UA118841C2

UA118841C2 - Спосіб формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи-шкідника

Info

Publication number: UA118841C2
Application number: UAA201507615A
Authority: UA
Inventors: Амір Авніель; Єфрат Лідор-Нілі; Руді Маор; Офір Меір; Орлі Нойвірт-Брік
Original assignee: Ей.Бі. СІДС ЛТД.
Priority date: 2013-01-01
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2019-03-25
Also published as: CL2015001874A1; EA032406B1; WO2014106838A3; AU2013371825B2; CN105358695A; AU2013371825A1; UY35252A; WO2014106837A3; BR112015015975A2; US10041068B2; IL239746B; MX2015008611A; WO2014106838A2; WO2014106837A2; EP2941487A2; BR112015015976A2; EP2941488B1; US20140296503A1; IL239746A0; US20190002878A1

Abstract

Винахід стосується способу формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи-шкідника, який включає праймінг насінини перед контактом насінини з молекулою голої дволанцюгової РНК (длРНК), який здійснюють шляхом промивання насінини перед вказаним контактуванням насінини і наступного сушіння насінини; контакт згаданої насінини напряму зі згаданою молекулою длРНК, яка включає щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або послідовність РНК, транскрибовану зі згаданого гена, контакт здійснюють шляхом замочування насінини у розчині, що містить остаточну концентрацію від 0,0005 мкг/мкл до 3 мкг/мкл згаданої молекули голої длРНК, та збовтування насінини у цьому розчині протягом від 4 до 24 годин, причому молекула голої длРНК вводиться у згадану насінину, проте не експресується з геному рослини, тобто не стає невід’ємним елементом геному; і пророщування насінини для отримання рослини, яка проявляє поліпшену стійкість до цієї комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною.

Description

(57) Реферат:

Винахід стосується способу формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи- шкідника, який включає праймінг насінини перед контактом насінини з молекулою голої дволанцюгової РНК (длРНК), який здійснюють шляхом промивання насінини перед вказаним контактуванням насінини і наступного сушіння насінини; контакт згаданої насінини напряму зі згаданою молекулою длРНК, яка включає щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи- шкідника або послідовність РНК, транскрибовану зі згаданого гена, контакт здійснюють шляхом замочування насінини у розчині, що містить остаточну концентрацію від 0,0005 мкг/мкл до З мкг/мкл згаданої молекули голої длРНК, та збовтування насінини у цьому розчині протягом від 4 до 24 годин, причому молекула голої длРНК вводиться у згадану насінину, проте не експресується з геному рослини, тобто не стає невід'ємним елементом геному; і пророщування насінини для отримання рослини, яка проявляє поліпшену стійкість до цієї комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною.

В. СЕ

Ек

ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ ФРЕЙМ

ІДЕНТИЧНІСТЬ

Яку й мене я их ра жів ук и їх у, ХЕ мух у ех ект

КЕ: ЩЕ й ех А. пк ИтОоє

ОЗНАКИ:

ВА шк ок я ВН ИН ОВК ОКУ щ 5 ка п БЕЖ Ж я ї кт ди й й Ки Кв ЕК шк пе АК зи жи в

МИ ЛЮ А юви в ко ННЯ ни щ

ФфІгЛ1Ос

Область техніки

Запропоновано способи та композиції для поліпшення стійкості насіння до комах-шкідників.

Також запропоновані спосіб і композиції для поліпшення стійкості рослин до вірусних патогенів.

Передумови для створення винаходу

При зростаючій кількості населення світу і зростанні попиту на їжу, паливо і волокно, а також враховуючи зміни клімату, сільське господарство зазнає безпрецедентних труднощів. Вкрай бажаним є культивування рослин з поліпшеними характеристиками, причому деякі з основних характеристик, які становлять великий інтерес для фермерів і компаній, що виробляють насіння, включають підвищену толерантність до абіотичного стресу, ефективність використання добрив, стійкість до хвороб, врожайність і т.д.

Характеристики рослин зазвичай вдосконалюють або генно-інженерними методами, або традиційною селекцією. Вкрай бажаними є нові способи вдосконалення характеристик шляхом модифікації специфічних генів. Вони включають способи надекспресії генів або сайленсінгу генів. Хорошим способом сайленсінгу послідовність-специфічних генів є РНК-інтерференція (далі КМАЇї). Вперше відкрита в нематоді С.еІедапзо (Файр та ін. (Ріге еї а.) 1998, Маїшиге, 391: 806-811), ЕМАЇ є механізмом, в якому експресія окремого гена може бути специфічно пригнічена шляхом введення дволанцюгової РНК (далі дсРНК або азеМА), яка гомологічна з обраним геном в клітинах. Усередині клітини молекули а85ЕМА розрізаються на більш короткі фрагменти з 21 - 27 нуклеотидів ферментом, що належить до звязуючого фермента рибонуклеази ЇЇ (сімейство білків Оісег). Ці фрагменти, що звуться малими інтерферуючими РНК (далі міРнК або 5ікМА), включають в РнНК-їндукований сайленсінг-комплекс (далі РНК-індукований сайленсінг--комплекс або КІЗС). Після додаткової обробки 5ікЖМА трансформують у одноланцюгові РНК, які діють як провідні послідовності для розщеплення, в кінцевому результаті, месенджерних РНК-мішеней. Шляхом використання КМАї для специфічного сайленсінгу відповідних генів-мішеней, можна змінювати базові характеристики організму. У специфічному застосуванні до рослин це має неймовірний потенціал для модифікацій, які можуть призвести до підвищеної стійкості до стресу і підвищеної врожайності зернових.

КМАЇ в рослинах зазвичай виконують шляхом продукції трансгенних рослин, які надекспресують фрагмент ДНК, який транскрибують для отримання а5КМА. Цю азкМА потім

Зо обробляють для отримання 5ікЖМА, які опосередковують відщеплення і сайленсінг генів- мішеней.

Основне технічне обмеження цієї технології полягає в тому, що багато важливих видів сільськогосподарських культур важко або неможливо трансформувати, що виключає конститутивну експресію конструктів, направляючих продукцію 85КМА. Більше того, питання, що стосуються потенційного впливу стійких до вірусів трансгенних рослин на екологію, досі значно обмежують їх використання (Тепфер (Теріег), 2002, Аппи. Кем. Рпуїораїйої. 40, 467-491).

Додаткова проблема в отриманні трансгенних рослин відноситься до проблеми забезпечення подій трансформації і регенерації в клітинах одних і тих же типів.

У зв'язку з цим, розробка способу отримання трансформованого насіння, який не залежить від способів, що відносяться до культивування тканин, є пріоритетним дослідженням в галузі молекулярної біології рослин.

Розкриття винаходу

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропонований спосіб введення голої 45КМА в насінину, причому спосіб включає контакт насінини з голою а5КМА в умовах, які дозволяють Д5КМА проникати в насінину, тим самим вводячи а5КМА в насінину.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано ізольоване насіння, що включає екзогенну голу азЕМА, причому насіння позбавлене гетерологічного промотора для стимуляції експресії азЕМА в рослині.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано ізольовану насінину, що включає екзогенну голу О5ЕМАЗ.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано рослину або частину рослини, що включають екзогенну голу а5ЕМА та позбавлені гетерологічного промотора для стимуляції експресії азЕМА в рослині.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано пристрій для вміщення насінини, що включає деяку кількість такого насіння.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропоновано засіяне поле, що включає деяку кількість такого насіння.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропонований 60 спосіб отримання рослини, причому спосіб включає:

(а) отримання насінини і (б) пророщування насінини, щоб отримати рослину.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропонований спосіб модуляції експресії генів, причому спосіб включає: (а) контакт насінини рослини з голою а5КМА в умовах, які дозволяють 85ЕМА проникати в насінину, тим самим вводячи а5КМА в насінину, і, за вибором, (р) отримання рослини з насінини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, гола азЗКМА призначена для зниження експресії гена рослини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, гола азЗКМА призначена для зниження експресії гена фітопатогена.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, проникнення здійснюється в ендосперм і, альтернативно або додатково, в зародок насінини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, гола азЕМА не інтегрується в геном насіння.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, умови призводять до присутності а5зКМА в рослині протягом щонайменше 10 діб після проростання.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропонований спосіб інгібування експресії гена-мішені в фітопатогенному організмі, причому спосіб включає вплив фітопатогенного організму на рослину або частину рослини, тим самим інгібуючи експресію гена-мішені в фітопатогенному організмі.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, фітопатогенний організм вибирають з групи, що складається з гриба, нематоди і комахи.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, спосіб крім того включає спостереження смерті або інгібування росту фітопатогена після отримання.

Відповідно до одного аспекту деяких варіантів здійснення даного винаходу, запропонований набір для введення голої Д5ЕМА в насіння, що включає: () голу азКМА і (ії) праймінговий розчин.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, гола а5КМА і розчини для праймінга (передпосівного замочування) містяться в роздільних контейнерах.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, 85КМА включає 5ікМА.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, 85КМА включає 5ікМА і азКМА.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, контакт здійснюють шляхом інокуляції азКМА в насінину.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, спосіб крім того включає праймінг насінини перед контактом.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, праймінг здійснюють шляхом: (|) промивки насінини перед контактом і (і) сушіння насінини після етапу (1).

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, промивку здійснюють у присутності двічі деіонізованої води.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, промивку здійснюють протягом 2 - 6 годин.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, промивку здійснюють при 4 - 28 26.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, сушіння здійснюють при 25 - 30 С протягом 10 - 16 годин.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, контакт здійснюють у присутності голої а5КМА в кінцевій концентрації 0,1 - 100 мкг/мкл.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, контакт здійснюють у присутності голої а5КМА в кінцевій концентрації 0,1 - 0,5 мкг/мкл.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, спосіб крім того включає обробку насінини агентом, який вибирається з групи, що складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу, після контакту.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, обробка включає покриття насінини агентом.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, насінини не містить агента, який вибирається з групи, що складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. 60 Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, 45ЕМА призначена для зниження експресії кодуючого гена.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, 45ЕМА призначена для зниження експресії некодуючого гена.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, насінина належить до надродини зелених рослин.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, умови дозволяють азКмМА накопичуватися в ендоспермі і, альтернативно або додатково, в зародку насінини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, концентрацію голої ОБЕКМА регулюють по параметру, який вибирається з групи, що складається з розміру насінини, маси насінини, об'єму насінини, площі поверхні насінини, щільності насінини і проникності насінини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, контакт здійснюють перед порушенням стану спокою насінини і появою зародка.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, насіниною є замочена в праймінговому розчині насінина.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, насінина або рослина включає активність РНК-залежної РНК-полімерази для ампліфікації експресії а5КМА.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, насіниною є гібридна насінина.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, запропонована ізольована а5КМА, що включає нуклеїнокислотну послідовність, що має: () рівень гомології з геном рослини, достатній для індукування ампліфікації вторинних 5івМА-продуктів 85КМА в клітині рослини, яка включає їх, причому зниження активності гена рослини а5КМА несуттєво впливає на біомасу, силу або врожайність рослини; і (і) рівень гомології з геном фітопатогенного організму, достатній для індукування деградації гена фітопатогенного організму, причому фітопатогенний організм залежить від вирощуваної рослини, і причому деградація індукує припинення росту або смерть фітопатогенного організму.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, нуклеїнокислотна послідовність має довжину щонайменше 25 пар основ. Відповідно до деяких варіантів здійснення, нуклеїнокислотна послідовність має довжину 25 -70 пар основ. Відповідно до деяких варіантів здійснення, О5БКЕМА з такою нуклеїнокислотною послідовністю щонайменше на 8095 ідентична гену рослини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, нуклеїнокислотна послідовність має довжину більше ніж 70 пар основ. Відповідно до деяких варіантів здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент довжиною щонайменше 70 пар основ, який щонайменше на 6595 ідентичний гену рослини, і/або другий нуклеїнокислотний сегмент довжиною щонайменше 17 пар основ, який щонайменше на 8595 ідентичний гену рослини. Відповідно до деяких варіантів здійснення, перший нуклеїнокислотний сегмент і другий нуклеїнокислотний сегмент перекриваються. Відповідно до деяких варіантів здійснення, перший нуклеїнокислотний сегмент і другий нуклеїнокислотний сегмент не мають області перекривання. Відповідно до деяких варіантів здійснення, ген рослини експресується в більшості органів рослини, починаючи з проростання. Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, ізольована азЕМА щонайменше на 8095 гомологічна з геном фітопатогена.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання рослини, що має підвищену стійкість до комах-шкідників, причому спосіб включає: вирощування рослини з насінини, причому насінина контактує з молекулою екзогенної а5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому рослина має поліпшену стійкість до цього комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, не контактуючої з молекулою екзогенної а5КМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення комахою-шкідником є 5родорієега

ІшЖогаїї5, Оіабгоїйса мігдігега мігоітега або І ерііпоїагза десептіїпеайа. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази (аденозинтрифосфатази),

МАОРН (нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат:"Н, далі НАДФ"Н або МАОРН)- (цитохром Р450)- оксидоредуктази, ІАР (інгібітора апоптозних білків, далі ІАБ або АР), хітинсинтази, ЕНРІс і Д- актину. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5БКМА включає послідовність, яка по суті є тотожна або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовностей ЗЕО ІЮО Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 146-190.

У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5КМА включає нуклеїнокислотну бо послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на

25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, отриманої способом, що включає: вирощування рослини з насінини, причому насінина контактує з молекулою екзогенної азКМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому рослина має поліпшену стійкість до цієї комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, не контактуючої з молекулою екзогенної а5КМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення комахою- шкідником є Зродоріега Ійогаїїє, Оіабгоїіїса мігуітега мігуїега або І еріїпоїагза десептіїпеаїа. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази,

МАОРН- (цитохром Р450)-оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕРТа і р- актину. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовностей ЗЕО ІЮО Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної Д5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовностей ЗЕО ІЮ Мо: 146-190.

У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної азКМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У деяких варіантах здійснення рослина не 25 включає пороги виявлення молекули екзогенної а5КМА.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання раслини, що має підвищену стійкість до комах-шкідників, причому спосіб включає вирощування рослини з насінини, причому насінина включає молекулу екзогенної ОБКМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому насіння позбавлене гетерологічного промотора для стимуляції експресії молекули екзогенної а5КМА, і причому рослина має поліпшену стійкість до цієї комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, що не включає молекулу екзогенної а5ЕМА.

У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення комахою-шкідником є Зродоріега Ійогаїїв5,

Ріабгоїїса мігудіїега мігдіїега або Іерііпоїагза десетіїпеаїа. У деяких варіантах здійснення ген комахби-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази, МАЮРН- (цитохром Р450)- оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕЕТа і рД-актину. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної Д5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності з«ЕО ІЮ Мо: 21-26, З1, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності 5ЕО ІО Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, отриманої способом, що включає вирощування рослини з насінини, причому насінина включає молекулу екзогенної 85ЕМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому насіння позбавлене гетерологічного промотора для стимуляції експресії молекули екзогенної а5КМА, і причому рослина має поліпшену стійкість до цієї комахи- шкідника в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, яка не включає молекулу екзогенної 85КМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення комахою-шкідником є 5роаоріега ІКогаїї5, Оіабгоїїса мігодітега мігдітега або І ерііпоїагхза десептіїпеаїа. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що бо складається з АТФази, МАЮРН-(цитохром Р450)-оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків,

хітинсинтази, ЕЕТс і рД-актину. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а85КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності

ЗЕБЕО ІО Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5ЕМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У деяких варіантах здійснення рослина не включає пороги виявлення молекули екзогенної а5КМА.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання рослини, яка має стійкість до комах, причому спосіб включає: а) введення молекули нетранскрибованого тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника в антисмисловій або смисловій орієнтації, в непророслу насінину і Б) пророщування насінини для отримання рослини, що проявляє стійкість до комах після появи зі згаданої насінини. У деяких варіантах здійснення рослина не включає пороги виявлення молекули тригера після появи з насінини. У деяких варіантах здійснення молекулою нетранскрибованого тригера є а5ЕМА. У деяких варіантах здійснення ген комахи- шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази, МАЮОРН- (цитохром Р450)- оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕЕТа і рД-актину. У деяких варіантах здійснення рослина стійка до інвазії Зродоріега ІШогаїїє, Оіабгоїїса мігуітега мігуйега або

І ерііпоїагза десетіїпеаїа. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25

Зо послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину попередньо замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули нетранскрибованого тригера. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: () промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (Її).

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу обробки насінини для поліпшення стійкості до комах рослини, вирощеної з такої насінини, причому спосіб включає: введення молекули екзогенної 52ЕМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої з гена комахи-шкідника в насінину, причому рослина, вирощена з насінини, має поліпшену стійкість до комах в порівнянні з контрольною рослиною. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності

ЗЕО ІО Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності зХЕО ІЮО Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули екзогенної а5КМА. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: (ї) промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (і). У деяких варіантах здійснення насінину промивають у двічі деіїонізованій воді. У деяких варіантах здійснення насінину промивають протягом 2 - 6 годин. У деяких варіантах здійснення насінину промивають при 4 - 28 "б. У деяких варіантах здійснення насінину сушать при 25 - 30 "С протягом 10 - 16 годин. У деяких варіантах здійснення молекулу а5КМА вводять в насінину в концентрації 20 - 150 мкг/мл.

У деяких варіантах здійснення молекулу а5КМА вводять в насінину в розчині, що включає 0,1

ММ ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота, далі ЕДТА або ЕЮОТА). У деяких варіантах здійснення молекулу 45КМА вводять в насінину в присутності фізичного агента. У деяких варіантах здійснення фізичним агентом є ПЕГ(поліетиленгліколь, далі ПЕГ)-модифіковані вуглецеві нанотрубки.

Кілька варіантів здійснення відносяться до насінини, отриманої способом, що включає введення молекули екзогенної а5КМА, яка включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до бо послідовності РНК, транскрибованої з гена комахи-шкідника в насінину, причому рослина,

вирощена з насінини, має поліпшену стійкість до комах в порівнянні з контрольною рослиною. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності

ЗЕО ІО Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності 560 ІЮ Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули екзогенної а5КМА. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: (ї) промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (ії). У деяких варіантах здійснення насінину промивають у двічі деіїонізованій воді. У деяких варіантах здійснення насінину промивають протягом 2 - 6 годин. У деяких варіантах здійснення насінину промивають при 4 - 28 "С. У деяких варіантах здійснення насінину сушать при 25 - 30 "С протягом 10 - 16 годин. У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в концентрації 20 - 150 мкг/мл.

У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в розчині, що включає 0,1

ММ ЕДТА. У деяких варіантах здійснення молекулу Д5КМА вводять в насінину в присутності фізичного агента. У деяких варіантах здійснення фізичним агентом є ПЕГ-модифіковані вуглецеві нанотрубки. Кілька варіантів здійснення відносяться до пристрою для вміщення насінини, що включає одну або більше насінини. Кілька варіантів здійснення відносяться до засіяного поля, що включає деяку кількість такого насіння.

Кілька варіантів здійснення відносяться до насінини, що включає молекулу екзогенної а5зКМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або до послідовності РНК, транскрибованої з гена комахи-шкідника, причому насінина позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії згаданої молекули а5КМА, і причому екзогенна а5КЕМА не інтегрується в геном насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 85ЕМА присутня в ендоспермі насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КАМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжним нуклеотидам послідовності ФБЕО ІЮ Мо: 21-26, 31, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА включає послідовність, яка по суті

Зо ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності

ЗЕО ІЮ Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5ЕМА є у зародку насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 45ЕМА присутня в подібній концентрації в зародку і ендоспермі насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 5ЕМА присутня в ендоспермі в більш високій концентрації ніж у зародку і насінині. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази,

МАОРН- (цитохром Р450)-оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕЕТа і р- актину. У деяких варіантах здійснення комахою-шкідником є 5Зродоріега Ішогаїї5, Оіаргоїйса мігдіїега мігуіега або Іеріїпоїагза десетіїпеаїа. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену насінини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У деяких варіантах здійснення насінина є замочена в праймінговому розчині насінина. Кілька варіантів здійснення відносяться до пристрою, який вміщує насінину, що включає одну або більше насінини. Кілька варіантів здійснення відносяться до засіяного поля, що включає деяку кількість такого насіння.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, що проявляє стійкість до комах після появи з насінини, причому молекулу нетранскрибованого тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника в антисмисловій або смисловій орієнтації, вводять в непророслу насіннину, з якої виростає згадана рослина. У деяких варіантах здійснення рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, сої, рису, пшениці, томату, огірка, салату, бавовни і ріпаку. У деяких варіантах здійснення рослина не включає поріг виявлення молекули нетранскрибованого тригера. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТфази, МАОРН-(цитохром Р450)-оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕЕТса і р-актину. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності 560 ІО Мо: 21-26, З1, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до бо щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності зХЕО ІЮО Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену насінини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 17 пар основ і щонайменше на 8595 ідентична ендогенному гену насінини. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 70 пар основ і щонайменше на 6595 ідентична ендогенному гену насінини.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, що включає молекулу нуклеїнової кислоти для пригнічення гена комахи-шкідника, причому молекула нуклеїнової кислоти не інтегрована в хромосому рослини, причому молекула нуклеїнової кислоти не транскрибована з гомологічного трансгена, інтегрованого в хромосому рослини, і причому ген комахи- шкідника пригнічений шляхом введення молекули тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника в антисмислоїй або смисловій орієнтації, в непророслу насінину, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, сої, рису, пшениці, томату, огірка, салату, бавовни і ріпаку. У деяких варіантах здійснення молекулою тригера є а5КМА. У деяких варіантах здійснення ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази, МАОРН-(цитохром Р450)- оксидоредуктази, інгібітора апоптозних білків, хітинсинтази, ЕЕТа і р-актину. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності 560 ІО Мо: 21-26, З1, 34, 37, 38, 131-133, 144 або 145. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕ ІО Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична щонайменше на 25 послідовних парах основ ендогенному гену насінини, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 17 пар основ і щонайменше на 8595 ідентична ендогенному гену насінини, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення тригерна

Зо молекула включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 70 пар основ і щонайменше на 6595 ідентична ендогенному гену насінини, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення рослина не включає поріг виявлення молекули тригера.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу зниження тиску личинки західного кукурудзяного жука на рослину кукурудзи, причому спосіб включає: а) введення молекули тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена личинки західного кукурудзяного жука в антисмисловій або смисловій орієнтації, в непророслу насінину кукурудзи та 5) пророщування насінини кукурудзи для отримання рослини кукурудзи. У деяких варіантах здійснення молекулою тригера є а5зКМА. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо. 144.

У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів послідовності зхЕО ІЮ Мо: 146-190. У деяких варіантах здійснення непророслу насінину кукурудзи замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули тригера. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині шляхом: (Її) промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (і). У деяких варіантах здійснення насінину промивають у двічі деіонізованій воді.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання рослини, що має поліпшену стійкість до вірусів, причому спосіб включає: вирощування рослини з насінини, причому насінина контактує з молекулою екзогенної О5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому рослина має поліпшену стійкість до вірусів в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, яка не контактувала з молекулою екзогенної а5ЕМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (далі ВЗКТ або

ТоСМом), вірус мозаїки огірка (цитомегаловірус, далі ЦМВ або СММ) або вірус плямистого в'янення томата (далі ВПВТ або Т5М/М). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТООМОМ, гена СММ і гена Т5УУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена 60 оболонки і гена АС1. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8090 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, отриманої способом, що включає: вирощування рослини з насінини, причому насінина контактує з молекулою екзогенної а5АМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності РНК транскрибованої зі згаданого гена, причому рослина має поліпшену стійкість до вірусу в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, яка не контактувала з молекулою екзогенної а5КМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (ТООМОМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5МУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТОСМОМУ, гена

СММУ і гена Т2М/М. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АСІ1. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної Д5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ФЕО ІЮО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на послідовних парах основ. В деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють 25 агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У деяких варіантах здійснення рослина не включає пороги виявлення молекули екзогенної а5КМА.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання рослини, що має поліпшену стійкість до вірусів, причому спосіб включає вирощування рослини з насінини, причому насінина включає молекулу екзогенної О5ЕМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності

РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому насінина позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії молекули екзогенної а5КМА, і причому рослина має поліпшену стійкість до вірусів в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, що не включає молекулу екзогенної 85КМА. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (ТООМОМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5М/УМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТОСМОМУ, гена СММУ і гена ТОМУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АСІ1. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЕС ІО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5зКМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, отриманої способом, що включає вирощування рослини з насінини, причому насінина включає молекулу екзогенної азеЕМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності РНК, транскрибованої зі згаданого гена, причому насінина позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії молекули екзогенної а5КМА, і причому рослина має поліпшену стійкість до вірусів в порівнянні з контрольною рослиною, причому контрольна рослина вирощена з насінини, що не включає молекулу екзогенної О5КМА. У деяких варіантах здійснення рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату («ТоОМоМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5УУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТООМОУ, гена СММ і гена Т5УМУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу бо вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АСТ1. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 85КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ФЕО ІО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5КМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. В деяких варіантах здійснення насінину крім того обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У деяких варіантах здійснення рослина не включає пороги виявлення молекули екзогенної а5АМА.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання рослини, що має стійкість до вірусів, причому спосіб включає: а) введення молекули нетранскрибованого тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена вірусу в антисмисловій або смисловій орієнтації, в непророслу насінину і 5) пророщування насінини для отримання рослини, яка виявляє стійкість до вірусів після появи зі згаданої насінини. У деяких варіантах здійснення рослина не включає пороги виявлення молекули тригера після появи з насінини. У деяких варіантах здійснення молекулою нетранскрибованого тригера є а5ЕМА. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату («ТоОМоМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5УУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТООМОУ, гена СММ і гена Т5УМУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АС1. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули нетранскрибованого тригера. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: () промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (Її).

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу обробки насінини для поліпшення стійкості рослини, вирощеної з насінини, до вірусів, причому спосіб включає: введення молекули екзогенної а5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності РНК, транскрибованої з гена вірусу в насінину, причому рослина, вирощена з насінини, має поліпшену стійкість до вірусів в порівнянні з контрольною рослиною. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної 5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули екзогенної ОБЕКМА. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: (ї) промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (1). У деяких варіантах здійснення насінину промивають у двічі деіонізованій воді. У деяких варіантах здійснення насінину промивають протягом 2 - 6 годин. У деяких варіантах здійснення насінину промивають при 4 - 28 "С. У деяких варіантах здійснення насінину сушать при 25 - 30 С протягом 10 - 16 годин. У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в концентрації 20 - 150 мкг/мл. У деяких варіантах здійснення молекулу а5КМА вводять в насінину в розчині, що включає 0,1 мМ ЕДТА. У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в присутності фізичного агента. У деяких варіантах здійснення фізичним агентом є

ПЕГ-модифіковані вуглецеві нанотрубки.

Кілька варіантів здійснення відносяться до насінини, отриманої способом, що включає введення молекули екзогенної 45ЕМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності

РНК, транскрибованої з гена вірусу в насінину, причому рослина, вирощена з насінини, має поліпшену стійкість до вірусів в порівнянні з контрольною рослиною. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної Д5КМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині перед введенням молекули екзогенної ОБЕКМА. У деяких варіантах здійснення праймінг здійснюють шляхом: (ї) промивки насінини перед згаданим контактом і (ії) сушіння насінини після етапу (1). У деяких варіантах здійснення насінину промивають у двічі деіонізованій воді. У деяких варіантах бо здійснення насінину промивають протягом 2 - 6 годин. У деяких варіантах здійснення насінину промивають при 4 - 28 "С. У деяких варіантах здійснення насінину сушать при 25 - 30 С протягом 10 - 16 годин. У деяких варіантах здійснення молекулу О5КМА вводять в насінину в концентрації 20 - 150 мкг/мл. У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в розчині, що включає 0,1 мМ ЕДТА. У деяких варіантах здійснення молекулу 85КМА вводять в насінину в присутності фізичного агента. У деяких варіантах здійснення фізичним агентом є

ПЕГ-модифіковані вуглецеві нанотрубки. Кілька варіантів здійснення відносяться до пристрою для вміщення насінини, що включає одну або більше насінини. Кілька варіантів здійснення відносяться до засіяного поля, що включає деяку кількість такого насіння.

Кілька варіантів здійснення відносяться до насінини, що включає молекулу екзогенної а5зКМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу або до послідовності РНК, транскрибованої з гена вірусу, причому насінина позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії згаданої молекули а5КМА, і причому екзогенна а5КМА не інтегрується в геном насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА присутня в ендоспермі насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5ЕМА є у зародку насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної а5КМА присутня в подібній концентрації в зародку і ендоспермі насінини. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної ОБКМА присутня в ендоспермі в більш високій концентрації ніж у зародку і насінини. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (ТООМОоМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (ТЗУУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТООМОМ, гена СММ і гена Т5УУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АС1. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5ЕМА включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО І Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула екзогенної О5КМА включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену насінині щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення насінину обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу. У

Зо деяких варіантах здійснення насінину замочують у праймінговому розчині. Кілька варіантів здійснення відносяться до пристрою для вміщення насінини, що включає одну або більше насінини. Кілька варіантів здійснення відносяться до засіяного поля, що включає деяку кількість такого насіння.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, що проявляє стійкість до вірусів після появи з насінини, причому молекулу нетранскрибованого тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена вірусу в антисмисловій або смисловій орієнтації, вводять в непророслу насінину, з якої виростає згадана рослина. У деяких варіантах здійснення рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, сої, рису, пшениці, томату, огірка, салату, бавовни і ріпаку. У деяких варіантах здійснення рослина не включає поріг виявлення молекули нетранскрибованого тригера. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (ТООМОМ), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5УМУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена

ТоСМоОМ, гена СММУ і гена Т5УУМ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АС1. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності

ЗЕО ІЮ Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична ендогенному гену насінини щонайменше на 25 послідовних парах основ. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 17 пар основ і щонайменше на 8595 ідентична ендогенному гену насінини. У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого тригера включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 70 пар основ і щонайменше на 6595 ідентична ендогенному гену насінини.

Кілька варіантів здійснення відносяться до рослини, що включає молекулу нуклеїнової кислоти для пригнічення гена вірусу, причому молекула нуклеїнової кислоти не інтегрована в хромосому рослини, причому молекула нуклеїнової кислоти не транскрибована з гомологічного трансгена інтегрованого в хромосому рослини, і причому ген вірусу пригнічений шляхом бо введення молекули тригера, що включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, який включає щонайменше один сегмент із 18 або більше суміжних нуклеотидів гена вірусу в антисмисловій або смисловій орієнтації, в непророслу насінину, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, сої, рису, пшениці, томату, огірка, салату, бавовни і ріпаку. У деяких варіантах здійснення молекулою тригера є а5зКМА. У деяких варіантах здійснення вірусом є вірус золотої крапчастості томату (ТосМом), вірус мозаїки огірка (СММ) або вірус плямистого в'янення томата (Т5МУМ). У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена ТООМОМУ, гена СММ і гена ТММ. У деяких варіантах здійснення ген вірусу вибирають з групи, що складається з гена нуклеокапсида (М), гена реплікази, гена оболонки і гена АС1. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 8, 11 або 185-190. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає нуклеїнокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична щонайменше на 25 послідовних парах основ ендогенному гену насінини, з якого виростає рослина. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає нуклеїнокислотна послідовність, яка має довжину щонайменше 17 пар основ і щонайменше на 8595 ідентична ендогенному гену насінини, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення тригерна молекула включає нуклеїнокислотну послідовність, яка має довжину щонайменше 70 пар основ і щонайменше на 6595 ідентична ендогенному гену насінини, з якої виростає рослина. У деяких варіантах здійснення рослина не включає поріг виявлення молекули тригера.

Якщо не вказано інше, всі технічні та/або наукові терміни, використанні в даному документі, мають таке ж значення, яке зазвичай розуміє середній фахівець в області, до якої належить винахід. Хоча на практичному здійсненні або при перевірці варіантів здійснення винаходу можуть бути використані способи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даному документі, нижче наведені приклади способів і/або матеріалів. У разі суперечності опис винаходу до патенту, включаючи визначення, має перевагу. Крім цього, матеріали, способи і приклади є тільки ілюстративними і не призначені для введення обмежень.

Короткий опис креслень

Нижче, тільки для прикладу, описані деякі варіанти здійснення винаходу з посиланнями на прикладені креслення. Тепер, з конкретним посиланням на докладні креслення, хотілося б підкреслити, що конкретні деталі показані для прикладу і для цілей ілюстрації опису варіантів здійснення винаходу. Відповідно, опис, взятий разом з кресленнями, пояснює спеціалістам в даній області техніки, як здійснити на практиці варіанти здійснення винаходу.

На Фіг. 1 показані результати впливу за часом обробки 5ібіІ О насіння рису. Перевірили вплив часу інкубації з а5ЕМА 5іб1 О на інтенсивність флуоресценції, що показує кількість і якість проникнення а5КМА. Зображення контрольного насіння, яке було залишене необробленим (1), отримували разом із зображеннями насіння, обробленого азКМА 5і01 0, для чотирьох періодів інкубації: 10 хвилин (2), 3,5 години (3), 5,5 годин (4) і 24 години (5).

На Фіг. 2А-В показаний сайленсінг гена РОБЗ-1 в рисі за допомогою суміші 45ЕМА/5ікМА. Фіг. 2А - зображення пророслого насіння рису через 5 діб після обробки, контрольні зліва. Фіг. 28 - зображення пророслого насіння рису через 7 діб після обробки, контрольні знизу.

На Фіг. ЗА-С показані рівні експресії РОБ-1, визначені шляхом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція, далі ПЛР) в реальному часі. фіг. ЗА - зображення пророслого насіння рису через 7 діб після обробки, контрольні знизу. Фіг. ЗВ - зображення посадженого насіння рису через 5 тижнів після обробки, контрольна рослина зліва і має більш темний зелений колір в порівнянні з рослиною, яку піддали сайленсінгу за допомогою РОБ-1. ФігМ. Зб - РНК екстрагували з контрольних і підданих сайленсінгу за допомогою РОБЗ-1 рослин, і рівні експресії РОБЗ-1 перевірили шляхом ПЛР в реальному часі. Рівні експресії ОВО5 слугували в якості нормалізаторів, і рівні експресії РОБЗ-1 в контрольних рослинах слугували в якості калібраторів і отримали значення 1.

На Фіг. 4А-В показано розподіл по висоті контрольних і МЕМ азКЕМА-оброблених рослин томата через 55 діб після інокуляції. На Фіг. 4А показано розподіл по висоті контрольних рослин (сині стовпці), і на Фіг. 4В показано розподіл по висоті оброблених рослин (жовті стовпчики).

На Фіг. 5БА-О показано специфічний розподіл по висоті контрольних (сині стовпці) і АКЕ8 а5зАМА-оброблених (червоно-коричневі стовпчики) рослин томата через 55 (Фіг. 5А), 62 (Фіг. 58) і 72 діб (Фіг. 5С) після обробки. На Фіг. 50 показана середня висота контрольних рослин в порівнянні з висотою оброблених рослин через 62 діб після обробки.

На Фіг. бА-В показані результати ЗТ-ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція з зворотною транскрипцією, далі ЗТ-ПЛР) на РНК, екстрагованої з листя контрольних і ЕМуУ2.2 азкМА- бо оброблених рослин томата через 9 тижнів після проростання. На фіг. бА показано кратну зміну експресії ЕМУ2.2 в контрольних (червоні стовпчики) і 45ЕМА-оброблених (сині стовпці) рослинах, яку нанесено на графік для кожної окремої рослини, щоб продемонструвати зміну в рівні експресії гена ЕМУ2.2 в цих двох групах рослин. На Фіг. 6В показана середня експресія ЕМУ2.2 в контрольних (червоний стовпець) в порівнянні з обробленими рослинами (синій стовпець).

Зниження рівня експресії гена ЕМУ2.2 очевидно у оброблених рослин в порівнянні з контрольними рослинами.

На Фіг. 7А-В показана більш довга і більш розвинена коренева система у паростків рису, вирощених з насіння рису, оброблених проти гена Оеїа (Фіг. 7В), в порівнянні з контрольними рослинами (Фіг. 7А).

На Фіг. вА-В показані довші і більш розвинуті системи коренів і пагонів у паростків рису, вирощених з насіння рису, оброблених проти гена МЕК (Фіг. 88) в порівнянні з контрольними рослинами (Фіг. 8А), коли паростки виростили в середовищі для росту без азоту.

На Фіг. 9А-С показана гомологія між генами Зродор'ієга Ійкогаїї5, які використані для обробки насінини, і геномом кукурудзи. Фіг. 9А - ген МАОРН, послідовність 1 (верхня панель, ЗЕО ІО МО: 14 ї 22) і послідовність 2 (нижня панель, 5ЕО ІЮ МО: 23 і 24) з 8295 -ю ідентичністю на 71 нуклеотиді і 8995 -ю ідентичністю на 35 нуклеотидах, відповідно. Фіг. 98 - АТФаза (5ЕО ІЮ МО: 25 і 26) з 7295-ю ідентичністю на 484 нуклеотидах, і Фіг. 9С - інгібітор апоптозних білків, послідовність 1 (верхня панель, ЗЕО ІЮО МО: 27 і 28) і послідовність 2 (нижня панель, ЗЕО ІЮ

МО: 29 і 30) з 8195 -ю ідентичністю на 36 нуклеотидах і 8795 -ю ідентичністю на 31 нуклеотиді, відповідно. "бОцегу" позначає послідовності 5. ІШогаїїє, і "ЗибБіесі" позначає послідовності кукурудзи.

На Фіг. 10А-С показана гомологія між генами 5родоріега ІШогаїї5, які використані для обробки насінини, і геномом томата. Фіг. 10А - ген МАОРН, послідовність 1 (верхня панель, ЗЕО

І МО: 31 ї 32) з 9395 -ю ідентичністю на 30 нуклеотидах і 8895 -ю ідентичністю на 25 нуклеотидах, відповідно і послідовність 2 (нижня панель, ЗЕО ІЮО МО: 33 ї 34). фіг. 108 - АТФаза (ЗЕО ІО Мо: 35 і 36) з 73965-ю ідентичністю на 359 нуклеотидах, і Фіг. 10С - інгібітор апоптозних білків (ЗЕО ІЮ Мо: 37 і 38) з 9395-ю ідентичністю на 28 нуклеотидах. "Оцегу" позначає послідовності 5. ІШогаїїв5, і "Зибіесі" позначає послідовності томата.

На Фіг. 11А-О показані стовпчасті діаграми, що показують смертність і середню масу живих личинок 5. ІШогаїїє. На Фіг. 11А показаний відсоток мертвих личинок через вісім діб після годування трьома обробленими молекулой тригера й5КМА АТФфази віком 43 дня і контрольними рослинами кукурудзи. На Фіг. 118 показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїй5 в той же момент часу. Фіг. 1103 - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїї5 через три доби після годування обробленими АТФазой віком 85 діб і контрольними рослинами кукурудзи. Фіг. 110 - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїї5 через сім діб після годування обробленими молекулою тригера а45ЕЕМА АТфази віком 91 добу і контрольними рослинами кукурудзи.

Фіг. 12 - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїї5 через сім діб після годування обробленими молекулою тригера азКМА (МАОРН, ІАР (інгібітор апоптозних білків) і АТФаза) віком 67 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи.

Фіг. 13А-В: Фіг. 13А - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5.

ІЩКогаїїєх через вісім діб після годування обробленими молекулою тригера а5ЕМА ЕНТа віком 43 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи. Фіг. 138 - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїїє через п'ять діб після годування обробленими молекулою тригера а5ЕМА ЕНТа віком 87 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи.

Фіг. 14 - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 через вісім діб після годування обробленими молекулою тригера й5ЕМА бета-актину віком 43 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи.

Фіг. 15А-В: Фіг. 15А - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5.

ІшЖогаїїх через вісім діб після годування обробленими молекулою тригера ОБКМА МАОРН віком 43 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи. Фіг. 158 - стовпчаста діаграма показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїїє через сім діб після годування обробленими молекулою тригера О5КЕМА МАОРН віком 91 добу і контрольними (ЕДТА) рослинами кукурудзи.

Фіг. 16А-В - стовпчасті діаграми, що показують середню масу живих личинок 5. ІШогаїїв5 через шість діб після годування обробленими молекулою тригера а5еЕМА (ІАР або МІХ (інгібітор апоптозних білків), МАЮРН і АТФаза)) віком 27 діб в порівнянні з контрольними (ЕДТА) рослинами. На Фіг. 16А показаний середній відсоток на одне повторення, і на Фіг. 168 показана середня маса на одну обробку.

Фіг. 17А-В - стовпчасті діаграми, що показують середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 після бо годування обробленими молекулою тригера О5КМА ЕЕТа рослинами кукурудзи. На Фіг. 17А показана середня маса через дев'ять діб після годування рослинами віком 35 діб. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення для кожної обробки. На Фіг. 17В показана середня маса через п'ять діб після годування рослинами віком 36 діб. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення для кожної рослини.

Фіг. 18А-В: Фіг. 18А - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІШогаїї5 через 12 діб після годування обробленої молекулою тригера Д5КМА АТФази віком 56 діб і контрольними (55 (бета-глюконідаза, далі 5Ш5)) рослинами кукурудзи. Фіг. 188 - стовпчаста діаграма, що показує відсоток мертвих личинок 5. ІЩогаїї5 через чотири доби після годування обробленими молекулою тригера а5ЕМА АТФфази віком 57 діб і контрольними (55) рослинами кукурудзи.

Фіг. 19А-В: Фіг. 19А - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5.

ІЩЖогаїїх через десять діб після годування обробленими молекулою тригера а5ЕМА віком 24 діб і контрольними (ЕДТА, ЕДТА/ПМВН (ПЕГ-модифіковані вуглецеві нанотрубки, далі ПМВН) і ЗФБ (зелений флуоресцентний білок, далі ЗФБ)) рослинами кукурудзи. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення для кожної рослини. Фіг. 198 - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїїє через десять діб після годування обробленими молекулою тригера й5КМА віком 25 діб і контрольними (ЕДТА, ЕДТА/ЛМВН і ЗФБ/ЛМВН) рослинами кукурудзи. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення для кожної рослини.

Фіг. 20А-В - стовпчасті діаграми, що показують середню масу личинок 5. ІШогаїї5 через 4 доби після годування обробленими молекулою тригера азКМА віком вісім діб (ЕНРта і

ЕЕТОа/ПМВН) і контрольними (505 і З0О5/ПМВН) рослинами кукурудзи. На Фіг. 20А показана середня маса личинок 5. ІШогаїї5 на одну рослину, і на Фіг. 208 показана середня маса личинок 5. ІШогаїї5 на одну обробку. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення даних.

Фіг. 21 - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 через три і сім діб після годування обробленими молекулою тригера д5КМА (МАОРН, інгібітор апоптозних білків, і МІХ (інгібітор апоптозних білків, АТФаза і МАОРН)) віком 48 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами томата.

Фіг. 22 - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 після

Зо годування протягом чотирьох діб обробленими молекулой тригера а5ЕМА (бета-актину, АТФази і МАОРН) віком 42 доби і контрольними (ЕДТА) рослинами томата.

Фіг. 23А-В: Фіг. 23А - стовпчаста діаграма, що показує масу личинок 5. ІШогаїї5 після годування протягом шести діб обробленими молекулою тригера а5КМА АТФфази віком 85 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами томату щодо їх початкової маси до годування. Фіг. 238В - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 після годування протягом п'яти діб обробленими молекулою тригера а5ЕМА АТ-Фази віком 88 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами томата.

Фіг. 24А-В: Фіг. 24А - стовпчаста діаграма, що показує середню масу личинок 5. ІШогаїї5 після годування протягом чотирьох діб обробленими молекулою тригера 5КМА МАОРН віком 95 діб і контрольними (ЕДТА) рослинами томата. Фіг. 248 - стовпчаста діаграма, що показує середню масу личинок 5. ІШогаїїх після годування протягом семи діб обробленими молекулою тригера Й5КМА МАОРН віком 95 доби і контрольними (АКЕ8) рослинами томата.

Фіг. 25А-Е: Фіг. 25А і С - стовпчасті діаграми, що показують відсоток мертвих личинок 5.

ІЩогаїйє на одну рослину через вісім і десять діб, відповідно, після годування обробленими молекулою тригера а5ЕМА (ЕНЕТа Ж 1, ЕРТа 2 2, АТФази і МАОРН) віком 31 доба і контрольними (ЕДТА ї ЗФБ) рослинами кукурудзи. Фіг. 25 В і 0 - стовпчасті діаграми, які об'єднують дані, показані на Фіг. 25 А і С, в число обробок. Фіг. 25Е - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїй5 через 11 діб після годування обробленими і контрольними рослинами кукурудзи. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення даних. Фіг. 25Е - стовпчаста діаграма, що показує середню масу живих личинок 5. ІШогаїї5 після годування протягом восьми і дев'яти діб обробленими рослинами віком 32 діб і контрольними рослинами кукурудзи. Маса, визначена після восьми діб, показана темними кольорами, і маса, визначена після дев'яти діб, показана світлими кольорами. Стовпці помилок представляють стандартне відхилення даних.

Фіг. 26А-0 - стовпчасті діаграми показують виживання личинок і масу західних кукурудзяних жуків (далі ЗКЖ), яких годували рослинами кукурудзи, що виросли з насіння, обробленого

МОМ104454 в кількості 0 частин на мільйон (контроль), 50 частин на мільйон або 500 частин на мільйон або трансгенними рослинами кукурудзи, які експресують конструкт пригнічення РНК проти Зп/7 ЗКЖ (позитивний контроль). Фіг. 26А - стовпчаста діаграма, що показує відсоток бо виживання личинок через 4 тижні. Фіг. 268 - стовпчаста діаграма, що показує сукупну масу личинок ЗКЖ, вижили через 4 тижні. Фіг. 26С - стовпчаста діаграма, що показує середню масу личинок ЗКЖ, вижили через 4 тижні.

Фіг. 27А-С - стовпчасті діаграми, що показують результати аналізу інвазії колорадського жука (далі КЖ) на рослини томата, які виросли з насіння, оброблених 16593, буфером ("композиція") або молекулою тригера Д5КЕМА ЗФБ. На Фіг. 27А показано середнє знищення листя колорадськими жуками на рослинах томата, оброблених 16593 і контрольних (композиція і ЗФБ). На Фіг. 27В показаний відсоток личинок КЖ, які вижили. На Фіг. 27С показана середня маса личинок ЗКЖ, які вижили на оброблених рослинах.

Фіг. 28А-В: на фіг. 28 показані результати аналізу Оцчапіїбзепе рослин, оброблених ТООМОоМ після насичення насінини полінуклеотидними послідовностями а5КМА. На Фіг. 28А показані результати після обробки полінуклеотидом 5'АС1Т азкМА в порівнянні з контрольними (МТС), обробленими 5ЗИ5. На Фіг. 288 показані результати після обробки полінуклеотидом З'АС1 а5зКМА в порівнянні з контрольними (МТС), обробленими 5И5.

Фіг. 29А-В: на Фіг. 29 показані результати аналізу Оцапіїзепе рослин, оброблених вірусом мозаїки огірка (СМУ) після насичення насінини полінуклеотидними послідовностями а5КМА. На

Фіг. 29А показані результати після обробки полінуклеотидом 5'МС а5еМА в порівнянні з контрольними (МТгС), обробленими 5И5. На фіг. 298 показані результати після обробки полінуклеотидом З'МС азеМА порівняно з контрольними (МТгС), обробленими 55.

На Фіг. 30 показані результати аналізу Оцчапіїзепе рослин, оброблених вірусом плямистого в'янення томата (Т5МУМ) полінуклеотидної послідовності З'М азКМА в порівнянні з контрольними (МТС), обробленими 55.

На Фіг. З31А-В показана гомологія між геномом ЕЕТа Зродоріега ІШогаїї5, який використаний для обробки насінини, і геномом кукурудзи. Фіг. З1А - ген ЕЕТа, послідовність 1 з 7595-ю ідентичністю на 400 нуклеотидах. Фіг. 31В - ген ЕЕТа, послідовність 2 з 75965-ю ідентичністю на 446 нуклеотидах. "Оцегу" позначає послідовності 5. ІШогаїїй5, і "Зибіесі" позначає послідовності кукурудзи.

Фіг. 32А-С - стовпчасті діаграми, що показують аналізи ПЛР в реальному часу експресії

МРНК (матрична рибонуклеїнова кислота, далі мРНК) гена ЕЕТа кукурудзи в рослинах кукурудзи віком 20 діб і 48 діб, що виросли з насіння, обробленого 50 мкг/мл а5ЕМА протягом 4 годин. На

Зо Фіг. 32А показана кратна зміна в експресії мРНК гена ЕЕРТа кукурудзи після обробки а5КМА гена

ЕРта 5. ІШогаїїх, для якого обробка а5хЕКМА ЗФБ була використана в якості контрольного базового рівня. Значення експресії для окремих рослин були нормалізовані до середньої експресії всіх рослин, оброблених д5КМА ЗФБ. Різниця в експресії в порівнянні з контрольною групою мала р-значення 0,016. На Фіг. 32В показано кратна зміна в експресії мРНК гена ЕЕ1а кукурудзи після обробки сумішшю тих же азЕМА, що і на Фіг. 32А, і ПЕГ-модифікованими вуглецевими нанотрубками (ПМВН). Значення експресії для окремих рослин були нормалізовані до середньої експресії всіх рослин, оброблених О5КМА/ЛМВН ЗФБ. Різниця в експресії в порівнянні з контрольною групою мала р-значення 0,003. На Фіг. 32С показана кратна зміна в тих же рослинах кукурудзи через 48 діб після обробки насінини. Значення експресії для окремих рослин були нормалізовані до середньої експресії всіх рослин, оброблених ахХеЕМА/ЛМВН ЗФБ.

Різниця в експресії в порівнянні з контрольною групою мала р-значення 0,07.

Фіг. 33 - стовпчаста діаграма, що показує аналіз шляхом ПЛР в реальному часу експресії

МРНК гена ЕРТа кукурудзи в рослинах кукурудзи віком дев'ять тижнів, які проросли з насіння, обробленого 132 мкг/мл а5зКМА, отриманої з послідовності 5. ІШогаїї5. Значення експресії для окремих рослин були нормалізовані до середньої експресії всіх контрольних рослин. Різниця в експресії в порівнянні з контрольною групою мала р-значення 0,12.

Фіг. 34А-В - стовпчасті діаграми, що показують аналізи шляхом ПЛР в реальному часі рослин кукурудзи віком шість діб, які проросли з насіння, обробленого 160 мкг/мл а5ЕМА протягом 7 годин. На Фіг. ЗАА показана кратна зміна в експресії мРНК гена ЕРТа кукурудзи по відношенню до обробки 505 азЕМА. На Фіг. 348 показана середня кратна зміна в експресії

МРНК гена ЕРТа кукурудзи для всіх рослин, оброблених О5КМА ЕРТа (а5КМА Х 1 22, з ПМВН і без них), 55 азКМА (з ПМВН і без них) і ЕДТА (з ПМВН і без них ). Стовпці помилок представляють стандартне відхилення даних.

Фіг. ЗБА-С - стовпчасті діаграми, що показують аналізи шляхом ПЛР в реальному часі експресії МРНК АТФази і МАОРН кукурудзи в рослинах кукурудзи віком 27 діб, які проросли з насіння, обробленого 160 мкг/мл а5ЕМА протягом 2 годин. На Фіг. З5А показана середня кратна зміна в експресії МРНК АТФази кукурудзи. На Фіг. 358 і 35С показана середня кратна зміна в експресії МРНК МАОРН. Значення експресії були нормалізовані до середньої експресії рослин, оброблених йі5КМА ЗФБ (Фіг. ЗБ5БА і 358), або до середньої експресії оброблених ЕДТА бо контрольних рослин (Фіг. 353). Стовпці помилок представляють стандартне відхилення даних.

Докладний опис

Якщо не вказано інше, нуклеїнокислотні послідовності вказані в тексті даного опису винаходу для читання зліва направо, тобто в напрямку від 5'-кінця до 3'-кінця. Нуклеїнокислотні послідовності можуть бути представлені як ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота, далі ДНК) або як РНК (рибонуклеїнова кислота, далі РНК), як зазначено; розкриття однієї обов'язково визначає іншу, як відомо середньому фахівцеві в даній галузі техніки. Крім того, розкриття нуклеїнокислотної послідовності розкриває послідовність її зворотного комплементу, оскільки одна обов'язково визначає іншу, як відомо середньому фахівцю в даній області техніки. Там, де термін має єдине число, автори винаходу також передбачають аспекти винаходу, які описані цим терміном в множині.

Перед тим, як докладно пояснити варіанти здійснення винаходу, слід сказати, що винахід необов'язково обмежений у його застосуванні деталями, зазначеними в подальшому описі або в Прикладах. Винахід може мати інші варіанти здійснення або бути здійсненим на практиці різними способами.

При зростаючій кількості населення світу і обмежених площах для росту і культивування рослин існує нагальна необхідність в покращені врожайності рослин в цих умовах, що змінюються. РНК-інтерференція (далі РНКі або КМАЇ) виникла як потужний інструмент для модуляції експресії генів, яка може бути використана для отримання рослин з підвищеною стійкістю до стресу. У рослинах КМАїЇ зазвичай виконують шляхом отримання трансгенних рослин, які включають фрагмент ДНК, що транскрибований для отримання дволанцюгової РНК (далі дсРНК або азКМА). Цю азкКМА потім процесують в малі інтерферуючі РНК (далі міРНК або 5ікМА), які опосередковують сайленсінг генів-мішеней, зазвичай шляхом відщеплення гена- мішені РНК-індукованим сайленсінг-комплексом (далі РНК-індукований сайленсінг-комплекс або

КІЗС) або шляхом трансляційного пригнічення. Головне технічне обмеження цієї технології полягає в тому, що багато важливих видів сільськогосподарських культур важко або неможливо трансформувати, що виключає конститутивну експресію конструктів, направляючих продукцію а5КМА. Більше того, питання, що стосуються потенційного впливу стійких до вірусів трансгенних рослин на екологію, досі значно обмежують їх використання (Тепфер (Теріег), 2002, Аппи. Кем.

Рпуїораїтої. 40, 467-491).

Представлені варіанти здійснення включають способи введення молекул екзогенних нетранскрибованих полінуклеотидних тригерів, наприклад а5ЕМА, в насіння рослин для модуляції експресії генів в рослині, вирощеній з насінини, та/або в фітопатичний організм, який живиться рослиною або інфікує рослину, вирощену з обробленої насінини. Кілька варіантів здійснення відносяться до способів введення екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера в насіння рослин для управління інвазією комахи-шкідника та/або вірусною інфекцією рослин, вирощених з насіння. Засвоєння рослинного матеріалу, отриманого з насіння, обробленого молекулами екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад аземМА, згідно з поданими варіантам здійснення призводить до припинення харчування, росту, розвитку, відтворення, інвазійної здібності і, в кінцевому результаті, може призвести до смерті фітопатогена. У деяких варіантах здійснення екзогенні нетранскрибовані полінуклеотидні тригери призначені для сайленсінгу гена-мішені комахи-шкідника або вірусного патогена. Полінуклеотидними тригерами можуть бути одно- або дволанцюгові РНК, або одно- або дволанцюгові ДНК або гібриди дволанцюгових ДНК/РНК, або їх модифіковані аналоги, і вони можуть мати довжину олігонуклеотидів або більше. Кілька варіантів здійснення відносяться до способів введення а5ЕМА в насіння рослин для модуляції експресії генів.

Автори винаходу розробили нову технологію введення екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, молекул 45КМА, прямо в насінину рослини. Молекули цих нетранскрибованих полінуклеотидних тригерів, наприклад, а5ЕМА, входять в насіння і починають процес сайленсінгу, який триває протягом всього життя рослини, приводячи до отримання рослини з поліпшеною цільовою характеристикою. Вводяться полінуклеотидні тригери голі й, таким чином, в рослину не потрапляють екзогенні елементи регулювання транскрипції, таким чином зменшуючи проблеми довкілля, пов'язані з трансгенними рослинами.

У деяких варіантах здійснення полінуклеотидним тригером, який вводиться, є гола азкМА, і, таким чином, в рослину не потрапляють екзогенні елементи регуляції транскрипції. Крім цього, модифікована насінина може бути пророщена для отримання рослини без необхідності в трудомістких і складних етапах регенерації культури тканини.

Представлені варіанти здійснення пропонують, в їх частині, систему доставки агентів боротьби зі шкідниками до шкідників за допомогою пропозиції їм раціону, що містить рослинний матеріал з насіння, обробленого цими молекулами екзогенного нетранскрибованого 60 полінуклеотидного тригера, наприклад а5зКМА, відповідно до представлених варіантів здійснення.

Як показано нижче і в розділі "Приклади", нижче, представлені варіанти здійснення включають створення умов, необхідних для введення екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голих а5КМА, в насіння (див., наприклад, Приклад 1). Ці молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, гола а5ЕМА, що не інтегруются в геном і мають високу стійкість як в рослині, так і в розчині (див. Приклади 2 - 4). Молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голої а5зКМА, проникають через оболонку насінини (шкірку) однодольних і дводольних рослин і поширюються в ендоспермі і зародку насінини (Приклади 5 - 6). В одному аспекті, представлені варіанти здійснення включають зміну експресії ендогенних генів (Приклади 8 - 15). У деяких варіантах здійснення ендогенний ген, чию експресію змінюють, є ортологом гена-мішені шкідника. У ще одному аспекті, представлені варіанти здійснення включають введення в насіння екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, абзЕМА, направленного на екзогенні гени (наприклад, гени комахи-шкідника або гени вірусів). Ці результати відтворені на ряді рослин однодольних і дводольних груп. У ще одному аспекті, представлені варіанти здійснення включають введення в насіння екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85ЕМА, направлених на істотні гени комах-шкідників або вірусних патогенів в широкому діапазоні доз і кінетики, що призводить до значної зміни експресії генів. Що цікаво, 45КМА, введена відповідно до представлених варіантів здійснення, здатна знижувати активність істотних генів у фітопатогенні, який живиться рослиною або інфікує рослину, вирощену з обробленої насінини (наприклад, Зродоріега Ішогаїї5, Приклад 7). Таким чином, даних результатів достатньо для того, щоб показати, що даний опис пропонує економічну обробку насіння рослин, щоб досягти бажаного сільськогосподарського та садівничого фенотипу, такого як стійкість до комах-шкідників і вірусних патогенів.

У даному документі запропоновані композиції і способи індукування системної регуляції (наприклад, системного пригнічення або сайленсінг) гена-мішені в рослині або фітопатогенні шляхом застосування до насінини рослини молекули полінуклеотидного тригера з сегментом в нуклеотидній послідовності, який по суті ідентичний або по суті комплементарний до послідовності з 18 або більше суміжних нуклеотидів або в гені-мішені, або в РНК,

Зо транскрибованої з гена-мішені, в результаті чого композиція проникає всередину насінини рослини і індукує системну регуляцію гена-мішені в рослині, вирощеної з насінини, або в фітопатогені рослини, вирощеної з насінини. Молекула полінуклеотидного тригера може бути однією або декількома молекулами полінуклеотидів з одним таким сегментом, декількома такими сегментами, кількома різними такими сегментами або їх поєднанням.

Без прив'язки до конкретної теорії можна припустити, що заново запропонована модальність трансформації і модуляція експресії генів пов'язані з: () введенням молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голою азКМА, всередину насіння (на противагу простому покриттю насінини).

Введення здійснюють шляхом замочування насіння в розчині, який включає ці молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, Яа5ЕКМА, так що молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера проникають через оболонку насінини, або шляхом занурення, так що ці молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера покривають насінину і проникають через оболонку після посіву; (і) ампліфікацією сигналу, що генерується молекулами екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА; і (ії) поширенням цього сигналу по рослині.

Перший етап відбувається тільки один раз, під час і незабаром після початкової обробки насінини, тоді як другий і третій етапи відбуваються в циклі, що повторюється, поки сигнал сайленсінгу залишається активним у рослині.

Без прив'язки до теорії, запропонований незв'язуючий режим дії для цього винаходу грунтується на кожному етапі.

Введення молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, азЕемМА, в насіння.

Типова зріла насінина складається з зародка, одягненого в материнську оболонку насінини (шкірку) і рясний шар тканини ендосперму між зародком і оболонкою насінини. Ендосперм служить в якості джерела поживних речовин для зародка під час розвитку насіння, його проростання і виникнення паростка.

Проростання насінини зазвичай починається з впливу води на насіння, яка вбирається зародком і ендоспермом. Потім ендосперм збільшується в об'ємі, причому ендосперм деяких 60 видів рослин здатний виростати до декількох первинних об'ємів. Зародок, який до цієї стадії знаходиться в стані спокою, тепер виходить зі стану спокою, і починається поділ, збільшення і диференціація клітин. Ендосперм живить зародок, що розвивається, до тих пір, поки останній достатньо не розвинеться, щоб почати фотосинтез і автотрофний ріст.

На підставі цих відомих механізмів проростання насінини передбачаються два можливих режими дії для початкового етапу "введення молекул екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5зЕКМА, в насіння".

Ці молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5зКМА, надходять безпосередньо в зародок з водним розчином, який використовується для обробки насінини.

Молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, входять в ендосперм як частина процесу вбирання води ендоспермом. Потім ці молекули живлять зародок, коли він розвивається, як частина потоку поживних речовин з ендосперму під час проростання і розвитку насінини.

Грунтуючись на результатах, показаних на Фіг. 7 - 13, можна зробити висновок, що має місце поєднання двох варіантів. Тобто, деякі а5ЕМА надходять безпосередньо в зародок, і деякі утримуються в ендоспермі і живлять зародок, що розвивається, під час проростання насінини.

Ампліфікація сигналу

Коли молекули а5КМА надходять в зародок, вони розпізнаються і обробляються ферментами, подібними РНКЗі ІІЇ (рибонуклеаза І, далі РНКзЗза ПІ), такими як Оісег або Оісег- подібні (далі ОСІ). Ферменти ОСІ. процесують довгі молекули а5ЕМА на короткі, дволанцюгові

РНК (відомі як звікМА або 5пемМА (короткі РНК, які утворюють шпильки)) (далі вікМА або 5пеМА), які зазвичай мають у довжину 21 - 24 нуклеотиду (нт). Один з ланцюгів звікМА зазвичай швидко деградує, і другий може бути включений в білкові комплекси КІЗС (далі РНК-індукований сайленсінг-комплекс або КІЗС), які містять білок Агдопаше (АСО). Білки АСО містять домен

РІММІ для зв'язування 5зікМА і домен РА7 з РНАзною активністю. Потім комплекс зікмМмА/АСвоО ідентифікує молекулу мРНК (матрична рибонуклеїнова кислота, далі мРНК), яка комплементарна до 5ікМА і викликає її сайленсінг шляхом відщеплення або пригнічення трансляції.

Потім звікМА вивільняється з комплексу КІЗС і може діяти в якості праймера для РНК-

Зо залежної РНК-полімерази (далі РЗРП або КОРБР), що є ферментом, унікальним для царства рослин, і може генерувати ампліфікацію сигналу сайленсінгу шляхом отримання нових молекул а5зКМА (вторинна 5ікМА). Ці знову синтезовані 5ЕМА знову можуть бути процесовані як сказано вище, цим зберігаючи і ампліфіцуючи сигнал сайленсінгу.

Поширення сигналу сайленсінгу

Поширення сайленсінгу є відомим і добре зрозумілим феноменом в рослинах. Без прив'язки до конкретної теорії, можна вважати, що поширення від клітини до клітини на коротку відстань відбувається через плазмодесми. Вважається, що цей процес опосередковує віБМА довжиною 21 нт, яка є продуктом ферменту ОСІ. Крім цього, системне поширення відбувається через флоему по всій рослині від джерела до стоку.

Без прив'язки до конкретної теорії можна припустити, що в описуваній методології поширення сигналу сайленсінгу відбувається з моменту початку сигналу сайленсінгу і його ампліфікації, як сказано вище. Це може включати як поширення на коротку відстань, так і системне поширення різними сигнальними молекулами 5ікМА.

Відповідно до одного варіанту здійснення, запропонований спосіб введення молекули екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голою дволанцюгової

РНК (й5ЕМА), в насінину, причому спосіб включає контакт насінини з молекулами екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голою азЕМА, в умовах, які дозволяють проникнення молекул екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, голою а5КМА, в насіннину, тим самим вводячи а5КМА в насінину.

Кілька варіантів здійснення, описаних у даному документі, відносяться до способу отримання рослини, що має бажаний фенотип, причому спосіб включає: а) контакт непророслої насінини з молекулою екзогенного нетранскрибованого полінуклеотидного тригера в умовах, які дозволяють такій молекулі тригера проникати в насінину, і БЮ) пророщування згаданої насінини для отримання рослини, що має бажаний фенотип після появи зі згаданої насінини. У деяких варіантах здійснення бажаним фенотипом є стійкість до комах. У деяких варіантах здійснення бажаним фенотипом є стійкість до вірусів.

Використовуваний в даному документі термін "тригер" або "критичний полінуклеотид" відноситься до молекули біологічно активного полінуклеотида, яка по суті гомологічна або комплементарна до полінуклеотидної послідовності гена-мішені або РНК, експресованої з гена- бо мішені або його фрагмента, і її функцією є пригнічення експресії гена-мішені або отримання фенотипу нокдауну. Тригерні полінуклеотиди зазвичай описують у зв'язку з їх "послідовністю- мішенню". Тригерні полінуклеотиди можуть бути одноланцюговою ДНК (далі 550МА), одноланцюговою РНК (далі 55КМА), дволанцюговою РНК (далі а5КМА), дволанцюговою ДНК (далі а5ОМА) або гібридами дволанцюгових ДНК/РНК. Тригерні полінуклеотиди можуть включати природні нуклеотиди, модифіковані нуклеотиди, аналоги нуклеотидів або будь-яке їх поєднання. У деяких варіантах здійснення тригерний полінуклеотид може бути включений в більший полінуклеотид, наприклад, в молекулу ргі-пікМА (пре-мікроРНК, далі ргі-тікМА). У деяких варіантах здійснення тригерний полінуклеотид може бути процесований в малу інтерферуючу РНК (5ікМА).

Використовуваний в даному документі термін "послідовність-мішень" відноситься до нуклеотидної послідовності, яка знаходиться в гені або продукті гена, проти якого направлений тригерний полінуклеотид. У цьому контексті термін "ген" означає локалізовану ділянку геномної послідовності, що відповідає одиниці спадкування, яка включає регуляторні ділянки, такі як промотори, енхансери, нетрансльовані ділянки на 5'-кінці, інтронні ділянки, нетрансльовані ділянки на 3'-кінці, транскрибовані ділянки і інші функціональні ділянки послідовності, які можуть існувати як нативні гени або трансгени в геномі рослини. Залежно від обставин, термін "послідовність-мішень" може відноситися до повнорозмірної нуклеотидної послідовності гена або продукту гена, наміченого для пригнічення, або до нуклеотидної послідовності частини гена або продукту гена, наміченого для пригнічення.

Використовуваний в даному документі термін "отриманий з" відноситься до певної нуклеотидної послідовності, яка може бути отримана з конкретно визначеного джерела або виду, хоча і необов'язково з такого певного джерела або виду.

Використовувані в цьому документі терміни "послідовність", "нуклеотидна послідовність" або "полінуклеотидна послідовність" відносяться до нуклеотидної послідовності молекули ДНК, молекули РНК або її частини.

Термін "полінуклеотид" відноситься до будь-якого полімеру мононуклеотидів, які пов'язані міжнуклеотидними зв'язками. Полінуклеотиди можуть бути складені з природних рибонуклеотидів, природних деоксирибонуклеотидів, аналогів природних нуклеотидів (наприклад, енантиомерний форм природніх нуклеотидів) або будь-якого їх поєднання. Якщо полінуклеотид одноланцюговий, його довжина може бути описана як число нуклеотидів. Якщо полінуклеотид дволанцюговий, його довжина може бути описана як число пар основ.

Використовуваний в даному документі термін "нетранскрибований полінуклеотид" відноситься до полінуклеотиду, який не включає повну одиницю транскрипції полімерази ІІ.

Термін "експресія гена" відноситься до процесу перетворення генетичної інформації, закодованої в геномній ДНК, в РНК (наприклад, мРНК (матрична рибонуклеїнова кислота, далі

МРНК або тЕМА), рРНК (рибосомна РНК, далі рРНК або гкМА), тРНК (транспортна РНК, далі

ТРНК або їІКМА) або мяРНК (малі ядерні РНК, далі мяРНК або зпЕеЕМА)) через транскрипцію гена за допомогою ферментативної дії РНК-полімерази і в білок через трансляцію мРНК. Експресію гена можна регулювати на багатьох стадіях процесу.

Використовувані в даному документі фрази "інгібування експресії гена", або "пригнічення гена", або "сайленсінг гена-мішені" і подібні їм терміни і фрази відносяться до відсутності або зниження, що спостерігається, рівня білка та/або продукту мРНК гена-мішені. Наслідки інгібування, чи пригнічення сайленсінгу можуть бути підтверджені дослідженням зовнішніх властивостей клітини або організму або біохімічними способами.

Використовуваний в даному документі термін "ідентичність послідовності", "схожість послідовності" або "гомологія" використовується для вказівки ступеня схожості між двома або більше нуклеотидними послідовностями. Відсоток "ідентичності послідовності" між двома послідовностями визначається шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, так що частина послідовності у вікні порівняння може включати додавання або делеції (пробіли) в порівнянні з контрольною послідовністю (яка не включає додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Цей відсоток обчислюють шляхом визначення числа положень, у яких ідентична нуклеїнокислотна основа або амінокислотний залишок присутній в обох послідовностях, щоб отримати число співпадаючих положень, ділення числа співпадаючих положень на сукупне число положень у вікні порівняння і множення результату на 100, щоб отримати відсоток ідентичності послідовності. Послідовність, яка ідентична в кожному положенні з контрольною послідовністю вважається ідентичною контрольної послідовністю, і навпаки. Вирівнювання двох або більше послідовностей може бути виконано з використанням будь-якої зручної комп'ютерної програми. Наприклад, широко використовуваною і прийнятою комп'ютерною програмою для вирівнювання послідовностей є бо СГОБТАГМУ м1.6 (Томпеон та ін. (Тпотрзоп, еї а.) Мисі. Асіаз Кев., 22: 4673-4680, 1994).

Під "по суті ідентична" або "по суті комплементарна" мається на увазі, що біологічно активний полінуклеотидний тригер (або щонайменше один ланцюг двохланцюгового полінуклеотида або його частини, або частина одноланцюгового полінуклеотида) гібрідизується у фізіологічних умовах з ендогенним геном, транскрибованої з нього РНК або її фрагмента, щоб здійснити регуляцію або супресію цього ендогенного гена. Наприклад, у деяких варіантах здійснення біологічно активний полінуклеотидний тригер має 10095 -у ідентичність послідовності або щонайменше приблизно 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995 -у ідентичність послідовності при порівнянні з послідовністю з 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 або більше суміжних нуклеотидів в гені-мішені або РНК, транскрибованої з гена-мішені. У деяких варіантах здійснення біологічно активний полінуклеотидний тригер має 10095 -у комплементарність послідовності або щонайменше приблизно 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995-у комплементарність послідовності при порівнянні з послідовністю з 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 або більше суміжних нуклеотидів в гені-мішені або РНК, транскрибованої з гена-мішені. У деяких варіантах здійснення біологічно активний полінуклеотидний тригер має 10095-у ідентичність чи комплементарність послідовності з одним алелем або одним членом сімейства даного гена-мішені (який кодує або не кодує послідовність гена). У деяких варіантах здійснення біологічно активний полінуклеотидний тригер має щонайменше приблизно 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99965-у ідентичність чи комплементарність послідовності з декількома алелями або членами сімейства даного гена-мішені. У деяких варіантах здійснення біологічно активний полінуклеотидний тригер має 10095-у ідентичність чи комплементарність послідовності з декількома алелями або членами сімейства даного гена-мішені.

Вважається, що використані в даному документі молекули нуклєїнокислотних послідовностей мають "повну комплементарність", коли кожний нуклеотид однієї з послідовностей при читанні від 5'-кінця до 3-кінця комплементарний кожному нуклеотиду іншій послідовності при читанні від 3'-кінця до 5-кінця. Нуклеотидна послідовність, яка повністю комплементарна контрольній нуклеотидній послідовності, матиме послідовність, ідентичну зворотному комплементу контрольної нуклеотидної послідовності.

Гомологічні послідовності включають ортологічні і паралогічні послідовності. Термін "паралогічні" відноситься до ген-дуплікації в геномі виду, що призводить до паралогічних генів.

Термін "ортологічний" відноситься до гомологічних генів в різних організмах через анцестральний зв'язок.

Використовувані в даному документі відносно організмів терміни "екзогенний полінуклеотид" і "молекула екзогенної нуклеїнової кислоти" відносяться до гетерологічної нуклеїнокислотної послідовності, яка не виражена природним чином в такому організмі, наприклад, в рослині.

Молекула екзогенної нуклеїнової кислоти може включати нуклеїнокислотну послідовність, яка ідентична або частково гомологічна ендогенній нуклеїнокислотній послідовності організму.

Використовувані в даному документі терміни "ендогенний полінуклеотид" і "ендогенна нуклеїнова кислота" відносяться до нуклеїнокислотним послідовностей, які знаходяться в клітині організму. При певних аспектах ендогенна нуклеїнова кислота може бути частиною ядерного геному або пластидного генома. Використовувані в даному документі ендогенні нуклеїнові кислоти не включають нуклеїнові кислоти вірусів, паразитів або патогенів, наприклад, послідовність ендовіруса.

Використовувана в даному документі фраза "гола азКМА" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти а5КМА, яка не може бути транскрибована в клітині рослини. Таким чином, гола молекула О5КМА не включена в конструкт експресії нуклеїнової кислоти, такий як вірусний вектор. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу, голу молекулу а5КМА не отримують з вірусного вектора. Відповідно до деяких варіантів здійснення, 85КЕМА не є продуктом природної патогенної або вірусної інфекції. Відповідно до деяких варіантів здійснення, гола 45ЕМА може включати регуляторні елементи для транскрипції іп міго, такі як промотор 17. Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу, гола 45ЕМА може бути модифікована, наприклад, хімічно модифікована, щоб забезпечити підвищені біологічну доступність, здатність проникати в насіння і/або термін зберігання.

Використовуваний в даному документі термін "азКЕМА" відноситься до двох ланцюгів антипаралельних полірибонуклеїнових кислот, утримуваних разом за рахунок спарювання основ. Молекула 5КМА може бути сформована внутрішньомолекулярною гібридизацією або бо міжмолекулярною гібридизацією. У деяких варіантах здійснення О5ЕМА може включати один ланцюг РНК, яка самостійно гібрідизується, щоб сформувати шпилькову структуру, що має щонайменше частково дволанцюгову структуру, що включає щонайменше один сегмент, який буде гібридизуватися з РНК, транскрибованої з гена, наміченого для супресії. У деяких варіантах здійснення 45ЕМА може включати два окремих ланцюга РНК, які гібридизуються за допомогою комплементарного спарювання основ. Ланцюги РНК можуть бути поліаденілуваними або не поліаденілуваними; ланцюги РНК можуть бути здатні або не здатні до трансляції в поліпептид трансляційним механізмом клітини. Два ланцюга можуть мати однакову або різну довжину за умови, що між ними існує гомологія послідовностей, достатня для того, щоб дволанцюгова структура була сформована з комплементарністю щонайменше 8095, 9095, 9590 або 10095 по всій довжині. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу, у молекули а5КМА немає звисаючих кінців. Відповідно до ще одного варіанту здійснення винаходу, молекула Д5КМА включає звисаючі кінці. Відповідно до інших варіантів здійснення, ланцюги вирівняні так, що існують щонайменше 1, 2 або З основи на кінці ланцюгів, що не вирівнюються (тобто, для яких немає комплементарних основ в протилежному ланцюзі), так що звисання 1, 2 або З залишків має місце на одному або обох кінцях дуплексу, коли ланцюги відпалені.

Як буде зрозуміло середньому фахівцю в даній області техніки, молекула а5ЕМА із даного розкриття може відноситися до будь-якого ланцюга антипаралельних нуклеїнових кислот. Як також буде зрозуміло середньому фахівцю в даній області техніки, молекула Д5КМА даного розкриття включає як смисловий, так і антисмисловий ланцюг, і смисловий і антисмисловий ланцюг є зворотними комплементами один одного на ділянці спарювання основ.

Використовувана в даному документі послідовність молекули а5КМА для регуляції наміченого гена-мішені запропонована в смисловій орієнтації стосовно до наміченого гену-мішені.

Використовувана в даному документі фраза "зворотний комплемент молекули а5КЕМА для регуляції наміченого гена-мішені" відноситься до нуклеїнокислотної послідовності в антисмисловій орієнтації.

Як сказано вище, будь-яку молекулу ОБКМА можна використовувати у відповідності з даним розкриттям. У деяких варіантах здійснення а5КМА, використовувану в даному розкритті, піддають ампліфікації РНК-залежної РНК-полімеразою (ЕОКР). Говорячи без обмежень, а58МА може бути 5ік МА, 5ПЕМА, рге-тікМА або ргі-тівмМА.

Зо Полінуклеотіди, ДНК, РНК, а5ЕМА, 5іЕМА, 5пКМА, рге-тівМА, ргі-птікМА або тікМА в представлених варіантах здійснення можуть бути отримані хімічним або ферментативним шляхом фахівцем у даній галузі техніки за допомогою реакцій, виконуваних вручну або автоматично, або іп мімо в іншому організмі. РНК також може бути отримана шляхом часткового або повного органічного синтезу; будь-який модифікований рибонуклеотид може бути введений іп мійго шляхом ферментативного або органічного синтезу. РНК може бути синтезована клітинною РНК-полімеразою або РНК-полімеразою бактеріофага (наприклад, Т3, Т7, 5Рб).

Використання та продукція експресуючого конструкту відомі в даній області техніки (див., наприклад, УМО 97/32016; патенти США МоМо 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214 і 5,804,693). Якщо вона синтезована хімічним шляхом або ферментативним синтезом іп міїго,

РНК може бути очищена перед введенням в насінину. Наприклад, РНК може бути очищена від суміші шляхом екстрагування розчинником або смолою, осадження, електрофорезу, хроматографії або їх поєднання. Альтернативно, РНК може бути використана без очищення або з мінімальним очищенням, щоб уникнути втрат при обробці проби. РНК може бути висушена для зберігання або розчинена у водному розчині. Такий розчин може містити буфери або солі, щоб сприяти відпалу та/або стабілізації ланцюгів дуплексу.

Дане розкриття відноситься до й5КМА різної довжини, у зв'язку з чим більш коротка версія, тобто, коротше або рівна 50 парам основ (наприклад, 17 - 50), називається 5ікМА або тікМА.

Більш довші молекули а5ЕМА з 51 - 600 або більше ніж 600 пар основ називаються в даному документі а5ЕМА, які можуть бути далі процесовані в молекули 5ікМА.

В одному варіанті здійснення Я5КМА в даній заявці має 20 - 100 пар основ, 25 - 90 пар основ, 30 - 80 пар основ, 30 - 70 пар основ, 30 - 60 пар основ або 30 - 50 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5КМА в цій заявці має приблизно 50 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5КМА включає 5'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення а45ЕМА не включає 5'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення а5ЕМА включає 3'-звисаючі кінці 3 17 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення, 45ЕМА не включає 3'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях.

У ще одному варіанті здійснення а5КМА в даній заявці має 100 - 1000 пар основ, 200 - 900 бо пар основ, 300 - 800 пар основ, 400 - 700 пар основ, 400 - 600 пар основ або 400 - 500 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5КМА в даній заявці має приблизно 450 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5ЕМА в даній заявці має приблизно 550 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5КМА в цій заявці має приблизно 650 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5ЕМА в цій заявці має приблизно 750 пар основ. У ще одному варіанті здійснення азЕМА в даній заявці має приблизно 850 пар основ. У ще одному варіанті здійснення 45ЕМА включає 5'-звисаючі кінці 3 17 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення а5КМА не включає 5'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення 85ЕМА включає 3'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях. У ще одному варіанті здійснення 45ЕМА не включає 3'-звисаючі кінці з 1 основи, 2 основ або З основ на одному або обох кінцях.

В одному варіанті здійснення а5КМА в даній заявці має 15 - 500 пар основ, 15 - 450 пар основ, 15 - 400 пар основ, 15 - 350 пар основ, 15 - 300 пар основ, 15 - 250 пар основ, 15 - 200 пар основ, 15 - 150 пар основ, 15 - 100 пар основ, 15 - 90 пар основ, 15 - 80 пар основ, 15 - 70 пар основ, 15 - 60 пар основ, 15 - 50 пар основ, 15 - 40 пар основ, 15 - 35 пар основ, 15 - 30 пар основ або 15 - 25 пар основ. У ще одному варіанті здійснення 45ЕМА в даній заявці має довжину щонайменше приблизно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 800, 900, 1000 пар основ. У ще одному варіанті здійснення а5КМА в цій заявці має 100 - 1000 пар основ, 200 - 1000 пар основ, 300 - 1000 пар основ, 400 - 1000 пар основ, 500 - 1000 пар основ, 600 - 1000 пар основ, 700 - 1000 пар основ, 800 - 1000 пар основ або 900 - 1000 пар основ.

Термін "зікМА" відноситься до дуплексів малих інгібуючих РНК (зазвичай 17 - 30 пар основ, але також довше, наприклад, 31 - 50 пар основ), які індукують шлях РНК-інтерференції (ЕМАЇ).

Зазвичай молекули 5ікМА синтезують хімічним шляхом як 21-міри з центральною дуплексною ділянкою із 19 пар основ і симетричними 3'-звисаючими кінцями з 2 основ на кінцях, хоча недавно було описано, що хімічно синтезовані дуплекси РНК довжиною 25 - 30 пар основ можуть мати 100-кратне підвищення потенції у порівнянні з 21-мірами в тому ж місці. Підвищена потенція, яка спостерігалася, отримана при використанні довших РНК при запуску ЕКМАЇ, теоретично є результатом застосування ферменту Оісег з субстратом (27-міри) замість продукту (21-міри), і це підвищує швидкість або ефективність входження дуплексу 5ікМА в

Зо комплекс КІЗО.

Було встановлено, що положення 3'-звисаючого кінця впливає на потенцію 5ікМА, ії що асиметричні дуплекси, що мають 3-звисаючий кінець на антисмисловому ланцюгу зазвичай більш сильні ніж такі з 3'-звисаючим кінцем на смисловому ланцюзі (Козе еї аї., 2005). Це може бути віднесено на рахунок завантаження асиметричного ланцюга в КіІ5ЗС, оскільки при націлюванні на антисмисловий транскрипт спостерігаються протилежні патерни ефективності.

Ланцюги дволанцюгової інтерферуючої РНК (наприклад, 5іеМА) можуть бути з'єднані, щоб сформувати структуру шпильки або стебла-петлі (наприклад, 5ЄПКМА). Таким чином, згаданий агент сайленсінгу РНК в деяких варіантах здійснення винаходу також може бути короткою шпильковою РНК (5ПКМА).

Термін "«ПКМА", використовуваний в даному документі, відноситься до РНК-агенту, що має структуру стебло-петля, що включає першу і другу ділянку комплементарної послідовності, причому ступінь комплементарності і орієнтація цих ділянок достатня для того, щоб між ними відбувалося спарювання основ, при цьому перша і друга ділянки з'єднуються петлевою ділянкою, де петля є результатом відсутності спарювання основ між нуклеотидами (або аналогами нуклеотидів) в петлевій ділянці. Число нуклеотидів в петлі становить, включно, З - 23, або 5 - 15, або 7 - 13, або 4 - 9, або 9 - 11. Деякі з нуклеотидів в петлі можуть брати участь у взаємодії пар основ з іншими нуклеотидами в петлі. Приклади послідовностей олігонуклеотидів, які можуть бути використані для формування петлі, включають 5'-ОШСААСАСА-З "(ВгиттеїЇКатр, ТК еї аї. (2002) бсіепсе 296: 550) ії 5-0 да-3' (Савіапоцо, О. еі а. (2002) КМА 8: 1454). Фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що одноланцюговий олігонуклеотид, що отримується, формує структуру стебла-петлі або шпильки, що включає дволанцюгову ділянку, здатну взаємодіяти з механізмом КМАЇ.

Використовувана в даному документі фраза "мікроРНК (також згадувана як взаємозамінні "тікМА" або "тік") або її прекурсор" відноситься до молекули мікроРНК (тіеМА), діючої як посттранскрипційний регулятор. Зазвичай молекулами тікМА є молекули РНК довжиною приблизно 20 - 22 нуклеотидів, які можуть бути завантажені в комплекс КІЗС і які направляють відщеплення іншої молекули РНК, причому така інша молекула РНК включає нуклеотидну послідовність, по суті комплементарну до нуклеотидної послідовності молекули тікМА.

Зазвичай молекулу тікМА процесують з "рге-тікМА" або, як використовується в даному бо документі, з прекурсора молекули рге-тікМА білками, такими як білки ОСІ, присутнього в клітці рослини і завантажуваного в комплекс КІЗС, де вона може направляти відщеплення молекул- мішеней РНК.

Молекули рге-тікМА зазвичай процесують з молекул ргі-тівМА (первинних транскриптів).

Одноланцюгові сегменти РНК, які фланкують рге-тікМА, важливі для процесингу ргі-тікМА в рге-тікМА. Представляється, що сайт відщеплення визначається відстанню від стику стеблів- 55ЕМА (одноланцюгова РНК, далі 55КМА) (Нап еї аї. 2006, Сеї! 125, 887-901, 887-901).

Використовуваний в даному документі термін "молекула рге-тікМА" відноситься до молекули РНК з приблизно 100 - 200 нуклеотидів, переважно приблизно 100 - 130 нуклеотидів, які можуть приймати вторинну структуру, що включає недосконале стебло дволанцюгової РНК і петлю одноланцюгової РНК, (також називається "шпилькою") і крім цього включає нуклеотидну послідовність тікМА (і послідовність її комплементу) в стеблі дволанцюгової РНК. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, тікМА і її комплемент розташовані приблизно на відстані 10 - 20 нуклеотидів від вільних кінців стебла тікМА дволанцюгової РНК. Довжина і послідовність одноланцюгової петлевої ділянки критичними не є і можуть значно змінюватися, наприклад, 30 - 50 нуклеотидів по довжині. Комплементарність між тікМА і її комплементом необов'язково повинна бути досконалою, і можуть бути допустимими приблизно 1 - З петлі неспарених нуклеотидів. Вторинна структура, яка приймається молекулою РНК, може бути спрогнозована з використанням комп'ютерних алгоритмів, відомих у цій галузі, наприклад

ТЕО О. Конкретний ланцюг дволанцюгового стебла РНК з рге-тікМА, яка вивільняється за рахунок активності білка ОСІ і завантажується в комплекс КІ5С, визначається ступенем комплементарності на 5'-кінці, у зв'язку з чим ланцюг, який на її 5'-кінці найменш бере участь у водневих зв'язках між нуклеотидами різних ланцюгів стебла азКМА, яку відщеплювали, завантажується в комплекс КІЗС і визначатиме специфічність послідовності деградації молекули-мішені РНК. Однак, якщо емпірично молекула тікМА з конкретної синтетичної молекули рге-тікМА не функціональна (оскільки в комплекс КіІ5С завантажений "неправильний" ланцюг), буде відразу ж очевидно, що цю проблему можна вирішити шляхом заміни положення молекули тікМА і її комплементу на відповідних ланцюгах стебла а52ЕМА молекули рге-тікЖМА. Як відомо в даній області, зв'язування між А і О, які включають два водневих зв'язки, або С і Ш, включає два водневих зв'язки, менш сильне ніж між с і С, які включають три водневих зв'язки. Приклади шпилькових послідовностей представлені в

Таблицях 3, 4, 6, 7, 13, 18, 26, 27, 28, 34, 35, 36 і 37, нижче.

Молекули природної тікМА можуть міститися в їх природних молекулах рге-тікМА, але вони також можуть бути введені в скелети існуючих молекул рге-тікМА шляхом заміни нуклеотидної послідовності молекули тікМА, яка нормально процесує з такої існуючої молекули рге-птікМА, на нуклеотидну послідовність іншої тікМА, яка представляє інтерес.

Скелет рге-тівМА також може бути повністю синтетичним. Подібно цьому, молекули синтетичної тікЖМА можуть міститися в скелетах молекул існуючої рге-тікМА або скелетах молекул синтетичної рге-тікМА і бути процесованими з них. Деякі скелети рге-тікМА можуть бути переважними ніж інші через ефективності їх правильного процесингу в намічену мікроРНК, особливо при експресії як химерний ген, в якому інші ділянки ДНК, такі як нетрансльовані лідерні послідовності або ділянки термінації транскрипції і поліаденілювання, включені в первинний транскрипт на додаток до рге-тіВМА.

Відповідно до даного розкриття, молекули азКМА можуть бути природними або синтетичними.

О5ЕМА може бути сумішшю довгих і коротких молекул а5КМА, таких як а5ЕМА, 5ікМА, 5ікМА т азеЕМА, 5ікМА ж тікМА або бути їх комбінацією. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, О5КМА є 5ікМА (10095). Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення а5КМА є комбінацією 5іфМА - а5зЕМА в різних співвідношеннях. Будь-яке співвідношення а5зКМА/бікКМА можна використовувати для комбінації 5ікМА - аб5ЕМА. Наприклад, співвідношення 1: 1 - одна а5ЕМА змішана з такою ж послідовністю після обробки РНКзою ЇЇ.

Відповідно до ще одного варіанту здійснення, співвідношення 85КМА/5ікМА становить 2:1, 1,5:1, 1,9:1, 1:0,01, 1:0,05 або 1:0,1. Відповідно до ще одного варіанту здійснення, співвідношення а5КМА/5зікМА становить 2:1 - 1:0,1. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, а5КМА є очищеною азКМА (10095). Відповідно до ще одного варіанту здійснення співвідношення а5КМА/5ігМА становить 1: 2, 1:5, 1:10, 1:20 або 1:50. Відповідно до ще одного варіанту здійснення 85КМА є очищеною 5ікМА (10095).

Молекулу а5КМА можна розробити для специфічного націлювання на ген-мішень, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення ген-мішень є істотним геном комахи- шкідника. У деяких варіантах здійснення ген-мішень є геном вірусу. Слід розуміти, що азкМА 60 можна використовувати для зниження активності одного або декількох генів-мішеней. Якщо намічено деяку кількість генів-мішеней, використовують гетерогенну композицію, яка включає деяку кількість молекул а5КМА для цієї кількості генів-мішеней. Альтернативно, згадані кілька молекул а5КМА окремо застосовують до насіння (але не як композицію). Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, використовують деяку кількість окремих молекул 85КМА для однієї мішені, які можуть бути застосовані окремо або одночасно (наприклад, в одній композиції).

Відповідно до одного варіанту здійснення, ген-мішень є ендогенним для рослини. Зниження активності такого гена зазвичай важливо для додання рослині поліпшених сільськогосподарських, садівничих, поживних характеристик (визначення "поліпшення" або "збільшення" наведені нижче). Слід розуміти, що обробка за допомогою азЕМА може призводити до підвищення активності гена-мішені (яка слідує до запронованого механізму, представленому нижче), але таке підвищення активності може бути короткочасним.

Відповідно до ще одного варіанту здійснення, ген-мішень є екзогенним для рослини. У деяких варіантах здійснення ген-мішень є геном комахи-шкідника. У деяких варіантах здійснення ген-мішень є геном вірусу. Також слід розуміти, що обробка за допомогою азЕМА може призводити до підвищення активності гена-мішені, ортологічного рослині.

Кілька варіантів здійснення, описаних у даному документі, відносяться до інструкцій з конструювання та вибору молекул нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад а5зКМА, молекул для ефективного сайленсінгу РНК в фітопатогенів, які живляться рослиною або залежать від рослини при рості/реплікації і/або виживанні. Без прив'язки до конкретної теорії, ці молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, що мають достатній рівень гомології з ендогенним геном рослини, дозволяють деградацію і ампліфікацію первинних 5ікЖМА (тих, які запущені процесингом за допомогою ферменту Оісег), щоб генерувати вторинні 5іеМА, сформовані ферментом ОІСЕРВ-І ІКЕ 4 (Рісег-подібний) (ОСІ 4). Так, ці молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 45ЕМА, можуть бути обрані за отриманням мінімального впливу на ріст і життєздатність рослини. У деяких варіантах здійснення вторинні віфМА мають достатню гомологію з геном фітопатогенна для того, щоб дозволити деградацію гена-мішені фітопатогена за допомогою РНК-інтерференції. У деяких варіантах здійснення фітопатоген, забезпечений матеріалом рослини, вирощеної з насінини,

Зо обробленої цими молекулами нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад а5АКМА, який описаний в даному документі, втрачає життєздатність шляхом індукування припинення росту або смерті. Так що молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, молекули 45КМА, вважаються цінними пестицидами і можуть знаходити широке застосування в сільському господарстві та садівництві.

Без прив'язки до конкретної теорії, припущено, що один режим модуляції експресії гена пов'язаний 3: (ї) введенням молекул нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5КМА, всередину насіння (на противагу простому покриттю насінини); (ії) ампліфікацією сигналу, створюваного шляхом введення молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5КМА; і поширенням цього сигналу по рослині. Перший етап має місце тільки один раз, під час і незадовго після початкової обробки насінини, тоді як другий і третій етапи відбуваються як повторюваний цикл, поки сигнал сайленсінгу залишається активним у рослині. Як було сказано, введення композицій цього винаходу також може бути виконано для інших органів/клітин рослини (на противагу до насіння) з використанням відомих способів доставки, таких як бомбардування частинками, щеплення, замочування, топікальне застосування з передавальним агентом і т.д. Таким чином, у вищевказані етапи (Її) і (її) також включено даний режим застосування.

Поїдання або інфікування фітопатогеном рослини, яка включає будь-яку з Й5КМА, первинної 5ікМА або вторинної 5ікМА, які націлені на істотний ген фітопатогена, тягне за собою припинення росту або смерть, ніж скорочується його шкідливий вплив на рослину або продукт рослини.

У деяких варіантах здійснення запропонований спосіб введення голої дволанцюгової РНК (а5ЕМА) в насінину, причому спосіб включає контакт насінини з голою а5КМА в умовах, які дозволяють проникнення нуклеїнокислотної послідовності, що має рівень гомології з геном фітопатогенного організму, достатній для індукування деградації цього гена цього фітопатогенного організму, причому ріст такого фітопатогенного організму залежить від такої рослини, і причому згадана деградація індукує припинення росту або смерть такого фітопатогенного організму. У деяких варіантах здійснення а5зКМА націлена на ген, який містить погано стабілізовані ділянки між окремими фітопатогенними організмами або між фітопатогенним організмом і рослиною-господарем. У певних варіантах здійснення може бути бо бажаним вибрати в якості мішені ген в фітопатогенному організмі, який не має відомих гомологів в інших організмах, таких як рослина-господар.

У деяких варіантах здійснення молекулу нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 45КМА, вибирають так, щоб вона мала достатню гомологію з геном рослини для того, щоб опосередкувати її деградацію у функції, опосередкованої РНК-інтерференцією.

Відповідно до одного варіанту здійснення, запропонований спосіб введення голої дволанцюгової РНК (05Е2МА) в насінину, причому спосіб включає контакт насінини з голою а5КМА в умовах, які дозволяють проникнення нуклеїнокислотної послідовності, що має: (ї) рівень гомології з геном рослин, достатній для індукування ампліфікації вторинної 5ікМА- продуктів згаданої а5КМА в клітці рослини, що включає цей ген, і причому модифікація експресії гена рослини згаданої 45ЕЕМА несуттєво впливає на біомасу, силу або врожайність такої рослини; і (і) рівень гомології з геном фітопатогенного організму, достатній для індукування деградації такого гена такого фітопатогенного організму, причому ріст фітопатогенного організму залежить від такої рослини, і причому згадана деградація індукує припинення росту або смерть фітопатогенного організму.

У деяких варіантах здійснення а5КМА має рівень гомології з геном рослини, достатній для індукування ампліфікації вторинної 5ікМА-продуктів згаданої аА5КМА в клітині рослини, що включає азкМА, і причому зміна експресії гена рослини згаданої а5ЕМА несуттєво впливає на біомасу, силу або врожайність такої рослини. Ген рослини може бути експресований в рослину природним шляхом (ендогенний) або бути результатом генетичної трансформації (трансгенна рослина).

У деяких варіантах здійснення а5КМА має рівень гомології з геном рослини, який: (ї) експресується у всіх або в більшості органів рослини, починаючи з проростання; (і) є несуттєвим геном, так що зниження або підвищення його активності не впливає на будь-яке з біомаси, врожайності, життєвої сили рослини; та / або (ії) не пов'язаний з існуванням абіотичного або біотичного стресу.

Може бути обраний ген рослини, що має щонайменше одну з вищенаведених характеристик, тобто, (Її), (ії) або (ії). Альтернативно, ген рослини задовольняє двом критеріям, таким як (Її) і (ії), (І) (ії) або (ії) і (ії). Альтернативно, превалюють всі три критерії, тобто, (і), (ії) і

Зо (ії). У деяких варіантах здійснення а5КМА має рівень гомології з геном рослини, який не впливає на біомасу, врожайність і/або життєву силу рослини, коли вживаються заходи для вирощування рослини в оптимальних/нормальних умовах чи в умовах, які не вимагають функціонування гена для оптимального росту, життєвої сили, біомаси та/або врожайності.

Використовувана в даному документі фраза "несуттєво впливає" відноситься до відсутності впливу в порівнянні з цією ж характеристикою в ізогенній рослині на тій же стадії розвитку і в тих же умовах росту. Альтернативно, вплив на згадану характеристику слабкий, наприклад, не більше ніж 1095, 895, 795, 690, 595, 4905, 3905, 295 або 1905.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, нуклеїнокислотну послідовність молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, вибирають так, щоб проявити достатню гомологію для рекрутування системи КОКб і створити транскрипти вторинної 5ікМА. Такий рівень гомології зазвичай має щонайменше 8095-ву ідентичність з ендогенним геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 45КМА, має щонайменше 8595 -у ідентичність з геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85КМА, має щонайменше 88595-у ідентичність з геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, азКМА, має щонайменше 9095 -у ідентичність з геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ гена-мішені. Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85ЕМА, має щонайменше 92595-у ідентичність з геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ.

Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, має щонайменше 95965-у ідентичність з геном рослини щонайменше на 25 послідовних парах основ. Відповідно до одного альтернативного варіанту здійснення, рівень гомології цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85КМА, становить щонайменше 25 послідовних пар основ. 60 Відповідно до деяких варіантів здійснення, молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 5КМА, має щонайменше 70 пар основ або більше, наприклад, 70-700, 700-600, 700-500, 70-400, 70-300, 70-200, 70-100 пар основ.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, аб5хКМА, включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 6595 ідентичний гену рослини.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 7095 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 7595 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 8095 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 8595 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 9095 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який щонайменше на 9595 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність включає нуклесїнокислотний сегмент щонайменше 70 пар основ в довжину, який на 10095 ідентичний (по всій послідовності) гену рослини.

У деяких варіантах здійснення нуклеїнокислотна послідовність молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, включає другий нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 17 пар основ в довжину (щонайменше 17 послідовних пар основ), який щонайменше на 8595 ідентичний гену рослини. Відповідно до одного специфічна варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність молекули нетранскрибованого

Зо полінуклеотидного тригера, наприклад, а5зКМА, включає другу нуклеїнокіислотний сегмент щонайменше 17 пар основ в довжину (щонайменше 17 послідовних пар основ), який щонайменше на 9095 ідентичний гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85КМА, включає другий нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 17 пар основ в довжину (щонайменше 17 послідовних пар основ), який щонайменше на 9590 ідентичний гену рослини. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, нуклеїнокислотна послідовність молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 85КМА, включає другий нуклеїнокислотний сегмент щонайменше 17 пар основ в довжину (щонайменше 17 послідовних пар основ), який на 10095 ідентичний гену рослини.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, перший нуклеїнокислотний сегмент і другий нуклеїнокислотний сегмент перекриваються (щонайменше на 595, 1095, 2095, 4095, 5090 або більше). Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, перекривання становить 5 - 99906, 5 - 95905, 5 - У09ю, 5 - 8095, 5 - 7090, 5 - 6095. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, перший нуклеїнокислотний сегмент і другий нуклеїнокислотний сегмент не мають перекривання.

У деяких варіантах здійснення нуклеїнокислотна послідовність молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, 45ЕМА, обрана як така, що має рівень гомології з геном фітопатогенного організму, достатній для індукування деградації гена фітопатогенного організму, причому зростання фітопатогенного організму залежить від рослини, і причому деградація індукує припинення росту або смерть фітопатогенного організму.

Таким чином, молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, володіє щонайменше 8095, 8595, 8895, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9996 або навіть 10095-ю ідентичністю гену фітопатогена.

У деяких варіантах здійснення молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5КМА, може бути розроблена для специфічного гена-мішені, що становить інтерес.

Слід розуміти, що молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5зКМА, може бути використана для зниження активності одного або більше генів-мішеней фітопатогена або рослини (в останньому випадку для підвищення ампліфікації). Якщо передбачено деяке число генів-мішеней, використовується гетерогенна композиція, яка 60 включає деяка кількість молекул нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад,

а5зКМА, для націлювання на гени-мішені. Альтернативно, кілька молекул нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, молекул а5КМА, наносять окремо на насіння (але не як їх композицію).

Зниження активності гена-мішені може бути важливим для надання підвищеної толерантності до біотичного стресу, який індукують фітопатогеном. Біотичний стрес може впливати на біомасу, силу або врожайність рослини, а також на толерантність до абіотичних стресів і ефективність використання азоту. Ген-мішень (рослина фітопатогена) може включати нуклеїнокислотну послідовність, яка транскрибується в мРНК, яка відповідає за властивості поліпептиду.

Використовуваний в даному документі термін "ендогенний" відноситься до гену, експресія якого (МРНК або білок) відбувається в рослині. Зазвичай ендогенний ген природним шляхом експресується в рослині або походить з рослини. Таким чином, рослиною може бути рослина дикого типу. Однак рослиною також може бути генетично модифікована рослина (трансгенна).

Використовуваний в даному документі термін "ізольований" відноситься до ізоляції від фізіологічного природного середовища. У випадку а5КМА - ізоляція від клітинних органел, таких як цитозоль або ядро. У випадку насінини - ізоляція від інших частин рослини, таких як плід.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, ізольована молекула а5КМА має форму голої РНК.

Зниження активності гена-мішені може бути важливо для надання поліпшеної характеристики, однією з або щонайменше однією з (наприклад, дві з або більше) наступних: біомаса, сила, врожайність, толерантність до абіотичних стресів, толерантність до біотичного стресу або підвищена ефективність використання азоту.

Приклади генів-мішеней включають, але без обмеження, фермент, структурний білок, регуляторний білок рослини, ген-мішень тікМА або некодуючої РНК, такої як тікМА рослини. У документах УМО2011067745, УМО 2009125401 та УМО 2012056401 представлені приклади послідовності тікМА або мішеней тігМА (наприклад, тЕеЕМА167, тікМА 156, тік 164 і їх мішені

МЕМ, 5РІ17 і МАС, відповідно), експресія яких може бути пригнічена для поліпшення характеристик рослини. Інші приклади генів-мішеней, які можуть бути піддані модуляції відповідно до даного розкриття, описані в розділі "Приклади", нижче.

Зо Ген-мішень може включати нуклеїнокислотну послідовність, яка транскрибується в мРНК, що відповідає за дії поліпептиду. Альтернативно, геном-мішенню може бути некодуючий ген, такий як тікМА або 5ікМА.

Наприклад, для пригнічення експресію мРНК, яка представляє інтерес, синтез 5КМА, що підходить для використання з деякими варіантами здійснення винаходу, можна вибрати такий спосіб. По-перше, послідовність МРНК сканують, включаючи 3'-нетрансльовану ділянку і 5'- нетрансльовану ділянку.

По-друге, послідовність мРНК порівнюють з прийнятною основою геномних даних, використовуючи будь-яке програмне забезпечення для вирівнювання послідовності, таке як програмне забезпечення ВІАЗТ, доступне на сервері МСВІ (млуим/.пебі.піт.пій.дом/ВІ АТ).

Передбачені ділянки в послідовності мРНК, які показують значну гомологію з іншими кодуючими послідовностями, фільтруються.

Відповідні послідовності-мішені вибирають як шаблон для синтезу а5КМА. Кращими є ті послідовності, які мають якомога меншу гомологію з іншими генами в геномі, щоб зменшити ефект "непотрапляння в мішень".

В одному варіанті здійснення 05КМА може включати послідовність-мішень в інтрони, екзоні, 3'-нетрансльованій ділянці, 5'-нетрансльованій ділянці, або регуляторний елемент гена-мішені, або їх комбінації. В одному варіанті здійснення а452МА даної заявки може включати сайт- мішень, що знаходиться в промоторі.

Слід розуміти, що агент сайленсінгу РНК в деяких варіантах здійснення винаходу необов'язково обмежений молекулами, що містять тільки РНК, але також включає хімічно модифіковані нуклеотиди і не нуклеотиди.

О5АМА може бути синтезована будь-яким способом, відомим в даній області техніки, включаючи ферментативний синтез і твердофазних синтез. Вони особливо підходять у випадку короткої полінуклеотидної послідовності з вищезазначеними модифікаціями або без них.

Обладнання та реагенти для виконання твердофазного синтезу пропонуються до продажу, наприклад, компанією Арріїей Віозузіет5. Також можуть бути застосовані будь-які інші засоби для такого синтезу; сам синтез олігонуклеотидів знаходиться цілком у межах здібностей фахівця в даній області і може бути виконаний за добре випробуваною методикою, яка детально описана, наприклад, в наступних публікаціях: ЗатргоокК, у. апа Кивзеїї, ММ (2001), 60 "Моїесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиа!"; А!зибеї, А. М. еї аї., Едв. (1994, 1989), "Ситепі

Ргогосоїв іп Моїесшіаг Ві-оіоду," Моїштев І-Ш, Чдойп УмМієу є Бопв, Вайітоге, Магуїапа; Регваї, В. (1988), "А Ргасіїса! С1ціде то МоїІесшіаг Сіопіпд," дойп УМієу 5 Боп5, Мем! ХогК; і Саїй, М. У., ей. (1984), "ОіїдописіІеоїіде зЗупіпевтібє"; з використанням твердофазного реагенту, наприклад, ціаноетил фосфорамідиту, після чого виконують депротекцію, знесолення та очистку автоматизованим способом з тритилоном або ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія, далі ВЕРХ або НРІ С).

Як сказано вище, голу молекулу О5КМА вводять в прямий контакт з насіниною. Насінина може бути від будь-якої рослини, такої як надродина Мігідіріапіаеє, що включає однодольні та дводольні рослини. Інші рослини перераховані в даному документі нижче. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу, клітини рослини включають РНК-залежну РНК-полімеразну активність і РНК молекулу-мішень, щоб забезпечити ампліфікацію А5КМА.

Термін "рослина", використовуваний в даному документі, включає цільні рослини, предків і потомство рослин і частини рослини, включаючи насіння, пагони, стебла, корені (включаючи бульби), і ізольовані клітини, тканини і органи рослини. Рослина може бути в будь-якій формі, включаючи суспензійні культури, зародки, меристематичні ділянки, тканину калусу, листя, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Слід розуміти, що рослина або її насіння можуть бути трансгенними.

Використовувана в даному документі фраза "клітина рослини" відноситься до клітин рослин, які отримані та ізольовані з дезінтегрованою клітинної тканини рослин або культур клітин рослин. Клітини рослини можуть бути репродуктивними (тобто, клітинами з тканини, що прямо сприяють статевій репродукції рослини) або нерепродуктивними (тобто, клітинами з тканини, що не беруть участь в статевій репродукції рослини). Клітинами рослини можуть бути клітини, які здатні регенеруватися в цільну рослину, або клітину, які не можуть регенеруватися в цільну рослину, наприклад, зрілі клітини ситовидних трубок з віддаленими ядрами.

Використовувана в даному документі фраза "культура клітин рослини" відноситься до будь- якого типу нативних (природних) клітин рослин, клітинних ліній рослин та генетично модифікованих клітин рослин, які не асембловані для формування повної рослини, так що щонайменше одна біологічна структура рослини відсутня. За вибором, культура клітин рослини в даному аспекті даного винаходу може включати конкретний тип клітини рослини або деяке

Зо число різних типів клітин рослини. Слід сказати, що, за вибором, культури рослин, що мають конкретний тип клітини рослини, можуть бути спочатку отримані з деякого числа таких клітин рослин різних типів.

Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходу передбачено будь-яке комерційно або науково значуща рослина. Рослини, які особливо підходять для способів винаходу, включають всі рослини, які ставляться до надродини зелених рослин, зокрема однодольні та дводольні рослини, що включають кормові бобові рослини, декоративні рослини, харчові сільськогосподарські культури, дерева або чагарники, які вибираються зі списку, що включає

Асасіа в5рр., Асег 5рр., Асііпідіа 5рр., Аезсціи5 5рр., Адаїнів аийвігаїї5, АїІрігіа атага, АІзорпіа

ШМісоїог, Апагородоп 5рр., Агаспі5 5рр, Агеса саїеспи, Авівійа Іадгап5, Авігада|ив5 сісег, ВаїКіаєа рішпішда, Веїша 5рр ., Вгазвіса 5рр., Видиієега дутпо!тпіга, Виїкеа айісапа, Вишїва їпопадоза,

Садаба Гагіпоза, СаїПапага 5рр, Сатепйа віпепвів5, Саппа іпдіса, Сарзісит 5рр., Саввзіа врр.,

Сепітоєта рибезсепв, Спасоотеїез 5рр., Сіппатотит саззіа, Соївєа агабіса, Соіорпозреттит торапе, Согопійа мапа, Соїопеавіє! зегоїїпа, Стаїаедив 5рр., Сиситів 5рр., Сиргезвзив з5рр.,

СуаїШйеа аеаїбаїа, Судопіа обіопда, Стуріотетгіа |(аропіса, Сутрородоп 5рр., Супінєа аваїбраїа,

Судопіа обіопда, ОаІрегдіа топеїагіа, Рамаїа аїмагісаїа, Оевтодійт 5рр., РісКбзопіа здоагоза , рібе(егородоп атріесієпв, Оіосієа 5рр, Роїїсно5 5рр., богуспішт гесішт, Еспіпоспіса ругатіадаї 5,

Епганіа 5рр., ЕІвивзіпе согасапа, Егадгевіїв 5рр., Егуїпгіпа 5рр., Єисаїуріи5 5рр., Єисієа 5сПітретгі,

Ешаїйа мі / Іоза, Радоругит 5рр., РейДоа зейомапа , Егадапйа 5рр., Ріетіпдіа 5рр, Егеусіпейа рапкзії, Сегапішт Шипрбегаї, СіпАдо Брііоба, Сіпіусіпе |амапіса, Сіігісідіа 5рр, Соззурійит НігшШит,

СтеміШеа зрр., Сиірошипіа соІеозрепта, Недузагит 5рр., НетайнНіа ай»ввіта, Неїегородоп сопіойив5, Ногдецт миїЇдаге, Нурагтепіа гиїта, Нурегісшт егесіит, НурейнНеїйа аїівбзо!ше, Іпаідо іпсатага, Іі 5рр., І ергатенпа ругоїїоїїа, І езредіга 5рр., Гейиса 5рр., І еисаєпа Іеисосерпаїа,

І оцадеїйа вітрієх, І оїопив бБаїпезвії, І оїи5 5рр., Мастоуота ахіїаге, Мав 5рр., Мапіної езсшіепіа,

Меадісадо заїїма, Меїазедиоіа діуріозігороїде5, Миза заріепшт, Місоїйапит 5рр., Опобгуснів врр.,

Огтпіййориз 5рр., Огула 5рр., Рейорпогит аїйсапит, Реппізейт з5рр., Регзеа дгаїїзвіта, Рейпіа 5рр., Рпазеоїи5 5рр., Рпоепіх сапагіепвів, Рпоптішт сооКіапит, РНоїїіпіа 5рр., Рісеа діайса, Ріпиб 5рр., Рівит заїмат, Родосагтрив оїага, Родопанйнгіа ПескКії, Родопайніа здиатоза, Роршив 5рр.,

Ргозорів сіпегагіа, Резецдоїзида тепт?ієзії, РіегоЇобішт вівайт, Ругиє соттипів, Ойегсив врр.,

Апарпіоіерзіє итбреїІага, НПораїпшовіуїї5 5аріда, ННпив5 паїаІепві5, Ніре5 дгоззціагпа, Ніре5 5рр., 60 Вобіпіа рзхейдоасасіа, Воза 5рр., Вибиз з5рр., Заїїх зрр., Зспугаспугішт запдиіпейт, бсіадоріїувз мейНісійага, Зедиоіїа зетрегмігепв5, Зедиоіадепагоп дідапівшт, Богайпит бБісоїог, бріпасіа з5рр., зрогороїйз Птбгіаєи5, ейриги5 аіІоресигоїдеб5, 5(уюзапіпйоб5 Питіїї5, Тадепаді 5рр, Таходійт дібтіспит, Тнетеада іпапага, Тиїоїйшт 5рр., Тийсит 5рр., Тзида Пейегорпуїа, Массіпішт 5рр., Місіа 5рр., Мі5 міпітега, УМаїзопіа ругатідава, гапівдезспіа аєеПіоріса, 7еа таув, амарант, артишок, спаржу, броколі, брюссельську капусту, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, листову капусту, льон, кормову капусту, сочевицю, ріпак, бамію, цибулю, картоплю, рис, сою, солому, цукровий буряк, цукровий очерет, томат, гарбуз, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, жито, овес, арахіс, горох, сочевицю і люцерну, бавовну, ріпак, канолу, перець, соняшник, тютюн, баклажан, евкаліпт, будь-яке дерево, будь-яка декоративне рослина, багаторічну траву і будь-яку фуражну культуру. Альтернативно, водорості та інші рослини, що не відносяться до зелених, можуть бути використані в способах даного винаходу.

Відповідно до деякого варіанту здійснення винаходу, рослина, що використовується в способі винаходу є сільськогосподарською культурою, включаючи, але без обмеження, бавовну, овочі сімейства капустяних, ріпак, кунжут, оливкове дерево, пальму, банан, пшеницю, кукурудзу, овес, люцерну, арахіс, соняшник, рис, овес, цукровий очерет, сою, дерноутворювальні рослини, ячмінь, жито, сорго, цикорій, салат, томат, цукіні, солодкий перець, баклажан, огірок, диню, кавун, боби, гібіскус, бамію, яблуко, троянду, суницю, перець чилі, часник, горох, сочевицю, канолу, мамс, Агарідорві5, броколі, капусту, буряк, лободу, шпинат, гарбуз, цибулю, цибулю- порей, тютюн, картоплю, цукровий буряк, папайю, ананас, манго, Агарідорзів ІПаїйапа, а також рослини, використовувані в садівництві, квітникарстві або лісовому господарстві, такі як, але без обмеження, тополя, ялиця, евкаліпт, сосна, будь-яка декоративна рослина, будь-яка багаторічна трава і будь-яка фуражна культура, хвойні дерева, мох, водорості, а також інші рослини, перераховані на сайті ммлу.пайоптавхіег.сот/епсусіоредіа/Ріапіає.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, рису, пшениці, томату, бавовни і сорго.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, насіниною є насінина без оболонки або свіжим насінням, яке не було піддане хімічній або фізичній обробці.

У деяких варіантах здійснення промивку насіння здійснюють протягом від ЗО хвилин до 4 годин. Інші приклади часу промивки становлять від 1 хвилини до 10 хвилин, від 10 хвилин до 30 хвилин. Відповідно до деяких варіантів здійснення, промивка насіння може тривати всього 5, 10, 20, 30, 45 або 60 секунд. Розчин для промивання може включати слабкий детергент, такий як

Тмееп-20. Концентрація детергенту може становити 0,01 - 0,295 або 0,2 - 195. Відповідно до ще одного варіанту здійснення, концентрація детергенту може становити приблизно 0,001905, 0,00595, 0,0195, 0,0595, 0,195, 0,595, 195 або вище.

Насінина може піддаватись праймінгу або промиванню перед контактом з а5ЕКМА.

Використовуваний в даному документі термін "праймінг" відноситься до управління рівнем гідратації насіння, щоб могла проходити метаболічна активність, необхідна для проростання, але запобігалась поява зародкових корінців. Різні види фізіологічної активності в насінині відбуваються при різних рівнях вологості (І еороїд апа Меписсі, 1989; Тауїог, 1997). Останньою фізіологічною активністю в процесі проростання є поява зародкових корінців. Ініціація появи зародкових корінців вимагає високого вмісту води в насінині. При обмеженні вміту води в насінині всі метаболічні етапи, необхідні для проростання, можуть відбуватися без незворотньої дії появи зародкових корінців. Перед появою зародкових корінців насінина вважається такою, що переживає зневоднення, так що вміст вологи в замоченій в праймінговому розчині насінині може бути знижено за допомогою сушіння. Після сушіння замочене у праймінговому розчині насіння може зберігатися до часу посіву.

У комерційних цілях використовуються різні способи праймінгу. Здається, що найбільші наслідки серед них мають рідинний або осмотичний праймінг і праймінг у твердій матриці (Кпап еї а!., 1991).

Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу, праймінг здійснюють в присутності солі, хелатного агента, поліетиленгліколю або їх комбінації (наприклад, хелатного агента і солі).

Альтернативно, праймінг здійснюють у присутності води, такої як деіонізована вода або двічі деіїонізована вода. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, праймінг здійснюють у присутності 10095 двічі деіонізованої води.

Зазвичай використовують кілька типів праймінгу насінини: осмопраймінг (осмо-кондиціювання) - стандартний спосіб праймінгу. Насіння інкубують в добре аераційних розчинах з низьким потенціалом води і після цього промивають і сушать.

Низький потенціал води для таких розчинів може бути досягнутий шляхом додавання таких осмотиків як манітол, поліетиленгліколь (ПЕГ) або солі, такі як КСІ; 60 гідропраймінг (праймінг в барабані) - здійснюється шляхом непреривного або послідовного додавання обмеженого об'єму води до насіння. Для цієї мети використовують барабан, і воду можна подавати вологим повітрям. "Замочування на фермі" є дешевим і відповідним способом, який здійснюють шляхом інкубації насіння (злакових, бобових) протягом обмеженого часу в теплій воді; матричний праймінг (матричне кондиціювання) - це інкубація насіння у твердій нерозчинній матриці (вермикуліт, діатомова земля, зшиті полімери з високою здатністю абсорбувати воду) з обмеженим об'ємом води. Цей спосіб забезпечує повільне вбирання.

Попередньо пророщене насіння - цей спосіб можливий тільки для небагатьох видів. На противагу нормальному праймінгу насінню дають можливість випустити зародкові корінці. Після цього застосовують сортування за специфічними стадіями, обробку, яка повторно індукує толерантність до зневоднення, і сушіння. Використання попередньо пророщеного насіння дозволяє отримати швидкий і рівномірний розвиток розсади.

Так, відповідно до одного варіанту здійснення, насіння замочують в праймінговому розчині.

Слід сказати, що насіння можна обробляти водою (двічі дистильованою) перед контактом з азЕМА без здійснення праймінгу. Наприклад, обробка водою протягом короткого часу (наприклад, від 30 секунд до години, від 30 секунд до 0,5 години, від ЗО секунд до 10 хвилин, від 30 секунд до 5 хвилин або від 45 секунд до 5 хвилин). Відповідно до деяких варіантів здійснення, обробка водою може тривати всього 5, 10, 20 або 30 секунд.

Слід розуміти, що молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5зКМА, може міститися у воді (наприклад, водопровідній, дистильованій або двічі дистильованій), тобто, що не містить солей у вищезгаданій ефективній концентрації для праймінгу, хелатних агентів, поліетиленгліколю або їх комбінацій ( наприклад, хелатний агент і сіль). У деяких варіантах здійснення молекулу нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, ад5ЕМА, вводять в насінину в буферному розчині, такому як ЕДТА.

У деяких варіантах здійснення насіння не замочують у праймінговому розчині.

Необмежений спосіб введення й5КМА в насінину представлений у Прикладі 1, який вважається невід'ємною частиною даного опису винаходу.

Температура на етапах промивання/праймінгу та сушіння може бути однаковою або різною.

Відповідно до одного варіанту здійснення, промивку/праймінг здійснюють при 4 - 28 2с.

Відповідно до одного варіанту здійснення, розчин для промивки/праймінгу або розчин, що містить 85КМА, позбавлений твердого носія.

Відповідно до одного варіанту здійснення, розчин для промивки/праймінгу або розчин, що містить а5КМА, позбавлений передавального агента, такого як ПАР (поверхнево-активні речовини, далі ПАР) або сіль.

Відповідно до ще одного варіанту здійснення винаходу, насіння, що піддавалось контакту з молекулою а5зЕМА, промивають, щоб видалити агенти, які впливали на насіння, такі як пестицид, фунгіцид, інсектицид, добриво, покриваючий засіб й фарбуючий засіб.

Так, відповідно до одного варіанту здійснення, насіння (перед обробкою за допомогою а5зКМА) по суті вільне (тобто, не включає ефективні кількості) від пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу й фарбуючого засобу.

Потім насіння піддають сушінню. У деяких варіантах здійснення сушіння не є обов'язковим.

Відповідно до одного варіанту здійснення, сушіння здійснюють при 20 - 37 С, 20 - 30 ос, -22 - 37 "б, 15 - 22 С або 20 - 25 "С протягом 10 - 20 годин, 10 - 16 годин або навіть 2 - 5 годин.

При розрахунку концентрації 85АКМА в розчині для контакту слід враховувати різні чинники.

Вони залежать щонайменше від одного з розміру насінини, маси насінини, об'єму насінини, площі поверхні насінини, щільності насінини і проникності насінини.

Наприклад, що стосується розміру, маси, об'єму і площі поверхні насінини, за оцінками насіння кукурудзи вимагають більш тривалої обробки ніж насіння Агарідорзі5 і томата. Що стосується проникності і щільності, по оцінкам насіння пшениці вимагають більш тривалої обробки при більш високих концентраціях ніж насіння томата.

Приклади концентрації 45КМА в розчині для обробки включають, але без обмеження, 0,01 - 0,3 мкг/мкл, 0,01 - 0,15 мкг/мкл, 0,04 - 0,15 мкг/мкл, 0,1 - 100 мкг/мкл; 0,1 - 50 мкг/мкл, 0,1 - 10 мкг/мкл, 0,1 - 5 мкг/мкл, 0,1 - 1 мкг/мкл, 0,1 - 0,5 мкг/мкл, 0,15 - 0,5 мкг/мкл, 0,1 - 0,3 мкг/мкл, 0,01 - 0,1 мкг/мкл, 0,01 - 0,05 мкг/мкл, 0,02 - 0,04 мкг/мкл, 0,001 - 0,02 мкг/мкл. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, концентрація 45КМА в розчині для обробки складає 0,01 - 0,15 або 0,04 - 0,15 мкг/мкл.

В одному варіанті здійснення концентрація 45КМА в розчині для обробки становить 0,01 - 0,3 мкг/мл, 0,01 - 0,15 мкг/мл, 0,04 - 0,15 мкг/мл, 0,1 - 100 мкг/мл; 0,1 - 50 мкг/мл, 0,1 - 10 мкг/мл, 60 0,1 - 5 мкг/мл, 0,1 - 1 мкг/мл, 0,1 - 0,5 мкг/мл, 0,15 - 0,5 мкг/мл, 0,1 - 0,3 мкг/мл, 0,01 - 0,1 мкг/мл,

0,01 - 0,05 мкг/мл, 0,02 - 0,04 мкг/мл або 0,001 - 0,02 мкг/мл.

У ще одному варіанті здійснення, концентрація 45КЕМА в розчині для обробки складає приблизно 5 - 10 мкг/мл, 10 - 15 мкг/мл, 15 - 20 мкг/мл, 20 - 25 мкг/мл; 25 - 30 мкг/мл, 30 - 35 мкг/мл, 35 - 40 мкг/мл, 40 - 45 мкг/мл, 45 - 50 мкг/мл, 50 - 55 мкг/мл, 55 - 60 мкг/мл, 60 - 65 мкг/мл, 65 - 70 мкг/мл, 70 - 75 мкг/мл, 75 - 80 мкг/мл, 80 - 85 мкг/мл, 85 - 90 мкг/мл, 90 - 95 мкг/мл, 95 - 100 мкг/мл, 100 - 105 мкг/мл, 105 - 110 мкг/мл, 110 - 115 мкг/мл, 115 - 120 мкг/мл, 120 - 125 мкг/мл; 125 - 130 мкг/мл, 130 - 135 мкг/мл, 135 - 140 мкг/мл, 140 - 145 мкг/мл, 145 - 150 мкг/мл, 150 - 155 мкг/мл, 155 - 160 мкг/мл, 160 - 165 мкг/мл, 165 - 170 мкг/мл, 170 - 175 мкг/мл, 175 - 180 мкг/мл, 180 - 185 мкг/мл, 185 - 190 мкг/мл, 190 - 195 мкг/мл, 195 - 200 мкг/мл, 200 - 210 мкг/мл, 210 - 220 мкг/мл, 220 - 230 мкг/мл, 230 - 240 мкг/мл, 240 - 250 мкг/мл, 250 - 260 мкг/мл, 260 - 270 мкг/мл, 270 - 280 мкг/мл, 280 - 290 мкг/мл, 290 - 300 мкг/мл, 300 - 310 мкг/мл, 310 - 320 мкг/мл, 320 - 330 мкг/мл, 330 - 340 мкг/мл, 340 - 350 мкг/мл, 350 - 360 мкг/мл, 360 - 370 мкг/мл, 370 - 380 мкг/мл, 380 - 390 мкг/мл, 390 - 400 мкг/мл, 400 - 410 мкг/мл, 410 - 420 мкг/мл, 420 - 430 мкг/мл, 430 - 440 мкг/мл, 440 - 450 мкг/мл, 450 - 460 мкг/мл, 460 - 470 мкг/мл, 470 - 480 мкг/мл, 480 - 490 мкг/мл або приблизно 490 - 500 мкг/мл.

У ще одному варіанті здійснення концентрація д5КМА в розчині для обробки складає 0,0001 - З мкг/мкл, 0,0001 - 2,5 мкг/мкл, 0,0001 - 2 мкг/мкл, 0, 0001 - 1,5 мкг/мкл, 0,0001 - 1 мкг/мкл, 0,0001 - 0,9 мкг/мкл, 0,0001 - 0,8 мкг/мкл, 0,0001 - 0,7 мкг/мкл, 0,0001 -0, 6 мкг/мкл, 0,0001 - 0,5 мкг/мкл, 0,0001 - 0,4 мкг/мкл, 0,0001 - 0,3 мкг/мкл, 0,0001 - 0,2 мкг/мкл, 0,0001 - 0,1 мкг/мкл, 0,0001 - 0,05 мкг/мкл, 0,0001 - 0,02 мкг/мкл, 0,0001 - 0,01 мкг/мкл, 0,0001 - 0,005 мкг/мкл, 0,0001 - 0,001 мкг/мкл або 0,0001 - 0,0005 мкг/мкл.

У ще одному варіанті здійснення концентрація а5КМА в розчині для обробки складає 0,0001 - З мкг/мкл, 0,0005 - З мкг/мкл, 0,001 - З мкг/мкл, 0,005 - З мкг/мкл, 0,01 - З мкг/мкл, 0,05 - З мкг/мкл, 0,1 - З мкг/мкл, 0,2 - З мкг/мкл, 0,3 - З мкг/мкл, 0,4 - З мкг/мкл, 0, 5 - З мкг/мкл, 0,6 - З мкг/мкл, 0,7 - З мкг/мкл, 0,8 - З мкг/мкл, 0,9 - З мкг/мкл, 1 - З мкг/мкл або 2 - З мкг/мкл.

У ще одному варіанті здійснення концентрація а5ЕМА в розчині для обробки складає 0,0001 - З мкг/мкл, 0,0005 - 2,5 мкг/мкл, 0,001 - 2 мкг/мкл, 0,005 - 1,5 мкг/мкл, 0, 01 - 1 мкг/мкл, 0,05 - 0,5 мкг/мкл, 0,1 - 0,4 мкг/мкл або 0,2 - 0,3 мкг/мкл.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення контакт з а5КМА здійснюють у присутності хелатного агента, такого як ЕДТА, або іншого хелатного агента, такого як ДТПА (діетилентріамінпентаоцтова кислота, далі ДТПА або ОТРА) (0,01 - 0,1 мм).

У деяких варіантах здійснення розчин для обробки може включати агент перенесення, такий як ПАР або сіль. Приклади таких агентів переносу включають, але без обмеження, солі, такі як натрієві або літієві солі жирних кислот (таких як жир, або талеві аміни, або фосфоліпіди, ліпофектамін або ліпофектін (1 - 20 нМ або 0,1 - 1 нМ) ) і кремнійорганічні ПАР. Інші відповідні

ПАР включають кремнійорганічні ПАР, включаючи неїонні кремнійорганічні ПАР, наприклад,

ПАР на основі трісилоксан етоксілату, або сополімер кремнію і поліефіру, такий як сополімер гептаметилтрісилоксана, модифікованого поліалкіленом, і метиловий ефір алілоксі поліпропіленгліколю (продається під товарним знаком 5іїжестМ -77 ії має номер СА5 27306-78- 1 ї номер ЕРА САГ.КЕС.МО. 5905-50073-АА, в даний час пропонується компанією Мотепіїме

Регіогтапсе Маїегіаі5, Олбані, Нью-Йорк).

У деяких варіантах здійснення розчин для обробки може включати фізичний агент.

Приклади фізичних агентів включають: (а) абразиви, такі як карборунд, корунд, пісок, кальцит, пемза, гранат і т.д., (5) наночастинки, такі як вуглецеві нанотрубки, і (с) фізичну силу. Вуглецеві нанотрубки розкриті Камом та ін. (Кат еї а!.) (2004) У. Ат. Спет. 5ос., 126 (22): 6850-6851, Лю та ін. «Си еї а.) (2009) Мапо Гей., 9 (3): 1007-1010, і Ходаковською та ін. (КподаКоузкКауа еї аї.) (2009) АС5 Мапо, З (10): 3221-3227. Агенти фізичної сили можуть включати нагрівання, охолодження, застосування позитивного тиску або ультразвукову обробку. Агенти для

БО лабораторного кондиціонування рослини для проникнення полінуклеотидів включають, наприклад, застосування хімічного агента, ферментативну обробку, нагрів або охолодження, обробку позитивним чи негативним тиском, ультразвукову обробку. Агенти для кондиціонування рослин в полі включають хімічні агенти, такі як ПАР і солі.

Контакт насіння з аБКМА може бути здійснений будь-яким способом, відомим в даній області техніки, якщо ефективна кількість д5ЕМА потрапляє в насіння. Приклади включають, але без обмеження, просочування, розпилення або покриття порошком, емульсією, суспензією або розчином; також, молекули полінуклеотида наносять на рослину будь-яким відомим способом, наприклад, розпиленням або обтиранням розчином, емульсією або суспензією.

Використовуваний в даному документі термін "ефективна кількість" відноситься до кількості 60 а5КМА, якого достатньо для зниження активності гена-мішені щонайменше на 2095, 30905, 40905,

5095 або більше, наприклад, на 6095, 7095, 80 95, 9095 або навіть на 10095. Ефективна кількість може бути результатом формування ампліфікації в рослині або фітопатогені.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення контакт може бути здійснений шляхом просочування (тобто інокуляції), так що збовтування насіння з розчином для обробки може поліпшити проникнення і просочування і, тому, скоротити час обробки. Збовтування зазвичай виконують при 50 - 150 об/хв і залежно від об'єму розчину для обробки. Збовтування може здійснюватися протягом 4 - 24 годин (1 - 4 годин, 10 хвилин - 1 година або 30 секунд - 10 хвилин). Дана заявка також передбачає короткий час інкубації, такий як до 10 хвилин. Приклади включають, але без обмеження, 30 секунд - 7 хвилин, 30 секунд - 5 хвилин, 30 секунд - З хвилини, 30 секунд - 2 хвилини, 30 секунд - 1 хвилина, 1 хвилина - 10 хвилин або 1 хвилина - 5 хвилин.

В одному варіанті здійснення час інкубації може становити 1 - 60, 2 - 60, 5 - 60, 10 - 60, 20 - 60, 30 - 60, 40 -60,50-60,1-50,1-40,1-30,1-20,1-10,1-5,5-50,10-40120 - 30 секунд.

У ще одному варіанті здійснення, час інкубації може становити 1 - 60,2 -60, 5 - 60, 10 - 60, 20-60,30-60,40-60,50-60,1-50,1-40,1-30,1-20,1-10,1-5,5-50,10-40120 - 30 хвилин.

У межах обсягу представлених варіантів здійснення також розглядається занурення. Так, насіння занурюють у розчин азЕМА на кілька секунд, наприклад, 1 - 10 секунд, 1 - 5 секунд, 1- З секунди або 1 - 2 секунди. Протягом цього періоду О5ЕМА може вбратися в поверхню насінини.

Ввібрана а5ЕМА, яка покриває насінину, може проникати в насіння або розсаду під час проростання. Інкубацію проводять у темряві при 4 - 28 7С або 15 - 22 С (наприклад, при 8 - 15"С,4-870,22-2879).

В одному варіанті здійснення час занурення може становити 1 -60,2160,5160,10160, 2014 60, 30160,40160,50160,1150,1140,1130,1120,1110,115,5150,10140, 120 і 30 хвилин.

В одному варіанті здійснення, час занурення може становити 1 - 60, 2 - 60, 5 - 60, 10 - 60, 20 - 60, 30 - 60, 40 -60,50-60,1-50,1-40,1-30,1-20,1-10,1-5,5-50,10-40120 - 30 секунд.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, контакт відбувається перед порушенням стану спокою насінини і появою зародка.

Після контакту, переважно перед порушенням стану спокою насінини і появою зародка,

Зо насіння може бути піддане обробці (наприклад, покриттю) вищевказаними агентами (наприклад, пестицидом, фунгіцидом і т.д.).

Контакт здійснюють так, що а5КМА надходить у зародок, ендосперм, оболонку або комбінацію з цих трьох органів.

Після контакту з розчином для обробки насіння може бути піддане сушінню протягом до 30 годин при 25 - 37 "С. Наприклад, насіння може сушитися протягом 16 годин при 30 "С.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, насінина (наприклад, ізольована насінина) включає екзогенну голу 85ЕМА, і причому щонайменше 10 або 20 молекул а5КЕМА знаходяться в ендоспермі ізольованої насінини.

Використовуваний в даному документі термін "ізольований" ставиться до відділення від природного фізіологічного середовища. У випадку насінини - ізольована насінина відокремлена від інших частин рослини. У випадку молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, а5КМА) - вона відокремлена від цитоплазми.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, 45КМА не експресується з генома рослини, тому вона не є невід'ємною частиною генома.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, запропонована ізольована насінина, що включає екзогенну а5КМА, присутню в подібній концентрації (наприклад, приблизно 1:1, 2:11 або 1:2) в зародку і ендоспермі насінини. Передбачається, що пряме введення голої а5КМА в насінину призводить до підвищення концентрації а5КМА в ендоспермі в порівнянні з тією, що спостерігається, коли Д5КМА експресується з експресуючого конструкту нуклеїнової кислоти.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, запропонована ізольована насінина, що включає екзогенну а5КМА, просторово розподілену у зародку і ендоспермі насінини рослини так, що просторовий розподіл відрізняється від просторового розподілу екзогенної а5КМА в насінині, отриманій від трансгенної рослини, яка рекомбінантно експресує таку екзогенну а85КМА.

Способи вимірювання локалізації молекул РНК в насінині добре відомі в даній галузі техніки.

Одним прикладом є використання 5ісіо, що описано в розділі "Приклади".

Відповідно до альтернативного або додаткового варіанту здійснення, запропонована ізольована насінина, що включає екзогенну а5КМА, причому співвідношення концентрацій бо екзогенної ОБКМА з дозріваючої з неї зікМА вище у насінині в порівнянні з трансгенною насіниною, рекомбінантно експресуючим таку екзогенну а5ЕМА.

Використовуваний в даному документі термін "вище, більше" означає, щонайменше, приблизно 395, 595, 795, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 5095, 6095, 7095, 8095, 9095 або навіть кілька разів.

Відповідно до альтернативного або додаткового варіанту здійснення, запропонована ізольована насінина, що включає екзогенну а5КМА, причому насінина рослини позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії такої екзогенної а5зКМА, і причому просторовий розподіл такої екзогенної а5КМА та/або дозріваючої з неї 5ікМА змінено в насінині в порівнянні з просторовим розподілом в трансгенній насінині, що рекомбінантно експресує цю екзогенну а85КМА.

Термін "рекомбінантно експресуючий" відноситься до експресії з конструкту нуклеїнової кислоти.

Відповідно до ще одного варіанту здійснення, запропонована насінина рослини, яка може бути отримана (або вже отримана) будь-яким із способів, описаних у даному документі.

Способи визначення успішного введення 45ЕМА включають, але без обмежень, ЗТ-ПЛР (наприклад, кількісне визначення рівня гена-мішені або голої Д5КМА), фенотипічний аналіз на біомасу, силу, врожайність і толерантність до стресу, архітектуру коренів, розміри листя, розмір і масу зерна, вміст олії, целюлози, а також способи біології клітини.

Відповідно до деяких варіантів здійснення, спостерігається зміна рівня експресії ортолога рослини гена комахи-шкідника, на який націлена обробка насінини, описана в даному документі.

Дивіться, наприклад, Приклади 45 і 46 з розділу "Приклади", нижче.

Насіння може зберігатися протягом 1 доби - кількох місяців перед посадкою (наприклад, при 4-1075).

Отримана насінина може бути пророщена в темряві, щоб отримати рослину.

Таким чином, запропонована рослина або частина рослини, що включає екзогенну голу а5зКМА і позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії 45КМА в рослині.

Використовувана в даному документі фраза "позбавлений гетерологічного промотора для стимуляції експресії О5КМА" означає, що рослина або клітина рослини не включає діючу в сів- положенні регуляторну послідовність (наприклад, гетерологічну), яка транскрибує а5ЕМА в

Зо рослині. Використовуваний в даному документі термін "гетерологічний" означає екзо- генний, такий, що не зустрічається в природному стані в нативній клітині рослини (за положенням інтеграції або такий, що знаходиться в штучному стані в клітині рослини). Таким чином, ізольоване насіння при відсутності послідовності гетерологічного промотора для стимуляції експресії а5БКМА в рослині включає гомогенну (перед ампліфікацією) або гетерогенну (вторинні 5ІКМА, після ампліфікації) популяцію нетранскрибованої а85КМА рослини.

Справжній спосіб може бути використаний для модуляції експресії гена, наприклад, в рослині, причому спосіб включає: (а) контакт насінини рослини з голою а5КМА в умовах, які дозволяють проникнення а5ЕКМА в насінину, тим самим вводячи Я5КМА в насінину; і, за вибором, (Б) генерацію насінини рослини.

При використанні для зниження активності гена рослини голу а5КЕМА конструюють з бажаною специфічністю, використовуючи засоби біоінформатики, які добре відомі в даній області техніки (наприклад, ВІ А5Т).

Цей спосіб може бути використаний у різних умовах застосування, починаючи з фундаментальних досліджень, наприклад, з оцінки функції гена і закінчуючи отриманням рослин зі зміненими характеристиками, які є цінними для комерційного використання.

Такі рослини можуть мати характеристики, вигідні для сільського господарства, включаючи змінену морфологію, змінене цвітіння, змінену толерантність до стресу (тобто, біотичного та/або абіотичного), змінену біомасу, силу і/або врожайність і т.д.

Фраза "абіотичний стрес", використовувана в даному документі, відно-сится до будь-якого несприятливого впливу на метаболізм, ріст, життєдіяльність та/"або репродукцію рослини.

Абіотичний стрес може бути індукований будь-яким з недостатньо оптимальних умов для росту в навколишньому середовищі, наприклад, дефіцитом води або посухою, повінню, заморозками, низькою або високою температурою, сильними вітрами, забрудненістю важкими металами, анаеробіозом, високими або низькими рівнями поживних речовин (наприклад, недоліком живильних речовин), високими або низькими рівнями вмісту солі (наприклад, засоленістю), забрудненням атмосфери, високою або низькою інтенсивністю світла (наприклад, недоліком освітлення) або УФ-випромінюванням. Абіотичний стрес може мати короткостроковий ефект (наприклад, гострий ефект, наприклад, який триває приблизно тиждень) або, альтернативно, 60 може бути неминаючим (наприклад, хронічний ефект, наприклад, що триває, наприклад, 10 діб або більше). Даний винахід передбачає ситуації, в яких існує одна умова абіотичного стресу, або, альтернативно, ситуації, в яких мають місце два і більше абіотичних стресів.

Відповідно до одного з варіантів здійснення, абіотичний стрес відноситься до засоленості.

Відповідно до одного з варіантів здійснення, абітичний стрес відно-сится до посухи.

Відповідно до одного з варіантів здійснення, абіотичний стрес відно-сится до температурного стресу.

Використовувана в даному документі фраза "толерантність до абіотичного стресу" відноситься до здатності рослини переносити абіотичний стрес без ознак істотного фізіологічного або фізичного пошкодження (наприклад, зміна у метаболізмі, рості, життєздатності та/або здатності до репродукції рослини).

Використовувана в даному документі фраза "ефективність використання азоту (далі ЕВА)" означає міру виробництва сільськогосподарської культури на одиницю внесеного азотного добрива. Ефективність використання добрива (далі ЕВД) є мірою ЕВА. Виробництво сільськогосподарської культури може бути виміряне по біомасі, силі або врожайності.

Ефективність використання азоту для рослини зазвичай є результатом зміни щонайменше одного з поглинання, розповсюдження, абсорбуючій здатності, накопичення, переміщення (в рослині) і використання азоту, абсорбованного рослиною. Підвищена ЕВА співвідноситься з такою у нетрансгенній рослині (тобто, за відсутності трансгена трансгенної рослини) того ж виду, на тій же стадії розвитку і вирощеного в тих же умовах.

Використовувана в даному документі фраза "умови, що обмежують постачання азотом" відноситься до умов росту, які включають рівень (наприклад, концентрацію) застосованого азоту (наприклад, амонію чи нітрату), який нижче рівня, необхідного для оптимального метаболізму, росту, репродукції та/або життєздатності рослини.

Використовуваний в даному документі термін/фраза "біомаса", "біомаса рослини" або "рослинна біомаса" відноситься до кількості (наприклад, що вимірюється в грамах тканини повітряного сушіння) тканини, отриманої від рослини за сезон вирощування. Збільшення в рослинній біомасі може відбуватися у всій рослині або її частинах, таких як надземні (наприклад, що збираються як врожай) частини, вегетативна біомаса, коріння та/або насіння або їх вміст (наприклад, масло, крохмаль і т.д.).

Зо Використовуваний в даному документі термін/фраза "сила", "сила рослини" або "рослинна сила" відноситься до кількості (наприклад, визначеною за масою) тканини, виробленої рослиною за певний період часу. Підвищена сила може визначати врожайність рослини, або врожайність на одиницю часу вирощування або одиницю площі вирощування або впливати на неї. Крім цього, рання сила (наприклад, насінини та/або розсади) призводить до поліпшення врожаю на корені.

Використовуваний в даному документі термін/фраза "врожайність", "врожайність рослини" або "рослинна врожайність" відноситься до об'єму (наприклад, визначеним за масою або розміром) або кількості (наприклад, численному) тканин або органів, продукованих на одну рослину або за один сезон вирощування. Підвищена врожайність рослини впливає на економічну вигоду, яку можна отримати від рослини в певній галузі вирощування та/або за певний час вирощування.

Відповідно до одного варіанту здійснення, врожайність вимірюють за вмістом целюлози, вмісту масла, вмісту крохмалю тощо.

Відповідно до ще одного ваіранту здійснення, врожайність вимірюють за вмістом масла.

Відповідно до ще одного ваїіранту здійснення, врожайність вимірюють за вмістом білка.

Відповідно до ще одного ваіранту здійснення, врожайність вимірюють за кількістю насінин, масою насінини, кількістю плодів або масі плодів на одну рослину або її частини (наприклад, по серцевині, їстівної насінини).

На врожайність рослини можуть впливати різні параметри, включаючи, але без обмеження, біомасу рослини, силу рослини, швидкість росту рослини, врожайність насінини, кількість насінин або зерен, якість насінини або зерен, врожайність за маслом, вміст олії, крохмалю та/або білка в прибраних органах (наприклад, насінні або вегетативних частинах рослини), кількість квіток (наприклад, квіток) на одну волоть (наприклад, виражена як співвідношення між наповненим насінням з кількістю первинних волотей), показник врожаю, кількість рослин, вирощених на одиниці площі, кількість і розмір прибраних органів на одну рослину і на одиницю площі, кількість рослин на одиницю площі вирощування (наприклад, щільність), кількість прибраних органів на поле, сукупна площа листя, засвоєння вуглецю і розподіл вуглецю (наприклад, розподілення/розташування вуглецю в рослині), стійкість до затінення, кількість органів, які можуть бути прибрані (наприклад, насіння), кількість насіння на один стручок, маса бо одної насінини і модифікована архітектура (така як збільшений діаметр стебла, товщина або поліпшення фізичних властивостей (наприклад, пружності)).

Покращена ЕВА рослини транслюється в поле або в отримання подібної врожайності при застосуванні меншої кількості добрив, або в підвищену врожайність при застосуванні тих же кількостей добрив. Таким чином, поліпшена ЕВА або ЕВД здійснює прямий вплив на врожайність рослини в полі.

Використовувана в даному документі фраза "біотичний стрес" відно-сится до стресу, який відбувається в результаті пошкодження рослин іншими живими організмами, такими як бактерії, віруси, гриби, паразити, корисні та шкідливі комахи, бур'яни і культивовані або нативні рослини.

У Прикладах 7 і 20 - 38 з розділу "Приклади", нижче, описана реалізація даного розкриття в аспекті надання стійкості до Зродоріега ІШогаїїє. У Прикладах 38 і 39 з Розділу "Приклади", нижче, описана реалізація даного розкриття в аспекті надання стійкості до шкідників

СоІеоріегап. У Прикладі 40 - 52 з Розділу "Приклади", нижче, описана реалізація даного розкриття в аспекті надання стійкості до вірусної інфекції.

Використовуваний в даному документі термін "поліпшення" або "підвищення" відноситься щонайменше приблизно до 295, щонайменше приблизно 395, щонайменше приблизно 495, щонайменше приблизно 595, щонайменше приблизно 1095, щонайменше приблизно 1595, щонайменше приблизно 2095, щонайменше приблизно 2595, щонайменше приблизно 30905, щонайменше приблизно 3595, щонайменше приблизно 4095, щонайменше приблизно 4595, щонайменше приблизно 5095, щонайменше приблизно 6095, щонайменше приблизно 7095, щонайменше приблизно 8095 щонайменше приблизно 9095 або більшого збільшення в ЕВА, в толерантності до стресу, у врожайності, в біомасі або в силі рослини в порівнянні з нативними рослинами або рослинами дикого типу (тобто, ізогенними рослинами (вирощеними не з насіння, обробленого за допомогою д5ЕМА) в представлених варіантах здійснення).

У деяких варіантах здійснення ген-мішень 45ЕМА може бути не ендогенним геном рослини, а скоріше геном, екзогенним для рослини, таким як ген фітопатогенного організму, який живиться рослиною або залежить від неї для росту/реплікації (наприклад, бактерії або віруси) та/або виживання. У деяких варіантах здійснення геном-мішенню є істотний ген комахи- шкідника. У деяких варіантах здійснення геном-мішенню є ген вірусу.

Використовуваний в даному документі термін "фітопатоген" відноситься до організму, який

Зо виграє від взаємодії з рослиною і здійснює від'ємний вплив на таку рослину. Термін "фітопатоген" включає комах, павуків, ракоподібних, гриби, бактерій, віруси, нематоди, плоских хробаків, круглих черв'яків, гостриків, анкілостом, стрічкових черв'яків, трипаносом, шистосом, оводів, бліх, кліщів, вошей і т.д., які можуть живитися або контактувати з однією або декількома клітинами, тканинами або рідинами, які продукуються рослиною.

Способи, описані в даному документі, можуть бути використані для отримання рослини, яка стійка до одного або декількох фітопатоген. У деяких варіантах здійснення фітопатогеном є комаха-шкідник. Якщо комаха є шкідником-мішенню для даного винаходу, такі шкідники включають, але без обмеження: із ряду І ерідорієга, наприклад, Асієгі5 5рр., Адохорпуез 5рр.,

Аедегпіа з5рр., Адгоїї5 5рр., АіІабата агдіасеає, Атуїоів 5рр., Апіїсагзіа деттаїаїв, АгсПірв 5рр,

Агаугоїаєпіа 5рр., Ашодгарна 5рр., Вив5еоіа їПизса, Садга сашеїа, Сагрозіпа пірропепвів, Спо 5рр., Спогівіопецга 5рр., Сіувіа атріднеПа, Спарпайосгосів в5рр., Спернавіа 5рр., Соспуїїв 5рр.,

СоіІєорпога в5рр., Стосідоїюотіа бБіпоїаї5, Стуріорпіеєріа Ієисоїгеїа, Суадіа 5рр., Оіапаєа зрр.,

Оірагорзів савзіапеа, Еапа5 5рр., Ерпезійа 5рр., Еисозта 5рр., Еироесійа атбрідшнейа, Еиргосії5 5рр., Еихоа 5рр., Старпоїйа 5рр., Недуа пибрітегапа, Неїоїніз врр., Неїша ипааїї, НурНапіїйіа сипеа, Кеїїепа ІусорегзісеПа, І еисорієега 5сіїейНа, І КпосоПетйів 5рр., Гобевіа роїапа, І утапіна 5рр., Гуопейа 5рр., Маіасозота 5рр., Матезіга Бгаззісає, Мапдиса зехіа, Орегорнієга 5рр.,

Ов5іппіа Мибіїіайбє, Раттепе 5рр., Рапдетів 5рр., Рапоїїз ПЯаттвєа, Ресііпорпога доззурієїЇІа,

Рінйогітаєа орегсиїеїІа, Ріегіз гарає, Рієгіз 5рр., Рішепйа хуїозівІІа, Ргауз 5рр., Зсігрорнада 5рр.,

Зезатіа 5рр., Зрагдапоїйів 5рр., 5родорієга 5рр., зупапіпедоп в5рр., Тнаштеїороєа 5рр., Топгїх 5рр., Тгіспоріивіа пі і Уропотещшіа 5рр.; із ряду СоІеорієга, наприклад, Адгіоїез 5рр., Апіпопотив 5рр., Аютагїіа Іпеєагі5, Снаєїспета ііріаійв, Совтороїйевз 5рр., Ситгсшіо врр., Оеєпитевіев 5рр.,

Оіабгоїїса 5рр., Ерпіаснппа 5рр., Егетпив5 5рр., І ерііпоїагїза десетіїпеєаїа, Гіб5огпорігив врр.,

Меїпоіопіна 5рр., Огусаєрнійшв врр., Сбогпупсниз зрр., РНіусіїпив 5рр., Роріїйа 5рр., РзуїППодез врр.,

ВПігоренна 5рр., Зсагареідає, Зпйорийи5 5рр., Зйоїгода 5рр., Тепебгіо 5рр., Тгіроїйшт 5рр. і

Тгододепта 5рр.; із ряду Огіпоріега, наприклад, Віаца з5рр., ВіацеМйа 5рр., ОгуПоїаІра 5рр.,

Іеисорпаєа тадегає, ІГосивєїа 5рр., Регіріапега 55р., і Зспібіосегса 5рр.; із ряду Ізоріега, наприклад, Кеїїсційетевз 55р.; із ряду Рзосорієега, наприклад, Гірозсеїї5 5рр.; із ряду Апорішига, наприклад, Наетайоріпих 5рр., Гіподпаїпиз» 5рр., Редісши» 5рр., Ретрпідиз» 5рр. і РпуїПохега 5рр.; із ряду Маїїорпада, наприклад, Оатаїйпеа 5рр. і Тгісподесіез 5рр.; із ряду Тпузапоріеєга, бо наприклад, ЕгапкКіїпеМа 5рр., НегсіпоїПпгір5 5рр., Таепіоїйгір5 5рр., ТАгір5 раїті, ТНигір5 їабасі і зсігоїпгір5 ашгапіїй; із ряду Неїйегоріега, наприклад, Сітех 5рр., бізіапіейПа (пеобгота, Рузаетсив5 5рр., Еиспівтив5 5рр., Еигудавієг 5рр., І еріосогіза 5рр., Мегага 5рр., Ріезта 5рр., Нпоапіив 5рр., запірегдеїІа зіпдиїагі5, ЗСОЇіпорнпага 5рр., Тгіаюта 5рр., Мігідає Татійу 5рр. такі як Гуди5 пезрегив5 і Гудив Імпеоїогі5, І удавідає Татійу 5рр. такі як Віїє5и5 Іеисоріегив5, і Репіаютідає Татійу 5рр.; із ряду Ноторіега, наприклад, АїПІеийгоїйгіхи5 ШПоссози5, АїПІеугодеб5 Бгазвзісає, АопідіеМНйа 5рр.,

Арпіадідає, Арпіз 5рр., Азріаіоїшв 5рр., Ветівіа їабасі, Сегоріазієг 5рр., СпгузотрпНаїив5 аопіаійт,

СпгузотрНа|в аїісіуозрепті, Соссив Незрепдит, Етроазса 5рр., Еппобзота Іагідегит,

ЕгуїШгопецта зврр., Савсагаіа врр., ІаодеІрнах зврр., Іасапішт согпі, І ерідозарпез 5рр.,

Мастгозірпив 5рр., Му2и5 5рр., Мепоїейіх 5рр., Міарагуага 5рр., Рагайтіа 5рр., Ретрпідив 5рр.,

Ріапососси5 5рр., Рзєешдаціасаврів 5рр., Рзепдососсив 5рр., РзуПа 55р., Риміпагіа аєїіоріса,

Опцаагазрідіотие 5рр., Впораіозірпит врр., Заїіззейа 5рр., Зсарпоїдеи5 врр., Зспігарнів врр., зпобріоп 5рр., Тгіаеєигоде5 марогагіогит, Тгіола егуїгеае і Опазріб сіїгі; із ряду Нуптепоріега, наприклад, Асготуптех, АНа врр., Серпив 5рр., Оіргіоп 5рр., Оіргіопідає, Сіїріпіа роууюта,

Норіосатра 5рр., Газіиз 5рр., Мопоїтогішт рпагаопів5, Меоадіргіоп 5рр, ЗоІепорів 5рр. і Мезра 55р.; із ряду Оірієга, наприклад, Аєде5 5рр., Апіпегідопа 5оссаїа, Віріо Погішапив, Саїрнога егуїпгосернаїйа, Сегаїйі5 5рр., Спгузотуїіа 5рр., Сшех з5рр., Сціетебга 5рр., Оасив з5рр., ЮОгозорпіїа теїаподавзієг, Раппіа з5рр., Сазігторніш5 врр., Сіозвіпа 5рр., Нуродепта 5рр., Нурророзса зрр.,

Піотуза з5рр., І исіїа 5рр., МеІападготу?а 5рр., Мивзса з55р., Оеєвігив 5рр., Огзеоїїа врр., О5сіпеПа її, Редотуїа Нуозсуаті, Рпогбіа 5рр., Впадоїеїї5 ротопеїа, 5сіага 5рр., Зіотохуз 5рр., Табапив 5рр., Таппіа 5рр. і Тірша 5рр., із ряду 5ірпопарієга, наприклад, Сегарпуїив5 5рр. ії ХепорзуПа спеорів і із ряду Тпузапига, наприклад, Герізхта засспагіпа. Так, відповідно до одного варіанту здійснення, запропонований спосіб інгібування експресії гена-мішені в фітопатогенному організмі, причому спосіб включає надання (наприклад, харчування або контакт в умовах інфікування) фітопатогенному організму рослини, яка описана в даному документі (щонайменше частина її включає голу д5ЕМА), тим самим інгібуючи експресію гена-мішені в фітопатогенному організмі. У деяких варіантах здійснення геном-мішенню є "істотний ген".

Використовуваний в даному документі термін "істотний ген" відноситься до гену організму, який має суттєве значення для його виживання або репродукції. У деяких варіантах здійснення ген- мішень експресований в травному тракті комахи, наприклад, в вакуолярній АТФазі. У деяких

Зо варіантах здійснення ген-мішень залучений до росту, розвитку та репродукції комахи. Приклади таких генів включають, але без обмеження, ген СНОЗ і ген бета-тубуліну.

Фітопатогенний організм відноситься до багатоклітинних організмів, наприклад, до комах, грибів, тварин або до мікроорганізмів, які можуть викликати захворювання рослини, включаючи віруси, бактерії, гриби, а також ооміцети, хітридіоміцети, водорості та нематоди.

У даному документі посилання на "нематоду" відноситься до члену філуму класу Нематоди.

Члени сімейства Неїегодегідае є осілими паразитами, які формують складні зв'язки з організмом-господарем. Вони відбирають живильні речовини з клітин інфікованого організму за допомогою спеціального зонда. Цистові нематоди (родів Неїегодега і СіІобродега) і галові нематоди (роду Меїїододупе), зокрема, викликають значні економічні втрати в рослинах, особливо в сільськогосподарських рослинах. Приклади цистових нематод включають, серед інших, Н. амепає (злакова гетеродера), Н. діусіпе5 (бурякова гетеродера) і 5. раїїіда (картопляна гетеродера). Галові нематоди включають, наприклад, М. іамапіса, М. іпсодпіга і М. агепагіа. Ці патогени створюють "місця годування" в рослині, викликаючи морфологічну трансформацію клітин коренів в гігантські клітини. Звідси, нематодна "інвазія" або "інфекція" відноситься до інвазії і живлення тканинами рослини-господаря. Інші нематоди, які викликають значні пошкодження, включають виразкову нематоду, таку як Ргаїуіепспи5, конкретно Р. репеїгапв5, яка інфікує кукурудзу, рис та овочі, Р. Бгаспуиги5, яка інфікує ананас, і Р. (Шогпеї, яка інфікує, крім іншого, пшеницю.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу інгібування експресії гена-мішені в комасі-шкіднику, причому спосіб включає надання (наприклад, шляхом харчування) цій комасі- шкіднику рослини, вирощеної з насінини, обробленої екзогенною й5КМА, яка описана в даному документі, ти самим інгібуючи експресію гена-мішені в комасі-шкіднику. Комахи, які можуть викликати пошкодження і захворювання у рослин, відносяться до трьох категорій, відповідно до їх способу живлення: гризучі, сисні і трубчасто-сисні. Основні пошкодження наносять гризучі комахи, які поїдають тканину рослини, таку як листя, квітки, бутони і пагони. Приклади цієї першої великої категорії комах включають жуків і їх личинок, гусениць, що будують павутинні гнізда, мішочниць і личинок метеликів та пильщиків (гусениці). Для порівняння, сисні комахи поміщають їх ротові органи в тканини листя, пагонів, гілок, квіток або плодів і висмоктують соки рослини. Типові приклади сисних комах включають, але без обмеження, тлю, червців 60 борошнистих, трипсів і цикадок. На пошкодження, викликані цими шкідниками, часто вказує знебарвлення, пониклість, в'янення і загальна відсутність сили в ураженої рослини.

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу отримання стійкості до комахи-шкідника, причому спосіб включає вирощування рослини з насінини, обробленої екзогенною а5ЕМА, яка описана в даному документі. У деяких варіантах здійснення комаху-шкідника вибирають із рядів

СоІеорієга, Іерідоріега, Оірієга, Огіпорієга, Неїегоріега, Степорпаїїде5, Агасппідіає і

Нутепоріега. У деяких варіантах здійснення комахою-шкідником є жук або личинка. Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, фітопатогеном є представник сімейства Мосіцідає, наприклад, зродоргіега ІКогаїїв5.

Приклади важливих бактеріальних патогенів рослин включають, але без обмеження,

Вигкпоїдегіа, Ргоїеобасівгіа (Хапіпотопа:х 5рр. і Рзейдотопах 5рр., Рзеидотопаз зугіпдає ру.

Юта).

Деяка кількість родів вірусів передається, як постійно, так і не постійно, земляними, що мають зооспори найпростішими. Ці найпростіші самі не є фітопатогенами, а паразитами.

Передача вірусу відбувається, коли вони стають пов'язаними з корінням рослини. Приклади включають РоїЇутуха дгатіпі5, які доведено передають вірусні захворювання рослин зерновим культурам, і РоїЇутуха реїає, які передають буряковий вірус некротичних жовтих прожилок.

Плазмодіофориди також створюють рани в коренях рослин, через які можуть проникати інші віруси.

Специфічні приклади вірусів, які можуть бути мішенями відповідно до даного розкриття, включають, але без обмеження: (1) вірус мозаїки тютюну (ТММ, РНК-вірус), який інфікує рослини, особливо тютюн та інших членів сімейства 5оЇІапасеає. (2) вірус плямистого в'янення томата (Т5М/М, РНК-вірус), який викликає серйозні захворювання багатьох економічно важливих рослин, що представляють 35 сімейств рослин, включаючи дводольні та однодольні. Ця широка гама рослин-господарів, що включає декоративні, овочеві і польові культури, є унікальною серед рослин, інфікованих вірусами. Вірус відносится до тосповірусів в басейні Середземного моря, впливає на овочеві культури, особливо на томат, перець і салат (Тигіпа еї аї., 2 012, Адм Міги5 Кез 84; 403-437). (3) вірус жовтої кучерявості листя томату (ТМ! СМ), який передається білокрилкою,

Зо здебільшого впливає на рослини томата. Гемінівіруси (ДНК-віруси) з роду Ведотоміги5 (включаючи свіповіруси і легумовіруси) є найбільш спустошливими патогенами, що впливають на різні культивовані рослини, включаючи маніоку, батат, квасолю, томат, бавовну і зернові бобові культури (Кеу еї аїЇ. «2012, Мігизе5 4; 1753-1791). Члени сімейства включають ТУ СМ і вірус кучерявості листя томату (То! СМ). (4) вірус мозаїки огірка (СММ) має широку гаму рослин-господарів і атакує великий діапазон овочів, декоративних та інших рослин (всього 191 вид з 40 сімейств). Найбільш важливі овочі, на які впливає вірус мозаїки огірка, включають перці (Сарзісит аппишт /..), гарбузи, томати (Гусорегвісоп езсцепіит МІЇ|.) і банани (Миза І. врр.).

Інші овочі-господарі включають: огірок, мускусну диню, патисон, томат, шпинат, селеру, перці, крес-салат, буряк, батат, турнепс, чайот (мексканський огірок), корнішон, кавун, гарбуз, цитрон, гарбуз пляшковий, лімську квасолю, кінські боби, цибулю, фізаліс, баклажан, картоплю, ревінь, моркву, кріп, фенхель, пастернак, петрушку, люфу і артишок (Спаррошй апа Спегії, 1990,

ЕАО Ріапі Ргої. Виї!. 38: 52-53.).

Декоративні рослини-господарі включають: китайську астру, хризантему, дельфініум, шавлію, герань, гілію, гладіолус, геліотроп, гіацинт, шпорник, лілію, нагідки, в'юнок пурпурний, настурції, барвінок, петунію, флокси, ротики, тюльпан і цинію (Спирр апа Зпегї, 1960; Адгіов, 1978). (5) Вірус картоплі М (РМУ) - один з найбільш важливих вірусів рослин, що впливає на продуктивність томату. (6) Вірус мозаїки цвітної капусти (Саму, ДдНК-вірус (Коїппіє єї а!., 1994)). (7) Африканський вірус мозаїки маніоки (АСММ). (8) Вірус прихованої мозаїки сливи (РРМ) - найбільш руйнівне вірусне захворювання кісточкових плодів з роду Ргипив. (9) Вірус мозаїки багаття (ВММ) - зазвичай інфікує Вготив іпегтіх та інші трави, може знаходитись майже скрізь, де вирощують пшеницю. (10) Вірус картоплі Х (РУХ) - для цього вірусу векторів комах або грибів не існує. Цей вірус викликає м'які симптоми або не викликає симптомів у більшості різновидів картоплі, але якщо присутній вірус картоплі У, синергія між цими двома вірусами викликає серйозні симптоми у картоплі. бо Додаткові віруси:

Вірус трістези цитрусових (СТМ) - викликає найбільш економічно руйнівне захворювання цитрусових, включаючи гіркий апельсин (Сіїги5 аигапійшт) і будь-який вид цитрусових, щеплений на коріння гіркого апельсина, солодкий апельсин (С. 5іпепві5), грейпфрут (С. рагадіві), лайм, севільський апельсин (С. ацйгапійоїйа) і мандарин (С. гейсціага). Також відомо, що вірус СТМ інфикує Аедіорзі5 спемаїїегі, Аїгаєдіє рапісціага, Ратригив тіззіопіз і Раззпйога дгасії5. Вірус СТУ поширений у всьому світі і може бути виявлений в будь-якому місці зростання цитрусових дерев.

Вірус жовтої карликовості ячменю (ВОМ) - найбільш широко розповсюджене вірусне захворювання зернових культур. Він впливає на економічно важливі види сільськогосподарських культур, такі як ячмінь, овес, пшениця, кукурудза, тритикале і рис.

Вірус скручування листя картоплі (РКМ) - інфікує картоплю та інших членів сімейства

ЗоЇапасеав.

Вірус рунистої карликовості томату (ТВ5М), РНК-вірус, член роду Тотривміги5, найбільш сильно впливає на томати і баклажани.

Додаткові матеріали:

Натійогп вї а!., 1981, У Сеп Мігої 54; 223-241 - згадує віруси ТММ, РУХ, РУХУ, СМУ, Самм.

Додаткові наукові статті:

Маккоик еї аї!., 2012, Адм Міги5 Нез 84; 367-402 - Віруси, що впливають на горох і квасолю з вузьким (некротична жовтяниця бобів (ЕВМУМ)) ії широким (вірус мозаїки люцерни (АММ) і СММ) діапазоном господарів.

Комахи-шкідники, що викликають захворювання рослин, включають, окрім інших, представників сімейств, наприклад, Арідає, Сигсцопідає, Ззсагаравїідає, Терпгійдаеє, Тогігісідає.

Ген-мішень фітопатогенного організму кодує продукт, істотний для життєздатності та/або інвазивної здатності патогена, тому зниження його активності (голою ахзКМА) призводить до зниженої здатності патогена виживати і інфікувати клітини-господарі. Отже, таке зниження активності призводить до "негативного впливу" на підтримку життєздатності та/або інвазивної здатності фітопатогена, тобто, запобігає або знижує здатність патогена отримувати з клітин- господарів поживні речовини і виживати на них. Через таке зниження життєздатності та/або інвазивної здатності фітопатогена забезпечується стійкість та/"або підвищена толерантність

Зо клітин рослини до інфекції, спричиненої патогеном. Гени патогена можуть бути націлені на зрілі (дорослі), незрілі (молоді) або зародкові стадії.

Приклади генів, істотних для життєздатності і/або інвазивної здатності патогена, представлені в даному документі. Такі гени можуть включати гени, що беруть участь у розвитку та репродукції, наприклад, факторів транскрипції (див., наприклад, Хие еї аї., 1993; Ріппеу еї аї., 1988), регуляторів клітинного циклу, таких як білки мее-1 і псос-1 (див., наприклад, Уміхоп еї аї., 1999; Вохет еї аї., 1999) і мутанти, летальні для зародків (див., наприклад, Зсппабеї еї аї., 1991); білки, необхідні для моделювання, такі як колаген, СИКЗ і І КР-1 (див., наприклад Моспет еї аї., 1999; Ковігоиспома еї аї., 1998; Кау еї аї., 1989); гени, що кодують білки, які беруть участь у рухливості/нервовій системі, наприклад, ацетилхолінестерази (див., наприклад Ріоїее еї аї., 1999; Таїеєза єї аї., 1995; Аградаиз сеї аї!., 1998), рецептор ріанодину, такий як ипсо-68 (див., наприклад Магуоп еї аї., 1998; Магуоп еї аї., 1996), і глутамат-керовані хлоридні канали або рецептор авермектини (див., наприклад, СшШу еї аї., 1994; Маззйайів5 еї аІ. , 1997; ЮОепі еї аї., 1997); гідролітичні ферменти, необхідні для отримання поживних речовин з господаря, наприклад, сироваткові протеїнази, такі як НОБР-1 і НОБР-П (див., наприклад, І Шеу еї аї., 1997); гени-паразити, що кодують білки, необхідні для інвазії і створення сайту харчування, наприклад, целюлази (див., наприклад, де Воег еї аїЇ., 1999; Ков550 еї аї., 1999), ії гени, що кодують білки, які направляють продукцію секретів стовпчиків або амфід, такі як білок 5ес-1 (див., наприклад, Кау еї аї., 1994; Оіпу еї аї., 1998); гени, що кодують білки, необхідні для визначення статі, наприклад, іга-1, їга-2 і еді-1, супресор сеа9 (див., наприклад, НоаакКіп, 1980;

Ноадкіп, 1977; Ноадкіп, 1999; Сутіеппу еї аї., 1999; 7агКоуег еї аї., 1992); і гени, що кодують білки, необхідні для підтримки нормальної функції метаболізму і гомеостазу, наприклад, метаболізму стеролу, мутанти, летальні для зародків (див., наприклад, Зсппарбеї еї аї., 1991), і транс-сплайсовані лідерні послідовності (див., наприклад, ЕРегдизоп еї аї, 1996), ров5-1, цитоплазматичний білок "цинковий палець"; ріве-1, цитоплазматичний білок "цинковий палець"; тві-1, АТФаза; ай-1, білок транспорту мітохондріальної енергії; гра-2, фактор асемблування хроматину; 5Кп-1, фактор транскрипції; рік-1, кіназа; дрр-1, субодиниця В О-білка; раг-1, кіназа;

Бік-1, інгібітор апоптозу; тех-3, РНК-зв'язуючий білок, ипо-37, субодиниця В с-білка; ПІй-2, фактор транскрипції; раг-2, дпс-1, дінактин; раг-б, Япс-1, важкий ланцюг динеїна; і ра!1-1, гомеобокс. Такі гени були клоновані з нематод-паразитів, таких як види Меїїододупе і 60 Неїегодега, або можуть бути ідентифіковані фахівцем у даній області, що використовують інформацію з послідовності з клонованих ортологів С. еієедап5 (геном С. еїЇедап5 був секвенований і є доступним, див. Пе С. еіїеєдап5 зедпепсіпд Сопзопішт (1998)).

Кілька варіантів здійснення відносяться до способу надання рослині стійкості до патогену, причому спосіб включає контакт насінини з молекулою екзогенної й5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотідів гена фітопатогенного організму, і вирощування рослини з насінини.

Використовувана в даному документі характеристика "стійкість до патогену" є характеристикою рослини, яка викликає стійкість рослини-господаря до атаки патогена, який зазвичай здатний нанести пошкодження рослині. Без прив'язки до якоїсь конкретної теорії, якщо фітопатоген отримує матеріал рослини, вирощеної з насінини, що включає голу а5КМА, експресія гена на патогені-мішені пригнічується, і пригнічення експресії гена на патогені-мішені призводить до стійкості рослини до цього патогену.

У варіантах здійснення, описаних у даному документі, ген-мішень може кодувати істотний білок або транскрибувати некодуючу РНК, теоретичну функцію якої вибирають з групи, що складається, крім іншого, з регуляції і транспорту іонів, синтезу ферментів, підтримання потенціалу клітинних мембран, біосинтезу амінокислот, деградації амінокислот, розвитку та диференціації, інфікування, проникнення, розвитку апресоріїв або гаусторій, росту міцелію, синтезу меланінів, синтезу токсинів, синтезу сідерофорів, споруляції, синтезу плодоносних органів, ділення клітин, метаболізму енергії, дихання і апоптозу.

Відповідно до одного специфічного варіанту здійснення, фітопатогенний організм вибирають з групи, що складається з гриба, нематоди, вірусу, бактерії і комахи.

Для обгрунтування активності проти шкідників даний документ також передбачає спостереження смерті або інгібування росту і ступінь симптоматології господаря після згаданого надання.

Для підвищення протифітопатогенної активності варіанти здійснення даного винаходу крім того пропонують композицію, яка містить два або більше різних агентів, кожний з яких токсичний для того ж патогенного для рослини мікроорганізму, і щонайменше один з яких включає а5КМА, описану в даному документі. У певних варіантах здійснення другим агентом може бути агент, що вибрається з групи, яка складається з інгібіторів метаболічних ферментів, що у синтезі амінокислот або вуглеводів, інгібіторів поділу клітин, інгібіторів синтезу клітинних стінок, інгібіторів синтезу ДНК або РНК, інгібіторів гірази, інгібіторів асемблування тубуліну, інгібіторів синтезу АТФ, розділяючих агентів окисного фосфорилювання, інгібіторів синтезу білків, інгібіторів МАП-кінази (мітоген-активована протеїінкіназа, далі МАП-кіназа або МАРК), інгібіторів синтезу або окислення ліпідів, інгібіторів синтезу стеролів та інгібіторів синтезу меланінів.

У деяких варіантах здійснення насінина, що включає екзогенну а5КМА, яка описана в даному документі, обробляють неполінуклеотидним пестицидом. Вважається, що поєднання рослини, яка проявляє біологічну активність проти шкідника-мішені в результаті обробки насінини, з якої вирощено рослину, з екзогенної О5КМА разом з обробкою насінини певними хімічними або білковими пестицидами дає несподівані синергічні переваги в насінні, що пройшли таку обробку, включаючи несподівано високу ефективність захисту від пошкодження шкідником-мішенню отриманої рослини. Вважається, що насіння в представлених варіантах здійснення мають властивість знижувати вартість використання пестицида, оскільки для отримання необхідного обсягу захисту потрібно менше пестициду ніж у випадку, коли ці новаторські композиція і спосіб не використовуються. Більше того, оскільки використовується менше пестициду, можна вважати, що запропонований спосіб буде безпечнішим для оператора і навколишнього середовища і потенційно менш дорожчим ніж відомі способи.

Якщо сказано, що деякі ефекти є "синергічними", це означає, що синергічні впливи цього поєднання на пестицидну активність (або ефективність), включають біологічну активність рослини, вирощеної з насінини, обробленої а5ЕМА, і пестициду. Однак мається на увазі, що такі синергічні впливи не обмежені пестицидного активністю, але також включають такі несподівані переваги як підвищений об'єм активності, вигідніший профіль активності за типом і величиною зменшення пошкоджень, зниження вартості пестициду і застосування, зниження розповсюдження пестициду в навколишньому середовищі, зниження впливу пестициду на персонал, зайнятий виробництвом, обробкою і посадкою насіння, і інші переваги, відомі фахівцям у даній галузі техніки.

Крім цього, рослини, отримані відповідно до опису представлених варіантів здійснення, або їх частини можуть мати змінену живильну або терапевтичну ефективність і, як такі, можуть застосовуватися в харчовій та фармацевтичній промисловості. Крім того, рослини, отримані відповідно до опису представлених варіантів здійснення, або їх частини можуть мати змінений 60 вміст олії або целюлози і, як такі, можуть бути застосовані в будівництві або виробництві олії.

Насіння даного винаходу можуть бути упаковані в пристрій для вміщення насінини, що включає деяку кількість такого насіння, щонайменше деякі з яких (наприклад, 595, 1095 або більше) містять екзогенну голу й5КМА, причому ця насінина позбавлена гетерологічного промотора для стимуляції експресії азКМА.

Пристроєм для вміщення насінини, може бути мішок, пластиковий мішок, паперовий мішок, контейнер з м'якою оболонкою або контейнер з твердою оболонкою.

Кілька варіантів здійснення, описаних у даному документі, відносяться до розчину для обробки насіння, що включає молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5КМА, що включає послідовність, яка по суті комплементарна або по суті ідентично щонайменше на 18 суміжних нуклеотидів гена-мішені. У деяких варіантах здійснення цей розчин може крім того включати буфер, наприклад, ЕДТА. Використовуваний в цьому документі термін "розчин" відноситься до однорідних сумішей і неоднорідних сумішей, таким як суспензії, колоїди, міцели та емульсії. У деяких варіантах здійснення розчин може бути представлений в наборі. У деяких варіантах здійснення набір може крім того включати одну або кілька насінин, контейнери, праймінговий розчин і середовище для росту насінини.

Реагенти даного винаходу можуть бути упаковані як набір, що включає молекулу нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, інструкції з введення цієї молекули нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, а5ЕМА, в насіння і, за вибором, праймінговий розчин.

Композиції з деяких варіантів здійснення винаходу за бажанням можуть бути представлені в упаковці або роздавальному пристрої, який може містити одну або декілька доз, що містять активний інгредієнт. Упаковка може включати, наприклад, металеву або пластикову фольгу, тобто, мати форму блістера. Упаковка або роздавальний пристрій може супроводжуватися інструкцією з введення в насінину.

Відповідно до одного варіанту здійснення, молекула нетранскрибованого полінуклеотидного тригера, наприклад, азЕмМА, і праймінговий розчин розміщені в різних контейнерах.

Використовуваний в даному документі термін "приблизно" відноситься до х 1095.

Терміни "включає", "який включає", "включають", "який має" і їх однокорінні слова означають "включаючи, але без обмеження".

Термін "який складається з" означає "який включає і обмежений чимось".

Термін "складається по суті з" означає, що композиція, спосіб або структура можуть включати додаткові інгредієнти, етапи та/або частини, але тільки якщо такі додаткові інгредієнти, етапи та/або частини не суттєво змінюють базові та нові характеристики заявлених композиції, способу або структури .

Використовувана в даному документі форма однини включає посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше. Наприклад, термін "з'єднання" або "цонайменше одне з'єднання" може включати деяку кількість сполук, включаючи їх суміші.

У тексті даної заявки різні варіанти здійснення даного винаходу можуть бути представлені у форматі діапазону. Слід розуміти, що опис у форматі діапазону наведено просто для зручності і стислості і не повинно тлумачитися як негнучке обмеження об'єму винаходу. Відповідно, вказування діапазону повинно розглядатися як таке, що специфічно розкриває всі можливі піддіапазони, а також окремі числові значення в цьому діапазоні. Наприклад, вказування діапазону, такого як від 1 до 6, повинне розглядатися як таке, що специфічно розкриває такі піддіапазони, як від 1 до 3, від 1 до 4, від !ї до 5,від2 до 4, від2 доб, від Здо б і т.д., а також окремі числа в цьому діапазоні, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 і 6. Це застосовується незалежно від ширини діапазону.

Якщо в даному документі вказано числовий діапазон, це означає, що він включає будь-яке число (дробове або ціле) в зазначеному діапазоні. Фрази "в діапазоні між" першим вказаним числом і другим вказаним числом і "від" першого вказаного числа "до" другого вказаного числа використовуються в даному документі як такі, що взаємозаміняються, і включають перше і друге вказані числа і всі дробові і цілі числа між ними.

Використовуваний в даному документі термін "спосіб" відноситься до образу дій, засобів, прийомів і порядку виконання деякої задачі, включаючи, але без обмеження, той спосіб дій, засоби, прийоми і порядок, які або відомі, або можуть бути легко розроблені на основі образу дії, засобів, прийомів і порядку, відомих практикуючим фахівцям в областях агрономії, хімії, фармакології, біології, біохімії та медицини.

Слід розуміти, що певні ознаки винаходу, які для ясності описані в контексті окремих варіантів здійснення, також можуть бути об'єднані в один варіант здійснення. | навпаки, різні ознаки винаходу, які для стислості описані в контексті одного варіанта здійснення, також можуть 60 бути представлені окремо, або в будь-якому придатному поєднанні, або придатними для будь-

якого іншого описаного варіанта здійснення винаходу. Певні ознаки, описані в контексті різних варіантів здійснення, не повинні вважатися істотними ознаками цих варіантів здійснення, якщо тільки варіант здіснення не може бути здійснений без цих елементів.

Різні варіанти здійснення і аспекти даного винаходу, які описані вище та заявлені у розділі

Claims

"Формула винаходу" нижче, знаходять експериментальну підтримку в подальших Прикладах. Ці Приклади представлені для цілей ілюстрації і не повинні тлумачитися як обмеження. Приклади Тепер перейдемо до прикладів, які разом з вищенаведеним описом ілюструють винахід, не обмежуючи його. Говорячи загалом, номенклатура, використана в даному документі, та лабораторні процедури, застосовані в даному винаході включають молекулярні, біохімічні, мікробіологічний і рекомбінантні способи роботи з ДНК. Такі способи широко представлені в літературі. Дивіться, наприклад, "МоїІесшаг СіІопіпд: А Іабогаїогу Мапиа!" Затьгоок еї аї., (1989); "Сигтепі Ргоїосої!5 іп Моїесшіаг Віоіоду" Моїштев І-Ш А!йзибеї, ВМ, ей. (1994); А!йзибреї єї аї., "Ситепі Ргоюсоїв5 іп Моїесшіаг Віоіоду", Чхопп УМієу апа 5оп5, Вайітоге, Магуїапа (1989); Регбаї, "А Ргасіїса! Сціде ю Моїесшіаг Сіопіпд", дойп УМпеу бе опе, Мем Моїк (1988); Маїзоп еї а!., "Несотбріпапі ОМА", Зсіепіййс Атегісап ВоокК5, Мем/ МоїКк; Вітеп еї аї. (єдв) "депоте Апаїувзів: А І арогаюгу Мапиаї Зегієв", Моів. 1-4, Соїй бргіпд Нагрог ІГарогайїогу Ргеб55, Мем/ мок (1998); способи, описані в патентах США 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 і 5,272,057; "СеїІ Віоіоду: А І арогаїгу Напароок", Моїштев І-Ш Сеїїв, УЕ, еєд. (1994); "Суйигте ої Апіта! Сеїїє - А Мапиаї ої Вавіс Тесппідое" ру Егезппеу, УМіеу-Гівв, ММ (1994), Тпіка Едйіоп; "Сцтепі Ргоїосоїів іп Іттипоіоду" Моїштевз І-І Соїїдап УЕ, єд. (1994); 5ійез єї аї!. (едв), "Вазіс апа Сіїпіса! Іттипоіоду" (8ВІй Еайіоп), Аррієїюп а ІГапде, МогмаїкК, СТ (1994); МізНеїЇ апа з5нпіїді (едв), "Зеіесівд Меїподз іп Сеїїшаг Іпптипоіоду", МУН Егеетап апа Со., Мем МогК (1980); доступні імуноаналізи широко описані в патентній і науковій літературі, див., наприклад, патенти США 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 ї 5,281,521; "ОіІїдописіеоїіде Зупіпебів" Сай, М. У., єа. (1984); "Мисівїс Асіа Нубгіаігайоп" Натез, ВО, апа Ніддіпео 5, єдв. (1985); "Тгапвстіріїоп апа Тгапвіайоп" Натезх, ВО, апа Ніддіпв 5, едв5. (1984); "Апіта! Се! Сийиге" Егтезппеу, В. І., єй. (1986); Зо "Ітторбіїї:еа Сей апа Епгутевз" ІВІ. Ргез5, (1986); "А Ргасіїса! Сціде ю МоіІесшіаг СіІопіпд" Регбраї,

В., (1984) і "Меїйоа5 іп ЕплутоІоду" Мої. 1-317, Асадетіс Ргев5; "РОСА Ргоїосоів: А Сшціде То Меїнодз Апа Арріїсайопв", Асадетіс Рге55, Зап Оієдо, СА (1990); Магзнак еї аї., "Зігагедієв ог Ргоївїп Ринітісайоп апа СНагасієгігайоп - А І абогагу Соцгзе Мапиа!" СЗНІ. Ргез5 (1996); які всі включені шляхом посилання, так якби вони були повністю викладені в даному документі. Інші загальні посилання представлені в тексті даного документа. Описані в них процедури вважаються добре відомими в даній галузі техніки і представлені для зручності читача. Вся інформація, яка міститься в них, включена в даний документ шляхом посилання. Приклад 1: Протоколи для продукції а5КМА і обробки насінини Отримання послідовностей а5КМА/5ікМА. О5АМА-послідовності були створені за параметрами, заданими для кожного гена, з використанням іп міго транскрипції ПЛР-продуктів. Частину мРНК, що включає відкриту рамку зчитування, 3'-нетрансльовану ділянку або 5'-ч-етрансльовану ділянку, для якої має бути продукувана а5КМА, піддали ПЛР-ампліфікації з використанням ген-специфічних праймерів, які містять послідовність промотора 17 на будь-якій стороні. Цей продукт використовували в якості матриці для продукції О5ЕМА із застосуванням комерційних наборів, таких як набір Махізсгірі а5зКМА (компанія І їе ТесппоЇодіе5) або набір Т7 Нідп мівіїдй КМА Зупіпезі5 (компанія МЕВ). Далі пробу обробили ДНК-ази Турбо при 37 "С протягом 15 - 30 хв., після чого обробили фенолом і здійснили осадження нуклеїнової кислоти. Далі, провели одну з двох різних реакцій: (1) азеАМА готова до використання, або (2) процесинг а5ЕЕМА ферментом Оісег (рибонуклеази ПІ (скорочення Рнази ІІЇ) (компанія МЕВ)), щоб створити малі інтерферуючі РНК (5ікМА). Для обробки насінини, яка описана нижче, використовували або а5ЕМА, або комбінацію азеМА і зікМА. Загальний протокол обробки насінини для сайленсінгу генів з використанням суміші а5зАМА/5ійМА. Насіння органічної кукурудзи різновиду "попкорн" без оболонки, цільні насіння органічного рису без оболонки, насіння органічної сої та пшениці були куплені у компанії Мізаї Надимаємап (Ізраїль). Насіння свіжих томатів були взяті з плодів томата М82, які вирощені в теплиці. Насіння рослин без оболонки або свіжі промили двічі дистильованою водою (далі ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин. Потім насіння сушили при 30 "С протягом 10 - 16 годин. Після етапу бо сушіння насіння обробили розчином, що містить композицію а5КМА, виготовлену з 45ЕМА в кінцевій концентрації 40 - 150 мкг/мл в 0,1 мМ ЕДТА.

Обробку виконали шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 24 годин в темній камері для росту при 15 "С.

На кінець насіння двічі швидко промили і висадили в грунт або сушили протягом 0 - 30 годин і пророщували при 25 "С в темній камері для росту і висадили в грунт або саджали прямо в грунт.

Контрольне насіння обробили таким же чином композицією без азЕМА або з неспецифічною а5ЕКМА.

Приклад 2: стабільність ОБЕМА в розсаді рису, томату і сорго

В якості прикладу екзогенного гена, який не присутній/експресований в рослинах, відкриті рамки зчитування, що кодують репліказу і оболончатий білок СОМММУ (ідентифікаційний номер

АБЕ417242), були використані в якості мішеней для обробки насіння рослин за допомогою а5ХеЕМА відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1. Насіння рису, томату й сорго промивали протягом 4 годин при 20 "С, насіння томата і сорго сушили при 30 "С, і насіння рису сушили при 20 С протягом ночі.

Насіння негайно обробили при 15 "С розчином з 132,7 мкг/мл а5еЕМА (кінцева концентрація) протягом 39 годин для рису, 93,8 мкг/мл а5КМА (кінцева концентрація)

протягом 48 годин для томату і 75 мкг/мл а5КМА (кінцева концентрація) протягом 40 годин для сорго.

Кажучи коротко, отримані з вірусу відкриті рамки зчитування ампліфікували шляхом ПЛР зі специфічними прямими та зворотними праймерами, які містили послідовність Т7 (5'- ТААТАСО,АСТОСАСТАТАСІИ-3, ЗЕО ІЮ МО: 1) на їх 5"-кінці (див.

Таблицю 1, нижче). Продукти

ПЛР очистили від агарозного гелю і, оскільки вони мають промотори Т7 на обох кінцях, використовували їх в якості темплетів для Т7-залежної транскрипції іп міго, що дало азКкМА- продукт генів СОММУМ.

ПЛР на гені домашнього господарства, тубуліну, використовували в якості позитивного контролю (прямий праймер 5-СсС:ТИ!СтТОТаААСатацАТИ-З' (5ЕО ІЮ МО: 2), і зворотний праймер 5-САТСАТСИССАТОСТСАТТСТО-3 (5ЕО ІЮ МО: 3)).

О5ЕМА, гомологічна для вірусу мозаїки зеленої плямистості стабільна в розсаді рису.

Насіння рису обробили при 15 "С розчином з 132,7 мкг/мл азКМА (кінцева концентрація) протягом 39 годин, і виконали детекцію 85КМА.

Через один тиждень після проростання Д5КЕМА можна було детектувати в 9 з 10 саджанців.

Детекцію кКДНК тубуліну використовували як позитивного контролю якості КДНК.

Через два тижні після проростання а5КМА детектували в 10

Зо 3 10 саджанців.

Через три тижні після проростання азКМА, гомологічну для вірусу мозаїки зеленої плямистості детектували в 5 з 5 проб з саджанців рису.

Таблиця 1 ПЛР-праймери, використані в якості темплетів для транскрипції іп міїго і детекції ОБКМА-продуктів СОМММУ і СОМММУ.

Назва Назва Прямий Зворотний . Послідовність/5ЕО ІЮ МО продукту: праймер/5ЗЕ | праймер/5ЕО ІЮ вірусу продукту Ор Мо: МО:

ТААТАСОАСТоАСТАТАССХОССТАдОаСа | ТААТАСИА Набір 1: С,ССАТТСТАДАССТОСАААТСССОЬСАаатТасі СТСАСТАТ ТААТ АСС АСТСА АСсСТоТаСТТСсТаААлсаАатТоСАсттотТа,ат | АдасасатА СТАТАССССАДС ТСТТТТаААСАТОСаСТТАСААТСССИАТСА | ДАаСОаасСАТ АСССТОСАААСТ САССТАВСАААСТТАТТИССИТТТАаТтаст | ТСТАААСС/ ААСС/(ЗЕО І ТСТТАТОТТОССатсСАССАСТТТАСТТААТІ (ЗЕО ІЮ МО) ТТСсТАаТТастТсСАСААааТтАССасттт | МО:5 І

1) СОМММ СсСАпАСТСАдаСа,аааААаАСвАТТСТТТО

(Ідентифі- СОоМУМ сесслатосстатотасаттТАсостсат каційний д5ВМА СстТатоатАСАТАТТААТТСТАСАТТСССА номер продукт 1 сАТасааспП т ТАСастТосСтТСААСась

МеВІ РодУукт 7 ТОСТОТатТТОАСОСстАТСТТОСТТТСОС | СТТСТТАТ набір 2:

АЕ417242) ТТСТСАССТССАСОСАТАСОССТААТАС | сТТоСССТт АСТО АССАСТСС саТсАТТаАдааТтТатАвАТССТАССААТСЇІ САС ТАССАТТО/(5ЕО СстТАСОАСсТаСсТалаТСастТААСассат |(5ЕО ОО Ю МО:в) ААдасатАСТаАтТадСсасатстАСаасс | МО:7) І аСстАдсаастаАпАтТАСАТААТТТААТАСВА аТстТАТ ТСТАДаааТтттТаАТатТтТАСа АТтТАааасСтТТСАТТТаАдАла,аСсСсасаттттоа стаатотастодадаасСстТАССАССТСаА

Таблиця 1 ПЛР-праймери, використані в якості темплетів для транскрипції іп міїго і детекції ОБКМА-продуктів СОМММУ і СОМММУ.

Назва Назва | | Прямий Зворотний . Послідовність/5ЕО ІЮ МО продукту: праймер/5ЗЕ | праймер/5ЕО ІЮ вірусу продукту Ор Мо: МО: 1 ее атадатСатАТТА/Л5ЗЕО ІО МО:8 ТААТАСИАСТОСАСТАТАСЯИССТТТАССа ССАСТААДВААСТСОТаТАСАСТОССТТОаСа саотаатотадсаастСсТТаААТТОаСААТА ТАТОАТаАТтТаСААОаСТтасссСстТАСаасСтТСА сСстаттТАТаАСАТСССОСОсСаТТААСТАТАС всСАССАСТТИТТСААдАсСатАСпАТСАТАТОИа тасСАТТаСТасСААТОСОСЯТтасСсСтТАСАТСТТ АААСАТОаттТасСспАаапААТатаАТаТтАСАА ТААТАССА СсаАТАТИАТСАСаСААСАТатАСАС,АСО СТСАСТАТ Набір 3: СОоМУМ САСААДССЯСАТСТОССОЯОСИТасАСАССТо АСССОССТТ ТААТАСОАСТСА д5ВМА ТТоСААСТТТОСАСАТАСАТаСАТТСАСОИ ТАСССССА СТАТАССССАТС продукт 2 АдатАСаАТАСТЬТОТОССТОТОССОСаИатсСА СТААСААС АССАТСЯАСССТ СсСстТатТСАпАСаТтТоСААсАа Тато Л8ЕО 0 ААДАС /5ЕО 10 тТАТОАТтпасаАХдатаатТАсаацАТААТСА МО-10) МО:9) таслдатстоатТасСсАТТСААТСТАССАТА І тТоСсСсТТАТТСТттСсаАТССОАССТаСТОСТТ САТАСОСАААААТатТассасАатттаТтТАТас дассСстТтсАТТСоТоСаАсаСасСАТТаТсттт тАасттсасстТатАаатТААТТТАААТАСТ АТттТасасастоАдаттАааатоаАТаата АТаСССТАТАаТОаАаТСаИТтАТТАЛЗЕО І МО:11 Насіння томату обробили при 15 "С, використавши 93, мкг/мл аб5зКМА (кінцева концентрація) протягом 48 годин, і насіння сорго обробили при 5 мкг/мл а5еЕМА (кінцева концентрація) протягом 40 годин.

ОБКМА СОММУМ детектували за допомогою ЗТ-ПЛР у 5 з 13 саджанців томату, перевірених через 10 діб після проростання і в З з чотирьох саджанців сорго через 4 тижні після проростання.

Було встановлено, що екзогенна 45ЕМА стабільна щонайменше протягом трьох тижнів у саджанцях рису і щонайменше 10 діб у саджанцях томату і чотирьох тижнів в рослинах сорго.

ПРИКЛАД 3: О5ЕМА НЕ ІНТЕГРУЄТЬСЯ В ГЕНОМ РИСУ Насіння рису обробили екзогенною Я5КМА як у Прикладі 2. Проростали рослини і вирощували їх протягом п'яти тижнів, ДНК екстрагували і виконали реакції ПЛР, щоб продемонструвати, що а5ЕМА не інтегрується в геном рису.

Використовували два набори праймерів, які дали позитивну реакцію при перевірці на рівні РНК.

Набір 1 (див.

Таблицю 2) праймерів містив праймери, що використовуються для ампліфікації темплету (всієї послідовності а5КМА). Набір 2 (див.

Таблицю 3) містив праймери, які використовували у вищезазначених реакціях ПЛР.

Ендогенний ген домашнього господарства рису (тубулін) використовували в якості позитивного контролю при реакції ПЛР (див.

Таблицю 2). Три різних реакції ПЛР з ДНК виконали на рослинах, оброблених і не оброблених а5КМА.

Ампліфікованої ДНК, відповідної СОММУ, в будь-якій обробленій або не обробленій рослині не детектували.

Таблиця 2 Праймери тубуліну, використані для ПЛР-ампліфікації. праймера праймера

Приклад 4: Молекули екзогенної й5КМА мають високу стабільність в розчині і не інкорпоруються у геном оброблених рослин Насіння кукурудзи обробили за протоколом, описаного в Прикладі 1. Насіння промивали протягом 4 годин при 20 "С, сушили при 30 "С протягом ночі і негайно обробили 40 мкг/мл а5КМА (кінцева концентрація), направленої проти репортерного гена рД-глюкоронідази (505) протягом 60 годин при 15 "С, висушили і проростили. Листя і коріння взяли у контрольних і оброблених д5505 рослин через 7 і 15 діб після проростання. РНК екстрагували із зібраних тканин і виконали ЗТ-ПЛР зі специфічними праймерами 5И5 (Таблиця 3). Додатково, ендогенний ген домашнього господарства кукурудзи (убіквітин) використовували в якості позитивного контролю при реакції ПЛР. Було встановлено, що молекули Й5КМА 5И5 є виключно стабільними в обробленому насінні і можуть бути детектовані в рослинах кукурудзи через 7 і 15 діб після проростання насіння. О5АЕМА БИ може бути детектована в саджанцях кукурудзи шляхом ЗТ-ПЛР через 7 і 15 діб після проростання відповідно до одного аспекту даного розкриття. Через один тиждень а5зеКМА СИ детектували в пагонах дев'яти з одинадцяти перевірених саджанців кукурудзи. ОБЕМА Ии5 не детектували у необроблених рослинах. Через 1 тиждень після проростання 45ЕМА 505 детектовані в п'яти з п'яти коренів оброблених саджанців кукурудзи через 1 тиждень після проростання. Через 15 діб після проростання О5КМА ИЗ були детектовані в коренях саджанців кукурудзи. Молекули Д5КМА 505 не інкорпоруються в геном оброблених рослин кукурудзи через один тиждень після проростання, що було визначено електрофорезом на агарозному гелі при реакціях ПЛР на послідовності (305. Таблиця З Праймери для ПЛР-ампліфікації генів 55 і убіквітину і продукту О5КМА И5.

- . . й , Довжина вялттє ПЕ свои тт ХЗЕО І МО:15 ВТК ііі ШОЕ ТУ Вем : 43 ЗЕО ІЮ МО:16 ТААТАСОАСТоАСТАТАСССАСАТОСАССОСЯОСТОаТасасСАТТСАС тотавпАтТСаСаААААСстТатасААтТТаАтоАа,асатаатапапАААс сасаТТАСААаАААлдасСсасастАта7астатасСАцасСАатТТТАА СвАТСАСТТоаССаАТасСсАСАТАТТССТААТТАТОаСОССОСИаСААСИТ д58МА СуЄ стаатТАТСсАаСасаААдатСсТТтТАТАССОАААаасаИтасасАаассСА продукт ссатадтсатастасатттОсАтТтасааТСАСТСАТТАСОасСАААИТ ставаТСААТААТСАсИаААдатаАтапАасСАтоА,сааоцпасСтТАТАС ВССАТТТаАдАдаССаАдтТаТатоАСасСсатАтТатТАттассцвацААААс татАСатАТСАСССЯТТТататаААСААСаААСТаААСТассСАСАСТ АТоОССОЯОСсСсвОааААТаСТтОо ССТАТАатадатСсатАТТАДЗЕОІЮ МО:21 Приклад 5: мікроскопія флуоресценції послідовності 5ікМА в насінні різних рослин Насіння рослин відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1. Насіння промивали протягом 4 годин при 20 "С, сушили при 25 "С і негайно обробили флуоресцентною 5івМА (5іБГ 0, кінцева концентрація 2 мкМ, компанія Тпегто зсіепійіс) при 15 "С протягом 24 годин. Зо Якість 5ібі О перед застосованням до насінини рослини перевірили аналізом електрофорезом на гелі. Детектували смуги, відповідні очікуваному розміру 20 - 24 пари основ молекул флуоресцентної 5ікМА. Зображення флуоресценції насіння отримали через 24 - 48 годин після обробки,

використавши мікроскоп ОЇутри5 з найменшим збільшенням об'єктива (5Х для більш великого насіння, такого як насіння рису і томата, і 10Х для більш дрібного насіння, такого як насіння Агарідорзі5). Для того, щоб усунути можливість неспецифічної автофлуоресценції, насіння, оброблені а5ЕМА, порівняли з контрольним необробленим насінням.

Проникнення молекул флуоресцентної 5ікМА в насіння рослин спостерігали через 24 години після обробки насінини Агарідорзів, рису та томату 5ікМА в кінцевій концентрації 2 мкМ.

Проникнення молекул флуоресцентної 5ікМА в насіння рису спостерігалось через 24 години після обробки а5ЕМА 5101 0.

Для того, щоб оцінити ефективність розподілу флуоресцентної 5ікМА всередині насіння,

зробили зрізи насіння різних рослин і отримали їх зображення за допомогою флуоресцентного мікроскопа через 48 годин після обробки.

Зображення кожної обробленої насінини виконували поруч із контрольною необробленою насіниною.

Світлові і флуоресцентні зображення отримували для проб насіння рису, томату, огірка, квасолі, сорго і пшениці.

Проникнення молекул флуоресцентної 5ікМА в насіння рису спостерігалось через 48 годин після обробки а5ЕМА 5101 0. Зробили зрізи обробленого 5і01 0 і контрольного насіння рису, щоб розглянути внутрішній розподіл флуоресцентної 4О5КМА на флуоресцентному мікроскопі, і в обробленій насінині детектували молекули флуоресцентної 5вікМА.

РНК флуоресцентної 5ісі 0 детектували в ендоспермі і зародку.

Проникнення молекул флуоресцентної 5бікМА в насіння томату спостерігалося через 48 годин після обробки а5ЕКМА 5ісі 0. Зробили зрізи обробленого 5і0І О і контрольного насіння томату, щоб розглянути внутрішній розподіл флуоресцентної Д5ЕМА на флуоресцентному мікроскопі.

РНК флуоресцентної 5і0І О була детектована в ендоспермі і зародку.

Проникнення молекул флуоресцентної 5ікМА в насіння огірка спостерігалося через 48 годин після обробки а5КМА 5ісі 0. Зробили зрізи обробленого 5іб1і 0 і контрольного насіння огірка,

щоб розглянути внутрішній розподіл флуоресцентної ОБКМА на флуоресцентному мікроскопі.

РНК флуоресцентної 5і0і О була детектована в ендоспермі і зародку.

Проникнення молекул флуоресцентної 5ікМА було детектовано в зрізах насіння різних видів рослин, включаючи квасолю, томат, сорго і пшеницю, через 48 годин після обробки а5ЕМА вісі о.

Зробили зрізи обробленого 5ісі 0 і контрольного насіння, щоб розглянути внутрішній

Зо розподіл флуоресцентної 45ЕМА на флуоресцентному мікроскопі.

Світлові зображення також були отримані для кожної насінини і показані поруч із рлуоресцентним зображенням насінини для довідки.

На Фіг. 1 представлені флуоресцентні зображення обробки 5ісі О насіння рису за період 24 години.

Перевіряли вплив часу інкубації з азКМА 5ібО на інтенсивність флуоресценції, що зазначає кількість і якість проникнення азЕМА.

Зображення контрольного насінння, що залишилося необробленим (1), були отримані разом із зображеннями насіння, обробленого а5зКМА 5іб/ 0, для чотирьох періодів часу інкубації: 10 хв (2), 3,5 години (3), 5,5 годин (4 ) і 24 години (5).

Зрозуміло, що 5ікМА розподілена на різних рівнях між зародком і ендоспермом.

Відповідно,

молекули а5ЕМА надходять прямо в зародок.

Без прив'язки до будь-якої теорії, молекули азКМА транспортуються водним розчином, використовуваним для обробки насінини.

Молекули а5зКМА надходять в ендосперм як частина процесу абсорбції води ендоспермом.

Потім ці молекули транспортуються в зародок, що розвивається, як частина потоку поживних речовин з ендосперму в зародок під час проростання і розвитку насінини.

Ці дані припускають, що молекули РНК, використовуваної для обробки насіння, проникають в зародок і функціонують в ньому при його розвитку, а також проникають в ендосперм і живлять зародок після проростання.

Приклад 6: Тимчасовий експеримент з 5ісбі О-обробки

Тимчасовий експеримент виконали на насінні рису, щоб контролювати кінетику проникнення

5іСі О в насіння після обробки насінини (Фіг. 1). Результати показують, що 5ікМА ефективно проникає в насіння рослин за протоколом, який описаний в Прикладі 1.

Приклад 7: Обробка насіння проти генів зродорієга ІШогаїїб

Зродорієга ІШогаїї5 (або Ргодепіа ІШогаїї5), також відома як гусінь, що харчується листям африканського або єгипетського бавовнику, є бабочкою, широко розповсюдженою в Африці та європейському Середземномор'ї.

Вона є поширеним шкідником овочів, квітів та інших сільськогосподарських культур.

РНК екстрагували для продукції а5КМА з личинок Зродоріеєга Ійогаїїв, і бібліотека КДНК була приготована з 0,5 мкг сукупної РНК.

Декілька генів (АТФаза, МАОРН-(цитохром Ра4а50)- оксидоредуктаза (в даному документі має назву "МАОРН"), інгібітор апоптозу (інгібітор бо апоптозних білків) і хітинсинтаза були обрані для перевірки впливу харчування 5. Ійогаїї5 рослинами, вирощеними з насіння, оброблених а5КМА, направленої проти цих генів (див.

Таблицю 4). Насіння кукурудзи промивали протягом 4 годин, сушили при З309С і відразу ж обробили молекулами а5КМА в кінцевій концентрації 40 мкг мл (для інгібітора апоптозних білків і АТФази), 80 мкг/мл (для МАОРН, 40 мкг/мл для кожної послідовності а5КМА, див.

Таблицю 4) або розчином суміші (80 мкг/мл кінцева концентрація), що містить всі три гени (20 мкг/мл для кожної з чотирьох послідовностей а5КМА) протягом 24 годин.

Свіже насіння томату не промивати і відразу ж обробили молекулами азКМА в кінцевій концентрації 66 мкг/мл (для інгібітора апоптозних білків), 133 мкг/мл (для МАЮРН) або розчином суміші (80 мкг/мл кінцева концентрація), що містить а5КМА, націлену на ці два гени, протягом 48 годин.

Оброблене насіння проростили і виростили з них рослини.

Контрольне насіння, що не було оброблене а5зКМА, направленої проти генів 5. ІШогаїї5, а були інкубовані зі схожим розчином, або яким не містить а5ЕМА, або яким містить а5ЕМА,направлену проти неспорідненого гена, такого як 55, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами.

Листя оброблених і контрольних рослин помістили на чашки Петрі і використовували як єдине джерело харчування для 5. ІШЖогаїйє (зазвичай, приблизно 5 гусениць на одну чашку). Сукупна маса тіла гусениць реєструвалася на початку кожного експерименту і відстежувалася протягом його.

При необхідності додавали нове листя, і їх масу також реєстрували.

Збільшення маси тіла гусениць обчислювали і використовували як індикатор їх стану і виживання.

Таблиця 4 Послідовності генів 5родорієга ІШогаїї5 для зниження активності і праймери, використані для покоління молекул О5КМА зродоріега ІШогаї5 мРНК МАОРН-(цитохром ух310073.1 зЗродоріега Іщогаїї5 Н(к) - мРНК субодиниці В где о.

Зродоріега ІШогаїї5 мРНК для інгібітора (нібторатолтознихбів ротова Тен) (АМТОВІВ . бЗродорієта ехідча мРНК хітинсинтази А, Експеримент 1 Гусениць Зродоріега ІшШогаїї5 помістили в чашки Петрі з листям кукурудзи від пророщеного контрольного або обробленого а5КМА насіння і щодня контролювали поїдання листя і збільшення маси тіла.

Дані по збільшенню маси тіла 5. ІЩШогаїї5 через 24 години, 48 годин і 5 діб показані в Таблиці 5, відповідно.

Відзначте негативний вплив на збільшення маси тіла гусениць, що харчувалися листям, обробленого а5КМА, у порівнянні з гусеницями, що харчувалися контрольним необробленим.

Збільшення маси тіла гусениць 5. ІШогаїйєх, що харчувалися контрольним листям, було нормалізовано до значення "1".

Експеримент 2 У цьому експерименті молекули 5ЕМА для сайленсінгу генів МАОРН або ІАР 5. Ійогаїїб використовували для обробки насіння кукурудзи.

Листя саджанців, вирощених з цього насіння, а також контрольне листя використовували як джерела їжі для 5 гусениць 5родорієега ІШогаїї5 в одній чашці Петрі (дві чашки для кожної обробки). Контрольні листя обробили азкМА, направленої проти гена 5И5. Збільшення маси тіла реєстрували для контрольної та обробленої груп через 48 годин з початку експерименту (Таблиця 5). Найбільший вплив на збільшення маси тіла спостерігається у гусениць, що харчувалися листям, обробленим МАОРН-а5зАМА.

Збільшення маси тіла 5. ІШогаїї5, що харчувалися контрольним листям, було нормалізовано до значення "1". Експеримент З У цьому експерименті молекули Д5КМА для сайленсінгу генів МАОРН або ІАР 5. ІКогаїїв використовували для обробки насіння томата.

Також була виконана додаткова обробка насіння розчином суміші, що містить молекули а5КМА, націлені проти обох генів.

Листя від саджанців, вирощених з цього насіння, а також контрольне листя використовували як джерела їжі для 5 гусениць Зродорієга ІШогаїйє в одній чашці Петрі.

Збільшення маси тіла реєстрували для контрольної та обробленої груп через 72 години після обробки (див.

Таблицю 5). Збільшення маси тіла 5. ІШогаїї5, що харчувалися контрольним листям, було нормалізовано до значення "1". Експеримент 4 У цьому експерименті молекули а5КМА для сайленсінгу генів МАОРН, ІАР або АТФази 5. ІЩЖогаїйє використовували для обробки насіння кукурудзи.

Також була виконана додаткова обробка насіння розчином суміші, що містить молекули а5КМА, націлені проти всіх трьох генів.

Листя від саджанців, вирощених з цього насіння, а також контрольне листя використовували як джерела їжі для 5 гусениць Зродоріега ІШогай5 в одній чашці Петрі.

На четвертий день оброблене листя кукурудзи було замінено необробленим листям салату в якості єдиного джерела їжі.

Збільшення маси тіла реєстрували для контрольної та обробленої груп протягом періоду до 8 діб.

Масу тіла всіх гусениць через 24 години використовували в якості контрольної точки, і збільшення маси тіла 5. ІШогаїйх, що харчувалися контрольним листям, було нормалізовано до значення "1". Дані з відносного збільшення маси тіла гусениць, що Зо харчувалися контрольним чи обробленим листям кукурудзи, представлені в Таблиці 5. Таблиця 5 Збільшення маси тіла Зродорієга ІКогаїї після харчування листями, обробленими а5ЕМА, через 24 години. 7777777. | гагодини | 710 | 064 | 038 | н/Зз | 08 | нНЗз 771 | 4вгодиїї | 70 | 069 | 057 | н/Зз | 07 | нНЗ 772 | 4вгодиїї | 710 | 055 | 09 | | | 10 773 | 4вгодиї | 1 | 055 | 09 | | її 73 | 7лгодини | 1 | 095 | 091 | 090 74 | 5діб, | 70 | 076 | 073 | 09899 | лі! 74 | діб? | 70 | 088 | 087 | 089 | 091 74 | ВвВдібб | 70 | 09 | 078 | 097 | пл2 1 Чотири доби - оброблена кукурудза і 1 добу - салат; 2 Чотири доби - оброблена кукурудза і З доби - салат; З Чотири доби - оброблена кукурудза та 4 доби - салат.

Н/З - Не застосовується.

Приклад 8: САЙЛЕНСІНГ ГЕНА РОЗ-1 В РИСІ СУМІШІ азеМА/ зівМА Насіння рису промивали у промивальному розчині протягом 4 годин при 20 "С, сушили при 25 С і негайно обробили сумішшю а5зКМА/5ікМА в сукупній концентрації 5 мкг/мл при 15 ос.

Насіння пророщували при кімнатній температурі протягом декількох діб і контролювали розвиток насінини.

Насіння, оброблене РОЗ і сумішшю азЕМА/5ікМА, показало уповільнений ріст і затриманий розвиток, що спостерігалось по саджанцям меншого розміру і зменшеному коренеутворенню.

З міркувань ефективності та для того, щоб збільшити схожість об'єкта, що спостерігається, два продуки гена РОБ-1 об'єднані (див.

Таблицю 6).

Таблиця 6 Два продукта гена РОБЗ-1 для сайленсінгу сумішшю а5зКМА/5ікМА. Цей експеримент виконали в трьох біологічних повторах, і результи представлені на фіг. 2А-

В. Приклад 9: Знебарвлення хлорофілу і інгібування росту після сайленсінгу РОЗ Насіння рису обробили відповідно до Прикладу 8 і контролювали їх подальший розвиток і ріст саджанців. Через 30 діб після обробки для сайленсінгу РОБ-1 реєстрували загальний фенотип двох груп рослин, контрольної та з пригніченим РОБ. Повідомлялося, що сайленсінг РОБ викликає знебарвлення хлорофілу і інгібування росту (Регеї? еї аї., 2007, Ріапі РВпузіо! 145: 1251-1263), що корелюється з фенотипом рослин з пригніченим РОБ у винаході. Оброблені рослини рису через 30 діб виглядали меншими за розміром і блідішими за кольором, відповідно, в порівнянні з контрольними рослинами. Приклад 10: Детекція двох продуктів гена РОБЗ-1 за допомогою плр у реальному часі Після обробки сумішшю а5зеЕМА/5іемМА (співвідношення 1:1) відповідно до Прикладу 8 рівні експресії продуктів гена РОБ-1 визначили за допомогою ПЛР в реальному часі, використовуючи спеціально розроблені праймери: Прямий: ОАТТОСТОСАССАССАТТАС ЗЕО ІЮ МО: 45; Зворотний: СССТТОССТСААССААТАТО, ЗЕО ІЮ МО: 46. Для цілей нормалізації також визначили експресію ОВО5, використовуючи праймери: Прямий - АССАСТТСОСАССОасСсСАСТАСТ, 5ЕО І МО: 47; Зворотний - АСИССТААа,асСстТастаатт, ЗЕО І МО: 48. Результати показані на Фіг. ЗА-О. Приклад 11: Сайленсінг гена-мішені НАР2Е Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1. Насіння промивали протягом 4 годин при кімнатній температурі, сушили протягом ночі при 25 "С і відразу ж обробили 45ЕМА Нарге в концентрації 152 мкг/мл протягом 41 годину при 15 "С (послідовність а5КМА Нарге див. в Таблиці 7). Контрольні та оброблені Д5ЕМА Нарге насіння рису, які проросли через 5 діб після обробки, не показали будь-яких відмінностей у розвитку їх коренів. РНК екстрагували з пагонів пророслого насіння через 5 і 7 діб після проростання, і виконали ЗТ-ПЛР. Після перевірки З різних наборів праймерів (див. Таблицю 7), розташованих на різних ділянках молекули 4528МА Зо (Таблиця 8, що показує кратну зміну відносно контролю), кращий набір праймерів (набір 3) використовували для оцінки рівнів експресії ендогенного Нарге в рослинах, оброблених а5КМА, проти контрольних (необроблених) рослин. Зниження експресії мРНК Нар2е в оброблених рослинах на рівні понад 5095 сайленсінгу в порівнянні з контрольними рослинами було досягнуто з ефективністю 31,2595 (Таблиця 9). Інші насінини рису обробили 85ЕМА Нар?е в концентрації 145,7 мкг/мл в тих же умовах. ЗТ- ПЛР з використанням випадкових праймерів «з Оїїдо ат на РНК, екстрагованої з саджанців через 18 діб після проростання, також показала зниження експресії мРНК Нарг2е в рослинах, оброблених а5ЕМА (Таблиця 10), на рівні 5095 зниження експресії з ефективністю більше 2595 у порівнянні з контрольними.

Таблиця 7 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекули а5КМА Нарге.

Набір Розташування Назва і напрямок . . . ЗЕО І прай- . . В Послідовність праймера , мерів набору праймерів праймеру Мо.: і В а5ЕМА озаНАР2Е5БОТЕЗ АССООСАТСАОСТСАаТтстТо озаНАР2Е5898З3 тастаттстстТОаОсСАСАСО озаНАР2ЕТТЕ5 ТССССТСАСАТАТТААСААС ці зе озанАР2ЕТО8В5 АССАОСАААСОСАССТІСТОТОЇ| 52 З Поза («5ЕМА озаНАР2Е122Е7 СТОАСТСОТСАССААСАдАС озаНАР2Е2О287 тататтТссСаттОАсАСТа Таблиця 8 Оцінка праймерів при обробці насіння рису а5ЕМА Нарге (мішень тіг 169) 01 Контроль | ЕМ4А7766 | ЕМ47767 | ЕМ47769 | ЕМ47772 | ЕМА47773 Набірпраймерів! | 10 | 087 | 007 | - | 081 | 062 Набірпраймерів2 | 10 | 0899 | 082 | - | 089 | 044 Набірпраймерів3 | 10 | 076 | 073 | - | 078 | 04 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0)

Таблиця 9 Обробка насіння рису а5ЕМА Нарге (мішень тіг 169) через 7 діб 0000 Ї Контроль | ЕМ47796 | ЕМА7798 | ЕМА47799 | ЕМ47803 | ЕМ47804 | ЕМ4А7769 Відносна зратазнні 0 | оо | о | ове | ся | ов | оо Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Таблиця 10 Обробка насіння рису 85ЕМА Нарге (мішень тіг 169) через 18 діб. й 49050 | 49051 | 49052 | 49053 | 49054 | 49056 | 49047 | 49060 | 49061 | 49063 | 49064 1033 041| 093 | 054 | 0,65 | 054 | 0,73 | 0,73 | 0,90 | 0,64 | 0,96 10 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Приклад 12: Сайленсінг гена-мішені МЕМ у насінні кукурудзи Насіння кукурудзи обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1. Насіння промивали протягом 4 годин при кімнатній температурі, сушили протягом ночі при 30 "С і відразу ж обробили а5ЕЕМА МЕМ в концентрації 56 мкг/мл протягом 40 годин при 15 "С (послідовність азЕМА МЕМ див. в Таблиці 11). ЗТ-ПЛР на РНК, екстрагованої з контрольного і обробленого а5зКМА МЕМ насіння кукурудзи через 10 діб після проростання була виконана для визначення рівня експресії гена-мішені МЕМ мішень (див.

Таблицю 11). Зниження експресії гена було успішно досягнуто, що показано в Таблиці 12.

Таблиця 11 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул азКМА МЕ в насінні кукурудзи З через 10 діб після проростання Назва і напрямок праймеру Послідовність праймеру ЗЕО ІО Мо.: 2та-МЕМАЗ 345 ЕЗ тсавддассостАсСсттсато 2та-МЕМАЗ 44283 сстваластастастттата 2та-МЕМАЗ 4574 ТАССАСОСОТСОАЛСТаатТТо 2та-МЕМ-АЗ 54284 СААДСАСООСОТОСАААТаСс Таблиця 12 Обробка насіння кукурудзи а5ЕМА МЕМ (мішень тіг169). Контроль ЕМ 48006ІЕМ 48007ЕМ 48009ІЕМ 48010ІЕМ 480111ЕМ 48012ІЕМ 48013|ЕМ 48014 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Приклад 10: Сайленсінг гена-мішені МЕМ в насінні томатів Насіння томату обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1. Насіння без промивання обробили ад5КМА МЕМ в концентрації 200 мкг/мл протягом 24 годин при 15 "С, насіння двічі коротко промили і відразу ж висадили в грунт без сушіння.

ЗТ-ПЛР на РНК, екстрагованої з контрольного і оброблеого а5ЕМА МЕМ насіння томата через З тижні після проростання, виконали для визначення рівня експресії гена-мішені МЕМ (див.

Таблицю 13). Зниження експресії гена було успішно досягнуто, як показано в Таблиці 14. Рослини томата через 55 діб після обробки молекулами а5зКМА МЕМ порівняли з контрольними рослинами того ж віку.

При порівнянні були очевидні великі відмінності між фенотипами, найбільш помітним було зрушення у рості, причому оброблені рослини були значно коротшими необроблених контрольних рослин (Фіг. 4). Таблиця 13 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул 5КМА МЕТУ в томатах, і продукт аБКМА МЕУ і ЗІУМЕМАТ25ЕЗ СТАТТОСОТОТОСТОСАААС ЗІУМЕМАг128З АСАТОДОСАССААССАААСО 60 СТААТАСОАСТСАСТАТАССОАСАСастСААпААССАаИТТ ТАТаТТААТаСТААДаСАаТАТССААаСаАТоСтТасСсАасСаАА САСАИТСАСИТаСтТААДаСАпААСТТаААААСпААаСАААТ АААСОСІТАПСАААаССАТАТСТТСАСИАдатстоасАСАТСАС СсАТаСАСТОАДССАССатААлсааасстосаатасцАСаеттт ,ССААДАААпАСАаАтТастСстТААасИ!тТАСсТаатстТатаА Продукт 1 азЗеЕМА МЕУ асТТсАТССССИатТтСстТаААссттасСсАатТТСААТаСсТасталд 61 ТАТ СААААпАСаОаААТаААААТасаа,астттааосвАастт СсАаСАаТсСТТАТТСАААТаСТтАасСАаТтТТАТааСААТСАДА аТАасСТТсСААаААТоСААдапаАТаАаТАССАСТТТастАА АдаСАсСапААдааАасТ ПИТ ТтатсААатТААТТасАСАТА ат СсАТаТтатАААСТАИаАСТСТТаСССтТСТоССтТАТАИ,ТО датСатАТТАС

Продовження таблиці 13 СТААТАСОАСТСАСТАТАССОСАСАССАСТТАТааСААТСА ААСТАаСТТТсСААВААТССААдааАтТадатТАССА,ттТаст АААдаСсАасСсасвАда,аАсасп т тттатсСААаТААТТавАаА тТАССТТСАТатТатТАААСТАОСТСОТТИОИССОСтТасСААСсСАсИос тАСАаТтТАТаАдаСААСпСАас,СаАаТтТАСАас,СасАТТаТТТСАТТ тотаасСсТтТсААпАТАсСасСсаасСААТТСАТТСТТваТстттТ Продукт 2 О5ЕМА МЕУ ТТАСТТТАаТаттТАААаасАаСААСАспСАаватаАСаАсва,тТ 62 АТСсСАСтТаттасАасСсАтттасттасАсАТТАСАТСТТОССТТ АТаТтТАСАСАСАТаСпСАТаААСТТАЧСААСТАаСАТТАСАААС ТТТІТСАСТТААСТ ТАТО ТТ ТОаСССАСТТАСТатАатТТТтТА ат тТАапАСпСАССАТИаТАААААСаИТтТатТАаТТтТасААДА СаАТСТТ СТ ТОССТААТТасТасСАТТСТОССТАТАС тадатСатАТТАС Таблиця 14 Обробка насіння томату О5ЕМА МЕМ (мішень тіг169) через З тижні рослина ЕМ 49778|ЕМ 49812ІЕМ 498161ЕМ 498181ЕМ 49819|1ЕМ 49826|1ЕМ 49827|1ЕМ 49829 Відносна зратазнна| 0 | 06 | 09 | 05 | 06 | ов | ов ов 49832 49833 49834 49835 49836 49837 49838 49839 Відносна зратазнна| 07 | 06 | 09 | 05 | 09 | 05 | о5 | ов Кратне зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Приклад 11: Сайленсінг гена-мішені МАС у насінні кукурудзи Насіння кукурудзи обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин при кімнатній температурі, сушили протягом ночі при 30 "С і відразу ж обробили а5ЕМА МАС в концентрації 90 мкг/мл протягом 40 годин при 15 С і відразу ж проростили (послідовність О56ЕМА МАС див. у Таблиці 15). ЗТ-ПЛР на РНК, екстрагованої з контрольного і обробленого О5КМА МАС насіння кукурудзи через 10 діб після проростання, була виконана для визначення рівня експресії гена-мішені МАС (див.

Таблицю 15). Зниження експресії гена було успішно досягнуто, як показано в Таблиці 16. Таблиця 15 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул О5КМА МАС в кукурудзі Назва і напрямок праймеру Послідовність праймеру ЗЕО ІО Мо.: 2тамАс5 267ЕЗ СсОАаТСОООАТАСТаСААДОС 2тамаАс5 34283 СсТТСТТсАТОССОАСсОоласа 2тамАс5 187Е4 АСсСОАтТОсОСОАаАдАасАста 2тамАс5 25084 тсАдстоссатоаватАстта 66 Таблиця 16 Обробка насіння кукурудзи Д5ЕМА МАС (мішень тіг164) через 10 діб після проростання Рослила | Контволи. | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7 Рослила | 8/ ЇЇ 9 | 710 | 1 1 12 01 13 114 (Відноснакратназмна | 000 |009|013| 021026 | 026 | 018

Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0)

Приклад 12: Сайленсінг гена-мішені АКЕ-8 в насінні рису Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин, сушили протягом ночі при 20 "С і відразу ж обробили 85ЕМА АКЕ-8 в концентрації 66,2 мкг/мл протягом 42 годин при 15"С.

ЗТ-ПЛР на РНК, екстрагованої з контрольного і обробленого 85ЕМА АКЕ-8 насіння рису через 18 діб після проростання, була виконана з метою визначення рівня експресії гена-мішені АКЕ-8 (див.

Таблицю 17). Зниження експресії гена було успішно досягнуто, як показано в Таблиці 18 і Таблиці 19. Таблиця 17 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекули Я85КМА АКЕ-8 кукурудзи і продукт азААМА АКЕ-8 СЕС сс ПН ЗП озаАнЕв 1403 дасаТтСсАСАТСССОСААСТАС озаАВЕ8 23383 АССТСОТСАИТСТОСАСАТС 68 озаАаВЕ8 1674Е4 стТТОвАТТСаАОСТТоСТТо 69 озаАВЕ8 175784 тастастОостСАСТАССТАС СТААТАСИаАСТСАСТАТАаССОСЬСАСАССТОССЯ ТТ ТОСССТАИ,ТТОоСТ АТтТааАаАТоТатТаААсае пес таасАТаААТСААСТасСсАасс САДАПАССАССААДИаАа СТ ТАТасвОсАААТТаААССАТТОаАСА АССТТТОСААТаТАТССАТСТСТаТТОССАСТОАСАаТТААасСАТ ссттастАТТСсАасасАХаттастооСстТасСАТаАТаАСАаТсСААТИаСТ Продукт 85ЕМА АКЕ8ІЇ ТТААТаТОССТОАСАСсСЯАХстТастастаАасасАсат ттСАсТС| 1 тТСтТаААСТТТСАаТСАССТОСТАТТОаССТОСТАСОасАСААСАаА вастоСАТССАТССТТАСТадасСсАасаАТСАСаАТСАаТАССАА сслатааттастастастастастСсСсСААТСТОИТОаТТТАСТТА ААДАСАаСААТТСТТаСАССТТСА,СААССТАТаСАСТоСССТОСАА СААСАСТаСААССТСААСССТСТОССТАТАИТОАдаТСаИТтАТТАС Таблиця 18 Обробка насіння рису О5ЕМА АКЕ-8 (мішень тіг167) через 18 діб після проростання ЕМ 48977 | ЕМ 48983 | ЕМ 48984 | ЕМ 48986 | ЕМ 48987 | ЕМ 48989

Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Таблиця 19 Обробка насіння рису а5ЕМА АКЕ-8 (мішень тіг167) через 18 діб після проростання троль | 49194 | 49196 | 49198 | 49200 | 49201 493203) 49204 | 49206 | 49209 (Кратназміна| 1,0 | 044 | 0,88 | 0,45 | 022 | 026 | 0л2 | 0,06 | 031 | 0,92 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Приклад 13: Сайленсінг гена-мішені 5РІ 17 в насінні рису Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин, сушили протягом ночі при 20 "С і відразу ж обробили а5ЕМА 5РІ 17 в концентрації 200 мкг/мл протягом 41 години при 15 "С (послідовність О5КМА 5РІ17 дивіться в Таблиці 20). Контрольне та оброблене а5ЕМА 5РІ 17 насіння рису, що проросло через 5 діб після обробки, не показало будь-яких візуальних відмінностей.

РНК екстрагували з пагонів віком 5 діб цього пророслого насіння і виконали ЗТ-ПЛР, щоб визначити рівні експресії ЗРІ17 в групах контрольних і оброблених рослин.

Перевірили два різних набори праймерів (див.

Таблицю 20), розподілені на різних ділянках молекул а5ЕМА (Таблиця 21). При виконанні ЗТ-ПЛР на РНК, екстрагованої з рослин віком 14 тижнів, було досягнуто зниження експресії МРНК 5РІ17 в оброблених рослинах з високою ефективністю в порівнянні з контрольними рослинами (Таблиця 22).

Таблиця 20 : Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул Я5КМА 5РІ 17 в насінні рису через 5 діб після проростання праймерів Мо.:

1. ваземМА озабРІ 17 1193 СТСАОССАТОССАТАСТАСС озабРІ 17 18983 встТаасСсСОТТОАсСОАСАТТОа

2. поза Фд5ВМА озабРІ 17 55Е4 АССТСАСОИТОаСАТОТСТС озабРі 17 15184 тастаавтастттТОосСОтТАС Таблиця 21 Обробка насіння рису а5ЕМА 5РІ 17 (мішень тіг156) через 5 діб після проростання ЕМ 47708 | ЕМ 47709 | ЕМ 47710 | ЕМ 47711 ІЕМ 47712 Набір праймерів 1 11,97 Набір праймерів 2 1 1 076 | 092 | 1 | 069 | 0,84 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1,0) Таблиця 22 Обробка насіння рису а5ЕМА 5РІ 17 (мішень тіг156) через 14 тижнів після проростання. Рослина | Контроль ЕМ 49502ІЕМ 49503ІЕМ 495111ЕМ 49513ІЕМ 49515ІЕМ 49517ЕМ 49519 0,085 | 0141 0,337 | 0,275 | 0129 | 0321 Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1,0). Приклад 15: Сайленсінг мікро РНК генів-мішеней комплементарної а5ЕМА/5ікМА Висока специфічність та ефективність посттранскрипційного сайленсінгу генів специфічної до гену-мішені 45ЕМА зробила його переважним способом створення переважного фенотипу еукаріотичних організмів, при цьому експресія одного або декількох генів знижується або вимикається. Специфічні послідовності а5КМА, призначені для сайленсінгу генів-мішеней мікроРНК кукурудзи (7еа таув) і рису (Огула заїїме). Більш конкретно, будуть використані мікроРНК, які, як відомо, асоціюються з підвищеною толерантністю до абіотичних стресів. У Таблиці 23, нижче, представлені кілька прикладів послідовностей генів-мішеней, які продуковані із використанням ПЛР-ампліфікації, щоб перевірити здатність до сайленсінгу генів сумішшю їх а5зКМА/зікМА. Ці молекули а5КМА потім будуть використані для нокдауну ендогенного рівня обраних генів-мішеней. Таблиця 23 Послідовності генів-мішеней і праймери для ПЛР ЗЕОЮ МО тів 69/МЕМ-АЗ тів169/МЕМУ-АЗ прямий тів169/МЕУ-АЗ зворотний тів169/МЕМУ-АЗ прямий тів169/МЕУ-АЗ зворотний Штучнапослідовність.ї | 77/80 НАР2 НАРА прямий НАРА зворотний НАРА прямий НАРА зворотний тів156/5РІ-17 (Огулавайма | 178641

Продовження таблиці 23 отіві56б/5РІ17 прямий 00000 |Штучнапослідовністьд//:///| 77/89 отів'56/5РІ17зворотний 000 |Штучнапослідовністьд//:// | 777901 отівіб4/МАС ММ 001064881.1, | Огулавайма///-://: | 777964 отімба/МАС зворотний 00 |Штучнапослідовністьд//:// | 77/98 отів'64/МАС прямий 0 |Штучнапослідовністьд//:///| 7777/9922 Приклад 16: Сайленсінг гену АКЕ-8 в насінні томатів

Насіння томату обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, непромите насіння обробили а5ЕМА АКЕ-8 в концентрації 200 мкг/мл протягом 24 годин при 15 С і відразу ж висадили в грунт.

Рівні експресії гена досліджували, використовуючи ЗТ-ПЛР, через З і 8 тижнів після обробки (див.

Таблицю 25). Зміни в експресії були досягнуті в рослинах, оброблених а5зКМА, через З тижні після обробки (Таблиця 24). Таблиця 24 Обробка насіння томату а5ЕМА АКЕ-8 (мішень тіг167) через З тижні і 8 тижнів після проростання

Зтижні 1777/1710 | 062 2 | щЩщ 06 | 05 | 08 Рослила | ЕМ49953 | єЕМ49954 | ЕМ49955 / ЕМ49957 Зтижні 17/08 | 2 .ЮД05 2 Ю Щ| 06 2 щЩ | 09 | ( І(Втижнів./ | 060 | 069 | 047 | 099 | 047

Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0)

Рослини, які обробили молекулами азКМА, специфічними для гена АКЕ8, показали фенотипічну відмінність в порівнянні з контрольними рослинами.

Ця фенотипічна відмінність спостерігалася в різні моменти часу (55, 62 і 72 діб) і проявлялася як зниження висоти (Фіг. 5А-

С), при цьому середня висота контрольних рослин становила - Зб см, висота рослин, оброблених д5Е2ЕМА, становила, в середньому , 30 см (Фіг. 50). На додаток до їх меншої висоти (затримка розвитку по вертикалі), рослини, оброблені а5КМА, виявилися більш гіллястими (збільшення розвитку по горизонталі) в порівнянні з контрольними рослинами.

Таким чином, рослини, оброблені Д5КМА, специфічної для АКЕ8, були коротшими і більш гіллястими в порівнянні з їх контрольними зразками через 55 і 72 діб після обробки.

Таблиця 25 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул 85КМА АКЕ-8 у томата і продукт ОБАМА АКЕ-8 послідовності Мо.: СТААТАСОАСТСАСТАТАССОАСАаСТ ТОТОСТОССТАСААСТата ТСТААСОСТСастТАСТАСАТСААТТаАТасСтаАТАТАТОСТСТАТОСС АСсТтАааспАСТТСТапАТТ ТССОААТОССТТатАТАИТТАТатТасААа АТТСТАСТаАСТТаТтТаСАТААТИаТАсСааСААдастаАТасСАСАААСТ Продукт 1 а5ЕМА стасСсСсСатАСАТТТатсСАдасТТТАСАААтТсАасатоссттасиаА АВЕ 8 ватСсАТТОСАСАТСАСТОССИТТСААСАаСТАТСАТаласСстТасСсАСА| 108 всаААТТАСССЯСАаАТаттаатАтоадАл,асиатта|асттаААаАССсСтТ САДАСАТСАСсСИаСсТасСАаасттатАт тат аАСАпацсАпААТИаАТОа тостсотостта,асАвАСаАтосатассАасААТТТатСААТАА таттастАСАТСААААТТСТТТСАССсСОАс,аАТатасСАСАААСТОа сапАдАдадасааатТасасАТСссСтсТССсСТАТАаТтОсАдаИтсаТтАТТАа СТААТАСОАСТСАСТАТАССОСАСАТасСаАаАТТаАаССТТТаАСТА СТТТССаАТаТАТССАТСТСТ ТТ ТТОСТОТААСИаСТАААсСАсСаТсст ТТСТАТСААС,СААССТОСАТСТТАТСАСССАТА,ТААСААТаААдаТстАТ ТААТССААТаТтСАТОСаТТААпаАдсасвААатТа,астаатавАдастАасАСАТ САТТСААТаААТСТТСсАСТОттТааСАТИСТТОСтТТапАТаСААСА Продукт 2 а5ЕМА | ФАСАСТоаАТТСААСААТТСТОССАААТаАТАТТААТСАС,САСТАТСОС 109 АВЕ 8 ААдастАТастаасСтТАСТваСтТТасСАААаа т тта,асаАаатасАсАТТТ АСТаААДАСАССААТТААТИСАаттТсАаСАасССтТатоСААТАТСТОаС ААСАТаСААаТАСТаАСаААТТСААТТТТасСАТСАСаСАаСАаСАаСА вСсАаСАаСАААТААТасСАаСААасСАсаТТСАТСАСаСАТАТОИСТасСстТ ССТСААДАСССААдАтТастатсАалдаААССТТСАААааТсСААТСССАСИС АТСААТССАТСТО ССТАТАСТОАЛдИТСаИтАТТАС Приклад 17: Сайленсінг гену ЕМУ2.2 в насінні томатів Насіння томату обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, непромите насіння обробили а5ЕМА ЕМУ2.2 в концентрації 100 мкг/мл протягом 24 годин при 15 "С і відразу ж висадили в грунт.

Рівні експресії гена досліджували, використовуючи ЗТ-ПЛР, через 9 тижнів після проростання (праймери вказані в Таблиці 26). Було детектоване приблизно дворазове зниження рівня експресії ЕМ/2.2 в рослинах, оброблених а5КМА, у порівнянні з контрольними рослинами (Фіг. 6).

Навіть у такому випадку рослини, які обробили молекулами а5ЕМА, специфічної для гена ЕМУ2.2, не показали фенотипічних відмінностей в порівнянні з контрольними рослинами, що прибирає токсичний ефект як альтернативне пояснення фенотипічних ефектів з Прикладу 15. Рослини мали схожу висоту і зовнішній вигляд через 72 діб після обробки.

Приклад 17: Зниження експресії гену ОЕЇ ГА в рисі призводить до більш розвинутих коренів у пророслого насіння

Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин, сушили протягом 24 годин при кімнатній температурі і відразу ж обробили а5ЕМА РЕА в концентрації 66 мкг/мл протягом 36 годин при 15 "С.

Насіння рису обробили а5еЕМА, направленої проти гена ОеїПа (див.

Таблиця 28), який є відомим репресором росту рослини.

Саджанці Агабідорзіз5 з геном-мутантом ЮОеїа більші і мають довшу кореневу систему (до55е, ЕМ, Сап, У., Вои-Тоїтепі, 9., Зіеуагі, КІ, сідау, АО, Удейтеє, СЕ, Маївії), ЕЕ, Магііпе7-Сагсіа , ОБ, Маду, Р., Стапат, ІА, апа Наїадау, Ку (2011). А ОЕГ ТА іп діздиіве: БРАТИ А гезігаїпв Ше дгоуУми ої Ше демеїІоріпуд Агабрідорзів з5ееайїпд.

Ріапі СеїЇ 23: 1337-1351). На Фіг. 7 показана імітація фенотипів Агабрідорзіє з використанням насіння, обробленого а5ЕМА, при цьому оброблені саджанці більші і мають більш довше коріння ніж контрольні саджанці.

Таблиця 26 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР молекул а5КМА ЕММ2.2 у томата і продукт ОБКМА ЕМУМ2.2 Назва . . ЗЕО СТААТАСОАСТСАСТАТАИСООАСАТССАпатоСААТаАААСААССТТАТ ет оСстТосСтТоАСТАТатТАТСТОСССССОООИСАССАССАСТЯССЯЯСОУЯТОас тбаАСТЯДИТСТТТатсАТТатттаАТтТаАСССтТастААСТатТтТАаТтТАС таатат ТтасссСтТТатАТСАССТТТаСАСАСАТТТСТОаАААТАСТАААСА Продукт а5ЕМА ААСОСААСААСТТСАТаТтасаАХатТАсСАсСатасСАТТАТАТТОаТТТаСТОСИ

М/2.2 АТтТаАСАСаСаАтТтасстТАасСсСтТАТАТТОСТастТстТАСАСаИатСТААААТОА! 112 І саеаааасСААТАТаАТСТапйААсСАасасАаєєататтаАтТаТатстТатАСА татАтпстатаААдсстатастст ТаССААСААТАСАСаАС,АасСТТААаА АдссатааСсттТаАТАТаСОААТАСаТайСААасСтТААТАТасСАТАСАСА АдасбадапАаТТАССАТаСССССТТАТСАТаСАааСАТаАССТОоТоСо ТАТАСТО,ОАИ,ТСИатТАТТАС Приклад 18: Зниження експресії гену піт у рисі призводить до більш розвинутих коренів та пагонів у пророслого насіння Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин, сушили протягом 24 годин при кімнатній температурі і відразу ж обробили а45КЕМА МК в концентрації приблизно 4 мкг/мл протягом 36 годин при 15 "С. Насіння рису обробили й5КМА, направленої проти гена МКК, який, як встановлено, регулює ріст коренів у відповідь на макронутрієнти в рисі (2папд еї аї., 2 012, Мої Ріапі 5 (1): 63-72). Доведено, що саджанці трансгенного рису з рівнями МКК, зниженими з використанням КМАЇї, мають більш довше коріння при вирощуванні в умовах нестачі азоту. На Фіг. 8 показана імітація цього фенотипу з використанням 85КМА-обробки насіння, при цьому саджанці, отримані з обробленої насінини, більші і мають більш довше коріння ніж контрольні саджанці. Приклад 19: Одночасний сайленсінг трьох ендогенних генів У даному Прикладі перевірено ефект одночасного сайленсінгу трьох генів. Насіння рису обробили за протоколом, описаним в Прикладі 1, насіння промивали протягом 4 годин, сушили протягом ночі при кімнатній температурі і відразу ж обробили розчином, що містить суміш (кінцева концентрація 152,7 мкг/мл) 85ЕМА проти трьох генів: Нарге ( 59,9 мкг/мл, див. Таблицю 28), ОеїІіа (44 мкг/мл, див. Таблицю 28, нижче) і 505 (48,4 мкг/мл, див. Таблицю 28, нижче) протягом 42 годин при 15 "С. РНК екстрагували з пагонів пророслого насіння через 18 діб після проростання і виконали ЗТ-ПЛР для кожного з цих трьох генів (див. Таблицю 28, нижче). Як можна бачити в Таблиці 29, зниження експресії всіх трьох генів було високоефективним, при цьому оброблені рослини показали зниження експресії кожного окремого гена в різних величинах, від мінімального зниження на 1095 до повного сайленсінгу гена (дорівнює 10095 -му зниженню експресії). Таблиця 27 Продукти молекул а5КМА МАК в рисі послідовності Мо.: СТААТАСВАСТСАСТАТАСССАСААХаСТОоСТаААСССАТСАТТИААСА АсСсАСТасттАассттаАтТоСАатасАаСАаССАТТТОСАТаАТИаТо тапСАстТаАпААСатААтТасАТаАААСТАТАЧаАХааТТаСАСАТАТСАС СаАСАТТСАСААТаАСТСОТСОТ ТТ ТААаСОСААаИТАТТАТАССЯАСа ТИССА Продукт 1 ААСОСААСТСАТаСАСААдатоСасСААТОСААаАСАСТАТТТСТОААСТО а58МА МАВ стапАСатСААаАТТОСТАТаСтТасСсАдатапААаАаТоССТАвпацАА| 113 АСССААДИТАСААСТАССЬЯИССАТапАсСААааАспААаССАТСАСТТОСТ СААТаТтТаттСАСТоСАЧААААХа тата тстааватТасстоААСТОСА ,астаАтТасцсАтТСААтТасАССАаССАааССАААСТТоСТасАСТТССАА савАтасАСТТтТаАдаАСсАаа,асаттасата,ада,асАсааСАТАСАаСаА АапАСАСАТТСТОССТАТАСТтТОаЛДатСаИТтА ТАС

Продовження таблиці 27 СТААТАСВАСТСАСТАТАСССАСАСАТапАпААа ТССаСААТССАДаА сСАСТАТТТСТаААСсТОСТасАСИаТСААСаАТТОСТАТИаСтТасСсААдаТасАа дадаИттосСстТАаааАААСССААатАСААСТАССваССАтасАаААас АСААаССАТСАСТ ТОСТаААТатТТатТСАСТОСАСААААдатаТатсАатто Продукт 2 ГАСОТасСсСтСААСТСАОСТОАТГасАТСААТОИСАССАСССАСОССАА а5В8МА МАВ АСсСТтоСсТапАСТТССААдсааАттасАСсттта,аАсАсАаасаттасваттаА 114 савдасасСАТАСАДаСаАддасАаАСАТТСАСаААтТоттасАастАасСАСС сстссАссСа,аадвААСТСАааАААСасСстТСААТТАасАтотасСсАада ,аСсТТатААССАТСАаТаАССТаАААТСТИААпААдАс,сААаСАспАдаТст АТСТАВИТАСАСАААпААпААсСатаААпАпАААСТТТааСАСАдАСАТ СААСааТтТАТОСТ ТСАаСПСААааТстоТСсТоСсСтТА ТАаТаАдаТСаИТтАТТАС Таблиця 28 Праймери, використані для аналізу шляхом ЗТ-ПЛР на рівень експресії генів Нарге, ОеїІа і 505 і продукти О5ЕМА СТААТАСИаАСТоСАСТАТАССЬОАДИ Ла СССАСТТСТАСОЯИТОС тТассссСстТАССТСААСТТСаСССАСТТСАССасАААТСАДИаС СсАТСОСТССАСОаСсТІ ТСаСсСссеастТасСАсСсасатоСАСаИтса тсадсттсаасСсАТСААлаСАасасаАТаСААтаассАастосто стоСсАСЯСССТСООСССТОСТОССЯвасааССССССАТССТ ссасстодсссасатасасоссссасАХа,асСса,ацвАСадаАсс Продукт 458 МА Оеіїа слсассттасаасасатасаттаздадасттассослаттсас 124 вСАСАССАТТСЯСОТоСАСТТоСсАаатасСсасасиИсАстсатса ссассастотсасааАсттасдассатСАтТастасСсаассо сласа7сСссАаааСсачАСасаААСсаАаа,асАасстадаатТадтос сосатсАдстсастатссвадастасассаастастоасас да,асссассасастасАааддсаатостазасасасвтаСАсас сатаСсосасСсСААлааАто,атсАсСсатаатТАвАатсТосСсСтТАТА атадатСаТатАТТАС СТААТАСВАСТСАСТАТАСЯСАСААТАТСТАСААССОасСсаАСТ сасСАТТАТТСАТатТасААСААААаАСТАСАААТТАСТОаАТОас АТААСТТ ТСИаССТТаТтотТосСАСсвасттсотесаАаесттасато ААСИТТАТСААСАСасСААТТаААСААДАТСАСТАЧастААТОС слаСсдапААТайСААААТТТАТСотТасСсААдааАааТТаАААСТ асТТаАТаАСТАСААТаАдатАСТаТтоСАСТАТИТАССАСОССТА Продукт 1 а5еЕМА ставастТАТОСССсТТоСАсСастотттсАТастаатаасаАс 122 зО5 ааААаАТоТааСТТСАСАТТСАСТТТСАААТТСААТОСОСЯСТТ ат ТСТаСАСАААДАТСААТАТААТТАССИаАТТАТТТаСсАССА САТАДАСОАСАТАССАААатСАСаТтАТаТатстаасстоцпАаА ААТАТаАСАС,ТАААТАТаТСААТАААСТОСАСаАТТТаАААТАС вАааААААТТСАпААДААааСАс ТТ ТсАа Та ТТаААТОаАТАТаИа аТаАСТААСастотТатсоТСсАТСТОССТАТАатТОаАсТСаТтАТТ да

Продовження таблиці 28 СТААТАСВАСТСАСТАТАСССАСАСОЯСТОТатСстТоАТаСТаА АСАСТаССТоСААТАСАТИаТСсАаСАТТаААсаАТСАТаССАТ тптоесаттатасСААТАССТСАСАТААТааСААТТасаАС АТатТасСТтТАТТТаСТАСААТААТаТтТадАТИаТСТтттТАаСАаааАсТТ Продукт 2 і56МА сТТААаАтТадсаСатацвасТСАСТасСАССАСТААТТОаАТаА О5 САСААДАСАСААТатСАаАТатоТАТАСТастТ ГТ СТАТОаАаИттТ 123 СстотТСастТаАТАСААТССПААСАТТаАТААТААТОАТССАААТІ СТ сССтТААСОЯаСОасАААСсаИататТаАтасаАТАААСАсСААС СсТаСААСТСАТСТТасСтТоАСТАААСАСАдасаСасАТтТАССАТТТ ,саАпААдаИТСАААатАСААСТоСАТастаАТААТОСТТаТатАСТ тстаттаатаастсоТсСсСтТАТАСТаАаТтСаИТтАТТА Таблиця 29 Одночасний нокдаун експресії в насінні рису через 18 діб після проростання реа | 10 | 04 | оо 1 047 | 700 | 042 | ол и Я Я Я ПОЛЯ КОН КОНОНКО Нарге | 0,06 | 027 | 092 | 024 | 027 | 029 | 037 реа | 001 | 04 | 060 | 027 | 029 | 0937 | об / БОБ | 0,56 | 008 | 087 | 049 | 009 | 013 | оо Кратна зміна відносно необроблених контрольних рослин (контроль - 1.0) Приклад 20: Створення молекул а5КМА для сайленсінгу гену-мішені фітопатогену Молекули а5КМА, що кодують гени 5. ІШогаїї5, проаналізували проти геномів кукурудзи та томата (Фіг. 9 і 10, відповідно), використовуючи пошуки ВГА5Т з наступними параметрами: поріг очікування - 10; розмір слова - 11; оцінка співпадання/неспівпадання 2-3; вартості гепів: існування: 5 подовження: 2; максимальні співпадання в діапазоні запиту: 0, пошуки ВІ А5Т були виконані на базах даних послідовностей кукурудзи (7еа таух - їахіа: 4577) та томата (Зоіапит Іусорегзісит їахід: 4081), які відповідають викладеному в даному винаході. Приклад 21: Обробка насіння проти гену МАОРН 5БРОБОРТЕКА ГІТТОКАГІЗ Насіння кукурудзи (вар. О10КО2) обробили молекулами а5КМА (5ЕО ІЮ Мо. 26), що має нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена МАОРН 5. ІШогаїї5, відповідно до протоколу, описаному в Прикладі

1. Використовували Я5ЕМА в кінцевій концентрації 80 мкг/мл, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА. Обробку виконали шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 3,5 годин в темній камері для росту при 15 "С. Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 257 зі світловим періодом 16 годин. Рослини при необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, яке було оброблене 85ЕМА ЗФБ (ЗЕО ІО Мо.: 124) або схожим розчином, що не містить азКМА (ЕДТА-контроль), проростили і вирощували в якості контрольного поруч з обробленими рослинами. Через 28 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин помістили в чашки Петрі і використовували в якості єдиного джерела їжі для 5. ІШогаїї5. Для кожної рослини використовували 15 личинок (5 личинок на одну чашку, три чашки на одну рослину). Перевірили п'ять рослин для кожної обробки насінини (МАЮОРН, ЗФБ і ЕДТА). При необхідності додавали нове листя. Масу тіла кожної личинки реєстрували через 12 діб після початку годування і використовували як показник їх стану і виживання. Спостерігався значний (односторонній дисперсійний аналіз АМОМА, р-значення-8,36х107) негативний вплив на масу тіла личинок, що Зо харчувалися рослинами, обробленими азКМА МАЮОРН, в порівнянні з личинками, що харчувалися контрольними рослинами. Дивіться Таблицю 30. Середня маса личинок, що харчувалися рослинами, обробленими МАОРН, була на 2395 і 2095 менше ніж середня маса личинок, що харчувалися рослинами, обробленими ЗФБ і ЕДТА, відповідно.

Таблиця 30 Середня маса (мг) Зродоріега Ійогаїї5 після 12 діб годування обробленими рослинами Станд.

Проба 1 2 З 4 5 Середнє відх ЕДТА зві-МАОРН Мет Через 73 діб після обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин знову використовували в якості єдиного джерела їжі для 5. ІШогаїї5. У експеримент з годування було включено п'ять рослин з кожної групи.

Листя кожної рослини помістили в п'ять чашок Петрі з п'ятьма личинками в кожній, тобто, 25 личинок на одну рослину і 125 личинок в одній групі.

Через сім діб експерименту неочковано велику кількість личинок знайшли мертвими в контрольній групі на ЕДТА.

Через велиу кількість смертей у контрольній групі вплив харчування тканиною рослини, взятої через 73 діб після 45ЕМА-обробки насінини, на стан і виживання 5. ІЩЖогаїї5 далі не аналізували.

Визначили рівні експресії МАОРН в підгрупах личинок, що харчувалися рослинами, вирощеними з насіння, обробленого молекулами а5КМА, націленими на МАОРН або ЗФБ (28 діб після обробки насінини).

Таблиця 31 Личинки, з яких екстрагували РНК

Обробка Маса (мо 2 2 МАНЕН З З 1 2 сть З 2

Повну РНК екстрагували з личинок, і приготували кКДНК, використовуючи оліго-аТ праймери, і рівень експресії МРНК МАОРН 5. Ійогаїїх визначили для личинок на оброблених і контрольних рослинах шляхом ПЛР в реальному часі (3ЗТ-ПЛР) за допомогою барвника 5УВК сСгееп (компанія Оцапіа Віобзсіепсе5), використовуючи гени домашнього господарства актин і ЕР1а в якості нормалізаторів.

Послідовності праймерів, використаних в ЗТ-ПЛР показані в Таблиці 32.

Таблиця 32 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії МАОРН Назва і направлення . . -

Ніякої істотної зміни в рівнях експресії МАОРН (критерій Уілкоксона, р-значення» 0,05) не спостерігалося при аналізі шляхом ЗТ-ПЛР личинок, що харчувалися рослинами, вирощеними з насіння, обробленого молекулами а5КМА, націленими на МАОРН або ЗФБ (28 діб після обробки насінини).

Приклад 22: Обробка насіння проти гену АТФази БРОБОРТЕКА ПТТОКАЇГ І

Насіння кукурудзи обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, молекулами а5зКМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена АТФази 5. ІШогаїйє (ЗЕБО ІЮ Мо. 31). Коротко,

насіння промили двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин.

Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі.

Після етапу сушіння використовували а5зеМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 53 мкг/мл.

Обробку виконали шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насінини пророщували на вологому папері протягом семи діб і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світловим періодом 16 годин.

Рослини при необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, які обробили схожим розчином, що не містить а5КМА, проростили і вирощували в якості контрольних (ЕДТА-контроль) поруч з обробленими рослинами.

Через 43 діб після обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Рослина Мо 1 служила в якості джерела живлення для 20 личинок, поміщених в коробку розмірами 130 х170 мм.

Рослина Мо 2 служила в якості джерела живлення для 15 личинок, поміщених в коробку розмірами 124х95 мм.

Рослина Мо З служила в якості джерела живлення для 8 личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня всіх коробок і планшетів була покрита вермикулітом, і нове листя додавали в міру необхідності.

Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом експерименту.

На Фіг. 11А показана смертність, і на Фіг. 118 показана середня маса живих личинок 5. Ійогаїї5 через вісім діб з початку годування.

Личинки, що харчувалися рослинами 1 і 3, вирощеними з насіння, обробленого а5КМА АТФфази, набрали зіставну масу і показали схожу смертність з такими у контрольній групі, а личинки, що харчувалися рослиною Мо 2, вирощеною

Зо з насінини, обробленої О5БКМА АТФфази, були майже в З рази меншими ніж у контрольній групі, в якій смертність була вищою.

Для перевірки сталості ефектів обробки насіниниазКМА листя рослини Мо 2 зібрали через 85 діб після обробки насінини і використовували в якості єдиного джерела харчування для 5. ІЖогаїї5. Використовували всього 15 личинок в трьох чашках Петрі, що містять по п'ять личинок кожна.

На Фіг. 11С показаний відсоток мертвих личинок через три доби після початку експерименту.

У групі обробки азхКМА АТФахзи 12 з 15 личинок були мертві, а в контрольній групі мертвих личинок не було.

Сталість ефектів обробки насінини а5КМА була потім перевірена шляхом збору листя рослин Мо 1 ї 2 через 91 добу після обробки насінини і використання цього листя в якості єдиного джерела їжі для 5. ІШогаїї5. Кожною рослиною харчувалися всього 15 личинок в трьох чашках Петрі, які містили по п'ять личинок кожна.

Через чотири доби експерименту обом групам також дали рослину Мо 3. На Фіг. 110 показаний відсоток мертвих личинок через сім діб після початку годування в порівнянні з контрольною групою.

Приклад 23: Обробка насіння проти генів АТФази, ІАР | МАОРН 5ЗРОБОРТЕБКА І ІТТОКАЇ ІЗ

Рослини, описані в цьому Прикладі, обробили молекулами а5ЕМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена АТФази, ІАР або МАЮРН 5. ІйШогаїї5, і є тими ж рослинами, які описані в Прикладі 7.

Через 67 діб після обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин, описаних у Прикладі 7, використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Одна рослина від кожної обробки служила в якості джерела живлення для 10 личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня планшетів була покрита вермикулітом.

На Фіг. 12 показаний відсоток мертвих личинок через сім діб годування.

Приклад 24: Обробка насіння проти гену ЕЕ1а4 5РОБОРТЕРА ПІТТОКАЇГ І5

Насіння кукурудзи обробили молекулами а5КМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена

ЕЕРТа 5. ІШогаїїх (Таблиця 33) відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1. Коротко, насіння кукурудзи перед обробкою промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) протягом чотирьох годин.

Потім насіння сушили при 30" С протягом ночі.

Після етапу сушіння використовували Я5КМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 132 мкг/мл.

Обробку виконали шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння пророщували на вологому папері протягом семи діб і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили схожим розчином, що не містить 5КМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних (ЕДТА-контроль).

Через 43 доби опісля обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Рослина Мо 1 служила в якості джерела живлення для 20 личинок, поміщених в коробку 130х170 мм.

Рослина Мо 2 служила в якості джерела живлення для 15 личинок, поміщених в коробку 124 х 95 мм.

Рослина Мо З служила в якості джерела живлення для 8 личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня всіх коробок і планшетів була покрита вермикулітом, і нове листя додавали в міру необхідності.

Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом усього експерименту.

Через вісім діб після початку експерименту з годування вісім личинок з 43 були знайдені мертвими в групі обробки проти ЕНЕТа, і три з 43 личинок були мертві в контрольній групі.

На Фіг. 13А показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 через вісім діб після початку годування.

Зо Через 87 діб після обробки насінини листя рослин Мо 2 і З використали вдруге в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Всього 15 личинок в трьох чашках Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, харчувались кожною рослиною, обробленою проти ЕЕТа, і двома контрольними рослинами (рослини Мо З і 6). На Фіг. 13В показаний відсоток мертвих личинок через п'ять діб після початку експерименту.

Таблиця 33 а5КМА, отримані з гена ЕКЕТа 5. ІШогаїї5 послідовності Мо.:

СТААТАСОАСТСАСТАТАССОСАСААТаСоСТаст ТСАдаааАТИас ААсаттадаСасСАдааААааСАА,аасТаААааТАААТасСсСтТСАТТ саасосстаАдсассСАТОСТаССССсСсТастоасСссСсССАСАаАСАА соссестасатсттоооСТоСАааАСаТАТАСААААТСССТтТаатАТ тастассатассСсатАасасСАпАатТТаАААСТаатТАТССТСААаСо а5ЕМА Ме1 ЕЕТа таатАССАТССЬТСОСТСТтТсСаСССССассСААСАТСАССАСТОадАаИат САДдатотТатапАпаАТасСАССАС,ААастоТоСААаАааасСатТАСс 191 сса,асТаАСААСатТасйтТтсААСаТАААпААСаТтттоСатсСААца датта,аса;атсатасттАса,атсастааТаАСТоСААпААСААСССАС СсСААСОСсССаССасспАТТсАСсАасСАСАааТСАТСИатасСтСААС САСССТааТСААДАТСТСАААСацпсАТАСАСАССТО ТОСТОСАТТОаС САСАСАаСССАСАТТаССТаСААСОТТОССТаТатсоТоСсСтТАТАИаТаА есТСатАТТАС бо

Продовження таблиці 33 СТААТАСОАСТСАСТАТАССОЯАсАсассСАааАААТаватААсас СТ оСТТСАААТАСЯССТОС,СатАТТасСАСАААСТаААасСаТстадас стТаААСатастТАТСАССАТТаАТАТТаСТОТатТапААатТТоапААА СсСасСтАААТАСТАТаТСАССАТТАТТаАСОаАСТОоССО,апАСАСАСАС АТТТСАТСААСААСАТаАТСАСТаЧААССТоССАцСасспАТТаса а5зКМА Ме2 ЕЕТа ССИатТАСТСоАТТатТСОССОСТОС,СтТАССОаТадлдАТттоаАаСастастА 132 тотоаАдАдадАсавАСАаАдсСсСсатадаСсАсастотастоасСтТТТсСА САСТОСОЯаТаТСААдасАаастаата,атаваСаТСААСААААтТасАСТ СсСАСсСТаДасссСССАТАСАаСаААТоСсСса тт тоадасАААТСААаА АапААдатТатостТоСтТАСАТСААСААаАТОСаИатТтТАСААСССАаста статсастттСатАСССАТТТСТаОСОСТааСАСОваАаТтсТосСсСтТАТ да ТтадатСаТтАТТАС Приклад 25: Обробка насіння проти гену бета-актина ЗРОБОРТЕКА ПІТТОКАГІЗ Насіння кукурудзи обробили молекулами а5КМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена бета-актину 5. ІШогаїї5 (Таблиця 34), відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин.

Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі.

Після етапу сушіння використовували азкМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 76 мкг/мл.

Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 С.

Після обробки насіння пророщували на вологому папері протягом семи діб і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, які обробили схожим розчином, що не містить 85ЕМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних (ЕДТА-контроль).

Через 43 доби після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Рослина Мо 1 служила в якості джерела живлення для 20 личинок, поміщених в коробку 130х170 мм.

Рослина Мо 2 служила в якості джерела живлення для 15 личинок, поміщених в коробку 124 х 95 мм.

Рослина

Мо З служила в якості джерела живлення для 8 личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня всіх коробок і планшетів була покрита вермикулітом, і нове листя додавали в міру необхідності.

Смертність і масу тіла гусениць відстежували протягом усього експерименту.

Через вісім діб після початку експерименту з годування три личинки з 43 були знайдені мертвими як у групі обробки проти бета-актину, так і в контрольній групі.

На Фіг. 14 показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 через вісім діб після початку годування.

Таблиця 34 а5зКМА, отримана з гену бета-актину 5. ІШогаїїб послідовності Мо.: СТААТАСаАСТСАСТАТАОССОСАСаААТасСстТоСсавасАтатасСАдаасо сатпсасссассАасадсасса,асоссасассатСсТСсССАТССАТССТ дастосассстоатсАсСсАасасататаатааттаатАатаватСАСААСаа АСТоСТАСОТАааасСадтавааассСсАадаСААаАдаАааТтТАТСОСТСАСО а5ЕМА Ме СстТаААатАССССАТСОСАаСАСааТАТСАТСАССААСТОСИаАСаИаАСАТ бета-актину ваАпААаАТоТаасСАССАСАССТТСТАСААССЯЯАаСстТасаСатСасСоссСіІ 133 стадааААСсАСсСсСсАХатсстСстадсталаастсссСтТСААСССТАдО ВсССААСАцасАпААдаАТаАСССАпАТСАТаТТтТаАпАССТТСААСТО ссссассСАТтатАСсатсасСссАТоСсАааоастатастттстТатТАСсаТсст стасвтоатАССАСССЯСТАТССЯТОСТОСАСТОСОСТаАтТаататстос САСАСССТТСТОССТАТАС ТАС ТСИаИатАТТАС Приклад 26: Обробка насіння проти гену МАОРН 5РОБОРТЕВА ПІТТОВАГІЗ Насіння кукурудзи обробили молекулами 45КЕМА (5ЕО ІЮ Мо. 26), які мали нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену МАОРН 5. Ійогаїї5, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Коротко, насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин. Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі. Після етапу сушіння використовували а5зеМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 154 мкг/мл. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 "С. Після обробки насінини пророщували на вологому папері протягом семи діб і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, які обробили схожим розчином, що не містить О5КМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних (ЕДТА-контроль). Через 43 доби після обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Рослина Мо 1 служила в якості джерела живлення для 20 личинок, поміщених в коробку 130х170 мм. Рослина Мо 2 служила в якості джерела живлення для 15 личинок, поміщених в коробку 124х95 мм. Рослина Мо З служила в якості джерела живлення для 8 личинок, поміщених в чашку Петрі. Поверхня всіх коробок і планшетів була покрита вермикулітом, і нове листя додавали в міру необхідності. Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом усього експерименту. Через вісім діб після початку експерименту з годування три личинки з 43 були знайдені мертвими як у групі обробки проти МАОРН, так і в контрольній групі. На Фіг. 15А показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 через вісім діб після початку годування. Через 91 добу після обробки насінини листя рослини Мо 2 використовували вдруге в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Всього 15 личинок в трьох чашках Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, харчувалися рослиною, обробленою проти МАЮОРН. Ще 15 личинок в трьох чашках Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, харчувалися контрольною рослиною. На

Фіг. 158 показаний відсоток мертвих личинок через сім діб після початку експерименту. У групі обробки проти МАОРН 9 з 15 личинок були мертві, а в контрольній групі 2 з 15 личинок були мертві. Приклад 27: Обробка насіння проти генів ІАР, АТФази І МАОРН 5РОБОРТЕРБКА І ІТТОКАЇ ІЗ Зо Насіння кукурудзи обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, молекулами азеЕМА (ЗЕО ІЮ Мо. 34), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена ІАР 5. ІШогаїї5, або розчином, який містить суміш О5ЕМА (ЗЕО ІЮ Мо 34, 25, 26 і 31), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів генів ІАР, МАОРРН і АТФази 5. ІШогаїї5. Ці два розчини спочатку використовували для обробки насіння, описаної в Прикладі 7, і потім використовували в даному експерименті. Насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин. Потім насіння сушили при 30 С протягом ночі. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 24 годин в темній камері росту при 15 "С. Після обробки насінини сушили протягом ночі при 30 "С, висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, які обробили схожим розчином (ЕДТА), що не містить а5ЕМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних. Через 27 діб після обробки насінини листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Всього 24 личинок в трьох чашках Петрі, що містять по вісім личинок кожна, використовували для кожної обробки. Один повтор для обробки проти ІАР містив дев'ять личинок. При кожному повторі для годування використовували одну рослину, а через три доби експерименту в чашку додавали другу рослину з тієї ж обробки. Смертність і масу тіла гусениць відстежували протягом усього експерименту. На Фіг. 16А-В показана середня маса живих личинок 5. ІЩогаїї5 через шість діб після початку експерименту з годування. Приклад 28: Обробка насіння проти гену ЕЕ1а ЗРОБОРТЕКА ПІТТОКАГІ5 Насіння кукурудзи обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, двома молекулами а5ЕМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ЕЕТса 5. ІЩШогаїї5 (Таблиця 33). Коротко, насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин. Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі. Дві послідовності ОБКМА (5ЕО ІО Мо. 131 і ЗЕО ІО Мо. 132) використовували роздільно в двох різних обробках насіння; кожна в кінцевій концентрації 67 мкг/мл а5КМА, розведеної 0,1 мМ ЕДТА. Обробку виконували шляхом бо обережного збовтування насіння в розчині протягом 24 годин в темній камері росту при 15 С.

Після обробки насіння сушили при 30 "С протягом ночі і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25"С зі світлоперіодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, які обробили молекулами а5ЕМА, що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ОМ/Е1 кукурудзи (Таблиця 35) (44 мкг/мл для ЮОУМЕ1Т Ме1 (5ЕО ІЮО Мо. 134) і 51 мкг/мл для ЮМУЕТ Ме2 (ЗЕО ІЮ Мо. 135)), проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості двох роздільних контролю. Через 35 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Дві рослини від кожної обробки і від контролю ЮУМЕТ Мо1 включили в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в дві чашки Петрі, що містять по 10 личинок кожна, в сумі 40 личинок, що харчувалися листям від кожної обробки насіння. Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом усього експерименту. Через дев'ять діб після початку експерименту з годування чотири личинки з 40 були знайдені мертвими в групі обробки проти ЕЕРТа Ме2 і в контрольній групі. Шість личинок з 40 були знайдені мертвими в групі обробки проти ЕЕТа Ме1. На фіг. 17А показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 через дев'ять діб після початку експерименту з годування. Через 36 діб після обробки насіння інші рослини від тієї ж обробки насіння проти ЕРТамМеї і ОМУЕ1 Мо1 використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. П'ятнадцять рослин від обробки були включені в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по 5 личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і в сукупності 225 личинок. Через дві доби експерименту рослина Мо 15 була замінена рослиною Мо

8. Дві рослини з контрольної групи були включені в експеримент з годування. Листя кожної контрольної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по 5 личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і 30 личинок в сукупності. Масу тіла личинок відстежували в процесі всього експерименту. На Фіг. 17В показана середня маса личинок 5. ІШогаїїє через п'ять діб годування. Таблиця 35 Контрольні а5КМА, отримані з гену ОМУЕ кукурудзи послідовності Мо.: СТААТАСВАСТСАСТАТАСССАС ТИ ТСААСАТасСаИатСАСАТААССАСІАС СстТАССсТассСААтТаАдАссттассстасаватостоаСсСсаластоадсса АсССстТсАСТОПТТОСТасасСтТаАТСААСсатТАСа,аасСАтоавАа,асавАастТ СстТоАССТСОТАТОСССТТ ТТОоТоСОаАСАСССОСТТОтТсСССсСАТаСсСАСаТттат тотсасАдаАдтаасссасатсатсАаАдасСсСсАССААапАСААСаАаИТтАСТо а5ЕМА Ме таАССТТТСТАТОСААТТОССТОСТоССАпСасААСАСТОСИЯСТТОоСТТ ПМУЕ атоТСстТасСсАСаАСаАТСААХасСстТаАТОСССАТСААСаОсАсСТАСАТИААОаСТСА| 134 ССТАСАСТОСАаТСААаасвсава т СсТАААл,ааАлаАаАтсаСсасСАааЙссСстТАСа саеаалдтсттсастосадасадлссатадссСааСААдАдастосстТаАсСтТ тпаттаАдда,ааАтТааТатТАСАСАсаАсА,аСсцпСАа,ваа,атТаТСАТаАТаАСаС ссататАСастТСОаАААаААдпА,васСи,ААдаААаААа,асасСААСААСаАТСА дстасатассатестаа тала т СстТАССТСТОССТАТАСТа даТСатАТТАС СТААТАСВАСТСАСТАТАСССЗАССьКСОСОСА СТ ТатапАаТАСАТСССОАС сАсасАатАСТАССАССааСАСАСсССЯСЯтеасстатастаскАдасааА дасталдтостасссттсвсаеасСсаАдссАаатстастсаааттостастас сстаастаАтТаСсСАССсаААдастатосстастадда,ааСаАдсосСАасвас сАааСтТАТСАЧИСААСТАСТАССАСПАСААССАТаТаАТОСАсСОАСАТОИА а5ЕМА Ме? ставатасСсастатАСсААХаааттасасАатасастача,аттсатасАсса ПМУЕ СсаАаАтТапАасатататосттата,аста7атасссСстСАССсСасСтТатАСАА | 135 сстасссатаАдАдаАаСадлтаататАссСсасАнасстасваттсаАасСАСс дасАСАсасАаасасвАаСасвсАастТАСасСАСАаАтаТатСАСа,адсата саса,атТатТАСТАСОСССССЯвасвсассвсатасталасасасацА;ацАатТСАА саасасссааастатасАасАаааставааСсАаатаастаАатоаАсаААСс АСсАаСтТАССсСАаСсСсасалатасассвататсосадаСстаААСаАадАасАс тоСстТатстоСсСтТАТАСТаАаТСаИтАТТАС Через 71 добу після обробки насіння листя оброблених проти ЕРТа Ме2 і контрольних ОМ/Е1

Ме2 рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Десять рослин з групи обробки були включені в експеримент з годування, з яких дві рослини були перевірені вдруге (див.

Фіг. 17А) і вісім рослин були перевірені в перший раз.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і 150 личинок в сукупності.

Дві рослини з контрольної групи, які раніше не перевіряли, були включені в експеримент з годування.

Листя кожної контрольної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і 30 личинок в сукупності.

Через вісім діб експерименту неочіковано велика кількість личинок була знайдена мертвими в групі обробки і в контрольній групі.

Тому далі аналіз не проводили.

Приклад 29: Обробка насіння проти гену АТФази БРОБОРТЕКА ПІТТОБКАЇ ІЗ

Насіння кукурудзи обробили молекулами 45КМА (5ЕО ІЮ Мо. 31), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену АТФази 5. ІШогаїї5, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Коротко, насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин.

Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі.

Після етапу сушіння використовували азкМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 145 мкг/мл.

Розчин Ю5ЕМА, містив суміш необроблених молекул а5КМА і оброблених фенолом молекул а5КМА, як вказано в Прикладі 1. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 24 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння сушили при 30 "С протягом ночі і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, які обробили а5КМА (5ЕО ІЮ Мо. 20) в концентрації 67 мкг/мл, отриманої з послідовності 505, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через 56 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Десять рослин від обробки були включені в експеримент з годування.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, крім рослин Мо З і 14, які були поміщені разом з однієї й ті ж чашки.

Всього перевірили 15 личинок на одну рослину і 135 личинок в сукупності.

Дві рослини з контрольної групи були включені в експеримент з годування.

Листя кожного контрольного

Зо рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і 30 личинок в сукупності.

Через дванадцять діб годування 12 з 135 личинок були знайдені мертвими в групі обробки проти АТФфази, і 21 з 30 личинок були знайдені мертвими в контрольній групі.

На Фіг. 18А показаний відсоток мертвих личинок через 12 діб після початку експерименту.

Через 57 діб після обробки насіння інші рослини з тих же обробленої та контрольної груп використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Чотирнадцять рослин з групи обробки були включені в експеримент з годування.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, крім рослин Мо 13 і 4, які були поміщені разом в одні чашки, і рослин Мо 10 і 19, які були поміщені разом в одні чашки (рослини 4 і 10 аналізували вдруге, див.

Фіг. 18А). Були перевірені всього 15 личинок на одну рослину і 180 личинок в сукупності.

Дві рослини з контрольної групи були включені в експеримент з годування.

Листя кожної контрольної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину і 30 личинок в сукупності.

Через чотири доби після початку годування 29 личинок з 180 були знайдені мертвими в групі обробки проти АТФази, і 29 личинок з 30 були знайдені мертвими в контрольній групі.

На Фіг. 188 показаний відсоток мертвих личинок через чотири доби після початку експерименту.

Приклад 30: Обробка насіння проти гену ЕЕ1а4 5РОБОРТЕРА ПІТТОКАЇГ І5

Насіння кукурудзи (вар.

Мімапі) обробили молекулами 45ЕМА (5ЕО ІЮ Мо 131 їі 132), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ЕЕТа 5. ІШогаїї5, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Використовували суміш 25 мкг/мл кожної з двох а5КМА.

ЮО5КМА розбавили тільки 0,1 мМ ЕДТА, або додатково змішали з 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок (ПМВН). Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 4 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили 50 мкг/мл а5КМА, отриманої з послідовності ЗФБ (ЗЕО ІЮ Мо. 124), або схожим розчином, що не містить 45ЕМА, з або без 40 мкг/мл ПЕГ- модифікованих вуглецевих нанотрубок, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

60 Через 24 доби після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Десять рослин з групи обробки проти ЕНРТа, дві рослини з групи ЗФБ-контролю, одна рослина з групи ЕДТА-контролю і одну рослину з групи ЕДТА/ПМВН-контролю були включені в експеримент з годування.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину, 150 личинок для обробки проти ЕЕТа, 30 личинок для ЗФБ-контролю і 15 для обох груп ЕДТА-контролю.

На Фіг. 19А показана середня маса личинок 5. Ійогаїї5 після десяти діб годування.

Через 25 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Тринадцять рослин з групи обробки проти ЕЕТа/ПМВН, дві рослини з ЗФБ/ПМВН-контролю, одна рослина з ЕДТА/ПМВН- контролю і одна рослина з ЕДТА-контролю були включені в експеримент з годування.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину, за винятком рослини 9 в групі ЕЕТа/ПМВН, де аналізували тільки дві чашки.

Перевірили всього 190 личинок для обробки проти ЕРЕТа/ПМВН, 30 личинок для

ЗФБ/ПМВН-контролю і 15 личинок для обох груп ЕДТА-контролю.

Через сім діб експерименту з годування рослина 1 з групи ЕЕТа/ПМВН була замінена рослиною 6 з тієї ж групи.

На Фіг. 198 показана середня маса личинок 5. ІЖогаїї5 після десяти діб годування.

Для того, щоб визначити рівні експресії ЕЕТа в личинках після десяти діб годування обробленими рослинами, кожен повтор (чашку) з п'ятьма личинками з'єднали, і екстрагували повну РНК. кДНК приготували,

використовуючи оліго-4Тї праймери (ЗЕО ІО Мо 136-143), і рівень експресії МРНК ЕРтТа 5. ІЩЖогаїїх визначили в оброблених і контрольних личинках за допомогою ПЛР в реальному часі з барвником 5УВЕ сСгееп (компанія Оцапіа Віозсіепсе5), використовуючи актин і АТФазу в якості нормалізаторів.

Ніякої істотної зміни в рівнях експресії ЕЕТа (критерій Уілкоксона, р- значення»0,05) не спостерігалося.

Через 61 добу після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин знову використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Тринадцять рослин з групи обробки проти ЕЕТа/ПМВН і три рослини з ЗФБ/ПМВН-контролю були включені в експеримент з годування.

Деякі рослини з групи ЕЕТО/ПМВН були перевірені в перший раз і деякі були перевірені вдруге (див.

Фіг. 198). Три рослини з ЗФБ/ЛМУН-контролю були перевірені в перший

Зо раз.

Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину, за винятком рослини 8 в групі ЕЕТа/ПМВН, де аналізували тільки дві чашки.

Всього перевірили 190 личинок для групи ЕЕТО/ПМВН і 45 личинок для ЗФБ/ПМВН-контролю.

Через дванадцять діб експерименту несподівано велика кількість личинок була знайдена мертвими в групі обробки і контрольній групі.

Тому з цього моменту аналіз більше не проводили.

Приклад 31: Обробка насіння проти гену ЕЕ1а4 5РОБОРТЕРА ПІТТОКАЇГ І5

Насіння кукурудзи (вар.

О10КО2) обробили молекулами а5ЕМА (ЗЕО ІЮО Мо 131 і 132), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ЕЕТса 5.Ійогаїї5, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Використовували суміш з 25 мкг/мл кожної з двох ахЗеЕМА.

О5КМА або розбавили тільки 0,1 мМ ЕДТА, або додатково змішали з 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок (ПМВН). Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 4 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили 50 мкг/мл а5ЕМА (5ЕБО ІЮ Мо. 20), отриманої з послідовності (ЗО5, з/без 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через вісім діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Тринадцять рослин від обробки проти ЕЕТа, тринадцять рослин від обробки проти ЕЕТо/ПМВН, десять рослин з 5О5- контрольних і чотири рослини з ЗО5/ЛМВН контрольних були включені в експеримент з годування.

Листя кожної рослини помістили в дві чашки Петрі, покриті 1 95 агаром.

Кожна чашка містила три личинки, у сумі шести личинок на одну рослину, 78 личинок для обох обробок ЕР1а і ЕЕтТа/ПМВН, 60 личинок для ЗФБ-контролю і 24 для ЗО5Б/ЛМВН-контролю.

Масу тіла личинок реєстрували через чотири доби після початку годування.

На Фіг. 20А-В показана середня маса личинок 5. ІШогаїї5 в контрольній та обробленій групах.

Приклад 32: Обробка насіння проти генів ІАР, АТФази І МАОРН 5РОБОРТЕРБКА І ІТТОКАЇ ІЗ Рослини томату, вирощені з насіння томату, описані у Прикладі 7, які обробили молекулами а5КМА (5ЕО ІО Мо 34, 35, 25 і 26), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична бо або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ІАР, гену АТФази або гену МАОРН 5. Ійогаїї5 далі досліджували для контролю 5. ІНогаїївб.

Через 48 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Одна рослина від кожної обробки служила в якості джерела живлення для семи личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня всіх планшетів була покрита вермикулітом.

Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом усього експерименту.

Через три доби експерименту одна личинка була знайдена мертвою в групі обробки проти ІАР, і дві личинки були знайдені мертвими в групі змішаної обробки.

Протягом наступної доби до дня 7 подальших смертей не було.

На Фіг. 21 показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 після трьох і семи діб годування.

Приклад 33: Обробка насіння проти генів бета- актину, АТФази | МАОРН ЗРОБОРТЕКА ПТТОВАГІ5

Насіння томату обробили молекулами а5ЕМА (5ЕО ІЮ Мо 133, 31, 25 і 26), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену бета-актину 5. ІШЩШогаїї5 (див.

Таблиця 34), гену АТФази або гену

МАОРН, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1. Використовували а5КМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 96 мкг/мл для бета-актину, 73 мкг/мл для АТФази і 164 мкг/мл для МАЮРН.

Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння проростили в грунті і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили схожим розчином (ЕДТА), що не містить а5зКМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через 42 доби після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Використовували рослини Мо 1 і 2 від обробки проти бета-актину і проти АТфФази і рослини Мо 21 і 23 від обробки проти

МАОРН.

Рослини від кожної обробки служили в якості джерела живлення для п'яти личинок, поміщених в чашку Петрі.

Поверхня всіх планшетів була покрита вермикулітом.

Масу тіла личинок відстежували в процесі всього експерименту.

На Фіг. 22 показана середня маса личинок 5. ІШогаїї5 після чотирьох діб годування.

Приклад 34: Обробка насіння проти гену АТФази БРОБОРТЕКА ПТТОКАЇГ І

Зо Рослини томата, описані в цьому Прикладі, отримані з насіння, оброблених Я5КМА проти АТФази як у Прикладі 33, вище.

Через 85 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин, описаних у Прикладі 33, знову використовували як єдине джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Використовували одну рослину від обробки проти АТФази і одну рослину з контрольних.

Листя від цих рослин помістили в три чашки Петрі, по п'яти личинок в кожну.

Через три доби експерименту ще одну рослину з оброблених і ще одну рослину з контрольних додали у відповідні чашки.

Масу тіла личинок відстежували в ході всього експерименту.

Оскільки на початку експерименту з годування личинки з контрольної групи були на 30 95 меншими ніж личинки, що харчувалися обробленими рослинами, реєстрували масу личинок щодо їх початкової маси.

На Фіг. 23А показана відносна маса личинок 5. ІШогаїйє після шести діб годування.

Через 88 діб після обробки насіння інші рослини від тієї ж обробки насіння використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїїє.

Використовували три рослини від обробки проти АТФази і дві рослини з контрольних.

Листя від цих рослин помістили в три чашки Петрі,

по п'ять личинок в кожну.

Смертність і масу тіла личинок відстежували протягом усього експерименту.

Після годування протягом п'яти діб 4 з 15 і 1 з 15 личинок були знайдені мертвими в групі АТФази і контрольній групі, відповідно.

На Фіг. 238 показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 після п'яти діб годування.

Приклад 35: Обробка насіння проти гену МАОРН 5БРОБОРТЕКА ГІТТОКАГІЗ

Рослини томату, описані в цьому Прикладі, отримані з насіння, оброблених 85ЕМА МАОРН з Прикладу 33, вище.

Через 95 діб після обробки насіння листя оброблених і контрольних рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Використовували дві рослини від обробки проти МАЮОРН (раніше не перевірялись) і набір рослин з контрольних.

Листя від цих рослин помістили в три чашки Петрі, по п'ять личинок в кожну.

Масу тіла гусениць відстежували в процесі всього експерименту.

На Фіг. 24А показана середня маса личинок 5. ІЩогаїїє після чотирьох діб годування.

На четвертий день контрольні рослини були замінені рослинами, які були пророщені з насіння, обробленого проти гена АЕК8 томату.

Це насіння обробили сумішшю двох д5КМА-послідовностей (5ЕО ІЮ Мо. 25 і 26) в кінцевій концентрації 200 бо мкг/мл (100 мкг/мл кожної а5КМА) протягом 24 годин.

На шостий день додали ще одну рослину до кожної з двох рослин, оброблених проти МАОРН. На Фіг. 248 показана середня маса личинок

5. ІШогаїї5 через сім діб після початку експерименту з годування. Приклад 36: Обробка насіння проти генів, що не належать до ЗРОБОРТЕКА ІП ІТТОКАЇГ ІЗ Рослини кукурудзи, описані в цьому Прикладі, отримані з насіння, оброблених як у Прикладі 28 (05ЕМА Мо2 ЮМУЕ1, ЗЕО ІЮ МО: 135) і в Прикладі 29 (505, ЗЕО ІЮ МО: 20). Через 69 діб після обробки насіння листя пророслих рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Дві рослини від обробки О5КМА Ме2 БУМЕ1 і п'ять рослин від обробки 305 були включені в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину, 30 личинок для обробки ЮО5ЕМА Ме2 ЮУМЕ1 і 75 личинок для обробки зИ5. Через десять діб експерименту несподівано велика кількість личинок були знайдені мертвими в обох обробках. Через велику кількість смертей в обох групах обробки в цей момент часу експеримент був припинений. Через 70 діб після обробки насіння інші рослини від тих же обробок використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Дві рослини від обробки О5ЕМА Ме2 ОМУЕ1 і 16 рослин від обробки 305 були включені в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в три чашки Петрі, що містять по п'ять личинок кожна, в сумі 15 личинок на одну рослину, ЗО личинок для обробки ЮУУЕ1 азЕМА Ме2 і 240 личинок для обробки 5И5. Через дев'ять діб експерименту несподівано велика кількість личинок були знайдені мертвими в обох обробках. Через велику кількість смертей в обох групах обробки в цей момент часу експеримент був припинений. Приклад 37: Обробка насіння проти генів АТФази, ЕЕТа4 І МАОРН 5РОБОРТЕКА ПТТОВАГІ5 Насіння кукурудзи (вар. Мімапі) обробили молекулами Я5ЕМА (5ЕО ІЮО Мо: 131, 132, 31, 251 26), що мають нуклеотидну послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гену ЕЕТа, гену АТФази або гену МАЮОРН 5. Іногаїїв5, відповідно до протоколу, описаного в Прикладі 1, без промивання перед обробкою. Дві а5ЕМА ЕРтТа використовували роздільно. Використовували а5КМА, розбавлену 0,1 мМ ЕДТА, в кінцевій концентрації 160 мкг/мл. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в Зо розчині протягом 2 годин в темній камері росту при 15 "С. Після обробки насіння швидко промили ДДВ, висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, яке обробили 160 мкг/мл азеЕМА (ЗЕО ІЮ Мо.: 124), отриманої з ЗФБ-послідовності, або схожим розчином, що не містить азКМА (ЕДТА) проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних. Через 31 добу після обробки насіння листя пророслих рослин використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Личинки, взяті для цього експерименту, мали вік до п'яти годин (тобто до п'яти годин після виведення). Шість рослин від кожної обробки були включені в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в 16 лунок 24-лункового планшета, що містять одну личинку в кожній лунці, в сумі 16 личинок на одну рослину і 96 личинок на одну обробку. Поверхню лунок покрили 1 95-й агарозою. Через вісім діб після початку годування 57 личинок були знайдені мертвими в групі обробки проти АТФази, і 42 личинки були знайдені мертвими в групі обробки проти МАОРН. Кількість мертвих личинок в інших групах становила від 13 до 23. Середня кількість мертвих личинок на шести рослинах, оброблених проти АТФази, була значно більша ніж середня кількість мертвих личинок на шести рослинах ЗФБ-контролю при р-значенні 0,03 (і-критерій). Подібно до цього, середня кількість мертвих личинок на рослинах, оброблених проти МАОРН, була більшою ніж середня кількість мертвих личинок на рослинах ЗФБ-контролю (І-критерій, р-значення - 0,07). На Фіг. 25А і В показаний відсоток мертвих личинок через вісім діб після початку годування. На Фіг. 25С і 0 показаний відсоток мертвих личинок через десять діб після початку годування. На Фіг. 25Е показана середня маса живих личинок 5. ІЩШогаїї5 через 11 діб після початку експерименту з годування. Через 32 доби після обробки насіння інші рослини від тієї ж обробки насіння використовували в якості єдиного джерела живлення для 5. ІШогаїї5. Личинки, взяті для цього експерименту, мали вік до 24 годин. Від п'яти до семи рослин від кожної обробки були включені в експеримент з годування. Листя кожної рослини помістили в 16 лунок 24-лункового планшета, що містять по одній личинці кожна, в сумі 16 личинок на одну рослину, 80 личинок для ЕДТА, 96 личинок для ЗФБ і АТФази і 112 личинок для МАОРН і для двох обробок проти ЕЕТа. Поверхня лунок була покрита 1 95-й агарозою. Масу тіла личинок реєстрували через вісім і дев'ять діб після початку годування; деяких личинок, що харчувалися підгрупою рослин, реєстрували на 60 восьмий день та інших личинок реєстрували на дев'ятий день. На Фіг. 25Е показана середня маса живих личинок 5. ІШогаїї5 на одну рослину. Приклад 38: Обробка насіння, направлена на шкідників ряду СОГЕОРТЕКА Цей Приклад ілюструє варіанти здійснення, які не обмежують способу отримання рослини, що має підвищену стійкість до шкідника ряду СоІеорієга, що включає етап вирощування рослини з насінини, яка контактувала з екзогенною нетранскрибованою а5КМА, причому вказана рослина має поліпшену стійкість до вказаного шкідника в порівняні з рослиною, вирощеної з насінини, що не контактувала з вказаною а5КМА. Більш конкретно, цей Приклад ілюструє спосіб отримання рослини кукурудзи, що має підвищену стійкість до кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса 5р.), включаючи етап вирощування рослини кукурудзи з насінини кукурудзи, яке контактувало щонайменше з одною азЕМА, розробленої для сайленсінгу гена- мішені, ендогенного для кукурудзяного кореневого жука, причому ця рослина кукурудзи, яка виросла з насінини кукурудзи має поліпшену стійкість до кукурудзяного кореневого жука в порівнянні з рослиною кукурудзи, що виросла з насінини кукурудзи, яка не контактувала з а5АМА. Тригер азКМА з 0228 пар основ 3 послідовністю смислового ланцюга сасСтаАТАаСАСТТАДапАасСТССТААТСАССАААЧААтТтотТасСАаасАТТ тТАСТТАТаСАСАТАСТОАСАС,ТАСТОТОТаСтТОСтТаАСТТАПАдаТтосСасАА СААвАСТТТААаТтСТАассстТаААТТАаТСТСОТТСАСО,апААСАТАСПСААаА ААТаСТАТТАСТАТТААСААДАааАдАа ТадаТААААСаатАпАСАаТаААСАТИАаСпСАТАСАСИАА АСТАСАСИС (МОМ104454, 5ЕБЕО ІО Мо: 144) був перевірений шляхом аналізу інвазії кукурудзяного кореневого жука в рослини кукурудзи, вирощені з насіння, яке контактувале перед проростанням з тригером а5КМА. Насіння кукурудзи (70 насінин, сорт І Н244) помістили в 50-мл пробірку типу Раїсоп з 35 мл розчину тригера а5ЕМА в буфері (0,1 мМ ЕДТА, розведеного від концентрації 0,5 М з рН 8) або 35 мл тільки буфера в якості нульового контролю і інкубували в темноті при 15" С при слабкому перемішуванні протягом 8 годин. Насіння трансгенної рослини кукурудзи, яке експресує конструкт супресії РНК, націлений на Юму5пі7 і яке має стійкість до кукурудзяного кореневого жука, використовували в трансгенному позитивному контролі і також інкубували перед проростанням в 35 мл тільки буфера. Юм5пі7 - це ортолог Зпі7 з Оіабгоїйїса мігоітега мігдіїега (західний кукурудзяний жук, ЗКЖ), який є компонентом комплексу ЕЗСКТ-ПЇІ Зо (ендосомний сортуючий комплекс, необхідний для транспорту), див. ВоіІодпевбі еї аї. (2012) РІ о5 ОМЕ 7 (10): е47534, дої: 10,1371/ЛоигпаІ.ропе.0047534. Наступного дня насіння тричі промили (кожна промивка по 1 хвилині при слабкому перемішуванні) в достатній кількості води для того, щоб наповнити пробірку типу Раісоп. Промите насіння посіяли на глибину 1,25 см в 15-см поліетиленові горщики з закритим дном, наповнені грунтом Меїготіх 200. У всіх обробках проросло більше 85 95 насіння. На стадії М2//3 (приблизно через 2 тижні після посіву) 50 новонароджених личинок Оіаргоїїса мігдїега мігдаїїега додали в кожен горщик (виконали 12-15 реплік). В якості трансгенного позитивного контролю використовували рослини кукурудзи, що експресують рекомбінантний трансген 5пі7 і також використовували личинки Оіаргоїйса мігдітега мігдаіїега. Через приблизно 4 тижні личинки ізолювали, використовуючи воронку Берлезе, підрахували і зважили. Вирахували виживаність і масу личинок. Результати представлені на Фіг.

26. Виживаність личинок на одну рослину істотно не відрізнялась між личинками, що харчувалися рослинами кукурудзи, вирощеними з насіння, обробленого тригером й5КМА в концентрації 50 частин на мільйон (мкг/мл), і личинок, що харчувалися контрольними рослинами (Фіг. 26А), але сукупна маса личинок (Фіг. 268) і середня маса личинок (Фіг. 26С) були значно нижче у личинок, що харчувалися рослинами кукурудзи, вирощеними з насіння, обробленого тригером а5КМА в концентрації 50 частин на мільйон (мкг/мл), в порівнянні 3 личинками, що харчувалися контрольними рослинами. Рослини, вирощені з насіння, обробленого тригером а5КМА в концентрації 500 частин на мільйон, показали уповільнений ріст рослин і коренів, що могло вплинути на результати, що спостерігалися; тим не менш, виживаність личинок на одну рослину була значно нижчою (Фіг. 26А), і сукупна маса личинок (Фіг. 268) і середня маса личинок (Фіг. 262) були значно меншими у личинок, що харчувалися рослинами кукурудзи, вирощеними з насіння, обробленого тригером а5КМА в концентрації 500 частин на мільйон (мкг/мл), у порівнянні з личинками, що харчувалися контрольними рослинами. Аналізи за допомогою Оцапіїбепе не детектували значної кількості РНК МОМ104454 в тканині листя або коріні рослин кукурудзи, вирощених з насіння, обробленого тригером д5ЕМА в концентрації 500 частин на мільйон. Схожий експеримент провели на рослинах томата, вирощених з насіння, обробленого перед проростанням шляхом інкубації протягом ночі в тригері а5ЕМА з 279 пар основ з тупими кінцями в концентрації 100 частин на мільйон (мкг/мл) з послідовністю смислового ланцюга во тАСсСТатасстоТтСАСАаа,САасСОоААаАатаатАсСсаттАалаттаасСАТАСИААТАСАСАСАС

АТТАСАСААТТаТтТттТаААТТАТОССТТОСсАСАСАСТатТаваАССАТТТа т ТаСТттТаАдАааСсатТтоСаА АТААТаОТТОототасасТтАТтТаАСсСАсСааСАаТАТАТТАИТаАААсСТТасААСАСААаААССвасА аттАаТтАТасАТаСсСсАа,атТасоааТААААТААТттапасСААдпаСАСТоа,аАТТАСААСААасСтТААТ таддсасасСстассСАпААса (16593, ЗЕО ІО Мо.: 145) і виконали аналіз на інвазію І ерііпоїагза десептіїпеава (колорадський картопляний жук, КЖ). Контрольні рослини обробили або буфером ("композиція") або тригером а5КМА для зеленого флуоресцентного білка (З3ФБ). Коефіцієнт проростання склав» 9095, і не спостерігалося жодних очевидних впливів на зростання оброблених рослин в порівнянні з контрольними рослинами. Не спостерігалося ніякого істотного впливу на коефіцієнт дефоліації рослин томата (Фіг. 27А), або на життєздатність личинок (фіг. 278), або на середню масу личинок (Фіг. 27С) рослин, оброблених або азхеЕМА Т6593 або азеЕМА ЗФБ, у порівнянні з контрольними рослинами. Аналізи Оцчапіїзепе не детектували будь-яку значущу кількість РНК 76593 в проаналізованих тканинах (молодий лист, старий лист, сім'ядоля, корінь) рослин томата, вирощених з насіння, обробленого тригером 85ЕМА 16593 в концентрації 500 частин на мільйон. Приклад 39: Обробка насіння, направлена на суттєві гени шкідників ряду СОЇ ЕОРТЕКА Цей Приклад ілюструє варіанти здійснення, які не обмежують способу отримання рослини, що має підвищену стійкість до шкідника ряду СоІеорієга, що включає етап вирощування рослини з насінини, яка контактувала з екзогенною нетранскрибованою а5КМА, причому вказана рослина має поліпшену стійкість до вказаного шкідника в порівняні з рослиною, вирощеної з насінини, що не контактувала з вказаною а5КМА. Більш конкретно, цей Приклад ілюструє спосіб отримання рослини кукурудзи, що має підвищену стійкість до кукурудзяного кореневого жука (Оіабгоїїса 5р.), включаючи етап вирощування рослини кукурудзи з насінини кукурудзи, яка контактувала щонайменше з одним полінуклеотидним тригером, розробленим для сайленсінгу гена-мішені, ендогенного для кукурудзяного кореневого жука, причому рослина кукурудзи, пророщена з цієї насінини кукурудзи, має поліпшену стійкість до кукурудзяного кореневого жука в порівнянні з рослиною кукурудзи, вирощеною з насінини кукурудзи, що не контактувала з цим полінуклеотидним тригером. Отримано тригери дволанцюгової РНК (й5КМА) для генів-мішеней, зазначених в Таблиці 36. Відповідні тригери мають довжину 21-1000 пар основ; в деяких варіантах здійснення 21-50, 50- Зо 100, 100-200, 200-500, 500-700 або 700-1000 пар основ. Тригери, представлені в Таблиці 36, мають довжину 173-504 пар основ, але для способів, розкритих в даному документі підходять більш коротші або більш довші тригери. Встановлено, що всі тригери а5ЕМА, представлені в Таблиці 36, викликали істотне уповільнення росту і смертність личинок при концентрації 10 частин на мільйон і 0,1 частини на мільйон в біологічному аналізі раціону для Оіаргоїїса мігдітега мігдітега (західного кукурудзяного жука, ЗКЖ), як вказано в робочих прикладах в опублікованій патентній заявці США Мо 2009/0307803, які включені в даний документ шляхом посилання, і в яких тригер аО5КЕМА нанесений як покриваючий шар на поверхню твердого раціону для комах в 9б-лунковому планшеті. Таблиця 36 Тригери О5АМА

Ід. Ме Довжина ЗЕО ІО МО. тригера тригера Ген-мішень ГЕНА- (пар основ) МІШЕНІ путативна поліаденілювання поліаденілювання поліаденілювання

Продовження таблиці 36 транспортера глюкози путативна путативна як (8 значне уповільнення росту або смертність в порівнянні з обробленим водою контролем; (-) відсутність значного уповільнення росту або смертності у порівнянні з обробленим водою контролем; МТ - (1) тригер не перевіряли, або (2) відбулися наступні 2 події:

проба не показала значного уповільнення росту/смертності, і позитивний контроль не показав значного уповільнення росту/смертності в даному тесті.

Позитивним контролем в даному аналізі була а5ЕМА з послідовністю, раніше розкритою як ЗЕО ІО МО.: 880 в патенті США Мо 7,943,819.

Тригери тупокінцевих дволанцюгових РНК (а5КМА) для кожної з послідовностей тригерів з Таблиці 36 синтезували і перевірили шляхом аналізу інвазії кукурудзяного кореневого жука в рослини кукурудзи, вирощені з насіння кукурудзи, перед проростанням за допомогою окремого тригера а5КМА, як вказано вище в Прикладі 38, використовуючи личинок Оіарбгоїїса мігдітега мігоїтега, причому аналізували смертність чи уповільнення росту личинок внаслідок контакту з полінуклеотидними тригерами або їх поїдання.

Тригери, які за отриманими даними були ефективними для уповільнення росту або смертності личинок перевіряли далі.

Передбачається, що способи, в яких використовується комбінація визначених полінуклеотидних тригерів відповідно до поданих варіантів здійснення (наприклад, тригерів а5КМА, описаних у даному документі) з одним або декількома неполінуклеотидними пестицидами, забезпечать сенергетичне поліпшення в запобіганні або боротьбі з інвазією комах в порівнянні з ефектом, що отримується за допомогою тільки полінуклеотидних тригерів або тільки неполінуклеотидного пестициду.

В одному варіанті здійснення рослини кукурудзи, які мають підвищену стійкість до інвазії кукурудзяного кореневого жука, вирощені з насінини, що мають у їх геномі послідовність рекомбінантної ДНК, яка кодує неполінуклеотидний пестицид, причому перед пророщуванням насінини вводять в контакт з ефективною кількістю полінуклеотидного тригера.

Біологічні аналізи, такі як аналіз інвазії кукурудзяного кореневого жука, описані в даному документі, підходять для визначення дози-ефекту для смертності або інгібування росту личинок при використанні комбінацій з полінуклеотидних тригерів з представлених варіантів здійснення і одного або декількох неполінуклеотидних пестицидів (наприклад, пататин, рослинний лектин, фітоекдистероїд, інсектицидний білок Васійи5 Іпигіпдіепоіх, інсектицидний білок Хепогпарди5, інсектицидний білок РВпоїогпараив, інсектицидний білок Васійи5 Іа(егозрогои5 і інсектицидний білок Васійн5 5рпеагіси5). Фахівець у даній галузі техніки може перевірити комбінації з полінуклеотидних тригерів і неполінуклеотидних пестицидів звичайними біологічними аналізами для того, щоб ідентифікувати комбінації біологічно активних речовин, які можуть бути об'єднані і є бажаними для захисту рослин від інвазії комах.

Приклад 40: Обробка насіння полінуклеотидами а5КЕМА, націленими на вірус золотої крапчастості томату (ТООМОМ)

Наступний Приклад ілюструє спосіб отримання рослини з поліпшеною стійкістю до вірусного патогену, включаючи етап вирощування рослини з насінини, просякнутої екзогенним нетранскрибованим полінуклеотидом 45КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусного патогена.

У цьому експерименті для кожної обробки використовували 40 насінин.

Полінуклеотидні тригери 45КЕМА, що включають послідовність, гомологічну до 5'- або 3- послідовності гена АС1 (білок, пов'язаний з репліказою) вірусу золотої крапчастості томату

(ТосСМом), які вказані в Таблиці 37, розбавили до 100 мкг/мл в 0,1 мМ ЕДТА рН 8.0, до кінцевого об'єму 06 мл.

По 40 насінин томату (Зоїапит Іусорегвзісит, вар.

НРЗ75) для кожного полінуклеотидного тригера 85Е2ЕМА помістили в 2-мл пробірки Еппендорф для інкубації в розчині полінуклеотида а5ЕМА.

Додатково 40 насінин томату інкубували в розчині, що містить полінуклеотид а5КМА, націлений на генну послідовність ВД-глюкуронідази Е.соїї (505), в якості негативного контролю.

Інкубацію виконували в темряві при 15 "С зі слабким перемішуванням протягом 24 годин.

Таблиця 37

Послідовності ТООМОМ, використані в експериментах з обробки насіння 5ЕОІЮМО | Генмішень//// | 77777777 Вид Наступного дня насіння тричі промили (кожна промивка по 1 хв при слабкому

Зо перемішуванні) у кількості води, достатній для наповнення пробірки Еппендорф.

Промите насіння висадили на глибину 1,25см в 15-см поліетиленові горщики, заповнені грунтом Меїготіх 200, і інкубували в стандартних умовах зростання в камері: 25 С вдень, 22 "С вночі; 12- годинний день; інтенсивність освітлення -«- 15000 люкс.

Приблизно через 2 тижні після посадки сім'ядол, які з'явились, інокулювали ТоОМом за допомогою сільськогосподарської інокуляції.

Сільськогосподарське інфікування рослин томату було виконано так, як по суті описано у Стітвіву М, Нонп Т, Юамівє5 ЛУ, Нопп В (1987) "Адгорасієгійт-теаіаїес аеїїмегу ої іп'єсійоив Маїге вігеак мігив іпіо таїіге ріапів". Мате 325: 177-179. Коротко, агроінфекційні клони компонентів ДНК-А і ДНК-В ТоОМоМм були вирощені в живильному середовищі І игіа-Вгоїй, доповненого селективним антибіотиком спектиноміцином (стійкість до якого була надана двійковим вектором). Культури виростили до 00600-0,4-0,5 при 28 "С в інкубаторі зі збовтуванням.

Агроінфікування виконали двічі на кожній рослині.

Агроінфіковані рослини утримували в умовах камери росту і контролювали на ознаки вірусної інфекції разом з неокулірованими рослинами, вирощуваних у тій же камері росту.

Через 14 діб після інокуляції вірусу листя рослин, приблизно 226 мм, що еквівалентно двом стандартним пучкам, зібрали і підготували для аналізу ОцапіїбЗепе.

Як можна бачити на фіг. 28А, рослини, оброблені тригерами 85ЕМА 5'АСІ (5ЕО ІЮ МО. 185) вірусу золотої крапчатості томату (ТООМоМ), накопичили вірус (що виміряли за рівнями РНК гену АС) на рівні, який незначно відрізняється від контрольної групи.

Навпаки, рослини, оброблені тригерами а5КМА З'АС1 (ЗЕО ІЮ МО. 186) вірусу золотої крапчатості томату, показали статично значиме зниження в рівнях накопичення вірусу ТООМоОМ в порівнянні з контрольною групою, обробленої (05, істотному при альфа 0,05. Див.

Фіг. 288.

Приклад 41: Обробка насіння полінуклеотидами Ю5КМА, направлених на вірус мозаїки огірка (СММ)

Наступний Приклад ілюструє спосіб отримання рослини з поліпшеною стійкістю до вірусного патогену, включаючи етап вирощування рослини з насінини, просякнутої екзогенним нетранскрибованим полінуклеотидом д5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу мозаїки огірка

(СММ). У цьому експерименті для кожної обробки використовували по 40 насінин.

Полінуклеотидні тригери 45КЕМА, що включають послідовність, гомологічну до 5'- або 3- послідовності гена Зб-нуклеокапсида (МС) СМУ, які вказані в Таблиці 38, розбавили до 100 мкг/мл в 0,1 ММ ЕДТА рН 8,0, до кінцевого об'єму 0,6 мл.

Для кожного полінуклеотидного тригера д5ЕМА 40 насінин томату (Зоїапит Іусорегзісит, вар.

НР375) помістили в 2-мл пробірки

Еппендорф і інкубували в розчині полінуклеотида а85ЕМА.

Ще 40 насінин томату інкубували в присутності полінуклеотида а5КМА, націленого на послідовність гена В-глюкуронідази Е.соїї (55) в якості негативного контролю.

Інкубацію виконали в темряві при 15 "С зі слабким перемішуванням протягом 24 годин.

Таблиця 38 Послідовності СМУ, використані в експериментах з обробки насіння ЗБОЮ МО | 0/0 Генмішень////////// | 77777777 Вид:

Наступного дня насіння тричі промили (кожна промивка по 1 хв при слабкому перемішуванні) у кількості води, достатній для наповнення пробірки Еппендорф.

Промите насіння висадили на глибину 1,25 см в 15-см поліетиленові горщики, заповнені грунтом Меїготіх 200, і інкубували в стандартних умовах росту в камері: 28 "С вдень, 21 "С вночі; 16-

годинний денний цикл.

Приблизно через 2 тижні після посадки сім'ядолі, які з'явились, інокулювали СММ за допомогою інфікування втиранням з використанням стандартного протоколу, відомого з літератури (Кодег Ниї!: Месвапіса! Іпосшціайоп ої Ріапі Мігизе5; Сштепі Ргоїосої5 іп Місторіоіоду, 2005, 13: 16586.1-1686.4). Коротко, 1 г симптоматичної тканини листя відомого СМУ-інфікованої рослини подрібнили у стерильній ступці товкачиком в 25 мл 0,1М крижаного фосфатного буфера (рН 7,8). Цей інокуляційний буфер м'яко втирали в сім'ядолі рослин, обсипаних порошком карборунда.

Після інокуляції рослини залишили в тепличних умовах і контролювали на ознаки інфекції.

Через 14 діб після інокуляції вірусу листя рослин, приблизно 226 мм", що еквівалентно двом стандартним пучкам, зібрали і підготували для аналізу Оцапіїбепе.

Як можна спостерігати на

Зо Фіг. 29А, рослини, оброблені полінуклеотидним тригером а5КЕМА (ЗЕО ІЮ МО. 187) 5 "30 проти вірусу мозаїки огірка (СММ), накопичували вірус (що виміряли за рівнями РНК гена 3Б-МС) до рівня, який незначно відрізнявся від контрольної групи, хоча і зі слабким трендом, що знижувався.

Подібний результат спостерігався у рослин, оброблених полінуклеотидним тригером 85КМА (ЗЕО ІЮ МО. 188) 5"З3р проти вірусу мозаїки огірка (СММ). Див.

Фіг. 298.

Приклад 42: Обробка насіння полінуклеотидами а5КМА, направлених на вірус плямистого в'янення томата (Т5УУМ)

Наступний Приклад ілюструє спосіб отримання рослини з поліпшеною стійкістю до вірусного патогену, включаючи етап вирощування рослини з насінини, просякнутої екзогенним нетранскрибованим полінуклеотидом 45КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу плямистого в'янення томату (ТУУМ).

Полінуклеотидний тригер Д5КМА, що включає послідовність, гомологічну З'-послідовності гена нуклеокапсида (М) Т5МУМ (ЗЕО ІО МО. 190), розбавили до 100 мкг/мл в 0,1 мМ ЕДТА рН 8.0 до кінцевого об'єму 0,бмл.

Сорок насінин томату (Зоіапит Іусорегхісит, вар.

НР375) помістили в 2-мл пробірку Еппендорфа і інкубували в розчині полінуклеотида Я45КЕМА.

Ще 40 насінин томата інкубували в присутності полінуклеотида а5КМА, направленого на послідовність гена |р- глукоронідази (505) Е. соїї в якості негативного контролю.

Інкубацію виконали в темряві при 1572 зі слабким перемішуванням протягом 24 годин.

Наступного дня насіння тричі промили (кожна промивка по 1 хв зі слабким перемішуванням) у кількості води, достатній для наповнення пробірки Еппендорфа.

Промите насіння висадили на глибину 1,25см в 15-см поліетиленові горщики, заповнені грунтом Меїготіх 200, і інкубували в стандартних умовах росту в камері: 28 7С вдень, 21 "С вночі; 16-годинний денний цикл.

Приблизно через 2 тижні після посадки сім'ядолі, які з'явились, інокулювали Т5УУМ за допомогою інфікування втиранням з використанням стандартного протоколу, відомого з літератури (Кодег НиїІ: Месвапіса! Іпосиіайоп ої Ріапі Мігизе5; Сигтепі Ргоїосої5 іп Місгобіоіоду, 2005, 13: 1686.1-1686.4). Коротко, 1 г симптоматичної тканини листя відомої Т5УУМ-інфікованої рослини подрібнили у стерильній ступці товкачиком в 25 мл 0,1М крижаного фосфатного буфера (рН 7,8). Цей інокуляційний буфер м'яко втирали в сім'ядолі рослин, обсипаних порошком карборунда. Після інокуляції рослини залишили в тепличних умовах і контролювали на ознаки інфекції. Через 14 діб після інокуляції вірусу листя рослин, приблизно 226 мм", що еквівалентно двом стандартним пучкам, зібрали і підготували для аналізу Оцапіїбепе. Як можна спостерігати на

Фіг. 30, рослини, оброблені полінуклеотидним тригером 452МА (ЗЕО ІЮ МО. 190) 3'М проти вірусу плямистого в'янення томата (Т5М/М), накопичували вірус (що виміряли за рівнями РНК гена ЗБ-МС) до рівня, який незначно відрізняється від контрольної групи. Приклад 43: Обробка насіння полінуклеотидами а5КМА, направленими на вірус плямистого в'янення томата (Т5УУМ) Наступний Приклад ілюструє спосіб отримання рослини з поліпшеною стійкістю до вірусного патогену, включаючи етап вирощування рослини з насінини, просякнутої екзогенним нетранскрибованим полінуклеотидом д5КМА, що включає послідовність, яка по суті ідентична або по суті комплементарна до щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена вірусу плямистого в'янення томату (ТУУМ). Полінуклеотидний тригер Д5КМА, що включає послідовність, гомологічну 5'-послідовності гена нуклеокапсида (М) Т5УУМ (ЗЕО ІО МО. 189), розбавили до 100 мкг/мл в 0,1 мМ ЕДТА рН 8.0 до кінцевого об'єму 0,6 мл. Сорок насінин томату (5оїапит Іусорегзісит, вар. НР375) помістили в 2-мл пробірку Еппендорфа, яка містить розчин полінуклеотида а5ЕКМА. Ще 40 насінин томату інкубували в присутності полінуклеотида а5ЕМА, направленого на послідовність гена р- глукоронідази Е. соїї (505, ЗЕО ІЮ Мо. 20) в якості негативного контролю. Інкубацію виконали в темряві при 15 "С зі слабким перемішуванням протягом 24 годин. Наступного дня насіння тричі промили (кожна промивка по 1 хв зі слабким перемішуванням) у кількості води, достатній для наповнення пробірки Еппендорфа. Промите насіння висадили на глибину 1,25 см в 15-см поліетиленові горщики, наповнені грунтом Меїготіх 200, і інкубували в стандартних умовах росту в камері: 28 "С вдень, 21 "С вночі; 16-годинний денний цикл. Приблизно через 2 тижні після посадки сім'ядолі, які з'явились, інокулювали Т5УУМ за допомогою інфікування втиранням з використанням стандартного протоколу, відомого з літератури (Кодег Ниї!: Меспапіса! Іпосшацйоп ої Ріапі Мігиве5; Ситепі Ргоїосої!5 іп Місторіоіоду, 2005, 13: 1686.1-1686.4). Коротко, 1 г симптоматичної тканини листя відомої Т5УУМ-інфікованої рослини подрібнили у стерильній ступці товкачиком в 25 мл 0,1М крижаного фосфатного буфера (рн 7,8). Цей інокуляційний буфер м'яко втирали в сім'ядолі рослин, обсипаних порошком карборунда. Після інокуляції рослини залишили в тепличних умовах і контролювали на ознаки інфекції. Через 14 діб після інокуляції вірусу листя рослин, приблизно 226 мм", що еквівалентно двом стандартним пучкам, зібрали і підготували для аналізу Оцапійзепе. Рослини, оброблені полінуклеотидом Я5КМА (5ЕБЕО ІЮ МО. 189) 5'М Т5УУМ накопичували вірус (що виміряли за рівнями РНК гена З3рБ-МС) до рівня нижче, ніж у контрольній групі. Приклад 44: Створення молекул а5КМА для сайленсінгу гена ЕЕТа 5. ГПІТТОКАГІ5 Полінуклеотидні тригери а5КМА, отримані з гена ЕЕТс 5. ІШогаїї5, проаналізували проти генома кукурудзи (7еа тауз-їахід: 4577, Фіг. 31), використовуючи програму ВІА5Т з параметрами, описаними в Прикладі 7. Вибрали молекули а5КМА, направлені на ген ЕЕТа 5. ІЩогаїї5 і які мають гомологію з геном кукурудзи. Приклад 45: Експресія ЕЕТа кукурудзи, яка змінилась, після обробки насіння а5ЕМА 5. ПТТОВАГІ5 Насіння кукурудзи (вар. Мімапі) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1 молекулами екзогенної нетранскрибованої 45ЕМА (5ЕО ІЮО Мо 131 ї 132), отриманими з послідовності гена ЕЕТса 5. ІШогаїї5 без промивки як до, так і після обробки. Використовували суміш з 25 мкг/мл кожної а45КЕМА. Ю5КМА або розбавляли 0,1 мМ ЕДТА, або змішували з 40мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 4 годин в темній камері росту при 15 "С. Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, оброблене 50 мкг/мл а5КМА, отриманої з ЗФБ-послідовності, проростили і вирощували поруч з рослинами, обробленими а5ЕМА ЕНТа, в якості контрольних. 60 Повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння через 20 діб після обробки. КДНК підготували, використовуючи оліго-4ї праймери, і рівень експресії МРНК ЕРТса кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах шляхом ПЛР в реальному часі з барвником ЗУВК Огееєп (компанія Оцапіа Віобзсіепсе5з). Гени домашнього господарства ОРМ120 і МЕЕ101 використовували в якості ендогенних контрольних генів для того, щоб нормалізувати кількості, що вводяться.

Праймери були розраховані так, щоб не ампліфікувати тригер а5ЕМА і, таким чином, детектувати тільки отриману з кукурудзи МРНК ЕЕТа.

Таблиця 39 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії ЕЕТа Цей аналіз показав істотне підвищення експресії (критерій Уілкоксона, р-значення «0,05) МРНК ЕРЕТса кукурудзи.

Медіанний рівень експресії ЕЕїса4 в рослинах, оброблених а5ЕМА 5. ІЩогаїї5, був у 2,12 і 1,68 рази вище ніж у контрольних рослин, оброблених Д5КМА ЗФБ, з ПЕГ- модифікованими вуглецевими нанотрубками або без них, відповідно.

Див.

Фіг.

З2А і В.

Рослини, оброблені О5КЕМА/ПМВН знову проаналізували на рівень експресії ЕРТа через 48 діб після обробки.

Цей аналіз показав підвищення експресії МРНК ЕЕтТа кукурудзи.

Медіанний рівень експресії ЕЕТса в рослинах, оброблених а5ЕМА 5. ІШогаїї5, був у 1,66 рази вище ніж у контрольних рослин, оброблених д5КМА ЗФфБ.

Див.

Фіг. 320. Приклад 46: Експресія бета-актину, АТФази | МАЮРН ЕнНТа після обробки насіння молекул азАМА 5. ПІТТОВАГІБ Насіння кукурудзи обробили молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої азЕМА, отриманими з генів 5. ІШогаїїх відповідно до протоколу, описанного в Прикладі 1. Насіння промивали двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин.

Потім насіння сушили при 30 "С протягом ночі.

Після етапу сушіння використовували кінцеву концентрацію 132 мкг/мл а5КЕМА для ЕЕТа (суміш ЯД5КМА Ме1 (ЗЕО ІО Мо. 131) та а5ЕМА Ме2 (ЗЕО ІЮ Мо. 132) у приблизно рівних концентраціях), 53 мкг/мл 45КМА для АТФази (5ЕО ІО Мо. 31), 76 мкг/мл д85ЕКМА для бета-актину (5ЕО ІЮ Мо. 133) і 154 мкг/мл азхеЕМА для МАОЮРН (5ЕО ІЮ Мо 25 і 26), все розбавлені 0,1 мМ ЕДТА.

Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 26 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння швидко промили ДДВ і помістили на вологий папір для проростання, не застосовуючи етап сушіння.

Через сім діб після проростання паростки висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили схожим розчином (ЕДТА), що містить а5зКМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через дев'ять тижнів після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння.

КДНК приготували, використовуючи оліго-4Т і випадкові праймери, і рівень експресії бета- актину, АТФази і МАОРН ЕЕТса кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах.

Кількість проаналізованих рослин становила 3, 4, 3, З і 7 для бета-актину, АТФази, МАОРН ЕРТа і контролю, відповідно.

Ген домашнього господарства ЕКВР (ЕК5Об-зв'язуючий білок, далі ЕКВР) використовували в якості ендогенного контрольного гена, щоб нормалізувати введені кількості.

Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригери а5ЕМА і, таким чином, детектувати тільки мРНК, отримані з кукурудзи.

Таблиця 40 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії БЕТА-АКТИНУ, АТФази і МАОРН ЕЕТа.

Через невеликий розмір групи цей аналіз не показав значних відмінностей в експресії цих генів (критерій Уілкоксона, р-значення» 0,05), але експресія ЕЕР1й4 показала тенденцію до підвищення.

Медіанний рівень експресії ЕЕТа в рослинах, оброблених 85КМА ЕРТа 5. ІШогаїїб був в 2,28 рази вище ніж у контрольних рослинах (Фіг. 33).

Приклад 47: Експресія ЕРТа І АТфФаза кукурудзи після обробки насіння моекулами а5КМА 5. ПТТОВАГІ5

Насіння кукурудзи обробили молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої а5КМА з генів ЕЕТса і АТФази 5. ІШогаїїє відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1. Насіння промили двічі дистильованою водою (ДДВ) перед обробкою протягом чотирьох годин і сушили при 30 "С протягом ночі.

Дві а5КМА-послідовності ЕЕТсе (а5Е5МА Ме1 (5ЕО ІО Мо. 131) та Ме2 (ЗЕО ІО Мо. 132)) використовували роздільно для двох різних обробок насіння; кожна в кінцевій концентрації 67 мкг/мл а5зАМА. азКМА АТФази (З5ЕО ІЮ Мо. 31) використовували в кінцевій концентрації 145 мкг/мл.

Всі 85ЕМА були розбавлені 0,1 мМ ЕДТА.

Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 24 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння сушили при 30 "С протягом ночі і потім висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили 67 мкг/мл а5ЕМА (5ЕО ІЮО Мо. 20), отриманої з послідовності (05, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через сім діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівень експресії ЕЕТа ії АТФази кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 2, вище.

Ген домашнього господарства СРМ120 використовували в якості ендогенного контрольного гена, щоб нормалізувати введені кількості Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригери а5КМА і, таким чином, детектувати тільки мРНК, отриману з кукурудзи.

Таблиця 41 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії ЕРТа і АТФази

Значних відмінностей в експресії цих генів не спостерігалося.

Приклад 48: Експресія МАЮРН кукурудзи після обробки насіння а5КМА 5. ГПІТТОКАГІЗ

Насіння кукурудзи (вар.

О10ОКО2) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 45, молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої 45Е2ЕМА (ЗЕО ІЮ Мо. 26), отриманими з гена МАОРН 5. Ійогаїї5. Використовували кінцеву концентрацію 80 мкг/мл а5зКМА, розведеної 0,1 ММ ЕДТА.

Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 3,5 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили 85КМА ЗФБ або схожим розчином, що не містить азеЕМА, проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через 20 діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівень експресії МАОРН кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 45, вище.

Гени домашнього господарства сРМ120 і МЕЕ101 використовували в якості ендогенних контрольних генів для того, щоб нормалізувати введені кількості.

Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригер а5КМА і, таким чином, детектувати тільки мРНК, отриману з кукурудзи.

Таблиця 42 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії МАОРН

Значних відмінностей в експресії МАОРН не спостерігалося.

Приклад 49: Експресія ЕЕТс кукурудзи після обробки насіння молекулами азЕМА 5. ПТТОВАГІ5

Насіння кукурудзи (вар.

О10ОКО2) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 45, молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої 45КЕМА (ЗЕО ІЮО Мо. 131), отриманої з гена ЕЕРТа 5. ІШогаї5. Використовували суміш з 25 мкг/мл кожної з двох а5КМА.

О5КМА розбавили або тільки 0,1 мМ ЕДТА, або додатково змішали з 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок (ПМВН). Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 4 годин в темній камері росту при 15 "С.

Після обробки насіння висадили в грунт і вирощували приблизно при 25 С зі світло періодом 16 годин.

Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили 50 мкг/мл азАМА,

Зо отриманої з послідовності (305, з/без 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через 20 діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівень експресії ЕЕТса кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 45. Гени домашнього господарства ЗРМ120, МЕЕ101 і експресовані використовували в якості ендогенних контрольних генів для того, щоб нормалізувати введені кількості.

Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригер а5КМА і, таким чином, детектувати тільки МРНК, отриману з кукурудзи.

Таблиця 43 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії ЕЕТа

Продовження таблиці 43 Значних відмінностей в експресії ЕЕТа не спостерігалося.

Приклад 50: Експресія ЕЕТа кукурудзи після обробки насіння молекулами а5КМА 5. ПТТОВАГІ5 Насіння кукурудзи (вар.

Мімапі) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої 45КЕМА (5ЕО ІЮ Мо 131 і 132), отриманої з гена ЕЕТа 5. ІШогаїїєх, без промивання перед обробкою.

Використовували суміш 25 мкг мл кожної з двох 45ЕМА.

О5КМА розбавили або тільки 0,1 мМ ЕДТА, або додатково змішали з 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок (ПМВН). Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 4 годин в темній камері росту при 15 "с.

Після обробки насіння швидко промили ДДВ і прямо проростили в грунті без етапу сушіння.

Рослини вирощували приблизно при 25 "С зі світло періодом 16 годин і при необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили схожим розчином, що не містить а5АМА, або з 50 мкг/мл а5КМА, отриманої з послідовності ЗФБ, з/без 40 мкг/мл ПЕГ- модифікованих вуглецевих нанотрубок проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через 14 діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівень експресії ЕЕТса кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 45, вище.

Ген домашнього господарства МЕЕ101 їі експресований використовували в якості ендогенних контрольних генів для того, щоб нормалізувати введені кількості.

Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригер а5КМА і, таким чином, детектувати тільки МРНК, отриману з кукурудзи.

Таблиця 44 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії ЕЕТа

Значних відмінностей в експресії ЕЕТа не спостерігалося.

Приклад 51: Експресія ЕЕТа кукурудзи після обробки насіння молекулами а5КМА 5. ПТТОВАГІ5 Насіння кукурудзи (вар.

Мімапі) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, Зо молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої 45КЕМА (5ЕО ІЮ Мо 131 і 132), отриманої з гена ЕРТа 5. ІШогаїї5, без промивання перед обробкою.

Дві а5ЕМА використовували роздільно, кожна в кінцевій концентрації 160 мкг/мл.

ОБКМА розбавили тільки буфером компанії ІОТ (30 мМ НЕРЕЗХ5, рН 7.5, 100 мм ацетату калію) або додатково змішали з 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок (ПМВН). Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 7 годин в темній камері росту при 25 "С.

Після обробки насіння швидко промили ДДЗ і прямо проростили в грунті без етапу сушіння.

Рослини вирощували приблизно при 25"С зі світло періодом 16 годин і при необхідності поливали водопровідною водою.

Насіння, яке обробили схожим розчином, що не містить а5КМА, або 160 мкг/мл азеЕМА, отриманої з послідовності ЗФБ, з/без 40 мкг/мл ПЕГ-модифікованих вуглецевих нанотрубок проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних.

Через шість діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівень експресії ЕЕТса кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 45, вище.

Гени домашнього господарства СРМ120 і експресованих використовували в якості ендогенних контрольних генів для того, щоб нормалізувати введені кількості.

Праймери були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригер а5КМА і, таким чином, детектувати тільки МРНК, отриману з кукурудзи. Таблиця 45 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії ЕЕТа Результати цього аналізу показані на Фіг. 34. Значне підвищення експресії МРНК ЕРТа кукурудзи спостерігалося в рослинах після обробки а5еЕМА Ме1 ЕЕРТа (і-критерій, р-значення - 0,004). Середній рівень експресії ЕЕТа в рослинах, оброблених цією а5зЕМА, був у 1,8 рази вище ніж у контрольних рослинах, оброблених 45ЕМА ЗИ5. Після об'єднання в групу всіх рослин, оброблених молекулами а5ЕМА ЕРТа (азЕМА Ме1 і Ме2, з ПМВН і без них), і порівняння з усіма рослинами, обробленими а5ЕМА 505 (з ПМВН і без них) спостерігалося значне підвищення експресії МРНК ЕНРтТа кукурудзи. Дивіться Фіг. 34В. Середній рівень експресії ЕЕТа в рослинах, оброблених молекулами Яа5ЕМА ЕЕТа, був у 1,73 рази вище ніж у контрольних рослинах, оброблених 05КЕМА И5 (І-критерій, р-значення - 0,005). Приклад 52: Експресія АТФази І МАОЮРН кукурудзи після обробки насіння молекулами 45ЕМА

5. ПТТОВАГ 5 Насіння кукурудзи (вар. Мімапі) обробили відповідно до протоколу, описаному в Прикладі 1, молекулами тригера екзогенної нетранскрибованої Д5Е2ЕМА (ЗЕО ІО Мо 31 і 26), отриманої з генів АТФаза і МАОРН 5. ІйШогайє, без промивки перед обробкою. Використовували кінцеву концентрацію 160 мкг/мл а5КМА, розведеної 0,1 мМ ЕДТА. Обробку виконували шляхом обережного збовтування насіння в розчині протягом 2 годин в темній камері росту при 15 с. Після обробки насіння швидко промили ДДВ, висадили в грунт і вирощували приблизно при 2576 зі світло періодом 16 годин. Рослини в міру необхідності поливали водопровідною водою. Насіння, яке обробили 160 мкг/мл а5КМА (ЗЕО ІО Мо. 124), отриманої з послідовності ЗФБ, або схожим розчином, що не містить а5КМА (ЕДТА), проростили і вирощували поруч з обробленими рослинами в якості контрольних. Через 27 діб після обробки повну РНК екстрагували з листя пророслого насіння, і рівні експресії АТФази і МАОРН кукурудзи визначили в оброблених і контрольних рослинах так, як вказано в Прикладі 45, вище. Ген домашнього господарства, експресований, використовували в якості ендогенного контрольного гена для того, щоб нормалізувати введені кількості. Праймери Зо були розроблені так, щоб не ампліфікувати тригер а5ЕМА і, таким чином, детектувати тільки МРНК, отриману з кукурудзи. Таблиця 46 Праймери, використані для ЗТ-ПЛР-аналізу на рівень експресії АТФази і МАОРН Результати цього аналізу показані на Фіг. ЗБ5А (експресія АТФази) і 358 і С (експресія МАОРН). Ніяких відмінностей у рівнях експресії АТФази кукурудзи після обробки 85ЕМА АТфази

5. Ішогаїї5 не детектували.

Однак спостерігалася тенденція до зниження експресії МРНК МАОРН кукурудзи в рослинах після обробки тригерами а45ЕМА МАОРН.

Середній рівень експресії МАОРН в рослинах, оброблених цим тригером й5КМА, був у 1,37 рази нижче ніж у контрольних рослинах, оброблених тригером Я5КМА ЗФБ (І-критерій, р-значення - 0,11). Після об'єднання в групу всіх контрольних рослин (оброблених Д5ЕМА ЗФБ і оброблених ЕДТА) і порівняння з рослинами, обробленими тригером а5КМА МАЮОРН, спостерігали значне зниження експресії МРНК МАОРН кукурудзи при середньому зниженні в 1,67 рази в рівнях експресії МАОЮОРН після обробки молекулами 45ЕМА МАОРН (І-критерій, р-значення - 0,02). Хоча винахід був описаний у зв'язку з конкретними варіантами його здійснення, зрозуміло, що фахівцям у даній галузі техніки будуть очевидними багато альтернатив, модифікацій і варіацій.

Відповідно, припускається, що він охоплює всі такі альтернативи, модифікації і варіації, які підпадають під сутність і широкий об'єм прикладеної формули винаходу.

Усі публікації, патенти і патентні заявки, згадані в даному описі винаходу, включені в даний документ в їх повному обсязі шляхом посилання в даному описі в тій же мірі, як якби кожна окрема публікація, патент або патентна заявка була конкретно і окремо вказана як включена в даний документ шляхом посилання.

Крім цього, приведення або вказування будь-якого посилання в даній заявці не повинно тлумачитися як допущеня того, що таке посилання служить в якості відомого джерела для даного винаходу.

Що ж стосується заголовків розділів, то вони не повинні тлумачитися в обмежувальному сенсі.

рн НН ЗБОБЕМСЕ ІЗ БЕМО ЕН їх д Сезон хо А.Б. ее ка. хі дан ях КЕ ОН Х т.ч 13713 пред ПпісСои-М3143, та Мк о ь І Маск, Базу Меїк, ОБіх Меучіхі ж вещкі у (їкіх; МсзУХхитюЕкихк, КУМ тя ен ки ок пи кт а НАННЯ Ве угод киВ си кУй муч МІУ гМУ мех УЮ па МЕТОЮ ОК МТК ОпЛОСтІМм: ЗавМмА то вОаМтоБЕКоУ КО МОпсрАТІМОС ЕМЕ ЕХРНАЕШЕІСМ реа пзиапада ща дОачЧОМ и для да тах ЖЕ, іш зі/ 745,05 я о зпа з.п. хау ОА анна шити гл «ПИ БА ічеа, ху нт то та по « ків 2пі3-0п1-01 яр щоия дл тА Тіз щапим 2і/748,И За сяк тях 4 4 ««1віМм 2213-01-91 из кт дя /тклс па «ВО» Б1/7ав,аа -еч:3 тт чі .шРу дівів ОБУ слЕд «я и тулоя па «їм 5178154, 888 щі т ваш ща КА рн ча сх НИ В ПИ В м «іба»о 51/15, ще лавин: а А МА лит и, о гла режи ни «іо» біглвій,вО «1512 3013-04-23 щих тиви ша «ШИ сійкі4,во ся ша заз ми аа «Бім шо -0п4-0а ча діи/йпо опи а замов, ЗО наша уп рот я ви сипБух ЖИ 3-11 - 6 ЛО дз/ад еще «150» 51/08, Що хх що нази І М А их 2015-11-56 плодтю зи марним; шиття урн я и душ ру ЩО «1708 Рачсепсіп техвіоп 3,5 АКА иа ях 1 коки 2 в дих «їй» ОМА шо ВиВі жі и і Шатіциичих Хо аХкузІїсіві Зецдиепсе тт лу шля ві гирі сх поруч тевтеею яи То хи Ї вжи ери і ЗаиА киш» вВоїіугслезтлаєе вециепог ого іп Уузжо чЧепеохваїза ЗаВМА дея 4 «яп 1 Брааграстчасс сасев'вогу щи стул гук є ке А «2115 15

«шій ОщЩА 7 Зоя щоє У Кі ді даті діжу «Рі я зиЕгагісСсівді засіли лешит нету ту тю іч М ги ди А 1 пут силу ук уки зх уеу 1 у па вих жк кгс 1 ли й хийа" роізїуписпівзвідче бесетсов с зп о Уулбхо пейвкрагей ОБАМА дп г; Я ра чт стЕча асуптззакз їз «шій» 3 спла -т мк «с «иа» 0 ПМА «щ1Зе дстітісїіві йесплеалсе 3 каша» каоконокя жи ххиізлиії миску их хвумучізим уко я Я во житні мочці сш МІВ «се пшоіУпПИСьшОогаа жесдрияепсев ок п жарка чапераценЯ НМА «пох 3 сатсавксчсс акссрсакко ту 22 «Рій 4 ДК Аг ки» що стат тм ванни ОМА ли г Кр а ЧР п - я. кож ук, «жо а» вх воі Зецвоасе зд «й» «жш3з рзіУупцої1еогіде зеццелсв о ок іп іо сдепекацеЗ ЗЗБАМА «4002 8 нддещ три ти уж тету гвів ж чути и подо в ом оцих г павпассчасо сист савсласосскос зЗаадвопалоо КО «вій» «х112 40 «йіТшМ ОМА «13: зкгїігісіві зецчийелпсе тату ту чив «луку г догани дви о и укази на ни о ШК. зи фони статі зи ММ «вай» розїупосівокійг вецдцелпсе сзж зп омісхо зепекалей О5ЕМА «вп» 5 вин лечу бвеогагсацас се оцодтееруерит дуб ві юр А опмахтсашоевисо сапссозсоззаа адсозаосуєс поши їм кій» 858 чеї11» ти туту тА ил ОКА «Ім дквійкоїаї Весело «киш» се шиахУухис засл швещіаепов ох побу Пи ен ке виМА «кап0х

В свист сек датою оч зе звеспосаДпозас сзсвизаткту 2 «210» 7 «ії ШО стул тк РУмИ «т пий «лу ту си ня п дахи ит чий» акті сіві б5ваавовосє рн «ай ул ен у их с скуті тина у м ин ру ев ДА 2 «ши» роіугтисіеоБбіЗв зедиепсе сг іп УЗЕтОо Чеператей ЗзЗВМА зд - ка» 7 ша р нове ся суч р ин пл пттсостакчЄ Ссосечссафу «М «ех 8 «2І11ї» 515 «від» ЕММА стра тлучу 0 ом чаї СОММУ сплячу в ха о пззивсоавов сзеововУзч леасвачелеас айписсдаззос весваацосоч доеиаистас во насоса ас сах досі ли нідшВастсчт спа сейнсс щипати 14 ачсадвсициа пчастлинива йпуесисоваєв соиссссьса садсличлати павайиашеюа 15 Фасад атасс ваззпаспас зипосяоаси салона зачала спасе ай тізижі іі из етери зима реж ть й рів тричі: псів или ки З пад исеплдсечи павессоосспос моапстиавсляч вдидавиайейв чвопсссаца масо адишии 399 -у зляаиних о злитті суч литих их чи зу зл титтУтутт пелет су стих зе пвзесасипиипсс МмсзасЗУупсс асетуасслтача соспацпсцисо пМисзсиищто сасстсвасих за ця тих дя щрут тич чес житі вра срфзичичч три пути ртуть затерти их лад авидівоое диуаооройстма зовосзцизоа зввссоваюю висслійсовни змжІшнавоцих ий сгимадтсттчсса павазлодливс позазвсзсо часчасоедсстл савсчалоснтча чпайзазцави 250 іпавилалита т спаси сова ааспиасиаУли ом сяВаа сорасСісац поаачопосо за) дидиспцизо срспспосача чоаолдостиоис дсзавалчоцои зозпооосзчазз зчасийсосс ло зивассовочаЧс очами пі «ій» З ис А ем аНШН ЗМ струк тУмід ан ак ОМА яхту прання Кс ня жи «12» вка гісіві Зедиаєрпсє «вих «232 рзіуписівонкіче зецзоепої сс зп мабто сепекапцей ЗАМША «й о Зводу би ель Я сич Я пу й. при ичи й ух уития прдіечи в лить ду тадтсвочато савблтвасазаа саоовоссаос Засссбдали о «ій 18 «вії» 4 «жі» ОМА теїЗзз актіКісівЕ бесделпсе хижих Та х тлу дили шию гі песто я АН пп кдокшгі гі ІЙ чеше боіупосівокіЧе шесилепсв ох їв УзКхо депетатеці сБРЕМК кнція и соватчасизвст свзсгтагаспфвкр чоссссасозе свставувас 4 соша «йІ10» 11

«ш1їМ 558

2 лота чі

«8122 БМА

«139 СОММУ

«4000» 1 падивстасі сасовсазад демровососує сасувацавсо попочасаси сссоппоосоо би пФоспаситатя спи;спнзави посади ецац узисдазодсва зчиадссосвасз чзомпсаоссицу 1759 піт ув ижижич ви ті лі рон чн и чи сіхливутирит іти чо пизвичаєсєвиас зосзчааси дчадоечсвота си дисзава зопоасавсзи ацдзчиспслицча 189 зізкіиз додати тижня 4 су су их чия дикі о пат бут рях и щи рт тятиву, лап свасвзацесо спзссмадацчсу цнагазчавов пасозазцаау зиаззпазчаса вудацацяаий й пі злу сщжвт п р є тифу ририх о піутф три гео сптщв гт:тии п свсчсСсаасай спала впазвппспвос очсасснрачо веадссстасл тдавтшапоса.

ЗО чацадацшоса писваздазай всовиоавооис чсссудицод спасвоспзйоий сзуасстиини 355 п ук аж плучучі у 143 хіти тих МЕЖІ свіжі суч луз етери зач ізаиричліікі их до пса бБлпОвзОоцацми посол АФ паро воОо сич 429 гулі ичитіія прі еті111711 пед иж утіх ти їз поро а о а у и ни ог азвисцастаий зисссийпацйи счасзчачсла вссапооам сзвизоцалай диспідршстатта ко мізки ит ря дае отим же схфктия узі вач уз суми ут ший зиаЧисоацйуеся чсоссимснаца запал сводс вппцоешала посту парту ватїц папи чне я себея тити и Н притктутіии рирззегті тич и пух светр дикі коСюд аавидсиали счсутлидесвта пйпаппооасзЗа почато сиавиадамняа сіла а

«шій 17 нут КІ каз» 15

«ій» ОКА

«13 вЕТігісіві беоделоє

«их нтуєутьх рр чна нич ке ци злу жит ок Я т--ї залу кжемтзЕк тлі взиї РМ Й

Ей» БВозіупосівогіЗе зедлелпст ск о їп о хієхо пепехатео аБАМА

«й» 12 суттєво вста ацоа 19 ну ке

«ж 13 ту ск,

вени с

«12» ОМА

«ж513» актітісїаї бвапепсе лугу

«й є роутисівоїісв веФфіавпосе ох їв іБко детесатені ЯаКМА

«4005 13 сгассаксуцсс аксстптаїтіє су «се

«10» 14

«ТЕ» 43 сігуттун лай чеш ОМА куля зоутін і я нят личку пох

«кій вИІЩаАЖІісїаА Звоапепсе шли ту вн чай

«й»? роіупвисівозгіЗе вечцпепрсоє сг зи Упбхо депекалей авБАМА

«по» 18 долу приро пу лу опручити| пи сур фр иуку риз ре тими в авта сассасазчча васвогсосЗ осузччасачо ока а

«хіх 15 КОДИ 4 тії» 42 «2125 ОМА тут тр, девійініщі пкт пу: тека ТОН оВИЧНИ каопаетут «сЕОх пут реч пан п пк о п а - сидру тв ср итиї кіс Мя, «вай позЗіуписівоів зечаелсе бок о їп іКхОо сеперацпені сББВМА сх 15 ; ; поча чна на а ан ау пра пи их З кавівсувотї сзстатазгвр азчсаєссссо зов ско 24 «254102 16 «пїе ха «1йт МА кгі3?» встаіїїсїіві дпезпепвсе пуд «220» «ша» розіупоасівоїлів зедоєвпсе огоів бісго Чепрехатей ЗЗЕМА «0» 15 удар це и Ж лугу 2 спас нава посох «и «вій» 17 я лож ЗА жо по лит ГУМІДА Хе ОМА «213» вккігісїіві Ззеспероє «ев копуту туя п летіти -4 пра ана а аа а аа а и А и ячи поту іт ки 327 «23» розіупипсівокіде вецостотс сб о іївйоУїшкто пепехкацті ОЗБЕМА «аййх 17 Н ц лі сс зсотса асзазчідвос о «Кох 18 «112 90 «12 ОМА ся о вісь баеордеглнт «пух кт» - тю и урарчт ект 2 - дуй рому сікфтр вод сте МВ «жав о роізіуписівоїійшв зефієглсов б зп тіКхо деперасей ОЧБЕМА синці 18 ; серк кв г сезтавсост зовочсчач 21 шва сцчаа тує й «й» 15 «Ух хо «12» УМА «213» веІзїіїо1аї бЗедоевсе «их пит Яотлуєзт я дощ ді - . те як Я меня прак о і з АТУуиХ ких мсоіфткласівослаг везцевсв ок ій УзсКо чепекатей ЗЗЕМА «4005 18 ев зксачассчсс часу стогу й займ зв сит и «11» 483

«пі» ВЕНА «13» Жвспекіспіа сії «апп п заазваайлповзсм свосраваюкрроачалйосслосоа садив вБисзцисвог) аОсаорчалая БО с)адичсваи зацсазозчиий описпоасчааво сподацаева звавоссЗзу шивимешищ 121 чосацасачМ мизавствас возаечесопав очсацамаМми сфидайливая судова 159 сиччиачсва сесзчаазиси ячвоивссзаа взузмоута срлосатозиа асп сосу КО пднІдаласо списвсосвоО зодасаначи здизетвви ввисвоззЗава манЧцаснося з99 пезацпопсачс озозсзссви засаалесла зприлгаслсесо вазизпозанвизч сспчладайа зап пасяоссинис яссуаазиаду пдаасваєца воводвасад сяуясчансс састоутвай го чсисссилид снаги сява пив. а «сеї1пз 751 «2112 ОО «бід ОМА «ії» вроайсрсвека іх огаїії8 «ап» г втлдиісдсавсв пезсасазчпа сЗзКгссасват засасяаева ссппечесЗо счосассес БО чЧссчатасосч стзабочако чо ссСачо воссббовга свассиєксї сестассста 122 ттчачасчеася ссвсссдеся чесатвосввс посааалаєФфа вадлаасайайа пасли 155 січсісвта аасайтоссає ссаззЗзссосз Ззчасссвесс авуссастолз азаксскете ай вптаввастваввс газаптсакос тозсватаваяє стае чЕве їтсетатосЗзис повалочеас 300 астаціозоз азстсозсззч асчсссстсс азоласозовз сзсзабасав чассдасох зай зичаппаска дісссзваза воля здававаосБге Бовавстссв вивів чо вастсаєтач стасагска свтсосввса сві давч дазассссово апавовастех а55 віддасть асзаасоадає вевсавосоусдв среастсоцвтт Бавосочити: аваБрересс 349 здо сгочос ггуусаасай часабаєсавйа свтсвезавто соч остаї абтарстасах во заввсобсЕсо засанеастїУуу соастіасвача зсоссброзас ссучсстууУ вачабсчасслаєй зв зокаахтаєта дазасбоувтї свссвзесірр;роадвазчаайаао бобадзссвой засо тио ваватїїісвата сслазчазевсо босбозазуаа заз заєст чісвоавкоса соска асх тво пвсзчастсто апцесвпсасе ассбадвсвяно атсвІтівсї сбвовзаттозо псачасеасто 49 сссстзозва пссачачзсс асстсбаслаї зпсосовазаазкс сассссоусцо ссааатсаса Зп чЕкаягасцва аастасатвв уззслувсає зачЧисБечЧра Босасессщв вібоаахе БЕН тсачЧасссутуа вааслодаєа сборсавсосаззи зассаксочсо стоастловсос авагтазатоуас іа їставслтвсоях саузісзкос яаЗасазссв всозззаачсса абвосцасза ааБбосвКеової 1055 спсвпозвзоз ссовссазча дассачсаай вазсастсоб гсссстоссс вассєсстах 114й пасзоспасає бассасвсбв сассовови зопасвсрчс ссосегасесв свівесввов 1-00 чечссччсз дасасспіво зпатозавозва чдасадайача алостзчатас садової ТБ ввісїсісвач асазусзвзазцо сагограссвя сувіїівісйї сачасооскоа свовавзсаі 329 здічсвосвкст сровазаєозї ассавбсессї ававсстссвс коздассасї зеабдадсох 138 рвосоподсос гасвассвву атапіастос впосповбосса Ззпсстащовії зба сталаях іч4й всачЕчсаєв одссзсвую са ксза свтавдаснс стдсзаакс слісввосвав їзпо чн чїїіасча савосалсазчиій засасасзас вавсссдваву созуасавасо сопксосбесо 1559 чЧівсстеуєві соапсазаав арсасавскс суді бвспосх бдевавопов ааоссососств 1529 акавзсзчксо чксссузгас аспдпаєсалеої сстсссосчз засос Ззса взчачосесох 1581 кесчсасЗКа счачсудсав взввстозза засвавбогбсс Карастиосощш втдлвормаизах. 1740 счсчассвачоеа ассастатіта псззозооаа сспоцчачавах асзазсааай зок ке іа аватідчавсс стадпсавеиско пгсзгчагсаз дадававай сові пгваєс асапреастя ня) чавазазалатва позасотоско апсчачасеаст вспоазказвс ссаастччаса ппсссасясЕ 1829 папсацочаса стаачавкає часа слас зчсоазоваса прапспізавх часідессаа іно сктаадачеасеа часочсвсвза восспвазсх опсасаавктга песвадоедаєвиї цес ат по аавачадхатас сізссчЧасає збзовигтав Ото «КОМ ши «211» 817 «12 ОМА «їв БВройсрсежв фс сохел «аа ше зсавкссзаба гсзасуссаа дчаатасссіо сапзазЕЕва сссочсзатахє сосзотовасх 5 пссчЯавБобосга йачасатен зате а спосвасочос ссзччавазис бабездласваху 150 жссостства сСсобобдсосза ззасвссвсу уасаєстствоуєт лпасазсссає сзаєсосавоу 159 бспопниутвісї ассссзазав чабчасбссач всооущовішо ссусгаксза соагчасоєьас Ба) КесвІблеко ЗзбазЗзесачав чабоссосовсяй сбоскекаеос сізЗсстоасо ссвасайслчай за зппасочеєсс азасстзсву всазччесози сппассазаа боесссоуздсвва вішати о часчасслоЯ аоачасавсве сесвтоссиіва посчсачосте боачасаслава саслазвос дк ссттазчісио ссвззасааз ососгрссаану вас сита сзчвсваса зсасосчто 489 ялудвасьвоя ссвагчзасосс сасгбаєсавлоа впав ев свесссосе пас авсос вай чопасоаває поссузпссв спвазсасзаз заасассває боса с чЗашеувовия опо костсабаса седацасксї зспок;звоЗо сосчосасос ста ачововуї встосоавсо БИ сеча сст сазлзисасає чіасвссзаї ссуцзссаста їссвслазовя попесаавсо ТЕ Зовлчадлодев позаеччакто сабсассстзя вссславкгй бозосавово бСсавосппочає 78 аксавсосаєс стаггсосча ст саслоеатла сахтаєва 17 «рій» 23 ка» 1555 свій» ОМА «3» бродорсвха БфіБокатів «ПО» 973 сассчваадсч всвассасво Сбаспсостау сосісаваса восвоїассв допов аоад БО впзтаававсяє сптссгратак о агавчесЗза вас давал соопвосвака пакЕалага 179 акісзацаса сБоцазайаавйа садтававсса пацсбазвазіз гочаззнагах пвадвіашосод 18 астаскксча чесати басьбсв3зсї зсакососвабо сссссозсии апасвіїсваєсх ши стабусавсча соФсЯазайсзоя позвсасетааа зсссцчашссо бозозчесаїте аваїтлетссосу зо авпусвавУєо асодвосгсаав сзссуучстст сс ецс свссвіосас ооспсаеже 389 шсозвлтеттптт пепосатоза бтаайдассзаєс автсвсласа ссппочаске сасчсоасасдає 42 зсчастчаєа пзазчавнаазчв чзасспвата: зс'одзазаоз првзазаака спчшшшсрютаи ан пкоссокавося часвАдсвать псебсзвавк здчаспсвкасс всстадоєтя тов ова ча чсссчіЄлеч сссіосзгавз вотоуувчатх зсчазчсачеа ссзазлчацова кпасостосу 509 апудасевтс впезпеісозЯчо аосасачеає ссвтсувчт певвостова ссрасачеесо ро васавссозсз соззгацісо часпссачслас чавозпоачо сссозсоассвс шоссе х 723 воспопосас сасусвтУс сало свсоссеосчер вагасусссув вето птвооа Т5И стасчтачст стазацастії щдоесвсовточс всдсочоплай авссотсвазча асксосвуво БА) Чекати ссївсасцЯа бозоозауас важжсствває зп іаспоа псчагасоасьиа 99 квазазвовзст зоизачавссл о садсасасст сзазазовзво згчсесасозазЗ азс сллссах зай тасасстазсу сусазастоУує чаазтассса здавтасосЕсо азаззасчак Ес часлоє 1020 кагчачакатє ссозсассотв вусвовасопи зчастасрассо осстсаставс ївсовусово 1080 ксостацичсоус сазісгодававо адссоуауаас сСсазсопата вастсвааанй: здбабззаваакс 8189 їз твалолєсзоа засвзсзппаа сопе чсктс зсзпизклид пссвотпи часа 12539 зазасслезссучо пззсазсоуа спавсссссово вочсзссЧез озасЗсттса чЧадечсасооя 1260 счабкакасс бсссусцвуя ачасесозсов зоссовадує бочассству сб васода 1320 счеасосчаса чат ака стозазссас заусссзаай чсосвочсюс сасвачсоза 1382 чбаваситвсс заввовзгасг азсркчЧасбацче сСтсдаівуув асссзокопо падсогеасся 1449 аввачаслаза гозазачесс тсасчазчіва зчасазчавака попа ата чола тата 150 зазсассвва ТбаЗспацзав ваазазавва ваз іп «10» 24 «112 ХО «ій ОМА «14» Жродоркгеха ехідчид «апп» 44 чачізайсчи чЧезуссопасо адосонасас всзсозсвавс пвососвао часассагсс БО ппипвасасв стесгосцева састссчетлавст слатаєзевоо пагвзвазосвсч часа сайста 129 зсаспивкосї ссасаасаїв стзлаасіва» зосвасєсваз забаЗсовея Стводасоа і5О авочоаслчала давдзазсвас часввогосо аочасчатсо басвссллє зосвавоепага аа мас оцтру вазосааваа асзогбасааоу вавзсчавпауз абоззасахта ппоссааечаВо 389 Екславссзлваз сезозасач: азчеасстацаза вазвалісвізвз візка чазч птосасачееє 3659 заскасобоза ззсзасучса сассіассот сосбовквас зУуссстсзуз сСспсоачасснх тий пвасаавачач сазсасасхт пса озсви свсачобадиеа ааадоавсяору суто 480 ассчгдасас зчаасосазає зооасзаас васттасачо аачессткоса часозоазаве 580 звуку салпасчазос апосрччоса сусттоатеві всосзопазванта аоааасвогов 5О0О кЕвЧатсзує зазпчлагбасзо ССС Еслава сттссвазсз зссзастацс асасадесся Бо скассавЕЕс сабаусчову асзчібоссата сзвгассвас зУУпоместв іт са. тай гестассача асталасака ссзззоЗза саасчаксас чдадсіопсств споевсввЕкс 7ва пчЕчссцЕсс плацесрасво бовсусзасї ссвзазвісс сФааасоашеоос абазазогоа Ме) ккд поавсвк посопосавта чЗЕбассасваач ствастізовев світо сасзз ссасоакодо здо ззавктазвоес гоїастастзУ ссчаєассаз сосдсвгсоево збосабтаїсс собак зви чзчававаста ГУссасвсоеїє саздазчсссча саззпакаві сагльацєисій русвхвосав 105 адчасчавос аассссросвоск сзсгассзса сусассозос басассвско бопававвсх 1089 судоми сврюказвакк стесрсязсна СООщаселуава вудсровосчац соспоассосеКЯє 1149 шкЕстссазет Ззестеавасцоо сс ссалає сасвсвака созссоссопай чаплі асайва 127 сппсзассачзч созччасстс астесзлаї свассзапак Ббастістаасс зачатусво 125 тЕчЧасчсаксас вассастатс заависсссат потаспечає счсссвастссва втаккеосао ізо тукасєвщітся стасвсанхвь чаадааУстсоз стсадтавдайї пссбсавувозв засос 380 звсчЧидиссго сзосзакссо чесассосає спусаоссзв струс зчаке чЧесасочсаса 1440 зивпсвазеа пУуЗсуасаво сзтассссс воздчщавовак поссуастає собевтоссх 130 ачачессовсс ватаг їапа сіззоостату хсабассссч їсапавтяцев Боовивипопо 1559 тастаєзчатїі ассассзсзз асвгозассва ссдсасатуаєЄ сбопдасасоз звазобоааєс 1529 зиск одестс свозчаазаз Сбасббсчбуа сеслсваїштв свзавзчоста оБгсасрчаса ї6во ззацчгассазс сттазасача вачазчлаавт ассвзасаза гЗзгтаззась Ччаладооост 1745 пачадакадча дача счесвосспаво ассаксчтавас бвсассваєх свсовостчата 180 всатсісчассо сіспівсвавав пскзгтазуєЄ саїсвчздіса лабсвзосазо згасвтусах 1858565 засчссатстовьо зоззсасавза зсгнавзатсту звззасзвісзча ст: зава БосасКоссКо ЗЕ ззспгвозсоз ззавісазбас чобсоасаот пгассрсваав собаботасоа пса 1980 сізаксавосся сузваїєсува асасатайсі побсачасча сЗсстссова втабсвзаєос 2045 асачічасча савасшсссзя зроввгсЗаї сочрадйадвхе зЗссслос ас вобагсову 10 пачточисос сзазавасак сасотосзааса Сбсзкасосз ассасссаас зазраосоя 2159 пупстівсуб зозасзакга асчбадасво спссвудвва сасазазчактоа абЕбеасслох и садазоааєаа зусадазчасє сзбсасазчча засассоЗсс гтсазусєчаєся басаксвьаєх дав зооспасксза тесассжтатів візозвостас саакайоКеЄ зеагсесваа звана 2340 стіцачадсас стайекаска асессгззасч зЗазчзасасстла ссбсосвассї сзбостусас БО) зії ає сзвсспчасоа аазаачавсв взватстсоз аЙпппасссао загс аске 235 акссспеівус сЕсваЗсссї асачіспоучо ВссвзаввЕсЕЕ сззазтатосс абсачісвіх 2829 зчсгчовава зЗцсазоїува стасаєзакта зогогбагасе Ззсусвусссї зУсксосиох пи состссбсач дачвавастоет ккоавоозасз асавсоставе саптаватає вовка 2640 січаїзлавоас псзасаккас зсрзсзУугасу вісвазлталчв азапсчвлаа БЕаБУгасиєс іо пт асеков воза кво ссассасвазчазт атосвосту стосзвозЗоо басасесясх 2769 зибссззачо СіІгтаасчач Сссбасавсс авсзБбозссо сгоЗУсЧюсь Сотуашевуєа най ссваасавтає зулсесічиїє деєсзаворзса васасассвт стачаслсавол чатавоесвест Во ссачессоса сабозсасво свовгзаїтзуо счзасчеазоаз басависсся побоссазай Ез49 стбвтвоєспик свсзеказчса оабасстісу ще срагасстоаєс аасгччасиї, 3559 зЕЕЕспвасза застає сссастсїчЧа ссесагзЕ гзгасуєск ассабсчвнавйх зво спсазазексв астУустсчсу зесссаатах сзпсзаосЗзас абасуссатя вВісвітасоу з12о сігтттатлає сазсастозея склтевзиказ зодчаччасея бассзавшлк сстпсспчста 3188 таїсссстлаї аптсзобвкоя ваббоУктст ссабвоссесе птдоплаоак созсаууац 3545 петлоасаезт гогассзчча аббассстасєс безе став зсссссвасоа Басубаєсссх 33050 завівся Сссуагівса вабсссавсоа базребосгсо дззсасосза чаалеазео ЗО ггаачавдчас Фаасвастав всспззвосац вадаздавача впоасачавста деввавзава захо шчучсавлдата лава ппачовггсс гссахзочачо аавасвпсзвзає чазваззоваєй 3480 чацєстаєвув воебосозекс чоссечссбає сСсвавусєуюс зсовсасасо сабосвлаяя 3550 чазассазса заававУусусай сісЕсСосаїав спзсассбво гоесазазайацч созчсчвадача зало ваккацавас бассзчатазчу зчссукзавос сгосвосрасає бачсадчазова співавстує по сучіїсчасс аазчаззпіазс зссастуаз зссаїоачії ссасолоїсїа здоглдавоове Зо сгавчавсавача савсзвоБов авсгогещиа созвсвлтвий своп па ссваадоаня Зо вчпазчавазкча пебсатавас сстаєаєсссзча пополазазсос гозасіоаав пд спайа 3845 взасос зсазусоссусст чавосвіс бссгузавача бебсашиЗв вплашвтвоах ЗІ ассстаєслчла бассотваставч зчасовозозаа соссзтабаєс савччатссая звазвазисов 3355 чазатіьшесєс песо пов спосо атоу Солити собозхаєьч апа раеастоє а02о Едстастввстї сзавсзаззчас адоссксаса ссввачкасс стксзспачив апаластавйса 080 гзасаєстасуа сгзазЗзчстастї саачазасєої сзаасоассзза дззататосу садстгоао аї40 стагкачЕсс восків пилка ссопзчапосс сасевсвасву сісти осев ОО кчитчктсосга сачатігролаз зсосскттсас всабассачо сдостчасазчав сісазаавобощЕ 42559 мис ква севзсосзас чассрУсоєсо аавчатоаєвсї восвовоаву авапоасаагач 4329 свавтацізвз азозсстзсач адастсадат зтіссзувсоза созаттастзуас дабсаасосво з48О чокосочЕсс гозбвасуєс сусазсвасва взавосасросз сазссотЗуву вадусуацає Яапй ачаайчавчас сдаїтатвслт всвссозавр сгзасоссЕсав садчалаєко сгтсвзиЕвиов 4500 атчссвасча сзуассвзааь асвссазостс Сазавісус ва сдасзласавгоа ачазасозая 4565 плдставваче сстїззазаса адчавсасчавто сваузакзос спзввазваза аавбоссдод 45 касзазвовог гозатууссяат дааїсчаавтсасц чзупововос звтасосзах ваабавтекає ло зчічЕссТачесс чесззсасазу всайиевато ссазоакабо ачесдляавее щкессосуєтих 740 ацшсавдвтсосс аззазссзваваєс звосзззост зосуайдшсту свсатлтаслає завласовосв 8509 спввасїсвві дпазвігасав сссрадасаваа всосавос сеорсвзууув азчабребеней 4850 зваачзесчссв азстаазоо содачссавйа саватзквза сгзсесазаває агалпасссса 429 азайцискка саазгуваацав їстслачовав папи поасочоа звассайяає баса 185 акатаскки ссссазлота пласассзат зозосстаксас бавласасстав савиллавсва пб0пао кі сатачис тасстзбазаз сзававсвгас уалістївсв: суосвославд спопасактя Зоо бкдатевЕжк тзгастваве сладаєвлаєа сосок єве сзазачакке габро вів БЕвказаез чсазасаєсту аабтачсяви зБасзсескок засозоу зай ібн ЗВ Зк ик «вії» 543 тату КУ лама МА хйх13» Бройорсвка Зістокчіва «4005 25 стиваи;апсуво цповосспаваза дазсаасимзу зсмиадавцва чЧасодасзова аивиачоазада Бо латициивис весоппдаза даддслисця зпсдослгилпуцва впипапаади чсавляацед 1289 мопрастацдивисо зссзспзавацч далася срисвссичца опоазозани Мосдайаох 4 ам чдадсваспади заазвачази мдаци;сзчноса здипосписли зичасисасу дапотдувита 180 діди ие пред де 141323 ус ди дез щи іі тет 11; пап свиасСсааьссти дласдаАсав дизвсоссаЗза заазспосвад мадсделаох пасавоцплеа. чо ик: ре рту зт пух щи шо о м лим АЧС ІЛ пасйчавзчсосз зчавОоссаии сода Зссвпа вапсвсвайли;в о чзозавачаци 3 ча су суУсзіе и пірехууихихоту лі тую х пд впвлвєериті сопазавацочо спосиаисса мемсдваииє забаобвосез асипссадльи Зо посидіти пед гйзис дисплесіті спийогтддіа ддідепся йти испідд 455) чсезасвосаза зсеаузузайс дисоадаситли зивсосоввов звичасисиз асозиочната Де почоаслацеал сяаацйийасину дезславсвв вчасдасиьо апа зл лані та.

ТІ ;рбаччайасс ачесвпааналос зиперопсоес пичоссаатси сплстециацал шасі за ки чаш 54Зз кі» шо «г1ї1вБ о пл «122 ВКА бло пеукдих кі ку о ух З 4 ха «ета Брока тивів дея їх «400» 26 пивнасасповсос пово тащ сеспасттатос пипдвососадам спаси пдв хати пи зпсадчспдляс сласлаатя сейссроосо спвпсосаас сллтсмацлує впипосвиОао ММ чежіз ЗУ діри квитки гру турів вія сззіз в виу це чічтизитчтчірі ц ця зо што самі плпачасйцаст асзаоссстєю часи сиАте аліавацлацва пласпаЧсзЗаМ нео дпиализсзлз бсавапааазс дададсващи звтдпсисви поссзасваци чспсададає ЗАВ шпозосравлтвЗза соосввпазапво пдачлсллти зву сво сповасовачи апиодлаодес ев лзодаллводяа спіІдесесданім зма діленіде дейсцілчедсї зада мкичия сет запа чозаппосви опа ссСшачисмл пп пчцат ваасдазово зеааеавиЗиУ сеть У пня речи соя т зи чуму: ситі умі "зе зачазсиавсс аисиичучава спсіссвссзз авссаопичич мпдчавасииицив сппутспао збо аашсввсвий спаслассвис часаососвЗзис сизацацюапй посоватлталаса здичсвавима 42 пиусадастув попросаавва адаасассча софудасустяй свасовавузиа зипасавстх 89 зе щу «ді сринящо чея пре тудліде згід р ме ца свизцсиизоас азвцаасаайа соссаавсссои сомоссцвово озазисучацй аа ЗІЗ «кеїйв 7 што АА кам жа «01 УМ еїй» СА «15» бройоркеха зібпокаїів «а0й» 27 Зліва ев а ази сід див ерт гр керчов о свія да ставсвавозчас ссасоасовза чЧазвасссзЗ оссоччазах час аа

«шій їВ шах ай бю ит чо. «3175 ОМА кола бтузетйиідумую аю РК гону з леїЗзе ЗюнодЗоЮтетв ЗЕ охгаї я ол МО «ах 5 скізагасчас гсвстатазз зЗалайссала сваздосвває Ззасу пе збут ді ла «рій» 25 кі» 55 ятлотую ти «їй ОМА пило» Сови 4ї- т тань -оті 1 - «ий примазосевха ВПО па Тв А пу За 4002 2 пежориЯ піл луттяо ЯК діди запавссаасс пгісвстививі се ди шпульогит тв ОЄ0всосбасво чачассаасс стчасланаА шує лю «1 30 кеїїв а З тля кеди НОЯ «із Бреочаортішев вв ехалів ХА зи «апа З скгаастасаас гсастатазчу чачазаао заставка сего пп ноту и з кої» 11 «115 ЗІБ пгт, тумя «вій» КЕМА сля зи кут до зни «тік -2132 Бброорлеха зїіппока1їїд оду гу» 7 «4 по р х1 фрукт тити ти тут туту к г ця щити о кн и на А чих щілині тити ди сададдстят псбалтлацвач часвосоооваДия ВаЧчошевтча ссевсооосо пспависооу БО па ан а о и очи ни ня - сепсису гтТитіл ге и діри цит КО слушний сппистзчасвис сдпачстасад селах виузопопосси асист 129 вачатчвилази ссасзсозза виасатшечеца зва стиазчалй шессисосии спосте 182 зачатки самост сритесмихоцти посаг продам сортами ко Фиалодсятсо слесатлицелі зайпвисосопоо пса шислоі сплави чвно папапзвопатаз 300 Миша таа бдловапсасз асиеноспоочу пли саиача аволпаососча поси осяас 3650 прути изнт діда щі ззрАЛІСТИЮлЮ терті ри дл змаскуєтлдтя до Маси зЗз заовсеаоссрі асопдистадча гсеФфаиеисо просо зас псосртослАНЯ 428 дечріщаї зп грчиульм сьговедаития ій сатири датами Я гііз ту ва звсоссспасиви суауауазци алплпасаєтлос даспопсиаий озсаОсипуєє спасФастииснх чи зихжутриинтіич ій зе лрилутьтия ться руху утіх су з сіируичижхі сліз ля: ль що спрптичааспстсацчМе село ст оииатссовао зочзипчайписостчМм виде пло межу учи лу тів о сок «и 45 «тій» ОМА елек ср шві 14 кн ва є вій бройорстевка БРКлокКАТІВ ша НКе зи т ЗтЕдатцств' геасгагачачладосалай ппиптдЕтад гас 45 пластмас сеча чЧаФфлссостлг лтссчАт ев Сех 3 они 3 «Жх1йх 33

«хтУух 45 ля гук

Си ОМА

«ві3» Броборсета зібокаійїв

«дай з

«ай»

ставтасчалс бсвссбатаза чпасзвоепеої постопсастоа спа що

«чих 34

«рії» 54 кій» ЕММА нт ту, ее в НН

«ій бБродортека Віт токайів

«асо За плтиззвиасопзос осасозиозоач часа злссуор птпавасиса зспсзосєклно сасчслеостаА в аВмннованиа со ссяпаЗв сбавиазадай дсссасолоВ сс зниклих ко ссассиачач сстодислога чЧеавсссвопа зпазчсписиа пачососаса аспзвсунаце 189 маляти побсасавиЯа созоаспссосей щтвсолувнаа азвсипсосада Часипасиши да зум ужиті тут ті з лу льлі рухи тут піхви отже іижитіхитих лізі тлу лу плит інд ссльтия посеасрачеа палпасст луці пепсин ага яристі Ди питати дани тів поз ві зійди ТТЛ зграя ЗИ че еляд зва пазчасаавес асзасзЗчаспс писоазвасва сосвпоасвсчоао зЗупйпичасстх йписечеспає ші я прати теж щих свіжу хі св ічижізУ ст долити зт ти их жи узі ув ужито лаг чичпсадипча пода цс плвайассо пваазоасиЯче мислі пари єтв чи мим ашана ух г тродзиттазутля лить і дод тя тетих лих т ос тататетани піди пспсчсплионна двачсалааЙсзч цсзвазЗззсгев ссспасастай сдивслпаства часова сшсу 46 стволи стла ппсппавазЗа поспсососилеа опадами лес из

«10 35

«11 44 плоту ТУКА

«из» МА

«пух о Бфсніортієка лаз охвіїв и ги з

«4002: 35 я юопргр трихуттьих фло ефв оц св оч пера и нка учити стрий вич пит Ак сопаасаосслеас гпсваствіазчу зчазсвіссз сзсавасгров асад че

«гійво о Зб туя я ла

«пд 5

«т ПМА о же че чим ен ки чн пи зреоеповрсека ссокатіх та» З пн аа о и А А А ун да птваїнсяви псассгасгазфр о зачавестс Зусастетлва спо З

«10» 37 штуку кп теїїз: 515 ет тА хи йит впМлЧА тт пе ак я 4 ум пхоспеорсекаА вхлеопів

«4005 37 пиаазиснвос пспасаалаЗУу Часазсваписа пспоспрачЧоаєс пспуцзесьа злуспдопаха. о йпс)зависпійс спасіачесва пцесисвоОО сип слдавт сбсавлслячавс пса ЕМ ючач учи су чу учи й я пах их и муфти ть с тчжеж:ус: щк фїйї платити три кшкен.

питав птизвассоса асоссилисис ссислиасвояв савзасиоеи Мналичачссоа 189 савсЗиззвиас зацзвзацицалж слина ес пйплвийззасо спопсерицаст чаплі та зщоджреретевщов фрі жирі сту хі Із учи ру фрпезозітиц що ЗКУ ІДИ ІЖІЗЖЖХІЗІЗ ТІ "зт посзчнасасия Фасад дати всистопв зпочпоссооза со с оплата. 2 шиасастичосс псосеалстпсимі зсзвсисзоеоз псссцчатєнтти спінпідлдсяава часизезЗоеса 350 прум чу чут че и жижиу й ичих щити цдутиири й ів п св м1оВчг чи чи - ихих ділити ця доз аспиастатчй модунвасово ссассзиасзс сазсвиц;вит часовцоноз ссздвимасах 82 впатдтсвис азвипвоовадоп дліддсдисиот сСдгосилслииви виспсасбдсос адм ли шщхвспастосвис звпвоМвазноч даддоспцеце слудслсмпиви висосаовоос подисайсли ж авпзоасипаач сисссиачау йзасиєзнцай пва ВІЗ кеїй» 38 к1ї15 713 шетул тут, тимій «де ВМА пулу вчу р кА 21 ми 5 кимазровка вити «ка» св тери КРИ суч уж :. прин и тзізетитІЗІЗІ В тлалалалитал тісту ще савачастувс псзобасваза аасовдсцусав сиззазстиа пподвонбадги чсабцайяинне БО зетіріитетеиії іти є дзрдоедеті пн а а а м о я і індсласстест пса ОоссОоср)і чдиодссьтМис мопс попвоссгабазч ап псаФгапос ТО пули рт ни и и и НН зва саиппоасасв саооазсицчис чаптачаасцит ававсйасициси зппсидачав сист дсняає 189 й пз вихлу пи шричежи тр итащрч св ев т вс ичжиаст поруки тісті політ що тятя тат тю туижть тт т пиачасисиаа всостАсЛААМ помада всваб спаайпссянх спаси я ТАКИМ ва чи еліті злети лити і и а а а а а а а п Н пи иутиия пл пиачЧалиастчис мчпасласзв пада зсаав уаосипсочачси сслеайлсослсв пазвопипспоо ЗО речи сф діїгзидриз щодо Зх ще плутьо фугу ви зу гуси єкт пали цит тудте пудплащна иа спнпеапосзова маси слиьу пса гслаца осо спве паза стстх 369 пи на я десСтлітллл(тяїи сарі муд де бедатамти дермі Ії пиппвлпиче ссоосзазчах дпаФсациеат зпадацстазвосоз созвсоочвизч ассолоетидид С, зсадоссиаа чзМосупазуви дастпсаца ззазавасос зазазасиі вувсастачвоа 180 терти леж сер проза 321 вчи ер щих а спіу дасть тгжИ фізи утво ре аччадйицлислс дела ттсзплав васазоззав 'ссосссацладас алддолоаивуІ цдпсосвайваЄ Зам павивиотзасл пласазовай зсосавзиани засузадудя поичЧацосаса Яосасзгадяєса 00 цицавизпсосв асововосази чада зватоазслвозс свевсспазоа чсваасасао БО пчаппсозого чзавассассаи дчлолатстай сипсосааизи пово сомйацй у Аг «10» 25 тло 4 кош 44 та1йт ОМА ут ух СтемічсУгіІЗика схід Ми зінмаимУ вка вади «ОО» 25 ткож ль ВІдузв ще дирир о грліи в дввия кит др ше ад пудаїбяеучаст ссастатазча звсаакаскса сссочбаст сс за штаті дг ких 8уо пеїїк ча бло ТИХ чи кА келошечя он и НА НН ху, ся звоасю пеже вхлсрів. дух Ай сво зи тв ододв дучьцдях иа и гія гіч дід цудвеуцо вині хе скавагавравос іїсастасвазуу чазцассалос авсосзасабосв псгу че

«Рій» 41 пе А кА З «2125 МА т зу у т : 1 и жит зроцорсвка вхічий «ап» 41 шсткваїтасшувос їзсассавпваа зазассшсва сту тста то 5 ог а ками? З «8115 44 ло ги «ий ОМА шлам, ж ую ана ви зрочовсеа шжжлерда «дл А квО0» Зх пипзапзосаас беасгіуву спалавблтатихй спспапоараз ге пе є; Осо ву І ша «різ З че ліц каша» 85 пт тхй шт ЕБА поту гр здо ах ема ЗУБ «400» 43 чіслі жу уч івизии депцеулуєтиии чи сте тчіч жу жити шкі та де ци тт ше пдиамеслевсий сасизвизвацча ач чсицашааах спала востй запа овя БО

; . тет для щоці : іі ізізлертії3434 32 пит стат Ззослвовоососоч ссехнусстав сл соссасв сива сасрвою слати 129 псмззизащемі зисптвовв слздідадіІ сІДдідІМлсМ вів нчАсрах дет дінтищд ла шпчисзоазаваси МпМичссачсдс сСпалазайа пвивалпаслосоо зач ачваа дода пу п щетини : соя рвати поміризеритм ит: ери ре істерія ее Аг чоспавасс сссосчлазалет зитаєвлшиммІс вас сррасль сист зашрхХхОогтОох А ди утиніяя тт йти Жлу ду шоцокя цоарлуиєт оон А аа шкоду доижия цдотекух АЖ и в апсоскжшсемиви бсилсаацпсиов вавсвисосоМ засседиаом лашиашза заавапашою ЗО м а а а а а а а ка а а а п а и и и ка ин зЗде перил стви спожопиозазімкр айпад мумім зад ортемас вососззосспспеаєс човпайицсми 369 авзвавиассицави спзасивзиотгиач чсесасутсви запитай со бозсеаассствам митиалтласчеа 120 А сані ! ! Я З яв втра ттчетутаї зи щцоццоц оч дев тт ет причи са црцазизичи Кир спи зи, тру лог адЗзаЧчосзоаи пола симМмадсипода папа «слід льаяЯсввИ МИ НИИ чаУ деруреристь в 1513 пе Морпасрлуносс сіДЛНТА ЗУ сту т «1 44 поту ще «и по пилу стух тк х вх тел ве має «ап» 44 вар и стор хг ри зелених пу пі прю зх азалія трати ту и цавацасавси саспацаз ачааслалио васзацазас вип йациче пайтиседась а пизсоаосзами посзиаамиспсИ зле азоца псазвапсзал осади сли ита во Ак очами ас пазл їмо псиааз зичесхась педчалесьма птсеома тва ам вущсаниосв зитсппозвосто пев осаосниМм сусла є сподасна псопосисчяи ра ранчо чн р и а у а ни и ик зва слспцпализз заасарасчаФч сасплліссте пил зчзавсімуо ззазосеасиис чага леа ЛЬжЯЖ зичосзасисїа; оаищасауцв селосипатйїст паста шовас оса вла тав ска туда іитті тиви злу пу уже у пкт сві дути лу пора нин прі юю ря єть дл пиасиинсласс подача велізаввова соопациаоспа сбдащослаце вал югм яки и и з пута из путі едикт, пр м х та чи и ни ож чЧчазчаийскаси цпалсвацйзаци свовзоалоди пиЧасечааа вслівасавос звсвзивчиачасс ОО пихелиАаєта іх смс цпоаспі асаосиииита опал зЗавосзошров фо ох За причи тр дюит зажити ую кер ку пути ри Зав жі од ето іа цех апчазцасила мпоасосвааву Фсосісаввите попдессспвса зозаоовсойл ил ва «2102 45 осно ні строку ти «їй ОМА пло» живи ших зу «А» вкцітісівА безйепсе «ей люють и не а очи і и я Фу ситі ти ую ку зи кий» розфупипсіеопбіце зедовпсє об фл маїКо депехвові Я5АМА «002 45 частассчлча чсвчпатевия ко «їй 45 птлулоя» пог ща й «шій ОМА нт ня не піні сія ех чаї акКІгІстіві оеЗиегся «иа» шоп чт ди 1 ризи зійти ку зх р шиї ин МІЙ «3» розіуписівгокіде везцєпсе ок оїп о увтхо сепекатей сБЕМА «пп» ай не вжив пледи пе тс лестс вазсзанака о лена Дт «ЕЕ» 4; скул я «4 «і «ії «й» УМА «шіЗ» акжікісїві Обеодепса «ТТ тя хм хажіє іо іі фрі а ті ско чзнкхоа аеїгрсатей МА нень шок слот ор пет ок ода шко чем сема швах яти дя «ОО 8) зосастсаз ссцссастац їх г «гій» 45 кЕїїз ІЗ пороки «1» ІА лу : см НАННЯ нкзхуеа «кій» вЕІКІЬХасІ1вІі Зевса «вих «аа» роіуписіеоссідв вецдоевпсв о об ій Узссо депехкабей азЕМА «4902 45 зочосотавас оспоаста 15 сеї» 49 туя тк «и А до «Еї» ОМА «шій вирі гісїві беспдетлниє

«ишОох сту ауту на, . ау одно я и ву чия жк во уз у ди піс Ей «иа» розїуписієосідцєе ведиепсе 5зк о їв Ууїпхо деператей сівБРЕМА ши го сао» 49 пет др 28 всисдалнісв пепоачеоско У спек це «10 то щи суті чи іх ях «122 УА «У вдусаїїсз1аї бепивасе за. «ей» титулу шо ким Я кру перуки чує Іди ен и Не «ше розіуУупмисівтЗзелав зезцепвпсе сок і зісто чепекасеа пакМА и лет щі ка» У гирі Кур рретиреиугх а паста осо бодусигстоу ке «війт Бі я п мнения си и стул тумтв «А ММА полу лот» г я яті чи жи «КІ1а» вхтіаїїісіаА Зеєпсе «ий ач з ну иїи зихизхиужияні ож уч КІ фени уж ре «зем «из» роіїуписівезгійв ведавеопст ож іл УзшЕто депекаслей ЗвкМА кабо» Бі тсссстсача сасдтавсаас КО «їх 5й «11 28 лен ГУ «Еш ма мо же шомані 11 и51 1 чі тт т тку «10У зп Іісалвах полі Вт «ишОх тут з 3 ши но на в и ШИ НЯ джу сту др кіш І МІВ «222 розіупосівоїіЗЧе весцелсе Зк їв о мМібхко дейперацтей сіввМА ел Жя «ух п претубі с текІв су гу діри кокер ко З плппазлиазвззоа повпссооа со со ло ща «и па шт ітут жук М слу з» гів ит МА кЕї3» врсзьЕзстваї педиепсе т «вий кас з яні сут ми мя сть че ч яю лих я. м очи ноя «виз» роїуюкисіствкпят зехдепсе ок оїіб іо чепскатея ЯМА и ДТ ці «ах 35 ; ; зи дечедодев діт зд ппіаасиісчос ассжасачау КО «вій па кожен ня За вини сви соло пгумтт сей ОМА -лтулолух пек во ян тка пив «Д1З2 вигтібтісіві 5аеопиепсе «Еш лу ух я й из зизифініужійитих о ку ому у фе 2 кг р 3 ие «23» роіфіупипсівокіде ведиавеост ск їй млЕто депевуівгей ЗБВМА

«4002 54 тзЕЗассто зссзазаска та стул т як «ших ОУуу слів т и? а я ТУ «жа ма чиїх вЕпікамствіІ беопдлапов ї

«ви»

ятати туч, пе кити міні Ко і речи ок ча вому вийти році тні ефе ФІ чаш рзіуписієсотісе весорлзепосе сх їв УхБхо зепекабец ЗЯЕБМА Ом, кох ве ЦЕ о ни й о и ит яю огричия и те поппааассу паесгтсот 2 «2102 За ил, ло и щи щи шо туя тую тумд «рів ЧА я З ке ЯН ее кіз втізтіхорїіві оедиевсе «их «жа» ші тУпиасІіеовІл ав ведовпсов ок оіп тісто сепесаїтей ЯЗеМА дл ЩА «400х 56 зи зпририкв у ке ие еВ з ппрачачока стосу и «шій п рони тугу ки ян. чен тУМміх «ях ОМА еконо вутіБвБісіді бдшасдієїтьсся кра зкпіміхгІїсїівА ЗзсспепоЄ ипй»

полк тлу туя о іитмутяия клина й или ще - я - 4 як ще пчіцт дх уів 1 лем ч«икіР взіупвносівоОкіЗе зеззлелсост ок о ї1п мах» пепектвплєі оБ5БВЕМА «апа» 57 Фо сут ут и житі пух і. зіви ТЕ звсствазушечє стазбаагко жо «хіх 58 слух пре «рії ши лох ТІЛ кет ОМА сила ас дует КТ 1 ян 1 00 А А КН ли см вишки сійь баса теле ї ко» елуут чих кожухи кун в ни зе її ай вому илутімі моти піс ВВ «шо пазусі яна чЧиепсе Оу двох ха чепекасені с вЕМА «ап» ЗВ ее А ее ложу рр ери т чавазайцасо гшсавакоу й конку я ща «их ПУ ло Я жо С рин ей ОМА яшло виг жтучя ді ет ле «жа» актліїсзаї бедпевосе «й»

ЄЮ жене круті -4 с а нини Ши си и т еутчиа лу се и МИ кн шсоіутиасівсіае зепаепсв ок оіп т1бго сепекатей ЗЗАМА «ад» 55 стаєтоастлео тоессссвавх о сеї Бо хиИлі» то «вів» ЩА о ше джрві шал єї 1 кре «13» зиІгтіТбісіїаї Зецйелує Ту тай кох меле ну дити зику их рон: БОНН Зк вони "жехтЕх у гркези ие МІЙ «ха» роіупосівокіде зедиєпсв ож апп о міїхо депекзтегО ОБЕМА «ав БИ всвізалава дбавосвзвазца 2 вспщодасана севстсззача М сло ри шли ві талу, док мими КжеКУ шопулоту тут «іт МА «Е13» актітісіаю бвайепсв со «ай» сим акме -З жк му кі зем - С «А во пе міжіжа рт в уми іє ТЕ ІІ шахмУтс НЕЗНАННЯ жеФфіепсе окоха хх ро сзФетуньрт а ЗаЕкКМмА Ат 2 «ами» 6 доза цес ітсс стл света дах вечір зі нтаіЯ геез ВО «и зиаазлзсазвос мпсзсивоачу чаАчазчподса авчавссаочмо пайпумчаашцу сидите ка пи апчавпацчлийю сиссАспснатА братаписвімт рапоапеасчох ФапелидсщтА садом пеВВлХ КК адацосластя аачесваайс засзсууазвс чпсудсацеас свчоссасича здозсочочаву 189 и ние а но вно о а «145743 злом оп оцлрифтьк прог риття тт пити ти кіт ти ти гу МК жаупспаии поспасЗпасоаза ссавпааичс маша єт вел паси чошостиаоаачаА а клич ижититі дату фриз теля ет ужити ев гаяз4 гу гу г до р З лиасвцоипочиа осопзасс ач исва знусцясловио воіосзаназча ччалислададд за зззаассима зсссоачсицис вусталиасциа писвавосуи зозсзуучация зсваштавахї 350 чацпсицисадй дагассавоя ваповцовсса зоичоаспавйа восачаслава папопраонеи яо дич іч туту йжиця - рр р чи ІА НК печи «ких іч цін ОА пуцсввудав піисазазавас зомсзисиує вазвсгцадеа цпидесосвосйпс сосозааоацея 450 ері у ли папоцвицвоу 40 зла У ке бе сії 497 клуя я см «ит ВКМА ки.» арки їблійі бедцепса туту «й» «виз» роїуюкисіствкпят зехдепсе ок оїіб іо чепскатея ЯМА «по» 62 зірд діди ідеалів Са у ет и - пиддаия ді еррлт пев лу тет я ск спизваопоЧчас о ппасцацачя щеплацлтвтии вичиапаздиспа зачаачсиии спала щи ка ше З т ка З и аччацзчастій ссдорлімаєі вававосвог вадам: іпилописатя завесвов 129 и и - кутики рі рити ти тс т Що ярих цу пре це ди часи зихозазасова спопоосом Зсялацевчас павзвслорав Чопа а пи чн сет року аа - се тю ож учосютв оч гу зечио хз риніт рифи "7А мпизавапача восОшосаци псппадечмим зсазвовизУд сопчусаабиса писпидчеашии 249 заажтцихіітізі це злія1зІЗІТИрИ и ИТх при оу путч туєутуєх тушу щиткіК: здат цтУ ЦІ в а А чия зла паспчзоспапива пора чззЗ азствасваазч чЧизасадач пас осзоцоци ще шатнх 00 у «зайвих дз зи и фут св уж свиту поету скит приул я в юю лу т со ля ж ст Зит сипачппасацчя депделаделних йпдалзовсатфр зчаискцінтий фопидлеїата вппавийесв а зо ачидаласвтч паатчайцаца псососаци паса атад повлилизвач ачавосвиив яко супу лугчежілілуичі дзсретізізфзїзгртї до щире іргч1ч1311рчи 0 грі еТеТІ Кт гу дадіємитчеи дае пітдоаея іх Беадооозасз ачачсежисицч пзпималадаєи поза сім 480 зидетнмтадси спід МІЗг 4а7 западає зипаиаау чи. «рій» 63 кві» о столу т хгй «їй ОМА ве згід ше іс «иа вххсатісів зечйелоє сл тя «290 и ОТУТ з хуя ва чн нн и НН НН ЗХ т ке тугу зни их розіуписіеоспціде бзецдцепсє ос вп УузіКоОо депекацей а5МА а дл Руя ду «400» а счачтстлчлча бло й «їз 04 стул п ща 2 «їй ОМА оленя ква іі щі сіогуурєтьстях чаї акКІгІстіві оеЗиегся иа ту сш АВТ - З тітуї мії нашо беспітев о тую з в ква йвихд «а» рзіуписівокіде зездлєтсев ок оїп о увкхо зпепекапей 4аБ5БМА «апп» й перо волтх уж гчучеудізитдг реч песо своя псзавочаоазча У Зло де КЕ ГоЯИМ стул зх ак жу «плоту ТУКА «из» МА «шіЗ» акжікісїві Обеодепса и лих ша нити ту чи куті лану ім меру чт ут я т-ек 1 «і ния пра а Но ЯК «сив пвозУПМИсСішсоКлае ве;жавлов ох п АКко аересквієні ЯКМА ий шт, «ех о дев втетечі діди луг зсозпахсзчсз азааччуєу ща попу ойух па «1 по Ул з кій У та1йт ОМА лу ту сум ст ну ихия жи Хх вхспЕхсіві зезчивпсе «вх ис и зе жує сич ри А ШИ Кок чи и -щ З атм А «3» Боіупцеіїеосіде зецоепсв ого іп УуїїсоОо депекатей азБ8МА дя д «00» об кзачетсссс соаасасику о та г шт ше Ото; тя г «и А до «Еї» ОМА тут. дині йітішщші мисі «жил ВУС песен ня

«сх опо и и жи ку и ії шко ер шрот тут -х х зу однин кій «Р роіупосівовіЗЧе васопєепсв о ву Її о Уузхо пепекатлесй (веЕМА афооВ о Б г ЗЕ "вові пибсцавоипає 23 вет статай псссзаасиво 2о я ди «Ж НІ 2 о сту тт че іх ши збутову сек «12» ОМА «ві32 вдкізіїсзіаї беводдепсе дат «ей» «ша рофуписівтЗкале зведпавосе ок ої зіго чепесатей ЗаКМА я ДЕК, ГА кап о авпоспочпова кесоссиссх й «Й п З зи кі М: «іш» ПМА полу лот» г а в чи жи «КІ1а» вхтіаїїісіаА Зеєпсе сту «ау шеопутю ча ни ну иїи зивиза нужно фу фони стук різ з ЯЖаАщМх «і» роїуписівопійв ведовпст соб їй Уїхо депехапей 5 «дп яд капа» 55 - чит -ех сич очи р чЕсчзчасссої ачоккосико шо лоб, с «жі х го «11» 20 пл птпоХхУ «ЕЕ? ШшкА мо же шомані 11 и51 1 тут тя ет «и ази пІісіва виш ПЗ «ЗУ аа доленя . Заклик ді ше иете иу т ді в у, ства ку коди ніш ЇВ ХВ «232 розїупиосівоїідче вадцепсе ок зп о хіїко сеперацтей сівРЕМА нуту, тр «ува У ск жи ж мч гру в вижити ті ту касілсіаст свостапоао 21 зл -4 «і в 4 «ті Я слу гу» ох «иа КМА кЕжї3з»з аксітібїтаї бедцевсе туту «кий «виз» роїуюкисіствкпят зехдепсе ок оїіб іо чепскатея ЯМА ад тн тя «400 дя тату я тих тих зи хіпі че ем че січ с езізитизичиз ци зу Кік вн що спидаозочас ссасцацазчу зЗазасвайпос здаадассипза писсцчацищз воувисиняа в адсчзицсспіс ссадчалиаса всппезсоозоа зааздассвпос дадлелжиацсмі апайпсосаава. їхоО ЯдізіІ ле ІМІМ1ІЯ Уж тутутєтче з кУиУЦ ЦлЛЛлУТтІ щТК мб дьруг ри умі чт зИЗІуихІУєЖІВИТІ кт) ц о цатУєЦцЗлІИ" тод маутаттелиї сласзвассоои ссБжьнисо садом сосовсзЗзваЗз попа чосяМо 13 зали свічі суиткю ка --. пз яри узі и е а сьд ззутрчіяічхя м ддриюитя чту и туди смлачлизвийе возачоооси моссипсвца визчасвусва воспрозацч мсекрсчсааеада тай ззчивасицао позу зпнаісалиасис пчдзасслийса опсассопоаЗм випаде шо ретире ді ищотит я се ити й кейс руту гіда щиру злитті и и чн ния а чЧчаччасадст сдодститтва плпадоесоовас очачсачочщ тунощсочалтяао слати зо чациисчсиас плеочааснаси псоссзвисоу зиучицасоц; аавасацсза асшишсаєсс УЖЕ засидеввсо? пвозсатоос ссосадазаєс волослаивстіа савоссвеопс срсивидсецо 459 птисччания хз засзцаціи ази «8102 72 кві» о стуку тій «їй ОМА зу Яся ді шеді че «А» вкцітісівА безйепсе «вх люють п ач не чн и НИ НЄ дю чит щи гуріз єв За каша» роїуписіеосіде зецдцепов ос о фй Узі сОо дЧепекасей Я5ЕАМА яд «00» 075 стсазчосаєоз обчаасасовоо о «ч«еїйх 75 ето» п ща 2 «п15з ОМА нт ня не піні сія ех чаї акКІгІстіві оеЗиегся «вай» шотуту ту ско хи в ші нт тілі чиї з ря шиї ин МІЙ «3» розіуписівгокіде везцєпсе ок оїп о увтхо сепекатей сБЕМА «апп 18 ре етиренеч ер седучтудед ліг ситу дЧасоувовнисй о пт тк «кій» 78 скул я 5 сії1ї1У 15 ста. я «іт МА «нії» актітістві бедиепсе Її «ту ля ті З хакі іо іс мм ічех сук че3Кко аелесата ЯеБМА нень І уУКПИСІ НОЯ МВ шеораєтосв ок охо Ко сиве оена пики А дат -4 Ох 8 зоевтсзачбо заїотстс ї8 «ій» 75 кіз 15 чиїй» ОМА лу : см НАННЯ нкзхуеа «кій» вЕІКІЬХасІ1вІі Зевса «вх «аа» роіупинсівогіде зецдовосв ог о їй УЖЕсо депехкаїей ЯМА «апа» 75 каспечечоє Сбоепатат 18 ее яти Же МАРІЯ я «11» 54 пе пух кк'Еж ОМА клоаки тот зх гр А ее ух

«аОо0Ох 76 п- Ян ожиуттю и жопу ре, че АЖ У те ф- опрІв с тки тк яву рі т простота тож ит сту со пвспатчзеча спестгаззач чассасачаста пас завои позаазсцса давсалчао що виїцоцоферивіЕ и уроці ох ри В учеу р ик фрез цизциучи реж цер о са пусті хутетутічу ПЕ чаааааарс соавчссча сикссзочаз попосзаосаос зссагессві орати ем счІчеасЕсло зчазчазесаак септевзсзса задрапсачо Ссслзадата чавсозосви 155 ївІТВоОХІОЯЄ сдазчзеічавсо аабобУссся вазаствісх чосчЧасвоаває ваксроссосяя 255 дит ужитих ово ожркчгречирини кол оф или фути тк и ж вон грехе щити рек щиті зап ацілцесссв ппжосаозос сісебселас зсїзсвузко стксзосазс сасссаасає 3539 у ит кити чи з ничих учииу чий щирий диню унію ють ря и ее у жих те сасадобаст госсстсоцу сщоеасісссоо ссосвовзсса аспссауєца Зсагмеуєтта 2 папацикиста шен що Бвсчхї зчдасппизкИй пайсапот фе маеседтвк дасеуКітвата. для часчласооста дасстпиехеснуї чваспссвная сСсачосозсаочосс сСоссслтлаАт ВІТ аа со,

гриль сте стасасосвиї спосвасЗсц свої осоки зЗасдастоді попит дл чавчслачса стласассайь спссовсссосу своїзсоскч здапвасисвио ососппчаопе вах тлапаслівіс ввозбпсзаї ачадсакзсад сіток бстсавпадвгад ьЛла сах сов засвзсопосзаК апасапсЗсла оса плсзозагев поко Бл 77 кій г;

«стих и плоту» УК ит А

«шїУз аксівісзаї Явайепсе шо пу чих бити як ее АНЯ пул ау и р-н ї чі жи пужриту ту туш

«и воїбУХИСТЛВСТО В верес ох зп ко чепекасай ях МА са тн рт

«ой» 77 фощоа Коцичзет що кедах стать причин фо хи ув учи й пзапасазвої састаеатаччч пеісчсасоссв подиосовкоо по

«их 78 лою дл бек ке стул сум м'я

«їв ПМА ел мчч с пику поживи чАДОи вххіїгї1сіві ЗЕ «шосе

«а»

и лим чи титри єхих і а ик пизирезизті ит у ри не р З ем

«ді? роїупипспівсзгійе везавлпст ож Зй УЕхоОо чЧепекапей а5КМА

«дп -6

«400» (78 зеожу рю уретри пу я - руч зрізи кН

Бавйтївсчаст сасіатазчаз псвізоссоаї повопасолт о

«сит 79

«11» о

«із ОМА тії» аксіБісіві баслівтнтя

«их кокон й З іжчнї пу я кфінро скелет ий ро чпвпат"диеки гій

«ДУ позуписаішвсосвов шесаєтпсов ох ап ом хо сепвкасшоу ЗБЕМА ча 75 їввівтсвст сасптапазоаз садасачесс зав 45 я лют ди бе и 2 5 ве

«кш117з 4й ло жо ТУ

«ВИ ОМА ка?" ашсвьгсохвахм бедзенпсв ноту ти й

«шах роїткплсієзсиьа Зебддевпсе ок їй іЄсо сепекахштя ЯаКМА ХА й «ами» ВО едоцов о цичзер цю ее в осцІчІч: см усу их яку низу дово ния 47 павапасавог сествсвазчуз зчсптасватаиос свппасваре о ге че «10» НІ суч су НН Зб «12» ЕМА «бут луки віх «Кіа» йгтуха вагіна «ад с «ап» ні аа ЄМА ХО ММ СЗЗ мно с лази пила Чазцосч счвосачачо БО призітдриреуттититьт ЗІЗ есе дитя приричіти тя зичу пакт Ка впадваписао своп Ммсцпи ччсчачалсастт завели спо рВососмсосипис далее 170 пзсазассзас спиш ста зе пшисан ссзапсодпиая спос дамою ла. ї5Оо ЧчиписСсалсйст дайлсаслт зсвошесвиоюо супсзососипоо даллииаслнх сис Б шосе база йсавоссадосм спадна пса сзапасатно 09 пазвзиатваця спвОосошоОатградоадасчесявй пси тсвз звилосайто псппапамлде 3659 я пд дози ти ді дуету реч ль ее ії чочосаазао зосззЗавцчсс аипдсоспоитамй чависсчас зисеасашпчс адалдалоела шо чппосспчиаспсаМ сор смс у спматсцивов ввааассаю соліст Сеат В 25 шина ана у ги З туту дали и призу чия т те причи тити кА спдшсяЯсят втлавтлосастс ВссоОсосаиса чосоапсалиситш саасаттнач апсасоезУввоех За пюре жит вчити дити зей оце лульсо тари ІВ жІВсВІЗІуитизІви пат изиз ие дл пудсренитх бра оооссмі запсвисчиьсо спра стесвл зазасасосвос апосстиасасшся во от ик и тю жи гурті гріти при суіиті их 43 ирит кити рити У ук спсацоепвовс созосзУзсиОс сдчАсаАлелтс питсацсиовиа бопоазоопозЗз Сайтом с во кодтчцодерцери Звір зер жару тій ихеУцз гі еВ тину сви пов созвосзазаачас асаиаслачецим сбшацстасн чдапсаосаосос ссвсосвацчва совет сш пн нн и и ізетрхржитізі1: м пає сптчичисосос лота талоля ваввесост зчаМнспосача спос стд плин ба кети гзчееия сечу узі учити кати и и щи пе и допиту щи ци зле шстидсацлиже спсвслоссгп о аоосососсицЗуУ ссавця зп аспиавиа аа ее тападвайзо бсопосотосСеа псих лацеає дадославстоа спопосапвла адподоа ач зп дицатиилоаз сизачзацчсиаа азасизаала ааосхи ло хуя гу пз «1 Ма «іїз 4 та1йт ОМА я З пе жу в хе «кій» вЕІКІЬХасІ1вІі Зевса «вих ис у з ри и гирі ки фо гу гу щи ати «ка рзіупцсіезтіде звециепсев сок їй зо депекахей аа ММА «дк по «00» я птадтапсапо спасти тЕспесвЕЕпо прп опаддло се ап павевсасчпосс слсомулаея сплпсесипс поспоспааа С с сеї В «112 40 «Еї» ОМА тм. дені йпіштшіші кігті сот ВМС х песен п

«то тя чи хкиха и дик я ні вузу уч учи я 4 хе нен к діти ее 1 «Ро пазіупиоосівостоє шесслєелпоюв Зк ла УїукОо пСепер агей ЗБ5ЕМА птапОз 83 с ни ен чи чи т се ни ни ни ми и их й ївавсвстоавт свосакастнвр гессассстс серудсвтвому 49 ку п «ді Ні 7? 5 «их 41 «бутку: «ук «ій? ІА «ві32 вдкізіїсзіаї беводдепсе зт «ей» «ше розіуУупмисівтЗзелав зезцепвпсе сок і зісто чепекасеа пакМА «дпа А ка» а засво сс сассасвоЗУ паска 5 воза оК у 41 «Рі» В5 З ди ка» ЗУ «чеїйз ОМА злу . мя сиди жи ат ахтахісзівх Ззечаепсе лугу чаш шоп п нь и НИ нн нн НІ НН и що 3 ямами ак рзалупнисавопхов о овеЧЯиавИсн сок ому М пїто сбдепехтхатей ч5 МА кайО» 85 дудьй ретст дит вв ак нк очи п о дреди до ді таватвасчжитсо савосатазчза пстсзптесазе сатацоскаю о «війх 85 етул я» Фі «21їЇз 515 лен зх «каш ЕКА нт ух пік ши ої хто «їй ОкУйа ватіма «аоох 85 пвапоаслси своспосоаЗзч чзчасассадо писсвссвос сзасосолиичЧа чопсдоспцеа 5 калі ит ви" зичу Уч пу жур жичижвих чи тиуйх ТАТИ ихутихутжті тк юри зчсіежіжіВІВитІ з й ачочадиало чпосчесуцщтщом лота лодаєс ппосазопососспа спос допити им сСачоссличс дилгслатссв 'завпоевесвоас зассасллоис стисла тс дпайоацоесОсаз БУ дебіт ку жі счутрзрзихиуні щи о в и нн и НН м и ни КН щидчессасс песппиЗзаваа саспосвастас спориш с пс тсво чопсзеассько 24 пресі етутучетря учет речення схе те ей пути чити стече серии те т за пзсацлпоасчч ссоспсссоеоч синачайсоас апставасопуи зссаозаосчч счсслччААс зпо ззаду лу ІЗКСТСТТК УТ иічИК ри дир КІйх суки пет ди пд чачосвоспос соска сиусв спечсостаачиа спдвасслоб псоссисосзчуУ сасисислтлає ща пу Етики вчи ан чия сестри изтіи се и, ни А й сасчаЗстсаиМм посту сусп Оос срок нКісаче чат спос яп зу еру тини ехо пу ижих пути узи ру грузи уф Уго луги пух д ти пали да поичЧчаватчуесва атчевлазаспо сопссавосоцс Чопа саЗсост аспипссвосва пассвиовас 450 режі и туту иттвичизтуя пззиутиитиххтутия щл З педусраслхєтияи всвавосстацио часто ях було т «ки» в. кла лошонья дог Бали то шля тУкіг «їй ОМА ка?" ашсвьгсохвахм бедзенпсв полу «ах

«шштаМ про1іУпиасієвзк:йе зедивпсе ок 10 З7іго чдепекдієй ЯЗБМА яд поз «4505 87 .еодоцоноцизет цим ве оп оц: ом чумі 4- пір их вия 4 п павпзсавосг сассвсвозоу пслаеспстісваа пачзапабого по сту ле во «дае» Б ето А «дя З «тій» ЩА зиулолу» доня кі і тизер жу я «ші? витік їсів: Зеслаєпсе «и блю зи титри -4 зви лу жі з Яр уже твої кун зла «йог роїзупйписівопміє вБечдцчепст ож пп упо чепекапей ОБ5ВБМА «айй» 88 свваїашувто сассасваза сапрособоЗза усччсдава 49 «кі» ВЗ ярї1їв 44 ол ГУ дл чеше АХ «із акті гісів бесраеатьтя «ж» лу чу жи ит ви нн Я ня кі ву тини мови піт іх «ше роіупосівотіце шесаелоев ох зп о Ууїбха девекацесі ЗЕБНМА «Фо аз тдлівсовсї свстатадла ссадулстсс восаосподтс ЄЕг пд опал ссвсто своп сатпгрроссдлистстшии о пипочасссс ст За екон ан жа «102 ва «и1ї1х 43 «210» УМА плоть три Я ня ту Сезичалкутилк. «са» вЕсіїті1сіві дезепсе полу я чими «ша» про1їупиасітстій!в зецовосе ої і ч"ірго чдепеедтієй пзМА и й ль ал «4005 о пзвапасано саствівоя вяасосакас виіпаапосеч од па «т1йв 1 пул злий кА Аа «ті МА слу» р дак чаю екв ЗУЄ тару» З апипзчавносува аспзппзсас азосззсази вусудавула судовосоцес спадааисис 5О р Я тури рух зефір ичих пом и и ч про оя стер ери лив я г чисвилевеи опсасссчс статично пссодпайсспо сосеацсоссли счасопеасас 1759 вирити щити зло ут фути мово жуІчзачичижижиу тлулуйуичиєиихихихкі жита вики и рити лу сети зо сзасазчачас счассучеси савлепаоза ввасоспоссовоа ссичсМмщоце осушити ік ссзччасавплос ааозсяассв боасезосзпс зазори сст сидемлеєстьи ваги о а чи сур итжи та тжежту тут я пдихихтли или рат тт ти речи -ї зи тит питати пл Читала аловсзасос сслншососУ Зсчесича савадоспсвов асо заЧооу 300 Ки ту ит тк яки я р я г та вих ч я и г К ва яр зриву ие ук: пчесассияи сзсоччсоча сеассадоасад чпассассяйс сосасазоци чиаспстазчеса зей керчия зккУщоцатаї ми ч ик мери чу тити щи спи ж УЖ м у жі п пзопосаачи суссссу3а сорасепспно зчосчосоааоас восусиаишия сива чий дере Ве бретяіичіея густо підсів бе риетит се її дощ ачдсосссиасс десситадснат зЗчпапоосспвс заосчпспаатс собдослаовитая втпосисм и рних пукт и ее презент дгдгр древо те дев ддетдутерт код чшсчччсвсв асзачзсапдпо чпосиаввазос засуссватюєт встасстастіс запаси с зам ор чия дручежежівитзиріи лети дтатйтеии о т пу ех рим рзузгзіреутІчичаИ Кия криз ефииреити и че щире встлтво ЗвссчевоавазЗзо часи счцс саслетшовути пБеспЧссоис ЧоспоЧасоше 50 є - с а А а а в и и и пк и тіл они не нн и еп м в и п и м 2-5 штассвсспсва зсисчМссос срусстлопатси олішопйсасо сСсосишпсиЧиас паттотаца БО часачдссисеа седдесета стпесосодо сочописеас созсоесосувй справи ссо Не ср рих т сетижу тити пери нн зни кити шН чочичоаота зола позоиа сосвсосовопсов висота асосшотесоо спосо ви щас вавовчовопсос совосислар сс стств паса сором 49 к2105 стала дог ше попу піл а ОКА «кій актібтсіві безпенпсев Але «кра» питати - 1 хіт умів и пліч жю й с. «ра Божу (діри і тити гі ВІЙ ІІ шсамеУхьсьсяко НН жеФфіепсе окоха хх ро сзФгІньисор п КМ «дл а КАМ Я тзагасзласт састагтаззуУ соспсзас ач гопоссасо п нтуч пе- ке «20» щІ туя Аг ча ни ту стух, тм «гій ОМА я Еко ні че, че «ІЙ» вика бісхвА Зеопепоє «ай» лю з тити п уч о пк ери в а и ВИ ИН а Чо «Ек» реіупцорівзціце вециецпсв ох ій збо зепекайцей ЗаКМА «дта- з «4302 33 павпрасад ож сло х, шорт вавиштюєсиу са с: сссЕ ЧЕ ча ди «и 34 «В1ї» Б чиїх ОМА «гій зЕКішІісіаА бециепшеє «вл «т ззіупусівзійв беспівйст бру іп ко» пепекатей ОБАМА си ползупррсівоКіОв о Бзесрієтіст сю лі члапкоОо пепекастеой сО0БимА «апр» 54 тиву єсвсгзгасйцпст саслиикехма сусла 35 сзлтламотвиЄє гассвпасйпвр сосасаячисссна ссосатя 3 «йо» 95 хе нашеня х чтеїїз 43 кутя гУКТУ хи йит МА кеїаМ ажтіКісзїтві пеипсе гурт чик» «ша БоЇописівсвіЗв вегцевсе ох о іїб 9їірко Зеатньеві«єні ЯаКМА «сви» чу и«запаочасс састабазуу педосодазча сзавазбасго о 4

«Рій» 35 ря пт чи» Ос штулотух, пет я лади КА шолулт йуистю с пжсю ні жи хи боуха завехч «да За ваза утуа поазпосасо здадседузчу чаззстзвашс пЧосцосзаЗ чЧиповачичео бо пити и и и ку сз зи езетліьіги еру дев и их пуття учити ЖЖ ситі ии ечи та ери ери кН тлатсопсзвоОо восопвозасоти соФчцпссоеєсрато авто дазавва попзассоосси сопасчаосоесо 125 двазасочсо ссоусузсузи чоасочичаст здисваосвзись асеусизесс дупудцютиє 180 чЧасспосстаниас посдаАсала срзапссвоза асо далее сопло исито чи дей хіт. сзізізу нена в НН до пись ди поп ил важити чсл аспасвсцвизва поссовосац аЧччллодашл сСсавсиасов о асивапаааМ БІО шідпнуєтезсстя Зессоасоз сиспчаачасс плисти аЗпопосссза аа льньи ьие тиж інтен зер зер лов ет ею рр здтдо З рідгрд и нг льстовИя дл ччаццасисо чсподайчсч адайатссцпоеа Ффиачпадсазса бзаачиачаче сусадснниу зи зачазсчасосз зячичуастай са зплввпйсо счсазадаво ас цв злу ЕКО чпиачосшбишиса дей зати зчасвооЗв аЗацчиасичоа спали часа за стріт тату сти рчуит тс су гризкуиї за диричлих ти пут проурсвт сг -х оприхулачлих три ще щелспастоито сеавсапасоа плпсовсьийссодамеаачата дпилисоовсас взасос БО сдсссситае сисесСсадосоал сауні стаи сла йчссит српосазиоосв аапсилівсао во «Тита щити попу тститітьрир гі т прлії1ти зичі1к сцоца ори и ті тії фаза часчос заоч сСсаделосзвай взвассспочо засадуссосваєс спадна них го пдодазеріієтиИт з лузги ділу дод одть позтлігТИЯ 13 аг ааоЧошчоснті мпедслисут сплав псзвачасослай вода дпсутесивло га деметч и итЯ тзужтуттуи тт дз паст ислитоІ п";авапссавит а «йібх 97 «112 41 «аа? ОМА сив о виг ускВо беорделья хижих ну тутю уз хто рр : - дів ню девіи тім «РИ поіуписавоїіце Зесізпс;е ох зп чіпа сепераце ЗвБеМА «ах 37 феопу ух г ичуж ов я яру дк вити пет пути дії їзапасозост света р;грвк стсазчасост всподеавца є з туя Зо «1» З «ії 41 «їй» УЗА «213» десхіїї1о1аї бездоеасе ой асхлтіїюіаї зеевсе ких ки-таМ шсеічасівошлае зед;епсв ої ів чтісго чепаежатей ЗЗВМА я зи «400 зв павгассчасс сассбасновую стптослоасаз сппппсваго а Бі «ній» З зум я я АЛІ 31

«ВИ ЩА са поря щоє У Кі ді даті діжу «і с зиЕгагісСсівді засіли кованая слеФих нету ту ть їч З акту ди я и лит иут их, ек ло я Я ех ще шою КІ Зк ти хи розїуписпівзкіЧе вечЧислст сб зп УузКо бевпвехвнєйі ОБАМА «ОО» 55 роду орел у тих печі у іди и пра и НН н С ївасСаеттувст? саєссзівазЗа сабосточас свсосіслаав ос по «Вій» 105 рик Ал чат чу пило» гл «ки ОМА «шТЗ встітісїіві йесплеалсе Отит ки шила ти, жхих і ху і мно хх змити т--к 4 як - яки кі м що мій сйаь КИВ «ле о возїУкйисьсотасш жшедаелйсе ох о широ чепераце НМА Ал пли «ах спо ар ие нн в в и, НИ кг ж всю л з васгасцавосс сзегагаззччї тавусаслас ста совас З «10 101 «шїїзЗ таз тах тую Аа А ит ОМА «ії» йев гавув «дп ук кап» 151 апччачсдтстс астлопсоассв соззсовзсс асаЗачовяє сосссоо сосзактссає 5 типо єчудОЗх дписпавиппипай сао нй рРИТОЇ варите д, пасопипа пасопса се п З пеипЬпУ ля фМтоасспове сасоесисстьИп со сову шмасосстосчеа смс Як ор и нн а а а а а у приз иих лу не и пи гужжи ретро ки жити и ту вити з вт здиассепочсо сспосоЗосча Чеаосавасстс аасавопсчоЗз азссатозча ссссассвесс нин пензосмідесщ ис орщю смувсрс до Кв онеекоем;І еще "ватки ону пай зазасовсава Зазваа зчазьвсатас ппозспобасо псзазчвося сало па а 4 4 ча ча чщчк піп т реа її а. п п Со но КУ вача с ре с їв дити ві - г. асчпзчзчаассса садслвасся зчоссвсспа посзачпасбасї счаваадацає пппезасЗає зо здерти тах чі Я Яга пуивихт їх п чн пар пн я пух ри вони ди цутуя де аччтазчаєсто ссваздвасав азоссстосугс зусаслвазча ачасдоспочі сбрсгессяосо зе) є починання мя грижею кущики р ис фо АЖ о гритжиту пи ги ту дети дО вазаллатс ссапоппарсоддадосоє сер ху п воовзосассч соссосслочоє 420 пог ви нн в не нин фени ня а и нн а пп р а ж о СН М я до зачсасзосоа зосзосачоося спсита Та ттпФ почсшсмо ев час бос ЗЕ туадасає то октави в а пк нм а как м а мл а а м и па а п ки КА чичи ее чачначсас песзсацо щтосстазсваз адсагтосціас ссассЗспщт вору вах НО заоч ссозсзозіас посовсозсУ ссуусачача вот зесопсосакоо 03 уро чу ему зу каже т пурижихк иа и он нн нин и ин ви риф кжірічижені ве зичи ери ох віщшісствізя вспузоспасої соФссзсзас золі спогзапозЗа сапасссече БО рр нн і я нн кра п а а п а Зо забчоасчласу ссзасавочо зчасачечісо всосзавзсвус сЗзсоссассо засолссасає ж: пріаасокаст пекосавсус зчсозсвасче сваспопров гЗзаассстасс сі сосво їн ссостосасоає спассастти Т95 стул зт «ші пи «112 40 «Еї» ОМА «яко о врругуєсїіві бесопаєтьте

«их шля шу джухаиї но Я ни речо гія че во сиру юр нні ера 1 МгЙ че розіувисівогіце веслелпсев озк їв Ууз1бхо деперате сБВМА скор тух, ще сапов о 1015 тат сливс своипабаснвр содсосссютв сшрупюдритсв ких 4 тим Хип орати пепсезтеапгвррососнчсосозльоЯв вул сих я ри тру «10 топ чиїм а «122 ОМА «ві32 вдкізіїсзіаї беводдепсе заз. «й» «ша Мроітписівсзкійв зецз)епсе ок і зісто чедекасейй пзЕМА «Ап пз «4005 193 пзабвочпас саессовсСазоу пев Сосстос сзоссвасаго о «рів 104 я -- чн 35 сеї» ОМА пулу» . мя ких дих щі аПхталхсіах За спиаФгглсс «Ей шоп п В я и чн нн нн и и що з мами ак ше Упилсавопхов бБедиптопсь сг ур м пЕхо сдепехтвпей п МА дп ла ка» 104 таваататчдої савсотататчтаа зопоцесоасосї садсаятк З «в10х 105 «11» 42 пря гм

КОН. ША «ші3» вакцікісівк берете «ишОх калложе . Здати ших ня; штучні дж роя седан т волоки не ТВ ХХ «аа» розіуписівсоїідЧе засддепсе Зк зп хійко здеператбей сівеМе а пгля лає ваних зп саваакхатовсої свссвказча бсассчаатай сиорустсвос во 42 я люлі ис же 196 ррорааааня «ії и слугу» гуд Яги МА кЕжї3з»з аксітібїтаї бедцевсе туту «вий штаті Є сухій чи мія тужити ут меш «у кожи фриз ури ель и уже ень що Техно ведцепсе ох ої 9хпоОо чЧепекаце а МА и ДОГ чилд «по» 106 пн нн за сопосзааосваг соспучасои «А ші я чех 127 для Б ки А шМ «1-7 ПМД шо отуя екв жені пиво «Д1З2 вигтібтісіві 5аеопиепсе «ЕЕ «лу ши зичу чн й иїк зизизтз нужно ук фе 2 кг у з зей чих заз уплизависзоВв Зелень сУЄ мо пепекаиєй п кА

«по» 107 сшсчсаасс сзлавастатя М «п г Ав «іх 103 «її пп пен т «ди? ЕКА «их вежі сіві беспдепсе

4 киш» «ав о вро1іуписівесііфце шесрдецте ок їв УїБко депарацес пеББМА Вих зп «пом 105 пизвацпасаво ссасзачазчач пчасчасстлс сстасссизса зсопопицсиа аостгисзтесивго во пзосазоОсааии дфацошсштив здаластиассав допссвосоонаатч золи сицчутМ зовано Ко, сичччацяасдти мпаиспадсвач зпосовсоза симчоочсяи дайлидтає авпсичаоое 159 все сизч сососпдвасаой пасасваЗУуй пмипсаанвиата зодасоооад допассоии лох зччвсвісвс) сппооосааса забодиасачча дсесловсво даввпоаппцо аздличиисая зао 1 и и Ниви АН суттю титулу ше и не зу оту зе лУєтих з пвзиссазачо МмосзслочЗавуУ джппсистаавл випоавасесиад сацздосшпиошйеь аиспітдсат ї5а пдкжкннааааанатькяя пи нн пхичиусзиети кт кріт тн звів свічучтчічтчиу ал зчазчаздидчам Фисседисцох мишосвовсса ососпосспоасг давав видане 420 чиасвллисава алиспцево ссоузоувизи чсазчадйдсиє сачваавсвая зпумшщчамс 4859 немае підт тудт тд зоб тиме сств песозчаципча пану ЗОМ лм зга «ших 155 стул ся «11 Кп44 б: УКВ «1» ВКА «шіЗ» акжікісїві Обеодепса етитутух, чих кхитялиі міну ру кити ще 4 «кі ни п не НН ок ця «сив пвозУПМИсСіесошЛае шеаєвпов ох за УАБкОо чепескасей ЯаКМА Аг зт чеКопх 0 - пе дин до затія еиики є тиж жд акт ря и чи щі сиззиазосавое псзсиачацзчцч пчалпааслалатл аиппдачесий мпзвсМасиии Мосс 5 г: ц зак ІіиеКе ие имеет коизчичі пли гри сл; ри льи и и путз міф тІВІЗУЗсУу є хи псепосисипчиа Мписсиславу чсгивавава сс с спевудльаснлцє ВІТЬ ахя і чЧчайазипатста аззчайацецнай чавасозацу пслицолиайй задала ааддовасца 90 увсви;свци саводааосо псадисииии устави сппузавроса асададатиє 249 ся лют дез зріз утуйкуєю ті т зи ол лутут о их кити свиті ри мокру туди Урерия лоетее пт зацасваєва босисссаваа чада иллайи свасасизвис звисзацрси згоаасмаао 30 зчасазачиа сизучазизу взапикхаспа авасвасааи чавзизсацци меси воєти зо пассадлилис моасадсвіале зазсизесвсат заппсатнг моасамсазов зчевосвосво по пачсалтстана павичозвасвз засво асам сачслешамоеєс св сорпосзосв ввоссваяму ам спичасвсзаяз весозсааач доддчсоспоа слиєсввиств версссМаца зипачисаиа вай заз ши пай іа чл

«2102 115 «вії то леза ПА поплулот й 4 4 т пужуичи хйіЗ» вхктітісіві бБеспеосєе ей А ННе з т и зкзизінужтитні кі тк КТК не хг до з Я -спМмд «й? рзіупипсівзпідвев зездиаепсв ск о йдул макїхо депетапей ЧвАМА «430» 119 кла с: ще чзаччтатсесу тс сзатка «У «шій 111 «211 а кіш» ОМА чаїв ваг ЗБісСсіщь йдеомелте ке тилу, опа й кут с л 1 при и и ЧчНХ 4 доро ожив всі и сек ЩЕ, «рах поіуписіо сш Бедцаєелпое б п ох ЕХО пепеке сен ЯБЕМА «апа 111 З павацисвтя зппестаазо КО ей Не «10 115 «ешАїЗ 511 пл т тк «їй» ВМА «кіз дксіїїсї1аї пеоцевсе «22: «ий «сина» роїіуймнсівЗзлоєе веФфавопст ог оіп тіККко чепекацей ЗаВМА «430 115 сивасасоас чпосзслачацу чедайссаза поссвзасдааяа сявзвссицвид зипапсумстоцоа ви сивидсацеи сссссспата ссвссвспзо зопдопчапмосг досйачцецха питво їжи пувидацтхи дбсчавовзао зазчоазсивау чими шссси цбпайосвоси чписапасеам 15 пипаавзиз созазсааас чпайдсдасиит висипи вло зовапоподіи папи Ай іпитадпвавзиз совзввосавВа Чдасласлаає додав зпзвапопсвМи паца ев ріки - дезщіІ АРІ сла дже І рути гяичіуєкичіути зт і ррьіЄтІо й лаластг тету зп чЧсизпавио зсзауачичс счалосиви;а паиассачоссио пеасСсеоцисца длячдссицо я чсааззацали сичолазчво салезопзобов пада сии Фипаслиейи злидидавоо пи Бе прита 4 аж из тупих пу рижики ори ут есте іІе в зфлузитит і діду дст пиаЗиазчоасии пеявацави восвсвозЗОоси падало дпоатипиплаца попа йашо жк пи и й ждадасвадшсти азвивппайа дасдааусоя вужа: апуспсоссай азпайасясу 4890 пвиЗасейеси бсспазацчиач всТессилачиа т 31 «кх10в 113 китіМ 51 свій Ом еїйг МА пло пит і Я йо й дл лк. «жа» актліїсзаї бедпевосе «290 сю ух я Зх п - и ее и нн НН ЕН КН НН Ко «же» шеіуписівовційе зейовпсе ОБ іп чіїжшоОо пелпетгастна авеМА дог ч «100» 115 уж р ліри злу КІВ ЖІВ ІВ ее хг сілірдіичичуиз щи тії ьо «зп бжутч ужитих сашК счиаивпазчасслс соте савді я засвзососс очадососиис о длииоласвми свое еаг о шимиЧчвааста пизчазсацева ссзоцосозв заччасаччу абичазлався авочазица 15 аасивц;адал перосачаза псдпчосчасац знопоначас воспсбовває чдодадоиаши їво і пезктдутізрти гудгтд др зе лес З ев нн и НН А тд зпаспайпіао зезааочазоо асаазлатлайа сисспсввиас совааЗасйа поапшисчдас ай чЧсччаассис вадаздиссів зусичЧеввов зпчаацациис ссивасевавйа сссввтивов.

Зо дерті гг уухижиу о щощте ше дети ща що птоз иЖІ що рречиудит мов дові шани асиавдтстсоттаст аззчзацаазча зчпчавспсвос вучисосошада псиалиисяо апсзозазаяу зви пори ослматта пощоооспосзЗз ЗзосопсСпасощ писати бавстсаоси чппосдлци дао кали твиття хз дере дея тлуих иеижлутхі нт 535 гІДГІГІД Є гли ис йпЕш; стпаплпасиас Сзапзациєгт лота всгстпиаачо ропезоасч сліпота 48 зачачзасвиаий сисоссищит засипав паз пл «Ріп» 114 п з що ке» Зий ст185» ВМА злу . мя сиди жи щі азЕтАсХІсівА ЗО спиаФгглсс «ий шоп п В я и чн нн нн и и що з мами пк о Упилсавопхов бБедиптопсь сг ур м пїто сбдепехтхатей ч5 АМА кап» 114 із мів дрир тили датитнтщ о гроти лу зятит - чуття ше пидалчйдасстят птлаславцазча ачдзосвосвооззЗа зчвациассосчтовй влатлавлазча сапвишиасиоа БУ пюгчаз іа жу грчаих из пути й порив свиту гірничі п щццоцичзичихц ви: яотлуй пил мили ппсвзвеЗаоос соаачсцдаса вели Вс писссипщкрІ адлосоьои 129 присут ин тт дача стйо петля тич трріетсуетіітитиія га М плели то: авсзасивссо зоссеозчЗалта даспАдсдалтс дис ииє зввОсоос сасиссасчдд 180 зазчзачисвгад Мосс с пставссвоас пзавовссаас замчочассву сесвузстсава МН; сиппсспсачас чиассвацови плоовсерооза засазосстииа дчоаспоиваляа зпипевивсац 309 а вч и -3 У о ззазизи щииту щі АН тт йижити тат их щини оц оцих де сувадолалас аписваавайс поссзосиач своссоцича писузувасо сассозазосцо 365 дспайливоасв осоопспзав ачоуиполс самдлслазаозво сравзваоспч деайалаАсчола до ужити дути зл егиіи б ЗеУрегту иїетізи а У дей сподізя1уУІрричи и Крат К у Іти лог чосзавчосча псопасозчаствав чЗаваслваалав члазчававов засицичЗса улавчантаа то чиааичопиаос часами зпиасесивнеа сода сь тре теї0» 13 отут я в МНН Ба «кій» ОМА я ту да жітті і пт «Ди звигакїісіаЙх сеспівгпсе «РЕ» кут нн тити ли р, и НЕ "че пр НМА «ий роіупнпосівопі(Чсг Беуцехлеє сб оз макто чЧепехацпей ОБЕМА кап» 115 ня пи их туту те катет єт ассвасазвза «М блогуя Ід «ей» 116 ел їх Аня ау «лу У ук дл чия ОКА

«ніх аскіЕісівді йводейсе «кЕвО» Кеди жзи З кож 1 ший іх пуху іч сухо лог ху ко сени кає посі вд пани 0 МОМ УДМСТЄНОСО В араєтима ок оп АБО Черекасе ЗшфКМА ач ід «Ох 116 фо и и вк чи кв корду т какао воес г Заатя ро; «8102 117 осно ні сярлстучу 0 тМгй «їй ОМА пт» п НО у зе «132 вхктіїїсів) безйевсое Й и люють па уч ід жуть зи ин ат У пи жк аниих щи гу ев зм ки» роїуписіеосгсідЦе зеццдоепоє ос о фй бак оОо сдепетхасей Я5КМА «4005 117 діра рити лу леді в и ол сСачеосстосФс дсплссатст М «шій 118 «11 2 «піз ОМА соло не піні сіру ие чаї акКІгІстіві оеЗиегся «иа»

-е ти дуття шій зір пу жк ря шиї ин МІЙ «3» розіуписівгокіде везцєпсе ок оїп о увтхо сепекатей сБЕМА «апп» 118 зспвзевітав суЗссосава о «10 11З ст 4 аг «іо ки «1» ОМА «нії» актітістві бедиепсе

Ї етитутум чих кхитялиії міну рух сему ут «ж 4 «і я яти р щвихЯ шйшу «сив пвозУПМИсСішсоКлае ве;жавлов ох п АКко аересквієні ЯКМА хай ча а х 18 дити додорти тан кни рн тп поспезврас сота сакио ра: ст пе прю «1 155 кіз го «їй» ОМА лу : жу в нкзжуи «кій» вЕІКІЬХасІ1вІі Зевса «ух

«ваз роіупинсівосіїде зецдсепов ок їй Узссо депехасей З38МА «да» 120 чеччсасччай беассасоке о сля тя ко ХМ 1271 «11» Ба «вір» ВМА «иа вгбУБьсів: Веселе

«г0х тутутун ши дути шив ер рр гу «ві ву сбдмутдю дон и і ІК «иа» розїуписієосідцєе ведиепсе 5зко їв Ууїїхо депегасей свеЕМА Мана ку сапоз 15 типадцалчдас зезссововагфрочааснпасссяс зналааллв) поспоебссебов сосипсдасє БО кж пюре жо уню и жрожраск чит ту лі ичичч ич лює пра жири рак пе нн и ин 75 чосссозвосоаса ссосачзаиса аплссашес Фастов ссаосоЗосса шоста 17 чЧеасчоссчасМ мнсодсазласай зчесазучувос сававнвчассай сисисситсв срушствососе 18 сичсоцеесс ссотомдессос звасоусоссчп сипсасссеФгот псоедпесосос зовассозас сао чіп ях счичт узи пали ие хи пулу іч тита тату; ии зо з цими цярутизети лог имени сизоолпосзасзЗз апостоли сою сени Зо е ше лади грот прути нн а петуичт 1ичиж о кзестетдезілаереют жи ктетіл ре лу Зк тпапасиипс зЗозосчч пслсосчасдес Ффипстасисот суазоМмицоча чес 365 афікси чичитнкя 0 пучку руди чи еру и ту фитиуцивичих ів пе рерТалиу цьритги о Жук ІВІжкезізе у 47 приачсвноассас асппдсопази сзастаиаво звзадвастасч зас аЗиисесє сопла пи паса стачо поасвссаати чЧепспсчосва соосозочопссо пеалачавса ссизпачЧчевео ча зи ету зх ек ца гі дали и дити гг чі іхгрруд фі дерзалитизі В щи: жачсводшоя поапчаосзвНа анисштцсасн: сиза споссспавва сЧапипссТьяи 49 ша зах 543 шеоплуло зт кі» ТЕХ чиї 547 шотутту- тухі з «и? ВА «й» дкіїїсїаї бейцевпсе лугу «г «сина» роїіуймнсівЗзлоєе веФфавопст ог оіп тіККко чепекацей ЗаВМА дя рю «аа хе српаасзочас посзсаацдазу чЧезаацайсв звсдхассоопосооа сачаспацит пеацопта в сайвдачасид сдалдаатлия виадипвоьзате ппсопссциси сипссдсФоста пцециЗувос ко писсташдастт пизвиасвацва чосчаОасанУ сви слцест о сппидацосезаа чпо»заааео 150 тайхашвалацизио соповаццсчвоа пипадалсцеа зраз азввсав сзвопациво оспипоспоацча 24 азасаасчасо аззчозицаи чеаспопийосаА часасиипоаса поса віча зп пчаспосоОпсл пислсиитв паежйасазЗоЗоа прописи сопла Ацсє садив воа юр пре тл 1 з1а1 тжежлу чи с е р р, І у зичря порт що лий чули сллачцасана засзвозоас сСсеаациастотх меалпЧипасьта сосдсазоваав яки пустот ВіДі Уд ді дід дети рові ічеудттвт в дя зі ея д авидлтава пвизводосазиа алчаписольая пивна спавосзвазай осзааалаво до пеитічіл и талих їз січ лузі пути ие тя и суха ее ее ца пачиацеатис споозачиазЗай амнссеиачасла воЗсподчас всаисисоеси диситасце Ва поацпиза па шт - 7 пеки 125 клі» 455 «шій МА о дув шо кш іо крій» витіїїсСсіві 5ецивопсе статуї ших «пу туту щи зизхічиї я й из зизизфчхніжіиих ост ори - «г др з зе що «й» роіїуписівокіде ведовост об о їпомабко сепекасей ЗБЕМА дит я ай» 198 сбрзодр кі па ул тий ілі я оду щити РІ РІЗІ Тіт Звич ириих діичиз дода дах що шивлиаволат псаслацаза чзеспасоосисм сша саецло славласиопс пссвайасац БО гі пусту сві: грізежетозх ці зитпзсзтаізі й з гж1л и сзізсвгззітдевдо році ириі Бо Фастова еасчвосзоацч ссдиапиасоя апипррнуств зозссосацсце записати 1279 падзасавай усизамчуси дсаазавлоди зчавизисицо ззаззазицу вача 180 Чилі познтусВоснЯвму завайпсвозв о пасваадолосяа ди стеАцу пдв чи прі лує зт: три злу цу щі прищ ою тЬьтя сві сівічех є дощощазититзтатух п Яадшцлтат плстапицоезо асвозозаос ЗЧавцашитайл аллалилайс сзвавиасиос зи ері проти Із ггзузит:и дазтичитщрігтьсьпх фжльгя ірежи о у лаетіи я узи цу ЛІ ЦО зд: пипідпесо то» ваеавсцоцра пиши лома валосеро солоних 35О греки дин дес темл( Е печія ярі діт стілллотт тут А завчаавзсача озспаМцІтр часа срівсавсмет зигота мсспьуилсл ар х СІУТА ТЕТ тій тканих 13 тІЗи ух щи г цк ппсочосаЧчиасч ецеассстиав дазласадлиаса пвоапа апо «гій 154 я дип ке зву «чеїйз ВМА поту пічки ті жу чати ті и щМшщшиезкзха ЗІпКОопІд «400» 194 шпиавацеттаєт псзспавазча аспаоссаас доця асимизиовоа вита чиися во злі сего де дзичтіїттитя - чути в дики сирки тор ея 12 пре миміта зсзовососао апиаселялиуа ро чсщсмит попсиисазое спосо 129 дзитлітижет ції цих тілу оц ул стелити тутуичіх их тез цодеякі У сі щує чец я дебет ту єтих ін ї пазацчацас зицсаоучаза здчасовасио йипсззсачао засзчозаасм додався ї5О пчосачЗлсоаос паси беласвсссв псчисапосваес вс десьм поут шо 4111: ее (ли ижи т щу дтичихалкутутииия уд УрУІХИ ПУТЬ ру ЛУЗІ и о щоихмруєтити цихц оц да цпиИацсадсечаоч сбастіавазвсовз 'аосослозооссостя спа цдиатща пасавасцпаса апиппсопсасаз зи рання дрочити, піяхлиотіото и итот ц руху гу до ту пмужрь віри из піл ит бе тІуашавсвас зстоспсазЗваосвз адосочавайачай зуп истава сстозастноса вадах Зо свасвийаза озоЗзЗзазоЗ чисадсиадас вапассвийвоа сзасбзааааце шипом 120 сазоососемхУі счисеМццал спе савіе пз соліцлаоаюрА оптом 18 «210» 125 для ти «йі1ї15 15 «т ПМА гоже зна я ді десційт ес си, зЕтлагІіСсі1вІ озецЧиепсе «й» я ши зелчтию єхичаи и зизеізіпіхійи: гія сіл чи фону сжх Кк прі» 3 зе А чия оз утім оє веуалпсс сур ол миїхо ЧдФевехвпгей оБеМА «адох 128 дек січ ек дев и їв ахсччУустсчЧс з ассесаацзча Мо кт1їо0х 126 рови З пеї1ї12 15 шко пал чия кА «жів актігісіві деопманлхе Ку «Еш» ст учи хужіьіи і пера во 0 рута ит ууу я уоякі фону цит ри гі ЮЛІЙ сайт мпоїУупМистеемасЕ жесраєпсяв ох по АБИ Чен юаєсну ЗК

«ао00ох 126 кчевоЗстковз пес 19 -плл пт хи 127 сту --к км МИ) стул тує тд «10 ЗА я прут Яні СЛиуизчінпуєтичну «ві? ака хісхві безавоасе «вах спон мч яхти яки шкуєтізкут ик ху ту кі тич жі тує кт или З-ЗА «ЖЕ? кнзіупцесівзсіде севуроепсе ок іп охо сепеуаіва ЗаБАМА для зт «4005 1277 зосчссасас бодсващіся хо 7 гул ре «їз 125 Кор тА ах БА «ій ПМА дету т тн пев жі сита куда «ій зкЕБігісіві бесодівпсє ки УК щу т птлутуль - ик ян из хи . тя ше доб пет ву аю ту 1 мий бий ро УпипслаеОосасош БФ ж ОМ спра леиео ТУ АМА «а» ЗВ ни ни щи чесне бссвчантика Ра. «лох ЛЕВ стіл о «ії 15 ЯРІВ.

Дах кит ка бать, шле 3 І кл их чо «іх дишаікхсіві птопдлетлоюв «зх визнане ктухутух З жзутутихі кинув і віп тчтчілічуя - чі ви пейумілі ові ефе УТІХ «ж вОагУкисІєно Трон шов вав ок хо Ух ка чесна мед ЗеВМА «ОоО0х 128 в нн па а р 4 спкпласоссЕво своесузіде А слу ях «10» 120 ші ши стул уч г й «10 ОМА «3 ві жені шоп ов «А» вттлізсїіві зеГзпйевоє «ий «кіз фюіулисівогійе зецепсе око ій УвЕсо депекаствій ЯЗАМА ди за «Ох 159 чЧсачац счта аспа мезо Де пт тут 54 теїйз 1351 «и ат «ккінМ ВЕНА си лише ве о ут 1 Ст пута ху зкЕгІігісіаї ЗзезЗцевпсе ее лань кА «223» взазіуписівогійе вецишалст ви і тіж» певвурдгей чих «и пззіуписівогіде зесгаелпсе ок зп о УувЕхОо сепекагтвй ЧБЕМА «птоз 17 хз сів че іутт тчунлуучі су х мати ті труни учеут св діва ижижію туя узкрцитичириз ц ти ух пиаптвмнастовос мсвспзоасзпа андааашссос пустив свисевасти пасіння БО стих уче додеері ту тастеех зі Зігттгдт пня 7, лдаапзсззвай сопзацйцицажй лиссслстгиь залчсосисо зспосацпсси чошссосолесх 175 я чичечичцхчц дуезщоцічеиіи пути жу учитих в. згчщеумьщичиї ща; рою сетжежіи ет 1 шл пасоссотвосща пед стесм ор тимшс сипссвссцос Ммацтсощавма слотів М зпчавосссистс ссср певт вгпосззасо зчайачосися йеТасспесбгалає пвпсФшаоссОо чи цисти тосвасвосво саспспааоис вались ажа ачацйолсвоса сспавиасаомо БІО, Од бю ту фу рт зе ит лету жи ручная сажу секту изитлд или тут є ще ліва ММІ бЗоспосппОпца сСдлассдунтх ддсавслива зпзасоопис осписдлтоьде 169 подосозсоачо зипивсучсуєс доолоасисо вававасаасос сасбссяаоо сорупутотуаий т12й зліпити прежекі те дути рр нн ти дит т рр чн ІЗ СВ ут в ск гу пат зсисасСсасловос деФфдсадснуа дллсввоссас спочзосацосдал мостом ВІДВИЛВЄВВОС М в зачсоудами тссваоазсвас ссозсвомосс чусяациоч сидаспсоссо озвучено 549 іч: У ца прали про" ле су «квт» ОА пз што ож ММ поплулолух ту или МА яю пр нн но «пай?» ашсьгасжві Зевса шопуть ких Савка їх; ни пуху их р-н ї чі жи піжрерлут ет и «і воїбУХИСТЛВСТО В верес ох зп ко чепекасай ях МА пд» у «апСоз 135 131 11 из Зір рт тижучит тт д3ижететяі пошретруту и З леї3 пугтижи І тізззастачас посшхосиадач чЧазаласосв саазввосчас заоч иеси асани що седзититиріі и сти тези гуру я нях тече ия: ау усу ут еу3и я г пиччамацис часвадсзуа вздесйсазсз сзайссооєги азсаєссачину вищицУубвоисо 159 сірими ж лу путч - щоцла цит цативуи щу уттіяія гг пт цих щоці ай чаччшаспаиит сазассспсив'азовосаоо сс спастсцпост часвосозчаоа М пон а а а ни На а ВВ а в и а ка о р и я ран аа а а чу А залах звовиозЗацбсисв состава ссплаію сестро поспосІмртас час 240 сгасизпцзос зоозавцося ачссипочливи смистазозас дозсазассс зичачсдспо за0 попЧасогс списи сщоу спасе встма чпипспациаце ся ПИЛИ ДО ЕХ ниж еко поса сЯаси сисасвсцту орилісввоса доспаапОслЯа зоасашсввсв паюазнувт ск сасичачссс сстазасазчся заасссодооо счацоаашис авчавоздавая пзисопосов до биків гг беуізри щи дизизИ цер ру тт із тити г ут ефери тет дп пеасладнасч апсзчаасз яосссвосОс попала спасоссвн соусасчоос 250 печити зір их д Землі лих па сІдазчисисс созвовчозчач псслациаа виз я Як «10» 135 гул сотня «КМ ВИЙ овоч «вд КА «3» аестізкїіозаї Зедливасе шо асхлтіїюіаї зеевсе кий жит Я ххмо я я ре . че сою Ся У ошкун, пра : і з СТУК М всітУтТнасІівстслав пез;евсе ої оїп УзКо чепекатей а ММА я СУ «480 1553 пиодвамасчаєс псасчацаоу чабзаводаев ссадовію сивадассеюи засос е Бі атцпатевчшс осзолосцис засссвисса псумадчоато сослозисас сапасодиуа 128 зеуФфапутизи обпузсзздаао дасиссзпасу чвузсзвояв дусссздацо азаададорий 189 пссиозсссо савосасссс восстадеасо бдивиасвиисвзо сзасозоадчас чЧасаязчдача 245 дурцззезіре ечщеК ета три ізети зизичизрзичитих чити ря ефе фігу тину зі званвосзасосе содспссоиас датавтоавтс паспаосстиасчс сосок жив мх по пссичасича дососсстис засссозавао созасацадча длацдалчовос свависвооо 380 чзчежсіх тічт ге ик зихих тик цит руюю тн 1 тратк тт рити лижічити утихітичч гі що доз пидататсци сваспсоооо доссачачивсу псссазоиса сасповасвос чспсчомасу 82 ппцдстцпууисо Звссасосоои айсалссиоя втдпсппиЗа впососМсс сасдосоно 489 осссоасази зазистивий в ог

«214» 1324 кші1ї5 вени шетул тут, тМмй

«де ВМА шля туя Ку ці офі мання зугіїтісі1ві бе чтаєзоє ра оо Ююсзї уписСаєеспьє ведені об аю ом го лепеканюеи ав МА

«4005 134 зігріє кудті тд хфруиререрути у и а Ілик ти 1 ета де српаваиааотчає мевслацата чазиспосзас аиачччасача малдсосвихвии дассипсссв оо пергу сиру учи тчизк нен, А А НЯ че узи пли ЗЕ виадвасстиця ссспвозбазо соосуссзау сьсдаслвосс певсопсввзоз зодпсидаме 129 ватстиивсоя зчевоосоувоча чафсипсисає сиасаваоууес попособссоуа сасудлиєно хво уча у, чу и и и рик ре нн А паї чсчашсшачо пис дадаласосо ассасзчач ссассвачче ша а псолпассиим псавадевва псссопцуоос садзопаасас мпадаомчтстм поппоецепоуєа 30 и - Ух щодалус ціх ци щетину луттьх че щоттит портик дл щи ле слссосстай сзасповоМап взиудасшув шоапсасцов опо ацОошоу 35 чия ие пс) узи призи пли Кк я умі ее пуилритвитвтх -ч титри ит и ло зурісзаввує зузосзосопся аассипасоєт дамиасии;оу спосовЗзза бапичаєссся 420 зчсавапоцицсс сезасозози задала зпипивсзсзо зззаслацзя азс це 18

Вопчасиитшсхь вс сва звсаасасспа ззаааспадас пси псиАм ВТМ Хмх аа здчсмсервасс зчоаайсосия Фдавсивсовс псосцуцацасти сдачистиайли ай 59 сту т але

«ші 13

«11» 5585 тшіЗ» акЕБІіКісік басиасилсяе

«их нуту й прань КН ж НН и у НИ Я тка р селу деки и МВ

«ДУ по1 уписавоОовьасз Бесиєпся Зх похо севевкасво вима

«400 135 стада ат псвссасаа дчафасенулом проза свиссспзвсптза ачачачласли во оч а и пики педа МЕНЕ де та вссвссапосв о сасссичиЗс спиасівсиута ачЧазчазвачси озиссипУсосс аашчестастс пекан;

ачиссцспсчии сао у спаси оас поча ваосасос чнадошецсс слмихттавостх Ви шчастссличеє спла сивио азопозвсчасев ассбаслатсвтй сстМзсиседло сала ишо ВА гу жи ке піч піни три и рин и чн й сх ші ЧАН За апдфелижсоси сопвозаазао ачиачадчсес поса дпевссаоспа ашапаасчис 319 ит фати их кіт пен и и ні щі її ат вик то зт, радити тіаивя лу ФО анстмсцслиас сеозиачзсссси сасоллецеи всватосйоасо стізавтаст вас сасо 359 прадчнсасспаа чичесспстктс седсасйвсацос задассаочос пасе спо лаоа ча сачассачас ссайпоадатлиао чдесессозаз сзчиачсичаст сасааласяатл апсззвсочоо 48 шив жтисчи дЧосвозапова заспсвудезЗс чдазчслвав псасацовас совоасосаосзоч 549 впчеппичис зуазсочаво чачпдадчадсм стазисислис ововзпвзаци состцпациде Зав дл я «ей 13256 «ії 15 туту вх «1 й МА кіз? вкстзіїїсїіві дпезпепвсе оо «2202 «жав шбоіуписівоцлав зедовпст ог оіп місто Чапекатей ЗзЗЕМА яхт чук «400» 135 шити их вивихи турок з аЗпччОопа Е а асусапу Аа «деії10д» 337 кл з КОН» 15 ситу ГУМІДА я шллУ «2ї1З3» вксігісїіві зесфипероє «ше ана не пи лити -4 пра ана а аа а аа а и А и яти пола іт кхиї УЗ «232 розуписівопідче вести ож їй УшЕто дпепекацеі сйїБЕМА «кап» 137 хасазчссіта поси спага 195 «пі1йх 18 «вії г ол ТУ кОм КА «вів о виб істКщо беордеатьте ОБОВ поту ту пи дихати и со титр ек - - ді року стіл дю коди сире ПКУ, «жав о роізіуписівоїійшв зефієглсов б зп тіКхо деперасей ОЧБЕМА «ані 155 причи у им по вок вкокуоку в ж -х зесясочезо гоЗсааатсс 2 лож 34 «10» 159 «т1ї хо «а УМА «3» аестізкїіозаї Зедливасе «ий «шинах рсоітупиасівЗкійе зедиевсе ог оіїп чУісго чейскасцей ЗзЗиМА п а «4005 155 гецсесмнсаєс Бест та печІнастссИ посли ло сеї 140 ЛЕ лі АЛІ я

«ВИ ЩА са ях щоє У Кі ді даті діжу

«і с зиЕгагісСсівді засіли клопа слеФих непу тут зн сити сита Я из из ан и нн НН ШК текти ку лк ЦОМЕЯ хи розїуписпівзкіЧе вечдиаслст сб зп УзКко сейвевузвсей ОБАМА

«ОО» 140 честі сссачаггас о ками 151 сплячу за

А М «М

«12 ПМА

«піїе акті бісїіщі болдицелпсе кг»

шила ти, жхих і ху і мно хх змити тк 4 «кни житні р ці с М В

«ле о возїУкйисьсотасш жшедаелйсе ох о широ чепераце НМА

2 Ай з

БУСУННЯ 15 нс ик МЕ нн п тп часссвексс уссстогас а «10» 147

«3115 183 сві М

Аа А ит ОМА де у г ВЕ и и У п - я. кож ук,

«жа» вас ві Зецвоасе за:

кий»

«аз рзіУупцої1еогіде зеццелсв о ок іп іо сдепекацеЗ ЗЗБАМА

«4002 145 сктччвостас сасспоах 13 сел дя

«шій» 143

«ля Я и йо

«иїшМ ОМА

«82132 зкКітісіві бБесагпсеє

Слона ча й 2 г дятли ду з я укази на ни о ШК. ук фр гати ето

«Ва» роїупосівокійг вецдцелпсе сзж зп омісхо зепекалей О5ЕМА

«ой» 145 ребрі спе туту фути п г Чинцазтаса аспспванза 2 ккї0з 144

«11» тоВ пу сУ тій

МН ОКА

«йіЗе акті бістівМ беспоенлєе

«ах чтешаз роїУуписівоКіде венудецов ох ів 1їіпкоОо чепекатец свЕМА вах за капох 144 зчЧасолакзоас асссаачзчзач ссстсстаасо воздаввозає сегзсазчах Єбасзчектасоя ви х пи и нн коня их: ся жу лили ихизн пове с тя Во у м о сут з тугі зсагастова ачоасостоє бестлйровос сачаворосс стае сбіваестоєво 120 росла айососотсев сопоззсвгаз зазчайваечах ассатлтоаєка асзазодаау ї5И вн п о и чи нн о и н мати т фо ру сс ув тех тут ще тюль їдЧасдівззас сопізззосзває чзаясагбовзоя вслсзаделвав пиво 228

«10» 145 ня т і і непу пк пики ОМА «їх ажкігісіві бевацепсе ї тут «и Тит пр ня нем чим К ї я косих прак нок ша пФ чкидсівстоВ Ведценпсев ох о їіб0 зісбКоОо ЧФепежасле ЗЗЕМА дн ри ха» 1353 родич их ірису пуржічежУ у тугу ту подаю води: дир учуутуюво псчужув ві сут е о пасопгчсачо гсебсвосжауус азтслвазчатта зсавосооссао азс сві асолавевсво БО всгзабєвдча чаассзет су звасквкзЗох сосзачачаче ссчаассаки стека сктов ко спите Я те ух ве . ВО явити дю г ші іч у що опурию шпик вид ол ачччсісчаа свасяассог спозсачтатз взосчазачсаз сасвосазиа завосродав У зчазаазлаввис сисзчесазчь агодаєсзсса зЗзсузсаїва засгваскчо чосдвасасятьосх 249 и ж я вк сич ся дру я и а пане ната што тин - кл гурт стчасєвсав сзаозстааку сЗавазчсотпоо чЧесазавау З «10» 1845 «ж ЗОЇ ту чя тА чиїй» МА шу пе попе чи не вьичня пк піасзтІспіаса зікахнетаи кайпй» 145 ччачЧаслвисті сасвасцави чвиазвоссса савуцОссим пс;асаасвчяв апизсесчпода БО видима лиоєс всазазаосо чоссосисис змо овиса ввиасассаси послала 129 ужити и кові их залі си пут ст ІЗ ких ж 1 гри гу латте тех хо лиачалсосвиос созиззосазчо ачдешпавпаля сплав стаз свизвоовослпи адасдеоелідї 189 щ азчачтихнізі мі оц цс ців усві уч: гу: - йхчачі щих кі шоцерциту Мур густу суті ЗАЗ зспзисисли зуваузацавс дазчайставаам пааосвзсолас савуазсцеуца счвалаавицоа. а сичипсачас ччпаствсозвма ссплодсова зпомлацисса вадамиавай виввссоуви зо ач там З : с? г пудацацпас спийпіваааав полоси чиапчацасас авасзасисв зопоссаиасу зво пита тету зате ді діа Виріс спідеМі вв Ап щадоалчавияио севвовопано дпацесиасолаьт пщидмалавілаза бвсосСсоаІс смаслідеай Зам пізізичит а піс зе цдоді іі еч ее гу Е вн в В дО зпазоаациз пззамсоосза сасплосанашйиа аадавзоззчас зол очЗачав уаччаьвстчна зо писзаассевоя аслелусава мо тій» 1847 ут 1 цщлпз МНН пи «іш» ВМА «вій» пзіархтогіса чікчЧіКера чтаепоз 147 ее ів прут свв тврижсус3с:3 дод цер жесту хв творч ежтвІвев ть п, тролі ліулрльсях ще дилиаєсімим зсвиоввооазе апа охо ведеасеаваеа сапацелдисьй Бо діля нкклододізичріуіілю перетерти - іфижлют є тролі 1ит1 т пиття сь тт ти зп7а асаимшшицвос зазасссчиахй децпесслессіх авазвавлоазис записи чспосчлатати пекан; звреайлацсиМмн:і зааайассапов свзававссива завапспоачса слів сбасрутааих се псосуасвалчаиа асавадазци поасассвзи сасисчайшас пейдассші псгдвачиоиу чо шосзаєсітвісцй посвосас»осда айпспааиаоцаст слані позссзсавосв азпадоцеу 319

1 я щ- жд прали г, пух ло вух ит ичх Я лапілілктовя Яку ях тур тив в вух у Ж авизазцези сзевасссцижз диссислисса всвивиайпчао брас плесасчидайга 155 зиччасзастца пи йсом що власти ваАсв диасассовас носа о цивма шила чем иачсачслплл лес тява псізозазоз зЗиМписочаси плсладфеала зиповамшо ау уссчасавтава поздасзвааа чо 502 Сх чид М 138 я пай МАН ящи скло туз «ий па Ам, ТУЯ ми Я евро зх жу Жорж ж хо я зтвютомаса УДЕИ ХХ В. 2 Аг чАк квО0» 148 чапасизазви Запали даейпзасичса зозпаавасоюиал честь полита и авчсивіисій дЧаддавсаза свессвоцево зам писла Фавалисича заазввиєов 159 дилислтвай цЗазавасвоивз асвезаиочацча смасзасжнимі вализвооозод зипассавзаци 180 мусповатстив воипразазваасроадиисияача сслваатлтиоч спивпосовазваз апоапапечсо 249 зазцацзааса сапзсгуасас ашідоцаєдо ссосасоразоа ззисиассвиа сассазцала зп папа асасимпІ паси зи пвазо вадвеацчпіик сорта Оце АТІКА КА пенею аа зацУ і ще З Я Я 7 чЧассциласи асавсидоазчи сапизувазу ачсцсдццим сицпаваасля даззвипслоои 32 вмисспиавотй сазсзаазос зачовчалич сусвавалаєс воподсваса зоапчЧичеазоа 459 і ві Ех з - в ве ї в ес в мас ллпподопуувид звосзаацоис зп ма По певно по пило ПИ зей с мя лу й А 145 «авіх Бої ля І «192 МА иа тур візу чу і ки і Прукщ «А рфаюжвустібса гтікаїпека «400» 1495 чзасасчастла сасалавицо псизавссзаа зиамссцпива сорласлизаач вазвицесоза БО вшчаиссопиовава сСсеазвззвозазвиа Чпячадчосацици деодассах псдпппсааЗ пасспачо 120 мяч г их ле ее г граю ет, пази Е Е : ПІІ и неви ви А нок ВА АННІ 18 псдчаслвістав сепсис чорт ІІ еВ Сем саою списислігило 189 ТВ Я 7 Ї ! ! вссазациси лачписпиаса часпсдоайииоа вчавиасвиавсСсаз спайпуцичави чор асих ай нео нн В нн и а НН заг асист итми дисфучстасту слава саов попспайасаа месилісстлх Сп ХО ту тури ля путі а рух етері кети. ло Я личить АНУ пащиаийсридат айпсазчцаавЙси зоссссазисгу пса соа тайссчлоза ссоспсиписаХ 35 педа пипСспесвзави мосчисаса сила лімисЯвОпасисвоосо часа зако мит тик т -1 р НН гі бала о гіддтгідо ду ту Серет н Али чсазвиалазвви сао сизча дисчашплтава счассосзача соапззадйвиа чопспсчадаслай чи пспозиостчасчи пила ПІ «рій» 35О о ци «я вух

«іш ВЕМА я 734 дізниую ід же Ер «віЗ3» Оівркобіса зікцчітекга тітку ст «апов що чин на а а а а а р п а п п п ка а а и и а п ря пе ше Михмаитіл вваассзазоа зчаччиасаав сипюдрашоча попвосппсасе адопниаспо оо притівідгтд зпдгдоряіл пгт діди дтп віл я г ачичацозаз ссазазвацса вдуицвалиоаває виазпис;всзо овзийззааиса йачувидсав 179 Часаспцалис слідлидтя сла сиоиосав смс прадаеадлає зпаваспосттв литих їв дулі рр ваду ще зищши дк дози дров З иутут в що оду ща ща ВН вдачу айдатайатцтиа авовсвзлпас садах плсагиаласа садовий о «ки ніг ІВ ТІВ ізежежс с Авіа І3131И7 риму м тіж іт реж вро до крцеруздерищ ці заг чат сачавво'оастазвовоОовЗи посли ссццое паст св соопзвасватча ср салой Зо тич ІТІЗиЖИтІВ сих гроз істо рт вто, си лу я и Ки че по длддузетт ее их ть Зк вчалапаззо ззвоЗсаастч чсалсвслив стнустсязас ззаваассчац ччасстадсай зо шуй опер поцо кб док помити мрія кр доці й датичия пери цію спі ІІТ пз зчечазааеа дао сощ слерасшисза ззиаспашйштийсос зссашоцикма пополпетатьа па пиадлочлай дласіавсяаата засазиззосе ес сяаца сисладатам сова чай дану йестдіїдосдд о де й піачовпачназ асзЗзвпавсззЗ о ас шк «відз 151 чЕ1і1» ПІ шт» ЗІ пкт вла «ЖАХ піайжлесалст УпЕуптєеха «апоз 151 чазасапссса аМпчеКичах мис лла вавацаосвиас асо и допаланяноХх Бо произрізісрит іст лоді гу их птедіздідтудо дод д ера пром я г зпсизчесастиа садах пиво вава звисає вла суп хто ЗО М яз Всме талу туйті: з тк ц ци цу ці при щу Ето тут пчилух и пазу тУТиттИ шАше диИасслартався пидаслдацй пдозвозсача зчовщдацсесасо ааассватт аЗисМпайойсу 5 - пре чіятчічи зт --х - є штир их тя и ач их уч іч різ сісти ці жів т вч уж туди падіюсдлтІма Мт Звисоозапгрвроадесаолоявх садоссдорлостзис взсйоеслоаис чвнадалаисялоЯ «М висзвиасаосс зазамсссси медиасссца пппасавззвас зЗеТазсисиливатцч чада за зЗапсчсие дис оси ад тивиов звиачацистма еліпс оме злет МІ хи плидацллс спол сала пссовоОозосацо паца цетлс спіалавичсо пацоваоссоо пли пшистиоелає повиачососсо взадианачсваа Зоачсассвз зпавипзсвача поссасопаси зво з1ізутутоия ре де -- й пилдавцаазге свзссааЗсям со иа я З «1» 155 тля шк «їв БИ:

овоч «вд КА «ша» Бідюхоїіба Уїхаїтеха яд Отке що «490 152 чЧпечаЧиасснся сомсслато всоепоесзпоза зав сстиастеа мале тенаєю плас пхлиита І чері річ та тиж ті т ож р ит лиття ти щит дитини тутзізежежитени тхжихит цатичизутц ти ччЧвозлидаелнт псссУудавовЗз чадом ис ср сенс влипсцссоя стосу НО; сппресппсвмлси сзапаавиоч салсасчост пзнтулоевсцш сбозоесошсиа зп слюешА 18 пзачсанисм чаасцОцчсим асзатаатт анющцсаатчеаос спа и сапу с пи пааспоцсссч сс дсзавиа взлавззозопоз сзоасипссвачс сЗастадствоно липа Зоо пачолпатяилчаи пт атапазав чавсавозвазЗ зчпавсшацйтт зпсттлісаслал асавазчаасацй ЗБО шазчеччасяча псасплачаа чЧавсипзоваЗ зчаастайсе попасасєтт асаласчаса зо му єстидоеса алІІЧеминроазасасстио вушна сСсоппсдозеост асасчліми и 229 пр нн и НИ и В я лог пчааасасво зосзазачач дплдаплпачасоз авшблгшнийссисоев зоваосача павччавптацА а одер цті нор (ет пот кіл аагччЧоапйасча САС мож стр огух ел «жав па сухо пи «йЛї» 538 ФО хіх Жду че гл жу оту її 1 ії жерти «2132 пзіарВтгогіса мігчіїека кажана пот, «пово 175 щас Басзоссоззиа засос спитала «Зала с асо ж, еірчетщущо ді дек пе ел т судізежи дере веде греч пл са ее 35 сисавспасва зезазЗчссс совайассає садвизсвлпчо звссассзЗсач Фсавсочишео 12 саачаспслпазвиа ссспоссвсва бралася с вас сос адаашчщтм слуга МК пчосдасдаєсое смвлоссисва дассспссос зиаиачодаот вссаваая пи сеєаска ж прут тт зі ядих их о путуежІІи учзифри» цикл зп сассвлслссв засоздавоса сосозуосас сисвасвута айповосадео ссдсасумая 30 ре ння пемзи дли цях кри дети - хз гуд дат гло з пинтеалсва свросазосзи сщсбасрвуличеньи састтсстссс звзеппсазосво зоссмласто 360 хфитититихихититат Кіт ду му ЖИ и ит ик шани нини 47 свуацососсчМм сзвидссисои садозатсоссс сзсавазчиос авосесасуци Фсомсеацетлао 220 писсасаосча сосвссвмії оузесвпеза авидписсусс чсаладасства пепевосшево 485 нки и и их сеих щі ихих щих ли ваше ут плпсоавчедац совас МА ДК ри «Ох 15 лу длуа те зи лю лю тУхІх ди аА Тл яп; дуету і стро че жі Бруд А Оквюгестстщ УЛ апп чай «опи 155 дизчаспооваи озсачасСсава диаштавстваа зчсспзазазо зацасеяацча пос му БО г "тези лтісільихл лельиче протя у зз у учужежвгї як р зихкінтих НИ іжіЗіх тету хи зоичосчавзласть пасозасмтогмо аиплозпавоЗа випаососспоцчеєс счссліваать ПДлАалТТиль і теж Ел крите й и в АН їди аплцчцчисвас зчацзаєсьити часисозоца аисуцпистиас сасдиасписза асцезвасшеше 5 зсзусвадиоу вазасдосас саосайауця здузаслило вузопозвуа апопсдаасяє 240 лузі Із и укр рт ри сіл еу гіди фаз ит стики из учи ла п ль т аспсьцаваз зисасасоззча ччспочлосаз пвцацвошов возпоаозсаис жфкріддайца аа спаддозасси счазУчсеза свицзуассвис ваасвазозчад амзччссавсво увопилувя зо ачспосстся сили аача зтасизисаєс засос ссифраальлераих спосте я ретііч тт тчтзсуізіії зві це утУТЩО: другу Кт ут ту тустутяитізи ро руля цатич це лама соломи певно поптос азспоччоаи вадЧассасв вав дочровисазосо зам ттучаавиичеч босзазасСацйа с ви й Ммицпчге бо зга ЗИ ож я -й1йх 155

«шїїМ 50 ор ло ИКеЬ МН МА «13» Пйівдвбузізба УузїхочЧіїехка «дат ци «400» 155 дв псачаайцича поазазоспива зосезвавоо зичпачааоас йвасаєтає вавасисвав Бо диасилаваси боддийпсвсзав сосовузууча чпудазазати пвависсзаа васочизМма 120 Миша ссВОо босозанОо чна диачасоиає стватівивсг сосзазазнслпи аасСсасиуая 189 записавиче сзавссицст аодсоузпадци здипососоаа пдамчсасаци щопавацотау 240 чпаасисчиатчя дана паесозапоеса зесоссашиий данину свому ва.

ЗО пли гтвУ бсвпасипстгЗза посол почи сосцпа цписвсоставо заоч ци 35О завдудазсецноя посаобзпоосво ачдеаадозиас часззивича сазевзовачеа запалом 29 ссзавадавассв заз писсасванеяа ссазачочва сьупзузусс ччочисасстах 48 асисасцачиа сич слас ух пи «вій» 15 «вії 501 поту тА вання мл шт В 34 діт і нд їі рих «їа» бівртогіса чікітека «оп» 158 піч в іти ту гу су гу 2 2 проц труди поия тати: пбуфучичижічтчія Зріз итичииих пихи па оапьлнаня спевззввозавза сосна МсМ псом плпосшмаввІ асапидалуи а, ри дгдізоз1туі сгтдед д я ТІ СОМллут я пудїгетхіея вдарте міт я пивапзисвийлиа зсисспасало злчсесріславио пмлшаотиавт звааосооиск сирлосситно 150 завозассочс часипсаасву сзилдцицєбавв авооссвичо зач сиоави пута 180 пислопсласчиамл дощосчсвазчип о чиаслпсьовосз зазчлаиацдадова стадо спииима пилосос о ам сечі вт лузі гущі ддазнкититии ких сі оа зІжса сзетізитуи чіізичир ци ця ле чиста али двз аа соссс вича валачслиис пипсоспецеи 309 адптиціицуса зповсссарови модчаласвац зврлаасвсаа вовусовоасо аапсавиде 3650 зисписооао ссзозчочузс сочовлссайи спасвивоци зоавазасчау Запас за чвйчЧчсоазоспса спачустайсх айппевсссва йасоссосаьрос гі сл плАааавВа. пі ацшиацавйайа дазлацвнач о зої пл я що «ших 15 «ви От «вій» ВКА туту ті пучка хі ее Бр че изаювктостіса Укази Аг ЕТ кхкапооМ 157 313 дит діди сла в ву ізізктііі ет дді да досто уУтух З чадйзвазатиса савоссатииас с одаавсосоов вав сосслпасасис дали о піичутя и зуп из Усик пуфи гу т фзкезитізізикдояия пон и а и и з ччиссасиаа сист полова зпосипоссяаєс сич плели мх зе рн нн АН 11331 щити тери и и лиж уж зрив под адиаиЕшиас дижітлайвсх цадиваосая сСсипиччастай салчаздаза пассаваиа. б прапеулаасиуєа почни сос послався спинити бспВодудвоссвазе аапспаииоау 243 їз а зілере три сет ря 155 112 дл седан радо те за: ввачсизззва свосмцисаМ сшсвсицетсти виаплилсвссоо сзавазасасця аа стшат зпа запацосзица чиспсуЗацив сдстдоспивоЯ здвовоасиаи мадчадчощев спасасививио 50 аа чалий писібввлсв сало заз посилати ладом паші сза3а а ЗНУ Ччсввипиццтуа здездавипсвай чписазацоМи дссиаататіа пип)ппуздавав вазсзавомои 480 їх ее не ТьКье гг 243332125 пи що аппоцивийз азопвозвиоада ас 2 суч ті 3 пу «І 155 «пу 50 оту тух ЖЕ «їй МА «З135 підвиогісв о туікаіглегд з міаютстір;в чВкчУукека я дп гу щи «00» 155 чЧсчацадлай сзаасаалтаза зсозозсваою пизочавіиийи палчачасаза аззозчацею бо аовлавучав ааадасвова позсишиаим сусиштивиа пиасзтаводва подадзоиоа 129 туя уч ти захв ту туту ду ул лрутту лу ужити т иа их феузфсМІвІвежтьйчиї приліт ть де пиши цасяаз зирозазвизи чада чатио Фустелстлвис ппиввацасо чаплалплалиио во ти яз дтп паса снідгу димдиедаяя гіди СКЧгЯа реве За й чиасзацссш аззаваацдтиа пиаЙссоваллдатл о восвсоваззва записаним сусла стомх ай зазаачиМисаж ПАСТ сСИА писесввистло зва ача айсесиМмимь бета ЗМО ччадсвдядии ассисосопсоза зазосзссаа сацацалиача авполайтвиа поси ЗО аніон сизаасоов чсасоаиММо паста двиза пссзавачво чзоспачааичс 42О прози вк алое з1у1л тіж 11112211 34143 Дт СтглуєРеТе тет ав ставалвспоззо сзвзоссасцчі сплата дпрдсспивао вззоезосоосооа чЗавачаолад ам почозпасача аа гу ох «вій» 155 и щу шАЦШИУЙ вий ит ту пет й, А ЕММА «13» Піво»хогісв зігчітбека «ап» 159 гер із 1: зу рзуиіІтТиК:І Удзудереізівв:ои пів ІВІЗІЗ згзфзгзізттитид Зо одерди ціх щі ше запсоца пписаЗвоси сзивосилам суцладащнвіа псивилова зазаасацуя БО мадаєсивити суззоаммоч заодасосицч апсдизисву ацоопсзчай вапасоилайдй 1729 п дит у ук цу г т зу вих узі лити урізу кі зЯежіе я зоп пвиасласйцсасо шана сстача савазазавз пиЗадвасаа спазссасица влитуасмиса 180 4 паті па люз лити Вежі ичичи кару уиничичиі пити ту теки ря сту же ик сет запппайсяи посвмсяиті влазисдобса оЗзоспоссоссм: зосачдоюаєт ваттоивосви то завичиасссо сподаавацио зозсссзизаа чуасизучаз асовораавоє пиосососває зо МАХ павоопооаса падати ця западина тговпопопоав аасишиассо 3з6о грот впр ділу б т тт 113 ри туту доти ет ди аа злзвасцсизви азсалицдочв чааспопитав зшліапесиос сопиласиса апачастлацас ши пзаасасилвиас лдральакнатйур ел сваоа завнисслацчес мс нащи ср іве3а па аацивичивс ажизчавцови ас 502

Лоу, зад Аме 150 «11 п ту зиї «335 БА та тук ті дуеті чо хі жі рух АЮ уаюгОосисв Ух к а дн зап «апп 1550 рез ерехтідітртії гр; ор пергу гулі деле гідддіьіІоА літі В де чсадсайли зазнати стала йвацз ацласавазвчо зававасСсоиайа чЧасаулицад БО приз оц 144 щи жук ижиУ Вих прізіЗухІВучитіВ ци сутзкзаіззи м пом их причали кіт пручіх хітів су ЗІ лота ччиваасФріасос всТдасоацп списа запори лдасч оф сасоцицу помста Ах чачсвав псотіапавазай авоозасяа пасожасощвтє цпсслласааи апипоззоЗвас ОМ пуусладеоцазчв засзовозаз соч лощ лада лачва ачоцсавариЗ чо ж претітееитеті11 (Тег ЕТ дет я 131 рев злили сет теле в й вчзвиаспазччии; спосоУувичсс аачсаттасти звпалиадаззво бсалаоосзЗини зпосспалчаАйсчА Зп ппсазвозспва аипчсиласови чаадайадем спосо; зазеаицлянти пла сатай щи ипчаччлзшстчи ср свопи сосги Сеат плсилисвлвава башти оО М Ед жор З тити з ! 2 шазчашсиива пассосазнас зало саЗ псчслоссзваса ваазовзацчцеи зовасастьни здо сита ас и пизсвозацйа с 501 депо кі» 181 пл еп ЖАХУ ЗМ х шо та щи ВА СУТ 14 ді уиутоя ух туз кита и кдд «ій» лаютозтісв УкЕЧІТека а - дл -4902 161 шощіїіісттхї злі зупинку дя тет щдоетт13131 -ії тіж гуру сх оч грві Ск ччадаилилай ланч щет биМмацавазео пиччалелМ самедацух сим талих т дз ін ІВ етику чи щодлазцдлльлитити т тд лі гутУрУУ ль: У Що лдіктихітиталатіти па апожстщцавава шссисспВимазавосососяа пуджчднсоу волі аластиа апопйпсйамса.

М питан зЗеазолаОцава часова сиутаелтении спаазисаса напади 180 ТАТУ 7 я 3 3 тот з З Ох х3 азвзавасосва Сооссудахй чиспавстадти пасазЗзивосод сзассацеси пчешлстц 240 дими - різу УМ сЗІчіхіижичичіІІЯ я пигвізиуихі тя тич цлізлутутктх зі тити "зх пчЧчЧчеасомпссс списи рда пзепостааЯщ ван ЗАМ ИЄТИХ ОМ чали з ел діри грі ріріє ліга чумі Ее е ззитіліі ти кни апсСспдіІнься дстАллвиастя палала сраслсразас делі вта било 350 цик бпасассвос соспсялав дЗвалснвиів авоппасаозо азооппасосуя 42О ужиті т причи сви студ зал ие преу13 2 2533 кдд уч ди зіздетиртлучяля же спетчаавсизаза осссеаосмас пислатеноє загиурааазавОо СЗасОоОастоЗ поселили 48 посзпаассицисо спсизиЗатстай со п «10» 159 «ЕМ ЗО мулу кажи «віз КМА жо туя сф їжу мері блю щи ля івохопапа унпахугкенаи нд луг З ах 152 Зк аиох саззосвзаз заоч оасщ судам спмтоввасвеав пз лисосояи ви уж учи пух пкт шифри зу и зле нти нач а аа но а нн 4. фі сазоззЗз зсаваааачс мапи аставито дбати Сас осаає писаччсаад 528 Чишазаиави дпа с задчасівисва даппассиаво сизадаайи давала 15 чзасачисааоа лес сасиа ллпсосвос зопидадичиа ппідеснАан сапремластта ши азичацлавйст пллачазаасо посоцаооца зи садлай дчазтазавцо десизазаву з0о печу рі ик дід п з зер лізійрьг суль ечетрт грі: «ізізлудутістеві Зк зда жса ЗизЗзовозпзавзіи масдпсшицка раль асо плас посади сеци 369 притітерехич дер дату ігр глід луг о но АННА дог атацсосвсзвоа зисзсайасч сачассвица зпдсповпазвспа ооайосуцатз палали цо 4 чадидаилдила висо ЧчадцсрвУ пава иоватр сезЗнасицам спаси ЗЛІ ча авдиадицидам апа тави о Ол «іо 163 «Р11 по 2 ох дя кА кое трісдуией ві йно и чі Ер Жди таюгоесаси мапу дол зе «ах 153 гущіале ізотерм сіл ту вд ззгрзіудтІд Ір гі ще чайсзайлавз сЗазаайцічй дацазлававЙ вачависвва боса аплеадлсю во сиачайспииас поасасиасливм сездиваспв о сипчавнацюмии поасолісьимм паца М чпасеаФфутаєсча ссевпайассас писввозМос зисСсаачоааХс всгфалласнаА чис ви апетит зазвзппдасй йпйпдсозососсяс асисалиалча вазлиписасио пападплааоа 259 ; : тірзізо зілізктеті и дорлоеіви : зі плтих о гріігріі ик тої запа ябсцеццас пом соЗас ачахнтласнтт випа йшпенао бапсаззесйо аосиасчсжяткоя 309 аззігтитіілтіітет о зі созт гг гу ситу додткцодтх дово сів иртих ель В дет за пиачассилоача послу оциав чЧасСавасдлоива спанвовзиаваз звавовчачав чад щомна зо доліт ти й свого пут хі дз ет попошжрцомети или сити пз хрх с утучуит зп ччосазисквро аисспглале саплмнвоизІа среадлеасеФиас счааствателе захо чих зізгтиплдза шюо т31131 гі: М. ядрі оцет т діду (гу утчижит у що щадтіітехутеза1т ОАЕ пачка пиши тдача часвасааЗ уааоатчамста спасе ялину йо зе дог вдаиди де заз тадустиіміва зеассозазнви ас зи. и гу та; кА» 184 пт, што сами ж «ля м 2 «2122 БМА «тії» Підьхоїіса зікзівекв дл та. «435025 1т84 чсчасслалоли папи полів палтавссзвзза сипчпсаснроно печаль ца рити ую п З З і же З пчсазивттйий дадзаазанйци зпивисосаса аципуцславдя дассайава сацаписиву 17259 павуки чува завопопава йпоспачимча Завспивоа саввзвизварис ачнимачста 189 руізізілети ето дог і диктор 313 и У и і НН ие Заг зациацзссзуа аазпиаоацай додасаллас свицедисза зсезузавцзцайх чослолайас ай зсидЗоозсичи часидищачс давацитоса впасоаслзиа полаМмичси шатах НО аВвиассгапоя погас с сиза зивсаз ппчасасстста сад алесрлєма сила З виш ЛАТИ т ВО ЗОООос Зоо аОщ вддаюпиовс влвилписиВи дзадзипимоьй як ви;вацициззз зесопваМазч чЧаспслазиий зпдасаававвзизаз звисаоОиса йасчцллнно 18 пзселниим Оп Зах го

«Рій» 155 «її» 314 штулотух, ект я лади КА шотулоть тя ман усю ді ки: ДО Я нулі чих півзІЗзпісЗ гічна ки «ОО» 155 щира бестаззвавсов о'сассавналная пвайсаавлаа васала вноаазвиайола Бо УТІК 13110 323 ери (СТ лу тут ето соті ити ото Уго глист 45 цдплчсавасвиз звозпосвач паса даасти гла ловлва пзввиповиа садайччсох 129 зваАвисвиспиеа аа ацог ласпатоавица завовавлсай засос солимо Аш сте (літе ви пдв Осмеенвю дадірісітитемі піст діал: лаг спасипсасм сбдлилАстаєах здволеопоссооб завислі млдоеддета зар ветата в Я дув льзуч чі ду т їх із ичирих о пирузі ди церщОо щурі тури: фуги ди дордаизититві і зла важили апапПацнпосзс зчссвзстааЗа помлсмсстмш слпивасвлазч ававиоспашяс З0о непу стіяі смму ЧІВ з ижІучя 2 23 гі зір ре ки о УЖ лу ге: до щорік сту ци ЗК запа звсвя Сезствовазацч садласиасача зрвальасрідев спвипозазОов адисстиаасьих зо апсбсдайнста пає 378 випсазайсса Мас КУ 10» 165 «АВМ оОвоОО оди в ШК рУ чеїа» 0 КМА су ті іяочту і кт буку пк піасзтІспіаса зікахнетаи кабОО» 155 приз 1 гі рух т ет доти поозуретті тя (сере лулься, АН ши чсвчочийиала атасацавв ссзавазопо плдадиасадпам о саластаатой спаозЗаазсши БУ яетізі роті гізутеудичини пн и ЧА техцерецеті Кт поржалосоати: висдаоссоза аачешнольс стос юяава змитзпосвосі поса аси 129 ужити ртуті чт ст прихужтучезиит тет дідо дили в сгицепацсли зззозазчацйе асспдеТадатиц пдсссссопа сзвозосааса дасоітад 189 чачпасалачач яассвицчсит плсацацанс псвосвсааа му спаурта пови по пичаслпачахл даАдорістдва пвсзввосзаза зочайисдоава сіли у псепвиюциого зо зрузач т с житя з еж щітичи щи дзизиечкітти щу: сор ас сг ТЗ иа 3 доц дян ці де щшеалаватств сазчавноссва воисссосчи ваша єттєх елпб;спасава ааспзаацацУ зе) сті: РТВ СТЕ ит приро сте гетто пн а а и сідла срв до пималлапазвазо зопСппсСсозаЧе чЧссСдянуст знала виозоспасуса слов го пчиздімтанади ддчалрщ ій ет ли діди едци споді гіллі дог чизизасзас чзаозааЗсиаи алозаавац айнйпизссзаа звоемавоУзе ага лав зо зчасиицшииис пила ух НО тій» 157 тт ща кни Вик «іш» ВМА «Рій» пфіваруІогіса чісЗійета чтапоз 157 ре свід з тд хззз тісті льтілЬ у луу ве ви ЗІЗ зІдеррТИирельт да Віл всбозпспаоо Яопсосдича еопаналсоАтНих писав пасок У тд т дітддтбдгдазер ура летів и дело зздяритщ дис дер єть за пссппазсвзва асааазЗачзч адасизацла йпчсссосвоаца майпссисасий яра тавх Аг додец пода: зрілу г учи прі зізцітсризиро зір В пудрі жі 3 Ше зацчеасссайи сидадитщиснх сесдлелпсипваЗз звзиазоопапяаса мивсстачо петлею се аадиацчслялиий спитав падасовосси азччайийастис дали орла шо яз у пи сміху - ух пам приро Ки чих пжіу гуд гух -х віх тіт ато за спіл інНа з спссзацава ачлайостай паса виа сзвзззсасввас палали 319

: тивіздспід зер т тт мефлізізгязия щі діт деечтіття тя зд: чЧивпипсила обеасасцушжи пОсеТестииацть лпчалиаиачо боса расацй попалася зва виапсчнозосоцаа зсссосоли злвасавсовстй зипсчпаасчеФ носа сосщеув бе анивавио чаш зчаачачаано доідисипе пдпопссзвоз осссасайса почадстіаваа апозззвопос 480 мидавлвувх писпувовосв ас зой «10 168 страх сп --Аїт ОШіІ лк я тухл «ий ЕММА «шт Підютосісв акт х а. и де зи капо» 155 апа пси сбезсацйшпицое давало засиацчати спащиовалса во анчдачайчяадй пилдгивисазла азчасопсооо пиаМмнисчла ЧФаваасчивива зздавсвавива 175 кидсивасалтса папочасо»осо позвавосногс поп авчас ссовдпаво аассвсацаци 189 увів йдеддадеиддо делі нів піді ддо даті дл п зувваиицауви давсвазасаа дададоиасми зсамазівас ворзазчацева азосмдасамо 240 псзацезвоайс азадисацчазч сидачаци;ла апдпосиовой пзпзусоцацу авсопівциста Зо папсоочимпата псом лиХА пМмусосопе запасом асист здат Ма ОМ долезт делі стя І туту ці дал дінчасчідт я злі дог зедаста АЛЕ апмидалитли азпазчсцесцо сипсосовзиоуа чпваиачаслата полвастасоллаяа азавазоваоа впкгМ пущиизавав сппоооаззва аздссайача вавасиасвва псеспасавоса созадваймоечу зо житт м гру дет дя дплалпицзвиси ззвозовсадяа с вд «лю с «5102 165 «их по спо ІМ «8195 БКМА иа т візучанв ів і кі пок «2132 біавтопісв т7ікаіКека «400» 165 пастор Е гул 13 чно палі а СТЕ Н С, оду чЧилаалчавч адісалазчсив ФдисевозвозЗа спосо слад сасесииили пзовосссвио ОА цищцицицаллсвосавосЗадази зосдчосясяа паса ЯВва ппспицове повчав 120 Ки г сти чи стоку пе и 4 при тутжичізет вія гази тро еле ли 1 в чачзавасгив зевосисазч сасисадаан сачазсичво звоуаавовоч сицоепиачоає 183 дізирдодтиттіхі цес ту вв ди пидддееі тр цритуц ззієсзвввутя "Ат пааодавсси Зисузичсиу злавави ца з пспвавачоси оса чосио пиисаасата р ачаацицасмм АБАЛЬАТАЦМ «мис ейеастве ооо лІісСМсо сао змиамеят спасає ЗО дузі ургльь ст ль У (В Вибр ик п) отр туту ух статись типу мих оте ту ше апоазЧадайа саваазчайзлчаци ззазавосилии ачЧчецзЗашУутих ацазчазавазч псзвавоассЯас 35 ввиасвосуав виЧуЗозавоа зайпидамчач зсвавизаси) ссесвзвацеча зсасдасийо 429 ререрчиичичня дода ччіглу др вве пчя се сддл г дет вт ло пааславос заасиасочипса дасталаллацла встацсисаав сншатсаадаст спаестпдаимосвх ап зазочасоас дФасоупавувн БІВ ситу тк, еру «їй 17 «й1ї1 5ОХ

«шпійш КЕМА я 734 дізниую ід и я «віЗ3» Оівркобіса зікцчітекга гу тра сао 170 щира бзасзЗзавОоосе зчешасиМо селах звозпепвососс ааоопспаФсгич о перисті тя тки іо риу брили лу лу луг при нан ин нн а а о и у п пн и я ивавипапоай зЗзиасосиуза чЧивсаайсво спалпавосос) васасссата поршсаєшаові 1729 айс спа плодассччсав чЗстазсзазсиво сис дацйтуда зуплральцо у липи пе Кот о при гітари р почала рр р сь Сех сів еіІрУще дала щи и З соду спачасисиста адсостппасова зсвссзоУу висо сла лопласти парилиазосааи со рез: гу дили піззет тиру: і рф гуу єю ри пери до тміз цим цазізІЩО заг пдв идеютО паспловозаз асчиосвчсеииа пис ва сввваспадча спобшслівиьнях З0о тІізектуєттиову сіло оргія мин нн НН рр и у чув - Зк. звзисазисзо збазасиали сставйайсевас своими звисати чола ап зачасспас асдбсищшиол саазсвасса зЗаавасоспОво зЗазиЧапачеє малина счпа ча дузі тт ти пу о сдлужужузізяз тв ірею о утричі тк тт лати тих ноті хом уч и учи дол заиссссайдс сстпдоелчатлсив плеча сччосцпачаси апллссвстта чайне кЗу ей иа яз ІІЗГХУЗІЇуЗдодизиз о тих ща вача дтуаз; посипсавазЗоз чо шк «ій ЕК «рії» а жу ЗІ пкт ка «и піайжлесалст УпЕуптєеха «ой» 171 чвсзиасаава ампичайициас долаззана йпвававазсваи спосадчаиш шрами БО пе дод одязі т «зргуири пе діл д ди се прізілізтудіз тс лог прадаситай деасчлслаьвує плив ивцссв випала длиас всачсаала Мих алитО В М мі шиті тА Уиу тихих ще щазрліцдатецалирь: г ідею спурурутьті у що тіетилчитілгетрі щі шАше сошвицслаиц іп лавч авасвизазои сумасяаавоктю випила аспссопассаам ї15У леву жів грін ти попгілуик дині сві гжсвтрстізізиті о поп опітерертиі суді зидстішаситТиви ппрпасцавзнайав адилпасоцат це свищ твса аадаисчсаАсі 243 возвзайслаца ссозвсМсоцозч чАсплачцатлта аавтиллааос зеподесцаци шпцпслсідстоа зай я хдмцарцути пе ще іі прі фев ухіхізижіуІвя сити дих чичичні проце зро тьой спосте зап саЯпеаслиунас подавши сепсис о ррсестоиоУм Ффищолаийщев МА ОПАИКИ ОХ хи изжлисисчлстса дл слшися ас по зичсссийпвас все ьлслсвиа паси Не пли жа сласннвно авсзаодлоз слона меласцивЯ апоссзазвава пзЗОосасаоМ о здаецесс;вуспо баоуєе 96 я Шо «1» 175 гул стуну «КМ ВИЙ овоч «вд КА «ша» Бідюхоїіба Уїхаїтеха

«дя яку «490025 175 - 41111134 3131 тех теле стр пгт т суки с :41 хужут м чЧеаЧчспоспаяиа маса пвсесипзисот соплаайсичеє саледеисни сети.

Би дичину гризе ту сус прліитяс палить: щи шетюівІЗІХ сУфзитіррежічиІвижих жзкрц цит ЗІЗ ти ше атеави асзузвасвозз засно Мм дешеве апзипстосвас спав ими НО; іплтввитшис Зесподйсавацй поза силиацое сану зЗозЗоесаситшс асист 1ва ззасвопосовоа адушпосдоацсс зпрізаачааєвй пспзасвосо дис сацииав сазеуместих ча пипапчоасосів дало звалоссовсзаб овоча сшдча паспоеадсцдА сплав ЗО ра чи злі еп зитуті я п рр кре нити гу из пути и п І чі зрхіичи до що Ки авсастадиалча асаслацавиа свзиассоззас сччазчсасост авсвиссваа пдисиососзаве зи діжу гру: Й сіл січки пуфи ил тзжжеті ві тжірцо щезечзетя слухаєте Бо зді єс ЗОЗ ИазЗзи Фсдлоссплавм зрудалаєав Боплмнсеє асссріиасии 229 заазасацаз сзазуссвуч авивсвдиио здиспровсс) асизсоязсай сосаодеспнх «во кл звФгпалассвам ссомссомлто ти дае «вій» 173 «ЖхЛї2 4956 ФО хіх Жду че гл «гї3» Пізргогбіса мігчібека мя тн, шт «аз 0317 дадулатате зЗвосзазиОс апалосспиац залоза заосзасазаспе асо ко УЖ З піч вижити у рити пит дику ее бутлі спр сх сво ТТ Урі или Болі чзвашцапсси сзспааОччЗс спчаделитаа чаавоедосозаа вовча сир овисатв 1279 зпизчасиситьн аа сива зииизвлизваз зваосспсасциавос масо За хто ЕКО ж. пакту их то ет Узі г 14 зт хз прик т ви А м 4131 жу ах тд аипасавлознти асалавасми даписзаазо пичайсама впаде дамсих здо ша суч о січі сти твіти ги троцриктя меру сх путч ур сус ту узизчличивиччічтьІзї пре жила змзусивиааз ачиссадсяа чиспаааааии свазвавдЗашеє мими ци БІ «347 с. - току я т т рії зх 133 1 є ще Е з дичриоло лу туя -- сплчзавзсав сисеавосОаай Ясла Власова спсзазассоо сосками 360 1141 лтиТеТИх пущу гг су сухі путасу тЦціУТІ ци цдалиретх ти тьілУте пе пут уст т 47 пизсасаасас зовиадчиахи сСпаааваслтина павспвоазс зас ВЕа ДАТАМИ по попе Урич почин діти сити зткия іти рів пп чаалчалсіче паса стця брувсаввостОо зейзисльсма кліше зм мУ чо пациццвсцця содсаєс тб «Ох 74 п тя цллз те зи сій ВМА ть ті щує і ро хе жчті Брю А Оквюгестстщ УЛ ач тЕ КМ ех 174 чиавпсдасовза пспзчасяас дотсопцоеає зававасивос свзозисачиа йотидінастрха при пдоуялі пір ик птуричжлря у зажим сумі ут зп рочки чия ПЧ ЧА чн ло чЧоасзатциоче паза местасвовнеа пса исося сьвлисвльеийх справу ау і зчучзЗийшоеч айсацанинаи зосвосзаос уауацайвдто доби ниви сасппессоуси 185 дю уч узі щи ках сіли и ту Вчи сут гьлжі узи А зчасцатлувий сипозсацосо асадасмачу дмвасвоса азузадоввив сдавададеи 249 щі дідо фест де г ни и А о зп зайисваицзое ссеспсацази чассгспслсосто сппвЗчасолосСса ввоавасасцйа сишлстассих 301 асасацачач часвичичус апапссоссва ввазаввисоо аададсоиси воппецвлос 50 зачдатіймЯ Физасаловиі зссозазаавоа заазчаацяиас спосацасаа зарпопавоо ЕН грипу У туту и що ож ці) цитат: ру Урі; те ие жуть -х тпроцпататат лапа За снанот апспозадоз чно длислацй Зоуцслаатна подати спос аиамимпо жом раси в дз плчдайзЗзаячЗ сиза оцалооло З»? ку -к -й1йх 175

«шїМ 505 нят «и МА «13» Пйівдвбузізба УузїхочЧіїехка «дам -щ «400» 175 чазачосчаоа дасодавави пасезазвоссо Ззииузчасавйа вадлсолпсавоуа ппсодспивеса о пивиатацтах савийпесобова поповзачсну сома ставу авалчиаевос аавзоачачсам ї2о шлдаздлалвио маоосзсасти чпасапсадода сила возпвосаса пса додесся 189 дичріцдочзаяіікі щи а мг ти дивини пищать о сов ві ут их ЗА зспавзвовоча записи вссдтаваси здававостос зсалчзавоя седан ай сдвеаваашусос лов вивипсвозве зеоопипвносв подо лдена дао ею ЗИ иа спиисваслвоп ачсипсоссяа Здулачстт цпачвсовазаочий ачивосазаася 359 мпасвазссова ва;сочавса падавдамайщи ваша зиаса вззуазазава чападсиорих 29 нн и аа ни а а м м ща аа р р о у з1і3і303ижи о зефір итАІі и пути ті ир лу дог ччиазававас сисузачоай садачаалчом здивпизозса зими зс вошаийиссай 1 зачсасскиай апиаи ла вл пи «рій» 175 «вії ЗОЇ пи ту, ти о шневи км лу кеїй» Півохогіса тікцібека «оп» 178 паству тюлю т грстужичиз ев до Ззер цирк рив ечижія ЗІЗ ІВіІзиКі зей щивичих ст цоц о Цоція де сальса сев Ведтсисзазча менчсстс вид нвии плпаплповрочцеа адоссаальао БО на нн аа и м п и по ни - тази ті ит ди жити з ери злу кі сачлв"лсазочав оосУусззаиа сСссадаіитваа ситацйтаваи соспвзосзоазча чЗсадилеасе 1250 зисосапаав сафацичсцєс здоцлцєсвацо зазавасосло сачсиоавта спстватавиа 180 исавадчачс чицсвсваоми поуововаосо апстидацеиа сацасасавйа возвлпуудоодве пад пМтчач у тва езрхтіучі рому и НН и и и и пихи ця лм аццийсисав списпаавав соаочаучсауц Зсиввсацта азвайпордсосса часа 300 пислазваао звозочанис часайдссвиаа завазозсваос зввссацвивс чпспидосмицс 3650 не ижіії1итіиз ет доза гнати учи гу г ура ,анчн руни ззкчіз ери ет Аг чопиазосзаи ацциуавачис счзсассваав чосасворио соавсузасзи мчиачшвасена зай нти ших сли три ужтуи дяисуужистутів зу суда гіда ижгі літі причи : и лют чи су к-мрк хі пс пЕпюА Я АЙ ЮК МТА АСТМА АКВА ХУ Мрсзс кіз олісіі спа І А А ААУ ч" п ї псчацейсио совеллопів пизадоивосоів адалили: часеиваатиих ух зппиу п аччиатцаси пазсаєсснав о БО шт тую з «ших 1775 «віри БИ «жі» ВКА туту трі ду ки гії ру че изаювктостіса Укази А пе аа каОоМ 177 зчзазазозац засасадина сади;саваатло мзсаапвидао; зссуасавчаст автори БО ші прим ни и чит тн уручну и ЧИ т чЧиашиочаасчсс заслано уту апазипзиснеос зазопаосчай пила иа мха.

М мн о и и сом нин ав и но о тд шеовдчлчеслсстиа пизЗзацацео Ссапспвзвасецза пйисСсисиисч оспіслиастизза пзопоссипеаше 80 зді аВсввивавсЗз алпдайпсишис о встозцела дпавзвисвавосз малися 259 чи спе маг ті нен НК пе тасдваззава стос азчои псопсалоетих йплечвлвизви зпасазозосМиа вслислаа 300 зичу це ци ц покжі т ццатачити Уха б з ижиа : ІКЦ (зих зт 1 ро лік ща ус зу ас е ів иче зе пасссзалоз асцщиллноя вавазсавзвавз даваоспаае щось щоав зло ат КОКО, ачиМмасисціи допашасас паси зооо чалаодосиис йпсслддлчота пасспоспоаЗс им сс жі ічуичи чу пази ази оч язики -ч премія щи нечічихля гаях ци дл паси итиху спесоспапсоаа пасисипсасяя пове стоила слсдазчлисвво апосвавиаспо шо цовлацалачс свиосозаспв ас ЗО А шт мех ха хакі хухі тА Ми АВ О т яв «І В ту тух ЖЕ «їй МА тю ль тності я їни пн ц ОН а піавюртспіпа чїкаїгенаи нд гу -у «002 175 чазчавдисса дФозспавсва совоевососо Замаайцисло чаваличеати зчзазазосве БО вппайнаалчаава сазвиппаазвосп аадеаеспвааа пузЗазжхввнас вавааваавсазасио ааипслаооси їх прижіу тів иІвуия узи приро гурти ще пережиті ІМтЖІІЗИЖеІтІ Кт круте лтевл в; ппдлавасеп сЗзсззЗзачав часа сльву сецсиссаав вапзапсацае псалпачеасчлса во пал ділі посі о ки тет дідів са спігтвсв і а п псозвацаазо аззвзавизуЗ сиссчаадаас зчазиайшиас зпиацасяава сасічатаай ай спла сич сЯ ес спри мативосвВ посох сао плСТІИММО ВВ.

ОО ФфчааисддЕнЯя сФрасілалцов зСззовавис чапйчсдхаиай втасеатцтав асазвазввова 359 пси єМІ ванпопаззаз адовнильитьяу пашсативс заз ачиапасисяии 42 ртуті давати діастоли з ваги дио дріт :ог авМчаштттвсо звозавососа чачспслссваа птоаллезвно ззасассаса ит ав зт пуУрцпинчит оч хром я пт пачаасчпачеас задав оо п Х «10» 175 «12 501 солена ЕМ й, вен ЕММА «13» Піво»хогісв зігчітбека «4002 173 ЧАщслогпал савзазасзви поса снас сто дасвас содазавосиий пупси во ру ейетитв ни пече делла пр учет руд учні дід гілізійхи тут 47 зна оплсЗит зоишосиссистчс плели сст гиічавзЗзо спвггосавацй пис А 179 аа З ! 7 ше ддігдтрдодаї ет тут ек діра ово ЗИЧИМО о тегу ло пазачасаясзи асолазЗашаЗ пцастсазца пизасисаза зшити адлащосоастиу 180 чЧопиасьоаи дишло ав сасасва паабисос сягав У спліІМВсї ж кваиаасасійа сипасдоалелилв о'звсвисви»яа чачиашиазата свивовиисса чазвавассвавз 30о іх еВ Ежтчі ті ту: ще тв ізичи лу прузтичет ци льсьстя поезія ізежтвізсвсьту ріс луки ільктіри зд: Іа лиИММацея бадпеворосазоа лосося АЗОТ посвизазоза сад со 3з6о риття щодо дач дрилі лу лу ут лу ді ізирінри Злгри да гр дет их аа злвиадиссзва зЗзаслахзоеа апсайаацала сзвиалацлсайоос восазслацчи даштлеплиса ча преачасчциа асасспьайс ссезхавнсва пссзоспопйаа сад аствати бами ча пссЗасСспилдши сніадлатлапаА с У

«чхісх 1859 хв1ї» 4857 «3195 ВМА та тук ті дуеті чо хі жі рух АЮ уаюгОосисв Ух к а луг ай «Ох 150 заиаааси зачзеасМицчучач дз ааттси аласосичва аспсоозайа паст дасо ВО мен со лидрдсхЗяІ ппаслшсззав о сивопавиам ассвеапл захо А вдичтсилтшину патацаацаНиа зсоззвозааЗ задачами атсагсзсв спососвоссав и преоретіц г жтлтхіхі урхтутудг ді делі фр рів: різ зіз дрізд міді зда аснащелаито пизаваосзо запиши сс млппсцасоЗо соди ши зі ізрититивяі зер дір дер землі сжізе 311 ст ддздагмі дреди их а виапипцесви соесСсоеосяацос о асстаалонух знаепиозав сввамацицрмаслипоссхст зпа сзписзсзсе фаст аасзадваца псоадпоососиааи бази еайивев класса щи пччссопилсй дл ср в. с З щи вавазчасчлп пласта лтва иа х с чи А пкт и дити дазеіци доця; о сзо гу хіліТУт ЗІЗ: втиті одесі: ДО ла: заачшИалтоІва цпасззасзвас ааспашианами стада ай випсвадватчя зр асосции дво прах ло пух 487 шоплуло й кі» 151 яти З ил ху ЗИ шу ту: ті щи ВА лють 4 іч я ит ж ки Кут «ша» равювхокісв тзжкЧІітекв -4902 181 додіттчтяо т не итіи дз влад ділити поезій іт зі пром аАння п ччипалилий дисчаслдеслрт дпа раєм зле пити Влх а часи іт талии що ятрктилатк до що сх чи лох тт щодизщеалалутщії па сашсчжиждлотий псовачЧазцов о аЧессосазаро заажчюцичв птщалалоисип засаспийосао жк М пупюльтьстічізр оту ЗІ тезі пз пух 114 жу гутжетст тики о зи пери 4 де ІІМЛАЛОХІМАа Са ЗасвапосОсв Фолс сАм зас аєсв сочЧессваоса пачпдачлаАє 189 писаасийийй сосзаОоусочх смссшдАлдамй авосатласизао сзспаасайатч подо 240 дпопоцдатузитатяір цу поцупив й сви жіуя гу гризтрез тру йзу ції из пибрцучибківспо спору ІВІІ "Іл звеаПиОсишйст сор олаєнв милостиво зспесессем списа пливли ШО ся рив тата зи меті і3 пл ол прах гри і о нн пулу с рр св такі жан псСаЧасшийні ппнтіластсва азвазззизЗосВ пиласріирласт пастилвиилвз пазвзизасаз 350 прі яти ід діщцлІТІЗІ1Іщ пюрдурр етері педдадееі да ЧаАЧчссинини пебсааазЗазиа Чазчнчипаачас паса й дапрпасвис позна васоси ше М пихи твіличі свт би и ии ще узяти ух яко дчичичяяу що лоту ть ст де ласчвавзіисти беапеспзОасе чЧаслчспасзла гинмійлсиистолс Бесирразецй зойлпайсло 48 Я діихика ли тую хочу я ці засасоависи Зсиааацйавя у зо «10» 1859 «ЕЕ» ОО 5п миру тут ий «віз КМА кутя туя осзфчу си я ко хі мирі би щи ля івохопапа унпахугкенаи ап0» 185 шести пзвзазавова счдоссонши Мом пспвпипзов засипааасьяо ви пед ич гу жу ізо ит3113 дит ще ія зір піч оо причини ри рт 1738 аавлаазтеиш Зооссестмь писстисітаа звід сспиєе боса оай аросенсса ж ивщаттіцтУцатїцодо причи провул оугІІ Утиркщ зів щ о пом ох цирк л1З311Ж113 2 хоп чзиспавозиаза зи чазЗс азаасипавасв зддзаспоачя всзаяасаАУВ зими цавав нь

ЧчаОчислацля девидлавита зчазвззазвоза зорадоасчослиа морпдделавиа здашлемзаоов ши нн НН и НН щон др жа лу "їх цпуєщодут дз дод ве чайсечиавст цписавасасста зчпеспавлоцо взЧиайпчссчай сбалайизсвса азлавасазсав З0о пада тет сСедпевозЗоссоз счопашистлис поз лнанал о басесцесатцю часа лацно 369 асгсичацациий песссоуМасиий ассзасласай обосазава опо ассоса поча стяє 4 ші дятивтучіня злу зятя учив рр : пИДІДКОрЧИНИ уч ж уже ужито лхаї айчсалітнис мс лим вооов зп аОсаслНн слів еорвиА ЛИПИ. ча ачузсивааз асазчазвавив во вОЕ «м» 183 «Р11 СН чел зиї ит п дя кА кое тзісдузеи во вчу хи жі ру Жди таюгоесаси мапу АН з тету «ах в вне вн НА Й НА сбруфллрею лего одрорітеттті й ел тету оч зчазчаасяии Узасисипаай дацйиавлтиса вазасвоцас взечсачи пдасчасаснтад їй; зиашсоачча яичасспиаза вазсависаа сини товос почесну списи тха.

Ак чЧайсслаьтиаще силсраснийатя часа сСсовсеселви сага павасйицаци ви мес МЬсва Ппаспазосзва засошоцсису пий ешнлит апозцеапцас азасипииошу 259 11111113 1311 1113 зр е додзіщіїі1м що : тріо фзазетдтуз ати д тт льс в з самими мМмих рошмошооссмрі да ждМиаеслам молаеращалвамх посепосасеє чолом ЗО «тітки сит ити в уро, пп п Вч ижічт т есте цтіизііи КУЦ діУ ри УКВ учи лк злззвчаазчзаасса сова св дадаанспна павосвосс сезачицеє ума зо щ кеиріілу то іт теп різали ер - яти ваті зеужтв пух сві зп пппЧоЧипинлМий маля ста брпмиимиМм очами чапа ваду сш степУвах ча путі из тА що яти цт що З агро руди ДІВ пелУ сг жрзуз ль Іо етатетеіи т по висадити слі пазллдасстив аовсовааацу усаацанища а!списасация пссплаасайа йо - рі с сюжеті дуже ги гуі . ик ДІА Бассоепачаацч о зл. ит тд; кА» 154 «2115 490 «ям сх; «2122 БМА «ії підабхосіса тікдіїевкга дол 84; «4005 184 чЧейсчацйпаацч часи бррасовпоса сода счейя севлчелиинма спати мав Би спацчеаєдсашии пибаацавачий свописззаа зисадачилил Фдбочаснлаєа аипвависивза 15о порада твив шепосоппосвоа айс шии паддайнвінза псзобдпзвавасє поопссачасо 189 дуєтехуу іду седггр о статі есте сатитді я в біз дозі пісі ти ДН запзацдавиз сапизоасзач чацасичсває мосизайцозва сисзайсчоч ласі а с2ззапосзааа сачсасотил чЗааводас спааводоачо пидаласоса хадииитав Зп звипасисасиий слпсволасит зоря овОо виоєсисвІайнса чпафиааасста стало цеасиу з5У ЯІчітіЗ сті гучежучичиі фрі пре цятки ет дів хИтчІя г ттуутуттижрутвитих пути да пошану впичппсзовзз зачин асаЗ водо сувасионос зсипписосяо щем пизвлпазслозза зЗезсзаЧчии ачалалллал вела всво пбзсависчси пишпачоси 18 зді дердаті а ззосспавиИашис Я страт -е «Рі1й2 185 пло чпи кі 2ш штулотух, ект я лади КА -4 Фев с ит Ме ишіи і яри хиба» Тошжасо соз/ева Моваіс УТ ж «ОО» 185 шасвоваиха спепзавазоссчи масаосжаМи асшжасваца аасиваспо счаззаавасо Бо нич а в и В и НН хв дигадавлевзо воропсазач ассласпсп орав члва псипсзопнисо аиспосоццл мк чих димі о гг жі ур тре дочці Зі Зі в ве 1983 посвасашиаза Звали сст щаетаздтатстав стзаваслзвсво пис зооиоег денс устаат Ап жі єфевутиитвиту зловити и русі ра дике ютіоті т фу ет кру дю яю уся ту ти свиачосасров мала цт спазсвововз зпччаспоспайа меадодося сорта оо Я стор тки у ре гук щи плірпичичитутиніщо щічку зчтзгчич ту ти дет цевцят лем вилститчвї аавававичазвза зиазсосисоа вич лалава циссвзавансчя асопоЗааМо 3 пом нн а а а о и а о рн а а и а о Зк заремл у ла шиссвосача спспстиасоовй запалив Зеслассповоє асасадисс з6о притіле щодетщ що кт вел дл 11141113 Уго пух из дрочити ррх 11112 3112 ли Ст 27 ачачсзазчав бсзсиссаай писи;авалла авчаасавасси зосчацицич чивадсаийии 49) псасависпис аачччМмлаасто знізалавосвов звпаппоОсадаао осла лопДууєюнмиих ЕКО йпссвиашиасша сипле зай цппазипас 200 утхл т с чшїах 156 слу у «дя козі» зи «під» БА пут ТПетцанат пи ново Мульти 57 « «шій» тТотакто бсоїі9Чевр Мозаїо Зіхцв Аг, зах І х 156 ужити ту жи дз те ліри теги ит их путі еЕу о сс ититіириизит пр ириитиеревт с пиіпалалчаво бозсасасліи чесспедитА миагадаличеяа висот оспешоросао во псоййпазловіни яса цицв зла злссазваз пчаавосовача зе ващв шалот 125 полчацсглад сад шислвда вадивосоЗзазй пчочисалоаа бадлніднщда савлплодцицев ам шпистпде дата сблависасв асподсадиуя поста пптЧбсвалайос соназазисояя о авптаптипазаа спепсосацач адчасослоаде паси засво зссвасесипа адипасасчеда 100 дечичех іти дід сг лазер гутих привіз ечитізитиі й зр дріт трете вн зоссайосза аувззазучзч зчсазлзассазпе авасдпазосоз поасаамссопя Запас 65 пазопосовида паслпійсслау псезасзсзЗа взейаососасем спіль овиоиХ рих че слугу я ль гл таті ит тихі ри их АЙ падачснлма пислоулепнос жо «кіп 187 «й по «жі» ВКА туту бра 1 У 1 нити чи Мои ЗИ ут че сСачаззкіскежЖ Мощшас Ужиа А угу, чат кхкапооМ 187 чзайсззавоса зиЗслизчиасуУ адасстлисеола счпозпсесос ис с споууглатснс а чуттів т дет ет тіхзиий діри ЕЛІТІ ер сечі с323і3 з де зд проссиассиспса сади сліа сбплзвсзсес пачивссоаоас ач еп ивах «М аФбщиаиасовиа сираумолнос васиводазвс сасоуаатююц ази мода 99 впФассірута асвосоЗзниПвас айпад сипиналентивх єсвзззаваце спаси 259

11: жи грдєтктхт ит шия тити У я : те св газет сушьетиха зятя зп; изиадпасасиаз ззесмОосии аопасслитвю йпсСавтиасзвост звиєвзюодзацт сьо спис зп почоспозиис зом дали сосна виаас зи пропала та КОКО, ФіссЧиаййс знтлеаотоилт спепсвсооз Осо олосст стае лсцлеає аа пцесех М щосили сеабспддасоа чассласзеч павича пичЧчадиоов апоссавсосяас 480 аавштапицичи зопвосМио І сут 22 «І» 155 «її 501 оту тух ТУ «іт МА к2і3» сСаціїїїозех Моб5азіс міру нд гу- За «400» 155 чЧисчоссайс мипгалалтесво ссвзоесивОор изчоачаспьтий еулслеиавта ббиплпичасе 5У шомаашатеио пазпавоспосоз засассаоссая падала пожфузолово засуха 1259 участі і зухч - зичн котли ті тує тю яю я пу вчу о сч(лічичих ичифихиі чіт тлі пи амиасицати зссозавзоса зписасстеля диво ав спейпопоиосч псзпапислв во ну ривтя тя пн я еебрудичичирві Стр гр сі вв вит а п писали ийза пссодицЗсоу длешиаиатлтаци спассзцадо ззизчасасих стада ай зутбіизиміиии сбаттіттщтити тів тери вия: Спірс етері негри СТБ сппчпссосоис чсасдящиснх опрашесопса попопсопсоаНи сус сесви лизати еко, счечаслаіса п;палпсалава чессосзосу чачасокаяс стваатаасвав сити 35У зе итижу и стУ є зи пазли пес ежіВ ІВ тут стижиитиу з. зутиитї 1 вЗІЗІ по маслами нлите дпепасЗосцг дала чоо воза сиаа спасти систоли 429 густу гу жди итту дк ери ти сіл тт притіз тити Ук ди дере :Ої сгвазваспвсозвооззсапсосзчач о ассстдонтАл пгластлисв рзиозасдиас чЧапсслссахо ва «из дчзазихичих щих цирку оу - пл чосваипОсссас яса о ОХ «10» 1855 «12 501 ит ти ЕМ А ЕММА «пулу Уучичидса о Плити кт изий 41 4 дкляих «13» ЖХощато бротей М1ТРТЕ Узїсах «400» 183 шиком с ппо;ЗзадвдасзЗз сяачОсяяо вод веах посваЗавява сзопдзпечосиоу во пу віхи г и соду ту нн У НН чілі сич ря яв орки и ин я З задчесацисзва сросСсазозси зосасісЯ ла стслича ССЗ осала пасли 1725 д зі щалит Угри тез В ил ду - шикдиридяї тп одазгрлруя прізіз льоту ть зо іпсалпслипслзич посипаний слтавсвацйцсє писпцассСецй аеейуаацшиий виш усата їв дачі тих ЗІЗ) рижиУх т пуху стиглих льки ль ет сфе рю тертю сит Чиачацисийшпес зві лава сглизвссваоза зчадпасиьс ачлевоєсвх смс А дуття «вет сеї тура литво таз ге итізІ: ; "дичини п аспамсчатклих свлтаазчаспи заавосооуа пса свас силач чаазвспоооя ЗО перрі жу 1313 у зд ди пз іл пиття дазтихдереі зді іслам псопвапагшо поса ице Аме Ммх бро ацписапоас 36 под зле длігІт ств вті г іти ж пітдодалгіи стисле Ве до заачацизвос сеспсуадзчав зспавалчитит пчаласачо сзиаайугич чол спассх чи песо пичиеий мпасиестуа дала залзоспасмн попи ну Ффовививно ча аччацсаслад дихала є с ЗИ

«іх 15 «о щи и ние «21857 БЕМА конем тизер и 4 У узи викл Тотатео врессяя яд мах НК ТЕ зай «Ох зо пи зт литі дет ріугрояріл бринуиф лу их г тізих жити тітки реро дл тр етеТет ля ой зассцисаса аоссаМчацййа Зсиалзлваитлацзч злиасасосцй опиоаоцай диалчстадино ВО яти прІвужухіліЗ ВІЗУ пої падспапнцоис длидсдвачсв вллесвацаб пчоспОппоссас ссимиешУмє валшсіавиостт їй авидаттушстаи чацзчадлствв всоихсозозазЗ зоспиачосвца алчупичазва пивасиаасо и резус кт о їз тягли пазли труть сл нет сити: зх щ дат патиз тресту Аг зн дих. пиво ЗоОозЗ асп Ви Зла сеаспд ди щи очних ай а КА ШКАННХ дл гг гри фол пчх учи уч е ил сж лк дез дере дей я я ие Зп пчсазазизо ззпосвссиса подостаєсс взвазлавоово засазссаццч дасосццидая 300 ззваачоисцас яссумусизва аавосвааце воппоозававацч заччазоавис вопчваслаа 25 я - о рез ро т ее с, я. нн а р и а п дич з гу угор у рило ня ус оно в вив дол жпчччайлсчист иплиалпсиосиш пвсоозЗмос сачсвацооси мдазнтсплдлє спа ито СН кі гг Іхтя ІзЗсує о із ц лати дод їх пики пуфритіл:з: у бкдоц оц допо лі: айви алтви пасзаозазав сист десей спласавичаа впсипноссоча мпопавасьася 489 частвавстис восвовасцікро За «105 191 пт аг «АХ ши шт тоту- УМА ки ВА «кіЗз дккіїїсїіаї пецевзсе отут «их об Я хе ока дяк он і слу ак - ож 25 ри У тир щи ер «ишаМ пвоішписіссЗслат вецивпсв ох іп бФібго чепежатей ЗВВМА «4005 131 из дирирвк и ців щи ув за посаспочксваш о сагсозабовах М пу топуя чт «142 155 ис т екшн М спря тУМА ання ОМА «туту прання Кс пня жи «12» вка гісіві Зедиаєрпсє «вих лют ти тетхти ня пн нн НЕ АН грат куті зим «и» рзіуписівонкічЧе Бзецзоепостг Об їла масо здепекалей ОБАМА долу аз «па» 197 чазоссспаса ваасвссласаа ши «їй 153 «рії 18 «ли» ОМА втру ту шкі йінтніщі бичем сел актіпісіи масел ких долоня тлу дили шию гі песто я ду вжи піз діт гі ий Ева боаіупистівокіце шеспрівнцнов ох їв УузЕхо депекатегі сБРЕМА

«ап. 195 пречучи т В вузу стеж 8 апчсттвеце пзецсчЕх 18 о шна й й 154

«1їМ 15 оо гУукій тут ОМА «її» вгкікїсхтаї бездевсе -тпути хи «иа роіуптівсоїлае зеццепсе ок іп ісго Чепаеакабей ЗаКМА я т п: «00 154 тачопсаос дадстсвїа 15 «стій» 135 я я за «ка М ФАТУ Тд ку ПА шу ту» док Уж из що Пе при є зипігісіві БЕ чавлпсе ел иа чия опти туя чиї тики я и зигиазаиіж им, ех І КІ р чех К е нич 1 З Зах зд уплнллієогасов безпе согоалпома їто сепетрапей ЗБеМА ап» 155 ме у и и Я чужих низи тю: зЗтпссвахтеот побзззапцає 2 «піп 136 «112 й «вій ПКА «ші» дЕшУКістія беовденлиав кишки нет тн. жи З хжізлиі шен т т ке рхучл ем ия ї яка вок гідкукі Морйіитгі гід МЕ «ши росезуписьФоКаце ЗКордепсе сок їв Ух по чзепеКасеу ЗвищА «пах 156 тури фо рих в ее гу зу і три м ерих 7 аскттетессв зсзсаастазо р полу тоия сот «да 157 «їх со лож овея сухій «122 ОМА шлю ПА А сиве й ху «вії? ахиїхисіво дезпевсе «20» «ша рзіупитівсотіде зеццепсв ог іп уїісго делпехаїтай ЯМА рик і 4 «49305 157 асаапидоко злиті др ки сь чосаасосвес сс истгх 5 тиїй» 18 ої й Ма Нине Б «тії» ОМА кожно два жітті щі кети и «Ди звигакїісіаЙх сеспівгпсе пев ут не терти ие зезкізірв жи ин жи суху те 1 ЩА «ий роіупнпосівопі(Чсг Беуцекпеєш сж м мк хо сдепекапеі ОБЕМА «ап» 155 р пи и "те речи Ше пачччесчса ссесваопико «М ке із За ета. НИ ре У еп ук дл чад ОМА

«шУх васжікїсіїві Шесвдлелйся «Ех копи зи З кути піків гі учать ух 4 «хі вий кра ури око гі І лайт пвофїУпМсКестоь хесрлайся ох зпоАБКОо Черекате чшкМА «ах 139 фо еутихщви дати у ди тут соспзосвса сасссоскас 2 «рій» 299 «вії» дО спря та «щі ОМА пт» о Я ня і пе зе «13» вкїаїїісів: безпепсе спа тя «й 2 узи хни хи я и деиірзювт ит гу у ря ще прі-зи Адм ки роозіупираієспьье Зечавпов ооо їгО депекацше пз МА жан зи «4002 БАНЯ ккстсасоеаче басесстоєоу о ся тупа «М МУ «11» люту Мі ОДНО ОМА соло кві іі Стук чаї акКІгІстіві оеЗиегся «шим шоп ти дуття ша є зідита тую жк ря шиї ин МІЙ «а» рзіуписівокіде зездлєтсев ок оїп о увкхо зпепекапей 4аБ5БМА «апоз вої кі рик Кевін тув ях че Бзетьессв пппстацоско о лоб Чл Зап є поря «кА ши СОН ТУКА «шля ОМА «шіЗ» акжікісїві Обеодепса Її и лих АК нити ту зи хі лен ім меру чт ут их т-ек 1 «і ния пра а Но ЯК «сив пвозУПМИсСішсоКлае ве;жавлов ох п АКко аересквієні ЯКМА А дл ве З М НЕ п СЯ азсвпсспваг ше ге ао2Ч й ся» гри «1 й кі» го «1» МА ол др я уяв ги кій» втусіїїсіві Беиавеосе «ох «аа» роіуписіеоссідв вецдоевпсв о об ій Узссо депехкабей азЕМА ще заз «49085 пз сасдаасоатеЯ сазштовсау то сля тяту ті о, М п4 «211 ти тд ГУ сум пт кю ОМА тут. дині йітішщші мігузех тм «У Ка: ще ше еще МЕ песен Не ших попу я шу жкичя и ке еф шорт тя рен терор нн ей «ша» розїуписівобіде вачиепсе зу їп оУуїхо сепекастесі сіввМА жати тїзу «ап 04 28 пидшЕсжечуєт авсодЕагоє МийІАЛИжерНЧИ ОО Воду ва гог ре ж л пилу «10 Ма сг суті чи іх ях «122 УА «152 дксіїісїіаї бедивпсе за. «ей» «чишУх роїУуписівзЕійе зезавосе окоі) зіто чепесдієй ЗаВМА янь оОокукмисиьивсхале Зедпдапсв око уссо чепсеидиунА сома и Аг зЗтц ка» ши - понад з та сзчаччасаа сова уву й «війв 205 1 б ким о) стул тумтв «А ММА полу лот» г я яті чи дих ««К1й3» вВхтАаХІісіаві Зеопепоє «ий ут ч не Я из и чн ни У ши ре з Же «из» роіїуписівезгійв ведавепст соб їй мажто депехкагей ве «пл за каб» ве вит Фа опуии Ж стазсвассвє бессазтаца 2 сту тет чех М; «11 20 лен ГУ «ЕЕ ма яру шві 1311 Учня «10У ЗКУ виш Вт чих ля тозіуписівовісє вестецесв зу їп туікго пепегратбес сівБМА Зк и пахупослевоксош Зесрліцесв ск лпокІко сеперасео БМ Кана сті кру а; с ц за пчзічіїсув свусвпотас 2 лютих зай ке МВ шт жук М слу гід ит МА кЕії3з десіїіїсіваї бедиепсе оо «й» бать Зк ня я соту кт че у я жи г перельоти у А «виз» роїуюкисіствкпят зехдепсе ок оїіб іо чепскатея ЯМА «400» гО08 і що ретро сгруєктнитя за спіусрчовчусс авсавтатс 2 сів зпа дей ши ох 77 вини скожи сять тм «шт 0 ММА коти пек во ян тка іх крій» витіїїсСсіві 5ецивопсе «Еш лу ух - . 1 я й из зизизфзініжіити ку му фе 2 кг р З ие «23» роіфіупипсівокіде ведиавеост ск їй млЕто депевуівгей ЗБВМА

400» 905 чечсвавчисЕ ссозтазавч ве яЕ лк Зал «іх 1 стул «11» 21 УЖ Гл «жа ПА «иа» вдЕЩіклсіві беоплеаглице ї квшО»

ятки а «уми ії ну ні опти че я пав зд вод ділі фі ФІМІ чі по 1 Упислесталє жена ск Ху ко зчерекаце сх МА й кю, Зах само 2719 веди дивтт зеапдттлдид - тої витсштатйклм азсата ща са ра т я т 2102 511 ил ла и щи шо «2125 ЧА сю ль син ТИ чу - сині кіз втсзтіхорїіві оедиевсе «йапух «жа» ші тУпиасІіеовІл ав ведовпсов ок оіп тісто сепесвіва ЯЗАМА «4005 511 азктасспчо зас киу о стріху за «із 15 «Ах ЕН ие тУМміх - - Ка У А

-еолу ту» п ака и Кік сі ха с «лід» вхЕжаМішІісіаї Звойепоє «вих «23» рзіупвцосївокіде зеузаелст ок їй УЕхо бепекасеО ОБАМА «па» 815 Ксзчісууоа сша кавоо 2 «100» 13 «2112 18 «12 ОМА сєт1іЗ- о вкігісіві бесплелеля ко» тва» роаіупосівотіцЧе шесаяпое ох їв іБхо Запгчрасені ЧЕББМА «а0пох 9713 зачсеЕссседс усасуве 18 «вій» 18 «кш1ї1хМ 19 шт чеїйи А пло пит і Я йо й дл лк. «жа» актліїсзаї бедпевосе «Й «кв» шеіуУписівоціце зезповпосв ск оіп Ззісто сепетгацей ЯЗАМА «4305 214 качзсссаясосс дадоксвов ва штуку пат леї 215 хилі» 7 «Ех ОЩА Сари ож в у 4 1 я пат то «від» звитаітісіаЕ беасциипсе тити хі меле ну дити зику их рон: БОНН Зк вони "жехтЕх у гркези ие МІЙ «ха» роіупосівокіде зедиєпсв ож апп о міїхо депекзтегО ОБЕМА «ап 415 і гіпс учету у діти цих -- пк стввячссс ппсузчапзЗає 2 ит т У шли т ї о со гу кдеців шу шоптяо ту ПЬХ а ОКА «Е13» актітісіаю бвайепсв кої «кра» тити З журитися К їх «А вочияо еліті ко и і ТІЙ ІІ шсамеУхьсьсяко НН жеФфіепсе окоха хх ко сегпевр паз шЕКМА Ан ті «ах гів вині со лук зебтосссса зсвззастаФто 2 свя тут «їй» 217 «ші їз пгултух ем «ій ОМА ол пр лу су ит дикі «ІЙ» вика бісхвА Зеопепоє «ай» ПЛ зт хтухтлунї ня сакзутуїзкзттутка ну лу т пит мое ну и її о «Ек» реЗіупцорівзціце вециецпог ок оій ма)бсо зепекайцей ЗаКМА «да: зі «400» 517 чзчагастасї сеассазчаса М ши «вів 5185 «21ї» 15 чиїх ОМА «гій зЕКішІісіаА бециепшеє «сел «ЙЙх озвіупосівотійа бсеспівпсе З іїп Уукхо пепегратео ЗБИМА чи позупрраноссою ше Та шт 24 ля пепекоасео сл та» 218 еще гишЄбсбесаас 19 «1» 5515 гул пи чем шк «й1йт МА «ил х пкіБісіщі Чедицепсю пиіКі1сїіві бедепсе ян «ай» «ша БоЇописівсвіЗв вегцевсе ох о іїб 9їірко Зеатньеві«єні ЯаКМА сви» ті "«режпедде о ва еччі дув де ТІ чосчсзваКрс пеЕсЗКаукор ах ре

«210 255 «Віз 21 «212» ОМА «213» вхгітіїсріві Зецнейое «оп «223» роіупиоіївоціде зецдцепсе ог їм ЗАКО чЧепекатвоі ЗЗВМА «400» го ассахачксосс дсачабаася є їх ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб формування рослини, яка має підвищену стійкість до комахи-шкідника, причому згаданий спосіб включає: (а) праймінг насінини перед контактом насінини з молекулою голої дволанцюгової РНК (длРНК), причому праймінг здійснюють шляхом: (ї) промивання насінини перед вказаним контактуванням насінини; і (ії) сушіння насінини після етапу (Її); (б) причому згадана насінина напряму контактує зі згаданою молекулою длРНК, причому згадана гола длРНК включає щонайменше один ланцюг полінуклеотидів, що містить принаймні один сегмент зі щонайменше 18 суміжних нуклеотидів гена комахи-шкідника або послідовність РНК, транскрибовану зі згаданого гена, який відрізняється тим, що згаданий контакт здійснюють шляхом замочування насінини у розчині, що містить кінцеву концентрацію від 0,0005 мкг/мкл до З мкг/мкл згаданої молекули голої длРНК, та збовтування насінини у цьому розчині протягом від 4 до 24 годин, причому молекула голої ДЛРНК вводиться у згадану насінину, проте не експресується з геному рослини, тобто не стає невід'ємним елементом геному; і (с) пророщування насінини для отримання рослини, яка проявляє поліпшену стійкість до цієї комахи-шкідника в порівнянні з контрольною рослиною.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рослиною є кукурудза, соя, рис, пшениця, томат, огірок, салат, бавовна або ріпак.

3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що комахою-шкідником є броаоріега Погаїїв, Оіабгоїса мігуіїега мігоітега або / еріїпогагза десетііпеаїйа.

4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що ген комахи-шкідника вибирають з групи, що складається з АТФази, МАОЮОРН-(цитохром Р450)-оксидоредуктази, ІАР, хітинсинтази, ЕРТа і рД-актину.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що молекула голої длРНК, крім того, включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 80 95 ідентична ендогенному гену рослини щонайменше на 25 послідовних нуклеотидів.

б. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-5, який відрізняється тим, що насінину, крім того, обробляють агентом, що вибирається з групи, яка складається з пестициду, фунгіциду, інсектициду, добрива, покриваючого засобу і фарбуючого засобу.

7. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-6, який відрізняється тим, що промивання здійснюють у присутності двічі деіонізованої води.

8. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-7, який відрізняється тим, що промивання здійснюють протягом 2-6 годин.

9. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1 - 8, який відрізняється тим, що промивання здійснюють при 4-28 76.

10. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-9, який відрізняється тим, що сушіння здійснюють при 25-0 7С протягом 10-16 годин.

11. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-10, який відрізняється тим, що молекулу голої длРНК вводять в насінину в розчині, що включає 0,1 мМ ЕДТА.

12. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-11, який відрізняється тим, що молекула голої длРНК присутня в ендоспермі насінини.

13. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-12, який відрізняється тим, що молекула голої длРНК є у зародку насінини.

14. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-13, який відрізняється тим, що молекула голої длРНК присутня в подібній концентрації в зародку і ендоспермі насінини.

15. Спосіб за будь-яким одним з пп. 1-14, який відрізняється тим, що молекула голої длРНК присутня в більш високій концентрації в ендоспермі, ніж у зародку насінини.

16. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згадана рослина не містить виявлюваного рівня молекули голої длРНК. Флуоресесцентва мала іІнтерферуюча РНК в рисі (рис посівний) екзогенна « період часу Через хво / Через 3,5 годин Через 5,5 годни Через 24 годин з ; гот суку ї д . їх т Контроль післяобробки після Обробки хтісля обробки пісня обробки ши нн МК нн нн ОН и и и в ОН и М ЛЕН, ОН тк ме о МАННА нн ЗОН ня КК я КИшЛ і. ша на нн З Ен сн нн о о МИ и ВИН В М о о в ооо ВИНИ ох пе Слони МНН и и о о и ВН се нн НН в НН В НН Би Пи и МН я с ОО нн ВН о НН ВВ Б 1 а НН МО о Ме о ве ВЕН и и ке нн о ОН НН и ма и ВО Ом о НЯ я ши НН іх. МОМ ВО М и в НН: с с ши Ес и о

0 М. с уеонн і енн В я пишна нн нн НН 0 и 5 НН ІОН Фіг вм ммввн ввмсово в ооо окон комах ЕК ОК опо кв евне подо поко от осо ре а о. п М с с !/!

о. с є п шн ВЕ о о Бо о п о с ее с У ПК и В с с с с її | с с ВО в ПЕ в ПК в в о с 0! с . с с ДИН КО Кв ВК они З МО А Вон о пе пох о о а с с о с с Її НО МИ и нини п ос М о с о. с ЇЇ

Е. с о с С с Б ИМЕНИ ян ан п в жнив. бен Фіг?А Фіг.2В ДІ о ВО р оно о о ок ше и Пед 0 и нн и ЗМО В с х ЗК КО и ОО рН оо а я у ша В М Б ду КО иКК і ДК ни ВК ОБО ши и ши я МЕ и я ОМ ОО В, М АК р Я о я М ОО ОВ ВК ох ж. Бк

ФІГ. ЗА с її шин ен о ня Фік3В Щи заввим Її, л сій а ка у «а БА ння З Рис дикого типу З Фіг Обробка насіння томату ЧЯКМА МЕХ (мішень тин169 Через 55 діб після обробки ОВА ЗЕ"! Контрольна рослина. В Ш В -ї | о. ; Е а ЕоЯ є Модем вня уч не тт АК тату нт ут поет отх хат Жу о т сет танк реження х. Е я я 4 4 ГО ше фо слилетяч ниття КИТ ИЙ ТЕТ КАМИ КАРИ КИТ КИЙ ТОК КИТ Ж ХВАТ ТЯ ТЯ ТТАЛИ лі шен ї Ди лсескн зано роги теки ни ЯКУ юю хе кт я Як Я З я Це бе ее беж де хо Висота (см)

Фіг. 4А зо дю Я 35: 4 ; ЩЕ ки аа на на а а о п ТИ прое тм тт КУСОК ТКУ УТ РКК УК юс ж умутеттткюи: Е ше ою і ЩА Ше Е З ї ше . : і Е Я феннянння - - , Сх : ! Ме ШЕ ин ин фекннннсст в в ї- Би ааккххкнккі Я ї 4 5.

Зх . її ка ж 3 й х Я ї Ку Я Я й х Ей Е : ї і ї ; ї я Я Бслю Я дк из ВЕК сли ЖЖ кивоу. зе Висота (см)

Фіг. 48 Обробка чзсіння томату ЧКМА АКРЕЯ (мивень тіг167) Р-звачення ї-критерію 1.226003 Рзначення і-критерію 1 3бе003 я нм сп пив осн нн я Я еннюанееннюннюкнмінаканнтоци венах коле ві ДК Етно ето пі овочева | Каконроль що ОО мосв. ВЖКАН В Ех т- Гі коніень КОМ, ії: КО фун екю чнактниял» ву : У п КЗ св і 4 зей Е я Р Я ей 1 З І 1 у г |; хі БО -й г і ЗЕ її | п ї щої ща шої ї ; Е ЩІ в от те и ШЕ КН Е то Я «з ши ШЕ: я Ам КР ї ї " 5 ши ЩЕ | ! щ ше з не Я 4 бі гі : :

в. ШЕ | щ. В Ії 2 - ре НУ СЯ х кн ТЕ щі Е 8 щ ше с ші. Не їй В. ; В! Мей Во ї ІБР ІН. м я 4 ї і Е ЩЕ Н БОБИ Як ОБ Я 1 й СН ЕШЕК ШЕЕ у В, ї ШІ ІННИ! ши ше шим ше 5 ЕН З І; ї Н х 5 Ба Е : : ння вив: вежа кни важ ки й | еще не ії ЩІ Ії і й ши ши ши ШЕ и В А Висота рослини (см) Висота рослини (см) ФігЗА Фіг ЗВ

Р-значення (критерію -55.206-002 Я рон енкічтенкюрнння сен рн ч. ТВ КН кино тону я ві СА аннн шине ния линии зни знан мин ВИНИ у У сі нан нн нн но вона Щі | . ІН . і Н іАжінимих БІ, У піпіінікоатінечкиткініноях ї Ї | мае : киш ! : я і: | ЕЙ Н і - ї . Бя і Я ке щ. | рт Й ОО, ! Би и Що : ї в щі ше ня ни ш ри зі Я ЕЕ ж ! ВО свя Шк що і 8 | ша Воде | яв ро я ЗО і Ов | Он ол ил Ге Н : от ї Ф ж ; Клим В І щ ВО ши 2 що І З Що ! в і ! ї нн пи В - Н ло г Н і їх лет Ми ня я ІЗ і а 4 і ШЕ и пек ен зах КЕ Н й ЕВ Я Кк Мо і ролю т Я ше ши ово ши ен а . У ї ІЗ: і; ї Кк І: пен нн Сен « о ши ши зни. ші і і Бе ц ро Кі Е НЕ ї м. р нн ШУ Н Я ї З 3 з Щ- В ї : : ДОН ЩН ій і Не РО І Ї Ен НЕ а нн нн м кими ЗЕ я ЛИ в ния й й я ж В ж ж й Висота рослини (см) Контроль АВЕ-В ЯМА Фіг Час 5Ю Обробка насіння томату 46АМА ЕКУ2.2

Я.В, мдатожчеактткинунчятмнам інн зенне оокмдвжлккікня сяк здклюкння замінні - зкмікикинх. й - не раукантикалдинннння не я пікантне нім лисини ож не тк пютіанетін кі тот отакі ік ке нк інді коді екю кити нки кине ке кеани ня ій

: . і ї я й І ! В в в ин нин Я фена кни ників чию нки сіянки нд кніійнтутитатннннн рення оннса нет іаті сен кв пеня ння о ЩЕ г ! ШЕУ пфенннотьннной У ринкове дин р нн

5. ! і я і і р хо і М: : с жен | : М т Ка но 7 вання Я повна ки В накриє М паном тивно мисі тин с ї я: : 4 і Е ш й НЯ - Н ї їх -й і дн ; ! ! Е ЕЕ; З г В к Я ї --к Е Г-я - ж дв р З с п ех і о. і, ; но : п щ В ? і і. сповна ве : Й 7 й нн ідх Ї ей пітжтннкя г і шини ше ве й З же Е як ЩЕ ї нн пи я 54 3 і Я і їі 1 1. і ї Еш па -в - і-й ну фену -- ши на ШК нори не ше ше вання м рн ї- пешешіш шен шен шини ши шо г ще 7 : (лежно т Е ї ї х. ї ів ; пф З Ї си можу бе» ях свв ех Е см вклю мея мя ке. сек вне шо ія ря Р : | 4 ; й Е шо санки МИ. "і г виш шен шш шЕшишише Еш р | ше пеня й ни а В БЕК МН Ж Я Ї нні доданки Мнйсною : зжненвеквв нен онйня пан нн п Сп п о о С а п І о С В С ЗЕ М НИ х яд я х 7 о ше ши: шк ше ши шк АН и З у у ре Ше ш роя З що фш кн х вчож пкоошедо йо ба як ж я 5 Я Е У ще р й ї- о хх х Бояе Кк ро рей ах дою роя ік І НН НН, ї- й ге шини й й ї- я їв» жо о фе Же ше ше ше ще ще ШУ з ве жке ; ж ше шк ЗОМ я що жо Рослини ФигоА

Я ОЕ зкфнояхонямінинякюну мінні ккаАкнк ін учнвА кни хання, терчачАКу Кі пет ЛАЙК Акне ек Ат Кен ЦК ДЖКУУх і хАкяжня тек сакккнтя тн ОО В : ж ніж жит кі же ОО ЕТ пннодаклнтнну ртуттю деподнт неоптутокннкотпоплотттвеетооттнкнтя що Я т Тони М ! ш є х з Кл ськ Е ІТ: Шен ди. о т дв Ілюк тя ут шт а ІЛИК, рани конт Мн КОТА кож кю експертні я 1 2: ФО і ток Й я т в яля і г п 1 х Я їх пас овнинни я ПІ НАШ зосавананнх н деоотінрінеттттттннттня ще. ха І ИМЯ То й ї в з ШЕ По В Ф Яд діння зд я НИ пт І ; й Щщ ТЕ прин пл ахітійн пи фут тиж тентів у кий дкучитийкетхкіуттиининкя їх Не ЖИ у т. Її з щ і пи. 2-й Н С - і ин - ї ст г р. ЩкЯ ме Н - . сх . її Ей Дали оуАжчнкАнь се ЗукуАААНиХ ВАЖКА Я АТ ЗАНЖАНКА Ка нд нК ни ЖАНА КИ КАК наділ АК РН АННИ БНеЯ Контроль ЕД Обробка Обробка засіння рису 45ВМА ОБІЛА Коптрольне насіння Насінвя, оброблене ОБО А нин и ВН и нн я о 0 НН он о Ор ви ен и ян и КК о они нн и АННИ КН пн п Мо ши як я. аа и НН Б ее нон р нн и и НЯ пн ни и и и НН М и ПИТИх у о ан нн ОН ПЕ о ни нини жи тин ве ня вання Срк при пд ЛИЖ І ой жо ПИ ни о и о НН З ШК пн с нн В НН о і я Ве о Би я ен но Б Б я ВО с ще її Б п. щ-е 5 АН НЯ пн он ке ян и в в А З в НН в и в в ан и и В о и в В и М ОН и в я и п ок М в Вин нн й т енер, В и В в и НК НН а М ша нн ня МН А ЕЕ ФА Ффіг.7В я . - га її : сх т; Обробка насіння рису ЗА МА МКК. Контроль Оброблене ВОК Ко В В о ово вото о но по оово я ОО в о Ех МО ОХ ВО в в ОХ Е СС. М и и о о п в р о в ПО о в о; се а Пн о и 5 и ин о ж ПН КА нн и ОН с в с 5 о в о а пе на о: Бен п о. в в и в ом п в в Пи в и в В п В и ВИ я у м Я Пн Кия ПОМ ПЕ пен і нн Ки М в оо Я о м Ме ОО ЕКО о о КК с ДН в и в я ж НН и нок СО и и с 5 пон с с о КО Б ех ков о о Ов в Ох п в о я Ен о в о и и, НК осв пн а. Он п а в М о о о нн в ен в о нн М Ми М я ен у МО и м М ох о о в п я 3 Ї оо и нн в В а В я ПО ПД ОХ ПО о нн нн В п і В Фіг8А Фіг-8В зажаєшни там АЗЕ ту пек мк теле тк жх ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ ФРЕЙМ з ГУКО и: ЗК БВ РКО: туру вев маш сов че КИ пикУцаює дув Не рен о НН ви а А В М АНЯ ВИ ок ек ви сн КО ВК М о зн НЕ Ве САН З в я ВОК ХЕ ЗіБ ЕВЕРІВЯ В ва.

БВ ФРБІЇ Я р оїБРО ТЯ ІІ їі и НН не такі 1531 331 туї її ЕЕ КН ЗУ Я ПАК и я УЮ Ж СЕК Ж Ж ВИС ПЕКИ ожив Ви в жи МК ши ж око Во Зио1і ВО я и и ик я НН ВО У М ПО А о я МЕЖ кі ШЕАТЕ ДУМ очи х МУК а В, ДИ нішах ки х І І мамами ий ШИМИ ПЕ Итя ГУБ ЕЖУ КЕ ПЖИщК км дню ЕХ КО рес НИ ШЕ Ат ш МИ ЕЕ ВНУ НЕ Я трлн ша о а ши ме НН ВВ РКЯ МЕ ши Шлш дк ОЙ де ста мие тушелу Шин ах ме зр ма тя шк ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ тРЕНМ. же ж ку Жва ЛЯ же СД укя ее урн УК уду вно сут ж ДЕ Кути ре Ок о Кф Те ун доро их туЬ, ие ШЕ ен и и КН НЯ ФРІ п до З БІ МІ з 35 ВЕ 11 ЕНН и ан Я ЯН ВЕ НН ИН НЕ ЕНН ЕЕ шов СН ДЖ у оВ ЕК УЮ я ЖИ ШОСЕ Ки АК Жх ур пеЖу КИ, Яд АНЯ Не Ж МАЯ ик о В М А КО ЗВ ле МОЯ Ду ми жи Фіг ЗА з ВЕЖ Ж ШЕ фі ОК Кт ЖЕ УВК Щит КЕ же ткож жи ОЦІНКА 0 ОчКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ ФРЕЙМ. их ЖК уУуУ их кан ев ну а ау ж іку ви у ук Мах Ум Кока їх Ми Ки МЕ ета ї планах ФО иМ Не МИ я 00 ШМАТ ЧК о ОЗНАКИ лежно Яру а кни в Кн В в в в и я «о МІВ Я пе ОВ В А Ти ВО ВО Я т ЕК я Еш и КИЙ Ж Емі ками мн и иа Ж Кн о нім М шо їх рай Не ще кової пох Н п РІ Н ех оОЕ Ехо: шощої. пох, не сни а З А ЕН НЕ НН ФЕВ ОС Е 7. З ЕН пи ПЕН М В ШИН КУ 51 ВО ОЗ КІ че ни НЯ Но ТІЛ Х ЕЕ їх Е ї ХЕ І п: ІННУ МОІх т ОХ К В ЖЕ ТОЖ жЖожит ОХ Жох Рок ої її хх я Ж ВО лих БК ЕЕ 1 хім ЖЕМН? шо Пи ДВ Ж МОДИ ИМЯ ШК Я Ши Ж ДЕМОН МЕ ТАРИ Ж Кк Ж КК и ТИЖ МИТИ хх шля БОНН НУ Беж с не ви Не ки в В Ну Кк дифллАлюОСЮ Ж ее кв М ВО он вв В ко о Тр В Я а у Кв В Ж ДК ЕС КВ МЖК Я вера що Коти КІВ ЖЖ: форт Що і сикк турні В МЕТКИ ст тий ТВ Ж т Ж т Кр им ут чик поем кни 00 ЖЖ иа шо а ни ни а и Ме ТЕ ЗНА еЯ Тк ЕКО ю пиктй ний у Й В м мя ик чук ШК ма цим ВАД нд ди ЕЕ ї Ко кох Ме ї ОЗ шо Б ФО З ОТ ОВ ДОВ ОВ Ой тої: БЕ ЛЬ та ох, ож ФО фЕ їх ОК ОБЛ Е Та ЗРІЗІ КЕТІ ХВ І х -шОУ З Е Ух 4 ТЕ хх ЕЕ аа ї 2 ті: зї 1 2. теж ЖИ Говея ЖОПОЖКІЖЕ МКМ КРИК ния КК Ки дв МОВИ МК ЕВ Кк ДВ КМ и Ж ИН и ПИ, фл и КУ ОБО МЕНШНЯ з ори в р о НИ и В в Б щей Як ЛИЖ и ВЕ ЕТ Кі ав НИКА няи п УТ ов Ми МАМАЯ ЖК у ЗИЖЕиХ шт ТАТ ЗЕД о и и ВВ ЕН и в В в В ОВ Ва З е ре т в нив КО В ук а Й сви НН ПЕН НК ке НН ЧЕК І ПІ М с М ВИ М В ПЧ т ПИ З З НЕ ЧИ ЗЕ А З ЗК НН ШЕ КК пе В ЕН о і В А НН ПН НЕ НЕ ЗАВ ВН ИН ЕН В ЕН М НЕ З Ве МЕ ПЕ Ва З В Вч МЕ ВИ ВІ ШЕ ДЕ ПЕ М ОО ПМ З в З З В КИ З я ЕН тм УЖ, ря КУ МЕМУЧА КИ ти Ву Жим КИ ПА КН ЕК ЖЕ Я и у ПИ Ку М Ки ка жх кН Я У а нан КК вн р ВН НВ БЕ МИТІ ТЕЖ а о ин ви ВН ПЕ ще ПЕ ср учох ма и ИН о В о КИ А В и АВ НЯ ди ки ВИ ней пит 245 и ак ов Я а Ер Ор и у в а и п В я С КОЖЕ я Яке подок я ВО ля кни КИ М ЖИ зд ня а в в а и Яни іо бої У з Фасж ю то по дом кю .: ж й жо Ж ж вової її лю шою й ех. т ИН ДЕ и а НЕ и В З ПЕН Б В ПЕ НН п КЕ п НЕ НН зи: ПЕ п НН М МЕ ДСН ВОК КМ ІБ З КІВІ Р.О ІВ І зві Її 1-5 РЕ ОРІ 28 пок. ЛИХ. КОН ан и а ЗК р и и и на в В КЛИН ах ЕМ, га рн и и НН а а Но ТЕ СЕМА я чи ПО Ен нин ЕЕ Ки В од Кк я Мат МКМ ХЕ пюре ТЯ ДФІ а а и В о В в в М НВ НЯ Кен ВЖЕ ВЗ ОН район и и В и і Нв НН А КК У КАМ «а дили ей ногтей и ок Во Еш Кв ВВ дра на М п З оп. Лі З тд ав ЗЛЕ 15 45234 ї І З 5 т МЕ ВЕ ЗІ Н ЯЕ НН ВЕ З А Я ПН НИ ЗЕ ВЕУ шеук тр тет Дт Ки ЖК яЖЕ Ж; ФК б ви КК ВЖК КЕ КИТИ и ККрИХТК ти кими СИХ ЛЮ Во КЕ ВК КИМ КВК ам ВК сх КК вт У ЕВ УЖ ЖИ КІ и ик КИ я Ким ВЕ Ж и КОМИ, Ех УМА НаЯ А в Кн ан он о в и п и НЯ В НК Кам ТУ ЕК БВ їж Км Кт улопА то шум в з А о кю ОО На шаф С ом В У МК и ЗЕТялЯ ПЕ кй Я МО КАЛКа а Жан АЙ и Ж ЕЕ шо СИ я в ВОК и СюИ ВЕК ку и ВІВ КЕ КЕ пава І Я: БРІВ тол Не а кН В с и ЕЕ ЗА ВІ нн, ШЕ Н ВР МК ЖІ В Не КВ АОДЕ ЕОЯоЮ ЕЕ БЕ ЗБЕ ДР КІ р КЕР ВІТ з о ЗЛЕТУ пед ючи сЕоТтх Ми Кжию ПЄд нюв, дике Ж Ж В що ж КК оку ВЖК Ж оку Ки ВК Ж Ко У ник и Мк Модк п К, КЖЯ АК ЖК Жш не в и о в В и В и а Во Не ЗЕ ж ре я У а А Он и в НК В А А ВН А АЙ ЖЕ ХЕМке тих НЯ со вв ЕКО о п в я ВК р а ВВ о В ЕВ ВН ЕК ОК ет ТЕЙ ІАЕ по Ж еф коцо я, ПАРТИ ШЕ М кт МЕМ ик УМ Ми КИ ВК Ж КИ: інн ен УК Ж Ж ДЖ и ДИН я НИ Ми ДК До я зва СНУ сих и и в в КН в и Он КО Не вежі ять диеАЙИ Й КЕК КК ВАМ ан и ВВ ОК В В в ж п Во В о оо Ся го БЕ: ВЕ ОО Е 5 Ж рах ко ша. ШЕ ЛяТЬ 1 о РОК ості ті ше Ше Не НЕ о З НН ШК ЗАС М щи СЕ и В и ни ви а и ДН Я их сю ІК РЕННЯ Певна а вовни о в З НИ НН НН НН ек АН ОН Н Х ОМННТЯ ПКТ СУКА пд ж. Ма ПМ МК АКТИ мов й В КМ ле мм МАК ми в МК Я БНея мо ки км их от о ник и в а В и и и и шт Не ск Пшоно в НН В ою АВ, жм кл ие нен свв в в В п с о ВВ до о В с і спо св п Ні Де НВ в сте сь и нн НН и НН ШЕ М НЕ в НН НН ЕЕ ПН З ЕЕ ЕЕ ЕЕ т Ге лов т. ТЕ ОА КОЖ СЕ те Ух г 2. ШЕ їх ТІ ку етану руч ШИТИ КМ ЕК КК ПЕ ВЕ ВА Є Ж Й он и ВВ КИ Км, Ж ВК у ЖУК ЕК ВК ее КЯ Уа ПІІ Пе шани и я АК: ЯЯ оо КН Я Пий тя дж КЕ «КМ я Бе Янв я си ун Й Мон и жиа юикиАйИ Е Й г шк Ед ЕН МИ ВИ КК шити урану ная І. т их рення ЕН ру ЕЕ ЕЕ ик, Се пря ШИН ТЕ ж ех ОДюТ Жюун сту з ЕТ леї ЩО МТ Ф 98 ХВ тя Ме ТЕКА КоеКУ 1с Я - я г ПРОДОВЖЕННЯ й пк я СЯ рр УНН ІД МАТІОС ж ших ясно й акоіноя ОЦІНКА ОчІКУВАННЯ ГЕНИ ЛАНЦЮГ ФРЕНМ ІДЕНТИЧНІСТЬ ОЗНАКИ дек; ЛБОЕОВ МВ РАХ В ВР Ж В ВУ о ота у, ща іррІБівівіВІВІ Св сг ЗБІР ІЗЕЇЗЯ я виш а І МА НУ ШК нс сті ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ пПАНЦЮГ ФРЕЙМ ІДЕНТИЧНІСТЬ ОЗНАКИ ес ННЯ ик КК В КТ КВ уки кпк кю ях пеЕНнциИчино С; пк й и

Фіг. оС.

до Ки. ЕВ ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ бРЕНМ а КІ МО, с КК Я, КЕН ас в ОХ суду. ОЗНАКИ. Ор КЕР ро ЕЕ ЗМОЖЕ ЖОРЖ КВ; УНВЕ ЕЧКК ЖОК Ж КК оичм ж МК ОЕМ ОМ ве ШК І ин и НН о Мрстю мо и ОСЖо шо ОСТ ЩО ФОП йШбВОЛьж жо шо Од ож Ох повоОї Ох я ЕЕ ши ЕТ І 5 хат І РІ як ЕВ БЕ ДЕ Ж НК В Кр НИК, КН Ж КК Ж отр омку ще ПКККеОнк В кУ ех ВЕН руки ки в ові ШИ ШИ ВІ жад'тецяе Еко Мафувтеки кий у ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕНИ ЛАНЦЮГ ФРЕЙМ У БІО ЕК Ме КЕ ВЕУ Кен ЕТ Бак шо шт а пост є ОЗНАКИ: ШТУКА ил ННЯ ПИКА я ж Кук ХИТ ЛВ. ранку КОЖ ІЛУ ІДИ ау ОО пк я и лк тої Вин Я пря ШИН ви ки ши ва НЯ шини шишешш не лов т В БК ПЕ БЕ КЯ Я Б раса в НЯ песен нн КН я ЗЕМ х Бод Енн в и ШЕ: у рев кня НУО де НЯ й тиюж и жк Се жк КК тики нтк жк зн. тей же о; жк т. п я ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ ФРЕНМ ІДЕНТИЧНІСТЬ хи с Мих п КИ ел ккаАмих ДАК ЕК ге тече дек. ща І п шо з ке ОЗНАКИ: реву ях Те Аа ПЗ КС нен я пкт зем я ВІН ан и и и ня шт: ВИШ ізоляторі я в Я ше их яти ми В ОКХ Мова ж пн ШН сх АТ М прання Фіг ібА ж АХ ЖЕКів У тел А У АН Мисни лет зн ОЦІНКА ОЧІКУВАННЯ ГЕНИ ЛАНЦЮГ ФЕБиМ «й й ЗИ яв 4 иа Ка Зевс ви я Ен вии гВ х пд М СЛ ще щу ов КВН і ї плен У щцх Ко Ж и с У я ке уки ЖЕО, Мо СЕ Х МОХ ваг Хо Кл Е Бе НЄ ТЕ реч ни и и в и Ки З ІК ах Вона но ни в а о р в ни М и в В З КН КУ Ех ж вже БАЗ БУ М М дув КЕ ИЙ КИ дн Кун ДИ дні М МВА ни А ДЕ 5: В 5 лою ше: 213 т: 2: фія дош 15 РА ! пивна сх нн Є з о є пе в а селеру кеВ пек зи и я я Кв ис ли ут ВЕЖ ОК ВИК я ж ря КК и ЖЕК ПАЮ В, КА ЕЕ Ж Жити ЖЕ ПІКИ ЖК. хо БО Тк ДЕ Ах ж и ме С я ОКО о у ж Ж ре ча ка р з КН що! оч чи мине й КМ ЩА ичн о ШВЕЯ кН ЕК ок ау Те АКА КМ А й ЛАК і пИВЯНИ ли си ди жу ий В и ДК Кк Ж ЕК КИ или жу м, а на НИ Уа вв жи ху У п ЕЕ вив ЕЕ МК и ПЕК ви в ди я КУ о ЕЕ ту а и ни НН и НК НН у чої шінож в у я о; - Фей от пої Ух її ка А А НН я з р ТЕР Її ш БтіІ: ІІІ І Б; фе Ви и НН ак З В ИЕЧ ж ОБРЕЖУІТІ ВІРІ а тя з КІ Вл Ії сло ек тА ТОМ ТЯ АВК В І ВОК Ж КИ МИСКИ а «ом и пт ЖК ие М Мам т Же Я У Ку мис их кре п пре ВО я и и В З ви в У и о в и КИ ВИМ ХВ ТЕ ТЕКИ НА Ки ой Ко ве я АД Я А ня кн АВМ КМ ВК Ви ТК ЯКЕ И БУДКУ ен а ва о ВЕ НН ва пл ее ня У ЛЖМ ЕЕ РУК ІМЕВИ й и и ИН в и ЕВ ДТ ЕАУВА «кт чу ААУ Кн Мк а Шан М Вл в КК й Пд КИ «УЖ кн В не А НН НН НН НН В НН НЯ х Же Ех РОБЛЮ їх Ах ЯВИ НЯ РОВІ ЕЕ БІО її ї МЕЖ т 135 Й Еш НЕ: їжте В.І Я 71 ПЕ ки О1 й п тЕККОХ ПЕК жк б и УНК Ж, ПК у КК й ж сю я Пи В ЖК КОП КИ ТК В, Мо ке ВИ Мой ММ Я ТИ НЕ ков КВ СТ ве о Укр р ОК а КЕ ТИ МОВ ЗА о ВЕДИ ки МЕ и ве ша ви а М и НН МКУ ЗІ Кей я п зак «М жири В ж ие оп ВИ Ж ПИ НК Ж и В тить Ж ик В Ка у т и ЕК Ж ВК б ж и хуя БАЯН КОР ОУН а а ОМ ОВ З В У ОЦ о ов М ВТ ЗІ ЗКЕЖМ Я ож «ША иа і В ти ВИ уд ік ми и КИ Мн АВМ що їх ж важка я: БІ БІ жая Рг ой Ма 55 Ед Мі дл я ра ВЕ ТЕ МОБ ЕЕ 9 віз ОБ ої 1215 3 Біз юну рр ЖЕ те порядку во Ж МИ ВО СЯ Ми умо ви мм ІМ МК допия ккд ФК Ж М ху жом ж Кт ВК ия КОКО я ПЕКИ В Ж: в и в и и В В ин ЕВ я й адхетити пу: Он в і А Я вед ж КА КА КУ ВАДА ке КТК и рани пк хКе Ех с пси вів ев де ж ВЕ І и Клин, НЕК К Мр г уд ж ик еВ, еп ЖАЦУХЦІКИЄ ТИЖ лек АК ИИя дж х ЕЛ Р се и и КИ а п В В и и ка В ОО ВО в я жи доки ОО І ие ОН ре кН НВ ние В в о НА КІ СЕР Ои ди ілю МОВА Зими АВМ и Ки о Мини ж АЕН и В А КАМИ и ек мк КА Ж А РО є мч и а т: Чо: її її КЕ пі хх г НАУ НИ я Ж шко БЕ ТБ Я ЖЕ ЗЕ ОТ Е ік МЕ жу ІЗ КВК ТІЇ я Е - хх ї ої ОВД ЮК тох Ся Кк хх хх т Не Вл вет ОЇ І С СК ВЕУ РЕК Ж ЕЕ т ЗУ Ж Ж ТК оКву т вжи ЯК Ж ЯМ тт ВЕУ ВТМ М ХК ж КН о Ж ПКЕЕ р Крани Іще че йжмшьК й ДИ АДЖЕ М ДОТЕПНІ е шжи ЕШИ УМ ДЕН ИМ В ое ЕЕ ТИТУМЕ Ок ЕЛ ЄМ, жу ММК ин ЖИ МОТИВ чути Ж МЕ М енд т и, ВОЮ ий а их ЖД КИМ У В Я пе. кН ЗІ в Здав а А ОВ ЕК СМ ДК НН У СВ щих на 0 и и в ки и Не щл ші ж ЗТ в о вРіІЬ пою БЕРЕ її 57 га ЕЕ О РОВІ БУ; УВК В Рі 50 кі 25 Б 11 0 5523 В 515: ЖЕКи КК. Ст КК ле своя пи юри кю НЕ МЕД НК, при ле в ММА ШИМИ я КЕ ПУ Ек дум ин мини: КК РУ пед ШОЇ ЕН Ви ан не Ка У в р и а о В В НІ и В ні КМ пуйКЕ учи КЕ ПТМ КАМИ? юю чи М КУМ ДАЕ ЦИ В БІО. Х рели УВЕИКА юки я ЖК ше. «Ві оВ У Я яки шви т шрот рол І БУК; кре ЯМОК ся й ж сккоже ля КИ ЗИМ РРО ж. Аж г. н я що - Я. ОЦІНКА 0 ОЧІКУВАННЯ ГЕПИ ЛАНЦЮГ РЕМ М й тулиоту ух до кт КИ З сом А КЕ живу Кн ШЕ ик их ПЗ ее БО Ж ак ие КУ г ТИ 5 ї ші Її" МЕ Я уд ОЗНАКИ: а и ж шу ЛЕК НИ ИТ У Ж КК МОЖУ Ж у ВЕ МСЕК Ж от НЕ - Б х С Я ЗПККШ, ОХ Оки От сю т ж ж КИ Ж АК КО ВЕ шо т ЗИ Бек ФМ Етики і КА ВК ВАК й БУД нн ее мае и а а ЕЕ НЯ ВО й йод шешОЩІЖ Ж ОЇ БОЖУ ВОД 3 ОБО ОО КІ СЕ ше І А М В В У З В З В на вЯ ропи п я Се и уту ж В ТВА КЕКВ В Кок Ми НЕ Кк Кая па ан А Я руни СКЛ Лек й Ж Ех Жоме мити ляк й КК АКНЕ КАТА ВЖК ЖЖ ЖЖ Фіг1ОС

Відсоток мертвих личинок 5. Го гайе після годування рослинами, обробленими А ТФазою, протягом 8 дій ях щі о ЕДТА шк во | ; А А бе у паж т ВК З 5 | п ОАТФфаза ї Уий А - й У є : і Носе та. и мя х щу І КУ до КЗ Са й і ше ож. я щи у ск Кб иа Ов А ще жо як. у і і Її ща тт 804 МИХ . ДІЛА й пранні кет нні т . можн й а но оч я дкдірх ай є спін "Рослина 1 Рослина 2 Рослина З ФА Середня маса 5, Гійогац5 після годування рослинами, обробленими АТФазою, протягом В ліб КУН моз пи о ККУ о ен ІА НЄ йо кій КК лі Как пвофі ктій оф т ет ть Кудрі их фін ти РУТ АТР діжк і пт піуіж кА ді клік тка ОДА ЗА й пли ер ще Ше зе коааахклиїкклйк 91 о АФфо ШИ до З Е серия ее й б іх 3 - й Ка і Й скллвйдлтіаяднтік х о й КЕ 2 ов ЖИ 7 ; | о ав Е диня ; і ! тя : ИЙ Би и ЕЗУ МА не я Як а сій вн сниннн шини а о НН НН НН ія С нонніети лих х Рослина 1 Рослина 2 Рослина З ФІЛІВ

Відсоток мертвих личинок після годування обробленими рослинами протягом 3 діб ЕІ Птн нн нн ня ин нн нин ин ання і в ОЯ в | і ш ! Е м і ї щ | і: в ї ! х З Н Е І ї | ; В ! І | ще ЩО 0 ретттттттттнтттнтрентнтн вн МИ рен шен ни ще ! Пов | твевовО Певні 0 Морі 5 Мово: 00 Пов ЕДТА І Атанаа ; фс Відсоток мертвих лячинок після годування обробленими росливами протягом 7 діб

ДІВ. пн нт ютвютеннтттетченне творенням етичне ясеКетеівненкчтт тенета пет тт о | Е В І в пл : ; і ОЗ і ї к Е Е | ЩЕ Е Е і 5 щ з З, що жу ї ї СІ ! | Е 5, | ! Ж ЕН І " Е попе? ДЕ ни поки тт ту тр ск ше ще дш Б фкжеор МПевторо оПовово З бевтові Повтор ! Мово біннові | Цовяж о ; їбшеовЯ Й ! і " ! Ї Н І ІВ Н Ї ЕЛТА АТФаза Рослина Ї ! АТФаза Рослина 2 ї Фо

Відсоток мертвих личинок після годування обробленими рослинами протягом 7 діб в те я РУК т КТ неті ад ні тот ятки появі якенвке коків тіні онко потіння сх іколеклк ненні яткіякнаннЯнс х ! і що і м Я ї й | і в ! ! Кей У Е й ї х що з і ї і | | : І

ОБ. ! ! ЕДТА МАбРІН Інгібітор. АтФаза аноптозних білків «ріг.12 Середня маса 5. ГлЛнотане після голування рослинами, обробленими СЕ с, протягом 8 дій па я нина п пи В п вн пи ик нн нин ГЕ БДТА ї е ! еще, Е: З | щеня ! х 05 А я я ЕЙ , БИ ск смдетау ;: серчествосну ср ака Я їх ї ЛИ і нику Се З Я Б Я пи Ак зт пи жу / нний ин ; з ще і о і с ДА я До Й ка З и мий ! у А я і ! ! вв прненнннень ш. Чет й піннвем сіє й птн дат нення повен ння Рослина і Рослина 2 Рослина 5 ФігіЗА

Відсоток мертвих личинок цісля годування се обленивми І ду р: рослинами протягом 5 діб МО рен ет окт т ур тр утри З ю ши шо ши В ши шишишше - 1 Н 1 К Н Н Н і І А вв ня | пн Е і ! | щ 3 і | і Ер 1 | щ шши ши щ Е : ; щ ше ши ще В щі | ЩЕ шк ши | ше ше і ше ши Де тот | ши ше ши: ШИ ШЕ ШЕ Ще | Я ія | ! | щі | ше шин І їх І їі ще Й ї | НН і шк ; ШО. і Н | І що й ва не ши ння ше и ях шини ння менеейшек нен и мя ши Вин стеки ішов і Їпоюев ар Певоря Понсор і Невсор оЇншеер Е: ї Пеневрі М Піннтов і: йон З Шов торі Баторо Повтер з Н і й Н сл ЕДТА Рослина З ; ЕДТА Рослина 6 і ЕБІа Росляна 7 Го БРів Рослина З ! Фіг 13 Середня маса 5. Гпота| 5 після годування рослинами, обробленими бета-актином, протягом 8 дій й щ вини ни пи м вто в п п пи ни сн пек псів пи подяк поновив пи нев «у те і Ну Ся Н Гана : и и нут і де ЕЕ СВИНИНА На Н - й С розвчакони УК ше Гованї к й Оля і 3. «- жи Н НИ ин х б А ! Е С як жит их ше 7 ; 4 - и Ки й А 4 й МИ шини Кей : і Я о р; . й й ї і ве як Я ї Е й їй - й яв р щі не і їм й й Й і 7 ей і и ! лий ше аа ня | м й Е ин Е ! я | ж і пий і : й я і Я Бик ї Хот я ї ї хви ме, їй ет ой шо Є Я 3 ЕН ї Н ї Рослина | Рослина 2 Рослина 3

Чиг.14

Середня маса 5. ГЛНогхаіів після годування рослинами, обробленими МАРІЇ, протягом 8 діб ДК стен тт тт тт тт тт сут ене тт тннннтентттннтнтнттетнтнтентнту а- 000 ЕДТА ш І | | я ле Е і сс ! тя дики як и : Ва денти ря я В мае й - я я ! ни Н і о, Яни Н а и сш ВИ; ї : і ї пи в т і ана З 1 й й -й ; Н с ж ве ти СИ і сш ї Пе Кеті вай ой ва я ж | де Н СІ их Ї хі С Сай їй ї ВО рн й а пиннени пенння Кк ківі ння трун й пеки Рослина | Рослина 2 Рослина З Фіг15А Відсоток мертвих личинок після годування обробленими росливами протягом 7 діб І Б шо в ш В і і ВО щ- ж і Й Е !

59. | щ Е і ! І й Н : З - Я ! : ше о 1 з І ШЕ ж у Е

КО. 5 ! ше о і Гевхорії і Мовні ї Пошоврі і Новхоті Ітор і Павлов Я ї з У і Є ї і ще ; і ЕДТА Росляна 5 і МАРБРН Рослина 2 і і ФІЗ

Серелня маса 5. Мцногане на один повтор після годування обробленими рослинами протягом б діб . т і ! і за-ж 4) ; і Зх У : і ! ! | ! 1 | Ї Е і ши шини ши ни ши в в о о В в вн В Покер | МПовтро ! ЗввихЗ | Пентоуї | Пошев Її І Повтор З | Повшеві З Пошорі Е Зівннов а ! ї ! Е ! Е і ЕДТА ! Інпбітор | , Сумі і апонптозних білків І Ф16А Середня маса 5. Бійотане на одну обробку після годування обробленими рослинами протягом б дю ; дн Н Н я : і Н ї Й - | Ї - : в Н ! ! : . ! наши і о ! Я З «в | що 4. і як ! і і 5 ! ї І 1 Я

ЕЗ. фени ок кя кн іпнінт я іконки кн кнопка нянинн панни мини нок нтнікінеінннй те Інгібіто ЕДТА Р й Сумин аюттозних бізків Фіг168

Середня маса 5. ГІнотаі|ів на одну обробку місля годування. обробленими рослинами протягом 9 діб г вв и ї і і і і Її Е : ! Її ї ; і вв | т і І ї ї : Н с і: і 2 і | ! ! : | |: ше | | і АКА ЕК ких ФА Середня маса 5. Мйогай5 нагодну рослину після годування обробленими рослинами протягом 5 діб вай ДУЮ Урни і . во | й т 7 і їш ті і І І Га ще у ин и М Ж! за М і | ! Шк; їі М. т | і І | | | ше Ії р ни - ! і і ! ! ще ' ще ше ! в | ! ! ши шишиш с- : ! ! і ї Й і і Еш Е В ши І ши що | ншщи о ї Е | | ї НЕ і І ії Н - і ! Е і ! І. : гЯЩ МЕ і шин що шиши ши ши в щі й ши ши ; | ! о шк. | : шищ ши ! ши ши ше і ! | ще ! ше ше ще ве 5515515 8855 858 А Кк ЕВ 11518355 818588 ск 85 15515515 513 ж ще ше: и пи о п а п п а п п В: о В. жк і 7 ся І и: ШИ ши ше НИ ТУКІНІ ЕКІЯІ ФірІ17В

Бідсоток мертвих личинок після годування обробленими рослинами протягом 12 дію ЩО й

5 . І м І 5 п в й І її у Х Ой: Е І і Я 5 в 5 що 5 во М о тк ках 2 І що же Й о- с Я 1 «2 т-- І бо ще і-ї є тя Е я й що в Е | Е Е Еш я й Е Е З В ше со Ше я я кт, Го за лі я. сої й щ ЗВ ІНН НК ше ши: ин В ії 5 5 во З У 2 Ко Кз с й Бетва- глюкуронідаза Шо АТеФаза Фіг ІА Відсоток мертних личинок пт годування обробленими рослинами протягом 4 дій 1Ю Щ ра - рн, 2 - 5 -щ В ! з Му у рес, що З «ех НЯ Б в т-- ре - МБ - ше й Ц в з - ш щ Й зво | Ф З в х во щ т Бо є д ні 8 з 508 0 би 8 88 | 80 581 в | в | г 5 В К І щот щі як КЕ х їх и х Ж ш щі в їй К дя ГІ в ож ГУ З Кк я В і: 5 5 5 и З З З ин маш: з З кри г жна нн нн нн п Бехта- 4 і й АТтФазх глюкуронілаза ФіглЕВ

Середня маса 5, Гога наодну рослину після годування обробленими рослинами протягом 10 діб т п я ! Й ї ! їх ! : | с що І х І о й ; | | І Й Я : і | | ; і : 2 ! | ' . ! | | Її - щої --е - ІЗ о ІЗ - і - ' як їз я хо Н г оо ев ій їх | я- В В з 5 во! ов в в в Е в й є Ки | п й ду х Ех в к щ д Ся 2 Ка КЯ ЕДТА? Зелевий Щ ЕДТА пмВн флуорес- ЕКІФ центний білок ФІЛО Середня маса 5. Гйотаня ва одну рослину після годування обробленими росдивами протягом 10 діб в - їх - Б - 25 Г ри ії - а!

. й я 15 ї Е - 7 п ше - - перев --. - - пивний он - як «з | - « | сі | « - що Ф ще с. в кві Б Т г Ж. Кн ши шен ши нен ше п В п в: В М п о З п: пе но Нв Пс ПЕ А НЯ їт-6 т- я п п їх Бе З й г) І 33 З іх) е Б пише ши шк: ни пом не и и п п п пи и с п п і-й | й во в я я іо Р Те т. щ й щи одне ; Зепений ми БДТА ЕДТА ауореє. ЕБІШНМВН пмвн о луорес цдентний білок/ пМВН ще Фіг 195

Середня маса 5. Гдогане їв одну рослвну після годування обробленими рослинами протягом 4 дій 23 нта нти 7 | | - є 5 п І Т ета 1 З і ве : Й ТЕ 1 й ТІНІ 59759552 5555 55553 52229255 1050 БАБІ ЕВ ЕЕ: я ЕВ З: пес Етв В ве янв Б АВ АВ я ВАВ ВІВ ВЕН КЕ в вк ЕВ ВВЕ вв В ШИ вед тет ав а щ виш ша вва Бета- дет св. ЕЕІоЛІМВН слюкуронідаза. ронілаза ЕКІв В ; лМВН фіг 20А Середня маса 5. (йога! на одну рослину після годування обробленими рослинами протягом 4 діб і ! і В 04 ; ши | ши в ЩІ | ше вся Б З і Н з Е З ї Ї ї і Ех |. 1 я Її і цій нет : пи пики КО ЗИ . Бета- Бета- ВЕ185, ЕКГТеЕЛІТМВИ глюкуронідаза гмлокуронідаза ли фіг. 208В

Середня маса 5. Г.огвіїз на одну рослину після годування обробленими рослинами протягом 3 та 7 діб м прут ненні нин кенсенсеетітюні ннііневет нів ненні стіні, мед є ! Я: З дня ! вк ! Сея ї ї : Ж ! в) Ї і Ж, і р ра ; ! гля мн ран Ж К З я Ка ; Я ра Ї й ж й Б Кк р й 3 й Я ее Ж є | Ей ра я Ка Ку і а А і ї Ко : я - і м ї Я й ; ЕДТА. МАЮРН інгібітор Суміш апоптозних о білків

Фіг. 21 Середня маса. 5. Ілйогане на одну обробку після 4 діб годування не тини шшшйя,ї,д49ля4яЩдияишншншннннннни : їй ! ще і С І Ї - | ! « І З : | і шк ! ! як о пипнананн нн ск | інннненреннннннокій нене мене ш-- ЕДТА Бета-актий АТФаза МАПРН Ффіг.22

Середнє збільшення маси 5. І Нога після б діб годування

І. ння унентнннодксттттепкнвнітетннінтнкнннтнвнкіет кісок птн потен кінетика, З Її з -яї 45 : їй ! і і З ; ! , що | ! ї і ! | і ща И ї : шо, | і ! в ! г я й і : ! В соднньм рекет вик с и вн соя пннана; шен ниннсннй зими сехонте при - Е поеорі І Мевзор у | Ки Я | Повтор ї Пов Повтор З і 1 ї і І Н Я ЕДТА | АТФаза і і і ! Фіг 23А Середнє збільшення маси 5; ГаЦоганйе після 5 днз годування їй юнниииИиИиижлжтлжлжлжлжлжлжлжлжлдлдлилилилинииилилжлтлЛлЛппКННИНИНТСЬСИНИСИЬСЬССИСЬСИСЬНОИ іт З то я ще і 15 Я Її 3 Я що. а І: ЕЕ 7 | ! | і і шк і | І що ОК до 4 | | і ПИ ! | і і Н Е АХ і Е І ! Повтор | Пехсорі | Нивеорії і Трневї | Теорії 000 поєев з ЕДТА АТФаза

Чиг. 23

Середве збільтнення маси 5. Гога після 4 діб годування і я | І І що он- г ї і : ; Ї і КО Її | | | ! БА | і | | о т, | ! І М і х. ї ! | І її Е к- ше: ! і ! і і і 85 ї ! ! ; і ши ЕЕ шк ікхіклюдіктектк З болкжктніь енееиованнй ср н стфьк, скік клученті ше миня «дет п і й М це Пошорі ШПовтеру її БКЯнорво ! Повний її Поза й Неворо 3 Поворі Повтор 2 ! Повгор і і Й і й Н ї Щ Й ї і ЕДТА | МАЮРН Рослина 7 | МАДРИ Рослина 9 і ! «фіг 24А. Середна маса 5. ТЛцОогя Нв після 7 дів голування ЯК т т ! | ЩЕ ж й і І! : ше шк й з Е « ЩО. ! | ! ! ! І ще о. : Я ; Я ї ВХ НЕ : | ! : - : : ! | ! ве і я | ще У От | Е | і Повні р Мовово | Хбнеор з о Пежері Поверо | Повх 50 Мові ДЛовлр З Нове ї Й; і і Н : ї : і ; ! ! | ! | | і ;

: . І і : і АВЕВ 00 МАЮРИ Росляна 71 Її МАЮДРНИ Рослива 11 ? Фіг АВ

Відсоток метртвих личищок після годування обробленими рослинами протягом. 8 діб З тини ши Ева : - вв Моя і хв Ко Кі ї | Е і я во Н - гос аа - чумі І" - СЯ жа стро АВ нок ій З 7 - ж ха рога му ї- в «3 с в роту в'я «а о ра ГУ в в їй в в в вот в в Ф- х що во в шо в 5 З ЕЕ БОБ ЕТ ЕЕ ЕЕ ЕК ЕЕ т чок вот Бі толь От в п гово ОС. фо ч в ВЕ пов а і УА НАННЯ - ІЗ 88885855 5 5 з 5 8 81 588 885 88585898 5| 585588 їкої 2. овк б. да б б й А оба до йод ву ду обу да Ве що да с о в о о в ду і в вв ЕДТА Зелений Й І Ето сіон ТФа: МАПбРН флуорес- ЕК1іоні Екс АТФаза чентний білох ФігО25А Відсоток метртвих личинок після годування обробленими рослинами протягом 8 діб т пнів кін Кнопки кін Кістіон ноут нентів іеекотія тт неті тн тя віку «анонс 57 Що ка : я 1 І : і.

Кк як Бодя г ! що з хх Ж Ї і я З як | ї ! 5 ЖИ Я й | Я ; в ! : ! З КЕ Її Н і шк ше й но тут ті джин джт дл сем пелети отже ктіжеютнй пет еежееовти ЕДТА Зелений . ; - де кидаищи Д й ТЕН ЕКісно АТФаза МАОРН Ффлуорес- цпентний білок Фріг.258

Відсоток метртвих личинок після годування обробленими росливами ІЗ В б 22020777 т В г в: ІІ ро ще Ї п а 0 Ф щи в ОоПайпо. Поу. Ї Ш. п ь " 13 5 -ссв о тот тоже з ва пря зви ви о 85 я явасзв вно ня з киснвя| зве вза З ЗБЕ БЕІЕБЕ ЕЕ ЗБЕ АВ БЕ схе вої: дово Во Б ово бе ою що Оот - що ото попоОоБ Б Б ОБОВ ск обОБ Б Б ЕВ ОВО й 1555555 8555355 53535153 3815555 55155895 шо ові в ву дім реа ві дя вів у що ду ву пів два вав во ло дово чо в Ра ВА вологу ЕДТА Зелений ; п се; Чіа ТФаза МАПРН флуорес- ЕКІані ЕКіах АтФфаза центний білок Фіг25С Відсоток метртвих личинок після годування обробленими росличами протягом 10 діб і : шк : Ї . щ й : - (5 ї Н їй пс. Н р ОО ! -ш ї х и ща ! Е щи ще 5 Ка ЯМ і Ж ше ; Бо Г5И ї ї о, і ОО й -- дю стіни інків сонних пень Зелений ях ся ня в ЕДТА ЕЕ1аяі ЕКіашто АТФаза МАрРИН флуоврес» пентний білок фт.250

Середня маса в. Тл йоОга!8 на одву росливу після годувавня обробленими рослинами протягом. в ота 9:дій ія 4 - я т ; К Ї пиши шини що ГУ - і ; мі ! от 1 ; Ї Щ тй «еп Пе ТВ пе з АППОТП ЛАН НИНЛЯТ КАХ Тв З ШИДИН ЛИВІ Пай Поп АКТИ по З 5 і-ї Еш Ні Її і Ї Е що НІЖ с з. й І: - 0 ооо Ге око я - пе лу Фо ре . Е 2 й є Б до ваз що на попав свое в'я мов в ие даю ВЕ кВ і : ВЕ «щі що до В ТЕ Б В в я Бокова В |В кВА З в В БЕ вх І вовка я б ває в я б ж В ВВА 55 9 а ат в | з 7 т- ве а а Е- а - ще ! Же Ек вк кт Еш ке ЕДТА Зелений - й ЕКІівї БЕ і АТФаза МАЮРЕ флуорес- ЕК БЕЇсно центний білок фріг.25Е Середня маса 5. Гійпозгайів на одну рослину після годування обробленнми рослинами протягом Є та 9 дій Іа 4 - 3 ї я т ки Н т : й ю і І т А й «тт ши т т п вий г М і І - т у НК - ; 1 І т т : І ват т Ве | Н ї ІН ПОШАНІ сенео Й Я ї | | 3 г еф ера вію ні ер ре | оре рахіт вшир ер || ші ніш вві вк сг «вікі я кре зі ші кі в| В ек и 3 Мо МИ НИ, Мао Яд В НЯ М ЧИ Моє НН, МА М БІБ) 5 ІІ БІБ Я я 5 ВІ 5 В БІБ 5 ВІВ КЕ ин ви ВІ Но ЕВ В реа я фев в рів | и и и в а ІЕЕ вх 1 1 Ір Й ста ен У ї ЕДТА Зелений ЕК БЕН? АтТФаза МАОРН флусрес- дентний білок Чиг ЗЕ пнЕтинннннниншншишншшнєнннннининмм мит і Відсоток личинок, які вижили Н : а дурінаєнтттктєктюкююєь літ я чуток Петті ях АНОДІ ОТ Кук пр КОС СЯ Я У нти КТ тт тітііттиянтя. ї дин Її : ЕЕ нан ан а нн нки і Й ше Ши Я: «дк ї в: : : Я ях ї Її окністнин й змив пон нан і тих ї ї ! У 1 Я З н « 1 ! К З ! | | г У ; : | : : ! ; ї Ах см: "знаних З х з. - і ке | Я Х Я: й : лм ; у ; ; і ї і дня стен НН З пре ліпіди нехуднкнк й нон сн сани нини сосен ' г й БУК е слу же Я їк я г, їз ашшниншшннт и кни нини ни ї ЧигобА (тет е ТРАТ тя півтіні тт че НІЧ Тіт іатю ж трі сао весняне МІРІ Т ТТ бі КО інет, : ї . Сукупна маса личинок (МГ) ІЗ

Е.О ЛД онукечнчуннннчалчучя які тету ту А нік КУ КАК МКУ НТК НН АК у кін кін чну ко ківннкдню ї бан Й ї Е Е т

7. па ї й й ши Щ с. . . : її Я ЕЗ «фінан нніонні рес вові кій кофе саон соків іно ояі ун НК нодее іно акнкрановококі ов ї з. яке ж с. х Н : окоеднненн, г? х г ше в З ! ї. : - т я К. у "Фонд кожи котлитктн АКА х дккжку соні ж ПДАА КЕ вв ж кжкти. и Я І ї і Х. як Її я і | : М Той і і | ще: . їх ; б З с з і у ї ї Е ї Ї Я ї їх і ссмваненя ікскикьк» У пейуня з Віпчіквккко асо шани сан онко дп овмайнювн і. Її м ду тож й ниву СЕ КК песню. ! ПРИЙ Б Р Б Мнннтен дк НЕ кі ононісднд от ен одн КК Кк ківі КАК КАК Ка ктів АНА Кк ан одесі окклжінііннк

Фіг. 268 Дт мее тотем о о КТ МН т нн . Сукупна маса личинок (мг) : КООСЯ фоуцданкакдюіуккви лан Ех ах ХУ ААКААККН Ал ВЕ ХК АКАХ АЛАНА кА АКТИ ен еАККАК КИ АК нх я тічяя у ;

ї в. а Х інно пкт птн оківкиніиттиіівівкнвнтттіетжи ї ї ов о х і х ше ших і і Я нн як о Кн Б ! Ї ї ПЕ я ШИН Я й ВИН МНН шк : їх в і ши З ЩЕ Ї поши сейвний В: : й о ї З ї 2 НЕ : і 3 ї Вид Е й ; обох і хе | | | ШЕ а - Її. ) і ! ! ї ї ЩЕ З Е: З ї Ко 5. комі о і ЯР ВРУ ЗАААИ й в и

Дефолація рослин томату через ї

4. Колорадського картопляного жука І Ж оррієітет сварити еа ів рдіховуквкх сг оаки Еко кх Соду ккапнічкевт МУ кіутвет нині хе ТЕКА жр ит нілвилуєтттекеккинииєтиккю і Н

«в. синя хчяячиквк вен, Зкнкхчинхчієжвнюкню тні я. пні поні Кт бочок кнктесоккінті ! рот ; | - ! Е ! ! : Н ї : і

Е В. ї ІЗ са ї і Я : : г пе ИН с п пи п А потен Композиція Зепенний флуоресцентини блок ТО594 Фіг27А они п в п пов і лай печія ши і Особини колорадського жука, які вижили і мА і х й ве я шх о Е шо с шо То. і а ї. ї. ! ія вище і ! хх ще т нев олива вив она. ннвнниоасвсвни ооо з ж В. шин шини ше рн) КІ сн. пе мин пи: фелннттетекучнуєаеатькух І члухтктлакх : п по зкхжя т ни жЕевтв: Ш туя етькттвжже ен» і 77 : : Композинвія Зелений Флуоросцензуний білок 16593

Фіг.278

С Середня маса личинок колорадського І Б ї. жика. ї ня Я вони си по и и КД п ЗА В КЛИНКИ М : ЩЕ: | ! аж ши Ше Е с й : з а МС ше Е; ж ї оджх Н І: : і з Ж з деитинкня : их аннх у укуєнуааанккиАкнно вкакукєкт щ о ! : ї ї 4 1 ЗР доми ВИНИ; У, акнічнннкндняттні нку ЩЕ к ЩО не 7 ії ! А : ШЕ ! Композиція Зелений флусресцентний білок 10593 . Фіг ОС фен др тних зжкн аж кс кі яія аяоІКкКК у ля піаніст к тя кан ТОК Яни я я мяч іванн Мік тн ян ж а ІІТ ТК Я Я а джина кю а де ДІ 4 та зрада пн: ї 5 р зни нн ні нн інн інн інн і ; ; ит реден В! Ї - до ен й і і я що

: . «і жниит ГІ ол, Шан З с і 53 Звбнннннння : ік мон й ниви й дети Ян нккя і й з і рай з ж нн МО З Зоо МНН пн ер ен кюдьисня пн шин шини 3 Не ши же ей м ми нь їх й : Ж Е Шок ; оо Ше: банк ке ще її 4 шк ЩЕ шин а и а і Бо, 1 оон ї ! Е : ! ей «й 5 Е Жуххумуюфуюуяй , Ян Е БЕ ї : І й - я ешшнанннн ннн Е - олії» Необроблений о/з контрольним і Оброблений роолех значенням Дандета Г вчинену контроль нин і (тригер) 005 : Фіг ВА

- І не Її ї к і свгішінх шен ЕОМ ка жде Що й дя І ! ! й чннкнчкптручкцянних ння рн тен ; Ї і ї : ІН ви НИ й я ши ян ! же ї 2 і ; ША пня і я ; й Ії ше ї чі пон и п п п Я п о п п в п п В ВВ ВВ і БК Й до сш Що ! й Необроблений З контрольним : я Га ка де і Оброблений контроль значенням Даннета (тригер) 0.05 Чнг258 рт и т и й | | ! : да їй І й з ши ж Шик а я і і ЯК.

Не І сей - оси м занай ПИКН я со одне ї і що пд нт Пр Цен Кн : о омомннния мини за ВИН Ніс: ий : : ШИ

! «Й т Шен я й тля ; іч рі ; па | І ; й Кн! : Н

Н Н І х : : З | | Необроблений З контрольним : Оброблений контроль значенням Даннета : (тригер) 0 85

Фіг,29А.

УЖ - ї дення І їх: ле : у КІ Ї «від І Н Я КЕ і ПКУ х Г « й Ше : і ще нн ЩЕ Ши весна /- ше ! і 2 З «3 мн інккн усккжк кн знах шк песен ср І ше; Й з ) аа : 7 "і . Що і не ща ; Ши ко а сн НИВІ Коен Ж А Я і і шоб | Ше і дин ! Хбнния і те о ей зн ше І ! р ИН пкеоокднесктандн неті нн пкнтрнннни З й Її | До З контрольним ж ж т м ко А 3 м Х що « Необроблений | еПтТрОли Оброблений М значенням Даннета (тригер контроль 0.05 і тригер! !

Фіг. 298 Епос сс нн посікти нс посада нос порі подія ві ні в нд сон косій носі опік ав інн нн попі пи км ванас ! й КУ пн п п о п п о т п пн спи попи нин і і і з 5 т : т | і в Е Кн З т | : І З що і зжж вади зон дірки ї У о ї ЕНН я У йіче Пе ї іній На г ЖИ нн ай 4 Її ш і пи жк ї і ї ; В; 5 а о я МИ ї ї й ! ж - З контрольним !

ї ;. ж я, вки й Н Оброб лений Необроблений значенням Даннета (тригер) контроль 0.05 Тенти ин поее і петні кі кокндтвгогіцинатнкДкно ів они дий тності оон наводимо ніна дао вані ват кетттессогосеоннй Фо

КУ НУК УЖ пива ЕВ меш сяк ДАВНО ях ОВК ЗО плюСсттюю НЕ АН слой РП ИМ У, Их Ж В АВАРІЯ Мити ит Ват ти пи ди у І ВИК А ВОК ниж Ім у и тих між скік Ов й ЕТ и іх М КАМ тю п ВОК ША У ма я зу очи тюми й Ви Ми пий ти в А КА ОКА МАН ВИ УА йо НІ он си Вино ем М У в м З НИ НН о щ-х хі рони З ие НН о НН НІНУ хх КОВО ние ни в В Є ВИК Не У Дн Ь жи ЗІБ ОК БО ВВ о: п:

ж. 1 Ей ФРІ БТІ РАБІВ БО БІВ рі сг 13 Р МРІЇ азкчуєт ух КЕКВ тую и Ж МОЯ ЕВ ЗК кв кину КМИН ЕК рт помочі ик ж кими Сеня ПСИ Тк ад І ЕР ЕЕ ЕЕ їі о они ІАЕ ее ЖАВИ М хай х ам кана о ния ке ови у пов и ви о во в ет у м о пл о ее иа не В ваз а ВС Ме ит ча мех полу и Мт али и Ви де Ки, МОЖ В кит я Кит, кожи ву музу их пи. ща шик КЛЕН ви и з Ва В ВО АН ДО фс аНи А АК я В М В В Ей ох Тит ма сотні т іні мама а ін А Вокер ся і т ВИХ Іру ях ЖК КЕ МАКИ, ЕЕ М ІТК АК А АН КИ АЛЕ ПК и он Ки ОО ДІ ВЕ діжі 5 1 ЕЕ Пе НЕ В не НН З НН МЕН ОО ТаАл ЕЕ БЕ ОБТЯЕ пк ВО ОВЕ ЛЕ ра: БІ 5: КІР КРІЛЯ ЛІ Я жа Ек де их сову канони ана а вна и и иа в А а А ДЕН до ши ТЕ км нирки и рана Ов Нм рун и Й ЕД ин о ЕН ВЕН ЗА; меш тиж МЕМ А ШІ АК ТЕ КВ ШИ А Ан КЕ ям «РК ЕЕк ше КЕ ри и п вд в уя К ви ду і КУКИ и ки екв у я в лет ріж ІК. ТЯ КК ТУ я ЕЕ ТА Б аа р ін гній ит й іже КО МЕ БеЯНЯ с Бах ШЕ Мушка о ММ КІ І ШК о й и Зх ни ВХ Я ї Її: у Ж жа тіл в: ЕБЕХ ТІ ЗІР і ТЕ З: Я та ї а в ТЕЖ па БЕР КР ЕІ БРІВ З СЕР З втік, бик ж ПОМ В М у дари ПК УМ и и ТИ Ми и уки ЛИ в у Ву У и т ох пох ам хо рН и ВО А пе ЕД о М и В Ні а НИ НЕ ТЕЖ иа ї п ЗДА ок МИ БАЙКУ ХК КИМ КУМ Бак кРКІ ЕОМ ИН Ме В АК КУМ ен ки ее а и а в и а ВКА тую ГКІ МУ «г АНІ и в І а и В НИ В ЗИ НН В и АНЯ ВНИХ яря ШМК и Нор АС ВН АД Оад а ИО ОВи ТІ рок Б аЯ ЕВ РФ бра ВІТРЕ 12 ІЕС ни ик тен ни І с а и З і З ти з и З М С В З А п а В я ОКО Ер З вух чрижти. яю ий Ки НЕ Кри ти Ж ЩО п ТЕЦИ у кути Ах, УМ У М Ж ел и их Ж КК ДУМИ МВ я оди МОХ Но бренда т А чув А ГИ ТЕ какая х мА АЗЗДНІ Мати А Ки У ПАЗА КАК Й Ки КИ ЗТ КВ я Зк ви в ие ВИК А МКК. БЕЖ АК ОВЯ кан зе : в и рн м а р о В А ак вечори тиву вл МЕМ хх Я дя кінь юс Іа пр; і фями с си ОХ АН а В и НН МНЕ ШН м, мил В я Зі кН Ки КН ТАМ ЛЕМ Мо они а КМУ М Я АК че Ж ка т. г. ХЕ ї: кож я г Я т Рак жотд г оВ Са Кк ОКО ТЕТ КУ 3 Ж БЕБІ 5 ЕЕ ЕК ОБ т ДЕ МЕ НЕ ЕІ Ех лі ЕФЕ кН її Згпрмжми зер жити КУ ТУДИ и Ей Му и в МИ уки у пи и уд у ци НН пр нн а в и А В и АВ тп ле вк Е й реко Ва Я о ВК пн о кв СЛ у ий и я п Ва в у во и Ти: ВИС а КО ЕС ВИ днлйожйя друк ДА ФВ ЕК ох тик миру и Ек ки фути ох й бритв Коти ун уки ик ож ПЕЖО, Га ож Морі жі в А І гАрю і МН ЕЕ ТІ МАМІ ійічі: мі Мі іш ж Мт зи А те СКУД МЕ у А А ПАСМ Кн чий уми А КАНТ МАМ МК ММ и ММ 1 ік : т форм фОЕ Кк х Де Ук В НН ку Ех ші СЕ їж й Ел Ша ЕЕ пн Ен и НН ТРЕК З Я ЕТ ло ; штрих ї 7 ХОДОЮ пою а Ма док Кох КУ ї хо: пово оо талу 0 вне ин ие кун в Ди вин Ол і 7 7 ЕВ Я па в и т НН ті токар в тА Ж АХ їх ОБО чию ХК Мчий икоюКу А у й чий Ті КВК уки АКОТ АЙ ШЕ МОМ и до ло кити оте, хе та пили Ми ж жк лики ди р руд ит, ВХІД ее то Я ГКУ Її пу на а а о КИ ВВ НН го ші РКО ре т їн х Ему ж ТЕХ век зви во р и о в и м о се ви вия Я й іЕкі Же рію Брі дя ГЕ ЕТ В Рв ж ж Ех БЕРЕ РЕ тя, ВЕ т вт їжи маки Ссвог Мих ШИК ку ЕЕ дров, МИ и ие МВ туя ви потр ин КН М КИ о и и НЄ ж ХЕ жде ра в м Я ОО по ою в поки В а ев с вка Са КСВ МЕ ВН ек йх тя мовне га ке зве «ща 0 плюСстлюС о ЕН АЖ та с: СУБ мак КИНЕ ря ШОЕ зна п Мллюс тими теле ей хи и пив их и и и В и ВИ дим т ух им и пкї КЕ б фею тіні оті Мік 1 ТІ див і рія і сані Мах піл міну.

БІК ік а Ек Я МОМ КІМ АТ и ЕМ и М КАМИ ЕІ ЕМ ЕК А й хз їх 2 ше: зх Ж ІВ п Як г млов т тох Кі Її : 120 1 Е27 5 Моз ЖІ тії В й ШОЕ ЖІ 1: С Я ШОВ ОІВ ОЗ Ж ЧНУ СУ Мото ФА ВО їж 1 Ер І ВІТ 1 в ожя жу МІ 5 МВ Тл ПОТ ечЧИ МК ух пи ттуйв ий лу и мини и вити ту и и их ки кину кумис ие ри вени РИ аз не во А НН М я я І Так г І іа ЕМ г Я хати ди Я ху вн нет ж ев и о и о ак с п о ов вв в и як нс в о а вия меж Тему ря Пр нн и и и СНИ ЗАЙ ЗЕжестує КИ ТД М я 2; їй іі: М ЩЕ І В УМА І ЕВ ТИ ТК сів гі ія п МАУ ве МЕККА Ма ту АМІНИ ОКО НА Мао Яке її З ня Ек в КО А а НН З НН НН НН ЕН Е: її : 2-Х тої хо ВК й БО ОТ ОМОЮ ОЇ Ж 23 ОКУ ОКО ТОЮ Я ЕЕ і п ОБО ія їх її катар іс реютТ тік: БІ Ех ХА ОЇ іш БЕТІ ї сен я; НН ОН СН ни В ВВ НК Ан и в ВИК о ЕН В ВВ вно НН ЗИ сей КУШЕ о о ДИ 35 ЕК Б.

Я З іх зіеию ти З Іа: Її Р ву КД В І весни ооо виє века я ших коп па я и п и п и во я с а ВЕ В КМ в о В МС й пута дл ев нн Ки ви м ОА ау В М Ки в в Вони ВИНИ ІлЬьТМі я 2 КУ З НО НУ і ічрямі м) вмінні лі ІН КЕ МЕ хо віче 4 Ка А Фе ТУР М ий ючи ее НТ МК МЕМ МА МК З МТК дю мої х ЕЕ р ах ОЇ У : У: че нн ни и ИН З Пе НЕ Н ни нь 1 З Ї лі у її і Ж ЖОВ : ти ве не не о В А НА НЯ КЕН ЕНН їх ни з я їх хо ШИН : Еш п фюЕз і ф Б ЕЕ ЕЕ от ЕЛЕ Оси ЯК я ВУ и МТ ик у Ж т вк я Я КМ о Ми М дин и ВМ ук им куки мул М ж ії Я ди ЩЕ юки рен МОЗ ла мк Міо і а НН ЖІ Мати я затих ул о ме м ки о и ДЕ Ки о о о Б В ВІН ДК Ви У НЕ НИ Зв С Я ЕН я В Зв а Во КО а о ав, мох а восени тк тки и ВМ ие и омпОлатимузнучу уми му ми ТЕЗИ В МИ ри прик им дедй ПЕНЯ Кох ана о ОО еВ у ен о ЕМ ЕВ ОК МИ В ВЗ ЕН я ЗИ В МД В В ВЕ ВОДИ В ЯН дж ах се ам.

АЕН МЕ Мен А мкА и и й АК ЕМ Ка о и НА ВЕ ЕІ її : вв їх А Ер й її Ен ни ЕК ЕВ НЕ АН НЕ ВЕ т вОотлЛея 1 5 зи жа я й 015 ке ОІВ: Я зер чук жкойлу, му ян Ам у, ом ви и МИ и МН у М МІ и я м вх кп Ми раму и у М мими и Яру ВН кН а Нд и нн КВК ЕК КОНЯ Мих ЯМ лі ку В а как в мМ вилки Ми оо ЕЕ Ах тихий збуту кишить р Дек ЕД Ну пр ли КВ их у о п ю я х татегу пику, ЩА ЗБ В ВН КВН ВИК Гео а не оо я а и З В Ва ж Те и вт НЕ МЖК ХЕ ії ха НА На Тлайїіещі ії ТЕ Ооуч ті їі І . зак їх її ЕНН ли ЯН: МЕ МА КАВУНА А М М и и Анд тики М ий В КН МЕ И Й АИООВИНИ КС ЕЕ: 2 сш; рф ют и шії Гн РО 1 1 ї Ки Ес КЕ пут т РН 1125: 55 1 5: 1511515 5 БІ МОВІ БІ 855 ОБО 171 хх Кт ФЕОЛЕтх ГУ ЕВ З Не З п и М Я їх З ТОК ат жи ХХ, плен у у ВА ми и Випити уп пу хи ку и У шо А ве: ол Кеди не Не ВН а р В М В НВ В ВЗ АНА Не ВН М М а АЙ хі ОНУЮья Я А АММО ВІ МНМА учн МК НЯМ г дии БЛНЕ АМ им АН МК Гезккаая ТУТ х.

Тх поцупив ул и кт Викуп дв МИ В их пи МК ТЕТ НЕЗНИЯ с НН В: ВН МН НН КеКяи ДИКЕ Кр КЕ ВК НИ КО їх ми ве ни мне до юс аль вин ВА и о а ре в зр мк ен в я ВК кю м ва ж Микол ний яйкдінй ТР БТ ЕЕ Не ее З НЕ її ЗНА ЕІ: їх ОО КЕл ЕОР ЛІх ЕЕ КЕ КяЯ Я ркя Я Я ЖЕНЯ РОБ дерти ОХ Те щулу тт МЕНШИХ Е у ий и ШИК В ви МКУ Я й, прю тя, Дт в ми мя З ївю о бомжі кін ті лег й мабеміісію я й ше Б 1 ши щі зи вом мч нове шше кН и С в В с ЕЕ в и В Я діжу кт пари ДМ дя с в хх, ИН ух и ярих у М ТММ М Ж и М В Кук м дик В дпа тя р УМ хх г й а пиМухох дл я жим МИ и и я Ехо кує ви Ви КрИ мк ва и х битим тн хК ТС фі іні меодіч і І КУ КІ І МО Мі кін МЕ ни ми о М ак вах ШК Види АМІАК А АЖ ий х я ї кої її: го вд ві її КІ Ж.

ЩО Код ж с г кЕ тодюою Се Одосй ОЖжОХ ї з В кі га Її Ід Кир її КІВІ 3153, Б ОБбЕ 158185 х ях Еш 5 ЗІ ХІТ ЮК кох тА пліва Я НЕННЯ ї ЕХ Мк Кох шу мих мо мують у тпм ж и диких ММ их Ко коми М хм КИМ МОХ У р й Ж ЖКОМ И оку КК.

Кана ке ЕК, ва п КН а Б НН вони МваСи я вн ик в Ва В и РАНКИ ЕН її Тв тями ТІ Ти ж г ан Н Ви и и ІК Зк пиши ше нн ЕН В Ва В В и я и ОО МОЯ ек водо 5. ра УК р ИМЕНИ вх ЕДДІ ВОЮ п тер сБішЧі щі вок тік ще г А 23 Ку Ар ці НИЖ А 5 БАКИ АТ я и АОС ЧЕ.

Ор 1 с 5 гі ї ТО 112 25 Б ї її г їх МЕНЕ ЕЕ г яки я ко ие пику и дики нини кр Меп о вотро шмат МІК ЕЕ а кох їгя-й ТУБІІЖЬА Кай й МАЙ М Мен ох ви З АДЕ ху язЕгі Кратна зміна - 1.678589 ч : іонна нн нн ни нн нн и и и ин ! : ї Її Й Ї ї Ї Ї ї 7 Ї 7 ї Ї й ї Ї Й ІК | | І Шо і й Пре ВИ г я: т ще Ж ; ще в 4» 4 - : ж енх ня 4 ня БЕ Бе ; Н В ОН. ях К) Й я Ме що і У : ше Ох -Щ Б не РК ШК «11 : ! ! СО ОАЕ о ЩО др хо яв 03 5 роб 05 У КО; гм ж 35 я зб є їй ож є З ві Ме мі не мо що 3 ма ж зя МО ма МО МО шХ 5 83 5 955 м З 5 щу ЗУ мо ме 88 5 що ж: ме ЩО Ще ме ще ще ме Ме чЧ8 мо ба Ре ще На ом ря ХЕ. За ж х. ж сс Я п о. й Я х со а т нт ЖЕ Ех се 5 де жк ся ші ШЖ ЩО щі ОШР а Я обі о її ЇМ ї6 їмо БК Ше ов їди 0 03 0 об а 0) їй СТЕР «зелений Фіг3зА флуоресздентний білок Що хмаврі Кратна зміна - 2.1214 Пс ОКР з смт Кк ОК ЕТ з ПМ ви ГА я - Н її Моя Е ЕНН; і Я й Б ня В Же ші й -

о. ші Ще. В і : ра ще ЕЕ її ; Він Бак н я З Я На І я ж ІЕ оЬ хз т ее З: Не о о Зоо с С З с т Не НО Бе писана: ав ше ше ши ше ж ші Ши шк ж шк ж Ше Ше ЩЕ ШЕ ШЕ ШЕ м о с З сте ЗК» ЗРО З Ви «ЗТ ПВ З в Во С Спо в І ЗМ в с пив З ЗМ МОЯ їв о мМ АЮ й що ми мА 3 ма ай змо ша ої ми ца й зах ща - і ма ж щі СТР з СМТР -- зелений Фіг лов флуоресцентний білок з ПМВН ха ЕК Кратна змиза се 16386 ке м ! Ек З вність НЕ сан Ї Н ї Н ї Н Ї ї Її Її ї Ї ! Ї Н і ї Е Ікру ОЕРзсМтР ; : ОС вЕСзпмен Е ї ; 3 повинне Е 4 Н о Ше ї г: рої ї

ЕІ. і ще ще я М оо ; Мк : ак вояк і дак і - ня Ко ши миши ше -ПеН Н ; Е ху МТ УТ на ж ни Ж ен Я Мен Я Зк Я Ян Її Е Й Х і І "Ва я вай всі р : ї С сс о ша ше ав ше ее ШЕ ие ШЕ Ши СН єди дх ша шо що се ще о МО ща 35 бе соч йо Ше ЩО ЩО бо бе 59 о жо Зо: 15555050 ща їш У 0 а В) а Мі а ща опа ма ой м М йо бю 23 й ШЕ ма 0 25 ШО ЇМО ПР ЇЗ СЕРЗСМТР - зелений «Фіг.39с флубресцентний білок з ПМВИ хіпз ЕКІ1 з 5 нини Сет і Гримич ЯК ї Мові го В | Е ІЗ Макс нжщівнтя квт жання Е Й пвоче Її як ах ав у и 4 545; | пе ен «- і ; лк а Ка нний. ї Ї а ВУЄ Ко Й і З їх Б я Вк АВ Ж Її ї Теж їк пах І о І ! Гежкуйу ника - З рик ув Я ЗМ х ! ; Кеава М н, Вне ои. ШЕ М і ї їжа Кв ей ж Же | Е 1 Е щи З ж т, ПОН | 1 Ї вини ши ши ПОН полной й сце КЕ. Е З В: ших РОК и ВН, 2 с хх денні о Со я ще ке Ж-х ре 2 - кві ГЕ ЯКА ої Кк Є сх Ж Я ну їв ха т. го к но 5 х2 5 хан ем гу же рожа хи Кан роя роя лк. НУ ВЗ М ж п вес ж ее іх де її їла ЕЗЕН КЗ їі їх3 їх БЕК ЕН ЕВ Фіг 33

В Ї і. Ї ї І ! Б і | і й т | : і "ши шш ЇЇ т й щи г т , | и у її. и ш ніше ; . ш ї. ї р що не Є. ни ! р 0 11 щі ІІ | щ соте Бета- Бета-слюку» де ЕПОС ех В Еш ЕДТА ЕДТАЛІМВН У ББіат Ева о не д д глюкуронідаза ронідазаЛІВМИА й ПпМВвН ПМ З вени а НВ В В ВН В ОО и Фіг А й в кн а ол Ло о п п пп нн і : Ф Е і є муж : Ї ї оо т ! ко | ; ; м 385 | роиною ян че ! | . | ! ЕДТА. Бета» ЕКІсо глюкуронідаза ФігЗав

14 оон пе жі ВЕ КУ іету ські ВІ С Є Р ство ето ІННУ за ос рі ую Ж А ТЕТ РЕ ЗЮ т же е НТ Же чі то еР Ре тт жності чені нюх пд тку песен пеуе от калину ат ЕЯ ; й На ЩІ ї Ї кт фоннннтня ни | І! 7 ши ше я щ ще Са ; ; ї З ій ; Е 22 ! . і ! В де 5 005 і ! ! і ! ; ши ще щ «ої ! ; !

г. т Х Е Зелений | но ЕДТА ; де АтТФаза А флуоресцейтний білок Фіг ЗА Фе і пиття тот Тут тт ттік тт» - сонввасвнасн Ї 204

5. ; ! З ; . Як ! З Я і -прозвжанкввйнитв ; ! « : | ! Бе доднкі дик нктаоо св я нов ох ДЯ я ННЯ ЕДТА Зелений МАЮРИ флусресцентний. білак фі дв