располагаться ниже (3') кодирующей последовательности, или одновременно выше и ниже кодирующей последовательности. Хлоропластный транзитный пептид (СТР), в частности, может быть сконструирован для сшивки с Νконцом белков, которые должны быть направлены в хлоропласты растения.

Большинство белков с локализацией в хлоропластах экспрессируются из ядерных генов в виде предшественников и направляются в хлоропласты с помощью СТР, который удаляется во время стадий импорта. Примеры хлоропластных белков включают малую субъединицу (КЬс82) рибулоза-1,5-бифосфат карбоксилазы, ферредоксин, оксидоредуктазу ферредоксина, светособирающий комплексный белок I и белок II и тиоредоксин Р. Было продемонстрировано ίη νίνο и ίη νίΐτο, что нехлоропластные белки могут направляться в хлоропласты путем использования белковых сшивок с СТР и что СТР является достаточным для направления белка в хлоропласты. Например, было показано, что введение подходящего транзитного пептида, такого как АгаЬ1борз1з (ПаПапа ЕР8Р8 СТР (К1ее с1 а1., 1987) и Ребиша НуЬпба ЕР8Р8 СТР (бе11а-Сюрра е( а1., 1986), направляет гетерологичные последовательности белка ЕР8Р8 в хлоропласты в трансгенных растениях. Другие типичные последовательности для направления в хлоропласты включают сигнальную последовательность саЬ-т7 маиса (Вескег е( а1., 1992; РСТ XVО 97/41228) и сигнальную последовательность глутатион-редуктазы гороха (Сге1ззеп е( а1., 1991; РСТ νθ 97/41228). В настоящем изобретении могут быть особенно полезными А1РЬс84 (СТР1; патент И8 № 5728925), Аб8ПкС (СТР2; К1ее е( а1., 1987), Αΐ81ι1<ΟΖιη (СТР2-синтетический; смотрите 8ЕС ΙΌ N0: 14 из ν004009761) и РзКЬс8 (Τ’οΓίιζζί е( а1., 1984), например, в отношении экспрессии полипептида ΌΜ0.

Последовательность 5'-иТК, которая функционирует в качестве лидерной последовательности трансляции, представляет собой генетический элемент ДНК, локализованный между промоторной последовательностью гена и кодирующей последовательностью. Лидерная последовательность трансляции присутствует в полностью процессированной мРНК выше последовательности старта трансляции. Лидерная последовательность трансляции может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК, на стабильность мРНК или эффективность трансляции. Примеры лидерных последовательностей трансляции включают среди прочих лидеры белка теплового шока маиса и петуньи (патент И8 № 5362865), лидеры белка оболочки растительных вирусов, лидеры растительных вирусов гиЫзсо (Тигпег апб Розбег, 1995). В настоящем изобретении последовательности 5'-иТК, которые, в частности, обнаружили полезное применение, представляют собой СтНзр (патент И8 № 5659122), РПОпаК (патент И8 № 5362865), ΑΐΑηΐ1, ТЕУ (Сатпдбоп апб Ргееб, 1990) и АСКбипоз (СепВапк Ассеззюп У00087; Веνаη еб а1., 1983).

З'-нетранслируемая последовательность, 3'-участок терминации транскрипции или участок полиаденилирования относятся к молекулам ДНК, связанным с кодирующим участком и локализованным ниже кодирующего участка гена, и включают полинуклеотиды, которые обеспечивают сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования функционирует в растениях с целью вызвать вставку полиаденилатных последовательностей к 3'-концу предшественника мРНК. Последовательность полиаденилирования может быть выделена из природного гена, из множества растительных генов или из генов Т-ДНК. Примером 3'-участка терминации транскрипции является 3'-участок нопалин-синтазы (поз 3'; Рга1еу еб а1., 1983). Использование различных нетранслируемых 3'-участков было описано (1пде1Ьгесйб еб а1., 1989). Молекулы полиаденилирования из гена КЬс82 Р1зит забути (Рз.КЬс82-Е9; С’оп.^1 еб а1., 1984) и АСКби.поз (Ко]1уаа еб а1., 1987, СепЬапк Ассеззюп Е01312) могут иметь конкретное полезное применение в изобретении.

Единица экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующего ΌΜ0, может быть связана со второй полинуклеотидной молекулой в единице экспрессии, содержащей генетические элементы для способного к детекции/количественному определению маркера или для гена, придающего желаемое свойство. Обычно используемые гены для скрининга предположительно трансформированных клеток включают βглюкуронидазу (СИ8), β-галактозидазу, люциферазу и хлорамфеникол ацетилтрасферазу (беГГегзоп. 1987; Тееп еб а1., 1989; Копсж еб а1., 1987; Эе В1оск еб а1., 1984), зеленый флуоресцентный белок (СРР) (Сйа1Пе еб а1., 1994; Назе1оГГ еб а1., 1995 и РСТ заявка АО 97/41228).

Вторая полинуклеотидная молекула может включать, но не ограничена им, ген, который действует в качестве маркера селекции. Второй или дополнительный ген может обеспечивать желаемую характеристику, ассоциированную с растительной морфологией, физиологией, ростом и развитием, урожаем, усилением питания, устойчивостью к заболеваниям или вредителям либо толерантностью к окружающей среде или к химическим веществам, и может включать генетические элементы, включающие устойчи

- 8 017638 вость к гербицидам (патенты И8 №№ 6803501; 6448476; 6248876; 6225114; 6107549; 5866775; 5804425; 5633435; 5463175), увеличивающие урожай (патенты И8 №№ КЕ38446; 6716474; 6663906; 6476295; 6441277; 6423828; 6399330; 6372211; 6235971; 6222098; 5716837), элементы контроля насекомых (патенты И8 №№ 6809078; 6713063; 6686452; 6657046; 6645497; 6642030; 6639054; 6620988; 6468523; 6326351; 6313378; 6284949; 6281016; 6248536; 6242241; 6221649; 6177615; 6156573; 6153814; 6110464; 6093695; 5959091; 5942664; 5942658, 5880275; 5763245; 5763241), элементы устойчивости к грибковым заболеваниям (патенты И8 №№ 6653280; 6573361; 6506962; 6316407; 6215048; 5516671; 5773696; 6121436; 6316407; 6506962), элементы устойчивости к вирусам (патенты И8 №№ 6617496; 6608241; 6015940; 6013864; 5850023; 5304730), элементы устойчивости к нематодам (патент И8 № 6228992), элементы устойчивости к бактериальным заболеваниям (патент И8 № 5516671), элементы роста и развития растения (патенты И8 №№ 6723897; 6518488), элементы для получения крахмала (патенты И8 №№ 6538181; 6538179; 6538178; 5750876; 6476295), элементы для получения модифицированных масел (патенты И8 №№ 6444876; 6426447; 6380462), элементы для получения продуктов с высоким содержанием масла (патенты И8 №№ 6495739; 5608149; 6483008; 6476295), элементы содержания модифицированных жирных кислот (патенты И8 №№ 6828475; 6822141; 6770465; 6706950; 6660849; 6596538; 6589767; 6537750; 6489461; 6459018), элементы для получения продуктов с высоким содержанием белка (патент И8 № 6380466), элементы для созревания плодов (патент И8 № 5512466), элементы для усиления питания животных и человека (патенты И8 №№ 6723837; 6653530; 6541259; 5985605; 6171640), элементы для биополимеров (патенты И8 №№ КЕ37543; 6228623; 5958745 и И8 патентная публикация № И820030028917), элементы для устойчивости к стрессу окружающей среды (патент И8 № 6072103), элементы для лекарственных пептидов и секретируемых пептидов (патенты И8 №№ 6812379; 6774283; 6140075; 6080560), элементы для улучшения свойств процессинга (патент И8 № 6476295), элементы для улучшения гидролизуемости (патент И8 № 6531648), элементы для низкого содержания рафинозы (патент И8 № 6166292), элементы для промышленного получения фермента (патент И8 № 5543576), элементы для улучшения вкуса (патент И8 № 6011199), элементы для фиксации азота (патент И8 № 5229114), элементы для получения гибридных семян (патент И8 № 5689041), элементы для получения волокна (патент И8 № 6576818; 6271443; 5981834; 5869720) и элементы для получения биотоплива (патент И8 № 5998700).

Любые из указанных и другие генетические элементы, методы и трансгены могут использоваться в изобретении, а также приниматься во внимание специалистами в данной области с точки зрения настоящего описания. Единица экспрессии может быть представлена в виде Т-ДНК между участками правой границы (КВ) и левой границы (ЬВ) первой плазмиды вместе со второй плазмидой, несущей трансферные и интеграционные функции для Т-ДНК в АдгоЬас1етшт. Конструкции также могут содержать остов плазмидных ДНК сегментов, которые обеспечивают репликативную функцию и селекцию с помощью антибиотика в бактериальных клетках, например точку начала репликации из ЕксйепсЫа со11, такую как ОГ1322, точку начала репликации для широкого предела организмов-хозяев, такую как опУ или οηΚί, и кодирующий участок для маркера селекции, такого как 8рес/81гр. который кодирует Тп7 аминогликозид аденилтрансферазу (аабА), придающую устойчивость к спектиномицину или стрептомицину, или ген маркера селекции гентамицина (Ст, СеШ). Для трансформации растений штамм бактерий-хозяев часто представляет собой АдгоЬас1етшт ШтеГааещ АВ1, С58 или ЬВА4404. Однако другие штаммы, известные специалисту в данной области трансформации растений, могут функционировать в настоящем изобретении.

3. Получение трансгенных клеток.

Получения трансформированных растительных клеток можно достичь с помощью любого из методов, известных из уровня техники для введения трансгенов в клетки (см., например, публикацию М1к1 е1 а1., 1993). Полагают, что примеры таких методов практически включают любой метод, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку. Методы, которые были описаны, включают электропорацию, как иллюстрируется в патенте И8 № 5384253; бомбардировку микрочастицами, как иллюстрируется в патентах И8 №№ 5015580; 5550318; 5538880; 6160208; 6399861 и 6403865; трансформацию, опосредованную АдгоЬас1етшт, как иллюстрируется в патентах И8 №№ 5635055; 5824877; 5591616; 5981840 и 6384301; и трансформацию протопластов, как иллюстрируется в патенте И8 № 5508184. Посредством применения методов, таких как указанные, клетки практически любого вида растения могут быть стабильно трансформированы и селектированы согласно изобретению, и указанные клетки развиваются в трансгенные растения.

Наиболее широко применяемый метод введения экспрессирующего вектора в растения основан на природной системе трансформации из АдтоЬас1егшт (например, Ногасй е1 а1., 1985). А. 1итеГааеп8 и А. г1иходепе5 представляют собой патогенные почвенные бактерии, которые генетически трансформируют растения. Плазмиды Т1 и К1 из А. 1итеГас1еп5 и А. г1ихо§епе5 соответственно несут гены, ответственные за генетическую трансформацию (например, Кабо, 1991). Описания векторных систем АдгоЬас1етшт и методов для переноса гена, опосредованного АдгоЬас1етшт, представлены в многочисленных ссылках, которые включают М1к1 е1 а1. выше, Мо1опеу е1 а1., 1989 и патенты И8 №№ 4940838 и 5464763. Другие бактерии, такие как ЗшогЫ/оЬшт, КЫхоЬшт и МекогЫ/оЬшт, которые в природе взаимодействуют с

- 9 017638 растениями, могут быть модифицированы для опосредования переноса гена во множество различных растений. Указанные ассоциированные с растениями симбиотические бактерии могут быть сделаны компетентными для переноса гена путем поглощения обоих - обезвреженной Τί-плазмиды и подходящего бинарного вектора (ВгоЛегк е! а1., 2005).

В. Культура клеток тканей и регенерация растения.

Получения регенерирующейся и трансформированной клетки в фертильном растении можно достичь путем первого культивирования эксплантата на ростовой среде и впоследствии на корневой среде. Иногда эксплантат может культивироваться на каллюсной среде перед переносом на ростовую среду. Множество сред и необходимых условий переноса могут быть реализованы и оптимизированы для каждой растительной системы для трансформации растения и получения трансгенных растений. Следовательно, такие условия среды и культивирования могут быть модифицированы или заменены эквивалентными компонентами питания или подобными способами селекции и получения случаев трансгенных растений. Питательную среду готовят в виде жидкости, но указанная жидкость может стать твердой путем добавления жидкости к веществам, способным обеспечивать твердую подложку. Агар является самым обычным веществом, используемым для этой цели. Бактоагар, НахеЙоп агар, Се1п1е и Се1дго представляют собой определенные типы твердой подложки, которые являются подходящими для роста растительных клеток в культуре клеток тканей. Некоторые типы клеток будут расти и делиться или в жидкой суспензии, или на твердой среде, или в обоих типах сред.

Реципиентные клетки-мишени включают, но не ограничены ими, клетки меристемы, каллюс, незрелые зародыши и гаметические клетки, такие как клетки пыльцы микроспор, спермий и яйцеклетки.

Любая клетка, из которой может быть регенерировано фертильное трансгенное растение, может быть использована в определенных воплощениях. Например, незрелые зародыши могут быть трансформированы с последующей селекцией и инициированием каллюса и последующей регенерацией фертильных трансгенных растений. Непосредственная трансформация незрелых эмбрионов избегает необходимости длительной разработки реципиентных клеточных культур. Меристематические клетки (то есть растительные клетки, способные к продолжительному клеточному делению и характеризующиеся недифференцированным цитологическим проявлением, обычно обнаруживают в растущих точках или тканях в растении, таких как концы корней, верхушки ствола, боковые ростки и т.д.), также могут быть использованы в качестве реципиентной растительной клетки. Из-за их недифференцированного роста и способности к дифференцировке в орган и тотипотентности цельное трансформированное растение может быть получено из единственной трансформированной меристематической клетки.

Соматические клетки представляют собой клетки множества типов. Эмбриогенные клетки представляют собой один из примеров соматических клеток, которые могут быть индуцированы к регенерации растения посредством образования зародыша. Неэмбриогенные клетки представляют собой такие клетки, которые обычно не реагируют таким образом.

Могут использоваться определенные методы, которые обогащают реципиентные клетки внутри популяции клеток. Например, развитие каллюса типа II с последующей ручной селекцией и культивированием хрупкой эмбриогенной ткани, как правило, приводит в результате к обогащению реципиентных клеток для использования в них, например, трансформации с помощью бомбардировки микрочастиц.

В определенных воплощениях реципиентные клетки селектируются после роста в культуре. Культивированные клетки могут быть выращены или на твердых подложках, или в форме жидких суспензий. В каждом случае клетки могут быть обеспечены питательными веществами в форме среды и контролируемых условий окружающей среды. Для культур клеток тканей существует много типов сред, состоящих из аминокислот, солей, сахаров, ростовых регуляторов и витаминов.

Большинство из применяемых в практике изобретения сред будет содержать некоторые подобные компоненты, в то время как среды могут отличаться в составе и пропорциях ингредиентов согласно известным практическим применениям культур клеток тканей. Например, различные типы клеток обычно растут в более чем одном типе среды, но демонстрируют различные скорости роста и различные морфологические черты в зависимости от ростовой среды. В некоторых средах клетки выживают, но не делятся.

Состав среды также часто оптимизируется на основе выбранных видов или типов клеток.

Ранее было описано множество типов сред, подходящих для культур растительных клеток. Примеры указанных сред включают, но не ограничены ими, среду N6, описанную в публикации С1ш е! а1. (1975), и среду М8 (МигакЫде & 8коод, 1962). В некоторых воплощениях может быть предпочтительным использование среды с немного меньшим соотношением аммоний/азот, такой как N6, для стимулирования генерации реципиентных клеток путем поддержания клеток в проэмбриональном состоянии способными к продолжительным делениям. Также может использоваться растительная среда ХУообу (^РМ) (Ь1оу6 апб МеСо\\'п. 1981).

Метод поддержания клеточных культур может вносить вклад в их применение в качестве источников реципиентных клеток для трансформации. Ручная селекция клеток для переноса в свежую культуральную среду, частота переноса в свежую культуральную среду, состав культуральной среды и факторы окружающей среды, включающие, но не ограниченные ими, качество и количество света и температуру,

- 10 017638 представляют собой все факторы для поддержания каллюса и/или суспензионных культур, которые применяются в качестве источников реципиентных клеток. Попеременное использование каллюса среди различных культуральных условий может быть полезным в обогащении реципиентных клеток в культуре. Например, клетки могут культивироваться в суспензионной культуре, но переносятся на твердую среду с регулярными интервалами. После периода роста на твердой среде клетки могут быть вручную селектированы для возвращения в жидкую культуральную среду. Повторение указанной последовательности переносов в свежую культуральную среду можно использовать для обогащения культуры реципиентными клетками. Пропускание клеточных культур через фильтр 1,9 мм также можно применять для поддержания рыхлости каллюса или суспензионной культуры и для обогащения клетками, способными к трансформации, когда используют такие типы клеток.

С. Трансгенные растения.

После селекции трансгенной клетки клетка может регенерироваться в фертильное трансгенное растение с использованием методов, хорошо известных из уровня техники. Трансформированные растения могут быть впоследствии подвергнуты анализу для определения присутствия или отсутствия конкретной интересующей нуклеиновой кислоты в конструкции ДНК. Молекулярный анализ может включать, но не ограничен ими, блоты по Саузерну (§ои1йегп, 1975) или ПЦР-анализы, иммунодиагностические методы. Полевые оценки также можно использовать. Указанные и другие хорошо известные методы могут быть осуществлены для подтверждения стабильности трансформированных растений, полученных описанными методами. Указанные методы хорошо известны специалисту в данной области (8ашЬгоок е1 а1., 1989).

Таким образом, могут быть получены представленные в настоящем описании трансгенные растения, включающие последовательность, кодирующую ΌΜΘ. В частности, экономически важные растения, включающие сельскохозяйственные культуры, деревья и другие растения, могут быть трансформированы с помощью конструкций ДНК по настоящему изобретению так, чтобы они были толерантны к дикамбе или имели повышенную толерантность. Растения, которые в настоящее время считаются толерантными к ауксинподобным гербицидам, таким образом, могут быть трансформированы для повышения их толерантности к гербициду. Некоторые неограничивающие примеры растений, которые могут найти применение по изобретению, включают люцерну, ячмень, бобы, свеклу, брокколи, капусту, морковь, канолу, цветную капусту, сельдерей, китайскую капусту, зерно, хлопок, огурец, баклажан, лукпорей, салат, дыню, овсяное зерно, лук, горох, перец, арахис, картофель, тыкву, редьку, рис, сахарную кукурузу, сорго, сою, шпинат, сквош, сахарную свеклу, подсолнечник, помидор, арбуз и пшеницу.

Как только получено трансгенное растение, содержащее трансген, указанный трансген может быть введен в любое растение, совместимое по полу с первым растением, путем скрещивания без необходимости когда-либо непосредственно трансформировать второе растение. Таким образом, при использовании в настоящем описании, термин потомство обозначает продукт любой генерации родительского растения, полученного согласно настоящему изобретению, где потомство включает выбранную конструкцию ДНК, полученную согласно изобретению. Трансгенное растение, таким образом, может представлять собой растение любой генерации. Скрещивание растения для получения линии растения, имеющего один или более добавленных трансгенов или аллелей по отношению к стартовой линии растения, как описано в настоящем описании, определяется как методы, которые приводят в результате к введению конкретной последовательности в линию растения путем скрещивания стартовой линии с донорной линией растений, которая включает трансген или аллель по изобретению. Для достижения указанного специалист может, например, осуществить следующие стадии: (а) семена растения первого родительского растения (стартовой линии) и второго родительского растения (линии донорного растения, которая включает желаемый трансген или аллель); (Ь) вырастить семена первого и второго родительских растений до состояния цветущих растений; (с) опылить цветок из первого родительского растения с помощью пыльцы из второго родительского растения и (ά) собрать семена, полученные на первом растении, несущем фертилизованный цветок.

В изобретении также предлагаются ткани трансгенного растения, включающие предложенную в настоящем описании нуклеиновую кислоту, кодирующую ΌΜΘ. Ткани могут быть непосредственно трансформированы с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей ΌΜΘ, или могут наследовать нуклеиновую кислоту от клетки-предшественника. Ткани, предложенные в изобретении, в частности, включают, но не ограничены ими, клетки, зародыши, незрелые зародыши, меристематические клетки, незрелые кисточки, микроспоры, пыльцу, листья, пыльники, корни, концы корней, цветы и семена. Таким образом, в изобретении предлагаются любые такие ткани, включающие любую часть растения, включающего описанную в настоящем описании нуклеиновую кислоту. В частности, семена находят конкретное полезное применение одновременно для коммерческих или пищевых применений в форме зерна, а также на плантациях для выращивания дополнительных сельскохозяйственных культур.

Примеры

Следующие примеры включены для иллюстрации воплощений изобретения. Специалисту в данной области следует принять во внимание, что методы, описанные в примерах, которые следуют описанным методам, разработаны заявителем для приемлемого практического функционирования изобретения. Однако специалисту в данной области в свете настоящего изобретения следует принять во внимание, что

- 11 017638 могут быть произведены многие изменения в определенных воплощениях, указанные изменения описаны и приводят к получению подобного или похожего результата, не выходя за рамки концепции, сущности и границ изобретения. Более конкретно, очевидно, что определенные агенты, которые связаны одновременно химически и физиологически, могут быть заменены описанными в настоящем описании агентами, тогда как при этом будут достигнуты такие же или подобные результаты. Считается, что все такие подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, будут находиться в рамках сущности, границ и концепции изобретения, как определено в прилагающейся формуле изобретения.

Пример 1. Векторная конструкция для полученного с помощью генетической инженерии гена ΌΜΘ.

Последовательность, кодирующая вариант ΌΜΘε, исходно была получена с помощью ПЦРамплификации из матрицы ЭМОте. В указанном процессе амплификации участок, кодирующий ЭМОте, амплифицировали из плазмиды рРЬН1, которая содержала ген ЭМОте в виде 3,5-т.п.о. фрагмента Х1о !/8з! I ДНК из Р. таЙорЫйа, штамм ΌΙ-6. Для ДНК-амплификации применяли 5'-праймер, с помощью которого вставляли сайт рестрикции 4со I около 5'-конца ПЦР-продукта и кодон для аланина, следом за инициирующим кодоном АТС, и применяли З'-праймер, который создает сайт рестрикции ХЬа I на 3'конце ПЦР-продукта (детали процедуры представлены ниже). Замену 112У на 112С впоследствии идентифицировали с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты.

Для создания вектора, трансформирующего растения, кодирующий участок гена ЭМОе вставляли с использованием сайтов Νεο I и ХЬа I, добавленных к 5'- и З'-концам соответственно в вектор рВТЬ2 (Саггшд!оп апб Егееб, 1990), посредством чего сшивая кодирующий участок с векторным энхансерным элементом трансляции (ТЕУ-лидер) из вируса гравировки табака. 5'-сайт Νεο I вводили вместе с добавлением ССС-кодона (аланин) следом за старт-кодоном АТС и создавали сайт рестрикции ХЬа I на З'-конце участка кодона с использованием специально созданных ПЦР-праймеров. Чтобы дать возможность доставки ЭМОе в хлоропласты, участок, кодирующий хлоропластный транзитный пептид, из субъединицы гена ВиЫзсо гороха (Соги/ζί е! а1., 1983) помещали выше участка, кодирующего ЭМО, чтобы дать возможность направления белка в хлоропласты. Последовательность, кодирующая транзитный пептид, которую несет в себе фрагмент Вд1 II и ЕсоВ I, клонировали по сайтам ВатН I и ЕсоВ I вектора рВ1иезспр! II К8+. Полученную конструкцию использовали в качестве матрицы в ПЦР-реакции, с помощью которой вставляли сайт 4со I с обоих концов, 3' и 5', последовательности транзитного пептида. Амплифицированный продукт клонировали по сайту 4со I вектора рВЬТ2 так, чтобы последовательность транзитного пептида располагалась непосредственно перед кодирующей последовательностью и в рамке с кодирующей последовательностью гена ЭМО. Кассету, состоящую из ТЕУ-лидера, участка транзитного пептида и последовательностей ДНК, кодирующих ЭМО, вырезали из вектора рВТЬ2 по сайтам ХЬо I и ХЬа I, и клонировали в вектор рКЬР36 (И8 5850019; фиг. 5) с использованием тех же сайтов рестрикции для связывания кассеты с РС18У-промотором и поли-А-последовательностью РзВЬс82-Е9. Новый вектор обозначали как рКЬР3 6-ТЕУ-ТР-ЭМОс (также обозначенный как рКЬР36-ОМОс), депонировали в Американскую Типированную Коллекцию Клеточных Культур (АТСС), 10801 Ишуегзйу Вои1еуагб, Мапаззаз, Уа. 20110-2209 И8А от 2.02.2006 и присвоили уникальный номер АТСС Ассеззюп № РТА-7357.

Вектор рКЬР36-ОМОс использовали для трансформации растений табака, АгаЬ1борз1з и томата. Для трансформации сои ЭМОс-кассету вырезали из рКЬР3 6-ТЕУ-ТР-ЭМОс в виде сегмента ЕсоК РАсс I и клонировали в гидролизованный рР2Р101 по ЕсоК ЕЛсс I (На_)бик1ете^ е! а1., 1994) для получения правой и левой границ. Указанный вектор (кассета рР2Р101+ЭМОс) затем резали с помощью 8саI и ЭМОскассету клонировали в бинарный вектор рРТ№00 (см. ниже), производное рР2Р201 (На_)бик1ете^ е! а1., 1994), который содержит ограничительную кассету, фланкированную левой и правой границами Т-ДНК, и дает возможность селекции регенерирующих трансформантов в присутствии гербицида Баста. Новый бинарный вектор с двумя Т-ДНК обозначили рРТЫ348 и использовали для трансформации сои. Вектор рРТЫ200 получали сперва с помощью клонирования элемента поз промотор-Ьаг из рСРТУ-Ьаг (Вескег е! а1., 1992) в виде сегмента РзП/ВатШ в рР2Р201 (см. На_)бик1ете^ е! а1., 1994), и полученную в результате плазмиду назвали рРТЮ93. поз-терминатор из рЕ7113-СИ8 (см. МйзиЬага е! а1., 1996) клонировали в рРТЫ193 ниже элемента поз промотор-Ьаг для получения Ьаг-кассеты.

Ферменты рестрикции и другие ферменты получали или на фирме Еегтейаз, или на (пуйгодеп. ПЮ-И-бИТР (меченный с помощью щелочного металла), С8РЭ (готовый к использованию), ОЮ III маркеры молекулярного веса, антидигоксигенин-АР (ЕаЬ-фрагменты) и блокирующий реагент были получены из Коске. Раствор предгибридизации, иЬТВАкуЬ, был получен из АтЬюп. ЭЮ-РНК маркер молекулярного веса I был получен из Воске. Антикроличьи ^С, антитело, связанное с пероксидазой (ослиное) и мембрана НуЬопб ЕСЬ (нитроцеллюлоза) были получены из Атегзкат Вюзшеисез. ДНК, РНК и белковые блоты, методы рекомбинантной ДНК и другие процедуры молекулярной биологии проводили с использованием стандартных методов (АизиЬе1 е! а1., 1995).

Пример 2. Получение и анализ трансгенных растений.

Табак, томат, сою и АгаЬ1борз1з использовали для трансгенной экспрессии полученного с помощью генетической инженерии гена ЭМОс и для подтверждения толерантности к дикамбе в растениях, экспрессирующих ген. Последовательность, кодирующая ЭМОс, в бинарном векторе рКЬР36 вводили в А.

- 12 017638

1итсГае1СП5 штамм С58С1, содержащий обезвреженную Τί-плазмиду рМР90 (Копс/ апк 8сйе11. 1986) с помощью триплоидного родительского скрещивания (ΩίΙΙη. 1980). Полученные в результате трансконъюгаты использовали для трансформации табака (су Χαηΐΐιί) и томата (су Ки1дег8) с использованием протокола для листового диска. описанного в публикации Ногасй е! а1. (Ногасй. 1985). АгаЫкорык (йайапа трансформировали с помощью метода цветковой жидкости (С1опцй апк Веп!. 1998). Трансформацию видов сои Тйогпе и ΝΕ-3001 проводили с помощью системы трансформации. опосредованной семядольным узлом АдгоЬас!егшт (Ζΐιηπβ е! а1.. 1999).

С помощью опосредованного АдгоЬас!егшт переноса гена ЭМОс в ядерный геном растений табака получали несколько независимо выделенных генераций Τι растений. Растения тестировали на присутствие и экспрессию гена ЭМОс с использованием анализов с помощью ДНК. РНК и белковых блотов. Фиг. 2 иллюстрирует. что хотя все трансгенные растения (дорожки 1-6) в указанном анализе содержали одни и те же фрагменты ДНК после гидролиза ферментами рестрикции в виде клонированного гена ΌΜΟ (дорожка 8). уровень транскриптов мРНК и белка ΌΜΟ существенно варьировался среди трансформантов. Например. растение. чьи экстракты изображены в дорожке 5. показали относительно высокий уровень ΌΜΟ мРНК. но при этом очень низкий уровень фермента. Наоборот. почти одинаковый уровень ΌΜΟ мРНК в экстрактах. показанный в дорожке 3. сочетался с высоким уровнем экспрессии ΌΜΟ. Однако было показано. что случаи сильной экспрессии равным образом могли быть получены с помощью указанного метода.

Растения в теплице опрыскивали растворителем и дикамбой коммерческого класса (С1ап!у; ВА8Р) с использованием трекового распылителя с сжатым воздухом. с механическим приводом. вентиляторным отделением 8002Е. перемещением сопла со скоростью 1.87 миль/ч. Добавки включают: 28% мочевину. нитрат аммония 1.25% об./об. и неионное поверхностно-активное вещество 1.0% об./об. Применяли раствор. содержащий дикамбу в различных концентрациях 182 л/га (40 галлонов на акр). Плантации полей сои опрыскивали с помощью гербицида С1агйу в количестве 2.8 кг/га (2.5 фунт/акр).

Растения табака. подобно большинству двудольных растений. достаточно чувствительны к обработке с помощью дикамбы. Указанное свойство было проиллюстрировано с помощью сравнения нетрансгенных растений табака - необработанных или обработанных с помощью повышенного количества дикамбы. Симптомы повреждения гербицида легко детектировали после опрыскивания с помощью дикамбы в количестве на уровне 0.017 кг/га. Симптомы были достаточно серьезными при количествах 0.28 и 0.56 кг/га. которые представляют собой уровни гербицида. обычно используемые для контроля сорняков при применении в сельском хозяйстве.

Послевсходовая обработка трансгенных растений табака. содержащих ΌΜΟ^ гербицидом в количестве 5.6 кг/га (в 10-20 раз выше обычных доз) вызывала слабые симптомы повреждения. если они были. в то время как нетрансгенное растение получало серьезное повреждение. Уменьшение повреждения нижних листьев трансгенных растений может быть удвоено при опрыскивании растений с помощью раствора растворителя. содержащего поверхностно-активное вещество. используемое в качестве носителя при применении дикамбы. Листья. полученные после обработки трансгенных растений с помощью дикамбы. демонстрировали отсутствие видимых признаков повреждения. Трансгенные растения томата. несущие полученный с помощью генетической инженерии ген ΌΜΟ^ также показывали отсутствие повреждения при опрыскивании раствором с высоким уровнем дикамбы. в указанном конкретном случае составляющим сначала 0.56 кг/га и впоследствии 5.6 кг/га. АгаЫкорык (йайапа. экспрессирующие ген ΌΜΟ^ также проявляли сильную толерантность к обработке дикамбы. В настоящем исследовании предлагается применять концентрацию дикамбы с дозой 1.12 кг/га. Неожиданным открытием оказалось наблюдение того. что растения табака. трансформированные геном ΌΜΟ^ лишенным участка. кодирующего транзитный пептид. также являются толерантными к послевсходовым обработкам с помощью дикамбы в концентрациях. которые в среднем были только чуть ниже концентраций. которыми обрабатывали растения. несущие гены ^ΜΟс с участками. кодирующими транзитный пептид. В настоящем исследовании проводили сравнение обработок дикамбой двух растений табака генерации Τ1 с использованием количества дикамбы 2.2 кг/га. одно растение несет ген ΌΜΟ^ лишенный хлоропластного транзитного пептида. и другое полностью лишено гена ^ΜΟс благодаря генетической сегрегации. Последнее растение обладало абсолютной чувствительностью к повреждению. вызванному обработкой с помощью дикамбы. и погибало в результате обработки (фиг. 3). Трансгенное растение. несущее ген ΌΜΟ^ лишенный транзитного пептида. обладало абсолютной толерантностью к обработке с помощью дикамбы в количестве 2.2 кг/га. Генетические исследования наследования гена ^ΜΟс в трансгенных растениях табака также демонстрировали. что указанное свойство в виде присутствия гена ^ΜΟс наследовалось в большинстве растений согласно обычному правилу Менделя. и поддерживался исходный уровень экспрессии в отношении толерантности к гербициду.

Для сои было получено более 50 Во случаев трансгенной сои и собраны генерации семян - Τι. Т₂ и Т₃. Поскольку использовали систему бинарного вектора АдгоЬас!егшт 1итеГас1еп8. были получены оба трансгенных растения - несущие ген маркера и свободные от маркера трансгенные растения. содержащие ген ΌΜΟ^ В каждом случае большинство линий трансгенной сои показывало существенную толерантность к обработке с помощью дикамбы в количествах 2.8 и 5.6 кг/га в условиях теплицы и растения пока

- 13 017638 зывали сильную толерантность к дикамбе в количестве 2,8 кг/га (наибольший тестируемый уровень) в течение двух лет полевых испытаний. Полученные результаты предполагают широкий предел безопасности для трансгенной сои и других сельскохозяйственных культур, несущих ген ΩΜΟ^ совместно с высокоэффективным контролем широкого спектра широколистных сорняков.

Высокий уровень устойчивости к дикамбе в трансгенных растениях сои, несущих ген ΩΜΟ, указывает на способность применения дикамбы на соевых полях с целью сильного подавления конкурирующего роста широколистных сорняков без сопутствующего повреждения сельскохозяйственной культуры. Кроме того, сельскохозяйственные культуры, устойчивые к дикамбе, могут быть важным дополнением к существующим в настоящее время способам контроля сорняков с применением трансгенных толерантных к гербициду сельскохозяйственных культур. То есть они могут представлять собой ценный вклад в стратегии контроля существующих в настоящее время устойчивых к гербицидам сорняков и в стратегии подавления появления дополнительных устойчивых к гербицидам сорняков, которые, в конечном счете, могут угрожать продолжительному применению и стоимости существующих в настоящее время гербицидов и устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Сверхэкспрессия, очистка и сравнение ΩΜΟν и ΩΜΟ^

Ферментативные свойства.

A. Клонирование и сверхэкспрессия.

Последовательности, кодирующие белок ΩΜΟ дикого типа (ΩΜΟν) и вариант (ΩΜΟ^, клонировали из плазмид ρΜΟΝ95900ΌΜΟ (ΩΜΟν) и ρΜΟΝ58499ΌΜΟ (ΩΜΟ^ в вектор рЕТ28Ь (№уадсп, 8ап Оюдо, СА) и трансформировали в клетки ЕксйсгюЫа сой ВЬ21 (№уадсп, 8ап О1сдо, СА). Клетки растили в 1 л среды Ьипа-Всг1аш при 37°С до поглощения 0,4-0,6 при 600 нм. Экспрессию белка индуцировали с помощью добавления 50 мкМ Ρ^ΝΗ₄)8Ο₄, 100 мкМ №ь8 и 1 мМ изопропил-бета-тиогалактопиранозида (1РТС) и клетки переводили на температуру 15°С. После инкубации в течение 48-72 ч при 15°С клетки собирали с помощью центрифугирования при 10000/д в течение 20 мин. Для дальнейшего использования клетки сохраняли при температуре 20°С.

Выход экспрессии белка в Е. сой для ΩΜΟ\ν и ^ΜΟс был различным. В то время как выход ΩΜΟν составлял приблизительно 100-150 мг очищенного белка на 1 л среды ЬВ, выход ^ΜΟс оказался в 10 раз ниже или приблизительно 10-15 мг очищенного белка на 1 л. Полученный результат не был предсказан, поскольку Е. сой не имеет редких кодонов для цистеина и существует только один кодон для триптофана, но гетерологичная способность получения белков в Е. сой была показана в обоих случаях независимо от выхода. Количество белка в телах включения было низким в обоих случаях, что предполагает присутствие белка главным образом в растворимой фракции.

Рекомбинантный белок ΩΜΟν, содержащий Ηίδ-фрагмент, из Рксийотопак таЙорЫйа, штамма ΩΙ6, и рекомбинантный белок ΩΜΟ^ содержащий Нщ-фрагмент, экспрессированный в Е. сой штамма ВЬ21, были очищены до гомогенного состояния с помощью колоночной хроматографии Νί-ΝΤΑ. Клетки суспендировали в лизирующем буфере (100 мМ №1Р| рН 8,0, 300 мМ №1С1 и 10 мМ имидазол) и разрушали с помощью ультразвука. Клеточный лизат центрифугировали при 55000/д в течение 1 ч. Супернатант загружали в колонку Νί-ΝΤΑ, которую промывали с помощью промывающего буфера (100 мМ №1Р| рН 8,0, 300 мМ №1С1 и 20 мМ имидазол) для удаления белков, которые неспецифично присоединялись к смоле. Белок, содержащий Нщ-фрагмент, элюировали с помощью элюирующего буфера (100 мМ №1Р| рН 8,0, 300 мМ №1С1 и 250 мМ имидазол). Для очистки белка ΩΜΟν было достаточно ступенчатого градиента для получения фермента со степенью чистоты 95%, в то время как для ^ΜΟс был необходим линейный градиент концентрации имидазола от 20 до 250 мМ для достижения такого же уровня степени чистоты. Фермент, который элюировали из колонки, обладал степенью чистоты, составляющей приблизительно 95%, по оценкам с помощью белковых блотов (вестерн-блотов) фермента после фракционирования по размеру с помощью 8О8-полиакриламидного гель-электрофореза. Единственная основная полоса, мигрирующая на уровне, соответствующем белку с молекулярной массой 40 кДа (37,3 кДа фермента ΩΜΟ плюс 3 кДа Нщ-фрагмента), указывала на сверхпродукцию корректного белка.

B. Анализы для ^ΜΟс и ΩΜΟν и стационарная кинетика.

Концентрации белка определяли с помощью анализа по Бредфорду, используя в качестве стандарта кроличий 1дС. Белки разделяли с помощью 808-РАСЕ и окрашивали с помощью кумасси-синего. Активность ΩΜΟ измеряли следующим образом: с помощью образования ΩίΈΑ, которую разделяли с помощью ВЭЖХ (\Уа1сг5 Согрогайоп, ΜίΓ^τά, ΜΑ) с использованием колонки Ойсоусгу С18 (8ирс1со, 81дта-А1йг1сй, 8ΐ. Ьош8, ΜΟ). Время удерживания для Ωί’8Α составляло 8 мин и для дикамбы - 9,5 мин. Для исследований кинетики Ωί.'8Λ детектировали и оценивали количественно с помощью флуоресцентного испускания при 420 нм (длина волны возбуждения 310 нм) после разделения на колонке ВЭЖХ из реакционной смеси. Набор концентраций ОС8А (12 и 24 мкМ) использовали в качестве стандартов количественной оценки.

Использовали маточный раствор дикамбы (100, 200, 400, 800, 1000, 2000, 5000 и 10000 мкМ), 0,1 М КР1 рН 7,2, 0,1 М Εс8Ο₄, 0,1 М НАОН и 1 М Μ§Ο₂. Анализы осуществляли при 30°С в течение 20 мин и реакцию останавливали путем добавления 40 мкл Η₂8Ο₄. Для измерений активности ΩΜΟ объединяли с

- 14 017638 избытком очищенных ферредоксина и редуктазы из Р. таЙорЪШа штамма ΌΙ-6.

Так как анализ измерения активности ΌΜ0 представлял собой дискретный анализ, было важно установить время, в течение которого следует проводить анализ для того, чтобы получить значимые кинетические параметры. Поэтому анализ следовало проводить при исходных условиях, пока количество получаемой Ό08Ά оставалось линейным в течение времени проведения анализа (фиг. 4). На основе результатов предположили, что анализ может быть проведен в интервале времени от 20 до 30 мин, и все это время сохранять линейность. На фиг. 5 показано, что оптимальное значение рН для осуществляемого анализа в присутствии буфера 0,1 М КР1 составило 7,2, и было обнаружено, что оптимальное значение температуры составляло приблизительно 37°С (фиг. 6).

С. Анализ кинетических данных.

Параметры Михаэлиса-Ментена определяли путем подбора данных для нелинейного уравнения стационарного состояния (уравнение 1). Данные анализировали с использованием сигма-графика 8.0 (1ап4е1 8с1спНПс).

Уо=Утах· [8]/(Кт+[8]).

Оптимальные значения рН и температуры также определяли для ΌΜ0^ и ΌΜ0^ Оптимальное значение рН измеряли при 30°С в течение 20 мин и определение оптимального значения температуры измеряли также в течение 20 мин при рН 7,2 для обеих форм фермента. Результаты суммированы на фиг. 7-9 и обсуждаются ниже.

Исследования показали, что ΌΜ0^ и ^ΜΟс отличаются по кинетическим свойствам. Например, параметры Михаэлиса-Ментена, рассчитанные для ΌΜ0^ и ΌΜ0^ составляли для ΌΜ0^, Кт=49±7 мкМ и Утах=633±24 нмоль/мин/мг, и для ΌΜ0^ Кт=20,5±5 мкМ и Утах=676±37 нмоль/мин/мг. Полученные результаты показаны на фиг. 10 и 11 и суммированы в табл. 1 ниже. Кроме того, с помощью двух дополнительных анализов для ΌΜ0^ и ЭУ0с получали подобные результаты (табл. 2 и 3).

Как можно заметить, в проявлении каталитических эффективностей ферменты ΌΜ0^ и ^ΜΟс обладают различными свойствами: согласно указанному анализу ^ΜΟс представляет собой фермент в пять раз лучший, чем ΌΜ0^. Профиль рН для ^ΜΟс отличается от профиля рН ΌΜ0^. Во-первых, повидимому, ^ΜΟс является чувствительным к используемым буферным системам (ТК18 против КР1) по сравнению с ΌΜ0^ (фиг. 9, 12 и 13). Во-вторых, ^ΜΟс демонстрирует устойчивую активность в широком пределе рН при проведении анализа в буфере КР1 по сравнению с буфером ТШ8, когда активность ^ΜΟс уменьшается с увеличением единиц рН. Температурные профили для ΌΜ0^ инкубированного в буфере КР1 или в буфере ТШ8, являются подобными.

При взгляде на температурные профили для указанных двух форм фермента можно заметить, что ΌΜ0^ функционирует лучше при 37°С, тогда как ЭУ0с функционирует лучше при чуть меньших температурах (фиг. 9). На фиг. 9 указана более низкая оптимальная температура для ΌΜ0^ который может рано применяться в трансгенных растениях в сезон роста.

Таблица 1

Кинетические параметры стационарного состояния для ΌΜ0^ и ^ΜΟс

Фермент	Кт (М)	Утах (Ед./мг·)	КсаЪ (с'1)	Кса+/Кт (М’1с’1)
ЮМОи	49+7x10’®	ОЗЗ±24х1О’3	36, 63	7,47х105
СМОс	20±5х10’®	676+37Х10’3	70,41	35,21x10'

Таблица 2 Суммирование параметров Михаэлиса-Ментена для ΌΜ0^

№ исследования	Нздг	Утах (нмоль/мин/мг)	Кт (мкМ)
1	0, 983	633±24	49±7
2	0, 988	583+18	46±5
3	0, 987	590+19	46±5,5

Таблица 3 Суммирование параметров Михаэлиса-Ментена для ^ΜΟс

№ исследования	Кздг	Утах (нмоль/мин/мг)	Кт (мкМ)
1	0, 933	713±43	21±6
2	0, 948	676±37	20±5

Пример 4. Анализ консервативных участков ΌΜ0 с использованием биоинформатики.

Анализ с использованием биоинформатики проводили для сравнения полипептидной последовательности ΌΜ0 с другими железосерными оксигеназами и для идентификации консервативных участков. Исходно, для анализа выбирали 78 последовательностей на основе е-величины отсекания 1е-08 и 70% перекрывания с последовательностью ΌΜ0 при сравнении последовательности. Дальнейший анализ этих 78 последовательностей обнаружил присутствие двух доменов, которые были идентифицированы в других исследованиях, включающих домены Р|С5ке и негеминового Ре (Негтап е! а1., 2005). Из указанных 78 последовательностей 68 содержали оба домена, в то время как 10 содержали только один из указанных доменов. 68 молекул с двумя доменами использовали для дальнейшего анализа мотивов.

Сравнение 68 молекул, содержащих оба домена с различным уровнем идентичности, обнаруживало

- 15 017638 новый мотив \νΧ\νΧ. В то время как некоторые последовательности не содержали мотива, филогенетический анализ показал, что молекулы без мотива попадают в определенные филогенетические ветви в филогенетическом дереве, которые не принадлежат той же группе, что и молекулы с мотивом. Указанные последовательности без мотива были, таким образом, удалены из исходного набора данных, оставались 52 оставшиеся последовательности, для которых повторяли сравнение для дальнейшего анализа.

Повторное сравнение 52 последовательностей показало консервативный участок вокруг двух остатков V, содержащий следующий формат: \νΧ|\νΧ₂Ο (V представляет собой Тгр, 6 представляет собой остаток С1у. Χί представляет собой неполярный остаток и Х₂ представляет собой любую аминокислоту). В этом случае второй остаток V соответствует положению 112 из 8ЕО ΙΌ N0: 1. Участок \νΧΟ из мотива ΧνΧΛνΧΥ недавно был опубликован, и было обнаружено, что белки, содержащие мотив \νΧΠ связаны с системами клеточной секреции (Иекуаих с1 а1., 2005).

Триптофан (ν) и цистеин (С) представляют собой остатки, значительно отличающиеся по размеру. ν представляет собой крупный остаток, в то время как С представляет собой относительно небольшой остаток. Поскольку оба ν и С представляют собой полярные аминокислоты, они разделяют некоторые общие характеристики, такие как отдача протонов. Так как остаток ν кодируется с помощью ТСС и Су8 кодируется с помощью ТСС и ТСТ, то определенные превращения в третьей букве (С^С или С^-Т) могут привести к получению миссенс-мутации, которая меняет ν на С, или С на ν. такие превращения были идентифицированы в природе, и такие мутации изменяли биофункции и активности (см., например, ген ВВСА1 в наследственном раковом заболевании груди и яичников (Χίηοιηηη апб Лпдйе, 1999); дефицит фактора коагуляции ΧΙΙ (^аба е1 а1., 2003) и мутация липопротеин-липазы при гиперлипопротеинанемии типа I (Нойтапп е1 а1., 2000)).

Таким образом, вышеупомянутые результаты указывают на то, что ΌΜ0 является уникальным ферментом и имеет низкую идентичность с известными ферментами, ν112 является консервативным в других родственных железосерных оксигеназах. Кроме того, положение 112 связано с двумя консервативными функциональными доменами (фиг. 18). Далее, превращение ν в С обычно оказывает влияние на биоактивность. Открытие того, что с ЭМОе является функциональным ферментом с кинетическими параметрами, превосходящими кинетические параметры фермента дикого типа ΌΜ0^, и обеспечивает высокий уровень толерантности к дикамбе при экспрессии в трансгенных растениях, оказалось особенно неожиданным.

Пример 5. Получение высокого уровня устойчивости к дикамбе с помощью кодируемого в хлоропластах белка ΌΜ0.

Для определения того, может ли ΌΜ0 функционировать исключительно внутри хлоропластов, и для исследования возможности ограничения распространения гена через перенос пыльцы, были созданы конструкции на основе вектора ρΕΜΌν1 (например, 8уаЬ е1 а1., 1990), чтобы допустить интеграцию гена ΌΜ0ε в хлоропластный геном табака путем гомологичной рекомбинации и допустить выделение трансформантов с использованием селекции на устойчивость к антибиотику (фиг. 14). В указанной конструкции участок, кодирующий ген ΌΜ0ε, управляется с помощью промотора хлоропластного гена р§ЬА, содержащего полную 5'-иТВ последовательность гена. Исходные ДНК-блот анализы трансгенных растений, устойчивых к антибиотикам (фиг. 15А), продемонстрировали присутствие в хлоропластных геномах обоих участков - трансгена ΌΜ0ε (полоса 5,6 т.п.о.) и участка нативного гена (полоса 3,3 т.п.о.), замещенного с помощью гомологичной интеграции гена ΌΜ0ε (то есть хлоропласты являлись гетеропластидными для нативного гена и трансгена ΌΜ0ε). Повторная регенерация и селекция трансгенных растений на среде, содержащей антибиотик, привела в результате к очевидному получению гетеропластидных хлоропластов, несущих фрагмент гена ΌΜ0ε, но не замещенный участок нативного гена (фиг. 15В).

Генерации Т_ь Т₂ и Т₃ потомства из двух независимо выделенных трансформантов хлоропластов тестировали на толерантность к обработке с помощью дикамбы в различных дозах. Все указанные генерации демонстрировали высокий уровень толерантности. Действительно трансформанты хлоропластного генома проявляли отсутствие видимого повреждения (в отличие от повреждения с помощью только растворителя для нижних листьев) при опрыскивании дикамбой с дозой 28 кг/га (25 фунт/акр) (фиг. 16), и наблюдалось только временное повреждение, когда растения обрабатывали экстремально высокими дозами дикамбы, составляющими 112 и 224 кг/га. При указанных экстремально высоких уровнях дозы исходные повреждения были вызваны, главным образом, поверхностно-активными веществами и другими компонентами растворителя, в котором осуществлялась доставка дикамбы; ткани, выросшие из поврежденной верхушки, демонстрировали фенотипы от почти нормального до нормального, показывали отсутствие замедления скорости роста после исходной остановки роста и сохраняли способность получения семян в обычном количестве и с обычным качеством.

Результаты были совместимы с возможностью того, что восстановленный ферредоксин в хлоропластах табака может являться донором электронов для ΌΜ0, необходимых для окисления дикамбы до ЭС8А. В качестве прямого теста указанной возможности определяли способность очищенного ферредоксина шпината поддерживать превращение дикамбы в ЭС8А в присутствии и в отсутствие ΌΜ0, очищенного из Р. таЙорЪШа, штамма ΌΙ-6, или полученного с помощью сверхпродукции и очистки из Е.

- 16 017638 со11 (табл. 4). Результаты продемонстрировали, что восстановленный ферредоксин из шпината или из ΟοδΙπάίιιιη был вполне способен к донорству электронов для ΌΜΟ ίη νίίτο по измерениям или с помощью деградации дикамбы или по измерениям появления ИС8Л.

В табл. 4А-В очищенная дикамба-монооксигеназа может утилизировать восстановленный ферредоксин хлоропластов или восстановленный ферредоксин из ΟοδΙπάίιιιη в качестве источника электронов для катализа ίη νίΐτο превращения дикамбы в 3,6-дихлорсалициловую кислоту.

Таблица 4А

Деградация дикамбы

Тип Реакции	Деградация дикамбы (%)
(Ферр+Ред) м-б+ΝΑΟΗ	0
(Окси+Ферр+Ред) ΟΙ_δ+ΝΑΟΗ	86
(Окси) 01-й+ (Ферр) ЦШИНЙТ+ (Ферр : Окисленный) ШП11(,ат+МАОРН	83
(Окси) р1-б+ (Ферр : Окисленный) шпинаг+МА^РН	НО
(Окси) П1_6+ (Ферр) шпинат·*· (Ферр: Окисленный) ШПИНат+^О ΝΑΟΡΗ	но
(Окси) м_6+ (Ферр) С1о3|;„а1ит+ (Ферр: Окисленный) Ιη«Ηιτ+ΝΑΟΡΗ	82
(Ферр) с1оЕ1:г1сНи1п + (Φβρρ ! ОКИСЛвННЫЙ) шпимат + ΝΑΟΡΗ	НО

Таблица 4В

Образование ЭС8Л

Тип реакции	Образование ОС5А (%)
(Ферр+Ред) βΐ-,^+ΝΑΟΗ	НО
(Окси+Ферр+Ред) 0Ι.6+ΝΑΟΗ	100
(Окси) вг-6+ (Ферр) шпинат'*’ (Ферр : Окисленный) шпинат+ЙАОРН	95
(Окси) οι-б+ (Ферр: Окисленный) шпинат+ΝΑΟΡΗ	2, 5
(Окси) 01-б+ (Ферр)шпинат+ (Ферр:Окисленный) Щ11инат+Мо ΝΑΡΡΗ	1,2
(Окси) р!-б+ (Ферр) С1оЗСГ1й1итп+ (Ферр : Окисленный) ШП11нат+ЫАОРН	90
(Ферр) еЮэЫхеНит·*· (Φ«Ρρΐ ОКИСЛеННЫЙ) цпинат + ΝΑϋΡΗ	1/ 5

НО - не определено.

В то время как результаты, представленные на фиг. 2, показали, что получаемый уровень ΌΜΟ варьировался и иногда уровень ^ΜΟс не проявлял тесной корреляции с уровнем толерантности к дикамбе, при этом результаты демонстрируют способность последовательно получать высокий уровень толерантности к дикамбе. Показана продукция ^ΜΟс для трансформантов из обоих источников - из гена ^ΜΟс с ядерной локализацией и из гена депе ^ΜΟс с локализацией в хлоропластах. В ядерных трансформантах отсутствовало создание исключительно высокого уровня тотального белка ^ΜΟс по отношению к тотальному белку, количество ^ΜΟс в хлоропластных трансформантах не имело значительных отличий и иногда было ниже, чем в ядерных трансформантах. Оценки относительной ферментативной активности в бесклеточных экстрактах образцов ткани листа показывали, что больший процент ΌΜΟ^ полученного в хлоропластах, является активным, по сравнению с ΌΜΟ^ синтезированным в цитоплазме и искусственно перенесенным в хлоропласты.

Во всех растениях анализированная толерантность к дикамбе достигалась без сотрансформации генами ферредоксина или редуктазы. Результаты демонстрируют, что растения содержали одну или более молекул, которые могли переносить необходимые электроны на ΌΜΟ, чтобы допустить превращение дикамбы в 3,6-дихлорсалициловую кислоту (ИС8Л). Исходное направление ΌΜΟ в хлоропласты с использованием последовательности транзитного пептида проводили с целью потенциальной утилизации восстановленного ферредоксина, доступного в больших количествах в хлоропластах. В этом отношении интересно заметить, что трансформация растений табака конструкцией гена ΌΜΟ^ лишенной последовательности, кодирующей хлоропластный пептид, приводила в результате к неожиданному получению растений, которые были толерантны к послевсходовой обработке дикамбой. Результаты из ограниченного количества испытаний с небольшим количеством растений генерации Т1, тем не менее, показывали, что уровень толерантности, полученный с указанными трансгенными растениями, был в среднем чуть ниже, чем уровень толерантности, полученный с растениями табака, продуцирующими ΌΜΟ^ содержащий транзитный пептид. Указанные наблюдения породили интересные вопросы в отношении молекул в трансгенных растениях, которые могут быть продуктивными донорами электронов для ΌΜΟ. Тот факт, что гомопластидные хлоропласты, продуцирующие внутри себя ΌΜΟ из гена ΌΜΟ^ интегрированного в хлоропластный геном, показывают устойчивость к экстремально высокому уровню дикамбы (фиг. 16), и тот факт, что очищенный белок ΌΜΟ может функционировать ίη νίίτο вместе с восстановленным фер

- 17 017638 редоксином хлоропластов шпината (табл. 4), оба предполагают, что хлоропластный ферредоксин может продуктивно взаимодействовать с ΌΜΟ, допуская перенос электронов. Однако источник электронов для ΌΜΟ, продуцируемого из ядерных генов, лишенных последовательности, кодирующей хлоропластный транзитный пептид, остается неизвестным. Предположение, что ферредоксины отсутствуют вне хлоропластов растения, должно допустить возможность того, что неизвестный цитоплазматический белок может обеспечивать ΌΜΟ устойчивым снабжением электронами. Альтернативно, ΌΜΟ сам по себе может содержать избыточный хлоропластный транзитный пептид, который допускает вход достаточного количества ΌΜΟ в хлоропласты для обеспечения защиты от дикамбы, продвигающегося в клетку после обработки с помощью дикамбы.

Все композиции и/или способы, описанные и заявленные в настоящем описании, могут быть сделаны и осуществлены без чрезмерного экспериментирования в свете настоящего описания. В то время как композиции и способы настоящего изобретения были описаны в выражении предпочтительных воплощений, специалисту в данной области будет очевидно, что могут применяться вариации к композициям и/или способам, и в стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в настоящем описании, не выходя за рамки концепции, сущности и границ изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые связаны одновременно химически и физиологически, могут быть заменены описанными в настоящем описании агентами, тогда как при этом будут достигнуты такие же или подобные результаты. Все такие подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, будут находиться в рамках сущности, границ и концепции изобретения, как определено в прилагающейся формуле изобретения.

Ссылки.

Ссылки, приведенные ниже, введены в настоящее описание с помощью ссылки в такой степени, чтобы они добавляли, объясняли, обеспечивали описание уровня техники или чтобы они объясняли методологию, методы и/или применяемые в настоящем описании композиции.

и8 патент № 4554101; патент И8 № 4940838; патент И8 № 5015580; патент И8 № 5017692; патент И8 № 5229114; патент И8 № 5304730; патент И8 № 5322938; патент И8 № 5352605; патент И8 № 5359142; патент И8 № 5362865; патент И8 № 5378619; патент И8 № 5384253; патент И8 № 5445962; патент и8 № 5463175; патент И8 № 5464763; патент И8 № 5508184; патент И8 № 5512466; патент И8 № 5516671; патент И8 № 5530196; патент И8 № 5538880; патент И8 № 5543576; патент И8 № 5550318; патент и8 № 5552299; патент И8 № 5567600; патент И8 № 5567862; патент И8 № 5591616; патент И8 № 5633435; патент И8 № 5635055; патент И8 № 5641876; патент И8 № 5659122; патент И8 № 5689041; патент и8 № 5689052; патент И8 № 5716837; патент И8 № 5728925; патент И8 № 5750876; патент И8 № 5763241; патент И8 № 5763245; патент И8 № 5773696; патент И8 № 5804425; патент И8 № 5824877; патент и8 № 5837848; патент И8 № 5850019; патент И8 № 5850023; патент И8 № 5866775; патент И8 № 5869720; патент И8 № 5880275; патент И8 № 5942658; патент И8 № 5942664; патент И8 № 5958745; патент и8 № 5959091; патент И8 № 5981834; патент И8 № 5981840; патент И8 № 5985605; патент И8 № 5998700; патент И8 № 6011199; патент И8 № 6013864; патент И8 № 6015940; патент И8 № 6023013; патент и8 № 6051753; патент И8 № 6063597; патент И8 № 6063756; патент И8 № 6072103; патент И8 № 6080560; патент И8 № 6093695; патент И8 № 6107549; патент И8 № 6110464; патент И8 № 6121436; патент и8 № 6140075; патент И8 № 6140078; патент И8 № 6153814; патент И8 № 6156573; патент И8 № 6160208; патент И8 № 6166292; патент И8 № 6171640; патент И8 № 6175060; патент И8 № 6177611; патент и8 № 6177615; патент И8 № 6215048; патент И8 № 6221649; патент И8 № 6222098; патент И8 № 6225114; патент И8 № 6228623; патент И8 № 6228992; патент И8 № 6232526; патент И8 № 6235971; патент и8 № 6242241; патент И8 № 6248536; патент И8 № 6248876; патент И8 № 6252138; патент И8 № 6271443; патент И8 № 6281016; патент И8 № 6284949; патент И8 № 6294714; патент И8 № 6313378; патент и8 № 6316407; патент И8 № 6326351; патент И8 № 6372211; патент И8 № 6380462; патент И8 № 6380466; патент И8 № 6384301; патент И8 № 6399330; патент И8 № 6399861; патент И8 № 6403865; патент и8 № 6423828; патент И8 № 6426446; патент И8 № 6426447; патент И8 № 6429357; патент И8 № 6429362; патент И8 № 6433252; патент И8 № 6437217; патент И8 № 6441277; патент И8 № 6444876; патент и8 № 6448476; патент И8 № 6459018; патент И8 № 6468523; патент И8 № 6476295; патент И8 № 6483008; патент И8 № 6489461; патент И8 № 6495739; патент И8 № 6501009; патент И8 № 6506962; патент и8 № 6518488; патент И8 № 6521442; патент И8 № 6531648; патент И8 № 6537750; патент И8 № 6537756; патент И8 № 6538109; патент И8 № 6538178; патент И8 № 6538179; патент И8 № 6538181; патент и8 № 6541259; патент И8 № 6555655; патент И8 № 6573361; патент И8 № 6576818; патент И8 № 6589767; патент И8 № 6593293; патент И8 № 6596538; патент И8 № 6608241; патент И8 № 6617496; патент и8 № 6620988; патент И8 № 6635806; патент И8 № 6639054; патент И8 № 6642030; патент И8 № 6645497; патент И8 № 6653280; патент И8 № 6653530; патент И8 № 6657046; патент И8 № 6660849; патент и8 № 6663906; патент И8 № 6686452; патент И8 № 6706950; патент И8 № 6713063; патент И8 № 6716474; патент И8 № 6723837; патент И8 № 6723897; патент И8 № 6770465; патент И8 № 6774283; патент и8 № 6803501; патент И8 № 6809078; патент И8 № 6812379; патент И8 № 6822141; патент И8 № 6828475; патент И8 № 7022896; И8 патентная заявка 2003/0028917; И8 патентная заявка 2003/0135879; и8 патентная заявка 2003/01403641; патент И8 № 09/757089; патент И8 № ЯЕ37543; патент И8 №

- 18 017638

КЕ38446.

Аи§иЬе1 е1 а1., Ιη: СштеШ РгоЮеоБ ίη ΜοΚοη^ Вю1оду, ίοΐιη. νίΕν & 8оп§, 1пс, №\ν Уогк, 1995.

Вескег е( а1. Р1ап( Ыо1. Вю1., 20:1195-1197, 1992.

Вескег е( а1., Р1ап1 Μο1. Вю1., 20:49, 1992.

Ветап е( а1., NΑΚ, 11:369, 1983.

Вго(йег8 е( а1., №1иге, 433:630, 2005.

Сагппд1оп апб Ргееб, 1. оГ У1го1оду 64:1590-1597, 1990.

Сагппд1оп апб Ргееб, I. У1го1оду, 64:1590, 1990.

СйаШе е( а1., 8с1епсе, 263:802, 1994.

Сйапб1ег е( а1., Р1ап1 Се11, 1:1175-1183, 1989.

Сйапд е(а1., I. Вю1. Сйет., 31; 278(44):42821-42828, 2003.

Сйи е( а1., 8с1епНа 81шса, 18:659, 1975.

С1оидй апб Веп(, Р1ап1 1., 16:735, 1998.

Согк апб Кйа111, Абт. Арр1. Μία^ώ^ 40:289, 1995.

Согк апб Кшедег, Абт. Арр1. Μ^с^οЬ^ο1, 38:1, 1991.

Сог^ е( а1., ЕΜВ0 I., 3:1671, 1984.

Соги/.ζι е(а1., I. Вю1. Сйет., 258:1399-1402, 1983.

Сге18§еп е( а1., Р1ап1 1., 2:129, 1991.

Сгор Рго1есНоп КеГегепсе, Сйетка1 & Рйагтасеийса1 Рге§8, 1пс., ΚΥ, 11(й Еб., 1803-1821, 1995.

Ое В1оск е( а1., ЕΜВ0 I., 3:1681, 1984.

бе11а-Сюрра е( а1., Ргос. №ί1. Асаб. 8οΐ. И8А, 83:6873-6877, 1986.

Рерккег е( а1., I. Μο1. Арр1. Сепек, 1:561, 1982.

Бе^тапх е( а1., ВюсЫтка е( Вкрйуыса Ас(а, 1745:223-253, 2005.

ϋΐ03 е( а1., Ргос. №ί1. Асаб. 8οΐ. И8А, 77(12):7347-7351, 1980.

ЕЬей е( а1., Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А, 84:5745-5749, 1987.

ЕР Арр1п. 553494.

ЕР Арр1п. 646643.

Рга1еу е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 80:4803, 1983.

На|бик1е\\'^ е( а1., Р1ап1 Μο1. Вк1., 25:989-994, 1994.

На§е1оГГ е1 а1., Т1С, 11:328-329, 1995.

Негтап е1 а1., I. Вю1. Сйет., 280:24759-24767, 2005.

НоГГтапп е( а1., I. С1ш. Епбосппо1. ΜеίаЬ., 85(12):4795-498, 2000.

Ногзсй е( а1., 8скпсе, 227:1229, 1985.

1пде1Ьгесй1 е( а1., Р1ап1 Се11, 1:671, 1989.

1еГГег8оп, Р1ап1 Μο1. Вю1. Вер., 5:387, 1987.

Лап§ е1 а1., I. Вас1епо1., 178:3133-3139, 1996.

Кабо, Сп1. Кет. Р1ап1. 8ск, 10:1, 1991.

К1ее е1 а1., Ыо1 Сеп. Сепе1., 210:437-442, 1987.

Копсж апб 8сйе11, Ыо1. Сеп. Сепе1., 204:383, 396, 1986.

^μζ е( а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск, И8А, 84:131, 1987.

Кгиедег е( а1., I. Адгк. Рооб Сйет., 37:534, 1989.

Ку1е апб РооШЛе, I. Ыо1. Вю1., 157 (1):105-132, 1982.

Ба\\1оп е( а1., Р1ап1 Μο1. Вю1., 9:315-324, 1987.

Ь1оуб апб Ргос. 1п1. Р1ап1 Ргор. 8ос, 30:421, 1981.

Μаη^аί^8, е1 а1., Μο1еси1а^ С1ошпд, А БаЬога1огу Μаηиа1, Со1б 8рппд НагЬог Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, КУ., 1982.

Μа8οη, БК., апб Саттаск, Κ., Аппи. Кет. Μ^ι^μΙ 46:277-305, 1992.

Μίΐχί е1 а1., 1п: Μеίйοб8 т Р1ап( Μο1еси1а^ Вк1оду апб Вк1есйпо1оду, СНск апб Тйотрзоп (Еб§.), СКС Рге§8, 67-88, 1993.

Μίΐ5ΐ.ι1ι;·ΐΓ;·ι е( а1., Р1ап1 Се11 РйуЛок 37:49-59, 1996

Μο1οηеу е( а1., Р1ап1 Се11 Керогк, 8:238, 1989.

Μω^Μ^ апб 8коод, РйуЛок Р1ап1, 15:473-497, 1962.

0бе11 е1 а1., ХаИие, 313:810-812, 1985.

РСТ Арр1п. А0 04009761.

РСТ Арр1п. А0 95/24492.

РСТ Арр1п. А0 97/11086.

РСТ Арр1п. А0 97/31115.

РСТ Арр1п. А0 97/41228.

КоДуая е1 а1. (ЛР 1987201527-А), 1987.

8атЬгоок е1 а1., 1п: Μο1еси1а^ с1ошпд: а 1аЬога1огу тапиа1, 2^пб Еб., Со1б 8рппд НагЬог БаЬога1огу Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, ΚΥ, 1989.

8ои1йет, Μο1. Вю1., 98:503, 1975.

- 19 017638

8уаЬ е! а1., Р1ап! Мо1. ΒίοΙ., 14:197, 1990.

8уаЬ е! а1., Ргос. Να!1. Асаб. δα. И8А, 87 (21):8526-8530, 1990.

Тееп е! а1., ΕΜΒΟ I., 8:343, 1989.

Тигпег апб Еоз!ег, Μο1ес. В1о!есйп., 3:225, 1995.

\Уаба е! а1., ТЬгошЬ. Наеток!., 90(1):59-63, 2003.

\\'а1кег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 84:6624-6628, 1987.

Х1аотап апб Лпдйе, СЫп. Μеб. 8с1. I., 14(4):195-199, 1999.

Уапд е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 87:4144-4148, 1990.

ΖΙππίβ е! а1., Р1ап! Се11, Т188ие апб Огдап Си1!иге, 56: 37-46, 1999.

Список последовательностей <110 > С.ЕИЕ1ТТЕ, ТНОИАЕ Е.

ΡϋΜΙΤΚϋ, ΕΑΣνΑΝ

РЕКО, РАНЬ С. С.

ΡΙΛ8ΙΝ3ΚΙ, 3ΤΑΝ

ИЕЕК2, ПОИДЫ) Р.

<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФЕРМЕНТ БМО И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ <130> Μ0Νε:093Ν0 <140? υΝΚΝΟΝΝ <141> 2007-06-06 <150> 11/758657 <151> 2007-06-05 <150> 60/811152 <151> 2006-06-06 <160? 24 <170> РаСепЪШ Чет. 2.1 <210> 1 <211> 340 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 1

МеЁ А1а 1

ТЬг РЬе ναΙ 5

Агд Αεη А1а Тгр Туг 10

Уа1

А1а

А1а Ьеи

Рго 15

О1и

&1и

Ьеи

Зег

О1и

ьуз

Рго

Ьеи

<31у

Агд

ТЬг

Не

Ьеи

Азр

ТЬг

Рго

Ьеи

20

25

30

А1а

Ьеи

Туг

Агд

<Э1п

Рго

Азр

О1у

Уа1

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

ьеи

Азр

11е

35

40

45

Суз

Рго

Н15

Агд

РЬе

А1а

Рго

Ьеи

Зег

Азр

С1у

Не

Ьеи

Уа1

Азп

С1у

50

55

60

ΗΪ8

Ьеи.

С1п

Суз

Рго

Туг

ΗΪ3

С1у

Ьеи

С1и

РЬе

Азр

С1у

С1у

С1у

С1п

65

70

75

80

Суз

ν&ι

Н13

Азп

Рго

Ηΐβ

С1у

Азп

С1у

А1а

Агд

Рго

А1а

Зег

Ьеи

Азп

85

90

95

Уа1

Агд

Зег

рЬе

РГО

Уа1

Уа1

О1и

Агд

Азр

А1а

Ьеи

Не

Тгр

Не

Суз

100

105

110

Рго

С1у

Азр

рго

А1а

Ьеи

А1а

Азр

Рго

С1у

А1а

11е

Рго

Азр

РЬе

С1у

115

120

125

Суд

Агд

νθΐ

Азр

Рго

А1а

Туг

Агд

ТЬг

Уа1

С1у

С1у

Туг

О1у

ΗΪ8

7а1

130

135

140

Азр

Суз

Азп

Туг

Ьуз

Ьеи

Ьеи

ν&ι

Азр

Азп

Ьеи

МеЬ

Азр

Ьеи

(31у

ΗΪ3

145

150

155

160

- 20 017638

А1а

О1п Туг

Уа1 Н1з 165

Агд А1а Азп

А1а О1п ТЬг 170

Азр А1а

РЬе

Азр 175

Ахд

Ьеи

С1и

Агд

С1и

Уа1

Не

Уа1

<31у

АЗр

О1у

С1и

Не

С1п

А1а

Ьеи

Не С

180

185

190

Ьуз

11е

Рго

С1у

С1у

ТЬг

Рго

Зег

Уа1

Ьеи

МеС

А1а

Ьуз

РЬе

Ьеи

Агд

195

200

205

<31у

А1а

АЗП

ТЬг

Рго

Уа1

Азр

А1а

Тгр

Азп

Азр

11е

Агд

Тгр

Азп

Ьуз

210

215

220

Уа1

Зег

А1а

мес.

Ьеи

АЗП

РЬе

Не

А1а

Уа1

А1а

Рго

О1и

С1у

ТЬг

Рго

225

230

235

240

ЬуЭ

<31и

С1п

Зег

Не

Нхз

Зег

Агд

С1у

ТЬг

ΗΪ5

Не

Ьеи

ТЬг

РГО

О1и

245

250

255

ТЬг

О1и

А1а

Зег

Суз

Н1з

Туг

РЬе

РЬе

О1у

Зег

Зег

Агд

Азп

РЬе

С1у

260

265

270

Не

Азр

Азр

Рго

С1и

МеБ

Азр

С1у

Уа1

Ьеи

Агд

Зег

Тгр

αΐη

А1а

С1л

275

280

285

А1а

Ьеи

Уа1

ьуз

σι и

Азр

Ьуз

Уа1

Уа1

Уа1

С1и

А1а

Не

О1 и

Агд

Агд

290

295

3 0 0

Агд

А1а

Туг

Уа1

О1и

А1а

АЗП

О1у

Не

Агд

Рго

А1а

МеБ

Ьеи

Зег

Суз

305

310

315

320

Азр

С1и

А1а

А1а

Уа1

Агд

Уа1

Зег

Агд

С1и

Т1е

С1и

Ьуз

Ьеи

С1и

С1п

325

ззо

335

Ьеи С1и А1а А1а

340 <210> 2 <211> 1023 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223э Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 2 аСддссассе СсдЪссдсаа СдссСддСаС дЪддсддсдс Сдсссдадда аседС-ссдаа60 аадссдсДсд дссддасдаС- ГсЬсдасаса ссдсрсдсдс СсРассдсса дсссдасддр120 дСддСсдсдд сдсС-дсЪсда са&сСдСссд сассдсСХсд сдссдсСдад сдасддсакс180 сСсдЕсаасд дссаСсБсса аС-дссссСаС сасдддсСдд ааССсдаСдд сддсдддсад240 рдсдБссаРа асссдсасдд сааСддсдсс сдсссддсм: сдсСсаасдр ссдсЬссСРс300 ссддсддрдд адсдсдасдс дссдарссдд аБсСдс.сссд дсдаСссддс дсСддссдаС.360 ссСддддсда СссссдасЬС. сддсСдссдс дСсда^сссд ссСаСсддас сдСсддсддс420

ЪаСдддааЬд СсдасЬдсаа сЬасаадсЕд с^ддСсдаса ассСдаСдда ссбсддссас430 дсссааСаЪд СссаСсдсдс саасдсссад ассдасдссС ЬсдассддсЕ ддадсдсдад540 дсдаБсдС.сд дсдасддрда даБасаддсд срда^даада Срсссддсдд сасдссдадс600 дЬдседаедд ссаадССссС. дсдсддсдсс аа1хасссссд ЬсдасдсСС-д даасдасаЬс660 сдсЪддааса аддЪдадсдс даЪдсБсаас С-БсаСсдсдд Бддсдссдда аддсассссд720 ааддадсада дсаСссасЕс дсдсддЕасс саЬаЬссЬда сссссдадас ддаддсдадс780

ЪдссаССаЫ ссС-Ссддсес сСсдсдсааС ХгЪсддсаСсд асдаСссдда даСддасддс840 дсдссдсдса дссддсаддс ссаддсдссд дъсааддадд асааддс.сде сддсдаддсд900 аЪсдадсдсс дссдсдссЬа •СдЬсдаддсд ааЪддсаБсс дсссддсдаЬ дсЪдЪсдЕдс960 дасдаадссд садСссдСдЬ садссдсдад аСсдадаадс ЬСдадсадсЕ сдаадссдсс1020

- 21 017638

Еда 1023 <210? 3 <211> 1023 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 3 аЕддссасЕЕ ЕсдЕЕадааа сдсСЕддЕас дССдсЕдсас ЕСссРдадда дССдадсдад60 аадссСсЕад даадаасСаС ссЕсдаЕасЕ ссассадсЕс ЕсЕассдСса асссдасдда120 дССдСсдсЕд сссСдсЕСда ЕаСЕЕдЕссд саЕсдсЕЕсд сЕссдЕЕдад СдасддЕаЕЕ180 сЕадСсаасд дасаЕсЕсса дЕдЕссаЕаЕ сасддЕсЕдд ааСЕЕдасдд аддЕддссад240

ЕдЕдЕссаса асссдсасдд саасддадсс сдсссЕдсЕЕ сЕсЕдаасдЕ дсдаЕсаЕЕс300 ссЕдЕсдЕдд ааададасдс ассдарссдд аЕсЕдсссЕд дадаЕссадс асЕсдсадаЕ3 60 сссддРдсЕа ЕсссЕдасЕЕ ЕдддСдЕсдЕ дЕЕдаессад сЕЕассдЕас рдссддаддс420

ЕасддЕсасд ЕддасЕдсаа сЕасаадсЕс сЕЕдЕддаЕа ассЕсаЕдда СсЕСддасас480 дсЕсадЕасд Едсассдсдс Еаасдсссаа асадасдссЕ ЕсдаЕадасЕ ЕдадсдЕдад540 дЕдаЕсдЕЕд дсдасддсда даЕссаддсд сЕсаЕдаада ЕссоСддЕдд сасасссЕса600 дСЕсЕсаРдд сЕаадЕЕсЕЕ дсдЕддрдсС аасасассад СЕдасдоесд даасдасаЕс¢60 сддЕддааЕа аддЕдрсддс ЕаЕдссдаас СЕсаесдсдд есдсдссдда адддасдссд720 ааддадсадЕ сааСссасЕс ссдаддаасс саЕаЕссЕЕа сЕссЕдадас сдаддсаадс780

ЕдссаЕЕасЕ ЕсЕЕсддЕад ЕЕсссдсаас ЕСсддЕаЕад асдаЕссада даСддасддЕ840 дЕЕсЕсадда дсЕддсаадс ЕсаадсссЕд дСдааддадд асааадЕддС сдСЕдаадсЕ900 аЕсдаааддс ддадддсЕЕа сдЕсдаадсд аасдддаЕса дасссдссаЕ дЕРдЕссЕдс960 дасдаддсад ссдСсадддЕ аСссадддад ассдадаадс Есдаасааср адаадсддсд1020

Еда1023 <210> 4 <211> 120 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 4

Зег 1

Азр

Не

Суз

Рго 5

ΗΪ3 Агд РЬе

А1а

Рго 10

Ьеи

Н1з

Ьеи

С1у

Ьуз 15

11е

Уа1

Азр

51у

Суз

Агд

Не

<31п

Суз

А1а

Туг

Ηίβ

А1а

Ьеи

С1и

РЬе

Азр

20

25

30

О1у

ТЬг

<Э1у

А1а

Суз

Уа1

Ьуз

Азп

Рго

ΗΪ8

С1у

Ьуз

С1п

Ьуз

11е

Рго

35

40

45

А1а

А1а

А1а

Ьуз

Ьеи

Θΐπ

А1а

Туг

Рго

Уа1

Уа1

61и

ьуз

Н18

Зег

ьеи

50

55

60

Не

Тгр

Уа1

Тгр

МеЕ

С1у

С1и

С1п

А1а

А1а

А1а

Азр

Рго

Зег

Уа1

Т1е

65

70

75

80

Рго

Азр

РЬе

Зег

Мес

Ьеи

Азр

Рго

Азр

Зег

С1у

РЬе

С1п

Уа1

Зег

Агд

85

90

95

Агд

Азр

Тгр

Ьеи

ΗΪ3

МеЕ

Азр

А1а

Зег

Туг

Азр

Ьеи

Уа1

Уа1

Азр

Азп

100

105

110

Ьеи МеЕ Азр Ьеи Бег Нхз ТЬг А1а

115 120

- 22 017638 <210> 5 <211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 5

А1а Азр Агд 1

Суз

Рго 5

ΗΪ5

Агд Рке Уа1

Рго Ьеи 10

Зег Агд

О1у

О1п 15

Агд

Азр

<31у

Азр

мее

мее

Ахд

Суй

С1у

туг

ΗΪ3

<31у

Ьеи

А1а

РЬе

Бег

Зег

20

25

30

Зег

<31у

<31у

Суз

Уа1

Ηίε

Αεη

Рго

РЬе

ТЬг

Аэр

01и

А1а

Ьеи

Рго

Ьеи

35

40

45

А1а Агд Уа1 О1и Уа1 Ьеи Рго Уа1 Уа1 С1и

55 <210> 6 к211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<31у С1у 1

Агд Суз

Рго 5

Н13 Агд

РЬе

А1а Рго 10

Ьеи <31у Ηίε

(31у

Зег 15

Уа1

Уа1

Азр

(31у

А1а

Ьеи

мес

Суз

Рго

Туг

Н13

(31у

Ьеи

Агд

Рке

Азр

<31у

20

25

30

Азр

С1у

Агд

Суз

Уа1

ΗΪ8

Азп

Рго

Ηί3

Рго

С1у

О1у

ΗΪ3

Ьеи

Рго

Азр

35

40

45

А1а Агд С1п Агд Уа1 Туг Рго Ьеи Уа1 О1и 50 55 <210> 7 <211> 59 <212> Белок <213> Искусственная последовательность с220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 7

Ьеи 1

Азр

Не Суз

Рго ΗΪ3 Агд РЬе А1а Рго Ьеи 5ег Азр С1у Не Ьеи

5

10

15

Уа1

Азп

О1у

Ηίε

Ьеи

©1п

Суз

Рго

Туг

Нхз

С1у

Ьеи

С1и

Рке

Азр

<31у

20

25

30

О1у

О1у

О1п

Суз

Уа1

Ηί 5

Азп

Рго

Ηίε

С1у

Авп

<31у

А1а

Агд

Рго

А1а

40 45

8ег Ьеи Азп Уа1 Агд Зег Рке Рго Уа1 Уа1 С1и

55 <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400>

С1и 1

Азр

Рке

Суз

Рго 5

Н1з

Агд

С1у

А1а

Рго 10

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у

Рке 15

ν31

Агд

Азр

С1у

νβΐ 20

Ьеи

νβΐ

Суз

С1у

Туг 25

Н1з

С1у

Ьеи

С1и

Мее 30

С1у

Суз

Азп

С1у

Ьуз 35

Ткг

А1а

А1а

Мек

Рго 40

С1у

С1п

Агд

Уа1

С1у 45

С1у

Рке

Рго

А1а

Не 50

Агд

Зег

РЬе

Рго

Уа1 55

Уа1

С1и

<2Ю>	9
<211>	57
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>

последовательность <400>

С1и 1

Азр

РЬе

Суз

Рго 5

ΗΪ3

Агд

С1у

А1а

Рго 10

Ьеи

Зег

Ьеи

С1у

РЬе 15

уа1

Агд

Азр

С1у

Уа1 20

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

Туг 25

ΗΪ3

С1у

Ьеи

С1и

Ме£ 30

С1у

Суз

Азп

31у

Ьуз 35

Рго

А1а

С1у

Мее

Рго 40

С1у

С1п

Агд

Уа1

<31у 45

С1у

РЬе

Рго

Зег

11е 50

Агд

Зег

РЬе

Рго

А1а 55

Уа1

&1и

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400>

01и 1

Азр

РЬе

Суз

Рго 5

Н_Б

Агд

С1у

А1а

Рго 10

Ьеи

Зег

Ьеи

<31у

Рке 15

νπΐ

Агд

Азр

01у

ΗΪ3 20

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

Туг 25

Ηίδ

31у

Ьеи

Ткг

Мек 30

Ьуз

А1а

Азр

С1у

Ьуз

Суз

А1а

Зег

мее

Рго

<31у

<31п

Агд

Уа1

<31у

О1у

РЬе

Рго

- 24 017638

40 45

Суз Не Агд С1п Рке Рго Уа1 Уа1 <31и

55 <210? 11 <211? 57 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 11

<31и 1

Аер Рке

Суз

Рго Н1з 5

Агд

31у А1а

Рго Ьеи Зег Ьеи <31у Рке

Уа1

10

15

Агд

Азр

С1у

αΐη

Ьеи

Уа1

Суз

С1у

Туг

ΗΪ8

О1у

Ьеи

О1и

МеС

<31у

Суз

20

25

30

Азр

С1у

Ьуз

Суз

Зег

Зег

Меб

Рго

С1у

С1п

Агд

Уа1

Агд

С1у

Рке

Рго

35

40

45

Зег 11е Ηίε А1а Туг Рго Уа1 Уа1 (31и

55 <210? 12 <211? 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 12

С1и 1

Азр

А1а

Суз

Тгр 5

Н13

Агд

Ьеи

Уа1

Рго 10

Ьеи

Зег

Ьуз

С1у

Агд 15

Ьеи

С1и

С1у

Азр

Ткг 20

Уа1

Уа1

Суз

С1у

Туг 25

ΗΪ5

С1у

Ьеи

Ьуз

Рке 30

Азп

Рго

С1п

<31у

Агд 35

Суз

Ткг

Туг

МеЬ

Рго 40

Зег

<31п

С1и

Ткг

11е 45

Азп

Рго

Зег

А1а

Суз 50

Уа1

Агд

Зег

Туг

Рго 55

Уа1

Уа1

<31и

<210? 13 <211> 58 <212> Белок ' <213> Искусственная последовательность <220>

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 13

О1и Азр А1а Суз Тгр Н1з

Агд

Ьеи Уа1

Рго Ьеи Зег Ьуз 10

(71у Агд Ьеи 15

1

5

С1и

<31у Азр

Ткг

Уа1

Уа1

Суз

О1у

Туг

ΗΪ8

31у Ьеи

Ьуз

Туг

Азп А1а

20

25

30

- 25 017638

АЗП РГО 2ег

<210? 14 <211? 60 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223? Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 14

Ьуз

Нхз

Зег

Ьеи

Не

Тгр

Уа1

Тгр

мес

С1у

С1и

Θΐη

А1а

А1а

А1а

Азр

1

5

10

15

Рго

Зег

Уа1

Не

Рго

Азр

РЬе

Зег

МеС

Ьеи

Азр

Рго

Азр

Зег

С1у

РЬе

20

25

30

31п

Уа1

зег

Агд

Агд

Аер

Тгр

Ьеи

Нхз

МеС.

Азр

А1а

Зег

Туг

Авр

Ьеи

35

40

45

Уа1

Уа1

АЗР

Азп

Ьеи

МеС

Азр

Ьеи

Зег

Н13

Т11Г

А1а

55 60 <210? 15 <211? 57 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 15

Ьуз 1

Нхв

ТЬг

О1у Ьеи 5

Тгр

РЬе Тгр

Рго С1у 10

Авр

А1а Азр

Агд

А1а 15

Азр

Рго

А1а

Ьеи

Не

Рго

Азр

РЬе

С1у

РЬе

Ьеи

Авр

Уа1

С1и

Агд

Рго

Ьеи

20

25

30

ИХ 5

Агд

<Э1у

Нхз

Ьеи

Ьуз

МеС

Азр

А1а

С1у

Туг

С1и

ьеи

Уа1

ТЬг

Азр

35

40

45

АЗП

Ьеи

МеС

Азр

Ьеи

Зег

Нхз

А1а

С1и

55 <210> 16 <211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 16

Агд Нхв А1а Ьеи Ьеи Тгр Не Тгр МеЬ <31у Авр А1а А1а Ьув А1а Авр

10 15

- 26 017638

Рго

А1а

5ег

Не 20

Рго

Азр

Рке

Зег

Тгр 25

Ьеи Зег

АЗр

Рго

Агд 30

Тгр

О1и

А1а

Уа1

Агд 35

С1у

А1а

Ткг

ν*1

А1а 40

О1и

<31у Н13

Рке

О1и 45

Ьеи

Туг

Зег

Авр

Авп

Не

Ьеи

Азр

Ьеи

Зег

Н18

А1а

Авп

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <400>

Агд 1

Азр

А1а

Ьеи

Не 5

Тгр

Не

Тгр

Рго

01у 10

Азр

Рго

А1а

Ьеи

А1а 15

Азр

Рго

О1у

А1а

Не 20

РГО

Азр

Рке

01у

Суз 25

Агд

Уа1

Азр

Рго

А1а 30

Туг

Агд

Ткг

Уа1

01у 35

<31у

Туг

О1у

Ηίε

Уа1 40

Азр

Суз

Азп

Туг

Ьуз 45

Ьеи

Ьеи

Уа1

Азр

Авп

Ьеи

Мер

Азр

Ьеи

01у

Ηίε

А1а

01П

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид ;400>

Агд 1

туг

01у

Рке

Уа1 5

тгр

Уа1

Тгр

Рго

О1у 10

Азр

А1а

Зег

Агд

А1а 15

Азр

Рго

А1а

А1а

ьеи 20

Рго

А1а

Ьеи

Ткг

тгр 25

А1а

Азр

Азр

Рго

Уа1 30

Тгр

А1а

Ηίε

С1у

С1у 35

С1у

Ьеи

Туг

Нхз

Не 40

Агд

Суз

Азр

Туг

Агд 45

Ьеи

МеС

Не

Азр

Азп

Ьеи

МеС

Азр

Ьеи

Ткг

ΗΪ3

О1и

ткг

<210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид <400> 19

Агд Туг С1у Рке Уа1 Тгр Уа1 тгр Рго С1у Авр А1а бег С1и А1а Азр

- 27 017638

5 10 15

Рго

А1а

Ьуз

Ьеи 20

Рго

А1а

Ьеи

А1а

Тгр 25

А1а

С31и

Азр

Рго

А1а 30

Тгр

А1а

нхз

С1у

С1у 35

С1у

Ьеи

Туг

Нхв

11е 40

Агд

Суз

Азр

Туг

Агд 45

Ьеи

МеС

Не

Азр

Азп

Ьеи

Мей

Азр

Ьеи

тЬг

ΗΪ3

С1и

ТЬг

55 <210> 20 <211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 20

Агд 1

Туг

<Э1у

РЬе

11е 5

Тгр

Уа1

Тгр

Рго

<31у 10

Азр

Рго

С1и

<31п

А1а 15

Авр

Рго

А1а

Агд

Не 20

Нхз

Нхз

Ьеи

С1и

Тгр 25

А1а

С1и

5ег

С1и

А1а 30

Тгр

А1а

Туг

О1у

С1у 35

О1у

Ьеи

Туг

Нхз

11е 40

С1п

Сув

Азр

Туг

Агд 45

Ьеи

МеС

Не

Азр

АЗП

Ьеи

мед

Авр

ьеи

ТЫ

ΗΪ3

О1и

ТЬг

55 <210> 21 <211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 21

Агд 1

Н13

С1у РЬе

11е 5

Тгр Уа1

Тгр

Рго С1у 10

Авр А1а С1и

С1п

А1а 15

Авр

Рго

Авр

<31п

11е

Рго

С1и

Ьеи

ΗΪ8

Тгр

А1а

Азп

Азр

Рго

С1и

Тгр

А1а

20

25

30

Туг

<Э1у

<31у

Э1у

Ьеи

Туг

Нхз

11е

АЗП

Суз

АЗр

Туг

Агд

Ьеи

МеС

Не

35

40

45

Азр

Авп

Ьеи

МеЬ

Азр

Ьеи

ТЬг

Н13

С1и

ТЬг

50

55

<210> 22 <211> 58 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

с223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 28 017638 <400> 22

Агд

Нхз

Агд

РЬе

Уа1

Тгр

Ьеи

Тгр

МеС

61у

Азр

Рго

Уа1

Ьеи

А1а

Азр

1

5

10

15

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Рго

Азр

мее

ΗΪ8

Тгр

Азп.

Азр

Азр

Рго

А1а

Тгр

А1а

20

25

30

<31у

Аар

С1у

Ьуз

ТЬг

Не

Туг

А1а

Ьуз

Суз

Азр

Тгр

Агд

Ьеи

Уа1

Уа1

35

40

45

Азр

Азп

Ьеи

Мес

Азр

Ьеи

ТЬг

ΗΪ3

О1и

ТЬг

55 с210> 23 <211> 58 ?212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<40С

23

Агд

Ηίε

Агд

Туг

Не

Тгр

Ьеи

Тгр

мес

<31у

Азр

Рго

А1а

Ьеи

А1а

Азр

1

5

10

15

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Рго

Азр

мес

Н1з

тгр

Азп

ΗΪ3

Азр

Рго

А1а

Тгр

А1а

20

25

30

С1у

Азр

<Э1у

Ьуз

ТЬг

Не

Агд

Уа1

АЗП

Суз

Азр

Туг

Агд

Ьеи

Уа1

Ьеи

35

40

45

Азр

Азп

Ьеи

мес

Азр

Ьеи

тЬг

ΗΪ3

С1и

ТЬг

50

55

<210> 24 <211> 433 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 24 адаСсССдад ссааСсааад аддадСдаСд СадассСааа дсааСааСдд адссаСдасд 60

СаадддсССа сдсссаСасд аааСааССаа аддсЬдаСдС дасссдСсдд СсСсссадаа 120 сссссасссс ссасдсссдд сдСдСаСССС СааасССсса сддсаасдас даСдСдассс 180 аасдадассс Сдадссааес ааададдадС даСдсадасс СааадсааСа асддадсоас 240 дасдсааддд сССасдссса Сасдааасаа ССаааддсСд аСдСдассСд ссддСсСсСс 3 00 адаассССЕа сСССССаСаС БСддсдСдСа ССССЬаааСС Сссасддсаа СдасдаСдСд 350 ассСдСдсаС ссдсСССдсс СаСаааСаад ССССадСССд СаСЬдаСсда сасддСсдад 420 аадасасддс саС 433

Claims (24)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из:

   a) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1;

   b) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2; и

   c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, а 8Е0 ΙΌ N0: 1 содержит цистеин в положении 112.
2. 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, входящая в состав плазмиды рК^Р36-ТЕУ-ТР-^Μ0с, АТСС РТА-7357.
3. 3. Конструкция ДНК, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:

   a) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1;

   b) молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2; и

   c) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, а 8Е0 ΙΌ N0: 1 содержит цистеин в положении 112, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором.
4. 4. Конструкция по п.3, где промотор является функциональным в растительной клетке.
5. 5. Конструкция по п.3, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с хлоропластным транзитным пептидом.
6. 6. Полипептид, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8Е0 ΙΌ N0: 1, где полипептид обладает дикамба-монооксигеназной активностью, а 8Е0 ΙΌ N0: 1 включает цистеин в положении 112.
7. 7. Растительная клетка, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по п.1.
8. 8. Клетка по п.7, представляющая собой клетку двудольного растения.
9. 9. Клетка по п.7, представляющая собой клетку однодольного растения.
10. 10. Клетка по п.8, представляющая собой клетку сои, хлопчатника, маиса или рапса.
11. 11. Культура растительной ткани, включающая клетку по п.7.

    - 29 017638
12. 12. Трансгенное растение, трансформированное молекулой нуклеиновой кислоты по п.1.
13. 13. Трансгенное растение по п.12, представляющее собой двудольное растение.
14. 14. Трансгенное растение по п.12, представляющее собой однодольное растение.
15. 15. Трансгенное растение по п.12, представляющее собой сою, хлопчатник, маис или рапс.
16. 16. Способ получения растения, толерантного к дикамбе, включающий введение в растение конструкции по п.3.
17. 17. Способ по п.16, включающий введение конструкции по п.3 в указанное растение путем стабильной трансформации исходной растительной клетки и регенерации клетки в указанное растение, толерантное к дикамбе.
18. 18. Способ получения растения, толерантного к дикамбе, путем скрещивания родительского растения с самим собой или со вторым растением, где родительское растение и/или второе растение включают конструкцию по п.3, введенную в растение путем трансформации, и растение, толерантное к дикамбе, наследует указанную конструкцию от родительского растения и/или от второго растения.
19. 19. Способ контроля роста сорняков в окружении сельскохозяйственной культуры, включающей растение по п.12 или его семя, предусматривающий нанесение эффективного для контроля роста сорняков количества гербицида дикамба вокруг указанной сельскохозяйственной культуры.
20. 20. Способ по п.19, где гербицид дикамба наносят на верхушки растений, окружающих указанную сельскохозяйственную культуру.
21. 21. Способ по п.19, где количество гербицида дикамба не повреждает указанное растение по п.12 или его семя, но повреждает растение такого же генотипа, что и растение по п.12, лишенное нуклеиновой кислоты по п.1.
22. 22. Способ получения пищевого, кормового или промышленного продукта, включающий:

    a) получение растения по п.12 или его части;

    b) приготовление пищевого, кормового или промышленного продукта из растения или его части.
23. 23. Способ по п.22, где пищевой или кормовой продукт представляет собой масло, муку, зерно, крахмал, порошок или белок.
24. 24. Способ по п.22, где промышленный продукт представляет собой биотопливо, волокно, химическое вещество для производственных нужд, лекарственное средство или нутрицевтик.