MX2014001076A - Composiciones y metodos para controlar la fusariosis. - Google Patents

Abstract

En la presente se proporcionan composiciones que comprenden cepas y cultivos microbiológicos y métodos de uso de estas; determinadas cepas, cultivos y composiciones de estos son útiles para el control de fusariosis, por ejemplo, de varias plantas de cultivo; también se proporcionan composiciones de control biológico, y métodos de uso de estas para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de enfermedad o patógenos vegetales y para conservar el rendimiento de la planta.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA CONTROLAR LA FUSARIOSIS INCORPORACIÓN DE LISTADO DE SECUENCIAS El material en el Listado de secuencias adjunto se incorpora por la presente en su totalidad. El archivo adjunto, llamado "SGI1520-1WO_ST25.txt", se creó el 24 de Julio de 2012 y pesa 55 Kb. Puede accederse al archivo utilizando Microsoft Word en una computadora con el sistema operativo Windows.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención guarda relación con el control biológico de enfermedades fitopatógenas. Específicamente, guarda relación con las composiciones y métodos útiles en el control de la fusariosis en plantas gramíneas, tales como el trigo y la cebada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La fusariosis, también conocida como fusariosis de la espiga, hongo rosado, hongo blanco y pudrición seca, es una enfermedad devastadora que afecta el trigo, la cebada y varios otros cultivos de cereales en el mundo, particularmente en Estados Unidos, Europa y China. Esta enfermedad puede alcanzar niveles epidémicos y causar un extenso daño a los granos, especialmente al trigo y la cebada en áreas de cultivo de cereales húmedas y semihúmedas del mundo, lo que incluye India, Rusia, Francia, Alemania y Reino Unido. Particularmente, la fusariosis o fusariosis de trigo es una de las enfermedades más dañinas para el trigo en los Estados Unidos. A nivel nacional, la enfermedad ha causado pérdidas de millones de dólares norteamericanos a la industria del trigo. En el medio oeste y las altas llanuras, la fusariosis del trigo es el mayor obstáculo en la producción de trigo de los últimos años. La fusariosis, además de atacar al trigo, también ataca y se reproduce en cebada, avena, maíz y otros tantos cereales.

Esta grave enfermedad de las plantas puede ser causada por varios fitopatógenos pero principalmente por varias especies del género de hongos Fusarium. Por ejemplo, los agentes causantes de la enfermedad fusariosis en el trigo pueden incluir una cantidad de diferentes especies de Fusarium, por ejemplo, F. culmorum, F. graminearum (teleomorfo Gibberella zeae), F. avenaceum (teleomorfo, G. avenacea), F. poae, así como también patógenos no pertenecientes al género Fusarium tales como Microdochium nivale (teleomorfo, Monographella nivalis) y Microdochium majus. En los Estados Unidos, Europa y la mayoría de las áreas importantes del mundo desde el punto de vista agrícola, el agente predominante que causa la fusariosis es Fusarium graminearum (telemorfo, Gibberella zeae, stricto sensu).

Estos patógenos normalmente sobreviven en los desechos vegetales. Invaden y dañan las espiguillas de la espiga durante la floración, lo que impide u obstruye parcialmente el desarrollo del grano de la espiga. Como resultado, el patógeno de fusariosis invasor puede matar parte de la espiga o toda la espiga. Algunas semillas infectadas carecen de energía y no logran germinar. Las semillas infectadas que germinan frecuentemente mueren tempranamente en la etapa de plántula debido a la putrefacción de la corona o de la raíz, lo que causa una mala postura en la siguiente planta de cultivo. Las plántulas saludables también pueden infectarse en la emergencia. Además de una mala y débil postura, las pérdidas de rendimiento debido a la infección por patógenos pueden ser bastante elevadas si las condiciones son favorables para el desarrollo de la enfermedad.

Los patógenos fúngicos del género Fusarium se esparcen en las áreas de cultivo de cereales de todo el mundo y se sabe que causan daños graves, particularmente en áreas con un nivel elevado de precipitaciones entre la floración y la formación del grano. Cuando Fusarium graminearum es el agente causante, esta enfermedad es de una preocupación primordial ya que no solo reduce el valor comercial de los granos contaminados, además de las pérdidas de rendimiento, sino que, dado que la infección por Fusarium puede conducir a la acumulación de micotoxinas tricotecenas en los granos, también amenaza la salud de los seres humanos y del ganado. Las tricotecenas son grandes contaminantes micotóxicos de cereales a nivel mundial, lo que causa rechazo a la alimentación, vómitos, diarrea y pérdida de peso en animales no rumiantes e implican un riesgo para la salud de otros animales y seres humanos cuando los niveles de exposición son elevados. Esta amenaza se ha exacerbado por el reciente cambio en las cepas de F. graminearum en Estados Unidos en cuanto a una mayor producción de toxinas y mayor potencia. Las micotoxinas que se encuentran con mayor frecuencia son deoxinivalenol (DON, también conocida como vomitoxina) y zearalenona (ZEA). El deoxinivalenol en particular es una toxina muy peligrosa, que causa trastornos gastrointestinales junto con afecciones hemorrágicás y similares en seres humanos y animales que consuman los granos infectados, lo que conduce a la muerte en algunos casos. Dado que el deoxinivalenol generalmente es estable en cambios de pH y altas temperaturas, la desintoxicación puede resultar muy difícil. Por tanto, los granos contaminados más allá de un nivel determinado no pueden utilizarse en forma alguna de destilación, procesamiento o alimentación de ganado y por tanto a menudo es necesario deshacerse de ellos.

Al día de la fecha, se han diseñado varias estrategias para controlar la fusariosis en las plantas de cultivo. Las opciones prometedoras incluyen medidas químicas, el desarrollo de cultivares de cultivo resistentes y prácticas tradicionales de rotación de cultivo y labranza de campos. Entre estas opciones, los pesticidas químicos son bastante efectivos en la reducción de la infección de fusariosis, pero los residuos generan preocupación en cuanto a que el uso de los fungicidas en etapas tardías del desarrollo del cultivo, normalmente en las etapas de floración tan solo unas pocas semanas antes del cultivo, pueda disminuir su efectividad. También están ocurriendo avances en el desarrollo de cultivares resistentes que utilizan cultivo tradicional y modificación genética que representan otra alternativa para el control de la enfermedad. Los ejemplos registrados de avances en modificación genética incluyen la alteración del producto de una hormona vegetal o la manipulación de la vía de señalización de la hormona vegetal. En los últimos años, se han hecho avances considerables en el área del cultivo tradicional al entenderse la base de la genética de la resistencia a la fusariosis y se ha registrado una cantidad de genes y loci de rasgos cuantitativos (QTL) que confieren resistencia. Sin embargo, el progreso en la mejora de la resistencia de los cultivos a la enfermedad de la fusariosis ha sido lento, más que nada por la dificultad de estudio de esta enfermedad. De hecho, actualmente se entiende poco sobre los mecanismos implicados en la resistencia o la susceptibilidad. Adicionalmente, la diversidad genética de la especie Fusaríum, que son los agentes predominantes que causan la enfermedad, a menudo aumenta la preocupación con respecto a qué tan duradera será la eficacia de los fungicidas químicos y de los cultivares resistentes. Como resultado, prácticamente todos los cultivares de trigo que tienen actualmente una producción a gran escala son vulnerables a la infección.

Adicionalmente, si bien puede esperarse algo de éxito en el control de la fusariosis mediante las prácticas tradicionales tales como el arado de los campos para enterrar los residuos de los cultivos infectados con el agente causante, por ejemplo, F. graminearum, luego de la recolección, el labrado convencional de los campos luego de la recolección no es compatible con la práctica de conservación del suelo de labranza mínima. Al considerar el potencial de la dispersión inoculante a larga distancia y la diversidad de cultivos que pueden funcionar como huéspedes alternativos para los patógenos, la rotación de cultivos es a menudo una solución insostenible. Adicionalmente al problema de los residuos de pesticidas en el ambiente, los registros de resistencia a los pesticidas y los aumentos de instancias con contenido DON en el grano también pueden generar preocupaciones sobre su uso. Adicionalmente, los costos y la preocupación creciente en los sectores públicos y privados acerca de los residuos de pesticidas en el ambiente y la seguridad en la producción de alimentos han hecho que este control alternativo de la enfermedad se vuelva menos atractivo, y ha llevado a pedidos de cultivos que utilicen pesticidas lo menos posible.

En resumen, a pesar de los avances considerables en el desarrollo de técnicas para controlar la fusariosis, reducir el impacto de esta enfermedad devastadora en la producción de granos y en la calidad sigue siendo un problema intratable. Por lo tanto, la identificación y desarrollo de nuevas técnicas de control para la fusariosis es esencial en la mejora de la producción y la calidad de muchos cultivos de cereales. Estos problemas requieren una solución urgente no solo en los Estados Unidos sino también a nivel mundial, lo que incluye Asia y Europa.

El control biológico de la fusariosis ha atraído un interés considerable desde mediados de la década de 1990. Los agentes de control biológico (BCA), si bien actualmente son un número limitado, podrían constituir un método aceptable desde el punto de vista ambiental para disminuir sustancialmente el nivel de la enfermedad incitada por patógenos tales como Fusarium. La aceptación del público, la compatibilidad con otras medidas de administración y la durabilidad son algunos de los factores favorables a favor del desarrollo de estrategias para el control biológico de la enfermedad fusariosis. Los agentes de control biológico pueden cumplir una función importante en la producción de cereal orgánico. En la producción convencional, tales agentes pueden extender la protección de las espigas hasta luego de la etapa de floración y después de que ya no se puedan aplicar los fungicidas químicos. Al día de la fecha, se han logrado avances en el área del control biológico. Por ejemplo, determinadas cepas de bacterias que producen esporas (tales como especies de Bacillus y Pseudomonas) y levaduras (tales como especies de Cryptococcus) son prometedoras en cuanto al control de la enfermedad fusariosis y en cuanto a la reducción de la contaminación micotóxica. Sin embargo, a pesar de estos y otros avances, persiste la necesidad de microorganismos mejorados para el uso en el control biológico de la fusariosis. Si bien los BCA se han vuelto una solución más aceptable para los patógenos vegetales y los productos con BCA se han promocionado más que antes, al día de la fecha ha habido pocos intentos de desarrollar estrategias y microorganismos antagonistas para el control biológico de la fusariosis. Además, el ciclo de vida de Fusarium spp. y otros agentes causantes de la fusariosis indica que los patógenos pueden ser potencialmente susceptibles a las técnicas de control biológico que utilicen microorganismos antagonistas en diferentes etapas de desarrollo. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar nuevos agentes de control biológico, preferentemente con diferentes modos de acción, asi como también métodos de biocontrol que puedan ayudar eficazmente a prevenir o impedir el desarrollo de la fusariosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se proporcionan composiciones que comprenden cepas y cultivos microbiológicos. Determinadas cepas, cultivos y composiciones de estos son útiles en el control de la fusariosis, por ejemplo, varios cultivos de plantas que incluyen el trigo y otras plantas gramíneas. También se proporcionan composiciones de control biológico y métodos para el uso de estas para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de patógenos o enfermedades vegetales y para preservar el rendimiento de las plantas. También se proporcionan métodos para el uso de tales composiciones como agentes de control biológico en combinaciones con otros compuestos o composiciones eficaces desde el punto de vista agrícola para el control de patógenos vegetales dañinos.

En un aspecto, la presente invención proporciona cepas microbianas aisladas que tienen una actividad supresora contra la fusariosis. Las cepas microbianas, de acuerdo con este aspecto de la presente invención, se seleccionan del grupo que consta de los géneros Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella y Variovorax. En algunas modalidades preferidas, las cepas microbianas se seleccionan del grupo que consta de Mycosphaerella sp. cepa SGI-010-H11 (depositada como NRRL B-50471), Microbacterium sp. cepa SGI-014-C06 (depositada como NRRL B-50470), Variovorax sp. cepa SGI-014-G01 (depositada como NRRL B-50469), Bacillus sp. cepa SGI-015-F03 (depositada como NRRL B-50760), Bacillus sp. cepa SGI-015-H06 (depositada como NRRL B-50761) y variantes activas como pesticidas de cualquiera de estas. La cepa microbiana de acuerdo con algunas otras de las modalidades preferidas pueden comprender una secuencia de ADN que exhibe al menos un 85 % de identidad de secuencia con cualquier de las secuencias de nucleótidos en el Listado de secuencias. Se proporcionan adicionalmente cultivos puros desde el punto de vista biológico y cultivos enriquecidos de las cepas microbianas que se describen en la presente.

También se proporcionan en otro aspecto de la presente invención composiciones que comprenden una cepa microbiana de la invención o de un cultivo de esta, y una cantidad eficaz desde el punto de vista agrícola de un compuesto o composición seleccionada del grupo que consta de un acaricida, un bactericida, un fungicida, un insecticida, un microbicida, un nematicida, un pesticida y un fertilizante. Las composiciones en algunas modalidades de este aspecto pueden prepararse como una formulación seleccionada del grupo que consta de una emulsión, un coloide, un polvo, un granulo, un sedimento, un polvo, un aerosol, una emulsión y una solución. En algunas otras modalidades, las composiciones pueden proporcionarse con un portador. En algunas modalidades preferidas, el portador es un portador aceptable desde el punto de vista agrícola. En algunas modalidades particularmente preferidas, el portador es una semilla de planta. En otras modalidades preferidas, la composición es una formulación de recubrimiento de semilla. Adicionalmente se proporcionan en la presente descripción semillas que tienen un recubrimiento con una composición de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de un patógeno vegetal. Los métodos implican cultivar una cepa microbiana de la invención o un cultivo de esta en un medio de cultivo o suelo de una planta hospedadora antes de que la planta hospedadora crezca o durante su crecimiento en el medio de cultivo o suelo. En algunas modalidades preferidas de este aspecto, el patógeno vegetal causa fusariosis. En algunas modalidades particularmente preferidas, el patógeno vegetal es Fusaríum graminearum.

En aun otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de la fusariosis en una planta. Los métodos implican la aplicación a la planta, o a los alrededores de la planta, de una cantidad efectiva de una cepa microbiana de la invención o un cultivo de esta. En una modalidad, dicha fusariosis es causada por el hongo Fusaríum graminearum. En algunas modalidades de este aspecto, la cepa microbiana o cultivo de esta se aplica al suelo, a una semilla, una raíz, una flor, una hoja, una parte de la planta o la planta entera. En una modalidad preferida, la planta es susceptible a Fusaríum graminearum. En otras modalidades, la planta es una planta de trigo, una planta de maíz, una planta de cebada o una planta de avena. En otra modalidad preferida, la cepa microbiana de la presente invención o cultivo de esta se establece como un endófito en la planta.

Otro aspecto adicional de la invención proporciona plantas de origen no natural. Las plantas de origen no natural se infectan artificialmente con una cepa microbiana de la invención o un cultivo de esta. En algunas modalidades preferidas de este aspecto se proporcionan adicionalmente semillas, tejido reproductor, tejido vegetativo, partes de plantas y progenie de las plantas de origen no natural.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona un método para preparar una composición agrícola. El método implica inocular la cepa microbiana de acuerdo con la presente invención o un cultivo de esta en o sobre un sustrato y permite que crezca a una temperatura de 1-37 °C hasta obtener una cantidad de células o esporas de al menos 102-103 por milímetro o por gramo.

Estos y otros objetos y características de la invención se volverán más evidentes a partir de la descripción detallada de la invención y las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Algunas definiciones A menos que se defina de otra forma, todos los términos, notaciones y otros términos o terminología científica de la técnica empleada en la presente tienen los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, se definen en la presente términos con significados comúnmente comprendidos con fines de claridad y/o para hacer una referencia específica, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe ser necesariamente interpretada como una representación de diferencia sustancial respecto a lo que generalmente se entiende en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o mencionados en la presente se entienden y emplean comúnmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica.

La forma en singular "un", "una" y "el/la" incluye referencias en plural a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una o más células, e incluye mezclas de estos.

Las expresiones "microorganismo antagonista" y "antagonista microbiano" cuando se usan de manera intercambiable en referencia a un microorganismo se pretende que signifiquen que la cepa de la presente exhibe un grado de inhibición de fusariosis que excede, a un nivel estadísticamente significativo, el de un control sin tratamiento.

Antibiótico: el término "antibiótico", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier sustancia que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por uno o más de los siguientes: 1) un microorganismo, 2) un proceso sintético, o 3) un proceso semisintético. Un antibiótico puede ser un microorganismo que secreta un compuesto orgánico volátil. Además, un antibiótico puede ser un compuesto orgánico volátil secretado por un microorganismo.

Bactericida: el término "bactericida", tal como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una composición o sustancia de aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de bacterias. La inhibición de la tasa de crecimiento de bacterias puede cuantificarse comúnmente como la reducción de células bacterianas viables durante el tiempo.

Control biológico: el término "control biológico" y su forma abreviada "biocontrol", como se usa en la presente, se define como el control de un patógeno o insecto o cualquier organismo no deseado mediante el uso de al menos un segundo organismo que no sea un ser humano. Un ejemplo de un mecanismo conocido de control biológico es el uso de microorganismos que controlan la descomposición de la raíz al ocupar el espacio que ocuparían los hongos en la superficie de la raíz, o microorganismos que inhiben el crecimiento o matan el patógeno. La "planta hospedadora" en el contexto de control biológico es la planta que es susceptible a la enfermedad causada por el patógeno. En el contexto del aislamiento de un organismo, tal como una especie fúngica, de su ambiente natural, la "planta hospedadora" es una planta que sustenta el crecimiento del hongo, por ejemplo, una planta de una especie de la cual el hongo es un endófito.

Se pretende que el término "cereal" tal como se usa en la presente, se refiera a cualquier especie de cereal que pueda ser susceptible a fusariosis. Los cereales que se ha reportado son susceptibles incluyen trigo, cebada, avena y triticale, aunque el trigo y la cebada son los dos cultivos en los cuales la enfermedad representa un problema económico significativo.

Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. En términos de manejo, tratamiento, inhibición o protección de la enfermedad, una cantidad eficaz es la cantidad suficiente para suprimir, estabilizar, revertir, enlentecer o retrasar la evolución de la infección o enfermedad objetivo. Como tal, la expresión "una cantidad eficaz" se utiliza en la presente en referencia a aquella cantidad de tratamiento antagonista que es necesaria para obtener una reducción en el nivel de desarrollo del patógeno y/o en el nivel de enfermedad patógena en relación con la que ocurre en un control sin tratamiento. Típicamente, una cantidad eficaz de un tratamiento de antagonista dado proporciona una reducción de al menos 20 %; o, más típicamente, entre 30 y 40 %; más típicamente, entre 50-60 %; incluso más típicamente, entre 70 y 80 %; e incluso más típicamente, entre 90 y 95 %, en relación con el nivel de enfermedad y/o el nivel del desarrollo de patógenos que ocurre en un control sin tratamiento bajo condiciones de tratamiento adecuadas. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. La tasa real de aplicación de una formulación líquida vanará usualmente entre un mínimo de alrededor de 1 X 103 a alrededor de 1 X 1010 células viables/mL y preferentemente de alrededor de 1 X 106 a alrededor de 5 X 109 células viables/mL. Bajo la mayoría de las condiciones, las cepas microbianas antagonistas de la invención descritas en los Ejemplos más adelante, será eficazmente óptima con tasas de aplicación en el intervalo de alrededor de 1 X 106 a 1 X 109 células viables/mL, asumiendo un modo de aplicación que lograría un contacto sustancialmente uniforme con al menos alrededor del 50 % de los tejidos de la planta. Si los antagonistas se aplican como formulación sólida, la tasa de aplicación debería controlarse para lograr una cantidad similar de células viables por área de unidad de superficie de tejido de plantas, como la obtenida mediante las tasas antemencionadas de tratamiento líquido. Típicamente, los agentes de control biológico de la presente invención son efectivos biológicamente cuando se administran a una concentración en exceso de 106 CFU/g (unidades formadoras de colonias por gramo), preferentemente en exceso de 107 CFU/g, más preferentemente 108 CFU/g y más preferentemente a 109 CFU/g.

Además, la expresión "antagonista microbiano eficaz" cuando se usa en referencia a un microorganismo se pretende que signifiquen que la cepa microbiana de la presente exhibe un grado de inhibición de fusariosis que excede, a un nivel estadísticamente significativo, el de un control sin tratamiento. Típicamente, una agente microbiano eficaz tiene la capacidad de producir una reducción de al menos 20 %; o, más típicamente, entre 30 y 40 %; más típicamente, entre 50-60 %; incluso más típicamente, entre 70 y 80 %; e incluso más típicamente, entre 90 y 95 %, en relación con el nivel de enfermedad y/o el nivel del desarrollo de patógenos que ocurre en un control sin tratamiento bajo condiciones de tratamiento adecuadas.

Composición: Se pretende que "composición" signifique una combinación de agente activo y al menos otro compuesto, portador o composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o etiqueta o portador líquido) o activo, tal como un pesticida.

Cepa microbiana aislada, cultivo aislado, cultivo biológicamente puro y cultivo enriquecido: Tal como se usa en la presente, el término "aislado" cuando se aplica a un microorganismo (por ejemplo, bacterias o microhongos) se refiere a un microorganismo que ha sido retirado y/o purificado del ambiente en el cual aparece naturalmente. Como tal, una "cepa aislada" de un microbio, tal como se usa en la presente, es una cepa que ha sido retirada y/o purificada de su entorno natural. Por lo tanto, un "microorganismo aislado" no incluye el que se encuentra en un ambiente en el cual aparece naturalmente. Además, el término "aislado" no refleja necesariamente la extensión en la cual el microbio ha sido purificado. Un "cultivo sustancialmente puro" de la cepa del microbio se refiere a un cultivo que sustancialmente no contiene otros microbios que la cepa o cepas deseadas de microbios. En otras palabras, un cultivo sustancialmente puro de una cepa de microbios está sustancialmente libre de otros contaminantes, que pueden incluir contaminantes microbianos, así como contaminantes químicos no deseados. Además, tal como se usa en la presente, una cepa "biológicamente pura" se pretende que signifique la cepa separada de materiales con los que se asocia normalmente en la naturaleza. Nótese que una cepa asociada con otras cepas, o con compuestos o materiales con los cuales no se encuentre normalmente en la naturaleza, se denomina de todos modos como "biológicamente pura". Un monocultivo de una cepa particular está, por supuesto, "biológicamente puro". Tal como se usa en la presente, el término "cultivo enriquecido" de una cepa microbiana aislada se refiere a un cultivo microbiano que contiene más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la cepa aislada.

Tal como se usa en la presente, un "endófito" es un endosimbionte que vive dentro de una planta durante al menos parte de su vida sin causar una enfermedad evidente. Los endófitos pueden transmitirse ya sea verticalmente (directamente de progenitor a progenie) u horizontalmente (de individuo a individuo no relacionado). Los endófitos fúngicos transmitidos verticalmente son típicamente asexuados y se transmiten desde la planta progenitora hasta la progenie por medio de penetración de la hifa fúngica en las semillas hospedadoras. Los endófitos bacterianos también pueden transferirse verticalmente desde semillas hasta plántulas (Ferreira et él., 2008). Por el contrario, los endófitos transmitidos horizontalmente son típicamente sexuales, y se transmiten por medio de esporas, y pueden expandirse por medio del viento y/o vectores insectos. Los endófitos de plantas de cultivo han recibido atención considerable con respecto a su capacidad de controlar tanto la enfermedad como la infestación por insectos, así como promover el crecimiento de la planta.

Proteína funcionalmente similar: La frase "proteína funcionalmente similar", tal como se usa en la presente, describe aquellas proteínas que tienen al menos una característica en común. Dichas características incluyen similitud de secuencia, actividad bioquímica, similitud de patrón transcripcional y actividad fenotípica. Típicamente, las proteínas funcionalmente similares comparten alguna similitud de secuencia o al menos una bioquímica. Dentro de esta definición, los homólogos, ortólogos, parálogos y análogos se consideran como funcionalmente similares. Además, las proteínas funcionalmente similares generalmente comparten al menos una actividad bioquímica y/o fenotípica. Las proteínas funcionalmente similares producirán la misma característica en un grado similar, pero no necesariamente igual. Típicamente, las proteínas funcionalmente similares proporcionan las mismas características donde la medición cuantitativa debido a una de las similares es de al menos 20 % de la otra; más típicamente, entre 30 y 40 %; más típicamente, entre 50-60 %; incluso más típicamente, entre 70 y 80 %; incluso más típicamente, entre 90 y 95 %; incluso más típicamente, entre 98 y 100 % de la otra.

Fungicida: Tal como se usa en la presente, "fungicida" se refiere a la capacidad de una composición o sustancia de disminuir la tasa de crecimiento de hongos o de aumentar la mortalidad de los hongos.

Hongo Fusarium: Para los fines de esta invención se entiende que el uso del término hongo Fusarium se pretende que incluya tanto la etapa sexual (teleomorfa) de este organismo como también la etapa asexual (anamorfa), también mencionadas como etapas fúngicas perfecta e imperfecta, respectivamente. Por ejemplo, la etapa anamorfa de Fusarium graminearum es Gibberella zeae, un agente que causa la fusariosis. Esta enfermedad ocurre típicamente cuando la cabeza de la flor o semilla se inocula con conidia producida por la forma imperfecta o ascosporas producidas por forma perfecta de este hongo.

Mutante: Tal como se usa en la presente, el término "mutante" o "variante" en referencia a un microorganismo se refiere a una modificación de la cepa progenitora en la cual la actividad biológica deseada es similar a la expresada por la cepa progenitora. Por ejemplo, en el caso de Microbacterium, la "cepa progenitora" se define en la presente como la cepa original de Microbacterium antes de la mutagénesis. Los mutantes o variantes pueden ocurrir en la naturaleza sin la intervención del hombre. También se pueden obtener mediante con o mediante una variedad de métodos y composiciones conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cepa progenitora puede ser tratada con un químico tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetanosulfona, o mediante radiación usando radiación por rayos gamma, X o ultravioleta, o mediante otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Nematicida: El término "nematicida", tal como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una sustancia o composición de aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de nemátodos.

Patógeno: El término "patógeno" tal como se usa en la presente se refiere a un organismo tal como un alga, un arácnido, una bacteria, un hongo, un insecto, un nemátodo, una planta parásita, levadura, un protozoario o un virus capaz de producir una enfermedad en una planta o animal. El término "fitopatógeno" tal como se usa en la presente se refiere a un organismo patogénico que infecta la planta.

Porcentaje del porcentaje de identidad: la "porcentaje de identidad de secuencia", tal como se usa en la presente, se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas ubicadas de manera óptima, durante una ventana de comparación definida por la longitud de la alineación local entre las dos secuencias. La secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo, huecos o excedentes) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación local de dos secuencias únicamente incluye segmentos de cada secuencia que se consideran los suficientemente similares, de acuerdo con un criterio que depende de un logaritmo usado para llevar a cabo la alineación (por ejemplo BLAST). El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en la que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100. La alineación óptima de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) Add. APL. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443,1970); mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444,1988), mediante implementaciones heurísticas de estos algoritmos (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ), o mediante inspección. Dado que se han identificado dos secuencias para su comparación, GAP y BESTFIT se emplean preferentemente para determinar su alineación óptima. Típicamente, se utilizan los valores por defecto de peso de huecos de 5,00 y 0,30 para la longitud de peso de hueco. El término "identidad de secuencia sustancial" entre secuencias polinucleótidos o polipéptidos se refiere a polinucleótidos o polipéptidos que comprenden una identidad de secuencia que es al menos 50 %, preferentemente al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, más preferentemente al menos 90 %, incluso más preferentemente al menos 95 %, y más preferentemente al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de sustancia comparada con una secuencia de referencia usando los programas.

La consulta de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos se pueden buscar contra secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de la invención que se encuentran en bases de datos públicas o privadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando el programa de Búsqueda de Alineación Local Básica del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI BLAST v 2.18). El programa NCBI BLAST está disponible en internet a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Típicamente se pueden utilizar los siguientes parámetros para NCBI BLAST: Las opciones de filtro se establecen en "por defecto", la Matriz de Comparación se establece como "BLOSUM62", el Costo de Hueco se establece como "Existencia: 1 1 , Extensión: 1 ", la longitud de palabra se establece como 3, la Expectativa (umbral E) se establece como 1e-3, y la longitud mínima para la alineación local se establece como 50 % de la longitud de secuencia consultada. La identidad y similitud de secuencia puede determinarse usando el software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. EUA).

El término "pesticida", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de una sustancia o composición de disminuir la tasa de crecimiento de una plaga, es decir, un organismo no deseado, o de aumentar la mortalidad de la plaga.

La "actividad supresora" de un agente de control biológico contra un patógeno significa la capacidad del agente de suprimir, inhibir, estabilizar, revertir, enlentecer o retrasar el desarrollo del patógeno en sí, o la evolución de la infección o enfermedades causadas por el patógeno.

Variante: Una "variante", tal como se usa en la presente, en referencia a un microorganismo, es una cepa que tiene características identificadoras de las especies a la que pertenece, mientras que tiene al menos una variación de secuencia de nucleótidos o un rasgo diferente identificable con respecto a la cepa progenitora, donde el rasgo es genético (hereditario). Por ejemplo, para una cepa SGI SGI-014-C06 de Microbacterium sp. que tiene actividad fungicida, los rasgos identificables incluyen 1) la capacidad de suprimir el crecimiento de Fusarium graminearum y su teleomorfo Gibberella zeae; 2) la capacidad de suprimir el desarrollo de fusariosis; 3) tener genes constitutivos con identidad de secuencia mayor que 95 %, mayor que 96 %, mayor que 97 %, mayor que 98 % o mayor que 99 % con los genes constitutivos de Microbacterium sp. SGI-014-C06 puede usarse para confirmar una variante como Microbacterium sp. SGI-014-C06.

En el caso de ácidos nucleicos y polipéptidos, el término "variante" se usa en la presente para denominar una molécula de polipéptido, proteína o polinucleótido con algunas diferencias, generadas sintética o naturalmente, en sus secuencias de aminoácidos o ácido nucleico, en comparación con un polipéptido o polinucleótido de referencia, respectivamente. Por ejemplo, estas diferencias incluyen sustituciones, inserciones, deleciones o cualesquiera combinaciones deseadas de dichos cambios en un polipéptido de referencia o polipéptido. Las variantes de polipéptidos y proteínas pueden consistir adicionalmente en cambios en la carga y/o modificaciones postraduccionales tal como glicosilación, metilación, fosforilación, etc.).

Todas las publicaciones y las solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara especifica e individualmente como incorporada a la presente mediante esta referencia.

No se admite que ninguna de las referencias constituya técnica previa. La discusión de las referencias establece lo que sus autores afirman, y los solicitantes se reservan el derecho a cuestionar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque haya una cantidad de publicaciones de la técnica previa mencionadas en la presente, estas referencias no constituyen una admisión de que ninguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común de la técnica.

Métodos para la identificación taxonómica Los microorganismos pueden, a menudo, diferenciarse en función de análisis microscópicos directos (si todas las células en una muestra se ven idénticas cuando se examinan), características de tinción, análisis molecular simple (tal como una determinación de restricción simple del polimorfismo de longitud de fragmento (RFLP)), y otros. Además de los ejemplos ilustrativos de dichas técnicas de análisis taxonómicos como se describe en los Ejemplos 2-3 de la presente descripción, la identificación taxonómica de un microorganismo puede implicar hasta varios niveles diferentes de análisis, y cada análisis se puede basar en una característica diferente del organismo. Dichos análisis taxonómicos pueden incluir análisis con base en ácidos nucleicos (por ejemplo, análisis de genes específicos individuales, ya sea con respecto a su presencia o su secuencia exacta, o la expresión de un gen o una familia de genes particulares), análisis con base en proteínas (por ejemplo, a un nivel funcional mediante ensayos de enzimas directos o indirectos o a un nivel estructural mediante técnicas de inmunodetección), y otros. a. Análisis con base en ácidos nucleicos: Un experto en la técnica entenderá que se conoce una amplia variedad de técnicas con base en ácidos nucleicos y que pueden ser útiles en la obtención de la identificación taxonómica de un microorganismo dado. Estas técnicas se pueden utilizar para identificar células mediante la secuencia de genes o para identificar células que presentan genes o familias de genes particulares. Las familias de genes comunes y útiles para los estudios taxonómicos incluyen la familia del gen 16S, la familia del gen de actina, y la familia del gen de recombinasa A {recA). Normalmente estos métodos incluyen la amplificación y secuenciación de genes a partir de pequeñas cantidades de células, y por lo tanto con frecuencia superan los problemas de concentración de células y su ADN de suspensiones diluidas. La frase "amplificación de ácido nucleico" en general hace referencia a técnicas que aumentan la cantidad de copias de una molécula de ácido nucleico en una muestra o espécimen. Las técnicas útiles para amplificar el ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Un ejemplo de amplificación del ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde una muestra biológica tomada de un sujeto entra en contacto con un par de cebadores de oligonucleótidos, en condiciones que permiten la hibridación de los cebadores en plantillas de ácido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden en condiciones adecuadas, se disocian de la plantilla y luego se vuelven a templar, se extienden y se disocian para amplificar la cantidad de copias del ácido nucleico. Otros ejemplos de técnicas de amplificación in vitro incluye amplificación por desplazamiento de la hebra; amplificación isotérmica sin transcripción; amplificación de reacción en cadena de reparación; reacción en cadena de ligasa; amplificación de reacción en cadena de ligasa de relleno de huecos; detección de ligasa acoplada y PCR; y amplificación sin transcripción de ARN.

Adicionalmente al ejemplo ilustrativo de cebadores que se proporciona en la presente, véase, por ejemplo, los Ejemplos 2-3 y el Listado de secuencias, los cebadores también han sido diseñados de manera rutinaria, y constantemente se diseñan nuevos, para especies individuales o grupos filogenéticos de microorganismos. Dichos cebadores dirigidos de manera restringida se pueden utilizar con los métodos descritos en la presente para analizar y/o identificar específicamente solo a los microorganismos de interés.

Se describen los métodos para preparar y usar cebadores de ácido nucleico, por ejemplo, en Sambrook et ál. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1989), Ausubel et ál. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1998). Los pares de cebadores para la amplificación pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas informáticos destinado a tales fines tal como Primer (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Un experto en la técnica entenderá que la especificidad de una sonda o cebador específico aumenta con su longitud. Por lo tanto, por ejemplo, un cebador que comprende 30 nucleótidos consecutivos de un nucleótido que codifica ARNr o región flanqueante de este se alineará a una secuencia diana con especificidad más alta que un cebador correspondiente con solo 15 nucleótidos. Por lo tanto, a modo de obtener mayor especificidad, se puede seleccionar sondas y cebadores que comprenden al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos diana tal como ARNr de 16S.

Las técnicas normales para la preparación de ácidos nucleicos útiles para las aplicaciones de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) incluyen la extracción de fenol/cloroformo o el uso de uno de los muchos kits de extracción de ADN que están disponibles en el mercado. Otra manera en que el ADN puede ser amplificado es mediante la adición de células directamente en la mezcla de reacción de la amplificación del ácido nucleico y la dependencia en la etapa de desnaturalización de la amplificación para lisar las células y liberar el ADN.

El producto de las reacciones de amplificación del ácido nucleico se pueden caracterizar adicionalmente mediante una o más de las técnicas estándar que son bien conocidas en la técnica, inclusive electroforesis, los patrones de escisión de las endonucleasas de restricción, la hibridación o ligación de oligonucleótidos, y/o la secuenciación de ácidos nucleicos. Cuando las técnicas de hibridación se utilizan a los efectos de la identificación celular, una variedad de métodos de marcado pueden ser útiles, incluso el marcado fluorescente, marcado radioactivo y el marcado no radioactivo. Cuando se usan las técnicas de secuenciación del ácido nucleico, se puede conducir una búsqueda de homología para la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico amplificadas usando varias bases de datos de secuencias conocidas, incluso, de modo no taxativo, las bases de datos DDBJ/GenBank/EMBL. b. Análisis con base en proteínas: Además del análisis de ácidos nucleicos, los microorganismos se pueden caracterizar de manera taxonómica e identificarse en función de la presencia (o ausencia) de proteínas específicas directamente. Dicho análisis se puede basar en la actividad de la proteína específica, por ejemplo, a través de un ensayo de enzimas o mediante la respuesta de un cocultivo de organismos o mediante la mera presencia de la proteína especificada (que puede por ejemplo determinarse usando métodos inmunológicos, tales como la tinción inmunofluorescente con anticuerpos in situ.) Ensayos de enzimas: A modo de ejemplo, los análogos de sustrato fluorescente o cromogénico se pueden incluir en el medio de crecimiento (por ejemplo, placa de microtitulación para cultivos), seguido de la incubación y el análisis para determinar los productos de reacción, lo cual identifica de esta manera los cultivos en función de sus actividades enzimáticas.

Respuesta de cocultivo: En algunas modalidades de la presente invención, la actividad de una enzima llevada a cabo por un microbiano aislado se puede analizar en función de la respuesta (o el grado de respuesta) de un organismo cocultivado (tal como un organismo reportero).

También se puede utilizar una variedad de métodos para la identificación de microorganismos seleccionados y aislados de un entorno fuente mediante la unión de al menos un anticuerpo o molécula derivada de un anticuerpo a una molécula, o más particularmente un epítopo de una molécula, del microorganismo.

Los anticuerpos antimicroorganismo de la proteína se pueden producir haciendo uso de procedimientos estándar descritos en una cantidad de textos que incluyen Harlow y Lañe (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1988). La determinación de que un agente particular se une básicamente solo a una proteína del microorganismo deseado se puede elaborar fácilmente mediante el uso o el ajuste de procedimientos de rutina. Un ensayo in vitro adecuado hace uso del procedimiento de transferencia de Western (descrito en muchos textos estándar que incluyen Harlow y Lañe (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1988)).

Los fragmentos más cortos de anticuerpos (moléculas derivadas de anticuerpos, por ejemplo, FAbs, Fvs, y Fvs de cadena simple (SCFvs)) también pueden servir como agentes de unión específica. Los métodos para elaborar estos fragmentos son rutinarios.

La detección de anticuerpos que se unen a células en un conjunto de la presente invención se puede llevar a cabo mediante el uso de técnicas estándar, por ejemplo los ensayos ELISA, que proporcionan una señal que se puede detectar, por ejemplo una señal fluorescente o luminiscente.

Cultivos aislados de la invención Tal como se describe más detalladamente en la sección de Ejemplos de la presente descripción, los Solicitantes han descubierto varios microorganismos novedosos agrícolamente beneficiosos, por ejemplo, supresores eficaces de fusariosis. En particular, estos microorganismos antagonistas son eficaces para reducir la gravedad de la fusariosis y para la inhibición del crecimiento de Fusarium graminearum, el principal agente causante de fusariosis en el trigo. Se identificaron los antagonistas microbianos a partir de un grupo de aproximadamente 5000 cepas microbianas que se obtuvieron a partir de muestras de plantas silvestres tomadas de varias localidades de los Estados Unidos. La selección inicial de microorganismos antagonistas se basó en la capacidad de los microorganismos de suprimir el desarrollo del patógeno de F. graminearum y de su teleomorfo Gibberella zeae en un ensayo de antagonismo in vitro. Luego, los antagonistas microbianos seleccionados se sometieron a un bioensayo en un estudio de invernadero en plántulas de trigo, el cual implica la inoculación de las plántulas con las cepas microbianas, seguido de inoculaciones reiteradas de esporas de F. graminearum, para determinar la capacidad de las cepas microbianas para disminuir la gravedad de infestación fúngica y la capacidad de conservar el rendimiento de la semilla. Se descubrió que los microorganismos antagonistas seleccionados de esta manera son eficaces en la disminución de la gravedad de la fusariosis en las pruebas de invernadero.

Los análisis taxonómicos determinaron adicionalmente que cada uno de los microorganismos antagonistas descritos en la presente descripción se relacionan estrechamente ya sea con el género bacteriano Microbacteríum, el género bacteriano Bacillus, el género bacteriano Variovorax o el género fúngico Mycosphaerella.

Generalmente se considera que el género Microbacteríum, el tipo de género de la familia Microbacteriaceae, presenta bacterias baciliformes Gram positivas que no forman esporas, las cuales originalmente se aislaron durante los primeros estudios realizados en bacterias que producen ácido láctico. Los miembros del género Microbacteríum se caracterizan originariamente a grandes rasgos por su marcada resistencia al calor, la presencia en lácteos, y la producción de pequeñas cantidades de L (+) ácido láctico a partir de glucosa. A diferencia de otros géneros de la familia Microbacteriaceae en que las especies se caracterizan mediante un tipo de peptidoglicano coherente, las especies de Microbacterium poseen ornitina o lisina ya sea en el puente inter-péptido o en la posición 3 del peptidoglicano tipo B. En otras propiedades quimiotaxanómicas, tales como quinonas isoprenoides (MK-11 , MK-12, MK-13), lípidos polares, ácidos grasos y composición base de ADN, los miembros del género exhiben la gama usual de diversidad que se encuentra en otros géneros de Microbacteriaceae. Los dos géneros bacterianos Microbacterium y Aureobacterium se pueden unir de conformidad con algunos estudios de taxonomía. A la fecha, los miembros del género Microbacterium comprenden al menos 33 especies, las cuales se han aislado de una amplia gama de hábitats, lo cual incluye suelos, productos lácteos, agallas vegetales, insectos o especímenes clínicos. Recientemente, Evtushenko y Takeuchi (2006) han sintetizado varios aspectos de su ecología, filogenia, taxonomía, métodos de cultivo y condiciones de preservación a largo plazo. Un experto en la técnica entenderá fácilmente que un microorganismo del género Microbacterium se puede identificar taxonómicamente a grandes rasgos mediante cualquier técnica de identificación taxonómica descrita anteriormente, lo que incluye el análisis quimiotaxonómico del peptidoglicano de la pared celular y el análisis comparativo de la secuencia de ADNr de 16S tal como se describe en Evtushenko y Takeuchi (2006) y las referencias que se citan en este, asi como también en aquellas descritas en los Ejemplos 2-3 de la presente descripción. Tal como se trata en detalle más adelante, a la fecha se ha registrado que varios microorganismos de origen natural presentan actividad antagonista contra la fusariosis. Sin embargo, no figuran registros anteriores a la presente invención que describan un microorganismo del género Mycobacterium con dicha actividad antagonista. Adicionalmente, previo a la presente invención, los presentes inventores no eran conscientes de la existencia de un método o proceso que utilizara una cepa bacteriana del género Mycobacterium como agente de biocontrol en la prevención, la inhibición o el tratamiento del desarrollo de un patógeno causante de la fusariosis.

El género Bacillus es un género de bacterias baciliformes, Gram positivas/variables, que forman esporas. De manera similar a otros géneros asociados al inicio de la historia de la microbiología, tales como Pseudomonas o Vibrio, aproximadamente 266 miembros de la especie del género Bacillus se encuentran de forma ubicua, y se considera que es uno de los géneros con la mayor diversidad de 16S y de diversidad ambiental. La especie Bacillus puede ser aerobia obligada o anaerobia facultativa, y dar positivo en la prueba de enzima catalasa. De naturaleza ubicua, Bacillus incluye tanto especies de vida libre como patógenas. En condiciones ambientales estresantes, las células producen endosporas ovaladas que pueden permanecer inactivas durante periodos de tiempo prolongados. Estas características definieron originalmente el género, pero no todas las especies están estrechamente relacionadas, y se pueden haber trasladado a otros géneros. De hecho, varios estudios han intentado reconstruir la filogenia del género. El estudio específico de Bacillus que cubre la mayor diversidad es el de Xu y Cote [Intl. J. of Syst.

Evol. Microbio!. 53 (3): 695-704; 2003], que usa 16S y la región ITS, donde se divide el género en 10 grupos, que incluye los géneros anidados Paenibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, arinibacillus y Virgibacillus. Sin embargo, de acuerdo con estudios más recientes, el género Bacillus contiene una cantidad muy grande de taxones anidados y especialmente tanto en 16S como en 23S, se considera que es parafilético de Lactobacillales (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, etc.), debido a Bacillus coahuilensis y otros (véase, por ejemplo, Yarda et él., Syst. Appl. Microbiol. 31 (4): 241-250, 2008; Yarda et ál., Syst. Appl. Microbiol. 33 (6): 291-299, 2010]. Un ciado particular, formado por B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudamycoides, B. thuringiensis y B. weihenstephanensis según los estándares actuales de clasificación, debería ser una única especie (dentro del 97 % de identidad con 16S), pero a causa de razones médicas, se consideran una especie aparte. Además de los métodos de análisis de taxonomía descritos en los Ejemplos 2-3 de la presente descripción, los análisis filogenéticos y taxonómicos de la especie Bacillus se pueden realizar mediante una variedad de técnicas, incluso aquellas que se tratan en detalle en Xu y Cote, 2003; Yarda et ál., 2008; Yarda et ál., 2010.

El género Variovorax se creó originariamente mediante la reclasificación de Alcaligenes paradoxus como Variovorax paradoxus (Willems et ál., 1991), que se considera como el tipo de especie de este género. Se ha estudiado V. paradoxus exhaustivamente como un modelo para los agentes de biodegradación novedosos, así como también las interacciones microbio/microbio y microbio/planta. Otras especies incluyen V. dokdonensis, V. soli (Kim et él., 2006), y V. boronicumulans (Miwa et ál., 2008). Las especies Variovorax son catabólicamente muy diversas y entablan interacciones mutuamente beneficiosas con otras especies bacterianas en muchas biodegradaciones, y por lo tanto poseen importancia ecológica y un alto potencial de aplicación. Por ejemplo, un metanotrofo del suelo, solo cuando se cocultivan junto con una cepa V. paradoxus, presenta alta afinidad por metano (un potente gas invernadero), y esta característica usualmente no se observa en cultivos de laboratorio. De manera similar, se ha descubierto que un pariente cercano de Variovorax es el compañero central, no fotosintético, dentro del consorcio fototrópico "Chlorochromatium aggregatum". Algunas especies del género Variovorax también tienen la capacidad de interferir con la comunicación de otras bacterias. Aun otras especies del género Variovorax pueden interactuar íntimamente con otra biota (por ejemplo, plantas) en varios ecosistemas. Además, se ha registrado que algunas especies de Variovorax, que habitan en el área justo afuera de las raíces de la planta y/o dentro de la planta, son capaces de promover el crecimiento de la planta a través de la reducción de los niveles de etileno, la represión de patogénesis controlada por la percepción de quorum, y el aumento de la resistencia a metales pesados, que en gran medida benefician la fitorremediación. Además de los métodos de análisis de taxonomía descritos en los Ejemplos 2-3 de la presente descripción, los análisis filogenéticos y taxonómicos de la especie Variovorax se pueden realizar mediante una variedad de técnicas, incluso aquellas que se tratan en detalle en otra parte de la presente.

Mycosphaerella es un género fúngico muy amplio, con más de 2000 nombres de especies y al menos 500 especies asociadas con más de 40 géneros anamorfos (especialmente Cercospora, Pseudocercospora, Septoria, Ramularia, etc.). Además, varios miles de anamorfos carecen de telomorfos. El género de Mycosphaerella incluye especies que son patógenos, saprobios, endofitos o asociaciones mutualísticas. Recientemente, se han registrado varios aspectos de su ecología, filogenia, taxonomía, métodos de cultivo y condiciones de preservación a largo plazo (véase, por ejemplo, Crous er ál., Persoonia, 23:119-146,2009). Un experto en la técnica entenderá fácilmente que el microorganismo del género Mycosphaerella se puede identificar taxonómicamente mediante cualquiera de las técnicas taxonómicas descritas anteriormente o una combinación de estas. Las técnicas más comunes incluyen los análisis de secuencia comparativa usando secuencias de ADNr de 16S y las regiones espadadoras transcritas internas, tal como se describe en, por ejemplo, Crous et ál., Studies in Mycology, 55:235-253,2006; Crous et ál., 2009, supra; Goodwin et ál., Phytopathology 91 : 648-658, 2001 ; y las que se describen en los Ejemplos 2-3 de la presente descripción.

Depósito de material biológico Los cultivos purificados de cepas microbianas, identificados como los que presentan una actividad supresora contra fusariosis, se depositaron en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola ubicado en 1815 N. University Street, Peoría, IL 61604, EUA (NRRL) de conformidad con el Tratado de Budapest a los efectos del procedimiento en materia de patentes y las regulaciones de este (Tratado de Budapest). Los números de registro de estos depósitos son los siguientes: Las cepas microbianas se han depositado en condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible, mientras que esta solicitud de patente se encuentre pendiente, para quien designe con este derecho el Comisionado de Patentes y Marcas Comerciales de conformidad con el artículo 37 del C.F.R. §1.14 y el título 35 del U.S.C. §122. Los depósitos representan básicamente cultivos puros de las cepas depositadas. Los depósitos están disponibles según lo requiera la legislación extranjera en materia de patentes en los países donde se presentan los equivalentes a la presente solicitud o su progenie. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en la práctica el objeto de la invención en menoscabo de los derechos de patente otorgados mediante acciones gubernamentales.

Los microorganismos preferidos de la presente invención presentan todas las características identificatorias de las cepas depositadas y, en particular, las características identificatorias de la capacidad de suprimir el desarrollo de la fusariosis tal como se describe en la presente, y la capacidad de suprimir el desarrollo del patógeno de Fusarium graminearum y su teleomorfo Gibberella zeae tal como se describe en la presente. En particular, los microorganismos preferidos de la presente invención hacen referencia a los microorganismos depositados tal como se describe anteriormente, y los m ufantes de estos.

Composiciones microbiológicas Las composiciones microbiológicas de la presente invención que comprenden las cepas microbianas aisladas o cultivos de estas pueden encontrarse en una variedad de formas, inclusive, de modo no taxativo, cultivos inmóviles, cultivos enteros, solución de células, micelio y/o hifas almacenadas (en particular, soluciones de glicerol), tiras de agar, tapones de agar almacenados en glicerol/agua, soluciones liofilizadas y soluciones secas tales como liofilizado o micelio secado en papel de filtro o semillas de grano. Tal como se define en la presente, se entiende que "cultivo aislado" o los equivalentes gramaticales, según se emplean en esta descripción y en la técnica, quiere decir que el cultivo al que se hace referencia es un cultivo de fluido, sedimento, raspado, muestra en seco, liofilado o sección (por ejemplo, hifa o micelio); o un soporte, contenedor, o medio tal como una placa, papel, filtro, matriz, paja, pipeta o punta de pipeta, fibra, aguja, gel, hisopo, tubo, recipiente, partícula, etc. que contiene un único tipo de organismo. En la presente invención, un cultivo aislado de un antagonista microbiano es un fluido de cultivo o un raspado, sedimento, preparación en seco, liofilado o sección del microorganismo, o un soporte, contenedor o medio que contiene el microorganismo, en ausencia de otros organismos.

La presente descripción proporciona adicionalmente composiciones que contienen al menos una cepa microbiana aislada o cultivos de esta de la presente invención y un portador. El portador puede ser cualquiera de uno o más de una cantidad de portadores que confieren una variedad de propiedades tales como mayor estabilidad, humectabilidad, dispersabilidad, etc. Los agentes humectantes tales como tensioactivos naturales o sintéticos, que pueden ser tensioactivos no iónicos o iónicos, o una combinación de estos se puede incluir en una composición de la invención. Las emulsiones de agua en aceite también se pueden utilizar para formular una composición que incluya al menos un microorganismo aislado de la presente invención (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 7,485,451 , la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia). Las formulaciones adecuadas que se pueden preparar incluyen polvos humedecibles, gránulos, geles, tiras de agar o sedimentos, espesantes y similares, partículas microencapsuladas, y similares, líquidos tales como fluidos acuosos, suspensiones acuosas, emulsiones de agua en aceite, etc. La formulación puede incluir productos en grano o legumbre (por ejemplo, grano de tierra o porotos, caldo o harina derivados del grano o porotos), almidón, azúcar o aceite. El portador puede ser un portador agrícola. En determinadas modalidades preferidas, el portador es una semilla, y la composición se puede aplicar o usar como recubrimiento sobre la semilla o dejar que sature a la semilla.

En algunas modalidades, el portador agrícola puede ser la tierra o un medio de crecimiento vegetal. Otros portadores agrícolas que se pueden utilizar incluyen agua, fertilizantes, aceites con base en vegetales, humectantes o combinaciones de estos. De manera alternativa, el portador agrícola puede ser un sólido, tal como tierra diatomácea, marga, sílice, alginato, arcilla, bentonita, vermiculita, vainas, otros productos animales y vegetales o combinaciones, que incluyen gránulos, sedimentos o suspensiones. Las mezclas de cualquiera de los ingredientes antemencionados también se consideran portadores, tales como de modo no taxativo, pesta (harina y arcilla de caolín), sedimentos a base de agar o harina en marga, arena o arcilla, etc. Las formulaciones pueden incluir fuentes alimenticias para los organismos cultivados, tal como cebada, arroz, u otros materiales biológicos como semilla, partes de planta, bagazo de caña de azúcar, cáscaras o cañas a partir del procesamiento del grano, material de la planta sobre la tierra (por ejemplo, "desechos de jardín") o madera de los desechos de un sitio de construcción, aserrín o pequeñas fibras del reciclaje de papel, tela o madera. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.

En la forma líquida, por ejemplo, las soluciones o suspensiones, los microorganismos se pueden mezclar o suspender en agua o en soluciones acuosas. Los diluyentes o portadores líquidos adecuados incluyen agua, soluciones acuosas, destilados de petróleo u otros portadores líquidos.

Las composiciones sólidas se pueden preparar mediante la dispersión de microorganismos antagonistas en y sobre un portador sólido adecuadamente dividido, tal como turba, trigo, salvado, vermiculita, arcilla, talco, bentonita, tierra diatomáeea, tierra de Fuller, suelo pasteurizado, y similares. Cuando dichas formulaciones se utilizan como polvos humedecibles, se puede emplear agentes dispersantes biológicamente compatibles tales como agentes dispersantes y emulsionantes no iónicos, aniónicos, anfotéricos o catiónicos.

En una modalidad preferida, las composiciones contempladas en la presente previenen el ataque de la fusariosis sobre las plantas, en particular las plantas gramíneas, tales como trigo, cebada, avena y maíz y, si se usan en cantidades suficientes, actúan como antagonistas microbianos. Estas composiciones, de manera similar a los demás agentes de biocontrol, tienen un alto margen de seguridad ya que normalmente no quema ni daña la planta.

Tal como se describe en mayor detalle en la presente descripción, el control de la fusariosis se puede efectuar mediante la aplicación de uno o más composiciones microbiológicas de la presente invención a una planta hospedadora o partes de una planta hospedadora. Las composiciones se pueden aplicar en una cantidad eficaz para reducir el nivel de fusariosis con relación a la del control sin tratar. Los constituyentes activos se utilizan en una concentración suficiente para inhibir el desarrollo del patógeno de la planta del patógeno de la planta diana cuando se aplica a la planta gramínea. Como será evidente para un experto en la técnica, las concentraciones eficaces pueden variar en función de factores tales como: (a) el tipo de la planta o materia prima agrícola; (b) el estado fisiológico de la planta o materia prima agrícola; (c) la concentración de patógenos que afectan la planta o materia prima agrícola; (d) el tipo de daño de la enfermedad a la planta o materia prima agrícola; (e) condiciones climáticas (por ejemplo, temperatura, humedad); y (f) la etapa de la enfermedad de la planta. De acuerdo con la invención, las concentraciones normales son aquellas mayores que 1 X 102 CFU/mL de portador. Las concentraciones preferidas oscilan entre alrededor de 1 X 104 a alrededor de 1 x 109 CFU/mL, tal como las concentraciones que oscilan entre 1 X 106 y 1 X 108 CFU/mL. Las concentraciones más preferidas con aquellas de alrededor de 35 a alrededor de 150 mg de masa microbiana seca por gramo de portador (formulación seca) o por mililitro de portador (composición líquida). En las formulaciones sólidas, la tasa de aplicación debería controlarse para lograr una cantidad similar de células viables por área de unidad de superficie de tejido de plantas, como la obtenida mediante las tasas antemencionadas de tratamiento líquido. Típicamente, los agentes de control biológico de la presente invención son efectivos biológicamente cuando se administran a una concentración en exceso de 106 CFU/g (unidades formadoras de colonias por gramo), preferentemente en exceso de 107 CFU/g, más preferentemente 108 CFU/g y más preferentemente a 109 CFU/g.

En algunas modalidades, la cantidad de uno o más de los agentes de control biológico en las composiciones microbianas de la presente invención pueden variar en función de la formulación final así como también el tamaño o el tipo de planta o semilla utilizada. Preferentemente, el uno o más agentes de control biológico en las composiciones microbianas están presentes en aproximadamente 2 % p/p a aproximadamente 80 % p/p de la formulación total. Más preferentemente, el uno o más agentes de control biológico empleados en las composiciones es aproximadamente 5 % p/p a aproximadamente 65 % p/p y más preferentemente aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 60 % p/p en peso de la formulación total.

Tal como lo entenderán los expertos en la técnica, las composiciones microbiológicas de la invención se pueden aplicar en las plantas de trigo u otros cereales usando una variedad de métodos convencionales tales como espolvoreo, recubrimiento, inyección, frotación, con rodillo, inmersión, pulverización o cepillado, o cualquier otra técnica adecuada que no dañe significativamente la planta de trigo u otros cereales a ser tratados. Particularmente se prefiere el método de pulverización.

Normalmente, las composiciones de la invención son químicamente inertes; por lo tanto son básicamente compatibles con cualquier constituyente del programa de pulverización. También se pueden utilizar en combinación con agentes pesticidas activos biológicamente compatibles como, por ejemplo, herbicidas, nematicidas, fungicidas, insecticidas, y similares. También se pueden utilizar en combinación con sustancias que afectan el crecimiento de las plantas, tales como fertilizantes, reguladores del crecimiento de las plantas, y similares, siempre que dichos compuestos o sustancias sean biológicamente compatibles.

Cuando se usan como pesticidas o fungicidas en sus formulaciones comercialmente disponibles y en las formas de uso, preparadas a partir de estas formulaciones, los antagonistas microbianos activos y las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden estar adicionalmente presentes en la forma de una mezcla con sinergistas. Los sinergistas son compuestos mediante los cuales se incrementa la actividad de las composiciones activas sin que sea necesario que el sinergista agregado sea activo en sí mismo.

Cuando se usan como pesticidas en sus formulaciones comercialmente disponible y en sus formas de uso, preparados a partir de estas formulaciones, los antagonistas microbianos activos y las composiciones de acuerdo con la invención pueden además estar presentes en la forma de una mezcla con inhibidores que reducen la degradación de las composiciones activas después de la aplicación en el hábitat de la planta, en la superficie de partes de las plantas o en los tejidos de la planta.

Los antagonistas microbianos activos y las composiciones de acuerdo con la invención, como tales o en sus formulaciones, también se pueden usar como una mezcla con acaricidas, bactericidas, fungicidas, insecticidas, microbicidas, nematicidas, pesticidas conocidos o combinaciones de estos, por ejemplo, a fin de ampliar el espectro de acción o impedir el desarrollo de resistencias de este modo. En muchos casos, dan como resultado efectos sinérgicos, es decir, la actividad de la mezcla puede superar la actividad de los componentes individuales. También se contempla una mezcla con otros compuestos activos conocidos, tales como fertilizantes, reguladores del crecimiento, protectores y/o semiquímicos.

En una modalidad preferida de la presente invención, las composiciones pueden incluir adicionalmente al menos un pesticida químico o biológico. La cantidad de al menos un pesticida químico o biológico empleado en las composiciones puede variar en función de la formulación final así como también el tamaño de la planta y la semilla a tratar. Preferentemente, el al menos un pesticida químico o biológico empleado es alrededor de 0,1 % p/p a alrededor de 80 % p/p con base en la formulación total. Más preferentemente, el al menos un pesticida químico o biológico está presente en una cantidad de alrededor de 1 % p/p a alrededor de 60 % p/p y más preferentemente alrededor de 10 % p/p a alrededor de 50 % p/p.

Una variedad de pesticidas es evidente para un experto en la técnica y los puede utilizar. Los pesticidas químicos de ejemplo incluyen los que se encuentran en las clases de carbamato, organofosfato, organoclorado, y piretroide. También incluye agentes de control químico tales como, de modo no taxativo, benomil, bórax, captafol, captan, clorotalonil, formulaciones que contienen cobre; formulaciones que contienen diclon, dicloran, yodo, cinc; fungicidas que inhiben biosíntesis de ergosterol tales como de modo no taxativo blasticidina, cimoxanilo, fenarimol, flusilazol, folpet, imazalil, iprodiona, maneb, mancozeb, metalaxilo, oxicarboxina, miclobutanilo, oxitetraciclina, PCNB, pentaclorofenol, procloraz, propiconazol, quinometionato, arsenito de sodio, DNOC de sodio, hipoclorito de sodio, fenilfenato de sodio, estreptomicina, azufre, tebuconazol, terbutrazol, tiabendazol, tiofanato de metilo, triadimefón, triciclazol, triforina, validamicina, vinclozolin, zineb y ziram. Una variedad de compuestos insecticidas pueden ser útiles para las composiciones de la invención, que incluye de modo no taxativo los que se citan en la solicitud de patente estadounidense N.° 20110?33432?1.

Las composiciones microbiológicas de la presente invención incluyen preferentemente al menos un pesticida biológico. Los pesticidas biológicos de ejemplo que son adecuados para su uso en la presente y que se pueden incluir en una composición microbiológica de acuerdo con la presente invención para prevenir una enfermedad patógena de la planta que incluye microbios, animales, bacterias, hongos, material genético, planta y productos naturales de organismos vivos. En estas composiciones, el microorganismo de la presente invención se halla aislado antes de la formulación con un organismo adicional. Por ejemplo, los microbios tales como, de modo no taxativo, especies de Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces y Trichoderma, se pueden proveer en una composición, de manera particular se prefieren los microorganismos antagonistas de la presente invención, con cepas fúngicas del género Muscodor. El uso de las composiciones microbiológicas de acuerdo con la presente invención en combinación con los antagonistas microbianos descritos en la patente estadounidense N.° 7,518,040; la patente estadounidense N.° 7,601 ,346; la patente estadounidense N.° 6,312,940 también se prefiere de manera particular.

Los ejemplos de hongos que se pueden combinar con antagonistas microbianos y composiciones de la presente invención en una composición incluyen, de modo no taxativo, especies Muscodor, Aschersonia aleyrodis, Beauvería bassiana ("muscarina blanca"), Beauvería brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps facis, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutellae, Fusaríum lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae ("muscarina verde"), Metarhizium flctviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans y especies micorriza tales como Lacearía bicolor. Otras especies micopesticidas serán evidentes para los expertos en la técnica.

La presente invención también proporciona métodos para el tratamiento de una planta mediante la aplicación de cualquiera de una variedad de formulaciones habituales en una cantidad eficaz ya sea al suelo (es decir, en el surco), a una parte de la planta (es decir, mojar) o a la semilla antes de plantarla (es decir, recubrimiento de la semilla o abono). Las formulaciones habituales incluyen soluciones, concentrado emulsionable, polvos humedecibles, concentrado de suspensión, polvos solubles, gránulos, concentrado de suspensión-emulsión, materiales naturales y sintéticos impregnados con el compuesto activo, y cápsulas de liberación controlada muy finas en sustancias poliméricas. En determinadas modalidades de la presente invención, las composiciones de control biológico son formuladas en polvos que están disponibles ya sea en una formulación lista para su uso o son mezcladas entre sí al momento del uso. En cualquiera de estas modalidades, el polvo se puede mezclar con el suelo antes o en el momento de la plantación. En una modalidad alternativa, uno o ambos de ya sea el agente de control biológico o el agente de control de insectos es una formulación líquida que se mezcla al momento del tratamiento. Un experto en la técnica entiende que una cantidad eficaz de las composiciones de la invención depende de la formulación final de la composición así como del tamaño de la planta o el tamaño de la semilla a ser tratada.

Dependiendo de la formulación final y el método de aplicación, uno o más aditivos adecuados también pueden introducirse a las composiciones de la presente invención. Pueden agregarse adhesivos, tal como carboximetilcelulosa y polímeros naturales y sintéticos en la forma de polvos, gránulos o látex, tal como goma arábiga, quitina, alcohol polivinílico y acetato de polivinilo, así como fosfolípidos naturales, tal como cefalinas y lecitinas, y fosfolípidos sintéticos, a las composiciones de la presente.

En una modalidad preferida, las composiciones microbiológicas están formuladas en una solución, emulsión o suspensión individual y estable. Para las soluciones, los compuestos químicos activos (es decir, los agentes de control de plagas) se disuelven típicamente en solventes antes de que se agregue el agente de control biológico. Los solventes líquidos adecuados incluyen aromáticos a base de petróleo, tal como xileno, tolueno o alquiinaftalenos, hidrocarburos alifáticos, tal como ciclohexano o parafinas, por ejemplo fracciones de petróleo, aceites minerales y vegetales, alcoholes, tal como butanol o glicol así como sus éteres y esteres, cetonas, tal como metil etil cetona, metil isobutil cetona o ciciohexanona, solvente altamente polares, tal como dimetilformamida y dimetil sulfóxido. Para emulsiones y suspensiones, el medio líquido es agua. En una modalidad, el agente de control químico y el agente de control biológico se suspenden en líquidos separados y se mezclan al momento de la aplicación. En una modalidad preferida de suspensión, el agente de control de insectos y el biológico se combinan en una formulación lista para utilizar, que presenta una vida útil de al menos dos años. En el uso, el líquido puede pulverizarse o puede aplicarse foliarmente como por pulverización o en el surco al momento de plantar el cultivo. La composición líquida puede introducirse en el suelo antes de la germinación de la semilla o directamente en el suelo en contacto con las raíces mediante la utilización de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, de modo no taxativo, irrigación por goteo, rociadores, inyección en el suelo o mediante el empapado del suelo.

Opcionalmente, se pueden agregar estabilizadores y amortiguadores, incluyendo sales de metales alcalinos y alcalinotérreos y ácidos orgánicos, tal como ácido cítrico y ácido ascórbico, ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. También pueden agregarse biocidas y pueden incluirse formaldehídos o agentes de liberación de formaldehído, y derivados de ácido benzoico, tal como ácido p-hidrobenzoico.

Formulación de recubrimiento de semillas En algunas modalidades preferidas en particular, las composiciones de biocontrol de la presente invención se formulan como un tratamiento de semillas. El tratamiento de semillas comprende preferentemente al menos un agente de control de insectos y al menos un agente de control biológico. Se contempla que las semillas puedan cubrirse sustancialmente de manera uniforme con una o más capas de las composiciones de biocontrol divulgadas en la presente usando métodos convencionales de mezcla, pulverización o una combinación de estos a través del uso de equipamiento de aplicación de tratamiento que se diseña y fabrica específicamente para aplicar de manera precisa, segura y eficiente los productos de tratamiento de semillas a las semillas. Dicho equipamiento utiliza varios tipos de tecnología de recubrimiento tal como recubridores rotatorios, recubridores de tambor, técnicas de lecho fluidizado, de lechos con salida a chorro, rociadores rotatorios o una combinación de estos. Los tratamientos para semillas líquidos tal como los de la presente invención pueden aplicarse por medio ya sea de un disco rotatorio "atomizador" o una boquilla pulverizadora que distribuye de forma pareja el tratamiento de semilla en las semillas mientras se mueve a lo largo de un patrón de pulverización. Preferentemente, la semilla luego se mezcla o se precipita durante un período de tiempo adicional para lograr la distribución adicional del tratamiento y el secado. Las semillas pueden estar imprimadas o no antes del recubrimiento con las composiciones de la invención para aumentar la uniformidad de germinación y surgimiento. En una modalidad alternativa, una formulación de polvo seco puede colocar de forma medida en las semillas en movimiento y se deja mezclar hasta que se distribuye por completo.

Otro aspecto de la invención proporciona semillas tratadas con las composiciones microbiológicas de la presente. Una modalidad proporciona semillas que tienen al menos parte del área de superficie recubierta con una composición mícrobiológica de acuerdo con la presente invención. En una modalidad específica, las semillas tratadas con microorganismos tienen una concentración de esporas o una concentración de células microbianas de alrededor de 106 a alrededor de 109 por semilla. Las semillas también pueden tener más esporas o células microbianas por semilla, tal como, por ejemplo 1010, 10 1 o 1012 esporas por semilla. Las esporas microbianas y/o las células pueden recubrir libremente las semillas o, preferentemente, pueden formularse en una composición líquida o sólida antes de recubrir las semillas. Por ejemplo, una composición sólida que comprende los microorganismos puede prepararse por mezclado de un portador sólido con una suspensión de las esporas hasta que los portadores sólidos están impregnados con la suspensión de esporas o células. Esta mezcla puede entonces secarse para obtener las partículas deseadas.

En algunas otras modalidades, se contempla que las composiciones de biocontrol sólidas o líquidas de la presente invención contengan adicionalmente agentes funcionales capaces de proteger las semillas de los efectos dañinos de herbicidas seleccionados, tal como carbono activado, nutrientes (fertilizantes) y otros agentes capaces de mejorar la germinación y la calidad de los productos o una combinación de estos.

Los métodos y composiciones de recubrimiento de semillas que son conocidos en la técnica pueden ser particularmente útiles cuando se modifican mediante la adición de una o más de las modalidades de la presente invención. Dichos métodos y aparatos de recubrimiento para su aplicación se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,918,413; 5,554,445; 5,389,399; 4,759,945; y 4,465,017. Varias composiciones de recubrimiento de semillas se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente estadounidense n ° US20110033432, US20100154299, las patentes estadounidenses n.° 5,939,356; 5,876,739, 5,849,320; 5,791 ,084, 5,661 ,103; 5,580,544, 5,328,942; 4,735,015; 4,634,587; 4,372,080, 4,339,456; o 4,245,432, entre otras.

Puede agregarse una variedad de aditivos a las formulaciones de tratamiento de semillas que comprenden las composiciones de la invención. Pueden agregarse aglutinantes, incluyendo aquellos compuestos preferentemente de un polímero adhesivo que puede ser natural o sintético sin efectos fitotóxicos en la semilla que va a ser recubierta. El aglutinante puede seleccionarse de acetatos de polivinilo; copolímeros de acetato de polivinilo; copolímeros de acetato de etilenvinilo (EVA); alcoholes polivinílicos; copolímeros de alcohol polivinílico; celulosas, incluyendo etilcelulosas, metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosas y carboximetilcelulosa; polivinilpirrolidonas; polisacáridos, incluyendo almidón, almidón modificado, dextrinas, maltodextrinas, alginato y quitosanos; grasas; aceites; proteínas, incluyendo gelatina y zeínas; goma arábiga; goma laca; cloruro de vinilideno y copolímeros de cloruro de vinilideno; lignosulfonatos de calcio; copolímeros de acrílico; polivinilacrilatos; óxido de polietileno; polímeros y copolímeros de acrilamida; acrilato de polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida; y policloropreno.

Puede emplearse cualquiera de una variedad de colorantes, incluyendo cromóforos orgánicos clasificados como nitroso, nitro, azo, incluyendo monoazo, bisazo y poliazo; acridina, antraquinona, azina, difenilmetano, indamina, indofenol, metina, oxazina, ftalocianina, tiazina, tiazol, triarilmetano, xanteno. Se pueden agregar otros aditivos, incluyendo oligonutrientes tal como sales de hierro, manganeso, boro, cobre, cobalto, molibdeno y cinc. Puede aplicarse un polímero u otro agente de control de polvo para conservar el tratamiento en la superficie de la semilla.

En algunas modalidades específicas, además de células microbianas y las esporas, los recubrimientos pueden comprender adicionalmente una capa de adherente. El adherente debería ser no tóxico, biodegradable y adhesivo. Los ejemplos de dichos materiales incluyen, de modo no taxativo, acetatos de polivinilo; copolímeros de acetatos de polivinilo; alcoholes polivinílicos; copolímeros de alcoholes polivinílicos; celulosas, tal como metilcelulosas, hidroximetil celulosas e hidroximetil propil celulosas; dextrinas; alginatos; azúcares; melaza; polivinil pirrolidonas; polisacáridos; proteínas; grasas; aceites; goma arábiga; gelatinas; jarabes; y almidones. Pueden encontrarse ejemplos en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,213,367 y en la solicitud de patente estadounidense n.° US20100189693.

También pueden incluirse diversos aditivos, tal como adherentes, dispersantes, tensioactivos y nutrientes, e ingredientes amortiguadores, en la formulación de tratamiento de semillas. Otros aditivos de tratamiento de semillas convencionales incluyen, de modo no taxativo, agentes de recubrimiento, agentes humectantes, agentes amortiguadores y polisacáridos. Puede agregarse al menos un excipiente agrícolamente aceptable a la formulación de tratamiento de semillas tal como agua, sólidos o polvos secos. Los polvos secos pueden derivar de una variedad de materiales, tal como carbonato de calcio, yeso, vermiculita, talco, humus, carbón activado y varios compuestos de fósforo.

En algunas modalidades, la composición de recubrimiento de semillas puede comprender al menos un relleno que es un compuesto natural o sintético, orgánico o inorgánico, con el cual se combinan los componentes activos para facilitar su aplicación sobre la semilla. Preferentemente, el relleno es un sólido inerte tal como arcilla, silicatos naturales o sintéticos, sílice, resinas, ceras, fertilizantes sólidos (por ejemplo, sales de amonio), minerales del suelo naturales, tal como caolinas, arcillas, talco, cal, cuarzo, atapulgita, montmorillonita, bentonita o tierras diatomáceas, o minerales sintéticos, tal como sílice, alúmina o silicatos, en particular silicatos de aluminio o magnesio.

La formulación de tratamiento de semillas puede incluir adicionalmente uno o más de los siguientes ingredientes: otros pesticidas, incluyendo compuestos que actúan únicamente debajo del suelo; fungicidas, tal como captan, tiram, metalaxilo, fludioxonilo, oxadixilo e isómeros de cada uno de estos materiales, y similares; herbicidas, incluyendo compuestos seleccionados de glifosato, carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas, triazinas, dinitroanilinas, éteres de glicerol, piridazinonas, uracilos, fenoxis, ureas y ácidos benzoicos; protectores herbicidas tal como benzoxazina, derivados de benzhidrilo, N, N-dialil dicloroacetamida, varios compuestos de dihaloacilo, oxazolidinilo y tiazolidinilo, etanona, compuestos de anhídrido naftalico, y derivados de oxima; fertilizantes; y agentes de biocontrol tales como bacterias de origen natural o recombinantes y hongos de los géneros Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium y hongos micorrizales. Estos ingredientes pueden agregarse como una capa separada en la semilla o, alternativamente, pueden agregarse como parte de la composición de recubrimiento de semillas de la invención.

Preferentemente, la cantidad de composición novedosa o de otros ingredientes usados en el tratamiento de semillas no debería inhibir la germinación de la semilla, o causar daño fitotóxico a la semilla.

Las semillas tratadas con microorganismos pueden también recubrirse adicionalmente con una película de segundo recubrimiento para proteger el recubrimiento. Dichos segundos recubrimientos son conocidos en la técnica y pueden aplicarse usando técnicas de recubrimiento de película de tambor y lecho fluidizado.

En principio, cualquier semilla de planta capaz de germinar para formar una planta que es susceptible al ataque de nemátodos y/o hongos patogénicos puede ser tratada de acuerdo con la invención. Las semillas adecuadas incluyen aquellas de cereales, café, cultivos de coles, cultivos de fibras, flores, frutas, legumbres, cultivos de aceite, árboles, cultivos de tubérculos, verduras, así como otras plantas de las especies monocotiledóneas y dicotiledóneas. Preferentemente se recubren semillas de cultivo, que incluyen, de modo no taxativo, semillas de poroto, zanahoria, maíz, algodón, pastos, lechuga, maní, morrón, papa, colza, arroz, centeno, sorgo, soja, remolacha azucarera, girasol, tabaco y tomate. Más preferentemente, se recubren semillas de cebada o trigo (especialmente trigo de primavera o trigo de invierno) con las composiciones de la presente invención.

También se proporciona, en otro aspecto de la presente invención, una planta gramínea novedosa creada mediante la introducción artificial de un endófito microbiano de la invención en una planta gramínea que está libre de microorganismos endofíticos. En algunas modalidades de este aspecto, el endófito microbiano que se introduce en la planta gramínea puede ser un antagonista endofítico que tiene actividad supresora contra la fusariosis o contra un agente que causa la fusariosis. Además, el antagonista endofítico introducido en la planta gramínea puede ser la cepa fúngica SGI-010-H11. Se conocen en la técnica una variedad de métodos que se descubrió previamente que eran eficaces para la introducción de un endófito microbiano en una especie de pasto cereal. Ejemplos de dichos métodos incluyen los descritos en la solicitud de patente estadounidense n.° 200301951 17A1 , solicitud de patente estadounidense n.° 20010032343A1 y la patente estadounidense n.° 7,084,331 , entre otras. Será evidente para los expertos en la técnica que muchos de los métodos antemencionados pueden ser útiles para producir una planta gramínea novedosa de la invención.

Después de la infección artificial, se prefiere que el ADN del antagonista endofítico aislado esté amplificado mediante PCR y el antagonista esté confirmado al llevar a cabo una búsqueda de homología para el ADN amplificado. Preferentemente se prefiere que el gen extraño que expresa un medio identificable se introduzca en el antagonista endofítico antemencionado, y la presencia de colonización del antagonista endofítico antemencionado que infecta la planta se confirma mediante el medio identificable antemencionado, usando el gen extraño.

Preparación de las composiciones de biocontrol de acuerdo con la presente invención Los cultivos de antagonistas microbianos pueden prepararse para su uso en las composiciones de biocontrol de la invención usando técnicas de secado estático y fermentación líquida estándar conocidas en la técnica. El crecimiento se lleva comúnmente a cabo en un biorreactor.

Un biorreactor se refiere a cualquier dispositivo o sistema que sustenta un entorno biológicamente activo. Como se describe en la presente, un biorreactor es un recipiente en el cual se cultivan microorganismos, incluidos los antagonistas microbianos de la presente invención. Un biorreactor puede ser de cualquier forma o tamaño adecuados para el cultivo de microorganismos. Un biorreactor puede tener un tamaño en el rango de 10 ml_ hasta litros hasta metros cúbicos y puede estar hecho de acero inoxidable o cualquier otro material adecuado como se conoce y utiliza en al técnica. El biorreactor puede ser un reactor de tipo por lotes, uno del tipo de alimentación por lotes o un biorreactor de tipo continuo (por ejemplo, un biorreactor de agitación continua). Por ejemplo, un biorreactor puede ser un quimiostato conocido y usado en la técnica de la microbiología para cultivar y recoger bacterias. Puede obtenerse un biorreactor de cualquier proveedor comercial (ver también Bioreactor System Design, Asenjo y Merchuk, CRC Press, 1995).

Para operaciones a baja escala se puede utilizar un biorreactor por lotes, por ejemplo, para evaluar y desarrollar nuevos procesos, y para los procesos que no pueden convertirse en operaciones continuas.

Los microorganismos cultivados en un biorreactor pueden suspenderse o inmovilizarse. El cultivo en el biorreactor es generalmente bajo condiciones aeróbicas a temperaturas y pH adecuados para el crecimiento. Para los organismos de la invención, el cultivo celular se puede llevar a cabo a una temperatura entre 5 y 37 °C, con la temperatura preferida en el intervalo de 15 a 30 °C, 15 a 28 °C, 20 a 30 °C, o 15 a 25 °C. El pH del medio nutriente puede variar entre 4.0 y 9.0, pero el intervalo operativo preferido es usualmente de ligeramente ácido hasta neutro, con pH 4.0 a 7.0, o 4.5 a 6.5, o pH 5.0 a 6.0. Típicamente, el rendimiento máximo de células se obtiene a las 20-72 horas después de la inoculación.

Las condiciones óptimas para el cultivo de antagonistas de esta invención dependerán, por supuesto, de la cepa particular. Sin embargo, en virtud de las condiciones aplicadas en el proceso de selección y requisitos generales de la mayoría de los microorganismos, un experto en la técnica será capaz de determinar nutrientes y condiciones esenciales. Los antagonistas microbianos se cultivarían típicamente en cultivos líquidos aeróbicos en medios que contiene fuentes de carbono, nitrógeno o sales inorgánicas que pueden ser asimiladas por el organismo y sustentar el crecimiento celular eficaz. Las fuentes de carbono preferidas son hexosas, tal como glucosa, pero pueden sustituirse con otras fuentes que son asimiladas fácilmente, tal como los aminoácidos. Pueden utilizarse muchos materiales inorgánicos y proteináceos como fuentes de nitrógeno en los procesos de cultivo. Las fuentes de nitrógeno preferidas son los aminoácidos y la urea, pero otros incluyen amoníaco gaseoso, sales inorgánicas de nitrato y amonio, vitaminas, purinas, pirimidinas, extracto de levadura, extracto de ternera, proteosa peptona, harina de soja, hidrolizado de caseína, solubles de destilados y similares. Entre los minerales inorgánicos que pueden incorporarse en el medio nutriente están las sales comunes que son capaces de producir calcio, cinc, hierro, manganeso, magnesio, cobre, cobalto, potasio, sodio, molibdato, fosfato, sulfato, cloruro, borato y iones similares. Sin limitarse a este, se prefiere el uso de medio líquido de dextrosa y papa para los antagonistas fúngicos y premezcla de caldo R2A para cepas bacterianas.

A lo largo de esta descripción, se mencionan y se incorporan varias fuentes de información mediante esta referencia. Estas fuentes de información incluyen, por ejemplo, artículos de diarios científicos, documentos de patentes, libros de texto y direcciones de páginas web inactivas en el navegador. La referencia a dichas fuentes de información es meramente a fines de proporcionar una indicación del estado general de la técnica al momento de realizar la presentación. Mientras que el contenido y lo descrito por cada fuente de información puede servir como apoyo y puede ser usado por un experto en la técnica para llevar a cabo las modalidades de la presente invención, cualquier discusión y comentario en una fuente de información específica no debe considerarse de ningún modo como una admisión de que dicho comentario era ampliamente aceptado como una opinión general en ese ámbito.

La discusión de los métodos generales proporcionada en la presente se pretende que tenga únicamente fines ilustrativos. Otros métodos y modalidades alternativas serán evidentes para los expertos en la técnica al examinar esta descripción, y deben incluirse dentro del espíritu y el ámbito de esta solicitud.

Debe también entenderse que los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Descubrimiento de los microorganismos antagonistas capaces de suprimir el desarrollo de Fusarium graminaerum y Gibberella zeae, agentes causantes de la fusariosis Este ejemplo describe un proceso de alto rendimiento para recoger y seleccionar microorganismos candidatos que ha sido desarrollado internamente en Synthetic Genomics, Inc., para aislar cepas de microorganismos que tengan actividad supresora contra agentes causantes de fusariosis, particularmente contra Fusarium graminearum. Las cepas antagonistas microbianas se aislaron de muestras de tejido vegetal recogidas en varias ubicaciones a lo largo de los Estados Unidos. Las cepas bacterianas SGI-014-C06, SGI-014-G01 , SGI-015-F03 y SGI-015-H06 se aislaron de tejidos de raíces de plantas recogidas en Eagle Peak Preserve, cerca de Julián, CA. La cepa fúngica SGI-010-H11 se aisló de tejidos del tallo de dos muestras diferentes de planta recogidas en San Elijo Lagoon, Encinitas, CA.

Se aislaron los microorganismos de la forma que se detalla a continuación. Para el aislamiento de cepas bacterianas, se sonicaron tejidos de la raíz de la planta y se sometieron a diluciones en serie de 2xYT (extracto de levadura y triptona) y placas de medio de agar libre de N. Luego se seleccionaron las colonias individuales basándose en características morfológicas, y se cultivaron individualmente en medio de caldo líquido. Para el aislamiento fúngico, primero se esterilizó la superficie del tejido vegetal mediante la sumersión en etanol al 70 % y pasándolo brevemente sobre una llama. El tejido se luego se diseccionó y se colocó en medio de agar de dextrosa y papa (PDA), seguido de incubación a temperatura ambiente. Cuando se observó crecimiento micelial, entonces se transfirió un segmento del crecimiento micelial a otra placa de PDA. Las cepas de microorganismos se aislaron, se purificaron y se preservaron a -80 °C en glicerol al 15 % para las cepas bacterias y en semillas de cebada secas para las cepas fúngicas.

Las cepas de microorganismos aislados como se describió anteriormente se analizaron luego para verificar su capacidad de suprimir el crecimiento micelial de F. graminearum en una prueba de antagonismo in vitro, la cual se llevó a cabo en placas de agar que contenían medio de cultivo de agar de dextrosa y papa (PDA), de acuerdo con un placa de selección de alto rendimiento descrito en la solicitud de patente estadounidense n.° US20120107915A1 , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, con modificaciones mínimas. A grandes rasgos, se cultivaron cepas aisladas de microorganismos en agar caldo de soja tríptica (TSBA/5) durante 24 horas antes de su uso. El inoculo conidial de F. graminearum NRRL-5883 se produjo mediante la exposición de la hifa a una colonia en crecimiento activo del hongo y trasferir los hilos de hifa al medio de agar PDA Después de incubar las placas durante 7 días a 25 °C usando un fotoperíodo de 12 h/día, se lavaron las placas de PDA de los conidios usando amortiguador fosfato débil (amortiguador fosfato al 0.004 %, pH 7.2, con MgCI2 al 0.019 %. Luego se esparció una suspensión de conidios de F. graminearum en amortiguador fosfato débil (1 x 105 conidios/ml) sobre la superficie de agar, y se incubaron las placas a 25°C durante 48-72 horas. Para iniciar la prueba de antagonismo, células de cepas microbianas aisladas se inocularon puntualmente a distancias iguales dentro del perímetro de la placa. Luego de cinco días, las cepas se evaluaron como positivas a la antibiosis cuando existía un área clara visible que carecía de crecimiento micelial alrededor del perímetro de las colonias microbianas.

Se aislaron y evaluaron más de 4,000 cepas microbianas mediante el procedimiento descrito anteriormente. De estas, se descubrió que seis cepas suprimían significativamente el crecimiento micelial de F. graminearum NRRL-5883 en medio PDA. Estos antagonistas microbianos nuevos se identifican como SGI-010-H11 , SGI-014-C06, SGI-014-G01 , SGI- 015-F03 y SGI-015-H06.

También se llevó a cabo una prueba de antagonismo para los antagonistas microbianos nuevos, para verificar su capacidad de suprimir el crecimiento del patógeno fúngico Gibberella zeae, que es la especie teleomorfa de Fusaríum graminearum. Todos los procedimientos fueron idénticos a los descritos anteriormente, excepto que la cepa patogénica evaluada en este ensayo fue una cepa patogénica del hongo Gibberella zeae.

De estos seis antagonistas microbianos, se descubrió que cuatro cepas, SGI-010-H1 1 , SGI-014-C06, SGI-015-F03, y SGI-015-H06, suprimían significativamente el crecimiento micelial de Gibberella zeae.

EJEMPLO 2 Extracción de ADN. Secuenciación y taxonomía Lisis celular fúngica y adquisición de la información de secuencia de ADNr de ITS-5.8S La biomasa fúngica se transfirió a una microplaca de PCR de 96 pocilios que contenía 50 pL de 2 x amortiguador de lisis (Tris HCI 100 rr»M, pH 8.0, EDTA 2 mM, pH 8.0, SDS 1 %, 400 pg/ml de Proteinasa K). Las condiciones de lisis fueron las siguientes: 55 °C durante 60 minutos, 94 °C durante 4 minutos. Se utilizó una alícuota de producto de lisis como la fuente de la plantilla de ADN para la amplificación por PCR. La secuencia de ADNr de ITS-5.8S se amplificó mediante PCR usando dos cebadores M13-ITS1 (SEQ ID NO: 15) y ITS4 M 3 con cola (SEQ ID NO: 16).

Para la amplificación de la región de ADNr de ITS-5.8S, cada mezcla de PCR se preparó en una reacción de volumen final de 20 pL que contenía 4 pL de la reacción de lisis fúngica, 0.2 µ? de cada cebador (ITS1/ITS4), Tween-20 al 6 % y 10 pL de 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 °C durante 10 minutos; 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 75 segundos, durante 30 ciclos; 72 °C durante 10 minutos. Una alícuota de 2 pl del producto de PCR se agregó a gel agarosa al 1.0 % para confirmar una única banda del tamaño esperado. Las bandas positivas se enviaron para realizarles el método de secuenciación de Sanger en sentido directo e inverso usando cebadores M13. La secuencia de la región intergénica de 5.8S (ITS) de la cepa fúngica SGI-010-H1 1 se proporciona den el listado de secuencias como SEQ ID NO: 11. La búsqueda de homología para la secuencia de nucleótidos determinada de la región intergénica 5.8S (ITS) se llevó a cabo usando la base de datos DDBJ/GenBank/EMBL. Luego, la relación filogénica de la secuencia de nucleótidos de la región intergénica de 5.8S (ITS) se analizó entre el antagonista fúngico aislado SGI-010-H1 1 descrito en la presente, microorganismos del género y especie que muestran homologías de secuencia altas con respecto al antagonista fúngico aislado SGI-010-H1 1 , y otra variedades amplias de géneros y especies de microorganismos, usando el programa para crear árboles filogénicos ClustalW. La cepa fúngica SGI-010-H1 1 se considera que está relacionada con la familia de Mycosphaerellaceae basándose en el -97 % de similitud de sus secuencias de ADNr ITS-5.8S con aquellas de Mycosphaerellapunctiformis (GenBank EU343182) y Ramularíapratensis (GenBank EU019284), cuyas secuencias de ITS 5.8S muestran un relacionamiento claro con Mycosphaerellaceae.

Lisis celular bacteriana y adquisición de información de secuencia de ARNr de 16S Se transfirió una alícuota de 20 pL a una placa de PCR de 96 pocilios que contenia 20 pL de 2 x amortiguador de lisis (Tris HCI 100 mM, pH 8.0, EDTA 2 mM, pH 8.0, SDS 1 %, 400 pg/ml de Proteinasa K). Las condiciones de lisis fueron las siguientes: 55 °C durante 30 minutos, 94 °C durante 4 minutos. Se utilizó una alícuota de producto de lisis como la fuente de la plantilla de ADN para la amplificación por PCR. La secuencia de ARNr de 16S se amplificó mediante PCR usando M13-27F (SEQ ID NO: 17) y cebadores 1492R M13 con cola (SEQ ID NO: 18).

Para la amplificación de la región de ARNr de 16S, cada mezcla de PCR se preparó en una reacción de volumen final de 20-pL que contenía 4 µ?. de la reacción de lisis bacteriana, 2 µ? de cada cebador (27F/1492R), Tween-20 al 6 % y 10 µ? de 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 °C durante 10 minutos; 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 75 segundos, durante 30 ciclos; 72 °C durante 10 minutos. Una alícuota de 2- µ? del producto de PCR se agregó a gel agarosa al 1.0 % para confirmar una única banda del tamaño esperado. Las bandas positivas se enviaron para realizarles el método de secuenciación de Sanger en sentido directo e inverso usando cebadores M13. La secuencias de ARNr de 16S de las cepas bacterianas SGI-014-C06, SGI-014-G01 , SGI-015-F03 y SGI-015-H06 tienen una longitud de 1 ,4 Kb y se proporcionan en el listado de secuencias como las SEQ ID NO: 1 , 10, 12, 13 y 14, respectivamente. La búsqueda de homología para la secuencia de nucleotidos determinada se llevó a cabo usando la base de datos DDBJ/GenBank/EMBL. Luego, la relación filogénica de la secuencia de nucleotidos de los 16 genes de ARNr se analizó entre el antagonista bacteriano aislado descrito en la presente, bacterias del género y especie que muestran homologías de secuencia altas con respecto al antagonista bacteriano aislado, y otra variedades amplias de géneros y especies de microorganismos, usando el programa para crear árboles filogénicos ClustalW. La identidad y similitud de secuencia se determinó usando el software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. EUA). El resultado del análisis de secuencia reveló que el aislado bacteriano SGI-014-G01 puede considerarse como relacionado con el género de Vanovorax basándose en la similitud de ~99% de su secuencia de ARNr 16S con respecto a varias especias de Vanovorax, incluyendo Vanovorax sp. R-21938 (GenBank AJ786799) y Vanovorax paradoxus (GenBank GU 186109), cuyas secuencias de ARNr de 16S muestran una relación clara con Vanovorax sp. Además, el resultado del análisis de secuencia también reveló que los dos aislados bacterianos SGI-015-F03 y SGI-015-H06 pueden considerarse como relacionados con la familia de Bacillaceae, basándose en la similitud de >99 % de sus secuencias de 16S respectivas con aquellas de varios Bacillus spp.

El resultado del análisis de secuencia reveló que el aislado bacteriano SGI-014-C06 puede considerarse relacionado a la familia de Microbacteríaceae basándose en la similitud de >99 % de sus secuencias de 16S respectivas con aquellas de varias Microbacteríum spp. Cabe destacar que la secuencia de 1430-nt del gen de ARNr de 16S de SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) es idéntica a la del gen de ARNr de 16S de una cepa de Microbacteríum oxydans DSM 20578 y de varias otras cepas de Microbacteríum sp. (por ejemplo, las secuencias GenBank Y17227.1, FJ200406, EU086800 y EU714335) a través de toda la longitud de 1430-nt.

En particular, entre las miles de cepas microbianas que fueron aisladas y evaluadas para verificar su capacidad de suprimir el desarrollo de Fusaríum en ensayos de antagonismo descritos en el Ejemplo 1, un total de ochenta y ocho cepas fueron identificadas subsiguientemente como de la especie Microbacteríum, basándose en la similitud de secuencia de sus secuencias 16S con aquellas de Microbactenum spp. conocidas. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que SGI-014-C06 fue la única cepa de Microbactenum que poseía actividad supresora contra Fusaríum graminearum. A la fecha, como se discutió anteriormente, se ha informado que varios microbios de origen natural presentan actividad antagonista contra la fusariosis. Sin embargo, no figuran registros anteriores a la presente invención que describan un microorganismo del género Mycobacterium con dicha actividad antagonista. Adicionalmente, previo a la presente invención, los presentes inventores no eran conscientes de la existencia de un método o proceso que utilizara una cepa bacteriana del género Mycobacterium como agente de biocontrol en la prevención, la inhibición o el tratamiento del desarrollo de un patógeno causante de la fusariosis.

EJEMPLO 3 Análisis de secuencia de genes constitutivos de SGI-014-C06 aislado Ha sido informado recientemente acerca de un estudio filogénico de varios genes constitutivos de 27 especies de género Microbactenum, por Richert et ál. (Syst. Appl. Microbio!. 30:102-108, 2007). El estudio concluyó que aunque los méritos del análisis de secuencia de ARNr de 16S para la taxonomía sistemática son insuperables, el mero énfasis en un único parámetro taxonómico no debería guiar conclusiones taxonómicas. Como se describió anteriormente, la secuencia de nucleótidos del gen de ARNr de 16S de SGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) es idéntica a la del gen ARNr de 16S de varuas cepas de Microbacteríum sp., incluyendo la secuencia de nucleótidos de un gen de ARNr de 16S de una cepa de Microbacteríum oxydans DSM 20578 que fue incluida en un estudio de Richert et ál. (2007) (GenBank registro Y17227.1). Los solicitantes proceden a llevar a cabo un análisis filogénico de cuatro genes constitutivos de SGI-014-C06 aislado, que son la subunidad B de ADN girasa (gyrB), subunidad B de ARN polimerasa (rpoB), recombinasa A (recA) y cinaca polifosfato (ppk). Para este propósito, se secuenció con el método de escopeta el SGI-014-C06 aislado, ensamblado y anotado mediante el uso de los procedimientos descritos en la solicitud de patente PCT n.° W02010115156A2. El ADN genómico se preparó a partir de un cultivo nuevo de SGI-014-C06. El sedimento celular se usó para la extracción de ADN de alto peso molecular usando el kit UltraClean® Mega Soil DNA Isolation (n.° de catálogo 12900-10) de MO BIO Laboratories, Inc., usando el protocolo recomendado por el fabricante. El ADN genómico de SGI-014-C06 luego se preparó para pirosecuenciación 454 por el método de escopeta. Se usó ADN genómico (7,5 pg) para la construcción de bibliotecas de acuerdo con el protocolo recomendado (454 Life Sciences) para lecturas largas simples. Las secuencias se generaron mediante dos corridas de secuenciación en serie de GS FLX Titanium.

Las secuencias de cuatro genes constitutivos gyrB, rpoB, recA, y ppk of del SGI-014-C06 aislado se proporcionan en el listado de secuencias. La búsqueda de homología para la secuencia de nucleótidos determinada se llevó a cabo usando la base de datos DDBJ/GenBank/EMBL La identidad y similitud de secuencia se determinó usando el software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. EUA). Como se discute en detalle más adelante, el resultado del análisis de secuencia de los genes constitutivos reveló que el SGI-014-C06 aislado descrito en la presente divulgación es una cepa bacteriana novedosa y puede considerarse relacionada con la familia de Microbacteriaceae.

La secuencia de polinucleótidos del gen gyrB de SGI-014-C06 tiene la mayor identidad de secuencia con un gen gyrB de Microbactenum testaceum con el número de registro GenBank ??0 2052 (82.69 % en una alineación de 936/2172 nucleótidos). Cuando se compara con el gen gyrB de la cepa de Microbactenum oxydans DSM 20578 (GenBank AM181493; Richert et á/., 2007), las homologías de secuencia entre los dos genes fue ~62 % idéntica a nivel de nucleótidos y -37 % idéntica a nivel de aminoácidos.

La secuencia de polinucleótidos del gen rpoB de SGI-014-C06 tiene la mayor identidad de secuencia con un gen rpoB de Microbactenum maritypicum con el número de registro GeneBank AM181582 (96.98 % en una alineación de 1093/3504 nucleótidos). Cuando se compara con el gen rpoB de la cepa de Microbactenum oxydans DSM 20578 (GenBank AM181583; Richert et ál., 2007), las homologías de secuencia entre los dos genes fue -96 % idéntica a nivel de nucleótidos y 99 % idéntica a nivel de aminoácidos.

La secuencia de polinucleótidos del gen recA de SGI-014-C06 tiene la mayor identidad de secuencia con un gen recA de Microbactenum testaceum con el número de registro GeneBank AP012052 (85.45 % en una alineación de 962/1188 nucleótidos). Cuando se compara con el gen recA de la cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181527; Richert ef á/., 2007), las homologías de secuencia entre los dos genes fue -92 % idéntica a nivel de nucleótidos y 100 % idéntica a nivel de aminoácidos.

La secuencia de polinucleótidos del gen ppk de SGI-014-C06 tiene la mayor identidad de secuencia con un gen ppk de Microbacterium luteolum con el número de registro GenBank AM181554 (91.38 % en una alineación de 1380/2175 nucleótidos). Cuando se compara con el gen ppk de la cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181556; Richert et ál., 2007), las homologías de secuencia entre los dos genes fue ~91 % idéntica a nivel de nucleótidos y ~98 % idéntica a nivel de aminoácidos.

EJEMPLO 4 Protección de trigo contra la infección de Fusarium graminearum usando los antagonistas microbianos Microbacterium sp. ÍNRRL B-50470) Mvcophaerella SP. (NRRL 50471) v Variovorax sp. ÍNRRL B-50469) Las cepas microbianas que se descubrió que eran positivas para la antibiosis en el análisis de antagonismo descrito en el Ejemplo 1 se evaluaron adicionalmente a través de un bioensayo vegetal donde las células de las cepas microbianas se aplicaron directamente a las semillas de una variedad cultivada de cereales susceptible, seguido de la inoculación con esporas del conidio de F. graminearum. Las cepas microbianas se cultivaron hasta una turbidez suficiente y se diluyeron en agua. Dos gramos de semillas de trigo de una variedad cultivada de trigo susceptible (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) se sembraron en recipientes de un litro que contenían medio de tierra pasteurizada. Luego de la siembra, se transfirieron 20 mL de la dilución de cultivo microbiano sobre las semillas sembradas. Las semillas de trigo se dejaron germinar en condiciones de invernadero en luz fluorescente con un fotoperíodo de 14 horas. Al inicio de la floración del trigo, las espigas de trigo se expusieron mediante la aspersión con esporas del conidio de F. graminearum NRRL 5883. Las esporas del conidio se cosecharon a partir de placas de FDA de cinco días vertiendo agua con 0.01 % Tween20 sobre las placas y rociando esporas en la suspensión. Luego de rociar esporas, las plantas de trigo se transfirieron a una cámara de rocío con 100 % de humedad durante tres días para permitir la infección. Los tratamientos fueron: 1. No tratado: sin tratamiento fúngico microbiano o químico + exposición a Fusarium. 2. No infectado: sin tratamiento fúngico microbiano o químico, sin exposición a Fusarium. 3. SGI-010-H1 1 : tratamiento fúngico + exposición a Fusarium. 4. SGI-014-G01 : tratamiento bacteriano + exposición a Fusarium. 5. SGI-014-C06: tratamiento bacteriano + exposición a Fusarium.

Veinte días luego de la infección, se detuvo el riego y se permitió que las plantas de trigo se secaran durante tres semanas antes de la cosecha. Se cosecharon y recogieron espigas de trigo individuales. Se determinó la gravedad de la enfermedad para cada espiga que muestra síntomas de fusariosis. La gravedad de la enfermedad se calculó como la cantidad de espiguillas afectadas dividida por la cantidad total de espiguillas por espiga. Los resultados (TABLA 2) revelaron que las plantas de trigo tratadas con cada uno de los tres antagonistas microbianos analizados, SGI-014-C06 (NRRL B-50470), SGI-010-H1 1 (NRRL 50471) y SGI-014-G01 (NRRL B-50469), tenían una gravedad considerablemente más baja e incidencia de infección de Fusarium graminearum cuando se comparan con el control "no tratado" que crece en las mismas condiciones (P<0.05).

Las semillas de cada espiga se cosecharon manualmente y se pesó la masa de semillas. Se calculó el promedio del peso de semillas por recipiente en cada uno de los tratamientos. Como se registra en la TABLA 3, se demostró que cada uno de los antagonistas microbianos redujo considerablemente la pérdida de rendimiento causada por la infección de fusariosis.

TABLA 2 Eficacia de los antagonistas microbianos en la reducción de la incidencia de fusariosis en el trigo.

TABLA 3 Eficacia de los antagonistas microbianos para conservar el rendimiento de la semilla en plantas de trigo con fusariosis.

EJEMPLO 5 Inhibición del crecimiento de Fusarium graminearum mediante antagonistas microbianos en plántulas de trigo Las cepas microbianas que se descubrió que poseían actividad supresora contra F. graminearum en ensayo de placa del antagonismo se analizaron adicionalmente para determinar su capacidad para reducir la incidencia de fusariosis en el trigo. Las semillas de una variedad cultivada de trigo susceptible (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) se sembraron en recipientes de 1 litro, cada uno de los cuales contenía un medio de tierra pasteurizada en recipientes de plástico de 20 cm de diámetro. Las suspensiones de células microbianas se prepararon de la siguiente manera. El 2YT, o un medio de cultivo similar, los cultivos de caldo se inocularon a partir de soluciones madre de glicerol aisladas o placas estriadas. En general, los cultivos se iniciaron 48 - 72 horas antes del uso en la cámara de crecimiento, invernadero o campo permitiendo que el cultivo alcance la fase exponencial tardía. Los aislados que presentan mayores tiempos de duplicación se iniciaron de forma anticipada. Los cultivos se incubaron a 30 °C en un agitador giratorio a 200 rpm. Luego del crecimiento, las células se sedimentaron a 10,000 x g durante 15 min a 4 °C y se volvieron a suspender en 10 mM de amortiguador de MgS04 (pH 7,0). Las densidades celulares se normalizaron para cada aislado en CFU/mL (unidades de formación de células por mililitro). En general, se prepararon suspensiones de ~109 CFU/ mL para cada aislado y se transportaron al sitio de inoculación sobre hielo. Las inoculaciones se realizaron diluyendo estas suspensiones celulares 1/20 en agua de riego hasta una densidad final de 5 X 107 CFU/mL. Para ensayos en recipientes de 1 litro, 20 mL de esta suspensión celular diluida se distribuyó uniformemente sobre la superficie de cada recipiente por duplicado. Para ensayos en microensayos, las suspensiones celulares no se diluyeron y se aplicó 1 mL de cada suspensión de 09 CFU/mL mediante pipeta directamente sobre la superficie de cada recipiente por duplicado empapando la tierra sobre las semillas sumergidas. Las semillas y las plantas se mantuvieron en un invernadero a temperatura ambiente con un fotoperíodo de luz de 14 horas.

El micelio de la cepa Fusarium graminearum NRRL-5883 se cultivó en placas de PDA durante 5 días a luz constante. Se cosecharon hifas y conidios vertiendo unos pocos mL de agua estéril (0,01 % Tween 20) sobre las placas y raspando la superficie de agar con una espátula estéril. La concentración de esporas en el inoculo era de aproximadamente 2x 105 esporas/mL, pero no se determinó la concentración de fragmento de hifa.

La inoculación con F. graminearum comenzó luego de que emergieron brotes de las semillas y continuó noche por medio durante 10 días. El inoculo de F. graminearum se aplicó con un rociador a alrededor de 30 mL por recipiente. Inmediatamente después de cada inoculación, las plantas se nebulizaron con nebulizador superior. Cuando se usó el fungicida químico, el fungicida (Banner Maxx, Syngenta) se preparó diluyendo 2 mL de solución madre de fungicida en 1 L de agua destilada, y se aplicó con un rociador a alrededor de 30 ml_ por recipiente.

Se evaluó la fusariosis según la gravedad de infección de Fusarium, como se determinó por la cantidad de unidades formadoras de colonias por gramo (CFU/g) de Fusarium de tejidos vegetales. Se realizaron todos los tratamientos en cuatro bloques con cuatro recipientes replicados. Los tratamientos fueron: 1. No tratado: sin tratamiento con fungicida microbiano o químico + exposición a Fusarium. 2. No infectado: sin tratamiento con fungicida microbiano o químico, sin exposición a Fusarium. 3. Fungicida: tratamiento con fungicidas químico + exposición a Fusarium. 4. SGI-010-H11 : tratamiento fúngico + exposición a Fusarium. 5. SGI-014-G01 : tratamiento bacteriano + exposición a Fusarium. 6. SGI-014-C06: tratamiento bacteriano + exposición a Fusarium. Los resultados, según se registran en la TABLA 4, revelaron que los tres tratamientos microbianos proporcionaron una disminución considerable en la gravedad de FHB, en comparación con el control infectado. En particular, dos antagonistas microbianos, SGI-014-C06 y SGI-010-H1 1 , redujeron considerablemente la infección de plantas de trigo mediante Fusarium graminearum en comparación con el control no tratado cultivado en las mismas condiciones. La protección de plantas de trigo de infección de Fusarium proporcionada por cada uno de los dos microorganismos SGI-014-C06 y SGI-010-H1 1 fue comparable en términos estadísticos con la protección proporcionada por el fungicida químico comercial. Cuando se aplicó el microorganismo SGI-014-G01 , la protección observada de las plantas de trigo de infección de Fusarium fue mucho menos notoria y su eficacia varió mucho entre los recipientes replicados.

TABLA 4 Efecto de antagonistas microbianos sobre infección de Fusarium EJEMPLO 6 Crecimiento y almacenamiento de los antagonistas microbianos Mycosphaerella sp.: Se usaron varios métodos para almacenar los hongos aislados como cultivo puro, uno de los cuales fue la técnica de papel de filtro. También se dejó que el hongo creciera en PDA, y luego se cortó en cuadrados pequeños que se colocaron en recipientes que contenían 15 % de glicerol y se almacenaron a -70 °C. El hongo también se almacenó a 4 °C mediante un método similar, usando agua destilada en lugar de glicerol.

Sin embargo, uno de los métodos preferidos de almacenamiento fue en semillas de cebada estériles infectadas a -80 °C.

Bacillus sp., Microbacterium sp. y Variovorax sp.: Las bacterias aisladas se almacenaron como un cultivo puro. Se transfirió una colonia bacteriana a un recipiente que contenía medio líquido de caldo R2A (Tecknova) y se dejó cultivar a 30 °C con agitación a 250 rpm durante dos días. Luego, el cultivo se transfirió a recipientes que contenían 15 % de glicerol y se almacenaron a -80 °C.

EJEMPLO 7 Producción de esporas y tratamientos de recubrimiento de semillas Producción de esporas: En un típico procedimiento de producción de esporas, se inoculó un litro de medio de cultivo 2x YT (16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCI) con 5 mL de cultivo de inicio o raspado de placa de petri y se incubó durante la noche a 30 °C en un agitador giratorio que se configuró a 225 rpm. Las células bacterianas se sedimentaron mediante centrifugación, y se lavaron 1x con amortiguador de PBS (8 g/L de NaCI; 0,2 g/L de KCI; 1 ,44 g/L de Na2HP04; 0.24g de KH2P0 ¡ pH 7,4). Las células se volvieron a suspender en medio de CDSM (Hageman et ál., J. Bacteríol., 438-441 ,1984), y se cultivaron durante cuatro noches adicionales a 30 °C en el agitador giratorio. La esporulación en el cultivo bacteriano se controló a diario usando microscopio de contraste de fase hasta que todo el cultivo estuvo prácticamente compuesto de esporas que flotan libremente. En general, el tiempo de incubación llevó menos de cuatro días o más de seis días dependiendo de la especie. En el microscopio de contraste de fase, se detectaron endoesporas dentro de las células como esferoides oblatos blancos brillantes. Las esporas bacterianas se sedimentaron mediante centrifugación a 10,000 X g durante 15 minutos, se lavaron dos veces con dH20 estéril y, si fuera necesario, se concentraron hasta 50 ml_ y se podrían usar inmediatamente o se podrían refrigerar para uso posterior. La concentración de esporas se midió a ??ß?? En general, este procedimiento produjo al menos 2000 OD de esporas de bacterias.

En particular, varias cepas bacterianas de la presente invención, por ejemplo, Bacillus sp. SGI-015-F03, podrían producir convenientemente grandes cantidades de esporas luego de 4 días de incubación con una inoculación simple de un gran cultivo inicial durante la noche (-15 mL) en 1 litro de medio de cultivo 2x SG, seguido de incubación durante 4 días a la temperatura apropiada en un agitador giratorio configurado a 225 rpm. La receta del medio de cultivo 2x SG fue la siguiente: 16 g/L de caldo nutriente; 0.25 g/L de MgS04¡ 2.0 g/L de KCI; 0.15 g/L de CaCI2.2H2O; 0.025 g/L de MnCI2.2H20; 0.28 mg/L de FeS04 7H20; 1.0 g/L de Dextrosa.

Tratamiento de recubrimiento de semillas de trigo y maíz: Los experimentos de tratamiento de semillas a pequeña escala se realizaron de acuerdo con un procedimiento descrito en Sudisha et ál., 2009 con pequeñas modificaciones. En general, se elaboró una solución madre de biopolímero agregando 6 gramos de polvo de goma arábiga (MP Biomedical) a 36 ml_ de agua en un tubo Falcon de 50 ml_, que se mezcló posteriormente hasta que se volvió homogénea usando un mezclador de rueda. Se usó una placa de agitación para mezclar cuando se requirieron mayores cantidades de semillas recubiertas.

Cuando se usaron células vegetativas, se lavaron cultivos turbios de células microbianas que crecen activamente con PBS y se ajustaron hasta un OD6oo de ~5.0. De manera alternativa, las suspensiones de esporas microbianas se prepararon como se describe anteriormente. Las esporas bacterianas y/o células vegetativas se volvieron a suspender por completo en una solución madre de biopolímero de goma arábiga de ~32 mL preparada como se describe anteriormente, y la suspensión resultante se mezcló por completo en una botella de 1 L. Se agregaron aproximadamente 400 g de semillas (trigo o maíz) a la botella y se agitaron vigorosamente o sometieron a vórtice para garantizar una distribución uniforme de la suspensión de goma/célula. Luego, las semillas recubiertas se diseminaron en recipientes para pesaje de plástico estéril para secarlas en una campana de flujo laminar hasta que dejan de ser pegajosas, generalmente 3-6 horas con mezcla periódica. En algunos casos, las semillas recubiertas con esporas podrían secarse durante la noche. Sin embargo, en general, las semillas recubiertas con cultivos vegetativos se almacenan antes de disecarse por completo. La prueba de viabilidad realizada periódicamente en los microbios usados en la formulación de recubrimiento de semillas mostró que los microbios seguían siendo viables durante al menos tres meses. Se determinó que el índice de germinación de las semillas recubiertas fue básicamente idéntico al de las semillas no recubiertas de control.

EJEMPLO 8 Efecto de tratamientos de semillas microbianas en el desarrollo de fusariosis de Fusarium Las semillas de una variedad cultivada de trigo susceptible a FHB (RB07) se recubrieron con cada uno de los microorganismos SGI-014-C06; SGI-015-F03 y SGI-015-H06, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Las semillas recubiertas se sembraron posteriormente en recipientes de un litro que contenían medio de tierra pasteurizada [(Metromix-Mix 200; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH; y 3 gramos de fertilizante 14-14-14 (N-P-K)]. Los recipientes se sembraron a 7-8 plantas por recipiente y se redujeron a 5 plantas por recipiente en la etapa de 3 hojas. Los recipientes se dispusieron en bloques aleatorios con 5 recipientes por tratamiento. Luego, las semillas recubiertas se dejaron germinar en condiciones de invernadero en luz fluorescente con un período de luz de 16 horas. Al inicio de la floración del trigo (antesis), las espigas de trigo se expusieron mediante la aspersión con esporas del macroconidio de F. graminearum NRRL 5883 a una concentración de 100,000 esporas/mL. Luego de rociar esporas, las plantas de trigo se transfirieron a una cámara de rocío con 100 % de humedad durante tres días para permitir la infección. Los tratamientos fueron: 1. No tratado, sin tratamiento con fungicida microbiano o químico + exposición a Fusarium. 2. SGI-014-C06: tratamiento con semillas bacterianas + exposición a Fusarium. 3. SGI-015-F03: tratamiento con semillas bacterianas + exposición a Fusarium. 4. SGI-015-H06: tratamiento con semillas bacterianas + exposición a Fusarium.

La gravedad de la fusariosis se evaluó visualmente a los diez días y veintiún días luego de la infección. Se determinó la gravedad de la enfermedad para cada espiga que muestra síntomas de fusariosis, y se calculó como el porcentaje de espiguillas sintomáticas, es decir, la cantidad de espiguillas que muestran síntomas de FHB dividida por la cantidad total de espiguillas. Los resultados (TABLA 5) revelaron que las semillas de trigo recubiertas con cada uno de los tres antagonistas microbianos analizados, SGI-014-C06; SGI-015-F03 y SGI-015-H06, tenían una gravedad considerablemente más baja de infección de Fusarium graminearum cuando se comparan con el control "no tratado" que crece en las mismas condiciones (P<0.05).

TABLA 5 Desarrollo de síntomas de fusariosis en trigo luego de los tratamientos con semillas con microorganismos antagonistas EJEMPLO 9 Biocontrol de la fusariosis del trigo en ensayos en invernaderos Cada uno de los microorganismos SGI-014-C06; SGI-015-F03 y SGI-015-H06 se analizaron adicionalmente en ensayos en invernadero a mayor escala. Los ensayos se realizaron en una "sala de contención de crecimiento vegetal" (PGCR) ubicado en Synthetic Genomics, Inc., e incluía los siguientes tratamientos de control: control infectado, control no infectado, así como cuatro referencias de fungicidas comerciales. Los fungicidas químicos de referencia fueron Banner MAXX® (Syngenta) a una concentración de 2 ml/L y Prosaro® (Bayer CropScience) a una concentración de 3 ml/L, cada uno se aplica como rocío foliar, según la recomendación del fabricante. Los fungicidas biológicos de referencia fueron Actinovate® (Natural Industries) y RhizoVital® (ABiTEP GmbH), cada uno se aplica empapando la tierra según los manuales de instrucción recomendados por los fabricantes.

Los tratamientos microbianos se prepararon y aplicaron empapando la tierra o recubriendo semillas. Cuando se aplicaron tratamientos microbianos empapando la tierra, las suspensiones celulares de cada uno de los microorganismos se aplicaron individualmente a las semillas antes de cubrir las semillas con más medio de cultivo. Con este propósito, los cultivos preparados recientemente se sedimentaron para retirar el medio de cultivo y se volvieron a suspender en 10 mM de amortiguador de sulfato de magnesio (MgS04). Luego, las suspensiones celulares se agregaron aplicando mediante pipeta y distribuyendo 20 mililitros uniformemente en las semillas en una cantidad total de células de ~109 células por recipiente. Cuando los tratamientos microbianos se aplicaron como recubrimiento de semillas, las células/esporas de microorganismos se prepararon básicamente como se describe anteriormente en el Ejemplo 8. Las semillas recubiertas se produjeron mediante la incorporación de suspensiones celulares con una solución de goma arábiga para formar una mezcla de recubrimiento pegajosa que se aplicó posteriormente a las semillas. Luego, el recubrimiento de semillas microbianas se dejó secar para formar un biopolimero duro pero soluble en agua que atrapa las células/esporas de microorganismos. El objetivo fue alcanzar una titulación de células en el intervalo de al menos 106 -107 células/semillas viables. En este experimento de ensayo en invernadero, los recubrimientos de semillas se prepararon el día antes de la siembra de las semillas.

Cada tratamiento presentó cuatro reiteraciones que se ubicaron en un diseño de bloque completo aleatorio (RCBD) en tres soportes nivelados dispuestos en dos filas a lo largo de los lados de una sala de crecimiento. Los soportes se equiparon con luces fluorescentes (Agrosun, 5850K) que generaron, en promedio, 800 pmol de intensidad de luz, según las mediciones en la superficie del recipiente. Cada reiteración consistía en cuatro recipientes de 1 litro contenidos en medio plano. Los recipientes se llenaron con un medio de cultivo sintético que consistía en una relación 3:1 (v/v) de medio de cultivo Arabidopsis AIS (semillas de Lehle) a arena (lavado grueso). En cada recipiente, se dispersaron dos gramos de semillas de trigo (Hank, WestBred) sobre la superficie del medio de cultivo. Los recipientes se regaron en la parte inferior dejando ~2 cm de agua en su base y se observaron durante la germinación y el crecimiento.

En la etapa de floración (Feekes 10.5.1), las espigas de trigo se infectaron rociándolas con una suspensión de esporas del conidio de Fusaríum graminearum. Para este experimento de ensayo en invernadero, se prepararon las esporas fúngicas colocando en placas los micelios homogeneizados de la cepa F. graminearum NRRL 5883 sobre grandes placas de PDA, seguido de incubación durante cinco días en luz constante a temperatura ambiente. Luego, las esporas fúngicas se cosecharon mediante inundación de las placas con amortiguador de sulfato de magnesio (10 mM de MgSO4; 0.01 % Tween 20) y raspando levemente la superficie de agar con una espátula estéril. La concentración de esporas se ajustó y aproximadamente 50,000 esporas del conidio se aplicaron por espiga con un rociador manual presurizado. Aumentó la humedad relativa de la sala de cultivo un 90 % durante tres días, permitiendo la infección antes de normalizarse otra vez. Luego del asentamiento de las semillas de trigo, se detuvo el riego y se dejaron secar las espigas de trigo por completo. Se cosecharon y recogieron espigas de trigo individuales. Se determinó la gravedad de la enfermedad para cada espiga que presenta síntomas de fusariosis. La gravedad de la enfermedad se calculó como la cantidad de espiguillas afectadas dividida por la cantidad total de espiguillas por espiga. Los resultados (TABLA 6) revelaron que el trigo tratado con cada uno de los tres antagonistas microbianos analizados, SGI-014-C06; SGI-015-F03 y SGI-015-H06, tenían una gravedad e incidencia de infección de Fusarium graminearum considerablemente más baja cuando se comparan con el control "no tratado" que crece en las mismas condiciones (P<0.05).

TABLA 6 Eficacia de los antagonistas microbianos en la reducción de la incidencia de fusariosis en el trigo Para determinar el rendimiento de la semilla, las espigas de trigo se desgranaron manualmente de forma individual, las semillas se recogieron y se retiraron las cáscaras y otros detritos, se contaron y pesaron. Se determinó el rendimiento total de las semillas como la masa de semillas total producida por 16 recipientes de cada uno de los tratamientos.

Como se registra en la TABLA 7, se demostró que cada uno de los tres antagonistas microbianos protegieron considerablemente el rendimiento de la semilla, es decir, se redujo considerablemente la pérdida de rendimiento causada por la infección de fusariosis.

TABLA 7 Eficacia de los antagonistas microbianos para conservar el rendimiento de la semilla en plantas de trigo con fusariosis.

Por lo tanto, los tratamientos de plantas de trigo con cada uno de los microorganismos analizados conservaron considerablemente las plantas de trigo contra la pérdida de rendimiento causada por la infección de Fusarium. En particular, las plantas de trigo tratadas con SGI-014-C06 o SGI-015-F03 mostraron una mejora considerable en el rendimiento total de las semillas, es decir, 110 % y 120 % respectivamente, cuando se comparan con el control no infectado. Por el contrario, los fungicidas de referencia Actinovate®, RhizoVital® y Prosario® no parecieron proteger considerablemente las plantas de trigo tratadas de la pérdida de rendimiento causada por la infección de fusariosis por Fusarium.

EJEMPLO 10 Biocontrol de fusariosis de trigo en condiciones de campo.

Antagonistas del microorganismo que se descubrió que tenía actividad supresora contra el patógeno F. graminearum y la fusariosis en ensayos de antagonismo in vitro y estudios en invernaderos, como se describe en los Ejemplos 4-9, se evalúan adicionalmente en una serie de experimentos de campo en distintas ubicaciones geográficas en los Estados Unidos. Algunos experimentos se llevan a cabo en áreas agrícolas que se utilizan para el control microbiológico de la fusariosis de trigo, donde ocurre la infección de la enfermedad natural. La variedad de trigo utilizada en el análisis es una variedad susceptible de F. graminearum. En general, las plantas de trigo con cada tratamiento se sembraron en parcelas de 12 filas, de alrededor de 3 metros de longitud. El espacio entre las filas es de alrededor de 20 cm. Las parcelas tratadas en cada experimento se disponen en un diseño de bloque aleatorio. También se evalúan la eficacia de varias composiciones en polvo humedecible que contienen los antagonistas microbianos de la presente invención para reducir la gravedad de la fusariosis y la incidencia. En estos experimentos, los antagonistas microbianos se evalúan de forma individual o combinada.

En estos análisis, se evalúan los antagonistas de microorganismos en varios tratamientos de recubrimiento de semillas y/o análisis de campo donde las suspensiones microbianas se aplican directamente sobre las espigas de trigo florecientes. En cada uno de los experimentos, los microorganismos son evaluados en parceladas replicadas. En estos experimentos se pueden usar los métodos de producción de plantas, patógenos y antagonistas que se describen en los Ejemplos 4 - 9.

Tratamiento de recubrimiento de semillas - Además del método de recubrimiento de semillas descrito en el Ejemplo 7 anteriormente, se pueden utilizar varias técnicas y formulaciones de recubrimiento de semillas conocidas en la técnica para el tratamiento de las semillas de trigo con antagonistas microbianos, como las descritas anteriormente por Fernando et él., 2002; Bello et él., 2002; y Kim et él., 1997. En general, las semillas de trigo se pre-humedecen y almacenan a temperatura ambiente para promover la germinación. Luego, las semillas germinadas se pueden sumergir en las suspensiones microbianas antes de la siembra. Las esporas de patógeno se pueden inocular antes o después de la inoculación bacteriana. Para estos tratamientos de semillas se pueden usar los métodos de producción de plantas, patógenos y antagonistas que se describen en los Ejemplos 4 y 5.

Gravedad de la enfermedad y evaluación del rendimiento - Los antagonistas se someten a evaluación adicional en invernadero y a evaluación de campo para determinar su actividad supresora contra la fusariosis en trigo y cebada en las etapas de floración, utilizando una variedad de métodos y procedimientos, generalmente los que se describen, por ejemplo, en Schisler, Plant Disease, tomo 86(12), 1350-1356, 2002; Schisler et ál. Biological Control, 39:497-506,2006; y Khan y Doohan, Biological Control, 48:42-47,2009. En uno de dichos experimentos, los inóculos de G. zeae se preparan en maíz dentado amarillo estéril, como lo describe Khan et ál. (Biological Control, 29:245-255, 2004). Los cultivos de lípidos completamente colonizados (cultivo de 48 horas) de las cepas microbianas se diluyen hasta un cuarto de la potencia con amortiguador de fosfato. Los conteos de CFU por mL finales para los tratamientos con antagonistas son de entre 1 X 109 CFU/mL y 6 X 109 CFU/mL. Luego, las suspensiones de tratamiento se aplican a las espigas de trigo florecientes utilizando un rociador tipo mochila de C02. En general, los tratamientos se aplican luego del atardecer para minimizar la degradación de UV potencial de las células de antagonistas. Hay 5 replicados por tratamiento que se disponen en un diseño de bloque aleatorio. El tratamiento de control primario consiste en plantas tratadas con una solución amortiguadora. Un segundo control consiste en plantas no tratadas. Las evaluaciones de campo de la fusariosis y la incidencia se realizan evaluando 60 espigas por replicado (es decir, 300 espigas/tratamiento) cuando el desarrollo de las plantas alcanza un desarrollo entre etapa lechosa media y etapa pastosa. Las espigas de trigo se cosechan manualmente y se desgranan usando un desgranador de espiga y planta única de Almaco (Almaco, IA) cuando los granos alcanzan el desarrollo total. Las muestras de granos obtenidas de cada fila de replicado se evalúan para determinar el peso de 100 granos. Se analizan los datos de gravedad de la enfermedad, incidencia y peso de 100 granos usando un análisis de varianza de una vía (ANOVA).

Se descubrió que las composiciones que contienen los antagonistas microbianos de la invención, individualmente o de forma combinada disminuyen considerablemente la incidencia de la enfermedad. Estos resultados muestran que las medidas de control biológico usando estos agentes microbianos activos pueden cumplir una función importante en el manejo de la fusariosis en las plantas gramíneas, tales como plantas de trigo.

EJEMPLO 11 Desarrollo de variedades cultivadas de origen no natural y programa de cultivo Los microorganismos endofíticos de la presente invención se introducen en plantas de cultivo, incluyendo cereales, de diversos genotipos y origen geográfico, que carecen de dichos microorganismos endofíticos, para crear combinaciones de plantas y endófitos con mejores características agronómicas, utilizando los procedimientos análogos a los conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la solicitud de patente estadounidense N° 20030195117A1 ; solicitud de patente estadounidense N° 20010032343A1 ; y patente estadounidense N° 7,084,331 , entre otras. Por lo tanto, se pueden crear combinaciones sintéticas de plantas y endófitos determinadas y se pueden seleccionar en un programa de desarrollo de cultivo/variedad cultivada en función de su capacidad para formar y mantener una combinación mutualista que da como resultado un beneficio agronómico. La clasificación de las características agronómicas de la combinación también se puede utilizar en dicho programa de cultivo. Estas características pueden incluir, de modo no taxativo, tolerancia a la sequía, acumulación a la biomasa, resistencia a la infección de los insectos, palatabilidad para el ganado (por ejemplo, herbívoros), facilidad de reproducción y rendimiento de las semillas, entre otros. Dichas combinaciones pueden diferir en los niveles de acumulación de los metabolitos microbianos que son tóxicos para las plagas y malezas, incluyendo niveles de alcaloide del ergot, niveles de lolina, niveles de peramina o niveles de lolitrem, a la vez que presentan características agronómicas deseadas de las plantas de cultivo, incluyendo la resistencia a la alimentación o infección con insectos, resistencia al estrés abiótico, palatabilidad del ganado, acumulación de biomasa, facilidad de reproducción y rendimiento de las semillas, entre otras características.

Se han descrito varias modalidades de la invención. Sin embargo, se comprenderá que los elementos de las modalidades descritas en la presente se pueden combinar para realizar modalidades adicionales y que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, otras modalidades, alternativas y equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención, tal como se describe y reivindica en la presente.

Los títulos dentro de la solicitud solamente se presentan a efectos de la comodidad del lector y no limitan de modo alguno el alcance de la invención o sus modalidades.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente mediante esta referencia en la misma medida en que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara como específica e individualmente incorporada mediante esta referencia.

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una cepa aislada que se selecciona del grupo que consiste en una cepa Microbacterium sp., una cepa Bacillus sp., una cepa Mycosphaerella sp. y una cepa Varíovorax sp., donde dicha cepa microbiana tiene actividad supresora contra la fusariosis.

2. La cepa microbiana aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha cepa microbiana se selecciona del grupo que consiste en la cepa Mycosphaerella sp. SGI-010-H11 (depositada como NRRL 50471), la cepa Microbacterium sp. SGI-014-C06 (depositada como NRRL B-50470), la cepa Varíovorax sp. SGI-014-G01 (depositada como NRRL B-50469), la cepa Bacillus sp. SGI-015-F03 (depositada como NRRL B-50760), la cepa Bacillus sp. SGI-015-H06 (depositada como NRRL B-50761), y variantes activas como pesticidas de cualquiera de estas.

3. La cepa microbiana aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha cepa microbiana comprende una secuencia de ADN que exhibe el menos 85 % de identidad de secuencia a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en el Listado de secuencias.

4. Un cultivo biológicamente puro de una cepa microbiana de la reivindicación 1.

5. Un cultivo enriquecido de una cepa microbiana de la reivindicación 1.

6. Una composición que comprende una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y una cantidad eficaz en el ámbito agrícola de un compuesto o composición que se selecciona del grupo que consiste en un acaricida, un bactericida, un fungicida, un insecticida, un microbicida, un nematicida, un pesticida y un fertilizante.

7. Una composición que comprende una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y un portador.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho portador es un portador aceptable en el ámbito agrícola.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho portador es una semilla de planta.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha composición se prepara como una formulación que se selecciona del grupo que consiste en una emulsión, un coloide, un polvo, un gránulo, un sedimento, un polvo, un aerosol, una emulsión y una solución.

1 1. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha composición es una formulación de recubrimiento de semillas.

12. Una semilla que tiene un recubrimiento que comprende una composición de la reivindicación 7.

13. Un método para evitar, inhibir o tratar el desarrollo de un patógeno vegetal, donde dicho método comprende cultivar una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un medio de cultivo o suelo de una planta hospedadora antes o concurrente con el cultivo de la planta hospedadora en dicho medio de cultivo o suelo.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho patógeno vegetal provoca fusariosis.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho patógeno vegetal es Fusarium graminearum.

16. Un método para evitar, inhibir o tratar el desarrollo de la fusariosis de una planta, donde dicho método comprende aplicarle a la planta, o a los alrededores de la planta, una cantidad eficaz de una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha cepa microbiana o cultivo de esta se aplica al suelo, una semilla, una raíz, una flor, una hoja, una parte de la planta o a toda la planta.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha planta es susceptible a Fusaríum graminearum.

19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha planta es una planta de trigo, una planta de maíz, una planta de cebada o una planta de avena.

20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha cepa microbiana o cultivo de esta se establece como un endófito en dicha planta.

21. Una planta de origen no natural que es una planta infectada artificialmente con una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

22. Semilla, tejido reproductor, tejido vegetativo, partes de la planta o progenie de una planta de origen no natural de la reivindicación 21.

23. Un método para preparar una composición agrícola, donde dicho método comprende inocular una cepa microbiana o cultivo de esta de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en o sobre un sustrato y permitir que dicha cepa microbiana o cultivo de esta crezca a una temperatura de 1-37 °C hasta obtener una cantidad de células o esporas de al menos 10 -10 por mililitro o por gramo.