UA125398C2 - Композиція та спосіб для боротьби з фузаріозом - Google Patents

Abstract

Винахід стосується виділеного мікробного штаму виду Variovorax, який задепоновано під номером NRRL В-50469, композиції, яка його містить, способу використання цієї композиції для пригнічення фузаріозу.

Description

Вміст доданого Переліку послідовностей включено тут в усій його повноті шляхом посилання. Доданий файл під назвою "50511520-МУО 5Т25.:4х" розміром 55 Кб був створений 24 липня 2012 р. Цей файл відкритий для доступу за допомогою Місгозой Умога на комп'ютері з операційною системою У/іпдом5 О5.

Винахід належить до біологічних методів боротьби з фітопатогенними хворобами. Зокрема, винахід стосується композицій і способів, які можуть використовуватися в боротьбі з фузаріозом злакових рослин, таких, як пшениця та ячмінь.

Фузаріоз, відомий також як "п'яний хліб", цвілеподібна рожева гниль і "снігова пліснява", є хворобою, що спустошує сільськогосподарські угіддя пшениці, ячменю і багатьох інших злакових культур в усьому світі і, особливо, у США, Європі та Китаю. Ця хвороба може досягати епідемічних масштабів і завдавати великі збитки зерновим культурам, особливо пшениці та ячменю, у вологих і напіввологих ареалах вирощування хлібних злаків, включаючи Індію, Росію,

Францію, Німеччину і Великобританію. Зокрема, фузаріоз або фузаріоз пшениці є однією з найбільш збиткових хвороб пшениці у Сполучених Штатах. У загальнонаціональних масштабах ця хвороба, яка розвинулася на Середньому Заході і на Високих Рівнинах, завдала виробництву пшениці втрати, що досягають мільйонів доларів і стала, таким чином, головною перешкодою для успішного функціонування цієї індустрії в останні роки. Фузаріоз, окрім пшениці, вражає також ячмінь, овес, кукурудзу і багато інших зернових культур, та репродукується на них.

Дана хвороба може викликатися різними численними фітопатогенами і в першу чергу кількома видами грибів роду Еизагішт. До імовірних збудників фузаріозу пшениці входять численні види роду Ризагішт, наприклад, Е. ситогит, Р. дгатіпеагит (телеоморф, сіррегеїїа 7ває), Е. ахепасеут (телеоморф, Са. амепасеа), Е. роає, а також патогени, які не належать до роду Ризагійт, такі, як Містодоспішт пімаіє (телеоморф, МоподгарпегїІа пімайї5) і Місгодоспійт та|и5. У Сполучених Штатах, Європі та інших найважливіших агрономічних ареалах світу домінуючим збудником фузаріозу виступає Ризапут агатіпеагпит (телеоморф, Ссіррегеїа 7єає у буквальному сенсі).

Ці патогени, як правило, виживають на рослинних рештках. На колоски злаків вони потрапляють і вражають їх під час цвітіння, зупиняючи або частково затримуючи розвиток зерна в колосі злаку. В результаті цього патоген, що потрапив на рослину, може вбити частину колосу

Зо або весь колос. Деякі інфіковані насінини мають настільки низьку енергію проростання, що нерідко втрачають здатність прорости. Інфіковані насінини, які проросли, часто гинуть у фазі проростання внаслідок пелікуляріозу або кореневої гнилі, що викликають поганий хлібостій вирослого злаку. Здорові сіянці можуть інфікуватися також у фазі появи сходів. Окрім поганого, неекономічного хлібостою, втрати врожаю внаслідок ураження патогеном можуть бути доволі високими, якщо умови сприяють розвитку хвороби.

Грибні патогени роду Еивзагйшт розповсюджуються по ареалах культивування злаків в усьому світі і завдають особливо великий збиток у місцях випадання великих осадів в період між цвітінням і наливом зерна. Якщо збудником захворювання є Ризагішт дгатіпеагит, то дана хвороба потребує першочергового втручання не тільки тому, що вона знижує комерційні показники ураженого зерна, крім прямих втрат врожаю, а й також тому, що зараження грибом

Еизатпцт може призводити до накопичення трихотеценових мікотоксинів у зернах, створюючи таким чином загрозу здоров'ю людей і худоби. Трихотецени являють собою головне мікотоксинове забруднення зернових культур в усьому світі, здатне у нежуйних тварин викликати відмову від їжі, блювоту, діарею і втрату ваги та створювати загрозу здоров'ю для інших тварин і людей у випадках високих рівнів впливу цих токсинів. У Сполучених Штатах ця загроза зросла ще більше внаслідок нещодавнього зсуву в штамах РЕ. дгатіпеапит у бік підвищення продукування і сили токсинів. Мікотоксинами, що виявляються найчастіше, є дезоксиніваленол (СОМ, відомий також як вомітоксин) і зеараленон (7ЕА). Дезоксиніваленол є особливо небезпечним токсином, який викликає шлунково-кишкові розлади, що супроводжуються кровотечами та іншими важкими станами у людей і тварин, які спожили інфіковані зерна, а в деяких випадках можуть призвести до смерті. Оскільки дезоксиніваленол у загальному випадку є стійким до змін рН і до високих температур, дезінтоксикація може проходити дуже важко. Таким чином, зерна, забруднені вище певного рівня, не можуть використовуватися у пивоварінні, переробці, кормі для худоби і, отже, повинні видалятися у відходи.

Сьогодні розроблено чимало різноманітних стратегій боротьби з фузаріозом у сільськогосподарських культур. Найбільш перспективними серед них є хімічні методи, розробка стійких сортів культур, а також традиційні методи сівозміни та обробки полів. Серед цих напрямків певну ефективність у зниженні зараження фузаріозом можна отримати від бо застосування хімічних пестицидів, проте залишки фунгіцидів, використаних на пізніх стадіях росту культур, як правило, в періоди цвітіння, лише за декілька тижнів до збору врожаю, зменшують привабливість цих методів. З іншого боку альтернативним підходом у боротьбі з цією хворобою є методи традиційної селекції та генної інженерії, завдяки яким відбувається помітний прогрес в розробках стійких сортів агрокультур. Генна інженерія дозволяє змінювати продукування фітогормону і здійснювати маніпуляції в його сигнальному шляху. Досягнутий останніми роками прогрес в галузі традиційної селекції дозволив значно просунутися в розумінні генетичних основ стійкості до фузаріозу й отримати відомості про численні гени і локуси кількісних ознак (ОТ: диапійаіме гай осі), які надають цієї стійкості. Але прогрес у підвищенні стійкості агрокультур до фузаріозу був повільним, що пояснюється, в першу чергу, труднощами, пов'язаними з вивченням даної хвороби. Фактично про механізми, які визначають стійкість або сприйманість рослин до фузаріозу, в даний час відомо порівняно мало. Крім того, генетичне різноманіття грибів виду Ризагпцт, які є переважними збудниками хвороби, часто створює проблеми у визначенні того, наскільки тривалою повинна бути ефективність хімічних фунгіцидів і наскільки стійкими повинні бути агрокультури, які потрібно захистити. Внаслідок цього в даний час практично всі сорти пшениці в агропромисловому виробництві залишаються уразливими до інфікування.

Крім того, незважаючи на певний успіх у боротьбі з фузаріозом, який можуть давати традиційні методи орної обробки з закопуванням пожнивних залишків, інфікованих збудником, наприклад, РЕ. дгатіпеагит, звичайне орання грунту після жнив є несумісним з усталеною практикою охорони грунтів, тобто за умови мінімальної орної обробки. Беручи до уваги ймовірність розкидання інокуляту на великі відстані і те, що різні культури можуть ставати альтернативними хазяїнами патогенів, метод сівозміни нерідко виявляється неприйнятним.

Окрім забруднення навколишнього середовища пестицидами, їх використання може породжувати проблеми, пов'язані з пестицидостійкістю. Крім того, з їх використанням можуть бути зв'язані також зареєстровані випадки росту вмісту СОМ в зернах. Крім цього, витрати і зрослі проблеми як в державному, так і в приватному секторі, пов'язані з забрудненням пестицидами навколишнього середовища і вимогами щодо безпеки харчових продуктів, знижують привабливість даного способу боротьби з такими хворобами і примушують у культивації агрокультур застосовувати пестициди якомога менше.

Підсумовуючи вищевикладене, можна сказати, що, незважаючи на суттєве просування в галузі розробок способів боротьби з фузаріозом, зменшення впливу цієї згубної хвороби на виробництво і якість зерна поки що залишається невирішеною проблемою. Отже, для підвищення продуктивності виробництва і якості багатьох зернових культур важливо вести пошук ї розробку нових способів боротьби з фузаріозом. Ці проблеми потребують термінового вирішення не тільки у Сполучених Штатах, а й на всій земній кулі, включаючи Азію і Європу.

Боротьба з фузаріозом за допомогою біологічних агентів стала привертати до себе увагу, починаючи з середини 1990-х років. Біологічні агенти для такої боротьби (ВСА: Віоіодісаї! сопіго! адепіб), незважаючи на те, що кількість їх в даний час доволі обмежена, можуть, за своєї сумісності з навколишнім середовищем, бути дуже ефективними в зниженні рівня захворюваності, зумовленої патогенами роду Ризагішт. Суспільне визнання, сумісність з іншими засобами боротьби з хворобами агрокультур, довговічність і стійкість - все це поряд з іншими позитивними факторами свідчить про необхідність розробок стратегій біологічної боротьби з фузаріозом. Засоби такої біологічної боротьби можуть відігравати важливу роль в органічній зерновій індустрії. У звичайному виробництві зерна такі засоби можуть продовжити захист колосків на час після фази цвітіння, коли хімічні фунгіциди застосовуватися більше не можуть.

Сьогодні в галузі біологічної боротьби вже досягнутий значний прогрес. Так, наприклад, деякі штами бактерій, які продукують спори (наприклад, видів Васіїйй5 і Рхоеинидотопав), і дріжджів (наприклад, виду Стуріососсив) демонструють якості, потрібні для боротьби з фузаріозом і для зниження мікотоксинового забруднення. Але, незважаючи на цей прогрес, залишається незадоволеною потреба у поліпшених мікроорганізмах для їх використання у боротьбі з фузаріозом. Хоча самі по собі ВСА-засоби вже є визнаними більш придатним інструментом для боротьби з фітопатогенами, а ВСА-продукти знаходять на ринку значно більш широкий попит, ніж коли-небудь раніше, все ж сьогодні було зроблено зовсім мало спроб розробити стратегії й антагоністичний мікроорганізм для біологічної боротьби з фузаріозом. Крім того, життєвий цикл роду Ризагішт та інших збудників фузаріозу вказує на те, що ці патогени потенційно можуть бути придатними для використання їх в методах біоборотьби за допомогою антагоністичних мікроорганізмів на різноманітних фазах росту і розвитку. Таким чином існує потреба в пошуку нових засобів біологічної боротьби, бажано з різноманітними видами активності, а також способів біоборотьби, які б дозволяли ефективно запобігати або пригнічувати розвиток бо фузаріозу.

Даним винаходом пропонуються композиції, які містять мікробіологічні штами і культури.

Деякі штами, культури та їх композиції можуть використовуватися для боротьби з фузаріозом, наприклад, різноманітних сільськогосподарських культур, включаючи пшеницю та інші зернові.

Винахід також відноситься до композицій для біологічної боротьби і способів використання даних композицій для запобігання виникненню, пригнічення розвитку або лікування викликаної патогенами хвороби і для збереження врожаю. Винахід також відноситься до способів використання таких композицій як засобів біологічної боротьби в комбінації з іншими ефективними в сільському господарстві сполуками або композиціями для боротьби зі шкідливими фітопатогенами.

В одному з аспектів даний винахід відноситься до виділених мікробних штамів, які мають супресорну активність відносно до фузаріозу. Мікробні штами відповідно до цього аспекту вибираються із групи, яка складається із видів Місгобрасіегішт, Васіи5, Мусозрпаєгеїа і

Магіомогах. В деяких переважних варіантах здійснення винаходу мікробні штами вибираються із групи, яка складається зі виду Мусозрпаєгейа штам 5501-010-НІ1 (депозит МКК. 50471), виду

Місторасієтійт штам 501-014-С06 (депозит МАВ В-50470), виду Магіомогах штам 501-014-501 (депозит МЕКІ. В-50469), виду Васійн5 штам 501І-015-603 (депозит МЕКІ. В-50760), виду Васі штам 501-015-НОб (депозит МКК. В-50761) та їх варіантів, які мають пестицидну активність.

Мікробний штам відповідно до інших переважних варіантів здійснення винаходу може містити послідовність ДНК, що демонструє щонайменше 85 95 ідентичність будь-якій із нуклеотидних послідовностей, наведених в доданому Переліку послідовностей. Винаходом пропонуються також біологічно чисті культури і збагачені культури описаних тут мікробних штамів.

Відповідно до інших аспектів даного винаходу пропонуються композиції, які містять мікробний штам згідно з винаходом або його культуру та ефективну для сільськогосподарського виробництва кількість сполуки або композиції, вибраних із групи, яка складається із акарициду, бактерициду, фунгіциду, інсектициду, мікробіциду, нематоциду, пестициду і добрива. Зазначені композиції в деяких варіантах здійснення даного аспекту можуть бути приготовані у формі препарату, вибраного із групи, яка складається із емульсії, колоїду, пилоподібного препарату, частки, гранули, порошку, спрею і розчину; в деяких інших варіантах здійснення винаходу зазначені композиції можуть містити носій. В одному із переважних варіантів носій є прийнятним

Зо для сільськогосподарського виробництва. В одному з особливо переважних варіантів здійснення винаходу носієм є насінина рослини. В інших переважних варіантах композицією є препарат покриття насіння. Крім того, винаходом передбачене насіння, вкрите композицією відповідно до даного винаходу.

В іншому аспекті даного винаходу пропонуються способи запобігання, інгібування або обробки проти розвитку фітопатогену. Дані способи включають вирощування мікробного штаму згідно з винаходом або його культури в поживному середовищі або грунті рослини-хазяїна перед або водночас із вирощуванням рослини-хазяїна в живильному середовищі або грунті, де в дещо переважних варіантах здійснення даного аспекту фітопатоген викликає фузаріоз. В одному з особливо переважних варіантів здійснення винаходу фітопатогеном є Ризапйт дгатіпеагит.

В іншому аспекті даного винаходу пропонуються способи запобігання, інгібування або обробки проти розвитку фузаріозу рослини. Дані способи включають постачання до рослини або до середовища навколо рослини ефективної кількості мікробного штаму згідно з винаходом або його культури. В одному із варіантів здійснення винаходу такий фузаріоз викликається грибом ЕРизагішт агатіпеагит. В деяких варіантах здійснення даного аспекту мікробний штам або його культуру постачають до грунту, насінини, коренів, квітки, листка, частини рослини або всієї рослини, де в переважному варіанті рослина є сприйнятливою до ЕРизагішт дгатіпеагит. В деяких інших переважних варіантах здійснення винаходу рослиною є пшениця, кукурудза, ячмінь або овес, в іншому переважному варіанті здійснення мікробний штам згідно з винаходом або його культуру вводять у рослину як ендофіт.

В подальшому аспекті даного винаходу пропонуються рослини неприродного походження.

Рослини неприродного походження штучно інфікуються мікробним штамом згідно з винаходом або його культурою. Крім того, в деяких переважних варіантах здійснення даного аспекту винаходу пропонуються насінина, репродукційна тканина, вегетативна тканина, частини рослини і потомство рослини неприродного походження.

В іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб приготування сільськогосподарської композиції. Даний спосіб включає інокуляцію мікробного штаму відповідно до даного винаходу або його культури в субстрат або на субстрат і вирощування його при температурі 1-37 "С до отримання клітин або спор в кількості щонайменше 102-103 на мілілітр або на грам. бо Цим та іншим цілям й ознакам даного винаходу дано більш повне роз'яснення нижче, у детальному описі і формулі винаходу.

Визначення

Якщо не вказано іншого, то всі використовувані в даному описі терміни, які стосуються даної галузі техніки, умовні позначки та інші наукові терміни мають загальноприйняті значення, відомі фахівцям у галузі техніки, до якої належить даний винахід. Деяким термінам із загальновідомими значеннями тут дані визначення з метою уникнення різночитання і/або для полегшення посилань, і включення тут таких визначень не повинно розглядатися як таке, що представляє суттєву відмінність від значень, загальноприйнятих серед фахівців. Багато способів і процедур, які тут описані або на які зроблені посилання, повинні бути фахівцям добре відомими і широко використовуються ними відповідно до звичайних методологій.

Якщо із контексту зрозуміло не випливає іншого, то однина може мати значення множини.

Наприклад, термін "клітина" може мати значення як однієї клітини, так і множини клітин, включаючи їхні суміші.

Вирази "антагоністичний мікроорганізм" і "мікробний антагоніст" - обидва означають мікроорганізм, штам якого демонструє ступінь інгібування фузаріозу, який на статистично значущому рівні перевищує ступінь інгібування від необробленого контролю.

Антибіотик: термін "антибіотик" в даному описі означає субстанцію, здатну вбити або інгібувати ріст мікроорганізму. Антибіотики можуть продукуватися щонайменше одним із таких джерел: 1) мікроорганізмом, 2) процесом синтезу, 3) процесом напівсинтезу. Антибіотиком може бути мікроорганізм, який виділяє летку органічну сполуку. Крім того, антибіотиком може бути летка органічна сполука, яка виділяється мікроорганізмом.

Бактерицидний: термін "бсактерицидний" у даному описі означає здатність композиції або субстанції збільшити смертність бактерій або інгібувати швидкість їх росту. Інгібування швидкості росту бактерій у більшості випадків може оцінюватися за зменшенням кількості життєздатних бактеріальних клітин у плині часу.

Біологічна боротьба: термін "біологічна боротьба" і його скорочена форма "біоборотьба" в даному описі означають боротьбу з патогеном або з комахою або з будь-яким іншим небажаним організмом за допомогою щонайменше одного іншого організму, який не є людиною. Як приклад відомого механізму біологічної боротьби можна навести використання мікроорганізмів, які

Зо борються з кореневою гниллю шляхом витіснення грибів із конкуренції за простір на поверхні кореня, або мікроорганізмів, які або інгібують ріст патогенна, або вбивають його. "Рослиною- хазяїном" у контексті біологічної боротьби є рослина, сприйнятлива до хвороби, яка викликається даним патогеном. "Рослиною-хазяїном" у контексті виділення організму, що належить до виду грибів, від його природного середовища є така рослина, яка підтримує ріст гриба, тобто, наприклад, рослина виду, для якого гриб є ендофітом.

Термін "зерновий" в даному описі означає будь-який зерновий вид, який може бути сприйнятливим до фузаріозу. До таких сприйнятливих зернових культур належать пшениця, ячмінь, овес і тритикале; при цьому пшениця та ячмінь є двома культурами, для яких дана хвороба є особливо значною економічною проблемою.

Термін "ефективна кількість" означає кількість, достатню для отримання корисних або цільових результатів. У тому, що стосується боротьби з хворобою, лікувальної обробки, інгібування хвороби або захисту від неї, ефективною є кількість, достатня для пригнічення, стабілізації, повернення ходу хвороби назад, уповільнення або затримання розвитку інфекції - мішені чи хворого стану. Таким чином вираз "ефективна кількість" в даному описі означає таку кількість антагоністичної обробки, яка є необхідною для зниження рівня розвитку патогену і/або рівня викликаної патогеном хвороби порівняно з рівнем, який спостерігається у необробленого контролю. Як правило, ефективна кількість даної антагоністичної обробки дає зниження щонайменше на: 20 95; як правило, від 30 до 40 95 і більше; як правило, від 50 до 60 95 і більше; як правило, від 70 до 80 95 і більше; або, як правило, від 90 до 95 95 порівняно з рівнем хвороби іабо рівнем розвитку патогену, що спостерігається у необробленого контролю у відповідних умовах лікувальної обробки. Ефективна кількість може постачатися за один або більше прийомів. Фактична швидкість постачання рідкого препарату зазвичай знаходиться у межах приблизно від мінімум 1 х 103 до 1 х 1079 життєздатних клітин/мл і переважно - приблизно від 1 х 106 до 5 х 1097 життєздатних клітин/мл. У більшості станів антагоністичні мікробні штами згідно з винаходом, описані у Прикладах нижче, будуть оптимально ефективними при швидкості постачання в інтервалі приблизно від 1 х 106 до 1 х 109 життєздатних клітин/мл, якщо при постачанні забезпечується практично однорідний контакт щонайменше приблизно 50 95 тканин рослини. Якщо антагоністи постачаються у формі твердого препарату, то швидкість постачання повинна регулюватися так, щоб забезпечувати кількість життєздатних клітин на одиницю площі 60 поверхні тканини рослини, порівняну з отримуваним при вищезгаданих величинах швидкості обробки рідиною. Як правило, засоби біологічної боротьби згідно з винаходом є біологічно ефективними, якщо вони постачаються в концентрації вище 105 КУО/г (колонієутворювальних одиниць на грам), переважно, якщо вище 107 КУО/г, ще переважніше, якщо вище 109 КУО/Г, і найпереважніше, якщо в концентрації 109 КУО/г.

Вираз "ефективний мікробний антагоніст", який використовується відносно мікроорганізму, означає, що даний мікробний штам демонструє ступінь інгібування фузаріозу, який на статистично значущому рівні перевищує ступінь інгібування, що спостерігається у необробленого контролю. Як правило, ефективний мікробний антагоніст має здатність давати зниження щонайменше на: 20 95 і більше; як правило, від 30 до 40 95 і більше; як правило, від 50 до 60 95 і більше; як правило, від 70 до 80 95 і більше; як правило, від 90 до 95 95 відносно рівня хвороби і/або рівня розвитку патогену, що відбувається в необробленому контролі за відповідних умов лікувальної обробки.

Композиція А термін "композиція" означає комбінацію активного агента щонайменше з іншою сполукою, носієм або композицією, інертною(им) (наприклад, детекційним агентом або міткою, рідким носієм і т. п.), або активним агентом, наприклад, пестицидом.

Виділений мікробний штам, виділена культура, біологічно чиста культура і збагачена культура: використовуваний в даному описі термін "виділений" стосовно мікроорганізму (наприклад, бактерії або мікрогриба) означає мікроорганізм, який був виділений і/або очищений від середовища, де він природно виникає. Аналогічно до цього, термін "виділений штам" мікроба означає штам, який був виділений і/або очищений від свого природного середовища.

Таким чином термін "виділений мікроорганізм" не включає в своє значення мікроорганізм, що перебуває в середовищі, в якому він природним чином виникає. Крім того, термін "виділений" не обов'язково відображає ступінь, до якого даний мікроб був очищений. Термін "по суті чиста культура" мікробного штаму означає культуру, яка по суті не містить інших мікробів, окрім цільового мікробного штаму або штамів. Інакше кажучи, "по суті чиста культура" мікробного штаму по суті не містить забруднень, які можуть включати мікробні забруднення, а також небажані хімічні забруднення. Крім того, використовуваний тут термін "біологічно чистий" штам означає штам, виділений з матеріалів, з якими він асоціюється в природних умовах. Варто зауважити, що штам, асоційований з іншими штамами або сполуками, або матеріалами, які в

Зо природних умовах, зазвичай, не зустрічаються, також визначається як "біологічно чистий".

Цілком зрозуміло, що монокультура того чи іншого штаму є "біологічно чистою".

Використовуваний тут термін "збагачена культура" виділеного мікробного штаму означає мікробну культуру, яка містить більше 50, 60, 70, 80, 90 або 95 95 виділеного штаму.

Використовуваний тут термін "ендофіт" означає ендосимбіонт, який живе в рослині впродовж щонайменше частини свого життя, не викликаючи очевидної хвороби. Трансмісія ендофітів може відбуватися або по вертикалі (безпосередньо від батьків до потомків) або по горизонталі (від індивіда до неспорідненого індивіда). Передані по вертикалі грибні ендофіти є, як правило, безстатевими і переносяться від материнської рослини до потомства шляхом проникнення в насінини хазяїна через грибні гіфи. Бактеріальні ендофіти можуть переноситися по вертикалі також від насінин до саджанців (|Ре!теїга єї аї., 2008). На противагу цьому, ендофіти, які передаються по горизонталі, як правило, мають стать і переносяться спорами вітром і/або комахами-переносниками. Ендофіти зернових культур привернули до себе велику увагу у зв'язку з їхньою здатністю боротися як з хворобою, так і з зараженням комахою, а також активувати ріст рослин.

Функціонально порівнянний протеїн: використовуваний тут термін "функціонально порівнянний протеїн" стосується протеїнів, які мають щонайменше одну спільну характеристику.

Такими характеристиками можуть бути подібність одна одній послідовностей, біохімічна активність, подібність одна одній схем транскрипції і фенотипова активність. Як правило, функціонально порівнянні протеїни мають деяку подібність між собою послідовностей або є подібними щонайменше за однією біохімічною ознакою. У межах цього визначення функціонально порівнянними вважаються гомологи, ортологи, паралоги та аналоги. Крім того, функціонально порівнянні протеїни у загальному випадку мають схожу щонайменше одну біохімічну і/або фенотипову активність. Функціонально порівнянні протеїни надають одній і тій самій характеристиці подібність, але не обов'язково в однаковому ступені. Як правило, у функціонально порівнянних протеїнів одні і ті ж характеристики в кількісному вимірі у одного із порівнюваних протеїнів складають щонайменше 20 95 від таких у іншого, частіше від ЗО до 40 95, ще частіше від 50 до 60 95, ще частіше від 70 до 80 95, ще частіше від 90 до 95 95 і, як правило, від 98 до 100 95 від таких у іншого.

Фунгіцидний: використовуваний тут термін "фунгіцидний" означає здатність композиції або 60 субстанції знижувати швидкість росту грибів або збільшувати смертність грибів.

Гриб ЕРивзагішт: у контексті даного винаходу термін "гриб Ризапцт" включає у себе як статеву (телеоморфну) фазу цього організму, так і безстатеву (анаморфну) його фазу, які називаються також фазами, відповідно, досконалих і недосконалих грибів. Наприклад, анаморфною фазою гриба Ризагійт дгатіпеагит є СібрегеїІа 7єає, тобто збудник фузаріозу. Ця хвороба, як правило, виникає, коли квітка або сім'яна шапка інокулюється конідіями, які випускаються недосконалою формою, або аскоспорами, що випускаються досконалою формою цього гриба.

Мутант: використовуваний тут термін "мутант" або "варіант" стосовно мікроорганізму означає модифікацію батьківського штаму, в якому цільова біологічна активність є подібною до активності, що демонструється батьківським штамом. Наприклад, у випадку Місгобасіегт "батьківським штамом" зветься оригінальний штам Місгобасіейцт до мутагенезу. Мутанти або варіанти можуть виникати в природі без втручання людини. Вони можуть отримуватися також шляхом обробки одним способом або багатьма способами і складами, відомими фахівцям в даній галузі. Наприклад, батьківський штам може бути оброблений хімікатом, таким, як М- метил-М'-нітро-М-нітрозогуанід, етилметансульфон, або ж гамма-, рентгенівським або ультрафіолетовим випромінюванням, або будь-якими іншими засобами, добре відомими фахівцям у даній галузі.

Нематоцидний: термін "нематоцидний" в даному описі означає здатність субстанції або композиції збільшити смертність або інгібувати швидкість росту нематодів.

Патоген: термін "патоген' в даному описі означає організм, такий, як водорість, павукоподібне, бактерія, гриб, комаха, нематода, рослина-паразит, дріжджі, найпростіша тварина або вірус, здатний продукувати хворобу у рослини або тварини. Термін "фітопатоген" в даному описі означає патогенний організм, який інфікує рослину.

Відсоток ідентичності: "відсоток ідентичності послідовності" відповідно до даного опису визначають шляхом локального зіставляння двох оптимально вирівняних послідовностей на ділянці вирівнювання, який визначається довжиною локального вирівнювання двох послідовностей. При оптимальному вирівнюванні двох послідовностей дана амінокислотна послідовність на ділянці вирівнювання може містити добавки або делеції (наприклад, пробіли або оверхенги) порівняно з еталонною послідовністю (яка не містить добавок або делецій).

Локальне вирівнювання двох послідовностей може проводитися тільки за тими сегментами кожної послідовності, які за припущенням є достатньо подібними за певним критерієм, що вибирається відповідно до алгоритму, використовуваному для вирівнювання (наприклад, програми ВІА5Т). Відсоток ідентичності обчислюють шляхом визначення кількості збігів позицій, в яких в обох послідовностях розміщуються ідентичні основи нуклеїнових кислот або залишки амінокислот, ділення отриманої кількості збігів на загальну кількість позицій на даній ділянці вирівнювання і множення одержаного результату на 100. Оптимальне вирівнювання послідовностей може здійснюватися за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта-

Ватермана (Зтйй апа Умаїептап, Аа. АРІ. Маїй. 2:482, 1981| або алгоритму глобальної гомології Нідлмана-Вунша ІМеедієтап апа МУипеси, . Мої. Віої. 48:443, 1970), методом дослідження подібності Пірсона-Ліпмана (Реагзоп апа Гіртап, Ргос. Майї! Асад. Осі. ОБА 85: 2444, 1988), евристичної імплементації цих алгоритмів (МСВІ ВІГАБТ, УМО-ВІ АТ, ВІ АТ, 5ІМ,

ВГА5ЗТ/Л) або шляхом візуальних досліджень. Якщо дві послідовності були вибрані для вирівнювання, то для проведення їх оптимального вирівнювання бажано використовувати алгоритми САР і ВЕЗТРЇТ. Як правило, за умовчанням задають величини 5.00 для ваги пробілів і 0.30 для довжини ваги пробілів. Термін "суттєва ідентичність послідовностей" між полінуклеотидними або поліпептидними послідовностями стосується полінуклеотиду або поліпептиду, який містить послідовність, що має щонайменше 50 95 ідентичність, переважно щонайменше 70 95, переважно щонайменше 80 95, ще переважніше щонайменше 85 95, більш переважно щонайменше 9095, ще більш переважно щонайменше 95 95, і найпереважніше щонайменше 96, 97, 98 або 99 95 ідентичність порівняно з еталонною ідентичністю, визначену за допомогою комп'ютерної програми.

Аналіз нуклеїнокислотних і амінокислотних послідовностей може проводитися шляхом зіставляння їх з відповідними нуклеїнокислотними або амінокислотними послідовностями, що зберігаються в публічних або приватних базах даних. Такі дослідження можуть проводитися за допомогою програми (МСВІ ВІ АЗТ м 2.18) Національного центру інформації з біотехнології (Майопаї! Сепіег ог ВіотесппоЇоду Іптогтацйоп Вавіс І оса! Аідптепі Зеагсп Тоої). Програма МОВІ

ВІГАБТ є доступною в мережі Інтернет за адресою (бБріаві.пеобі.піт.пій.дом/Віаві.соді| (Маїіопа!

Сепіег тог Віоїесппоіоду Іптогтайоп). У програмі МСВІ ВГА5Т можуть використовуватися, як правило, такі параметри: Опції фільтрів встановлюють на "За умовчанням" (детац), Матрицю бо вирівнювання (Соптрагізоп Маїгіх) встановлюють на "В О5ИМб62", Витрати на пробіли (Сар

Со5і5) встановлюють на "Ехізіепсе: 11, Ехіепвіоп: 1", Розмір слова (Умога 5і7е) встановлюють на

З, Поріг очікування Ехресі (Е Ійгезпоїа) встановлюють на Іе-3, а мінімальну довжину локального вирівнювання встановлюють на 50 956 довжини послідовності, що аналізується. Ідентичність і подібність послідовності можуть визначатися також за допомогою програми СепотеОицеві тм (Сепе-ІТ, Могсевієї Мавв. ОА).

Термін "пестицидний" в даному описі означає здатність даної субстанції або композиції знижувати швидкість росту організму-шкідника, тобто небажаного організму, або збільшувати смертність організму-шкідника.

Під виразом "супресорна активність" агента біологічної боротьби з даним фітопатогеном розуміють здатність даного агента пригнічувати, інгібувати, стабілізувати, повертати хід хвороби назад, уповільнювати або затримувати розвиток самого патогену або прогресування інфекції або хворого стану, викликаного даним патогеном.

Варіант: термін "варіант", використовуваний в даному описі стосовно мікроорганізму, означає штам, який має ідентифікаційні ознаки біологічного виду, до якого він належить, і при цьому щонайменше одну варіацію нуклеотидної послідовності або розпізнавальну особливість, що ідентифікується та належить до батьківського штаму і є такою, що генетично успадковується. Наприклад, штам 501-5.(11-014-С06 виду Місгорасієгішт, який має фунгіцидну активність і має такі особливості, що ідентифікуються: 1) здатність пригнічувати ріст гриба

Еизагішт дгатіпеагит і його телеоморфу Сірбегеїїа 7єає, 2) здатність пригнічувати розвиток фузаріозу, 3) наявність обов'язкових генів з ідентичністю більше 95 95, більше 96 95, більше 97 95, більше 98 95 або більше 99 95 до обов'язкових генів 5051-014-С06 виду Місгобасієгічт, може використовуватися для підтвердження того, що варіантом, який аналізується, є 501-014-

СО6 виду Містобасієтит.

У застосуванні до нуклеїнових кислот і поліпептидів термін "варіант" має значення поліпептидної, протеїнової або полінуклеотидної молекули з деякими відмінностями, створеними штучно або природним шляхом в їх амінокислотних або нуклеїнокислотних послідовностях, від еталонних поліпептидів або полінуклеотидів, відповідно. Цими відмінностями можуть бути, наприклад, заміни, інсерції, делеції або будь-які цільові комбінації таких змін в еталонному поліпептиді або полінуклеотиді. Поліпептидні і протеїнові варіанти

Зо можуть, крім того, складатися зі змін в заряді і/або посттрансляційних модифікацій (наприклад, глікозилювання, метилювання, фосфорилювання та ін.)

Всі публікації і патентні заявки, згадані в даному описі, включені тут шляхом посилання так, ніби кожна із публікацій або патентних заявок була індивідуально включена шляхом посилання.

Посилання не означають визнання їх відомим рівнем техніки або прототипом. Обговоренням посилань констатується, що їхні автори декларують, а заявники мають право заперечувати точність і релевантність цитованих документів. Абсолютно зрозуміло, що, хоча тут зроблені посилання на численні публікації відомого рівня техніки, ці посилання не означають визнання того, що будь-який із цих документів створює собою частину загальновідомих знань у даній галузі.

Методи таксономічної ідентифікації

Мікроорганізми часто можна розрізняти шляхом прямих мікроскопічних досліджень (адже всі клітини у зразку під мікроскопом мають різний вигляд), за характеристиками забарвлення, шляхом простого молекулярного аналізу (наприклад, просто шляхом визначення поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ)) і т. д. В додаток до ілюстративних прикладів таких методів таксономічного аналізу, описаних нижче, в Прикладах 2-3, у таксономічній ідентифікації того чи іншого мікроорганізму може використовуватися до кількох різноманітних рівнів аналізу і кожний аналіз може грунтуватися на відмінних від інших характеристиках даного організму. До таких різновидів таксономічного аналізу можуть входити аналіз на основі нуклеїнових кислот (наприклад, аналіз індивідуальних специфічних генів за рівнем їх наявності або за їхньою точною послідовністю, або за експресією конкретного гена чи родини генів), протеїновий аналіз (наприклад, на функціональному рівні за допомогою прямого або непрямого ферментного аналізу, або на структурному рівні за допомогою методів імунодетектування) і т. д. а. Аналіз за посередництвом нуклеїнових кислот. Фахівцям в даній галузі добре відомо, що в таксономічній ідентифікації того чи іншого мікроорганізму можуть використовуватися найрізноманітніші методи нуклеїнокислотного аналізу. Ці методи можуть використовуватися для ідентифікації клітин за нуклеотидною послідовністю гена, або для ідентифікації клітини, яка має конкретні гени або родини генів. Придатними для таксономічних досліджень загальними родинами генів можуть бути родина генів 165, родина актинових генів і родина генів рекомбінази А (гесА). До цих методів, як правило, входять амплифікація і секвенування генів із 60 дуже малих кількостей клітин, що часто дозволяє подолати проблеми, пов'язані з концентруванням клітин та їхніх ДНК із розбавлених суспензій. Термін "ампліфікація нуклеїнових кислот", у загальному випадку, стосується методів збільшення кількості копій нуклеїнокислотної молекули у зразку або препараті. Техніка ампліфікації нуклеїнових кислот є добре відомою. Ампліфікацію нуклеїнових кислот можна здійснювати, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), у якій взятий у суб'єкта біологічний зразок приводять у контакт з парою оолігонуклеотидних праймерів в умовах, які дозволяють здійснювати гібридизацію праймерів з нуклеїнокислотною матрицею в даному зразку. Праймери в придатних умовах подовжуються, відокремлюються від матриці, а потім відпалюються, подовжуються і відокремлюються, збільшуючи кількість копій нуклеїнових кислот. Ампліфікація іп мйго може проводитися також методом зсуву ниток, ізотермічним методом без транскрипції, методом ампліфікації з реакцією репарації ланцюгів, методом лігазної ланцюгової реакції, методом лігазної ланцюгової реакції із заповненням розривів, спареним методом лігазної детекції і ПЛР, і методом ампліфікації без транскрипції РНК.

Окрім праймерів, наведених в ілюстративних Прикладах 2-3 і доданому Переліку послідовностей, авторами під час лабораторних експериментів були сконструйовані також інші праймери і, крім того, проводиться подальше конструювання нових праймерів для індивідуальних біологічних видів і філогенетичних груп мікроорганізмів. Такі вузькоспрямовані праймери можуть знаходити застосування в описаних тут способах для відбору і/або специфічної ідентифікації конкретних, цільових мікроорганізмів.

Методи готування і використання нуклеїнокислотних праймерів описані, наприклад, у

ЇЗатюогоок еї аї. (Іп МоІесшаг Сіопіпд: А І абогаюгту Мапиа!, СНІ, Мем Мотк, 19891, Аймзибеї еї аї. (єд.) (п Ситепі РгоїосоЇї5 іп Моїесшаг Віоюду, дойп УМпеу 5 Боп5, Мем/ Могк, 1998). Пари праймерів для ампліфікації можуть бути отримані із відомої послідовності, наприклад, за допомогою спеціальної комп'ютерної програми "Ргітег", розробленої Інститутом фузаріозу, м.

Кембридж, шт. Массачусетс, США (М/пйепеай Іпзійше їог Віотеадіса! Кезеагс!, Сатрьгідде,

Ма55.). Фахівцеві в даній галузі добре відомо, що специфічність зонда або праймера зростає з його довжиною. Так, наприклад, праймер, який містить 30 послідовних нуклеотидів його рРРНК- кодуючої нуклеотидної або фланкувальної ділянки, буде відпалюватися до цільової послідовності з більш високою специфічністю, ніж відповідний праймер, який складається тільки

Зо із 15 нуклеотидів. Таким чином для отримання більшої специфічності можна відбирати зонди і праймери, які містять, щонайменше, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 або більше послідовних нуклеотидів цільової нуклеотидної послідовності, такі, як 165 рРНК.

Нуклеїнові кислоти, придатні для нуклеїнокислотних маніпуляцій (наприклад, ПЛР), можна отримувати за допомогою таких загальновідомих технологій, як екстрагування фенол- хлороформом, або за допомогою одного із численних комерційних комплектів екстрагування

ДНК. Альтернативним шляхом ампліфікації ДНК може бути оприсаджування клітин безпосередньо в реакційну суміш для ампліфікації нуклеїнових кислот і проведення решти маніпуляцій на стадії денатурації з лізисом клітин і відокремленням ДНК.

Одержаний продукт реакцій ампліфікації нуклеїнових кислот аналізують за допомогою стандартних методів, включаючи електрофорез, картини розщеплення рестрикційною ендонуклеазою, гібридизацію або лігування олігонуклеотидів і/або секвенування нуклеїнових кислот. Якщо методи гібридизації використовуються для всіх цілей ідентифікації клітин, то придатними для цього можуть бути найрізноманітніші способи мічення зондів, включаючи флуоресцентне мічення, радіоактивне мічення і нерадіоактивне мічення. У випадку використання методів секвенування нуклеїнових кислот може проводитися дослідження гомології нуклеотидних послідовностей ампліфікованих нуклеїнокислотних молекул за допомогою різноманітних баз даних відомих послідовностей, включаючи, наприклад, бази даних роВуд/СепВапк/ЕМВІ.. р. Протеїнопосередкований аналіз. В додаток до аналізу нуклеїнових кислот, мікроорганізми можуть характеризуватися за допомогою таксономії та ідентифікуватися безпосередньо за наявністю (або відсутністю) специфічних протеїнів. В такому аналізі за основу може братися активність певного протеїну, наприклад, у ферментному аналізі, або відповідь спільно вирощуваних організмів, або ж просто наявність специфікованого протеїну (яка може визначатися, наприклад, за допомогою імунологічних методів, таких, як імунофлуоресцентне забарвлення антитілами іп 5йи).

Ферментні аналізи: для проведення такого аналізу в поживне середовище (наприклад, культури на мікротитрувальному планшеті) включають флуоресцентні або хромогенні аналоги субстрату, а потім проводять інкубацію і скринінг за продуктами реакції, ідентифікуючи таким чином культури за їхньою ферментативною активністю. 60 Відповідь при спільній культивації. В деяких варіантах здійснення даного винаходу активність ферменту, утримуваного мікробним ізолятом, можна визначати за відповіддю (або ступенем відповіді) спільно вирощуваного організму (наприклад, організму-репортера).

Для ідентифікації мікроорганізмів, вибраних і виділених з навколишнього середовища- джерела шляхом зв'язування щонайменше одного антитіла або однієї молекули, отриманої із антитіла, з певною молекулою, а точніше - з епітопом молекули, мікроорганізму, також можуть застосовуватися найрізноманітніші способи.

Антитіла до протеїнів мікроорганізмів можуть бути отримані за допомогою стандартних методик, описаних в багатьох літературних джерелах, наприклад |Нагіоуг апа І апе, Апііродієв5, А

Іарогаїогу Мапиа!, СНІ, Мем МогК, 1988). Визначити те, чи зв'язується даний агент по суті тільки з протеїном цільового мікроорганізму, можна лего за допомогою звичайних або адаптованих методик. Однією з таких методик, придатних для аналізу іп міо, є процедура вестерн-блотінгу, описана в багатьох відомих працях, включаючи |Нагіоу/ апа І апе, Апіїрбодіеєв, А

І абогаїогу Мапиаї, С5НІ., Мем Моїк, 19881.

Більш короткі фрагменти антитіл (молекул, одержаних із антитіл, наприклад, РАБ», Ем5 та одноланцюгові Ем5 (ЗСЕм5)) також можуть слугувати специфічно зв'язувальними агентами.

Способи готування таких фрагментів є широко відомими.

Детекція антитіл, які зв'язуються з клітинами відповідно до даного винаходу, може здійснюватися за допомогою стандартних методів, наприклад, імуно-ферментного аналізу (ІФА), які дозволяють отримувати детекційний, наприклад флуоресцентний або люмінесцентний, сигнал.

Виділені культури згідно з винаходом

Як більш детально описано в розділі ПРИКЛАДИ, авторами було виявлено декілька корисних для сільського господарства нових мікроорганізмів, здатних, наприклад, ефективно пригнічувати фузаріоз. Зазначені нові антагоністичні мікроорганізми, зокрема, є ефективним засобом для зменшення тяжкості захворювання фузаріозом і для інгібування росту гриба

Еизатішт дгатіпеагит, головного збудника фузаріозу у пшениці. Ці мікробні антагоністи були ідентифіковані із пулу, що складав приблизно 5000 мікробних штамів, одержаних зі зразків диких рослин, зібраних у кількох місцях на території Сполучених Штатів. Начальний відбір антагоністичного мікроорганізму проводився за здатністю мікроорганізмів пригнічувати розвиток

Зо патогену Е. дгатіпеагит і його телеоморфу Сібрегейа 76єає у випробуваннях іп міо на антагонізм. Відібрані мікробні антагоністи піддавалися біологічним випробуванням у теплиці на сіянцях пшениці, де проводилася інокуляція сіянців мікробними штамами, а потім - повторні інокуляції спор Р. дгатіпеагит, на здатність цих мікробних штамів зменшувати тяжкість інфікування грибом і на їхню здатність зберігати вихід насіння. Відібрані таким чином антагоністичні мікроорганізми продемонстрували в тепличних випробуваннях / свою ефективність у зменшенні тяжкості фузаріозу.

Крім того, таксономічний аналіз показав, що кожний із описаних тут антагоністичних мікроорганізмів має близьке споріднення або з бактеріальним родом Місгобасівелит, бактеріальним родом Васі, бактеріальним родом Магіомогах, або з родом грибів

Мусозрпаєтгеї а.

Рід Містобасієтійт, типовий рід родини Місторасієласеєає, у загальному випадку належить до здатних пристосовуватися, грампозитивних, неспоротвірних, паличкоподібних бактерій, які первинно, на ранніх стадіях досліджень, були виділені на бактеріях, що продукують молочну кислоту. Члени роду Містгорасієйит спочатку широко характеризувалися своєю помітною теплостійкістю, наявністю в молочних продуктах і продукуванням невеликих кількостей І (ж) молочної кислоти із глюкози. На противагу цим родам родини Місгобасієгіасеає, види якої відрізняються когерентним пептидоглікановим типом, вид Місторасієгішт має орнітин або лізин або у міжпептидному містку, або в позиції З пептидоглікану В-типу. В інших хемотаксономічних властивостях, таких, як ізопреноїдні хінони (МК-11, МК-12, МК-13), полярні ліпіди, жирні кислоти й основний склад ДНК, члени цієї родини демонструють звичайний діапазон різноманітності, що спостерігається в інших родах Місгобрасієгіасеае. За результатами деяких таксономічних досліджень два бактеріальні роди Місгобасіегішт і Аєйгеорасіегійшт можуть бути об'єднані.

Сьогодні рід Місгорасієгішт включає у себе щонайменше 33 види, які були виділені із широкого діапазону місць проживання, включаючи грунт, молочні продукти, рослинні гали, комах, і клінічні зразки. Різноманітні аспекти їхньої екології, філогенії, таксономії, культивування й умов довготривалого зберігання нещодавно були підсумовані Євтушенко і Такеуті (Еми5пепко і

ТаКеисвпі, 2006Ї. Абсолютно зрозуміло, що мікроорганізм роду Місторасієййт може бути повністю надійно ідентифікований будь-якими таксономічними методами, описаними вище, включаючи хемотаксономічний аналіз пептидогліканів клітинної стінки та аналіз послідовностей бо методом вирівнювання з 165 рДНК, як описано в (Емизпепко і ТаКешйспі, 2006) і цитованих ними посиланнях, а також у посиланнях, цитованих в Прикладах 2-3 даного опису. Як більш детально розглянуто нижче, раніше повідомлялося про виявлення антагоністичної активності проти фузаріозу у декількох мікроорганізмів природного походження. Але про те, що таку антагоністичну активність має мікроорганізм роду Мусобрасієйцт, до появи даного винаходу повідомлень не було. Крім того, до того часу авторам винаходу не були відомі способи і процеси використання бактеріального штаму роду Мусобрасіегішт як агента біоборотьби для запобігання, інгібування або обробки проти розвитку патогену, який викликає фузаріоз.

Васійни5 є родом грампозитивних варіабельних, споротвірних паличкоподібних бактерій.

Аналогічно до інших родів, що асоціюються з ранньою історією розвитку мікробіології, таким, як

Рзейдотопавх або Ммівгіо, близько 266 видових членів роду Васійй5 спостерігаються всюди, і він широко визнаний як один із родів з найбільшим різноманіттям 165 і навколишнього середовища. Види Васійн5 можуть бути обов'язковими аеробами або факультативними анаеробами, і давати позитивний тест на каталазу. Убіквіст за своєю природою, рід Васійи5 включає у себе як вільноіснуючі, так і патогенні види. В тяжких навколишніх умовах ці клітини продукують овальні ендоспори, які тривалий час можуть перебувати у стані спокою. Ці характеристики були первинно притаманними даному роду. Але не всі такі види мають близьке споріднення, і багато з них перейшли до інших родів. Фактично було зроблено декілька спроб реконструювати філогенію цього роду. ВасПив-специфічні дослідження з найбільшим різноманіттям були проведені в роботі |(Хи апа Согїе, Іі. 9. ої Бузі. Емої. Містобіо!ї. 53 (3): 695- 704; 2003) з використанням 165 і ділянки ІТ5 (внутрішнього транскрибованого спейсера), де автори поділили рід на 10 груп, які включають гніздові роди Раепірасійи5, ВгемірбасшШив,

Сеобрасійи5, Магіпірасійи5 і Мігдібасійи5. Але згідно з більш пізнім дослідженням рід ВасйШиб містить дуже велику кількість гніздових таксонів і, особливо як в 165, так і в 235, він вважається парафілетичним до І асіорасійаіез (Гасіорасійи5, зігеріососсивз, Зарпуіососсив, І ібїегіа та ін.) завдяки Васіїйй5 соайиціепбві5 та ін., наприклад ІМагаа еї аї, Зуві. Аррі. Містобіої!. 31 (43: 241-250, 2008; Магаа сеї аї, узі. Аррі. Містобріої. 33 (6): 291-299, 2010). Одна із клад, утворена видами В. апіпгасіх, В. сегеи5, В. тусоіїде5, В. рхоепдотусоїіде5, В. (Тигіпдіеп5і5 і В. меїіпепеіерпапепвів відповідно до сучасних стандартів класифікації, повинна бути одиничного виду (з 97 95 165 ідентичністю), але з медичних міркувань їх вважають окремими видами. В додаток до методів

Зо таксономічного аналізу, описаних у Прикладах 2-3, філогенетичний і таксономічний аналізи видів Васійиє можуть проводитися за допомогою низки різноманітних методів, включаючи детально описані в роботі |(Хи апа Соїе, 2003; Магаа єї аї!., 2008; Магаа єї а!., 20101.

Рід Магіомогах первинно був створений рекласифікацією роду АїЇсаїдепев5 рагадохив на

Мапомогахрагадохив (УМіетб5 еї аї., 1991), який вважається типовим видом цього роду. У. рагадохиє був широко досліджений як модель для нових біодеградаційних агентів, а також взаємодій мікроб-мікроб і мікроб-рослина. Іншими видами цього роду є М. докаопепвів, М. 5о0ЇЇ

ЇКіт єї аї., 20061, ї М. рогопіситиіапев (Міма еї а!., 2008). Види Магіомогах дуже різняться з боку катаболізму і вступають у взаємовигідні взаємодії з іншими бактеріальними видами в багатьох процесах біологічного розкладання і, отже, є екологічно значущими і мають високий потенціал практичного застосування. Наприклад, грунтовий метанотроф тільки при спільному культивуванні зі штамом М. рагадохих5 демонструє високу афінність до метану (потужному тепличному газу) - особливість, яка зазвичай не спостерігається у лабораторних культур.

Подібним способом було виявлено, що його близький родич Магомогах є центральним, не- фотосинтетичним партнером в рамках фототрофної консорції "Спіогоспготаїййшт аддгедайт".

Деякі види роду Мапомогах мають також здатністю втручатися в комунікацію інших бактерій.

Крім того, деякі види роду Магіомогах можуть тісно взаємодіяти з другою біотою (наприклад, рослинами) в різноманітних екосистемах. Більше того, деякі види Магіомогах, перебуваючи на площі за межами коріння рослини і/або усередині рослини, виявляли здатність активувати ріст рослини шляхом зниження рівнів етилену, репресії патогенезу, регульованого відчуттям кворуму, і підвищення стійкості до важких металів, що дуже корисно для фіторемедіації. В додаток до методів аналізу таксономії описаних у Прикладах 2-3, філогенетичний і таксономічний аналізи виду Магіомогтах можуть проводитися всілякими методами, включаючи детально розглянуті в даному описі.

Мусозрпаєтейа є дуже великим родом грибів з більш ніж 2000 найменуваннями видів і щонайменше 500 видами, асоційованими з більш ніж 40 анаморфними родами (зокрема,

Сегсозрога, Рзеийдосегсозрога, Зеріогіа, Катшгагіа та ін.). Крім того, декілька тисяч анаморфів не мають телеморфів. Рід Мусозрпаегейа включає види, які є патогенами, сапробами, ендофітами, або мутуалістичними асоціаціями. Різноманітні аспекти їхньої екології, походження, таксономії, методів культивування й умов довготривалого зберігання нещодавно були описані в бо роботі |(Сгои5 еїа!., Регзоопіа, 23:119-146, 2009). Таксономічна ідентифікація мікроорганізмів роду Мусозрпаєгеїйа може проводитися будь-яким із вищеописаних відповідних методів або їх комбінацією. Найбільш загальними із таких методів є аналіз послідовностей шляхом вирівнювання з послідовностями 165 рДНК і ділянками внутрішніх транскрибованих спейсерів, як описано, наприклад, в роботах |Сгоцз5 єї аї!., 5ішаїев іп Мусоіоду, 55:235-253,2006; Стоиз евї аї, 2009, вурга; Соодмлп єї аї, Рпуїораїйоіоду 91: 648-658, 2001|, а також методи, описані у

Прикладах 2-3 нижче.

Депозити біологічних матеріалів

Очищені культури мікробних штамів, які згідно з їх ідентифікацією мають супресорну активність проти фузаріозу, були депоновані в колекцію агрокультур для досліджень (Адгісийига

Кезеагсп бегмісе Сийиге СоПесіоп, розміщену за адресою 1815 М. Опімег5йу 5ігевї, Реогіа, І. 61604, ОБА (МККІ)) відповідно до "Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури" і нормативними положеннями, які з нього випливають (Видарезі Тгеаїу). Ці депозити розміщені під такими номерами: зо штаму

Дані мікробні штами були депоновані з умовою забезпечення доступу до культури протягом перебування даної заявки в процесі розгляду і прийняття рішення щодо неї керівником

Патентного відомства США згідно з 37 С.Р.К. 51.14 і 35 0.5.0. 5122. Ці депозити являють собою по суті чисті культури депонованих штамів. Доступ до депозитів забезпечується відповідно до патентних законодавств країн, де зареєстровані протилежні сторони даної заявки або їхні спадкоємці. Цілком зрозуміло, що доступ до депозитів не означає надання дозволу на практичне застосування предмета винаходу в порушення патентних прав, гарантованих державою.

Переважні мікроорганізми згідно з винаходом мають всі ідентифікаційні характеристики депонованих штамів і, зокрема, ідентифікаційні характеристики стосовно здатності пригнічувати розвиток фузаріозу, як указано в даному описі, і здатності пригнічувати розвиток патогену

Еивзагішт дгатіпеагит та його телеоморфу Спібрегейа 7є6ає. Зокрема, переважними мікроорганізмами згідно з винаходом є такі, які указані в депозитах мікроорганізмів, описаних вище, або є їх мутантами.

Зо Мікробіологічні композиції

Мікробіологічні композиції згідно з винаходом, які містять виділені мікробні штами або їх культури, можуть мати найрізноманітніші форми, включаючи, зокрема, форми стаціонарної культури, суцільної культури, клітинного штаму, що зберігається, міцелію і/або гіфи (особливо, маточних гліцеринових розчинів), агарових стрічок, агарових комплексів у водно-гліцериновій суміші, висушених виморожуванням маточних розчинів і висушених маточних розчинів, таких, як ліофілізати або міцелії, висушені на фільтрувальному папері або на посівному зерні. Відповідно до визначення в даному описі, термін "виділена культура" або його граматичні еквіваленти означають, що дана культура являє собою поживну рідину, гранулу, зскрібок, висушений зразок, ліофілат або зріз (наприклад, гіфи чи міцелію), або основу, контейнер чи середовище, наприклад, планшет, папір, фільтр, матрицю, солому, піпетку або вістря піпетки, волокно, голку, гель, тампон, пробірку, флакончик, частку та ін., і містить один тип організму. В даному винаході виділеною культурою мікробного антагоніста є поживна рідина або зскрібок, гранула, висушений препарат, ліофілат або зріз мікроорганізму, або основа, контейнер, або середовище, що містить мікроорганізм за відсутності інших організмів.

Даним винаходом пропонуються також композиції, які містять щонайменше один виділений мікробний штам або його культуру згідно з винаходом і носій. Носієм може бути будь-який один носій або багато носіїв, що відповідає(ють) різноманітним властивостям, таким, як підвищена стійкість, змочуваність, диспергованість та ін. Композиція згідно з винаходом може включати змочувальні агенти, такі, як природні або штучні поверхнево-активні речовини, якими можуть бути неіонні або іонні поверхнево-активні речовини або їх комбінації. До складу композиції можуть входити також емульсії типу вода-в-маслі, які містять щонайменше один виділений мікроорганізм згідно з винаходом (0.5. Раїепі Мо. 7,485,451|, включений тут шляхом посилання.

Потрібні препарати можуть бути приготовані зі змочуваних порошків, гранул, гелів, агарових смужок або гранул, загусників і т. п., вміщених у мікрокапсули частинок і т. п., рідин, таких, як водні плинні середовища, водні суспензії, емульсії типу вода-в-маслі та ін. Препарат може містити зернові або бобові продукти (наприклад, здрібнене зерно або боби, бульйон або муку, приготовані із зерна або бобів) крохмаль, цукор або олію. Носієм може бути сільськогосподарський носій. В деяких переважних варіантах здійснення винаходу носієм є насінина, а композиція може наноситися на цю насінину або покривати чи просочувати Її.

В деяких варіантах здійснення винаходу сільськогосподарським носієм може бути грунт або середовище для вирощування рослин. Іншими придатними сільськогосподарськими носіями є вода, добрива, олії зволожувачі та їх комбінації В альтернативному варіанті сільськогосподарським носієм може бути твердий матеріал, такий, як інфузорна земля, суглинок, кремнезем, альгінат, глина, бентоніт, вермікуліт, насіннєві капсули, інші рослинні і тваринні продукти або їх комбінації, включаючи гранули, котуни і суспензії. Носіями можуть слугувати також суміші будь-яких вищезазначених інгредієнтів, такі, як, наприклад, песта (ревіа: борошно і каолінова глина), агарові або борошняні гранули в суглинку, піску або глині та ін.

Препарати можуть містити харчові джерела для культивованих організмів, такі, як ячмінь, рис або інші біологічні матеріали, наприклад, насіння, частини рослин, багаса - цукрової тростини, лузга або черешки від обробки зерна, подрібнений рослинний матеріал (наприклад, "відходи від зберігання у сховищах") або деревина із будівельних відходів, тирса або дрібні волокна від повторної переробки паперу, тканих матеріалів або деревини. Фахівцям у даній галузі можуть бути відомі також інші придатні матеріали для цих цілей.

В рідкій формі, наприклад розчинів або суспензій, мікроорганізми можуть змішуватися або суспендуватися у воді або у водних розчинах. Придатними рідкими розріджувачами або носіями при цьому є вода, водні розчини, нафтові дистиляти й інші рідкі матеріали.

Тверді композиції можуть готуватися шляхом диспергування антагоністичних мікроорганізмів у відповідним чином розподіленому твердому носію або на ньому, тобто такому, як торф, пшениця, висівки, вермікуліт, глина, тальк, бентоніт, інфузорна земля, сукновальна глина, пастеризований грунт і т. п. Якщо такі препарати використовуються у формі змочуваних порошків, то можуть застосовуватися біологічно сумісні диспергатори, такі, як неїіонні, аніонні,

Зо амфотерні або катіонні диспергатори та емульсифікатори.

У переважному варіанті здійснення винаходу запропоновані композиції запобігають ураженню фузаріозом рослин і особливо зернових, таких, як пшениця, ячмінь, овес і кукурудза, а при використанні їх в достатніх кількостях діють як мікробні антагоністи. Подібно до інших засобів біологічної боротьби ці композиції мають високий поріг безпеки, оскільки вони, як правило, не опалюють і не пошкоджують рослину.

Як детально показано в даному описі, боротьба з фузаріозом може здійснюватися шляхом нанесення однієї або більше мікробіологічних композицій згідно з винаходом на рослину-хазяїна або на її частини. Ці композиції можуть наноситися в кількості, ефективній для зниження рівня фузаріозу порівняно з його рівнем у необробленому контролі. Активні компоненти при цьому використовуються в концентрації, достатній для інгібування розвитку цільового фітопатогену, коли вони прикладені до зернової культури. Для фахівця повинно бути очевидним, що ефективні концентрації можуть бути різними і залежати від таких факторів: (а) типу рослини або сільськогосподарського продукту; (Б) фізіологічного стану рослини або сільськогосподарського продукту; (с) концентрації патогенів, які вражають рослину або сільськогосподарський продукт; (4) типу хвороби, що вражає рослину або сільськогосподарський продукт; (е) погодних умов (наприклад, температури, вологості); і () стадії розвитку хвороби рослини. Згідно з винаходом типові величини концентрації знаходяться вище рівня 1 х 10- КУО/мл носію. Переважні рівні концентрації знаходяться в інтервалі приблизно від 1 х 107 до 1 х109 КУО/мл, а ще переважніше - в інтервалі від 1 х 106 до 1 х 108 КУО/мл. Більш переважним є інтервал концентрації приблизно від 35 до 150 мг сухої мікробної маси на грам носію (сухого препарату) або на мілілітр носію (рідка композиція). У твердих препаратів швидкість постачання повинна регулюватися так, щоб отримувати кількість життєздатних клітин на одиницю площі поверхні тканини рослини, порівняну з отримуваним від застосування вищезазначених концентрацій рідкої обробки. Як правило, агенти біологічного методу боротьби згідно з винаходом є біологічно ефективними, коли вони постачаються в концентрації вище 105 КУО/г (колонієутворювальних одиниць на грам), переважно - вище 107 КУО/г, ще переважніше - в концентрації 108 КУО/г, і найпереважніше -- в концентрації 109 КУО/г.

В деяких варіантах здійснення винаходу кількість одного або більше агентів біологічної боротьби в мікробній композиції згідно з винаходом може варіювати залежно від кінцевого бо препарату, а також розмірів і типу рослини або використовуваного насіння. В переважному варіанті один або більше агентів біологічної боротьби в мікробній композиції використовується в кількості приблизно від 2 до 80 95 (мас.) від всієї кількості препарату. В переважному варіанті один або більше агентів біологічної боротьби в мікробній композиції використовується в кількості приблизно від 5 до 65 95 (мас.), а в найбільш переважному - приблизно від 10 до 60 95 (мас.) від всієї кількості препарату.

Мікробіологічні композиції згідно з винаходом можуть наноситися на пшеницю або іншу зернову культуру за допомогою найрізноманітніших, добре відомих фахівцям способів, таких, як опилення, створення покриття, вливання, втирання, катання, протруювання зануренням, розпилення, обтирання щіткою та інші придатні способи, які не викликають суттєвих ушкоджень у пшениці або інших зернових культур при їх обробці. Особливо прийнятним є спосіб розпилення.

Композиції згідно з винаходом, як правило, є хімічно інертними. Тому вони є сумісними по суті з будь-якими іншими компонентами схеми розпилення. Вони можуть використовуватися також у сполученні з біологічно сумісними пестицидними активними агентами, наприклад, з гербіцидами, нематоцидами, фунгіцидами, інсектицидами і т. п. Вони можуть використовуватися також у сполученні з субстанціями регуляції росту рослин, такими, як добрива, регулятори росту рослин і т. п., якщо тільки такі сполуки або субстанції є біологічно сумісними.

Якщо пестициди або фунгіциди використовуються в їх комерційних препаратах і в формах, приготованих із цих препаратів, то активні мікробні антагоністи і композиції відповідно до даного винаходу можуть, тим більше, використовуватися разом з ними у формі синергічної суміші.

Компоненти такої суміші, будучи синергістами, підвищують ефективність активної композиції без необхідності додавати в суміш спеціальні синергісти.

Використовувані як пестициди в їх комерційних препаратах і в формах, приготованих із цих препаратів, активні мікробні антагоністи і композиції відповідно до даного винаходу можуть, тим більше, використовуватися разом з ними у формі суміші з інгібіторами, які зменшують деградацію активних композицій після їх застосування в місці росту рослини, на поверхні частин рослини або в ' її тканинах.

Активні мікробні антагоністи і композиції згідно з винаходом, у своєму маточному стані або в препаратах, можуть використовуватися також у формі суміші з відомими акарицидами, бактерицидами, фунгіцидами, інсектицидами, мікробіцидами, нематоцидами, пестицидами або їх комбінаціями, наприклад, з метою розширення їхнього спектра дії або для запобігання розвитку стійкості цим шляхом. У багатьох випадках синергетика дає позитивний результат, тобто активність такої суміші може перевищувати активність її індивідуальних компонентів.

Суміш з іншими відомими активними сполуками, такими, як добрива, регулятори росту, захисні агенти і/або хімікалії сигналізації, також охоплюються об'ємом винаходу.

У переважному варіанті здійснення винаходу композиції можуть містити також щонайменше один хімічний або біологічний пестицид. Кількість щонайменше одного хімічного або біологічного пестициду, використовуваного в даній композиції, може варіювати залежно від кінцевого препарату, а також розмірів оброблюваної рослини і насінини. В переважному варіанті кількість щонайменше одного використовуваного хімічного або біологічного пестициду складає приблизно від 0,1 до 80 95 (мас.) від всієї кількості препарату. У ще переважнішому варіанті кількість щонайменше одного використовуваного хімічного або біологічного пестициду складає приблизно від 1 до 60 95 (мас.), а в найбільш переважному - приблизно від 10 до 50 95 (мас.).

У даному винаході можуть використовуватися будь-які пестициди, відомі фахівцям у даній галузі. Це можуть бути, наприклад, хімічні пестициди, які належать до класів карбаматів, органофосфатів, хлорорганічних сполук і піретроїдів. Винаходом передбачені також хімічні агенти біоборотьби, такі, як, наприклад: беноміл; боракс; каптафол; каптан; хлорталоніл; мідевмісні препарати; препарати, які містять дихлон, дихлоран, йод, цинк; фунгіциди, що інгібують біосинтез ергостеролу, такі, як, наприклад, бластицидин, цимоксаніл, фенаримол,

БО флузилазол, фолпет, імазаліл, іпордіон, манеб, манокоцеб, металаксил, оксикарбоксин, міклобутаніл, окситетрациклін, ПХНБ (пентахлорнітробензол), пентахлорфенол, прохлораз, пропіконазол, хінометіонат, арсеніт натрію, натрій ОМОС (динітроокрезол), натрій гіпохлорит, натрій фенілфенат, стрептоміцин, сірка, тебуконазол, тербутразол, тіабендозол, тіофанат- метил, триадимефон, трициклазол, трифорин, валідиміцин, винклозолін, цинеб і цирам. В композиціях згідно з винаходом можуть використовуватися найрізноманітніші інсектицидні сполуки, включаючи, наприклад, зазначені в заявці (0.5. Раї. Аррі. Мо. 20110033432А11.

Мікробіологічні композиції згідно з винаходом в переважному варіанті містять щонайменше один біологічний пестицид. Типовими біологічними пестицидами, які є придатними для використання згідно з винаходом і можуть входити в мікробіологічну композицію згідно з 60 винаходом для запобігання фітопатогенній хворобі, є мікроби, тварини, бактерії, гриби,

генетичний матеріал, рослина і природні продукти живих організмів. У цих композиціях мікроорганізм згідно з винаходом виділяється перед готуванням препарату додатковим організмом. У композиції з антагоністичними мікроорганізмами згідно з винаходом можуть використовуватися мікроби, наприклад, видів Атреіотусев, Айгеобавзідійт, Васійи5, Веаиймеїга, Сапаїда, Спаєїотішт, Согаусерв, Стуріососси5, Барагуотусев, Егміпіа, Ехорпіїйа, Сііосіадійт,

Магпаппаєа, Раєесітусе5, Раепібасійй5, Рапіоєа, Ріспіа, Реєпдотопав, 5брогороІотусев,

Таіаготусез і Тгісподегта, де особливо переважними є грибні штами роду Мивсодог. Особливо прийнятним є також використання мікробіологічних композицій відповідно до даного винаходу в комбінації з мікробними антагоністами, описаними в (05 Раїепі Мо. 7,518,040; 05 Раїепі Мо. 7,601,346; 05 Раїепі Мо. 6,312,9401|.

Як приклади грибів, які можуть використовуватися в комбінаціях з мікробними антагоністами і композиціями згідно з винаходом, можна назвати види Мизсодог, АвсПегзопіа аїІеугодів,

Веацмета Браззіапа ("білий мускарин"), Веаймегіа Бгопопіапії, Спіадозрогіт пегбагит, Согаусерв сіаушата, Согаусерв епіотогп іга, Согаусерв5 Тадз5, Согаусерз агасіїв, Согаусерз твеїіоЇапінає,

Согаусере тіїйагієх, Согаусерз туптесорпіа, Согаусерб5 гамепеїїйї, Согаусер5 зіпепзвів,

СогаусерзПпесосернаіа, Согадусере зиБ5езвзіїв, Согаусерз ипііатегайв, Согаусерз маїіайіїв,

Согаусер5 уазпіпаїопепвіб5, Сиїсіпотусеб5 сіамозрогих, Епіоторнпада гу, Епіоторнада таїтаіда, Епіоторпада тивбсає, Епіоторнада ргахіриїйїї, Епіоторпїйпога рішейнає, ЕРизайит

Іаїегйит, НікзшейПНа сйпитогтів, Ні«ешейа Тотрзопі, Меїатігійит апізорііає ("зелений мускарин"),

Меїатігішт Памігіде, Мизсодог аІрив, МеогудітезПогідапа, Мотигавєа піеуії, Раесіотусез Тагіповив,

Раеспотусев Тштоз5ого5еи5, Рапдога пеоарпіаїі5, Тоїуросіадіит суїїпагозрогит, МепісшШіит Іесапії, 2оорпїнога гадісапв, і мікоризні види грибів, наприклад, І ассагіа рісоїог. Придатними можуть бути також інші мікопестицидні види, відомі фахівцям у даній галузі.

Даним винаходом пропонуються також способи лікувальної обробки рослини шляхом нанесення будь-якого зі звичайних препаратів в ефективній кількості або на грунт (тобто, в борозни), на частини рослини (тобто обприскуванням) або на насінини до їх посадки (тобто нанесенням покриття або протруюванням). Звичайними препаратами можуть бути розчини, концентрат, який емульсифікується, змочувані порошки, суспензійний концентрат, розчинні порошки, гранули, суспензійно-емульсійний концентрат, природні і штучні матеріали, просочені

Зо активною сполукою, і дуже дрібні полімерні капсули з керованим вивільненням. У деяких варіантах здійснення винаходу композиції для біологічної боротьби готують у порошках, які надходять у продаж або в препаратах, готових до вживання, або змішуються один з одним під час їх вживання. В обох випадках порошок може додаватися в грунт перед посадкою або під час посадки. В альтернативному варіанті агент біоборотьби і агент боротьби з комахою можуть бути обидва, або один із них, рідкими препаратами і змішуватися один з одним під час лікувальної обробки. Для фахівця зрозуміло, що ефективна кількість композиції згідно з винаходом залежить від кінцевого препарату композиції, а також від розмірів оброблюваних рослин або насіння.

Залежно від кінцевого препарату і способу його нанесення композиція згідно з винаходом може містити у собі одну або більше придатних добавок. Такими добавками в даній композиції можуть бути, наприклад, адгезиви, такі, як карбоксиметилцелюлоза і природні або штучні полімери у формі порошків, гранул або латексів, такі, як гуміарабік, хітин, полівініловий спирт і полівінілацетат, а також природні фосфоліпіди, такі, як цефаліни і лектицини, і штучні фосфоліпіди.

В одному із переважних варіантів здійснення винаходу мікробіологічні композиції готують в єдиному стабільному розчині, емульсії або суспензії. Для готування розчинів активні хімічні сполуки (тобто агенти біоборотьби з шкідниками) перед додаванням агента біоборотьби, як правило, розчиняють у розчинниках. Придатними рідкими розчинниками можуть бути, наприклад, ароматичні речовини із нафти, такі, як ксилол, толуол або алкілнафталіни, аліфатичні вуглеводні, такі, як циклогексан або парафіни, наприклад, нафтові фракції, мінеральні масла і рослинні олії, спирти, такі, як бутанол або гліколь, а також їхні прості і складні ефіри, каєетони, такі, як метилетилкетон, метилізобутилкетон або циклогексанон, сильні полярні розчинники, такі, як диметилформамід і диметилсульфоксид. Рідким середовищем для емульсії або суспензії є вода. В одному із варіантів здійснення винаходу агент хімічної боротьби й агент біологічної боротьби суспендуються в рідинах окремо один від одного і змішуються під час вживання. У переважному варіанті готування суспензії агент боротьби з комахами і біологічний агент об'єднуються у препараті, готовому до вживання, з терміном зберігання щонайменше два роки. При вживанні рідина може розпилятися або наноситися у формі плівки за допомогою розпилювача, або в борозну під час посіву культури. Рідка композиція може бо вводитися в грунт перед проростанням насінин або безпосередньо в грунт у контакті з корінням за допомогою різноманітних засобів і методів, добре відомих в даній галузі, включаючи, наприклад, крапельне зрошення, розбризкування, інжекцію в грунт або просочування грунту.

У разі потреби можуть додаватися стабілізатори і буфери, включаючи солі лужних і лужноземельних металів та органічні кислоти, такі, як лимонна кислота й аскорбінова кислота, неорганічні кислоти, такі, як соляна кислота або сірчана кислота. Можуть додаватися також біоциди, наприклад, формальдегіди або агенти, які виділяють формальдегід, і похідні бензойної кислоти, такі, як п-гідроксибензойна кислота.

Препарати для нанесення покриття на насіння

В деяких особливо переважних варіантах здійснення винаходу склад композиції для біоборотьби згідно з винаходом розраховують для лікувальної обробки насіння. Композиція для лікувальної обробки насіння містить щонайменше один агент боротьби з комахами і щонайменше один агент біологічної боротьби. Передбачається, що насінини можуть по суті рівномірно покриватися одним або більше шарами описаних тут композицій для біоборотьби, використовуючи для цього звичайні методи змішування і розпилення або їх комбінації і спеціально сконструйовані і виготовлені пристрої для створення покриття, які забезпечують необхідні точність, безпеку й ефективність нанесення продуктів обробки на насіння. В таких пристроях використовуються різноманітні технології створення покриття, наприклад, роторного типу, барабанного типу, методи псевдозрідженого шару, фонтануючого шару, роторного розпилення або їх комбінації. Рідка обробка насіння відповідно до даного винаходу може здійснюватися за допомогою або центрифугального дискового "розпилювача", або спрею, що забезпечує рівномірний розподіл покриття на насінинах в умовах їх руху через профіль розпилення. Після цього насіння в переважному варіанті перемішують або ворушать протягом деякого часу з метою додаткового вирівнювання розподілу і сушать. Перед нанесенням покриття із композиції згідно з винаходом насіння може піддаватися праймуванню (стимуляції проростання) для підвищення рівномірності проростання і випускання сходів. В альтернативному варіанті сухий порошковий препарат може подаватися в певних дозах на насіння у процесі перемішування і перемішуватися з ними до отримання однорідного розподілу.

В іншому аспекті згідно з винаходом пропонується насіння, оброблене мікробіологічними композиціями згідно з винаходом. В одному із варіантів щонайменше частина поверхні насінини

Зо є покритою мікробіологічною композицією згідно з винаходом. В одному зі специфічних варіантів оброблені мікроорганізмами насінини мають концентрацію спор або мікробних клітин приблизно від 106 до 109 на одну насінину. Насінини можуть мати також більшу кількість спор або мікробних клітин, наприклад, 1079, 1011 або 1072 спор на насінину. Мікробні спори і/або клітини можуть покривати насінини у вільному стані або, переважно, наноситися на них у попередньо приготованій рідкій або твердій композиції. Тверда композиція, яка містить мікроорганізми, може готуватися шляхом перемішування твердого носія з суспензією спор доти, поки тверді носії не будуть просочені цією споровою або клітинною суспензією. Після цього суміш просушують, отримуючи в результаті потрібні частки.

В деяких інших варіантах здійснення винаходу передбачається, що тверді або рідкі композиції для біоборотьби, крім того, містять функціональні агенти, здатні захищати насіння від шкідливої дії селективних гербіцидів, таких, як активоване вугілля, поживні речовини (добрива) й інші агенти, здатні покращувати проростання і якість продукту.

Відомі способи і композиції для нанесення покриття на насіння можуть бути особливо корисними, коли вони модифікуються шляхом додавання відповідно до одного із варіантів здійснення даного винаходу. Такі придатні для застосування способи і пристрої для нанесення покриття описані, наприклад, в (О.5. Раї Мо5. 5,918,413; 5,554,445 5,389,399; 4,759,945; 4,465,017). Всілякі композиції для створення покриття на насінинах описані, наприклад, в (0.5.

Раї. Аррі. Моз. О520110033432, О0520100154299, 0.5. Раї. Моз. 5,939,356; 5,876,739, 5,849,320; 5,791,084, 5,661,103; 5,580,544, 5,328,942; 4,735,015; 4,634,587; 4,372,080, 4,339,456; і 4,245,432).

У препарати для обробки насіння, які містять композиції згідно з винаходом, можуть уводитися найрізноманітніші добавки. Такими добавками можуть бути, наприклад, сполучні матеріали, які складаються із адгезивного полімеру, що може бути природним або штучним і не повинен чинити фітотоксичної дії на оброблюване покриттям насіння. Сполучний матеріал може вибиратися серед: полівінілацетатів; співполімерів полівінілацетатів; співполімерів етиленвінілацетату (ЕВА); полівінілового спирту; співполімерів полівінілового спирту; целюлози, включаючи етилцелюлозу, метилцелюлозу, гідроксиметилцелюлозу, гідроксипропілцелюлозу і карбоксиметилцелюлозу; полівінілпіролідонів; полісахаридів, включаючи крохмаль, модифікований крохмаль, декстрини, мальтодекстрини, альгінат і хітозани; жирів; рослинних 60 олій; протеїнів, включаючи желатин і зеїни; гуміарабіків; шелаків; вініліденхлориду і співполімерів вініліденхлориду; лігносульфонатів кальцію; акрилових співполімерів; полівінілакрилатів; поліетиленоксиду; акриламідних полімерів і співполімерів; полігідроксіетилакрилату, метилакриламідних мономерів; і поліхлоропрену.

Можуть використовуватися будь-які барвники, включаючи органічні хромофори, які належать до класу нітрозо; нітро; азо, включаючи моназо, бізазо і поліазо; акридин, антрахінон, азин, дифенілметан, індамін, індофенол, метин, оксазин, фталоціанін, тіазин, тіазол, триарилметан, ксантен. Серед інших припустимих добавок можна назвати слідові поживні добавки, такі, як солі заліза, марганцю, бору, міді, кобальту, молібдену і цинку. Для утримування цих речовин на поверхні насінин можуть додаватися полімерні або інші пилоподібні засоби.

В деяких специфічних варіантах здійснення винаходу нанесене покриття, окрім мікробних клітин або спор, може містити також шари адгезиву. Адгезив повинен бути нетоксичним, біорозкладаним і клейким. Придатними для нього матеріалами є, наприклад: полівінілацетати; співполімери полівінілацетатів; полівінілові спирти; співполімери полівінілових спиртів; целюлози, такі, як метилцелюлоза, гідроксиметилцелюлоза і гідроксиметилпропілцелюлоза; декстрини; альгінати; цукри; меляси; полівінілпіролідони; полісахариди; протеїни; жири; олії; гуміарабіки; желатини; сиропи; і крохмалі. Придатними можуть бути також матеріали, описані в

ІО.5. Раї. Мо. 7,213,367 і 0.5. Раї. Арріп. Мо. 05201001896931.

До препарату для обробки насіння також можуть входити різноманітні добавки, такі, як адгезиви, диспергатори, поверхнево-активні речовини, поживні і буферні інгредієнти.

Звичайними добавками у препарат для обробки насіння є, наприклад, агенти для нанесення покриття, змочувальні агенти, буферні агенти і полісахариди, а також щонайменше один придатний для сільського господарства носій, такий, як вода, тверді тіла або сухі порошки. Сухі порошки можна готувати із різноманітних матеріалів, таких, як карбонат кальцію, гіпс, вермікуліт, тальк, гумус, активоване вугілля і всілякі сполуки фосфору.

В одному із варіантів здійснення винаходу композиція для створення покриття на насінині може містити щонайменше один наповнювач, який є органічним або неорганічним, природним або штучним компонентом, з яким об'єднуються активні компоненти для полегшення їх нанесення на насінину. При цьому бажано, щоб наповнювач був інертним, твердим матеріалом, таким, як глина, природний або штучний силікат, кремнезем, смола, віск, тверде добриво (наприклад, сіль амонію), природним грунтовим мінералом, таким, як каолін, глина, тальк, вапно, кварц, атапульгіт, монтморилоніт, бентоніт або інфузорна земля, або штучним мінералом, таким, як кремнезем, глинозем або силікат, із яких особливо придатними є силікати алюмінію або магнію.

Препарат для обробки насіння може містити, крім того, один або більше таких інгредієнтів: інші пестициди, включаючи сполуки, що діють тільки під землею; фунгіциди, такі, як каптан, тирам, метаксил, флудіоксоніл, оксадиліл і ізомери кожного із цих матеріалів, і т. п.; гербіциди, включаючи сполуки, вибрані серед гліфосфату, карбаматів, тіокарбаматів, ацетамідів, триазинів, динітроанілінів, гліцеринових ефірів, піридазинонів, урацилів, фенокси, сечовин і бензойних кислот; гербіцидні захисні агенти, такі, як бензоксазин, похідні бензгідрилу, М, М- діалілдихлорацетамід, різноманітні сполуки дигалоацилів, оксазолідинілів і тіазолідинілів, етанон, сполуки нафталевих ангідридів і похідні оксимів; добрива; та агенти біоборотьби -- інші природні або рекомбінантні бактерії і гриби родів ВНі2обішт, Васішв5, Рзепдотопав, бетайа,

Тиснподента, Сіотив, Спіосіадіит ї мікоризні гриби. Ці інгредієнти можуть додаватися у формі окремого шару на насінинах або, в альтернативному варіанті, як частини композиції для покриття насіння згідно з винаходом.

У переважному варіанті кількість нової композиції або інших інгредієнтів, використовуваних для обробки насіння, не повинна інгібувати проростання насінин або викликати у них фітотоксичні ушкодження.

Оброблені мікроорганізмами насінини можуть бути додатково покриті плівкою поверх нанесеного на них покриття для захисту останнього. Такі поверхневі покриття є добре відомими і можуть наноситися методами псевдозрідженого шару і барабану, що обертається.

У принципі будь-яку насінину, здатну проростати й утворювати рослину, сприйнятливу до дії нематодів і/або патогенних грибів, можна піддавати обробці відповідно до даного винаходу.

Придатними для цього є насінини зернових культур, кава, капустяних культур, волокнистих культур, квітів, фруктів, бобових, олійних культур, дерев, бульбоплодів, овочів, а також інших рослин однодольних і дводольних видів. Переважним для нанесення на нього покриття є насіння, наприклад, бобових, моркви, кукурудзи, бавовни, трав, салату, арахісу, перцю, картоплі, рапсу, рису, жита, сорго, сої, цукрового буряку, соняшнику, тютюну і томатів. Найбільш придатними для покриття композиціями згідно з винаходом є насіння ячменю та пшениці (ярової 60 або озимої пшениці).

В іншому аспекті даного винаходу пропонується нова зернова рослина, створена шляхом штучного введення мікробного ендофіту згідно з винаходом у зернову рослину, що не містить ендофітних мікроорганізмів. В деяких варіантах здійснення даного аспекту мікробним ендофітом, уведеним в зернову рослину, може бути ендофітний антагоніст, який має супресорну активність проти фузаріозу або збудника фузаріозу. Крім того, ендофітним антагоністом, уведеним у зернову рослину, може бути грибний штам 561-010-НІ11. Відомо багато способів, які продемонстрували свою ефективність у введенні мікробного ендофіту в зернові трави. Приклади таких способів можна знайти в (О.5. Раї. Аррі. Мо. 20030195117А1, 0.5.

Раї. Аррі. Мо. 20010032343А1, О.5. Раї. Мо. 7,084,331|. Для фахівця в даній галузі цілком зрозуміло, що в культивуванні нової зернової рослини згідно з винаходом можуть використовуватися багато із вищезгаданих способів.

Після штучної інфікації бажано ДНК виділеного ендофітного антагоніста ампліфікувати за допомогою ПЛР-реакції, і підтвердити його антагоністичність шляхом проведення досліджень гомології для ампліфікованої ДНК. Далі бажано у вищезгаданий ендофітний антагоніст ввести чужорідний ген, що експресує засіб, який ідентифікується, і підтвердити наявність колонізації даного ендофітного антагоніста, що інфікує рослину, вищезгаданим засобом, що ідентифікується, використовуючи цей чужорідний ген.

Приготування композиції для біоборотьби відповідно до даного винаходу

Культури мікробних антагоністів можуть бути приготовані для використання в композиціях біоборотьби згідно з винаходом за допомогою відомих методів стандартної статичної сушки і рідкої ферментації. Культивування, як завжди, проводять у біореакторі.

Біореактором називається будь-який пристрій, що забезпечує умови біологічно активного навколишнього середовища. У контексті даного опису біореактором є посудина, в якій можна вирощувати мікроорганізми, включаючи мікробні антагоністи згідно з винаходом. Біореактор може мати будь-яку форму і розміри, придатні для культивування мікроорганізмів. Біореактор може мати розміри від 10 мл до літрів і кубічних метрів. Він може бути виконаний із нержавіючої сталі або будь-якого іншого придатного матеріалу. Біореактор може бути періодичної дії або безперервної дії (наприклад, з безперервним перемішуванням). За своїм типом біореактор може належати до хемостатів, які використовуються в мікробіології для вирощування і збору

Зо бактерій. Серед придатних комерційних біореакторів можна назвати, наприклад, апарати фірми

Віогеасіог Зувієт ЮОезідп, Азепіо 2 Мегспик, САС Ргезз, 1995.

Для незначних потреб, наприклад, для тестування і розробки нових процесів і процесів, які не можуть бути перетворені на безперервні, можна використовувати біореактор періодичної дії.

Мікроорганізми, вирощувані в біореакторі можна суспендувати або |іммобілізувати.

Культивація в біореакторі у загальному випадку здійснюється в аеробних умовах при відповідних температурах і рН. Для отримання організмів згідно з винаходом культивацію клітин здійснюють при температурах в інтервалі 5-37 "С, в якому переважними є температури в інтервалах 15-30 "С, 15-28 70, 20-30 "С ії 15-25 70. Величина рН поживного середовища може варіювати від 4,0 до 9,0, але переважним є робочий інтервал від трохи кислуватого до нейтрального з рН 4,0-7,0, або 4,5-6,5, або рН 5,0-6.0. Як правило, максимальний клітинний вихід отримують в період 20-72 годин після інокуляції.

Абсолютно зрозуміло, що оптимальні умови культивації антагоністів згідно з винаходом залежать від конкретного штаму. Але, головні інгредієнти та умови живлення можна буде визначити, виходячи із умов, використовуваних у процесі селекції, і загальних вимог для більшості мікроорганізмів. Мікробні антагоністи, як правило, повинні вирощуватися в аеробних рідких культурах на середовищі, що містить джерела вуглецю, азоту і неорганічних солей, які можуть асимілюватися мікроорганізмом і сприяти ефективному росту клітин. Переважними джерелами вуглецю є гексози, такі, як глюкоза. Але їх можуть замінити інші джерела, що легко асимілюються, такі, як амінокислоти. Джерелами азоту в процесі вирощування можуть слугувати різноманітні неорганічні і білкові матеріали. Переважними джерелами азоту є амінокислоти і сечовини, але можуть використовуватися також газоподібний аміак, неорганічні нітрати і солі амонію, вітаміни, чисті поживні речовини, піримідини, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, протеоз пептону, соєве борошно, гідролізати казеїну, фільтрат барди і т. п.

Серед неорганічних мінералів, які можуть уводитися в поживне середовище, можна назвати звичайні солі, здатні постачати іони кальцію, цинку, заліза, марганцю, магнію, міді, кобальту, калію, натрію, молібдату, фосфату, сульфату, хлориду, борату та ін. Переважним поживним середовищем для грибних антагоністів є рідка картопляна декстроза, а для бактеріальних штамів - бульйон премікс К2А.

В даному описі указані і включені шляхом посилань різноманітні джерела інформації:, серед 60 яких, наприклад, статті із наукових журналів, патентні документи, навчальні посібники та адреси інтернет-сторінок. Посилання на ці джерела слугують виключно для висвітлення загального рівня техніки на час подачі заявки. Поряд з тим, що вміст та ідеї, висловлені в усіх і кожному із цих джерел, можуть стати основою і використовуватися для реалізації і застосування варіантів здійснення винаходу на практиці, жодні із обговорень і коментаріїв в тому чи іншому джерелі інформації не можуть вважатися визнанням того, що вони в широкому сенсі приймаються тут як загальноприйнятий погляд в даній галузі.

Поданий тут опис загальних способів має виключно ілюстративне спрямування. Абсолютно очевидними можуть бути інші альтернативні способи і варіанти здійснення винаходу, які випливають із цього опису і також лежать в межах ідеї і сфери застосування даної заявки.

Нижче наведені приклади, які також слугують лише для ілюстрації даного винаходу і не мають жодних його обмежень.

Приклади

Приклад 1. Опис антагоністичних мікроорганізмів, здатних пригнічувати розвиток Ризагійт дгатіпаєгит і сзіррегеїІа 7еає, які є збудниками фузаріозу

У даному прикладі описаний високопродуктивний процес збору і скринінгу мікроорганізмів - кандидатів, розроблений фірмою 5упіпеїйїс сСепотісв5, Іпс. для виділення штамів мікроорганізмів, які мають супресорну активністю проти збудників фузаріозу і, зокрема, проти Ризагчт дгатіпеагит. Нові мікробні антагоністичні штами були виділені зі зразків рослинних тканин, зібраних у кількох місцях на території Сполучених Штатів. Із тканин коріння рослин, зібраних у заповіднику Еадіеє Реак Ргезегле поблизу селища Уцшіап, шт. Каліфорнія (США), були виділені бактеріальні штами 501-014-С06, 5021-014-2401, 5021І-015-603 і 501-015-НОб. Із тканин стеблин двох зразків різноманітних рослин, зібраних в Зап ЕїЇйШо І адооп, Епсіпках, СА, були виділені грибний штам 501-010-Н11 і бактеріальний штам 501І-005-508.

Виділення цих мікроорганізмів проводили таким способом. Спочатку для виділення бактеріального штаму кореневої тканини рослини опромінювали ультразвуком і потім розбавляли на планшетах з 2хТ (дріжджовим екстрактом з триптоном) і з безазотистим агаровим середовищем. Після цього за морфологічними характеристиками відбиралися індивідуальні колонії, які кожну окремо культивували в рідкому бульйонному середовищі. Для виділення грибів рослинну тканину спочатку піддавали поверхневій стерилізації шляхом

Зо занурення в 7095 етанол і короткотермінової обробки у полум'ї. Потім тканину розсікали і поміщали на картопляно-декстрозний агар (КДА), після чого її інкубували при кімнатній температурі. Коли починав спостерігатися ріст міцелію, сегмент міцеліальної культури переносили на другий КДА-планшет. Штами мікроорганізмів виділяли, очищували і зберігали при -80 "С у 15 95 гліцерині для бактеріальних штамів і на висушеному насінні ячменю для грибних штамів.

У виділених штамів мікроорганізмів визначали здатність пригнічувати ріст міцелію РЕ. дгатіпеагит у випробуваннях на антагонізм іп міо, які проводили на агарових планшетах із картопляно-декстрозним агаровим (КДА) поживним середовищем відповідно до методики високоефективного скринінгу з невеликими модифікаціями, описаної в заявці (0.5. Раї. Аррі. Мо. 0О520120107915А1|, включеної тут шляхом посилання. Коротко, виділені штами мікроорганізмів вирощували на трипсин-соєвому бульйонному агарі (ТОБА/5) з однією п'ятою від нормальної концентрацією протягом 24 год. перед вживанням. Конідіальний інокулят Е. дгатіпеагит МАНІ - 5883 продукували шляхом гіфального прищеплювання грибної колонії, яка активно росла, і перенесення гіфальних ниток у КДА агарове середовище. Після інкубування планшетів протягом 7 днів при 25 "С з 12 год./день фотоперіодом конідії відмивали від КДА-планшетів за допомогою слабкого фосфатного буферу (0,004 95 фосфатний буфер, рН 7,2 з 0,019 95 Масіг).

Потім суспензію конідій Е. дгатіпеагит в слабкому фосфатному буфері (1 х 105 конідій/мл) одразу розподіляли по поверхні агару, і потім планшети інкубували при 25 "С протягом 48-72 год. Для ініціації тесту на антагонізм, клітини виділених мікробних штамів точковим способом інокулювали на однакових відстанях усередині периметра планшета. Через п'ять днів штами визначали як антибіоз-позитивні коли за периметром мікробних колоній візуально спостерігалася світла ділянка, на якій був відсутній міцеліальний ріст.

За допомогою вищеописаної методики було виділено і проаналізовано більше 4000 мікробних штамів. Серед них шість штамів виявляли здатність суттєво пригнічувати міцеліальний ріст Е. дгатіпеагит МАНІ -5883 на КДА-середовищі. Ці нові мікробні антагоністи отримали такі найменування: 501-005-508, 5(023І1-010-Н11, 5023І-014-С06, 5(023І1-014-5401, 5(021І-015-

ЕОЗ ї 50І-015-НОб.

Вищезазначені нові мікробні антагоністи піддавалися також тестуванню на антагонізм за їхньою здатністю пригнічувати ріст грибного патогену СіррегеПйа 76ає, який є телеоморфним бо видом гриба Ризапйит дгатіпеагит. Всі використовувані при цьому методики були ідентичними вищеописаним, за винятком того, що тестованим таким способом патогенним штамом був штам гриба СірбегеїІа 7єає. Серед цих шести мікробних антагоністів чотири штами 501І-010-Н11, 5аІ- 014-006, 50І-015-Р03 і 501І-015-НОб продемонстрували здатність суттєво пригнічувати міцеліальний ріст гриба СірбегеїЇа 7еав.

Приклад 2. Екстрагування ДНК. Секвенування і таксономія

Лізис грибних клітин та отримання інформації щодо послідовності ІТ 5-5.85 ДНК

Грибну біомасу переносили на 9б-лунковий ПЛР-мікропланшет, який містив 50 мкл 2 х буферу для лізису (100 мМ Ттгі5 НОСІЇ, рН 8,0, 2 мМ ЕОТА, рН 8,0, 195 505, 400 мкг/мл протеїнази К). Лізис проводили в таких умовах: 55 "С протягом 60 хвилин, 94 "С протягом 4 хвилин. Аліквоту лізисного продукту використовували як джерела матричної ДНК для ПЛР- ампліфікації. Послідовність І75-5.85 рРДНК ампліфікували за допомогою ПЛР-реакції з двома праймерами М13-І751 (5ЕО ІО МО:15) і 1754 М13-хвіст (ЗЕО ІЮ МО:16).

Для ампліфікації ділянки І75-5.85 рРДНК кожну ПЛР-суміш готували в реакційній суміші з кінцевим об'ємом 20 мкл, що містила 4 мкл із реакційної суміші грибного лізису, 0,2 мкМ кожного праймера (ІТ51/154), б 96 Пуееп-20 і 10 мкл 2х ІттомМіх (Віоїїпе О5А Іпс, Таипіоп, МА). ПЛР проводили в таких умовах: 94 "С протягом 10 хвилин; 94 "С протягом 30 секунд, 52 "С протягом 30 секунд, 72 "С протягом 75 секунд протягом 30 циклів; 72 "С протягом 10 хвилин. 2-мкл аліквоту ПЛР-продукту поміщали на 1,0 95 агарозний гель для підтвердження одинарної смужки очікуваного розміру. Позитивні смужки спрямовували на секвенування за Сенгером в прямому та зворотному напрямках за допомогою М13 праймерів. Послідовність 5.85 міжгенної ділянки (ІТ5) грибного штаму 501-010-НІ11 представлена в Переліку послідовностей під номером 5ЕО

ІО МО:11. Дослідження гомології для певної нуклеотидної послідовності 5.8 5 міжгенної ділянки (75) проводили за допомогою бази даних ОВО зепВапк/ЕМВІ.. Після цього за допомогою програми СіихіаїМму побудови філогенетичного дерева був проаналізований філогенетичний взаємозв'язок нуклеотидної послідовності 5.85 міжгенної ділянки (ІТ5) у групі, до якої ввійшли описаний тут виділений грибний антагоніст 501-010-Н11, мікроорганізми родів і видів, які демонструють високі гомології послідовностей з виділеним грибним антагоністом 501-010-Н11, та інші різноманітні роди і види мікроорганізмів. Грибний штам 501-010-НІ1 вважається спорідненим з родиною МусозрпаєгеПасеає, якщо брати за критерій «97 95 подібність його

Зо послідовності І75-5.85 рДНК такій у МусозрпаєтеПарипсійогптіє (СепВапк ЕИОЗ43182) і

Ватиїагтіаргаїепвзіз (здепВапк ЕОО19284), 5.85 ІТ5 послідовності яких демонструють очевидне споріднення з МусозрпаєгеїІасєав.

Лізис бактеріальних клітин та отримання інформації щодо послідовності 165 рРНК 20 мкл аліквоту клітинної суспензії переносили на 96-лунковий ПЛР-планшет, що містив 20 мкл 2х буферу для лізису (100 мМ Ттгі5 НС, рН 8,0,2 мМ ЕОТА, рН 8,0,1 95 505, 400 мкг/мл протеїнази К). Лізис проводили в таких умовах: 55 "С протягом 30 хвилин, 94 "С протягом 4 хвилин. Аліквоту лізисного продукту використовували як джерело матричної ДНК для ПЛР- ампліфікації. Послідовність 165 рРНК ампліфікували за допомогою ПЛР-реакції з праймерами

М13-27Е (ЗЕО ІЮ МО:17) і 1492 М13-хвіст (ЗЕО ІЮ МО':18).

Для ампліфікації ділянки 165 рРНК кожну ПЛР-суміш готували в реакційній суміші з кінцевим об'ємом 20 мкл, що містила 4 мкл із реакційної суміші бактеріального лізису, 2 мкМ кожного праймера (27Е/1492К), 6 956 Гуееп-20 і 10 мкл 2х ІттомМіх (Віоїїпе ОА Іпс, Таипіоп, МА). ПЛР- реакцію проводили в таких умовах: 94 "С протягом 10 хвилин; 94 "С протягом 30 секунд, 527 протягом 30 секунд, 72 "С протягом 75 секунд протягом 30 циклів; 72 "С протягом 10 хвилин. 2- мкл аліквоту ПЛР-продукту поміщали на 1,0 95 агарозний гель для підтвердження одиничної смужки очікуваного розміру. Позитивні смужки спрямовували на секвенування за Сенгером у прямому і зворотному напрямках з М13 праймерами. Послідовності 165 рРНК бактеріальних штамів 5051-014-С206, 5051-005-5408, 501-014-501, 501І-015-Р03 і 5061І-015-НОбЄ мали довжину приблизно 1,4 КЬ і представлені в Переліку послідовностей під номерами 5ЕО ІЮ МО-1, 10, 12, 13 ї 14 відповідно. Дослідження гомології для певних нуклеотидних послідовностей проводили за допомогою бази даних ООВО/зЗепВапк/ЕМВІ.. Після цього за допомогою програми СіІиетаІмМу/ побудови філогенетичного дерева аналізували філогенетичний взаємозв'язок нуклеотидної послідовності 16 рРНК генів у групі, що складається із описаних тут виділених бактеріальних антагоністів, бактерій родів і видів, які демонструють великі гомології послідовностей з виділеними бактеріальними антагоністами, та інших різноманітних бактеріальних родів і видів.

Ідентичність послідовностей і подібність визначали також за допомогою програми

СепотеОцеві м ((зепе-ІТ, М/огсевівї Мавх5. ОБА). Результати аналізу послідовностей показали, що бактеріальний ізолят 5051-014--5301 може вважатися спорідненим з родом Маїгомогах на основі 99 95 подібності його 165 рРНК послідовності з такими у декількох видів Магіомогах, бо включаючи Магпомогах. В-21938 (СепВапк А.)786799) і Мапомогахрагадохиз (СепВапк

С2І186109), 165 рРНК послідовності яких демонструють очевидну спорідненість 3 видом

Матіомогах. Крім того, результати аналізу послідовностей показали, що два бактеріальні ізоляти

ЗИІ-015-603 і 501-015-НОбЄ можуть вважатися спорідненими з родиною Васіїїасеає на основі »99 95 подібності їхніх відповідних 165 послідовностей таким у декількох видів ВасіПив5.

Результати аналізу послідовностей показали, що два бактеріальні ізоляти 501-014-С06 і

З0І-055-508 можуть вважатися спорідненими з родиною Місгобасієпасеає на основі »99 95 подібності їхніх відповідних 165 послідовностей таким у декількох видів Місторасієгішт. А саме 1430 нт послідовність 165 рРНК гена 501-014-С06 (5ЕО ІЮ МО:1) є ідентичною 165 рРНК гена штаму ОМ 20578 Місгобасіегішт охудапз і декількох інших штамів Містобрасієгійт (наприклад, послідовностям У17227.1, ЕОУ200406, Е0О086800 і ЕЄО714335 із СепВапк) на всій 1430 нт довжині.

Зокрема, серед тисяч мікробних штамів, які були виділені і протестовані на здатність пригнічувати розвиток Ризалит в аналізі на антагонізм, як описано у Прикладі 1, вісімдесят вісім штамів були надалі ідентифіковані як вид Місторасієгцшт на основі подібності їх 165 послідовностей таким у відомих видів Містобрасієгішт. Але авторами було встановлено, що супресорну активність проти Ризагійт дгатіпеагит мали тільки два штами - 5(023І1-014-С06 і 561- 055-208 Місгобасієгішт. Як зазначалося вище, сьогодні є повідомлення про існування декількох родів мікробів природного походження, які мають антагоністичну активність проти фузаріозу.

Але до появи даного винаходу не було повідомлень про мікроорганізми роду Мусобасіегіит, які мають антагоністичну активність. Крім того, до появи даного винаходу його авторам не були відомі способи або процеси, в яких би використовувався бактеріальний штам роду

Мусовбасієгіцт як агент біоборотьби для запобігання, інгібування або лікувальної обробки проти розвитку патогену, що є збудником фузаріозу.

Приклад 3. Аналіз послідовностей обов'язкових генів з ізоляту 5051-014-С206

Нещодавно в роботі ІКіснегі єї аї. узі. Аррі. Містобіо!. 30:102-108, 2007| повідомлялося про філогенетичні дослідження декількох обов'язкових генів із 27 видів роду Місторасієгішт. В цих дослідженнях був зроблений висновок про те, що хоча можливості, які надає аналіз 165 рРНК послідовностей для систематичної таксономії, є неперевершеними, фокусування уваги лише на одному таксономічному параметрі не приведе до систематичних висновків. Як зазначалося вище, нуклеотидна послідовність 165 рРНК гена штаму 501І-014-6206 (5ЕБЕО І МО) є ідентичною 165 рРНК гена декількох штамів Місторасієйцт, включаючи нуклеотидну послідовність 165 рРНК гена штаму О5М 20578 Місгобасіейуцт охудапв5, який був включений у дослідження (Кіспегї єї аї. (2007) (сепВапкК Ассеззіоп У17227.1)). Автори винаходу поширили філогенетичний аналіз ще на чотири обов'язкові гени ізоляту 501-014-С06, якими є субодиниця

В ДНК-тгірази (дув), субодиниця В РНК-полімерази (гроЄ), рекомбіназа А (гесА) і поліфосфат- кіназа (ррК). В напрямку цього кінця весь геном ізоляту 501-014-С06 був секвенований методом "шотган", зібраний та анотований відповідно до методик, описаних у заявці |РСТ Раїепі

Арріїсайоп Мо. УМО2010115156А21. Геномна ДНК була приготована зі свіжої культури 501-014-

СОоб. Для екстрагування високомолекулярної ДНК використовувались клітинна гранула і комплект для відокремлення ДНК ОйгаСівєапе Меда 5ойї ОМА ІзоїЇайоп Киї (Саї Мо 12900-10) виробництва фірми МО ВІО І абогацогієв5, Іпс. згідно з протоколом, рекомендованим виробником.

Після цього була приготована геномна ДНК із 501-014-С06 для "шотган" 454-піросеквенування.

Геномна ДНК (7,5 мкг) використовувалася для конструювання бібліотеки відповідно до рекомендованого протоколу (454 | Ше 5сіепсе5) для поодиноких довгих ридів. Послідовності були генеровані за два послідовні проходи секвенування 5 РІ Х Тпапішт.

Отримані послідовності чотирьох обов'язкових генів дугВ, гроВ, гесА, апарркК ізоляту 5ОІ- 014-С06 наведені в Переліку послідовностей. Дослідження гомології для певних нуклеотидних послідовностей проводилися за допомогою бази даних ЮОВОХзепВапк/ЕМВІ. Ідентичність послідовностей і подібність також визначались за допомогою програми сСепотеОпцеві "м ((Зепе-

ІТ, ММогсевіег Ма55. БА). Нижче більш детально показано, що результат секвенування обов'язкових генів виявив новизну описаного тут ізоляту 5З0І-014-С0О6б, який є новим бактеріальним штамом і може вважатися спорідненим із родиною Містгорасієгіасєавє.

Полінуклеотидна послідовність гена дутВ штаму 501І-014-С06 має найбільшу ідентичність з послідовністю гена ду(В штаму Містобрасієгішт їезіасешт з номером доступу АРО12052 в

СепВапк (82,69 95 за вирівнюванням 936/2172 нуклеотидів). Порівняно з геном дугВ штаму ОБМ 20578 Місторасієйцт охудапе |СепВапк АМІ 81493; Вісней єї аїЇ., 2007), гомології послідовностей між цими двома генами були на «-62 95 ідентичними на нуклеотидному рівні і на -37 95 ідентичними на амінокислотному рівні.

Полінуклеотидна послідовність гена гроВ штаму 501І-014-С06 має найбільшу ідентичність з послідовністю гена гроВ штаму Місгорасіегішт птагйурісит з номером доступу АМ181582 в бо СепеВапк (96,98 95 за вирівнюванням 1093/3504 нуклеотидів). Порівняно з геном гроВ штаму

ОМ 20578 Місгорасієтійт охудапе І(СепВапк АМ181583; Віснеп еї аї., 2007), гомології послідовностей між цими двома генами були на «96 95 ідентичними на нуклеотидному рівні і на 99 95 ідентичними на амінокислотному рівні.

Полінуклеотидна послідовність гена гесА штаму 501-014-С06 має найбільшу ідентичність із послідовністю гена гесА штаму Місгорасіегішт їезіасешт з номером доступу АРО12052 в

СепеВапк (85,45 95 за вирівнюванням 962/1188 нуклеотидів). Порівняно з геном гесА штаму

ОМ 20578 Містгорасієйцт охудапе (ІСепВапк АМ181527; Вісней єї аї., 2007| гомології послідовностей між цими двома генами були на «92 95 ідентичними на нуклеотидному рівні і на 100 95 ідентичними на амінокислотному рівні.

Полінуклеотидна послідовність гена ррк штаму 501І-014-С06 має найбільшу ідентичність із послідовністю гена ррК штаму Місгобасіегічт Ішеоїшт з номером доступу АМ181554 в сСепВапк (91,38 95 за вирівнюванням 1380/2175 нуклеотидів). Порівняно з геном ррК штаму О5М 20578

Місторасієгійт охудап5 |бепВапк АМ181556; Віснен еї аї., 2007 гомології послідовностей між цими двома генами були на «91 95 ідентичними на нуклеотидному рівні і на 98 95 ідентичними на амінокислотному рівні.

ПРИКЛАД 4. Захист пшениці від інфекції Ризагішт дгатіпеагит за допомогою мікробних антагоністів Місгорасіегійт. (МКК В-50470) МусорпаеєгеїПІа. (МАК. 50471) і Магіомогах. (МКК. В- 50469)

Описані у Прикладі 1 мікробні штами, які продемонстрували позитивну пробу на антибіоз у скринінгу за антагонізмом, були піддані біовипробуванням на рослинах, в яких клітини мікробних штамів наносилися безпосередньо на насінини сприйнятливої зернової культури з наступною інокуляцією конідіальними спорами гриба Р. дгатіпеагит. Мікробні штами вирощувались до достатньої мутності і розбавлялися у воді. Два грами насіння пшениці сприйнятливого сорту (НапкК; УмезіВгеа Г1С, Волетап, МТ) висівали в однолітрові горщики з пастеризованим грунтовим середовищем. Після висівання поверх насінин розподіляли 20 мл розчину мікробної культури. Насінини пшениці витримували в тепличних умовах для пророщування під флуоресцентним освітленням протягом 14 год. фотоперіоду. На початку цвітіння колос пшениці піддавали зараженню шляхом розпилення конідіальних спор МАКНІ 5883 РЕ. дгатіпеагит.

Конідіальні спори збирали з КДА-планшетів п'ятиденного віку шляхом виливання на планшети

Зо води з 0,01 95 Тмееп 20 і зскрібання спор у суспензію. Після розпилення спор пшеничні рослини переносили в туманну камеру з 100 95 вологістю і витримували в ній протягом трьох днів для інфікування. Таким чином готували такі зразки: 1. Необроблені зразки: без обробки мікробним або хімічним фунгіцидом ї- зараження

Еизатлит. 2. Неінфіковані зразки: без обробки мікробним або хімічним фунгіцидом, без зараження

Еизатлит. 3. 5(03І1-010-Н11: грибна обробка я зараження Ризапит. 4. 5(3І1-014-С2401: бактеріальна обробка я зараження Ризагтійт. 5. 501І-014-С06: бактеріальна обробка ї зараження Ризагпт.

Через двадцять днів після інфікування зрошення припиняли, і пшеничним рослинам давали висохнути протягом трьох тижнів перед збором врожаю. Потім кожний колос пшениці зрізали і збирали індивідуально. Тяжкість хвороби визначали для кожного колоса, що мав симптоми фузаріозу. У числовому вираженні тяжкість хвороби визначали шляхом ділення числа уражених колосків на загальне число колосків, що припадало на один колос. Одержані результати (Табл. 2) показали, що пшениця, оброблена будь-яким із трьох мікробних антагоністів 5651-014-206 (МАВ В-50470), 501-010-Н11 (МКК 50471) і 505І-014-С2401 (МАВ 8-50469), мала значно менші тяжкість хвороби і кількість заражень ЕРизагішт дгатіпеагит, ніж "необроблений" контроль, вирощуваний в тих же умовах (Р « 0,05).

Насінини з кожного колоса збирали вручну і зважували. Визначали середню вагу насінин на горщик і в кожному режимі обробки. Як показано в Табл. 3, всі мікробні антагоністи дали значне зниження втрат врожаю, зумовлених інфікуванням фузаріозом.

Таблиця 2

Ефективність мікробних антагоністів у зниженні кількості випадків захворювання пшениці фузаріозом /о відхилення

Таблиця З

Ефективність мікробних антагоністів у збереженні виходу насіння в пшениці, зараженій фузаріозом

Приклад 5. Інгібування росту Ризагійт агатіпеагит мікробними антагоністами на сіянцях пшениці

Мікробні штами, які продемонстрували супресорну активність проти Е. дгатіпеагит в лабораторному тесті на антагонізм, були досліджені також на їх здатність знижувати захворюваність насінин пшениці фузаріозом. Насінини сприйнятливого сорту пшениці (Напк;

УмезіВгеа Г.С, Во7етап, МТ) висівали в однолітрові пластмасові горщики діаметром 20 см з пастеризованим грунтовим середовищем. Мікробні клітинні суспензії готували таким чином. 2УТ або інше подібне поживне середовище інокулювали бульйонними культурами із матричних гліцеринових розчинів ізолятів або штрихових планшетів. Як правило, культури ініціювались за 48-72 год. до поміщення їх в камеру для культивування, теплицю або на поле, де вони досягали пізньої експоненціальної фази росту. Ізоляти з більшим часом подвоєння ініціювались, крім того, заздалегідь. Культури інкубували при 30 "С на роторному шейкері при 200 об./хв. Після культивування, клітини формувались у гранули 10000 хг протягом 15 хв. при 4"сС і ресуспендувались в 10 мМ М95О.4 буфері (рН 7,0). Густину клітин нормували для кожного ізоляту в одиницях КУО/мл (клітиноутворювальні одиниці на мілілітр). Як правило, готували 109 КУО/мл суспензії для кожного ізоляту, яку доставляли до місця інокуляції на льоду.

Інокуляцію проводили шляхом розбавляння цих клітинних суспензій у співвідношенні 1/20 в іригаційній воді до кінцевої густини 5 х 107 КУО/мл. У дослідах з однолітровими горщиками, 20 мл цієї розбавленої клітинної суспензії рівномірно розподіляли по культиваційній поверхні кожного горщика. В експериментах в мікрогорщиках клітинні суспензії не розбавлялися, і 1 мл кожної 109 КУО/мл суспензії поміщали за допомогою піпетки на культиваційну поверхню кожного горщика подібно до обприскування зверху занурених насінин. Насінини і рослини витримувались у теплиці при кімнатній температурі з 14 год. фотоперіодом освітлення.

Міцелій штаму МАНІ-5883 виду ЕРизагпйцт дгатіпеагпит вирощували на КДА-планшетах протягом 5 днів при безперервному освітленні. Гіфи і конідії збирали шляхом виливання декількох мілілітрів стерильної води (0,01 95 Тмееп 20) на планшети і зскрібання поверхні агару

Зо стерильним шпателем. Концентрація спор в інокуляті складала приблизно 2 х 105 спор/мл, але концентрація гіфального фрагмента не визначалася.

Інокуляцію видом РЕ. дгатіпеагит починали після виходу коротких пагонів із насінин і повторювали кожний другий вечір упродовж 10 днів. Інокулят Е. дгатіпеагит наносили шляхом розприскування в кількості приблизно 30 мл на горщик. Одразу після інокуляції рослини кожний раз обприскували зверху за допомогою туманоутворювача. Коли використовували хімічний фунгіцид, його готували шляхом розбавляння 2 мл фунгіцидного маточного розчину (Ваппег

Махх, зупдепіа) в 1 л дистильованої води і наносили за допомогою розприскувача в кількості приблизно 30 мл на горщик.

Фузаріозне ураження оцінювали ступенем інфікування Ризагішт, який визначали числом колонієутворювальних одиниць Еизапйцт на грам (КУО/; рослинних тканин. Всі операції обробки виконувались в чотирьох блоках по чотири горщика в кожному блоці. Проводились такі види обробки: 1. Необроблений: без обробки мікробним або хімічним фунгіцидом ж зараження Еизагійт. 2. Неінфікований: без обробки мікробним або хімічним фунгіцидом і без зараження

Еизатлит. 3. Фунгіцид: обробка хімічним фунгіцидом ж зараження Ризагійт. 4. 5(3І1-010-Н11: грибна обробка я зараження Ризапит. 5. 501І-014-501: бактеріальна обробка я зараження Ризагт. 6. 501І-014-С06: бактеріальна обробка ї зараження Ризагпт.

Одержані результати, які подані в Табл. 4, показали, що всі три мікробні обробки дали значне зниження тяжкості фузаріозу порівняно з неінфікованим контролем. Зокрема, два мікробні антагоністи, 501-014-С06 і 501І-010-НІ11, значно знизили інфікування пшениці видом

Еизатішт дгатіпеагит порівняно з необробленим контролем, вирощуваним в таких же умовах.

Захист пшениці від Ризагійт-інфікування, здійснюваний будь-яким із двох мікроорганізмів - 5(1- 014-С0О6 або 501-010-НІТ1, - був статистично порівняним із захистом комерційним хімічним фунгіцидом. У випадку використання мікроорганізму 5051-014-501 захист пшениці від РГизагійт- інфікування був набагато менш помітним, а його ефективність суттєво змінювалася від одного культиваційного горщика до другого.

Таблиця 4

Дія мікробних антагоністів на інфікування грибом ЕРизагійт.

ПРИКЛАД 6. Культивування і зберігання мікробних антагоністів

Вид МусозрпаєгеїЇІа. Для зберігання виділеного гриба як чистої культури використовували декілька способів, в одному із яких застосовували фільтрувальний папір. В іншому випадку після культивування гриба на КДА його розрізали на маленькі квадрати, які поміщали у флакончики з 15 95 розчином гліцерину і зберігали в них при -70 "С. В аналогічному досліді цей гриб зберігали при 4 "С, але не в гліцерині, а в дистильованій воді. Проте, одним із переважних

Зо способів було зберігання на інфікованому стерильному насінні ячменю при -80 "С.

Види Васіїш5, Містобасієгішт і Магіомогах. Виділені бактерії зберігались як чиста культура.

Бактеріальну колонію переносили у флакончик із рідким бульйонним середовищем К2А (ТесКпома) і культивували в ньому при 30 "С на шейкері при швидкості 250 об./хв. протягом двох днів. Після цього культуру переносили у флакончики з 15 95 розчином гліцерину і зберігали в них при -80 "С.

Приклад 7. Обробка для продукування спор і нанесення покриття на насіння

Продукування спор. Відповідно до типової методики продукування спор один літр поживного середовища 2хУТ (16 г/л триптону, 10 г/л дріжджового екстракту, 5 г/л масі) інокулювали стартерною культурою в кількості 5 мл або зскрібком чашки Петрі та інкубували протягом ночі при 30 "С в ротаційному шейкері при швидкості 225 об./хв. Бактеріальні клітини гранулювали шляхом центрифугування і промивали їх ЗФР буфером (8 г/л Масі; 0,2 г/л КС1; 1,44 г/л

МагНРО»; 0,24 г КНгРО»; рН 7,4). Клітини ресуспендували у середовищі СОЗМ ІНадетанп 6ї аї, у).

Васіепо!., 438-441, 1984) і культивували ще протягом чотирьох ночей при 30 "С в ротаційному шейкері. Споруляцію в бактеріальній культурі контролювали щоденно за допомогою фазоконтрастного мікроскопа доти, поки не утворювалась вся культура із вільно плаваючих спор. Період такого інкубування, як правило, не перевищує чотирьох днів або ж триває більше шести днів, залежно від вирощуваного виду. Під фазоконтрастним мікроскопом ендоспори видно усередині клітин у вигляді яскраво-білих сплющених сфероїдів. Бактеріальні спори гранулювали шляхом центрифугування в режимі 10000 х г протягом 15 хвилин, двічі промивали стерильною анеоО і, в разі потреби, концентрували до 50 мл. Приготовані таким способом спори могли або одразу використовуватися, або охолоджуватися для майбутнього використання.

Концентрацію спор вимірювали згідно з методикою ОЮвоо. Ця методика, як правило, давала щонайменше 2000 00 бактеріальних спор.

Зокрема, було встановлено, що декілька бактеріальних штамів відповідно до даного винаходу, наприклад, 5(01І1-015-03 виду Васійц5, можуть продукувати великі кількості спор після 4 днів інкубації з простою інокуляцією великою стартерною культурою (415 мл), що росла протягом ночі, в ї л 2х 50 поживного середовища з наступною 4-денною інкубацією при відповідній температурі в ротаційному шейкері в режимі 225 об./хв. У досліді використовувалося поживне середовище 2 х 50 такого складу: 16 г/л поживний бульйон; 0,25 г/л МадаЗО»х; 2,0 г/л КСІ; 0,15 г/л Сасі».2Нго; 0,025 г/л МпсСі».2Нго; 0,28 мг/л Ре5оО4-7Нго; 1,0 г/л декстрози.

Нанесення покриття на насіння пшениці і кукурудзи. Проводили невеликий експеримент з обробки насіння згідно з мінімально модифікованою методикою, описаною в ІЗидіхпа еї аї., 2009). В експерименті готували маточний розчин біополімеру шляхом додавання 6 г порошку гуміарабіку (МР Віотеайїсаї) в 36 мл води в 50 мл пробірці Раїсоп і наступного перемішування до досягнення гомогенності за допомогою колісного міксера. Для перемішування великих кількостей оброблюваного насіння, де необхідно, використовували змішувальну плиту.

У тих випадках, коли використовували рослинні клітини, мутні культури мікробних клітин, що активно росли, промивали ЗФР (забуференим фосфатом фізіологічним розчином) і доводили до ОЮвоо 75,0. В альтернативному варіанті мікробні спорові суспензії готували так, як описано вище. Бактеріальні спори і/або рослинні клітини ретельно ресуспендували в «32 мл гуміарабік- біополімерного маточного розчину, приготованого так, як описано вище, і одержану суспензію ретельно перемішували в 1 л пляшці. У пляшку додавали приблизно 400 г насіння (пшениці або кукурудзи) та інтенсивно перемішували на шейкері або вихровому струшувальному пристрої до досягнення рівномірного розподілу гумі/клітинної суспензії. Потім покриті насінини розподіляли на пластмасових блюдцях для сушіння в ламінарному потоці до усунення липкості, у загальному випадку, протягом 3-6 год. з періодичним перемішуванням. В деяких випадках, покрите спорами насіння можна сушити протягом ночі. Але насіння, покрите вегетативними культурами, як правило, відправлялося на зберігання до того, як воно повністю зневоднювалося. Тест на життєздатність, якому періодично піддавалися мікроби, використовувані в препаратах покриття на насінні, показав, що ці мікроби зберігали життєздатність протягом, щонайменше, трьох місяців. Швидкість проростання покритих насінин була практично ідентичною швидкості проростання непокритих контрольних насінин.

Приклад 8. Вплив мікробної обробки насіння на розвиток фузаріозу в пшениці

Насінини сприйнятливого до фузаріозу сорту (КВО7) пшениці покривались мікроорганізмами 50І-014-СО6, або 501І-015-503, або 501-015-НОб згідно з методикою, описаною у Прикладі 8.

Покрите насіння висівали в 1 л горщики з пастеризованим грунтовим середовищем |((Меїготіх-

Міх 200; Зсойвг-зіегта Ногпісинига! Ргодисів, МагубхміМПе, ОН; і З грами добрива 14-14-14 (М-Р-К)).

Горщики засівалися по 7-8 рослин в кожному, після чого у фазу росту 3-го листа їх засівання зменшували до 5 рослин на горщик. Горщики об'єднували у рандомізовані блоки по 5 горщиків на обробку. Далі покриті насінини ставили для проростання в тепличні умови з фрлуоресцентним освітленням протягом 16 год. на добу. Коли почалось квітіння пшениці, її шляхом розприскування на колос заражали макроконідіальними спорами штаму МАККІ 5883 виду ЕК. дгатіпеагит в концентрації 100000 спор/мл. Після розприскування спор пшеницю поміщали в кліматичну камеру з 100 9о вологістю й утворюванням роси, і витримували в цих сприятливих для інфікування умовах протягом трьох днів. Проводили такі види обробки зразків: 1. Необроблений: без мікробної або хімічної фунгіцидної обробки ї зараження Ризагпт. 2. З(3І1-014-С06: бактеріальна обробка насінин ж зараження Еизагійт. 3. 5(3І1-015-603: бактеріальна обробка насінин т зараження Ризагпит. 4. 5(3І1-015-НО6: бактеріальна обробка насінин ж зараження Еизагійт.

Тяжкість фузаріозу оцінювали візуально на десятий день і двадцять перший день після інфікування. Ступінь інфікування визначали для кожного колоска, що виявляв симптоми фузаріозу, й обчислювали відсоток симптоматичних колосків, тобто помножене на 100 число колосків, які демонстрували симптоми фузаріозу, ділили на загальне число колосків. Одержані результати (Табл. 5) показали, що насінини пшениці, покриті будь-яким із трьох тестованих мікробних антагоністів - 50І1-014-С506, 50211-015-603, 501І-015-НОб, -- мали значно знижений ступінь інфікування грибом ЕРизапйцт дгатіпеагит порівняно з "необробленим" контролем, вирощуваним в таких же умовах (Р « 0,05).

Таблиця 5

Розвиток симптомів фузаріозу в пшениці після обробки насінин антагоністичними мікроорганізмами тенти нення | НЕ інфікування

Приклад 9. Біоборотьба з фузаріозом пшениці в тепличних випробуваннях

Кожний із мікроорганізмів 50І1-014-С06, 5(03І1-015-Р03 ї 501І-015-НОбЄ тестували в тепличних випробуваннях більшого масштабу. Випробування проводили в "теплиці для культивування рослин" (РОСЕ: ріапі дгоули сопіаійптепі гоот) при фірмі Зупіпеїййс Сепотісв, Іпс. і включали такі види лікувальної обробки: інфікований контроль, неінфікований контроль, а також обробку промисловими фунгіцидами чотирьох марок. Серед них були: хімічні фунгіциди марок Ваппег

МАХХФ (Зупдепіа) з концентрацією 2 мл/л і РгозагоФ (Вауег Сторзсіепсе) з концентрацією З мл/л, які наносились шляхом розпилення на листя відповідно до рекомендацій виробника, і біологічні фунгіциди марок АсіїпомаїеФ (Маїшига! Іпдивігіев) і КПігомйакш (АВІТЕР Отрьн), які наносились шляхом обприскування грунту також відповідно до рекомендацій виробника.

Препарат для мікробної обробки наносили або шляхом обприскування грунту, або шляхом покриття насінин. Коли мікробну обробку проводили шляхом обприскування грунту, клітинні суспензії кожного мікроорганізму індивідуально наносили на насінини перед покриттям їх великою кількістю поживного середовища. Для цього свіжоприготовані культури гранулювали, видаляючи з них поживні речовини, і повторно суспендували в 10 мМ сульфат-магнієвого (М9505) буферу. Після цього клітинні суспензії додавали методом піпетування і рівномірного розподілу 20 мілілітрів суспензії по насінинах при загальній кількості «109 клітин на горщик. У випадку мікробної обробки шляхом нанесення покриття на насіння, мікроорганізми (клітини/спори) готували по суті так, як описано вище, у Прикладі 8. Покриття на насінини наносили шляхом введення в клітинну суспензію розчину гуміарабіку і таким чином створення липкої суміші для наступного нанесення її на насіння. Після цього мікробне покриття насінин просушували, в результаті чого утворювався твердий, але водорозчинний біополімер, що захоплював мікроорганізми (клітини/спори). Мета цих маніпуляцій полягала в тому, щоб забезпечити титр клітин щонайменше 109-107 життєздатних клітин/насінину. В цьому тепличному експерименті покриття на насінини наносили за день до посіву.

Для кожного виду обробки було передбачено чотири однакові комплекти зразків, розміщених за рандомізованою повноблочною схемою проведення експерименту (КСВО:

Зо Капдотілеа Сотріеїе Віоск Оезідп) на трирівневих поличках, розташованих двома рядами уздовж бічних стін теплиці. Полички були обладнані флуоресцентною системою освітлення (Адгозип, 5850К), яка забезпечувала освітленість в середньому 800 мкмоль, виміряну на поверхні горщика. Кожний комплект зразків складався із чотирьох нерухомо установлених 1 л горщиків. Горщики наповнювали штучним поживним середовищем, що складалося із поживного середовища Агарідорзіз Сгоулп Меадішт АЇ!З (від фірми І епіе Зеєав5) на основі трав'янистої рослини Агабідорбвів і грубого промитого піску в об'ємному співвідношенні 3:1. В усіх горщиках за поверхні поживного середовища розподіляли по два грами насінин ярової пшениці (Напк,

УмезіВгед). Горщики мали донну подачу води з підтримуванням -2 см рівня води і візуально контролювалися на проростання і ріст.

У фазу цвітіння (за системою ідентифікації росту і розвитку зернових культур РеекКез 10.5.1) колос пшениці інфікували розпилюванням суспензії конідіальних спор Ризагішт дгатіпеагит.

Для цього тепличного експерименту спори грибів готували шляхом посадки гомогенізованого міцелію штаму МКК! 5883 Р. дгатіпеагит на великі КДА-планшети і наступної п'ятиденної інкубації в умовах безперервного освітлення при кімнатній температурі. Після цього грибні спори збирали шляхом заливки планшетів магній-сульфатним буфером (10 мМ Ма5о5; 0,01 95

Тмееп 20) і зскрібання поверхні агару стерильним шпателем. Після регулювання концентрації спор їх в кількості приблизно 50000 конідіальних спор на один колос наносили на рослини за допомогою ручного розпилювача. Відносну вологість у теплиці підвищували до 9095 і витримували протягом трьох днів для інфікування, а потім повертали на нормальний рівень.

Після того, як насінини пшениці зав'язувались, подачу води припиняли і колоскам давали можливість повністю висохнути. Потім колосся пшениці по одному збирали. Тяжкість захворювання визначали для кожного колоса, який мав симптоми фузаріозу, шляхом підраховування кількості уражених колосків і ділення її на загальну кількість колосків, що припадала на один колос. Одержані результати (Табл. 6) показали, що пшениця, оброблена будь-яким із трьох тестованих мікробних антагоністів, 551-014-206, 5(3І1-015-Е03, 5С01І-015-НОб, мала значно меншу тяжкість і кількість інфікацій Ривагшт дгатіпеагит порівняно з "необробленим" контролем, вирощуваним в таких же умовах (Р«0,05).

Таблиця 6

Ефективність мікробних антагоністів у зменшенні захворюваності пшениці фузаріозом.

Чнфіковваний 77771717 372398 |7777777777711000сС1С

Для визначення виходу насіння кожний колос пшениці зрізали вручну, насінини збирали й очищували від лузги та інших детритів, підраховували і зважували. Загальний вихід насіння визначали як загальну масу насіння, одержаного від рослин в 16 горщиках для кожного виду обробки. Як показано в Табл. 7, всі три тестовані мікробні антагоністи продемонстрували суттєве збереження виходу насіння, тобто втрати насіння, зумовлені фузаріозною інфікацією, були значно знижені.

Таблиця 7

Ефективність мікробних антагоністів у збереженні виходу насіння пшениці, ураженої фузаріозом.

Необроблений.//-/-:////1777777171717171111305777777111Ї711111111111111000сСсС1С

Таким чином, обробка пшениці будь-яким із розглянутих мікроорганізмів дозволила помітно запобігти втратам виходу насіння, які спричиняються інфікуванням грибом Ризагішт. Зокрема, пшениця, оброблена будь-яким із штамів 505І-014-С06 або 501І-015-03, продемонструвала суттєве покращення загального виходу насіння, тобто 110 95 ї 120 95 відповідно порівняно з неінфікованим контролем. На противагу цьому, комерційні фунгіциди марок АсііпомаїетФф),

КПпігомійакю і РгозагоФ не показали суттєвого захисту врожаю обробленої ними пшениці від втрат, зумовлених інфікацією грибом Ризагт.

Приклад 10. Біоборотьба з фузаріозом пшениці в польових умовах

Антагоністичні мікроорганізми, які виявили свою супресорну активність проти патогену

Е. дгатіпеагит і фузаріозу в аналізі на антагонізм іп міо і в тепличних дослідженнях, описаних

Зо у Прикладах 4-9, досліджуються і далі в серії польових випробувань у різних місцях Сполучених

Штатів. Деякі експерименти проводяться на сільськогосподарських площах, які використовуються для мікробіологічної боротьби з фузаріозом пшениці в умовах природного інфікування цим захворюванням. В цих випробуваннях використовуються сорти пшениці, чутливі до зараження грибом Р. дгатіпеагит. При цьому пшеницю, оброблену різноманітними методами, висівають на невеликих ділянках у 12 рядків завдовжки приблизно З метри. Проміжок між рядками становить приблизно 20 см. Оброблені ділянки в кожному експерименті виносяться в рандомізовану блочну схему. Оцінюється також ефективність різноманітних композицій зі змочуваних порошків, які містять мікробні антагоністи згідно з винаходом, у зниженні тяжкості і кількості випадків інфікування фузаріозом. В цих експериментах мікробні антагоністи оцінюються як індивідуально, так і в комбінаціях.

Крім того, проводиться оцінка антагоністичних мікроорганізмів у різноманітних покриттях на насінинах і/або в польових умовах, де мікробні суспензії наносять безпосередньо на пшеничне колосся у фазу цвітіння. В кожному із цих експериментів мікроорганізми оцінюються на ідентичних ділянках. При цьому можуть використовуватися антагоністи, патогени і методи аграрного виробництва, описані у Прикладах 4-9.

Нанесення покриття на насіння. Окрім способів нанесення покриття на насіння, описаних вище у Прикладі 7, можуть застосовуватися найрізноманітніші відомі технології і препарати для обробки насінин пшениці мікробними антагоністами, наприклад, описані в роботах |Регпапао єї а!, 2002; Веїо єї аї!., 2002; Кіт еї аї, 1997). У загальному випадку насінини пшениці спочатку зволожують і витримують при кімнатній температурі для ініціації проростання. Перед висіванням пророслі насінини можна занурювати в мікробні суспензії. |Інокулювання патогенних спор можна проводити до бактеріальної інокуляції або після неї. Способи готування антагоністів, патогенов і рослин для такої обробки насінин можуть бути такими, як описано у

Прикладах 4 і 5.

Оцінка тяжкості захворювання і виходу насіння. Антагоністи піддаються подальшим оцінкам в тепличних умовах на їх супресорну активність проти фузаріозу на пшениці та ячмені у фазу цвітіння за допомогою найрізноманітніших способів і методик, включаючи описані, наприклад, в

Ібспізієгї, Ріапі ОРізеазєе, Мо! 86(12), 1350-1356, 2002; ЗсНівіег єї аї. Віоіодіса! Сопігої, 39:497- 506,2006; апа Кнап апа Ооонап, Віоіодіса! Сопігої, 48:42-47,2009|. В одному із таких експериментів інокуляти штаму (Сі. 76єає готують на стерильній, жовтозерновій кукурудзі, як

Зо описано в (Кап еї а!. Віоіодіса! Сопігої, 29:245-255, 2004). Повністю колонізовані ліпідні культури (48-година культивація) мікробних штамів розбавляють до однієї четвертої концентрації фосфатним буфером. Кінцеве число КУО на мілілітр для антагоністичної обробки складає від 1 х 109 КУО/мл до б х 109 КУО/мл. Після цього до квітучого колосся пшениці застосовують обробку суспензіями за допомогою СОг ручного розпилювача. Обробку, як правило, проводять після заходу сонця для зниження до мінімуму можливу УФ-деградацію антагоністичних клітин.

Готують 5 реплікатів (груп зразків-копій) на одну обробку, які вносять у рандомізовану блок- схему. Першим контролем обробки є рослини, оброблені буферним розчином. Другим контролем обробки є необроблені рослини. Оцінку тяжкості інфікування і захворюваності фузаріозом в польових умовах проводять шляхом підрахунку 60 колосів на реплікат (тобто 300 колосів на обробку), де розвиток рослини відбувається від фази середньо-молочної стиглості і до фази м'якої воскової стиглості. Коли зерна досягають повної зрілості, колосся пшениці збирають вручну й обмолочують за допомогою молотарки марки АїЇтасо для одиничних рослин і колосів (АІтасо, ІА). Зразки зерен, одержані із кожного рядка реплікатів, оцінюють за вагою 100 зернівок. Дані стосовно тяжкості захворювання, захворюваності і маси 100 зернівок аналізують методом однофакторного дисперсійного аналізу (АМОМА).

Композиції, які містять мікробні антагоністи згідно з винаходом, індивідуально або в комбінації, демонструють значне зниження захворюваності. Ці результати є свідченням того, що біологічний метод боротьби за допомогою даних активних мікробних агентів може грати важливу роль у боротьбі з фузаріозом зернових рослин, таких, як пшениця.

Приклад 11. Розробка культиварів неприродного походження і програм їх селекціонування

Ендофітні мікроорганізми згідно з винаходом вводяться в культурні рослини, включаючи зернові культури, різноманітних генотипів і географічного походження. Але ще немає подібних їм ендофітних мікроорганізмів, з якими би можна було створювати рослинно-ендофітні комбінації з поліпшеними агрономічними характеристиками за допомогою методик, аналогічних методикам, відомим у даній галузі включаючи ті, що описані в (0.5. Раї Аррі. Мо. 20030195117А1; Ш.5. Раї. Аррі. Мо. 20010032343А1; і О.5. Раї. Мо. 7,084,331|. Таким чином, потрібні штучні рослинно-ендофітні комбінації можуть створюватися і селекціонуватися за програмою селекції і розробки культиварів на базі їхньої здатності утворювати і підтримувати мутуалістичну комбінацію, яка у підсумку дає агрономічний ефект. У такій селекційній програмі бо може використовуватися також рейтинг агрономічних характеристик даної комбінації. До цих характеристик можуть входити, наприклад, засухостійкість, акумулювання біомаси, стійкість до інфікування комахами, поїдання худобою (наприклад, травоїдними), легкість репродукції, вихід насіння та ін. Такі комбінації можуть розрізнятися за рівнем акумулювання мікробних метаболітів, що є токсичними для сільськогосподарських шкідників і бур'яну, включаючи рівні ергот-алкалоїдів, рівні лоліну, рівні пераміну або рівні лолітрему, і демонструвати при цьому потрібні агрономічні характеристики вирощуваних рослин, включаючи стійкість до інфікування або до поїдання комахами, стійкість до абіотичного стресу, поїдання худобою, акумулювання біомаси, легкість розмноження і вихід насіння тощо.

У даному описі розглянуто численні варіанти здійснення винаходу. Проте, абсолютно зрозуміло, що елементи цих варіантів можуть об'єднуватися в комбінації, утворюючи нові варіанти здійснення винаходу і його різноманітні модифікації, які залишаються в межах ідеї та обсягом даного винаходу. Отже, всі інші варіанти здійснення винаходу, його альтернативи й еквіваленти охоплюються обсягом винаходу відповідно до даного Опису і Формули винаходу.

Назва заявки дана виключно для полегшення сприйняття вмісту і жодним чином не обмежує обсягу винаходу та варіантів його здійснення.

Всі публікації і патентні заявки, згадані в даному описі, включені тут шляхом посилання такою ж мірою, як ніби кожна публікація або патентна заявка індивідуально зазначалася включеною шляхом посилання.

ПЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 шдУучЧтТнЕтТІС сЕМОМІСВ, ІМО. швАМОВІС, СНКІБТОРНЕВ. С.

СКЕЕМ, МАУМЕ А.

КкЕВОУЦО, мАММЕ 5,

МОСАМИЕ, КУАМ т.

Ти» композит І ТА СПОСОВБИиИ Для БОРОТЬБМ З ФУЗАВІСНОМ «1205 детішно-1Ко ««І8оОз п ет;511,457 «1515 2011-01- КУ «1505 18 «1705 патент у нЕертії 3.5 «10 4 «8112 1431 ил з «київ» ДАК «8135 Бид Міскорассетіцт «ж «221» разноманітні ознаки «823» БсІ бактеріальний изЗоблят 5сІ-014-006 «20 «8212 разноманітсні ознаки т тя лежсуттяєт ЛО ї т хіт ма «иа кодує Щоб рійоссмну РНК -ео» 1 азастЧасоадп сстрспсісавас всавкстсогаці сцвеватачода всавсдаацек боса

Зо чассачелос свасослоса девасаслья апсавсесгодпо ссестзасвос чодасаачс 12 сроЧаваєсоай сусстадтає гоупасабата всзруасоссЯс вче цоз бстозеавадча 182 аксксочесто псесчаєчадст стоззосссає сао сопеадатавак доастбассад, засасссасоа здпогачссяацо соцацвадоає спавссодоссас ассддапасо власаєсдасо

Зп савцастсста содпладчлова свпелдозлаа швттсчсдсаа пачпцеасавс соетзааровай свастостод боавспоасдасса ссапсспісслч добопавасс песвекадоа досоавзасваде 42 чаазасчаса пгзостіпсво аввавцедос сдчетаастат счодссацсас созспосаах 450 асцівусался сжлвловстбає ссосчвассає сСооподчіава сацсісоаосво дечасбасо

АД

Ччосесгсспа бслазосстЯ властосвасс поспцасстоде вас адаасо сопсзавлтатй во азтеуспоасва саЗваттот вастсстазпе пласт васасловтв парсаолаот засассовоч ссоуавассва вЕссссцазс сотвзвсса? пстдаасвачс Чазазоазеок й

Ччацовавсяа длобсачата сосгцасачс ссвсосолпта ааАсасоосвав всгазвкоати во

ФлІдтсосаєбтс свосдатосс сіласлсвос ївасцдсвлта вублосесото стддоадачта о салсесповва щшосаваяссоо вавозваєсоп всоппувссс деасавосяо садапсавоо з давссвзаєйос жзвопсавсцс сСавцавстоо досазвцосЕ дцасзстатасо вчзасозасеу за зсвавгоцлсос вассссссот всасосачсаз всвалісося свіча сс цсСсталоссооу

МН

1059 чксчклазви подача стаа діоссодсвас сацепсавсс стсрсясеставк чекдосачсв 1оно плтсавочася плосавссової бЧасвогцяс сдоруплосаасо соадацазазчо садова пли 1155 чісаваєсво ссвслесссосї аошосовозде шисастосає цесасавсоц ссоЗсвсааа топай 15. дластссвво авссссцазао стачславкс ставвавосс пуссссвзасг содастоаочх яд 1250 огусваєсто дассопсатоаа вп сзцачос счетвогаатс пеацабсачсо васастосує 1385 тдавтаслвє сосстоцістот діасасассо сшесодпсвазч сасчавежос Ффусласассх 1340 чаавчссечас ссбравссюе чіпцводав шпесасспаай Фчсадивисад пд

Якою же З ша ї- «2115 8177

ОО пи «вій?» дик «13» Бид МІісторашсекланн «ие» колі» різноманітні сзнаки «3» 5БІ бактеріальний ізоляжф Зі -918-С06 кора «вжі» різноманітні сзваки «23» 5ОБІ ген І БОіМмЕСссвоОооВЕ «ит». «хі» різноманісні знаки «ша» кодує пептидну поспідовність БЕ ТБ ОО З чиктссцооцд соузацзачея Зсідіссача влазластоод вчаслясдав пасесацдиаї бо тссустповос вссвссаціє ссосцаоазча сосйзадено спссласавовеа сессодазсасу з; 150 тасабецеци слапоцесво сосочасссс атстоосастопо соблоазацає сасодбзсаво 155 тескчїісцвсої вадосспцгоде вплеваслос авсовачахох всватсатесст довоебослас

ЗАД

ЕЕ дасацтчісз впусосясцда соссопошес сосвососга спседасатодав Чосоасосасо

ХВ пери нице дв ерЕе Ат ятки етю пат сви пан пу тісствассц спІдссцЧасоу сЗсстасаєсс ваадосоасасо ссападодав щсоеоосаче аа авсасЕспівсод саусвісвоЗзщ боластосає саслостася ссіестося дЧаксоасасго до ага тссчапосос жсувсзстода сшІусдвссоас содласавча сстаслодат песто 182 пасоудочцвос сеуадсасссо сасодасос спопойацаацс пуссчласос сесцзсбсвох па ссЧкісовоах вуувавсяалодча зсіцечезис вистчсваФфу сзссуссчо сподастсоцє ог щв-У енатов ання тини я кричу ит пе пи тини те дечут вне кети я у ція зІпссацсоас шоссавсосочо стасслосач звосстсасвса валасасоло чстссваске сво урн в, НН о о доти дуг суч куті ти С отит у ери я ск дг нт т гозувпслоз вчасссплодзо вопосвуасоя дезисотод слессоаЗтоет сФдадатопне -2д

НІ чісавсддасоа сасслоосодо ссисесвозсє воссесттсєс саласстовода суусстадасх їв асоісєЗсся соавссцасоа сассісвоасас соссастацєу псзоасасссс сеацсрсас

Ап чдаттасстсця совесцассо бсосдідвос спасвсстацоя дтасссвоадли ссаолосатя ісСсазапчацча сочеосоосЯас сссссвоадса дассцесаса степ гсзоссас сплата

Сад зв ж еф тити нету ки зер ик ее те ран пи р ин оо ких сспсчіспбло сочесцавсат субчстзсоас спосчдчассо цебаслпасас сепсису сає т1о02и гсстісосца всвісвосдо двсопсссвава послддаавосс весадсвовди соснова

Тов і вин сту ит оте вет отих дати т. жити диф дра еталетн алеля кинанн кдродите і рикерия чачссссоса впшчоососсоЯ сісссаттис садсачзаасв сссиссласо пава соос лада?

Жити авсчасавос бчдвчвасоса ссасапостс доссасстсвя сспасстроює сасзтксвас зла

Т12по чкасопцавачс сосвосссла сопспссавуаєс ввузгзайсояс сезпсасосссо сасоцлросо тачабсорооцц соасвапчорсає ссоставоцає сорпцецовоас псотсачосос дассаавлеозо зп 1320 часодсавса вссвапцесас всвоссосоіс цпавсавцвіисоа ссіссоазчає пазпчдсоссо 1385

ЧЕстодцецс доусссасваа сцачасосау спесосаача авосдсцестоа чісасоласа 1555 стлесотасса вососссцосцла стосслсасу вавссзоцассл вЧчсзсасосда чоегостсане т песчлсалоцедч вссоспцетої спосассцес вазпазсодсецс дсвазсазосчв о оросавпаса 1555 стдсбссоча Ессаазцеєцаа сассстсаас сіцсваочаацл сстстатово стпасавцев 15720 гсплавсасся возсоасцсецоо бассасссову сізассапол ссддассоту асгосассоко 1555 часаєсцчвата спчусустлота созповаачлія вссстчацтоца асласлоста сбтостастоас ля не дсдсасассс дгтассссосо дсссалоцстеа бпсоспссос асасдозасєс здотзагспай тапаи 1820 сапудасата босі сцосос оцдсцссоцесо бтосассспох суастсаслає ЗЧаасссозос задо 185855

Кссавоссца восдвцаєцчає стасаєвстаєсє впосдвадсафіІ адакоасасяс сдоБлетацет т922 авчсбсслосвг ааццеисцасва сспсіцасас спацчссчасс воасоасівнсав дпа сгсоц 1980 чачаєсовосх ссоуввсвосо сазцаасвос вссатадасо пебссоацссво бопдогоусос

Заг гало соацчсспеоса Сссвацасас ссасдссоосс папосасопцо посодацсосо чатдлпосаво 2100 часчесдсос сссдосопоса дессассвос сасоссївст ассопасгасс доросла 260 агсувоцось са 2112 «2102 3 «21125 723 «8122 МРОТВІН «2132 Бмид Міскораскекіца «Ей» «вті» різноманітні сзнаки «та» ББІ бактеріальний ізолят шосі-014-006

«виз «т2ї5» різноманітні ознаки «от сег аю - тп пп тити бик «-825з БІ пептид 1 ОБс1МІСТВООВВ2 «лап» «ї2гї1з різноманітні сзнаки сел ппзтеиутттчергттт дл в со сусодиниця гібпазви В -400з 3

Мес бак Аа Аза піу біц АКу Бви бек Ак ті АБробат Бі: Іі Уві 1 а 10 15

Авп діа бЗій тук Жеїг Аза Ків Ні Гей бів Маї їєц бій с0іу Печ біц - -ещ З м. го 20

Атїа уві Акпо Був АкщовБго бі Меї тук тів сбіу бек АБпосіу Сет вго -е я й 2о щі чо бру еп МеЕ Нів Су Бей Тео бій ті 118 А5роАвп обех Уді Акробіц

Зо ЗО во

Аїв Уві Аїд бу АБп обі Тк Був 112 АБротіе тіє їБО Нів сет АвБр 7 ту ва сСіу бек Уаї сіб уві нія Аво Ака с0іу Ака обі тіє БгОо ЗаЗ! АвооУаї вх ЗО 25 сій Рхо АкЯ тпкосбіу Бей ТВгопіу Уві піц Маї Уді Теї тах ГувБ о Бец 105 125 110 нНіз Аїа щіу 01у пу Ейе о сбіу зіу Б1іу дет ТуУук Аїа Аіа дех бі у ля д л7жх лз5 113 125 123 ще ші утізлу яд хі дл Фея я «уд депо АЛ до їз; тлу 3131 Ат ти ївн нів Зіу Уві 51у Аїа бек Уаі баї Ап Аза ей беї сій Ак без 135 155 155

Авроуаї б5ій Уаїі Ар оАка сіу біу пуб ТЕЖ ТУ Аїа Меб бек Ре нів 145 150 155 150

Аха зі Бій Рго б51іу ї18а8 Ре Тату Авзбоб5ек сіу зіц Буз Ах РКО Авр ща з7и -- 155 170 175

АТїа Рко газ так орко Розв осі. б10 Авзбобех бій іч Ар Уві 112 б1У зді о кое

ВЕНИ 185 1520

Був Аза РКО Акч о сб1Уу уві ТЕ о біу так оАку Уві Аку туї ТІб Аа Авр л88 зах па 135 жов; -

Ах зів тіе Ре Тих БТУуз Або дів Аїд Бпе ціп бец беїх біб Тем осбіц 24 зв ще 219 Іо 2 тік ду ще т, «т пак дл ово пет - тд те ляготоштя Зах ол

ТВі Аку Аід вк с51п Тпх Аза вйе тТец Уді Ехо біУу Ти бі: І1е Уд1 225 230 235 ад аю пув Авр о Віз Ак о Ата Аза зіу біп Уві тів Руб Маї Рто Адродеї ла зв ван

Авробіу пій так отТпх Уді Уді пщіу тах Авропій Тк обеї Туї Тен ТУх 259 2Б5 27 ід оіу зіу ч1іе пет 013 Ре Уаії бій тує Без Атїа ті Ар РКО вго та 285 285

УуВЩДї Так оАвр отак ТгроАга Ті піп 0іу Бін пі Ме Бпе Був бін Тох 290 55 за уаЩаї Ркоз Маї Гео п5ів Аа Азо опіу Нів Меї Маї Ата Тих бій Уві піц 309 З16 зів 328 пе Ед іт, зд щодо лш 1 т нн рани шин но нь Я

Ахао уві був Аів Уві Авр о Ті дів еп Аку ТгробіУ Тих сСіУу Туг Авр зв зап з 125 125 335 тних Аку Уаї Ак о беї ре о уді Авпої11е Тіз Ага Так оБго Був бі біу 34 345 359

Тих нія Зіп бій біУу Бе осіб біп осіб пей обБейп Бу Уді їв Аку Зеї 53 зо 65

Сіп Уві зів біб Ап Аза Ак Акт о ГПеб Був Маї бі Ап АзобоГув Тез 370 375 15 сін пу АвроАзо Мас без Аза біу Гей Таж Аза уа1і тей Тк оУуді Адц 36 450 за 100

Уві вхо Бій Рко о б5івп Рпе о сій біу біп Таж Був січ Уві Бебопіу ТВЕ 2205 10 15 го Атїа аз Аку обівп ї1е уві Аів сіб Ма! тів Атад уз Азр ом Аа долі поля лози аро шо аг сСіп Акд пе бек обеї Тпйт Бу Ако Аза АвроБуз Авітобіп Аія Теж біп 435 445 4458 івц Пец АБрогБудв 1182 уві бек пій Ме пу Аа Ах Уаї дех Аза АКо 450 45 355

Атїа нів уз біб Тпх біп Агу Ага гГув АвпоАіа їеб сій бак бек ТІ 465 ати СН 455 у п а - о виш ша зе воші т Що пути бод ів Рхо тах ГБуБ їв Уді Ашо Су АЖ Та АБ обі Уаі біб Акз о БЗеї 28 450 455

Ух Тахо пк - тдло тля пл смт бпту Аа й Зал тля під тут й іч пец впе т1іе уві 01 бі АвБю бек АТа Бе о біу тТпх Атв о ГПув Ап з Зп зів

АТа Ако АБ бек піц БЕпе бій дів гей ей рго 116 Ага сіУу Пуб5 ї12г 315 25 зе івч Аза о Уаї Сіп губ Аіа Бек оуаії 01Уу Адр о Маїс Пец беїт АвпоТВпК піц 53 525 за

Суз Атїа Зеї Ії т128 Сбіп Уді т1із с1іу Аза бі» бек обіу вхо ТБХ ББе 545 5 255 50 й ІН шк ла 7 Тут ту їт3 тяжке гло Тоня: Ма вк лах В

Авр о І1е Авр А1в А13 Ага о Тук біу Гу Маї тів іч Меб бек АБр о Ала

ЗВУ 570 75

Азроуві Авросіу Аа пів Ті Акт отак о бей Бей іецз Тпї їевб Ре Ба

ЗВО ЗБ Зо

Ату Тук Меї Аку Бго їец Т1іє Пій Ні бпіУу Ата о Уді пе вів Аа уУді 500 во

Ріо Рко Тез Нів Аку Уві Тіє УЩгі Мес АБп о Біо сі беї Був РКко АБ 51 бі во

Сі Тк тіз о тук Тиї Туїх Євк Зі сіп бій Ме бів Атїа іїіевн о їеч Аа

БІБ о За 540

Бпув Пец Акт о їГув Аа біУу Бу Акт отІЮ Ні Бій РеЕс 112 біб Аку ТуУух 645 ОО ви ге Зх тота ану шнАННЕ ен нн ЕН о АЖ ще дл шко піку ж їче т

Пув о сзіУу Пец о сіу 51 Место Авродів сій бій Без Атїа Ап ото»к ТІ Мес

Бо БЕ: во

Авр о Аку Зеї 01 Агу їв Гео Акт одйтз Узі Акта Мек осі Ар оАтїа бід 573 а 85

Аа Аїа зіУу Ако узі Бпе біс гей Тез Меї ЗіУу Авдпосій Уві Авра ро 530 зо та ака о Ахопрхій Ре Ті Тіе Авробек бек А5роАтЯ Ге бех Ако бій беу 725 То ТЕЗ тав 112 Авр діа «810» 4 -2І1ї1з Зап4 -812з ДНК «2133 Бид Міскоравстекіцтш сих «в2із різноманітні ознаки с«ва3з щІії бактеріальний ізолят б95І-3414-С06 «ЕКО» «піз різноманітні ознаки «ваз шрсї Бен 10 ББіМІСснООиЗО «Еш» «2212 різвоманітні ознаки «г23з кодує пептидну послідовність БО ІроМмОо 5 «4аАПпо» 4 гкЕаустососоа сксотовасос віссасваєсс вссассасса взчавслоавасоо счдчатссксос во песто Ссусс зав сібссдосвоо стиавсаитесс стадестьс спосо иа нови пассвазчасє сосспасата сСсочаслалосс о сстасотосг спосо лад 129 асеуваєссво фбсудсляцесо ассопсвас саслосточа вадсососг дасосдавоатео 182 авчазосвод дпопспсаєссса ссосаасдад аасзасоціс гадзистадчає сотселадцаєт

Ай аюстісктсоссса ссувошаєссу ссоподзачасвяа втоаосвастоаї сзсгсасцдав ссосівсого зай чачссосавзца вабастесає ставаодцазіас аволаасопа деавцасств спосасіссо сспеасочсосс вадоссасоо сассвассає сссавсоалоаса ачатсзацаєс ссадасоазкс

СУ

КЕсабсоцлод аоссссссцест ссаццаєвсодчає авазсчавоя ссагсатсавд сооастссдат 185 сопсуісцссяЯ Ссесосаосо сососЯгісз сослагбасоЄ вссгспвсав дасссоссаос 540 азвзчаспиьсос восзавассасає сспосссспра спетлосацсс сздайссссао сосстозоссо о чапєсавзца бсдвсвзацчеоя ссассвалис сасотоасосд послпассцсза доздсайчоеах тсоауєсасоц фссісстсвд бусостодпоас втуавссвоаєст вусачатост стсодацего цписодеастаса соеподатодла спазчасоссо сцецаводаса сцдатсоассас дазпззадчайє 7 да бе чпчсбсспод о васабстасосЯ савососсяо ссопасоавос воазісцссЯс савоадосасо

Ай спсочсодсїсс гоувсавсосо стасстстсває стовачеспої всавсстовдс саадяакссоої зай спсогасавца бсавссасва сосоцяссту спасозоцссоас сЧазосозос чатостласо де пессавовса бсусоцесас сабсавосає стптоцсасс соповоспеспоз сасодадава зп 102о асскЕсасоц дсабсслсзу гоставувау сппосдладцатсс дщостсподас соавстласавс 1050 чЧасавогбса дсавсотося савссспсдпеу поіспоасааас сувоссвоаа сова ссос ассучпстсї состсатода оепсчтсдис спетвасоса сувссасцса сдлчвсатсзат з здЕ 1290

Чдосчабсавсос соасвчавссотї свісзвзасоастяа сассссаосст поеапссолсзає сазалацчто тд 1260 риЕпсслдаюсти поасвсцитце повцттесаго здпсдапвдсова дессоосватоенус о пес едоссї гЕсодвасої сосвустіобс осацеьссасу спассвуваса вссоцатояс доаЗсстдчася 1320 аавсавоєсдстс дшессобссоас дессоцесос дпопрозчесссє сасслачвоссо спссачсЯе 13980 чачуїсстіо: авсусссассо сісссасїтас попсозсагої псосзчасбста дастосопаз 1450 члссосавса бсозсассстдасє слопсоцсвстс десвссіссот сзчсосатсаа сісстсоода побори 1510

ТЕсабсоваца сопсссстасстя сдвасеасссос о спасоцаіліст пчасслтасся чассцасовас 1555 стзасодцето сосувацдацчяає стассососває вптодсчдсафу ссавсдосос дотепасасо 15ХО звудістоее боспоцадат ссасцосстая поссдссосса вазабпосао содсаацдс 1580 часссаьоса гпссссзасєза свосзастасє воссаслнсї сссодсоасса Часзаготся 1750 чісоссасст сасссцтссс стсостодсазч сассасдасд савсазчечсяс сстсагзоаді 1809 чдсосазсаєцє всосогсазас сабосзусто стоасоасвост астсоцосоуое сеугсзовасо 1850 - же часаблавоп доепасасочцо себйоцдаєчес сетзласчицос слтсассозсода даачоасосЗак гурт 13955 чесобсепосз азпдбспссос дсвссоаслос дпісассвтс ссоавсазцао соасаасоасат 1580 ну детви пи дер ди че дет дер плрипуи ння - чачквссвос гопсдеавсто сувссясосс давссаалоса соч авсав ссвоадацкао

ЗпАп йо явАНЕ щи пити сечу дунтку пиждгєатнв и течі сет дут дфіссобозосЗч соуасцазосЯ ссоссзазчиасс спадастіасса сспосоазозо соссососасс

НН

Чачавсцаса апстоцессх спававоавс стссотодчкод езбтсаслас чола тп де

Або тапавстїся апувсцодат савуіссстдазс свозасостот соаваздавояа сасосстслео в5ззв у їспабссвсоя іїпузоцазоя судоцієтає йсісЯсазса ссазцюєтсво сСсавзцоазвозад пак яидщи ярих ризи и - - тити ту дат и тити пт точити ил сер чити зисасоозо у ассвссосад суссачесосоу спвоастоуссзча ввсстооа созацеасЗос тилюй гу яп уд феттия фр ттьдо печива рі оче путі дере азвсарсслев бсуловссдза соцсецесие поаславсаксо ссакоосав о сдосасоєво тп дай тр Сержа ик т рееирия ит ут ин жи ит ке кути кроти тири су палет пох зазуссчаца сеоцдвоустото сдосзводацд сясосестсс дослоцасєсег сазссназу 246 щити ітд тот ужив их духу кі ур пити ветщу ве и моде з алеасцсецавва гссожзтодаЄас стлзстовацч сліцсссозе дослацчевоо саслатсавс вий

Чдссчісавоя всагбсзасос сдпасоаслас дпасласодвох педасосспи стсавсооє 258 сцсчрсчсчя Сбссасассзо ссаузачсзс ввсвосасосдч валасавсав деспочссочо дих вл счиісвсцдсоя дсавуцеатаї сабсцезаву ахестсссоча пепацавсає чес а тТсучасоупа сосопцасоса сасочтостоя авсосастосоч цсагссосспо сгочдлародвас 270 уд уча вил итих очи ту итову либдечкет йти джек тужити дочідечевитии в я гдоцечекі тив щія

Кесуплесвад бсстоцадас сеассстсдоаг сазатстоза вчасацдлосіо даволсспаа зи вний вн нн НН НК рон певне ди дфісавсессца ваксчицесас сСавостсссз авадлвсдсаї ссаваазоссдо соегслусво ват 285 авпассозсса сссосчарсассє ссасоцеьосоя зпссадслваод ачавсассоє сепесвтсоао

Уа зас рт щив ри фея лют и дтииВ лк ик и ти плиті ит ди из єтити ет вон пити причи чЧсчастзазос ссчасослочв сацодтесас слдатозасо садвасососай дасдвадоу зап

Зо п и и НН в и НН і ксбсувсолос дрова чес ссссо щосссбчувисс сосзтодассв сатобасаєс р збо стцависсцдс восассіоао сосвосдасєзац воссастсат че ссасоцоа бсосзрасося тросі під азкчатсасос васвусосцесї соптдатвад спсцсацітсоя драдасацеу шосе дат зави 5180 збловацьяь сдауосссосоа сосстасдас десцозізсо сустосвода десрсстсасц

ЗАХ щих три нт г сглет мети інте от орав та р танк тлу узд діІИчТТ ТВ Я алоаачнслоц всдасаєтосї сплассоЯсзос авопчолаосо водсдатчню савцапосзац

ЗУ азасабссвоц васосцалсаї соссдацієд їїсвваплІдс ссагдавола датдевціся зи

УКХ. их жити вико свити етики веж ичртгчичия стече чері уче іл сти вд стстутоїча аочссцацї согстсуцес сасцпсасос супксавссї содсласасо али пасовсцчацц шоці ссссос сусочазацач соссцасвассй асарсбссво сопстссави

ЗАВО чдссчискспа ссцзаслачах сова льш вий она В ші З 33; 157 «ка 1157 «212з ПЕОТЕІН «вії» Бид Місторассетіщци

СаО вання «Тіз різноманішвні сзнаки пох туті сі що - 1осусярт ут Я кт т щит-пя- А «ше і;і актертальний іБОлЛляЯтТ Обі п14-С06 си? «дні» різваманітні созваки

АшАН ст штьтідт Ту пил мМмтством ап сив БІ пептиш 15 БВлЗІМІСТВООЯЗО «Ве». «вві» різноманітні сзнаки путь тях тдттирт еттли това кдд, сх Субодиниця В ЕНК-полімерази «ЯпО» 5 ген 13 йід 1 Ат шт АЛ ета вгорі ті пра я їсзуєр Ач т їх

Меї йів дія Кіа Ак Азп о Аів бек Твпгоб5ех ТВ тк ТпІ Був Ал облу 1 З 10 15 ге сани ши в ши Ше та на А що тки рі сив ку пт ти піни

Атч слі вів бек Ак фс Бей опо Аїд бу її рек Ажо тигоТей тих 2 В Зо 1 ли дос туз: ен чи Ні от мо ла мо тт по нан нн и чиї чУваі Еко дю Ппеч Геч Аза ем обіп так осів дек РББе біу тхб Тем Узі зо 45

А ц дев іа пи її й адже до КН не Зх Тлуєв СТ р 51 АБп дар Аза ТКкв о Був Аа Ат Уві А1а біо дів був Буд сіп бО1Уу

Зо 55 50 фо п а и ННЯ 13 детуу пря ля Сон Тл лу ТЯ СТ я ІХюриу (0 аж

Ах тТпЕоАВр Уві Ап бьш АБО Зах бі Бей бі в5іч їІ1а Рве о сбім 015 59 7о ТЗ 0 т1і2а бек гко ті біз Авропес піу Біб тих Меб бій їй бах РБе ТБх во трояни Тв: 07113 ін, поля тя чук Лв ТІ й: (7114 біхуд тує ті

Азп Ріо ТУух Бе» піц Еко зі Був Тук бек тів біц о сій Сув Ппув піц

НН па зд

А фл 410

АкЧ озіУу Туз Так Тух АТїа Аіа Еко Тецй тТук уаї 51 Аїа бій Ре Мес 115 125 125

Авп о Нів тей тпкоспіУ біз Ті Був Так обіпй ТБ оУді Бе Мат сі Авр зо ме заг шт 125 пу 12 си я ЩІ зе т тут 071 5, піалу тла ті. сек Ях Сдую т впа о Рко їей осіп тп Авропув піу Так оРБпе Ті тіє АБпобіу бег піц 145 150 153 1525 дит хд ха яд лен поті ЗА дит ви жи пі ля тю рве о дет

Ахкп ові Уві Уді бвхюк біп Гей Уаіїі дко дек Бо біуУу Маї тТух Рв Авр 155 176 175

Був ТЕБЕ вгОо АвороГу5 Тпх бек АБО» Гуд Аврої1е Уві беї Аів Аку Уві 185 тв 1580 тів ро ет Ак о пшім А Тк цес) бій о Бпеощії ті досту тлу вк; пошжхх 411: жо ог ВЕ ІМ Аді Об оцем о саш о Епе їх 4 141є дБ БУВ АБгЯ одер 135 200 205

Сіп уві Зіу Уві Ак Уві Ав оАтс о пуб Ак о Буз сії Зеї Уві Тр?Бї Узі пла зл ж зав

А аю що

ВБе о йец туз Аза ТБ біу Меж тТву бек бій бій тіє їй дів січ рез 28 230 233 240

Аза зі Тут Тік о Беї ї18 сій біб тако оїей Ата Бук АвротТикК Тіз Уві хау об ши тах опушк о5ій АзроАїз Бен Аку Авротіє ТУї Аха Бук їй Ату Рко б1у ри дя о-ї аву рені АТО їх ті лі 1- й тп. Ат діз ЧЕ 2 тТ-езз; Дсту Воз зе Пляг сін осів Уаї АТа Аїа бів АТа дів Ах Аїд Без івч АпроАзпв о Ре ТУх ---ч зад за

ТВ 285 285 пе о АБповко Був Аку Тут Авробей) Ав Був Уві сіУ Ак о тТук Туя 118 еВ зп95

АвпоНія пуз БПеч обіу Тец Авробзійп Ріо Бей Авп бек обех Уві їєч Ту

У у ое вовна: ти дв век : Ї 305 319 315 329 тал тлу: лоту т хтщдло дл тве ті Ту лат ші ХК лячно ти мі п чаї бій Авро:1їе ЗР Аїа ТБготіе пуд Тук їз уві Ага о їец нів АТа 325 3:09 зах в тої зе ЕТ іх пе че І жі, ті ет; ча НИ а У НЕ т ві т

С-Ту ТБкЕ ій біб Тахо Епе ТБгопіу 112 Акпрозі с1у Бу Буд Аза піц 325 345 359 дУукротвияї Мід та де дя ті дет щу з пляг дл дим ут ті 112 Ак їй Аїд ТЕ АвроАБо 1іе А АБп о рпе 01у АБп о АКЧ Ак о ї18 253 5О0 55 де АлщохАВ ТТ тілу 133 хв зо ті де ки ше и шини АН Я ся

Акт о Атїа Уаї сіу 51 іїц Ті зіп одап о бів Маї Ах тпх піу Бей бех

Зо 375 зво пт реа нь КИ я хтдло хр АЛО доні 171150 Ддоиє Мету тк тв ту пе -о тла

Ака Мас піп Ако Уаї худі Ах піц вто Ме ТЬБЕ таКосіп АвроЇтів піц зда зап зав бл зЗа5 за 2аа 406 вра хл тля пін плн та ті де з-7ой пут хи ля А кла

АтТа її Таж РКО іп тах пе із Азп Узі Ага Руб Ууаї Уві Аа Аа як ли ал 5, 510 ТУ

Тита и Фіз тА пу лит тт п Раш тую пан лету лот 112 пПув Бі Раз Ре біу ТБкобЗеї сіп о Тецй о Зеї біб Бе Мет Ар о біп до ат дз де ди тях Тизі: й селу т їн дат тя в щ ж оті тк Ал тоі

Авп о АБпоБко Гей Аза білу Тез Таї Азп Був Ах Акад тей бех Ата тец 435 4145 ча тертя м ті я "3313 Те зи дує дик дит в. пз луд пл 3781 кот тах сСіу Рко цБіу Сі Тез деї Аку Ар оАхо Аа о Біу Уві Бій Уві АкЯ4 Авр 450 55 455

УвЕ нів ВкКо беконі Тух с51У Ака; Мес був Ріо т1є бі тах Рко бід 1465 47 ата 4вп тя ми ту тд т чн нон а не и в и нн о Не дов тла сСіу РБРко Ап о т1іе с1у Беца тТ1іє Зіу Аїд Тецй Аїд тпгоБоз від Аку ї18в «ав «зп я ут, ав 230 шо

Азп бак о вбев о сіу Бпе їі1е сій ТЕ РІО ТУХ Ага фу УуУаї Уві Ар об1у

Мю зп 519

Уві Уві тТаї Азрозів ї11е АБО Тут Тени Тпх Аїд бекобіцй бін Заї Авр 315 525 325

Бпе АБпотівз АТЗ 51 Аза АБ дів Ріо Бей АвроАїа Бу с1іУу Ака о РБе кА що ай 536 235 за

АхчЧозіц деї Нів Уві іа Ата АкФ РІО ПДуБ бі б0іУу беї сіу сліч Уві 545 ЗО 238 250 то; т. КУ; и НА ШИ те м я ті. ши лькя тя тт пу луг т-ї болух их то,

Ар опекш впе Маї Бго бі біб Іі 5іу тує Ті АдроМаї бех Ртбо Аха за зт зт - т к- Абу тло пд 4 що 14 їде Тоашяя б ду 113 8-0 сх біп Мес Маї бек Узі Аа Ту бек Гео Уві рРхо Рпє зи біб нів АБр зо ЗЕ зи) ож пут тут - тт вх т т Ві о у што т що кю ТТ В т хр

АБровіа пій Ако Аїа Бай о мМекосіу їз Авпь о Меї біб АкзЗ5 бІп Ата Уаї сек ст пах 00 во т Тахо Тана ки та де пен пкт Те що ту тік о їх Мет лях та пев гей Ако пет Авробехк ко Гей Уві цпіу тах ошіу Мет Би пу дуг дує яті ві 615 БІО ре а от ті Му щі (Ук йду Хв т її оту Дідо спі тлу до ут ля

ТУух о ТБкодій тів Авродіа сіу двЮ о Уві Пи ТпПх Аза щі Буз Аза і

З 230 35 вдо ке шок ха сіл З: хущло а рон ше ши а кни НН що Тез Лщу, З

Уві Ууаі беї сій Маг дет АтТа Ар о Ато Уві Мві Уві Меб ів Акробіц зо во трюк пять Я 1 бляум о Я о ббовтя дуриит о То те шу Вон без Ду ул сх сім біу ТПІ бСіп 51Ч Тут Бі Бей одйтЗ ГУБ Рпе АБО дДЕЗ бех Ап обіп «аа Бий Вл оз пох що ут лк во ут плуг Іл току зт дя зло ть Алло пл (ля ловко лив сту ТЕБЕ беї туУук Аква обіп пу Узі Уді Уві Твх А1вВ Зіу Сів Ака Уві та во 285 т. хв ен шко ще же ВИ пл що лаку бл) бух дія тьми 133 ца пкт та сій уяві ціу зії Уві їла АтТа АБЮ СОТУу его Ага так обід Авпосіу піц 526 55 т

Е плоть т те ту дит т т Жожштх дл пло зи ок У где УТ яя тот їм від пей сіу БВ вЕп ім Бей Ууаі Аза РП оМех ТІ тІв Сі бі1у пет ва т-к пог

ТОВ 710 115 НРК ппят т те тля одутує Зк сті тато бив Ло Доти они дя тям дося

Тук Ав вне бі АБ оАта Ті ті Ппейї бек от АБО їй Уді ПУ АБ т7ьЗі -лрт ув 725 0 735

Авр отпк о їей бек о бет т1182е Бівотів ОР бін Тук бБіц уаї взр Аа Ака

Ще тА 758

АвпотвкКолез Бен пі Буд біб бі) їі тик Ат АЗоб ший Ба Адть Уді 753 750 те

Здюжо оби ті: Тем; Теля Тан Адує Товіз ля (1 жо тіх: тів тім дв тла

Сех Еко 5іц Бей Гей Був АвБроБецй; Аз бій АТО осіУ Т118 т11еє Вкщ ої ли зЗче пат 1 У о а 1-х дода рану 021; дамо ті хх Лв 02 Те хв Ст жк сі Ата зі Уві Ака Бо сіу Аврот1іє Бей Уві зі Був Уві Теж рЕв став тат чах ро тво за за по г ях ит та таз 7133 Же тя ТЗ 131 так джу тази; Тов жи Ал т був сім зт те За бе) бвх Аів спій сій Ах ц іевц іш АкКп дів 11е де оп ді ох пі РУ си пат 131 т кр о пт й тд Де ато тк Дт тиші Ту5ит ві вх пе о Авпопіц їУуд пек о Акоа сі уаії Ако АвзроТВІ бек о Гей Гуз Уві Бго 820 325 830

Ні бі піп біп йпіу Тьк о т11е ї11е дія ді рух піб Ра деп Атд піц піл оос4Уу сбхац о3пошпІіІМ Д4ПЖХ 25 1346 віз Уві м о оса пе ВІпП Аза їла вас вах

Аврозіу АвроАзЗзропій Бей осбіу дек сіу Уа! Ап Ага АксдоУуві Уві Уві ао 855 дво

Тух Ті Аїа Сіп Ту Ахоа БубБ Тіа тпк сій біУ Аз оту Бей Афа біу дез 570 а Ба

Ага нів о сіу ВЗп о Пує Сліу Уві тів вів Пух Тіз їв Рго тів о січ АвБр

КЗЗ 320 ЕЗУ

Меї Рхо Бе гей беж Авробіу тах РтОо Уві АЮ о тіє Маі Пец) Ав овБКо зо зо З1й ївц бБіу ті Рко спіу АКоа Межї АБпоРБпе обіу піп о Уві Ти бі; Тв Нід щлод ля ст,

ЗІЗ 2250 23 їй о біу Тгр оті Ата Без бій сЗіу ту був Ууаї біб біу вп оРко біц зло а:5 зад

Ттр Атїа Уаії Гуд Тец Бго Пу5 АБО ойіа Бпе озім Аіа Аа Рто сіУ ТБЕ вла окл ок и зав з5о зза з5о т- хтді ще трюк ша: ср ролю Яжлт вл сту 1: 1А дя що Моя

Був уві Аїд тпу Бго ха1ї РБ АБО с1іу Аїд бек о біц сій сіб Ії Ад

ЗУ а7о 75 ох, твхо тва Яд АТ т Я ян бр Я до пет тт: гл жит те

Сі печ опец Авп о АТа тп о ТВК о вБКОо Тако Ага Аво осі Уві Ахс о їГєм ї18 зво зв5 зай дя те лід 1» т; но нан и кеш пл пи голу пуиляу кл: у

Аво Бек Зеї сіфіу Був Так осів Бе) о Бе Авросіу Акл;одех біу сіфч еко за 1055 105 вро зи що пи то ее Са ВН зл; г пен Ши У й от Тож она пе Еко Аїд о гкОо 1 Бак о Уді Зі тТУукК МаКоОтУуЮК 118 Бей ошпущ ре ївіа злі чай 1015 1915 1523 дян о с4ї4-5 тим ХА дім бхгх ше зл св А ТО до пе т Ля піни вів ні їжи Заї Ар оАвБе уз 118 НІіЗ Аа Ако одех гпх бі рко тел пли Ах 1025 05 1555 ати сечо Мак тів от тя й Шису теп тю піл Тло діт тя вне

Тук Беж Меп їТ18е Так бій бій о Рго пейп осі БіТіУу Бус о Аїтв о 016 Бе тва НЕ: чик і04О 3уао 1555 сьіу вБіУу 0Біп Ак ББпе свіу сій Меїб зі Уаї Тгр Аїд Ба біс діа 1055 1050 10555

Тут біу Аа Аза ТУуїх Аїяа їй бів цій їТей їй ТБх тів пу деїг 1075 1075 1089

АвроАвро їі Гей пі Аху Уаї Ппув Уаї Тук обі Аїв тів о уаї Гуз 1085 1050 105 с1у бій Азп тів оЗзіп осіб вБгоОо бі Тів Рух сій бех ве Зуд Уді 1160 11025 1115 ївц Мет гув піц Меї біб бек Пец ув Тес Ави Маї піп Уді Тец 1115 1120 1125

Зеї Аїа АзпобпіуУу ТВх їеб Уаф Аве; їй о АхОо АвБроТпх АвБроАза піц 1135 1135 1140

Атїа Ріє Ахо Аза Аза сіц сій Пец о піУу 112 АБй ї11е дет бек АКа 1145 1150 1155 впав о бій діа Аза беї 116 Авро біц тів 1155 1155 «8102 6 «х1ї1 1188 «8122 ДНК «8132 Бид МістоБассєвкізна «го «221» різноманітні ознаки «8232 БІ бактеріальний ізолят 5БЗІ-0П14-С06 «КО» «221» різноманітні сзнаки «823» БбІ гГев 10 ББЗІМІССВ5ІОО4 «2202 «21» різноманітні сзнаки «23» кодує пептидну послідавність БО 15 ОМО 7 «4005 5 бслссцавасоссє паспосочод песпсоспсоста соазіпдвава савассосаво воросабтівст «0 ссстестсдца спауссдессс саавсоспоздач сцессосдаса цпестасазлс здопдсассасос 120 зчсусвцавцо вососавсаєсвї десаїсвсос досовсоцед авдаадіссог стацассусо стсацдоссаца бсцасодося діісчлавац десссоцоасса соолддото садосдаєзас тд хх пасопсесова гГпцопцісає ссссассаще бссассасос псавсатсЯат сокспосЯто з чЧаводасосс сосасцлоося саїсзтсдлаю віІстасалає сулачесосс стсавзасаи ди и зстчебовссос боасвлецесас сасовасоева спазчсссассоа сдпгасдсатсоас одезвосато 47о чЧассосецдаце апостола сосопастає сосцесавцє ссслоедсосдча сатодатояса птестапцеьек спосалчиссод паосслатсдо свОНЛесДУГОсС впдгслесзїд СсдтетеУ стсстацеєс сосвососоЯа саооцутааз сводлецетес вуаполеста сатасропка

А сепоссзаоа сдпабсцасст сабсцієвос сасьесотєюх судосовсояє десдоооусо вод чЧчачассцваоца шдсуазчесзЯя сстассесзсас сссдтоссчс водессопосст сатцзососва чдсчебопсцва васссвосЯг,; бот соозас сазасцваса ссасзчасцзає сессагсаво тел ги сгачсвьсосзсоя авсавоассзя сошсвосос сппстосцосол вопассасвас Сас вац тва дочсрсавас гсовецессо суцвссясата спасвосоесс щЩивІсоавцас фогсавозас сддрассцвод стубсолтав сесповссапа посаващтіся спсвадцавсаа датолпссея зп сстжісавос вадосцазоо стасатсссс сводасатед псалсосозоо сазоалоаввоє з зу стчаєсувої гозасастсзла бсвстдедасс сосвазчаває ссаЗсЕссто Згагасатасє 10255 часадодчцвос вассцацосв сдоспсаачсад звасдодсода сдсрссстоют сапсавосЗос т го) пт

Ки часарсясяс гсусуассдла своцсвовіс вазсзаааци ссппсатсзо садесссасо пай

Я чЧсочдуспеста сидеводпсата савуцсвссео сацепЕсосс сгазсссда тів аю «21095 «211» 355 сіро ПЕОТЕЇТН «813» Бид Міскораєтекіцша «а» «ті?» різноманітні стнаки «вий» БОБ бактеріальний ізоляж всі-018-05

«Зп» «г2ї1з рівноманітні сзяаки «каз ЩІ пептив 15 о БЗ5ЗІ1МІСТЯВЗ10бОЯ сих «Тіз рівноманітні ознаки «и23з рекомбіназа А «4005 7

Мес Рко ТтТа)х Ако Сув Ака Тео Бко Те; їем Ага тер їв Тпх пет АхЯ 1 5 10 15

Ахп о Аїа т1е тйак о Бго бух Аху Ак Уді Аза Рхс Адп о АгтУ бі; АкЯ о дкоа 2 23 зо

Авро бек тей о біп Аза Ата Ріо Ака о Аів сій Був 51; Ніз ч1іе Ме вБКОо зо 45 еї РхІо Аза АвроАко обі Був йех тес спін Так Аіз Тв дів біп їі

Зо 35 во

Авр о Акц піп ве о піуУу їз біУу ех Уді Меї Ак о їв сіу бак Авросіц гОх за те Зп па ЩО 13 Зо

АхЧ о Аїа ЕКО Уді Аза уві Ті его тТВкосіуУу беї іє Аа їец АвроУаї ве Зо за

Аза іви обБіу Мві ші Сіу Пи вБко Ат о піу Ахч о тіє Узі біб Ті тУух 1205 15 110 біУу Еко Бій бек обеї біуУу пу ТВту Так обей ТІ їец Ні А18 тів Аа 113 125 125

Азп Ата Зіп Ако АТа Сі сіу ті від Аа Ре ті АвроАТА січ нів 1:65 125 145

Аїа їеч о Авроркоа АБроїухк Аїа діа пуб ей бі Уаї Ар оті Ар о Ада 145 150 155 155

Бен оївц о Уа)ї бек о б5іп Бго АбБротТвБЕ сіу бій біп АТа тей 01: Тіз Ага 155 175 175

Авор Ме тей Уві Аку дек сіу дів ті АБроБбеп тіє Уаї ті АБропех 18589 ів 159 182 155 159

Уві Ата Аїя пецп оУаї рго Аку дів сій Т1іе 53 бі бій Має сіУу Авдр лав па зт 135 00 205 дет Нів Уві біу Ге о біп Аза Ага їей Мет деїг сіб Аіз Ге АкЯ УЗ сло 715 за ан ща жк ге ївц ТБЕ сіу С01у Гез Авп обі Тйх двп о тТпт Тпї Меї т1із Ре І185 Ап 285 230 238 280 -1іп о пеб АКкФосіб Ппу5 ї11а біу уУаії ве о Бпе о ЗзіУ бек БгО бій ТВгоОтох ау 250 25У

В - "7 1 кт тт Ї: т Б тожтае т пек З лот ЗЕ ож т - у о т

АтТа взіу піу ГУув Аза їц пуб Епа о тух Аза беї уві Агод Мет Аврої18 289 255 27 кт путч тів ан зе -щ- Тлетто й лк, Пк ля ве іч що В по вка о Аху тів біб тах Бай Був Аве обіу ТОК АБ оА1із уаї С1Уу АЗзподкд тот тр 7Зах

ДИН аю ву ті дум ох нт хто лі тяг Ада Тохут Мун ля «еп на тк "лою тах Ак оУаї Був ді Уді Був АБп оГуЗз Мет Аза РЕо его Рпе пуб ціп за Мини га шо шо Зо

Атїа сій вБпе Азрочт1іе їецп Тук біу Уді біу тів бек Акт сіб сі цех

Зої 310 ЗІЗ з20 їн о І1іє Авр оРае 51у Уві сі нНіз Аза 112 Маї іт їУуз бек осіу ех 3225 150 135

ТІр Тук ТІ Тук Акросіу Аврорсіп Ів о біу Біл осі Туз Сів Ап оАдід 3430 за а5о

Ах ТБковБпе їГеб ТЯ Ап оАвп о Бко Ази І1е Аїд їец Аа т1іе січ ту 355 зво 85 77 З тх зла «р зі й: тів йо (ху ту АТ з їв АТ д каз АТ сСіп о Тіє уз біб Тв Бе) сіу тів сі сп1іу Різ Аза Ата тів Рко Аа 376 375 ї85

А1їВ8 Ата Авр осіб їєчЗ Ата сій Ако дйтхо Рко Ат 385 за 35 «810» 8 «вії» 9175 «8122 ДНК «2132 Бид Міскорастегіцт «а» «вії» різвоманітні сзваки «та» 5БІ бактеріальний ізолят білі -014-С06 «20» «в-2ї» різноманітні сзваки «28» БІ Ген Ії ББ1іМІСсвА5758

«ЕОЗ -ї8їз різноманітні ознаки тулрть пхят натхдіяху пом шия и сте т ту а сито» коОодме пептидну Ппослідавнасть по ІС ОМ 5 «апп В зЕтвсссоса бовієцатсо сусвстсдлс дасслосазос ссаасавсяс саван бо я: чає педвецанви вести диеват бдистегетит веди соти вег

Часткове шсабсцазос соссзастет сазчсссосоо асовоссосов сесспознсое 7 120 чачстлачої сдастоцесох саассвосяає соавстоадацє содосозцда псспбсаста ї5о пити и т дитяти т о и ут жи в чужу ее далтіи касі ц неквах мя во псозавосоя ацелочезЗаа стсесСтдеасо восттосдосв дбосвасстопа слав соке

Ра чи що ит уки анвІата ний й тери яви шоб шет ррадлуих ткана ред щі зичдослежя гоусоцасст свасспосоас вссвоідасот чЧоеспезчсся дсгсдпасзаво

Зо яЯвертчтетити о А лтетвиі а я зсвдестнеся о ссесстеедї асбсуцесдоес соссосуссца сзсососчос сасатстсосс ассзачецев сососгосах сецедосво шсувощфесоу сдассотвчшсс дозссссся сСсоесцдесда сіссоосаєо п чачаїсасуц всбзчотосча Ссссассдлає спаслацозсс оссочаєтос сзаченосске яд 159 сачебссвопя бссобссоцас досоаіцесу ссспеЧассод всосудоцев сосцевоосе ем пай

Зищо в их вени кт тет итодоит і ит жит пелети ит дит доикеитиия фенол ноатьна ни касасстоса досеуссосо увассссодеяд свслесасатсс дсаворссо сассподесе

Оп сацчеувссося шдоссассссва шесдосасос восстссосо песпотова дсродосапсе

БО шамани нано нини оду у ит тити я ре етит. ве Кор А и де утихижу щі

Чаподсцвоя бсавосясех сосцеспцоссу спвулавоссовяа седодавссяо бСопопостає т

Не 2 З гзутутии ги кт ти тий ет б тіжи ув тити кутя т ут ту птутя ит те при стчЕЕрсссод дпрсасодацчеає пессдассаєс свсдоЯстес деспсавося сазстаачцає тя

ГІ пре ет вч пити поет лиже рр щи ск дк туди зро тиж учити пу дахи ген чЧічовцасса задувацасда саподаєтвас стсасссвоуд сдстстадас стлазесгоско пшесаосслво безпосе сцео цасссасессс сацчавтстсвсозч всласатоза стзалсовоях зо асопсвссосос о бозвссцоза дессдасвис вссзасстоу аФлорсеясоо сопесосоое 38590 тя За изд ие тритю дити й теє дов яри ети тут дае чити п ие вт сесчстсдвос Ббпезлсзпаст ЧчрсодЧаювося бсссасавтєл асопбссосла плапдопссає то ссчсротвасєс боссотасвсво дасбсповос стссвусос саелдсвассдад сазсвросасо

Тон часаєстоса зазсцастосоп слацівсцає дшпрасссєтто: ассассосзса сопаціозс зсчастаслеод жбсасвудозоо ссссопввсау пссдосепод всоссосасяк догБелпосатс зачсацастсо босвссспсас сстсолоасчасє впсосудистг сцсвучаоцек Чассозвосяся зд 1265

Чессзавоосоч дсавосяоцо посодасосс спсслпаофоча вааассаікє соазводавоасо

ШИНИ

1359 запавсаїбса жепаццовстя савацчстссдву авалосацех соасасутояг совоспцьсте 1380 дисозвсіса впасссяасся сщавацессцес сосплосвлсс подзацавадя палав дай 1550 пцпесдсгаєс сосвоцосзЯ сассцччсаас басваасосса звцаспсазесо сасстзочас

Т500 часЕбсавзос басссасвозс асасососаФф сослоасават вссспасасо соц срсаво «ді 15659 чачсітпастоцй добасаоцат сдпадавцаво блсвацедсос сдоспессото шсосдогусває 1529 січесуеввоцщ щдосьсаїсся ссвовосЗає сосівусоася псуввсасоста зЗасдазтацо 1585 сссуссвта фбссловссва ссодавсосУу воічстоезатд валачастсяв стесяпосочоете тип шлю тТавасслочеда сдоссосопцесоал о сшохозачикс спасапчечоел тчсастлоесаг стосаассто ад 1952 сосассувос їсувсоцоссаї сайпгтцасааєс віСсвасоатоє дсвяпасатост седссУстає л вит 1555 сссЧвсвої ссосетсатсоо ссочссосад васоосоцед асоссасацяє Зіасавсаде

То засчссзвса Бсасосасстї сзасстсдчаєсє сасбсасасад вас сесагсвсо 1980 часчстцаєс восісавоза всодсводсоя блсіБсласс ссдоедасода сазсловвасо пит ре тсчЧрсобозчцс асессоадодзо соадсацесис сцоедлачсзсс аедшссозодай сопсспасое ман аачесссвцчя босувсссоопса сзсасбавадавос возоачесов о сесацеццео сопсвосост задй ща оМм сепичусачеко часа рих укл. «2102 З «ші» 728 кутя сірі ут «ши ПРОТБІН «йі3» Бид Міскторасьетіц

«т2ї5» різноманітні ознаки ол пит ще я дрхжі хіти й 7 зе пита тп ові піхі бактеріальним аполят з5І-014-с05 «лап» «22їіз різноманітно ознаки «га3з босі пептив 10 БсС1МІСТВ4А07БВ за «ша «ї2і1з різноманітні сзнаки «823» поліфосват кіназа «4А0ппз З

Мес тТук Бко Мег І1е АБр Рхо дів Тен: Аза Авр оАіа сбіу їн пі Авр 1 Б 15 15

Аїа 5іш Авровзр о АБр вп Ав одів тіео5імй бехї Рко АБробак о сбіп Бей рж 23 зо

Бо АБроНіз вк Тут Беп Аво АкФобсіб; Пем бек тТтІр їви дід Ре Ап 20 15

Сіп Ах Уді Мег осбпіц Бец Аа зЗій аз Еко бек їв Бго бій Тен біц

Зо 53 бо

Акт Аа АБп Рпе Га Аа Ті вБа йід бек Ап о їзви АБр осіб Ре ББе то 75 во

Меї Уві Актпома! Аза бі гей Був вто Ак тТіе Мек Тпї біу Тем Аїд де чо За

Уві Рко Тьтї Авп о ІзЇе бі Ату цех Рто Ув! АвроАїа тво Вів Авроїте

І 105 119

І пщ- "ії АТ ці А тлі Тіт там: ди під таті А пев пу

Чек Ака зі Аза НІіБ Ата вчи біп їви Аг пів Аза зіш Аза Ткр ТНК 115 125 175 па г-мроцеї дк бга дідо там дів дор се лі тд ол тід тн де пек цеч УЩі Аку вко Аза Гей Аівз Ав бек слу 112 біц 118 ТЬХ Авр 136 125 155 гро тки кт Тим: пня до А п: х шо бан З ту туз: от 1 сля пе їхро зак об5зій Пец Тих Ар оАвробіс Атхса Бек о сіу івип о бЗеї сій Туї Рв 145 150 155 155 ит тхір ут мот кине Се стоячі: пав и Кот 1-8 182781 лу тік; ще

Сів опдеч обЗіп Уві Бдпе ро Уді Бей) Мет овко Без діа Ууаі Азо)оРКко Ата 1855 170 175 нів Еко Ре РКО ТУуї 118 бек біу Гей бек Ге АБпоїв) А1н 118 Аха 18о 155 150

112 Акху Ап обід Ака о тТлк о сіУ Акообіп пшімн Епе АіЗ Ака о обеб Ту Уді 1 цк зай яп 185 по о

Вхо Рхо Меб пе Ркго Ага РБє Уаї бій Уві Его біу сіу біу січ ї112е - зак -95 210 215 ві тва дкщо вве Теч: Акщо Бей дім сій тей І) Аід Аз ція Пес пі дер

Гуз Аку вБПпе їв Акз о їецп бій сій Тей 116 Аїа Аз оНів Мей обі Авр 288 230 235 240 їв! о Рбе вго бЗіу Меє біз ді Бей Азю Ні піз Аїа Бпе джу Тем ТБу лах 250 55

Ага Авпогсіцй Авзроуаї бі Ті сій сій АвроБзій бегосій Ап оГей ї1в 289 85 27о ще шин нн МАН во ПІІ Тіз тої ех кто Тр ст, ТУ кот

Сіп Аза тей біб Аза біз Гео Бей Ахо Ак Ак РБє сіу Рус Рко її

АкЯ во бій І1іе Тпх Авр оАзо Меї дев осбій мМаї такт о Меї Аврогеч Бей 255 255 зп

УуВі Акцошіцй Геб Аврої1е ТНК о АвБроїецй сій Маї тук Ага Бец о рко Зі

З05 зт За з20

Рго іецз Ав о пев Ака біб Гей ве Ази Теми одеї Ато тів Азов Аку рко

Авроївеч Ака о Тук РБко Рго Бі Бей РІО Тпжх Ту АтТа Узі Аїд Ре віп 320 345 350

Рго діа Зіу бак Беї Авгп о Ака Аів Ази Іі Рпе пуб Ага 118 Ак Був

Уа НИ ви до У ро пек АБроУаі Печ Уді Вів о нів ко Ттук піп дек Ре тТпУ Тпгобет Уді 370 375 155

Сіп Аа пе пеб о біз біп Аза діа вата АБр о Рто Ніє Уді Гек Аа ї18 383 350 35 405

Був сзіп Тпї БГеєс ТУуї АтЯ Тк обЗеї спі Авропеїт Рхо Узі Уві сіп Ага 015 210 415

Тен Ті Авр Ат Аївз бів Аїа Б1і1у Ппудк о біп Уві їГез Аїа Пец оУді біз

Ал ал дз бе бро я жея

Ууаї Пув Аіа АкоО Епе Авросій дів Ап АБвь о Їїїіе уа1і Тгродів АкЯ їх 435 445 443 й лі тах пл дою зла мл. т те бля Фр хх теці ліц ех шеря о точи їв бій пув Атїв о сш1і1у уві Бів уУаі Ууді Тук Зі їв Уаї біу Тен Буд лаг дп да 456 4135 455 ть ша дося тстд - пл тех хто тт кт пут 313 02135 т ту Минотоди

ТВЕ нів 'сбує Гуд Гез Аїа гео уаї 118 Ак озізч біб ій с01у Ме пец 4655 ати аа 450

Акта нів Тут бек нів уаї біу ТЕ Оу АвпоТтТУух Адп о вгО МБУу5 Тк Зех 250 455

Акта їі туї 515 АБО о вБпе біу бецй о Рпе Ток діа Адо Аіа сіп уві п1іУу

Зо Зп5 іо 7 туя тот тім цих щит - йо ит т щотлизе зу т па - А

Був Авр опеч тТаХ АкКкЯ Бей) РБе АБп обі пен бек біу тТУух АТЗ І185 піц 313 525 З

Був пуш пе Був АкдоБец тео Узі Атїа Рко Бей Ні Тец Ахо Гв бі вла тре ЧДНИ

Іо 535 545 їн о І1іє Акшосіб ІчІ12 Азр Аїа біц Ато Аку Ап о Ата бій від с1Уу її 545 5 253 з5о

Ск дів ція тів ву; т тк г лову лез Мр худ шт З т тла

РІО Атїа Ніз т1іе Аку І1е пу Уві Азп оШеїх Мео Уві Акробін січ ї118е

ЗБ 570 З75 112 Авродіа геб Туї Ак Ата деї Атв Аза піу уві Туз Уві АкроУві

ЗО 55 За тлу яхлн Ди ниушнише ше и ни і а нина ня ти: у ке х Зх - пеау

ТЕр уві Ак с5іУу І1е Сув бек Бей Ага ТБжї Авроїву АноосіУу Іїе беї 235 опо ОЗ

АзвроАБі о т11в о так оУві Ага о Євк тів еп оз1Уу Аж ТУукК їшц сіб; нів бехї сля дл деп ві сао ев

Агуч її ЕПе дід пе о біц Авп дів сі АвроБтІб біп Уаї тук ІТ1е 01у

БЕ 530 38 вад зеї Атїа АвроМаг Меї нів Агу Ап Гей дкр о Ака Ага Уаї сін Ата о бец 645 850 625 уві Акц Уаї тик о Авр оАїа АвроНів Гей Був іп ів о сЗіп о АтА Ре ве оо ве ж

Ар опеп Аїд Мес Аве оАросіу Тйпх бек бек ТТ нів ви Оу Афа о йпіуУу

З 28 35

У толтв бак я жит тя я дод тА - о що см ета тат м шк тла біу Уві ТтрБ Біб Акад нія Аіа Уаї вадп о Аза дво бі Був ро Ген їі 050 635 та

АБробво пій АдроГбуб Тих Мекопіу Ге) Ті Зі) Ата Акл АхЧ Акч Аза

ТО 10 ТЕЗ ТЕО

Акт Аза Уві Ако «Х1О0» 18 стилів 17590 з -В «хі дНЕ

Мал я. піки щоки иа сті Бид Міскорасівєгічці «0» пкт 203 суттиуцл іт і ет ль, «Тіз різноманітні ознаки «каз прі бактеріальний їіз5ляж І - 5-й «Еш «2215 різнамакітні ознаки «піз кодує 155 рібссомну РНК «ВВ «21» різноманітні ознаки чт ох сла «ах чив... 35, сива поє в, С. З, Б ота інші си? «хі» візноманіотні сзнаки

Аж Где кАНИ ау сивих св... «З?» бпоє а, С, З, Є та інші «ап ій запусдсоцвас всузацесеЯї стсогцЗтаЩси зишплпіщлаїй псесспоссахь засасоєтає стаасстцсос спуастсвтатч дасзацчцеоєсї сдцазестся спебазсвсто давтассазга пап на сдсчавсзсові сопсбовастас бостлааатвс БІ ласс ут зчдасодоасос дечопссіаЕе лави нон азстватісЧа гсдазчсотаветт псссСассавае спецісчЧасул Чптасссеос Єплпеаласоано

Ай аспсапссвся студчассяв сдвсасцоесос впассоестас позасасалс васоцедаах х0о вкпдсвасває падеуславас счаєдсвоас ваосдословає свсапчаєчас опоссвсооа

Зо квас шесссбапсовту сЧсаацазласоя ввапстчавсод о спессіссача вазвососся ар

Ему чЧестазвсосвсц Сцссвдсаде ссосопдоаата сабадалосот вас ваєс содаассаєо аа сдласставва васесцовоя сша ся сптостустеє давабсоссла дпастсвассї

Ай

ШВАМИ падшссісса здрчузопасазч Ззсасастазча соУусаціача осуазаєсода весшсгоа о талопзсода вІчспсАдлаї в'овоадавсда всапесдата сплазцачсасдв о пегобоссо газсцяусодеа вгоспсяцеає восвацапода асассчцасал слтавозсада пекоацесо пт

Чівассцвся стуводвоаст ваводалпч сачсвавсах сдпесбтачасас сстотваде хо сасссопус ва возссцодаа сівостцьоозв здагссаєтсс асадаїтосо павсосатсх 7да ва дасосовібва штвбссеспес бледадотас сппссасавист стаздасься адапзадетод атошвоовща дос ссоссосс сулсцваосас пасочодач Сопзвансосв папа ооид

ЧНІ сотоаусассся сасавоцєсоае ссассасзлсоя сассавісосз вслсвасуєт зауаасстга 500 ссвадслсста авсабвтлаєла павасодяцеса спаваатоалтсаяа ассстесача састосокдай сачебоацієс авгоузссватея сосвостсас ссоіпадаєо созацетава госссасаасх г їх 1925 ацпчусавсс соч сстаст гбпесацсеає слівасеткот цаасесвело дасвескозох то

Фпацсавасто дсвсдавоцо сооцатовсу бтавассатс вошдсссссов себе тодос ай и

Есаспсвоя ствсоватсудс сотгтвасваас счосопсвата ссадгзчаЗбосо дадслвассе тп їешчУ сававацосо шессосваєтсє сстастааозаї стдцовастсд асоксатєдав дістане ся зай 1269 сіауіазісЯ саЧагсацсва спосо сзвніасцссс ссздассісб сСатсасносує узи 1380 ссптсватос авгуввалост піазсасесто авачссофатоя сствассссв діодачачає 138 сечесцавих 1335 еп з

КАМ 1 «Рі Зай оо пщцк «122 ДНК скіЗ32» Вид Мусовровекеіїв «ВЕ» «їі» різноманітні ознаки «ей? щО51і Зактеріальний ізолят ЗсІі-010-НІЇ

ЧЕ»

«трі рівноманітні ознаки «ЕЕВз Бнкутрішній транскрибований спейсто 1 5.85 рібосомна ДНК зай «аг стгіЗ вМізноманітні оззнаки спр 453,.143 пе х453)..143; «аз пошє а, С, ц, або клея «її» врБівноманітні ознаки сФсЕвез 1325)..152К) «Е23» м 'є в, с, й, Во ї «пз 11 сочазачатс аесвассвас свацапуєса сссссавосі сспасосцс Чідвасосв

МАО) пгабсубсоцето сшодасцесас сотссооос пеодеавосс соссоазчає сарсазавсд ти 120 сіцчсвоЕстоє асуссолазс азазнацчіївда спПовагавнавз сті ссаасав садуассьсте 159 чат гссалов жсуастцдавца вспоапеолчав вхчспасвал лав іоаат Басадпазаико гуд; 240 азсзавіштво ссавоссоспоїї васоссвсахо доеосссольіо поасоссало доподсаоссї

ОВ чЧеселацчеЗе сасесссасса сісаваассс ст чааво падсосодоео вщстсосУє зай чессспосвва шпсссспосо шрссцатьсу бстсоссавасл стптцдеваас Багоссосаа пл

Не гочаттасча десодпцссзя сосптовавсс їстсвзача паассссцла плевдлтатйуч о абассоцивоа аавсбсаащех стапсазсаач псодводацто сабаципеосу ще 232 «5102 19 «вії 41431 ст19» пНК алу іти Лк Зал жит, ій2 Бид УВткїОоссСТтах «Зо» «гі» різноманітні ознаки «ЕЕ3» ЖІ пактерізльний іЗззляшж рі -014- 501 дО «221? різноманітні свзваки «223» кодує 155 рібссомну РНЕ «по» 12

КоссЄгасає вгцсваціст авасодесвасоа спесачсває сссидсодоо впспасзаас ак) чачісачсва басвоспсаа сосчсосвай сапочосстає аасспсазсла васесроагасе засассусво впувссівст бОвісваацса попузгатссса вуассвоасо сзвасодашо здлоессвочос азастачога псосоцо паче твавчоцостса ссавосотіс пдасстапазо дп «чо таадготсваса дластассач ссвсастлоє васіпзопдвсас зпчдоссазась сстасодоаас 200 чсассвУусоча хсавсосоітзев всвастучсоз вватлеостчаї ссавацссвояс соесопсосвоц зай аслаавтоссс беуаоосота засоцетооо споаспцазол ваасцасост сістазеааа

А 7

У чачадетаво сдавсосляссЯ бдяааятаво сассозцссай сптасоцассв досвассдео 459 гаатасусєва пдослозазоя главостодаз стастпожмьяа певацечтяс десзалосзое вт

Ай аслпіавцаса здесасцавасє соосцпосос васстцацав ссдсасссяк Частасаєат о сіачвсбаса слгатазчлозчт абпувасссс споезсчтасса пссааатосо Саастасясу чадозасвос дассоссват ссавоссосо сдасстлрас поавосЗсотсаг Зсзслазвос -п 712 чечЧослачесв авсавоозчатта бсасасосслу сбвосссасцс сстваводає чісавсооцї та

Пе косе содоо бсзогцдастс восгвдасовзад стазвсдецед вало ласоЯ сопоцоадаці

Ай па асцуссцсва ласссавасо сзаазччвнао дасласаасо счдсвсавоцсо дсодаєчавх зап за0 слаб савосї ссасосавося сставааасої басссзоссо гуасаїсобас длавітодпесс

ЗБ азачасоацсо бадпсссосзв авсасавсося саасасачоє шпасссшатцврю Сороса бсвос - у кт --н о - - - - з - я с хх -а 1025

Ксуєстсдоя авсасесооя гравзоасосоо спасчазтедсо васлосстосєс абсачесоасх асагісвлис ппусавсссста вісазастоас споаосдаснав сслсалосаво діод дасвіча 1150 сппсвацісс гсвосцоссо гастазаслоач соссвсасаєсот псагасавіс депоигасаз тай 1220 азачспчсса апсспссцаза спсспазовбзає сосвсозаває сазлтеостато ссаЗчагсоса чесЕссавос спастцсзотї аацссчозає соссовЧчсваї сзссдастсяс ватдісавуу тслаабводпох сесозоувсво стасасвосоцд слсосдлослсяс свбладацео дастссадсся чавосвуЧсся чЧчесоадссоей авадаочсоа звргбастасоя салаті сто ч 1431 -хіпз і5 ри чик скіх 1428 «І2з ДдНЕ сЕ13з Басі1іїйв8 вшузїбоііцицвтівсівпе5 «г» «Тіз різноманітні свнаки сказ щі бактеріальний ізолят 55І-015-Б07 зпй кл вя «гі» різноманізні ознаки стей» кодує 105 пібсссмну РНК «Япо» 15 яті кити ки вот тт чия лу тя пит єкти вати очи ти зни ниття солуссцсояо щшоссватсаса сосзачссода десзсасачає сзавасосясо посовоасою «а у іастетттите ех итогу Кеті гр ит що пебдечруі етері задо в кру вощх сут в уже вон

Бачедссаца сачлоцазчіа всавсссослає васссчстсьо сбвачассо возасгссоз 128 чавассочац стаасассЯя віл спаасосзсатя чЧесссадзсаг вавазадоаце де 185 кгсодосвос втсідсазає сцасососяа оповіттазсї вчітодлізао чгватоцоено пд да нссазвоцоца соавоцссльве соссеасотсач воаосочваієдч сссвсасолуо Ччасічазчвса зай пцпссосатас бсссавспода досадоааста сдодвавстко сзпсзасоазчас дчазачстод 80 ие що дес и пихи их ді пощое ко гол учи ці у у доти ут зних віч що с«ечадсавод содестявас басосавоок сгоссдавсяє давоасосвяє пастассдав

СУ чдвасавцчсцєс саресаваїа сопсспесвос сбтовоЧдптас ствассвоува ачосвосязчох зп ож па и р із и ие году дізуєтуту я др ще пять клич мощі рун р Я пющо З вузі засіасціас свусацесоас сдівасасцо вазіпоасват сзоеціссло вастагопоз ди

АВ сліаввочас беусвцасах кЕІсттдває стовсчілай вадопесопдлс педаєссоміси сплтазацадс гсцовцоса сбБІсставоє стовотядбсаа вадсолсоссаде БбозассозЯа «о асопассассо савазсіоссаЯ авсосодатоЯя сасзвзачасоав спазлподнаєс сстаслотад й сота свавсоя сосбавцавпаєса сшсаодцавса ссвстодосдса аздодастсов сторо зга пп астчатоасса асузвостпава чспсдоцава спавсвзацасЄ седаїассок дасалпросає -ав 28

Чосцчівавосод звочачсосїв астзссадао сисісессост ссопапкоюЕ довоасгвася шк най паїтавцсодс фБосасссозу дастасуасєс цпезачассча аасхІсавато авагосвоспоа по чассопсвсеа вобчосоазчат сасссоЗзеоо вавагосуцазус васосдвзачав вссосовссед ода шле

Честелаєво спапосцасай бостаачає апппеціссо сптесоаздоацяс ваза сва тазо та зипирповта понагпоелтсд пер ит и и нклпалдтчттях адігадооос ссптадстада дкоадціасата щшепапестса сосссочоцісЯя спала сдбгавасос состаасавос їпво чдсавстоста восослати совосаціса зЗІтплоЧоевосї ставоалтцас соасолосла тлиг 1150 завсочлчвуч аздасцоасча сзЗасзссава ссавсавосс ссотабчаєс лоадчєсасас пп

ТД чоЗЕшсЕвзса агупавсазва сзавадоасауч сдазвзассося вадегаззсс загсоссасваз їгвп 1569 адостасксотс аасясцеавов ссадтстдоз вастсцистцє щбавалотоаз автсясівцЕ 1330

Я сис зассусзчлво сауовсоссося сСосідаасає піт сссадцо сесіотасаса содссосцоса зло

Зо свпсвосвоа писодставза зссцпавциси чиЕдадоаєая со тАдІА їз счят. ; ст102 14 «рії» 1475 сі лпНЕ кі12 днк «213» Бвсіїїца зсрсі1і5 «КО» «хі» різноманітні сзнаки «ваз» жщОі Зактеріальний ізолят щоб1-0215-НОБ «дя чий «ші? різноманітно созвнаки «883» кодув 155 рібссомну РНК «апоОо» 14 часа сасог сСссопавсво асзсаасосЯ впоссдаасацча содчасьоя стссстовех 0 тБацецеца водоспад васаспслач свасстяссс цсдачассояо дЧчатзаєсоссят та 128

Фзазвасстоя поссветасст дахсоазовакЕ спвасстсаї пустсадаєх Савнаацатоє 185 спад сстас о сасібсалтача сспопассосаооа споФдсастацшс сладіісвпа дасвасзасе

ЗАй

Ка сассзазчаса авосдводеста ссосавассоча дазчоацілаїс аассасассч сдпастсавпас зап - У асцосесвца срсссавопгв воплпсовлсачі апудваїсі ссасавацода соаавауєсг асочацсввс сдесасцібсач годагсдавляє тоб оспдвассо саввоцатобо під ізоазлоа щ асдзасвациіц спеубссазвзаї васпососсвс соспвсалов ссізассада вваспссвосодо ав . гтаасівсаста ссадсалост ссплоавтатсо сбвоплітодтав педчиатосо дчаатовисоцї

БАЗ досстазациа стопсвасазсЯ сдесспсотавау сбетслатасча вадососодзо стсвассЗос впй свв чачадчосвото слсчавзвосбоЗзЯа бдастізачо сппсацавасдсзоалй апазлтоачавс поссасооата пз чсччуєдаває дедівцазасї сіспцачуаає вссвцсласл о вазлосавоссс боса гсц свв застовслої сдавуавоцсова впсцоплоопавз дпсовасвача ссвзабвососс годдтазьсса зву вай соосттавас сдаблазсост авчочогалпа спас стссдо ссесгтаціяс сСтоазссвас щ чсасбзатса стосусотох сставсоасзоє стсавчассу ааастсозава давссозосЧа зай

Чдадсссцовс аавЧеоціозла ссасзчодоє свассслдвах сввоцезаво аассїітасса й чассісдаса босстстосдса втісствдаца бвозастісс ссттевнвюо савчалесаса та2о

ЗА дао цдсас пдассцісцоо восгсарасс підваа ої адлстаалос стстосавсцчат то й спозатссто дабосгтазос: сосвосасс вросадасас ссбзачасла стдссвозхода 1150 1288 сзазвссозад дцазоссоцоза абзпасцісав восвосацос сссповодас стадиссаса това сасуєбпсстає вабсуасача асазацосва сдозсаваассас пазли адяс сазісссвся 1700 1329 завсстбспвост свусссосає стсазоссос звавсісчасьт сзічавоасоо цЧазьсосотат 1380 ївзасбсчссляа бсасовсцсс песепоспавала спріссхюв ссопосасас всопосспспо

Й асассасзлад асесгоабавос ассссаавасс ччатзлазавав спасе «8102 18 «11» 57

«т5х19з ДЕК «2153 Штучна посліловність «Оз сто ПДР праймер М13-ТТІ «апп» 15 гоаїадзасса пзчцстафцтсї соасвааісаа. псгдепо ат «ВІ» 16 -сІїз ЗЕ «212з ДНК «їх13з Штучна послідовність сто «аз ПЛР праймер ІТ53-М13 «по» ії6 сацчавасад стасавосго птссуствах сгдагасос 25 «8Іі10О0» 17 «8115 «212з ДНЕ «5135 Штучна посліловність «ЕЕ» «із ПЛР праймер МІ1З-2Тк Вас «4п95 17

Етптіоаввасзца сподссвуцеа тачесбсато спасе «8102 18 «8112 37 «8195 днк «213» Штучна послілеовність «дО» «жа» ЦИЛР праймер 149558-М12 Вас і: «4пор» 15 своадвлдасад стабчасосчу стасастрате асо --

КЗ

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділений мікробний штам, вибраний зі штаму 501І-014-0501 виду Мапомогах, депозит МЕКІ. В-50469, і його варіантів, які мають пестицидну активність, де штам і його варіанти мають супресорну активність проти фузаріозу.

2. Виділений мікробний штам за п. 1, де вказаний мікробний штам містить послідовність ДНК ЗЕО І МО: 12.

3. Біологічно чиста культура мікробного штаму за п. 1.

4. Збагачена культура мікробного штаму за п. 1.

5. Композиція для пригнічення фузаріозу, яка містить мікробний штам або його культуру за будь-яким із пп. 1-4 і ефективну для сільськогосподарського виробництва кількість сполуки або композиції, вибраних з групи, яка складається з акарициду, бактерициду, фунгіциду, інсектициду, мікробіциду, нематициду, пестициду і добрива.

6. Композиція для пригнічення фузаріозу, яка містить мікробний штам або його культуру за будь-яким із пп. 1-4 і носій.

7. Композиція за п. 6, де вказаним носієм є носій, прийнятний для сільського господарства.

8. Композиція за п. 6, де вказаним носієм є насіння рослини.

9. Композиція за п. б, де вказана композиція отримана у формі складу, вибраного з групи, що складається з емульсії, колоїду, пилоподібного препарату, гранули, кульки, порошку, спрею, емульсії і розчину.

10. Композиція за п. 6, де вказана композиція являє собою склад, який покриває насіння.

11. Насіння, яке має покриття, що містить композицію за п. 6, де покриття насіння пригнічує фузаріоз у рослини, яка виростає з цього насіння.

12. Спосіб запобігання, інгібування або обробки проти розвитку фузаріозу, де вказаний спосіб включає вирощування мікробного штаму або його культури за будь-яким із пп. 1-4 в середовищі для росту або грунті рослини-хазяїна перед вирощуванням або одночасно з вирощуванням рослини-хазяїна у вказаному середовищі для росту або грунті.

13. Спосіб за п. 12, де вказаний фузаріоз викликаний фітопатогеном рослини.

14. Спосіб за п. 13, де вказаний фітопатоген являє собою Ризапит дгатіпеагит. Зо

15. Спосіб запобігання, інгібування або обробки проти розвитку фузаріозу рослини, де вказаний спосіб включає нанесення на рослину або на середовище навколо рослини ефективної кількості мікробного штаму або його культури за будь-яким із пп. 1-4.

16. Спосіб за п. 15, де вказаний мікробний штам або його культуру наносять на грунт, насіння, корінь, квітку, листок, частину рослини або всю рослину.

17. Спосіб за п. 15, де вказана рослина є сприйнятливою до Ризагійт дгатіпеагит.

18. Спосіб за п. 15, де вказаною рослиною є пшениця, кукурудза, ячмінь або овес.

19. Спосіб за п. 15, де вказаний мікробний штам або його культура є встановленим(ою) як ендофіт до вказаної рослини.

20. Рослина, яка є рослиною, штучно інфікованою мікробним штамом або його культурою за будь-яким із пп. 1-4.

21. Спосіб отримання сільськогосподарської композиції, що включає стадії, на яких мікробний штам або його культуру за будь-яким із пп. 1-4 інокулюють в або на субстрат, і дозволяють вказаному мікробному штаму або його культурі рости при температурі 1-37 "С до отримання клітин або спор в кількості щонайменше 102-103 на мілілітр або на грам.

22. Штам Малоуогах 5р., який містить послідовність ДНК, що демонструє щонайменше 8590 ідентичності послідовності ДНК ЕС ІО МО: 12, де вказаний штам Маломогах 5р. має пригнічувальну активність проти фузаріозу.