BR112014001815B1 - Composições e métodos para prevenir, inibir ou tratar a doença da fusariose de cereais, semente revestida e método de preparação da referida composição - Google Patents

Abstract

abstract compositions and methods for controlling head blight disease compositions comprising microbiological strains and cultures and methods of use thereof are provided herein. certain strains, cultures, and compositions thereof are useful for the control of head blight disease, for example, of various crop plants. biological control compositions, and methods of use thereof to prevent, inhibit or treat the development of plant pathogens or disease and for preserving plant yield, are also provided. tradução do resumo resumo patente de invenção: "composições e método para controlar a doença da fusariose de cereais". composições compreendendo cepas microbiológicas e culturas e métodos para uso das mesmas são providos aqui. certas cepas, cultura e composições das mesmas são úteis para o controle da doença da fusariose de cereais, por exemplo, de vários cereais. composições de controle biológico, e métodos de uso dos mesmos para prevenir, inibir ou tratar o desenvolvimento de patógenos de planta ou doença e para preservação do rendimento da planta, também são providos.

Description

[001] O material na Listagem de Sequência de acompanhamento é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. O arquivo de acompanhamento, nomeado SGI1520-1 WO_ST25.txt, foi criado em 24 de Julho de 2012 e é de 55 Kb. O arquivo pode ser acessado utilizando Microsoft Word em um computador que utilize Windows OS.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se ao controle biológico de doenças fitopatogênicas. Especificamente, refere-se às composições e métodos úteis para controlar a doença da fusariose de cereais em plantas de cereais, tais como trigo e cevada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] Fusariose de cereais, também conhecida como sarna de cabeça (head scab), mofo rosa (pink mold), cabeças brancas (whiteheads) e tombstone scab, é uma doença devastadora quer aflige o trigo, cevada, e várias outras culturas de cereais no mundo todo, particularmente nos EUA, Europa e China. Essa doença pode atingir níveis epidêmicos e provocar dano extenso aos grãos, especialmente trigo e cevada em áreas de cultivo de cereal úmidas e semiúmidas do mundo, incluindo Índia, Rússia, França, Alemanha e Reino Unido. Particularmente, sarna de trigo ou fusariose de cereais é uma das doenças mais danificadoras do trigo nos Estados Unidos. Em todo o país, essa doença causou à indústria de trigo milhões de dólares em perdas de rendimentos. No Centro-Oeste e Altos Planos, sarna de trigo é o principal obstáculo para a produção de trigo nos últimos anos. Fusariose de cePetição 870190046231, de 17/05/2019, pág. 6/90

2/75 reais além de atacar o trigo também ataca e reproduz em cevada, aveias, milho e muitos outros cereais.

[004] Esta séria doença de planta pode ser causada por vários fitopatógenos, mas primeiramente por várias espécies no gênero fungal Fusarium. Por exemplo, agentes causais da doença da fusariose de cereais no trigo incluem um número de diferentes espécies de Fusarium species, por exemplo F. culmorum, F. graminearum (teleomorfo, Gibberella zeae), F. avenaceum (teleomorfo, G. avenacea), F. poae, bem como por patógenos de não Fusarium tal como Microdochium nivale (teleomorph, Monographella nivalis) e Microdochium majus. Nos Estados Unidos, Europa e áreas mais importantes agrônomamente do mundo, o agente causador predominante da fusariose de cereais é Fusarium graminearum (teleomorph, Gibberella zeae estrito senso).

[005] Esses patógenos normalmente sobrevivem em restos de plantas. Eles invadem e danificam as espiguetas da cabeça do grão durante a florada, consequentemente evitando ou impedindo parcialmente o desenvolvimento do grão na cabeça do grão. Como resultado, o patógeno de sarna invasor pode ou matar parte da cabeça do grão ou toda a cabeça do grão. Algumas sementes infectadas são inferiores em vigor e frequentemente falham em germinar. Sementes infectadas que germinam frequentemente morrem cedo no estágio de plântula devido à podridão da coroa ou podridão radicular, causando estandes pobres na seguinte planta de cultivo. Plântulas saudáveis também podem ser tornar infectadas em emergência. Além do estande debilitado e pobre, perdas de rendimento devido à infestação de patógeno podem ser muito altas se as condições são favoráveis para desenvolvimento da doença.

[006] Os patógenos fungais do gênero Fusarium espalhou pelas áreas de cultivo de grão em todo o mundo, e são conhecidos por cau

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3/75 sar sério dano, particularmente em áreas com alta pluviosidade entre a florada e o suplemento do grão. Quando Fusarium graminearum é o agente causador, essa doença é de preocupação primária porque não apenas reduz valores comerciais dos grãos contaminados, além das perdas de rendimento, mas porque infecção de Fusarium também pode levar ao acúmulo de micotoxinas de tricoteceno nos grãos consequentemente ameaçando a saúde do humano e do gado. Tricotecenos são contaminadores de micotoxina principais de cereais do mundo inteiro, provocando recusa alimentar, vômito, diarréia e perda de peso em animais não ruminantes e representando uma ameaça à saúde de outros animais e humanos quando níveis de exposição são altos. Essa ameaça tem sido exacerbada pelo deslocamento recente nas cepas de F. graminearum nos Estados Unidos em direção à produção e vigor de toxina maior. Micotoxinas mais frequentemente encontradas são deoxinivalenol (DON, também conhecido como vomitoxina) e zearalenona (ZEA). Deoxinivalenol em particular é uma toxina muito perigosa, provocando desordens gastrointestinais acompanhadas por condições hemorrágicas e outras em humanos e animais que come grãos infectados, levando à morte em alguns casos. Desde que deoxinivalenol seja geralmente estável contra alterações em pH e alta temperatura, detoxificação pode ser muito difícil. Portanto, grãos contaminados além de um certo nível não podem ser utilizados em qualquer forma de preparação, processamento ou alimento de gado, e consequentemente com freqüência precisa ser descartado.

[007] Até agora, várias estratégias foram empregadas para controlar fusariose de cereais em cereais. Opões promissoras incluem medições químicas, o desenvolvimento de cultivos de cultura resistente, e práticas tradicionais de rotação de cultura e lavoura dos campos. Dentre essas opões, pesticidas químicos podem ser de algum modo eficazes na redução da infestação por fusariose de cereais, mas pro

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4/75 blemas de resíduo em relação ao uso de fungicidas tardio no desenvolvimento do cultivo, normalmente nos estágios de florecimento apenas algumas semanas antes da colheita, diminuem sua atratividade. Avanços no desenvolvimento de cultivos resistentes utilizando reprodução tradicional e manipulação genética mostram que outras alternativas de controle de doença também estão ocorrendo. Exemplos relatados de avanços da manipulação genética incluem alterar a produção de um hormônio de planta ou manipular a via de sinalização do hormônio da planta. Nos últimos anos, avanços consideráveis na área de reprodução tradicional foram feitos no entendimento da base genética de resistência à doença da fusariose de cereais e um número de genes e locos de características quantitativas (QTL) conferindo resistência foram relatados. No entanto, progresso na resistência de cultura de aprimoramento para doença da fusariose de cereais tem sido lento, grandemente por causa da dificuldade de estudar essa doença. De fato, é entendido relativamente pouco atualmente sobre os mecanismos envolvidos na resistência ou suscetibilidade. Além disso, a diversidade genética das espécies de Fusarium, que são os agentes causadores predominantes da doença, frequentemente desponta preocupações em relação a quão durável a eficácia dos fungicidas químicos e cultivos resistentes pode ser. Como resultado, praticamente todos os cultivos de trigo atualmente em produção de larga escala permanecem vulneráveis à infecção.

[008] Além disso, embora algum sucesso no controle da doença da fusariose de cereais possa ser esperado por práticas tradicionais tais como arar campos para enterrar resíduos de culturas infestados com agente causador, por exemplo, de F. graminearum, depois de colher, lavouro convencional dos campos após colheita não é compatível com a prática de conservação do solo de lavouro mínimo. Considerando o potencial de dispersão de inoculação a longa distância e os culti

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5/75 vos diversos que podem agir como hospedeiros alternativos dos patógenos, rotação de cultura é frequentemente uma solução insustentável. Além do problema de resíduos de pesticidas no ambiente, relatos de resistência ao pesticida e casos de aumentos de conteúdo de DON no grão também podem ser problemas com seu uso. Adicionalmente, custos e problemas crescentes nos setores público e privado sobre resíduos de pesticidas no ambiente e segurança do produto alimentar rendem essa alternativa de controle de doença menos atrativa, e levaram a solicitações por cultivo de cultura utilizando o mínimo possível de pesticidas.

[009] Em resumo, apesar dos avanços consideráveis no desenvolvimento de técnicas para controlar fusariose de cereais, reduzir o impacto dessa doença devastadora sobre a produção e qualidade do grão permanece um problema insolúvel. Portanto, a identificação e desenvolvimento de novas técnicas de controle de fusariose de cereais é essencial na melhoria da produção e qualidade de muitas culturas de cereais. Esses problemas exigem solução urgente não apenas nos Estados Unidos, mas também por todo o globo, incluindo a Ásia e Europa.

[0010] Controle biológico da doença da fusariose de cereais atraiu interesse considerável desde meados de 1990. Agentes de controle biológico (BCAs), embora atualmente em número muito limitado, poderiam ser um método ambientalmente aceitável para diminuir substancialmente o nível de doença incitado por patógenos tal como Fusarium. Aceitação pública, compatibilidade com outras medições de gerenciamento de doença, e durabilidade estão entre fatores favoráveis no apoio de desenvolvimento de estratégias para controlar biologicamente doença da fusariose de cereais. Agentes de controle biológico podem desempenhas um papel importante na produção de cereal orgânico. Na produção convencional, tais agentes podem extender pro

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6/75 teção de espigões após o estágio de florada após fungicidas químicos não poderem ser mais aplicados. Até agora, avanços significativos na área de controle biológico tem sido atingidos. Por exemplo, certas cepas de bactérias produtoras de esporo (tais como espécies de Bacillus e Pseudomonas) e leveduras (tais como espécies de Cryptococcus) mostram alguma promesa para o controle de doença da fusariose de cereais e a redução de contaminação por micotoxina. No entanto, apesar desses e outros avaços, a necessidade permanece por microorganismos aprimorados para uso no controle biológico da doença da fusariose de cereais. Embora BCAs se tornaram uma soluçaõ mais aceitável para patógernos de planta e produtos BCA tem sido propagandeados a uma estensão maior do que antes, até agora houve poucas tentativas em desenvolver estratégias e micro-organismos antagônicos para controlar biologicamente a doença da fusariose de cereais. Além disso, o ciclo de vida da Fusarium spp. e outros agentes causadores da doença da fusariose de cereais sugere que os patógenos podem potencialmente ser suscetíveis às técnicas de controle biológico utilizando micro-organismos antagônicos em estágios de desenvolvimento diferentes. Consequentemente, há uma necessidade por identificar novos agentes de controle biológicos, preferencialmente com modos diferentes de ações,bem como métodos de biocontrole que podem ajudar a evitar de modo eficaz ou suprimir o desenvolvimento da doença da fusariose de cereais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] Composições compreendendo cepas microbiológicas e culturas são providas aqui. Certas cepas, culturas e composições das mesmas são úteis para o controle da doença da fusariose de cereais, por exemplo, de vários cereais incluindo trigo e outras plantas de cereal. Composições de controle biológico, e métodos de uso das mesmas para evitar, inibir ou tratar o desenvolvimento de patógenos de

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7/75 planta ou doença e para preservar rendimento de planta, são providos também. Também são providos métodos para uso de tais composições como agentes de controle biológico em combinação com outros compostos agricolamente eficazes ou composições para controlar patógenos de plantas perigosos.

[0012] Em um aspecto, a presente invenção provê cepas microbianas isoladas tendo atividade supressiva contra doença da fusariose de cereais. As cepas microbianas de acordo com este aspecto da presente invenção são selecionadas do grupo constituído pelos gêneros Microbacterium, Bacillus, Mycosphaerella e Variovorax. Em algumas modalidades preferenciais, as cepas microbianas são selecionadas do grupo constituído por cepa de Mycosphaerella sp. SGI-010- HI 1 (depositada como NRRL 50471), cepa de Microbacterium sp. SGI-014C06 (depositada como NRRL B-50470), cepa de Microbacterium sp. SGI-005-G08 (depositada como NRRL -), cepa de Variovorax sp. SGI014-G01 (depositada como NRRL B-50469), cepa de Bacillus sp. SGI015-F03 (depositada como NRRL B-50760), cepa de Bacillus sp. SGI015-H06 (depositada como NRRL B-50761), e variantes de ativo de pesticida de qualquer uma das mesmas. A cepa microbiana de acordo com algumas outras modalidades preferenciais pode compreender um sequência de DNA que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência para qualquer uma das sequências de nucleotídeos na Listagem de Sequência. São adicionalmente providas culturas biologicamnete puras e culturas enriquecidas das cepas microbianas divulgadas aqui.

[0013] Também são providas em outro aspecto da presente invenção composições que compreendem uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura das mesmas, e uma quantidade agricolamente eficaz de um composto ou composição selecionada do grupo constituído por um acaricida, um bactericida, um fungicida, um inseticida, um mi

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8/75 crobicida, um nematicida, um pesticida e um fertilizante. As composições em algumas modalidades desse aspecto podem ser preparadas como uma formulação selecionada do grupo constituído por uma emulsão, um coloide, uma poeira, um grânulo, uma pastilha, um pó, um spray, uma emulsão e uma solução. Em algumas outras modalidades, as composições podem ser providas com um veículo. Em alguma modalidade preferencial, o veículo é um veículo agriculturalmente aceitável. Em alguma modalidade particularmente preferencial, o veículo é uma semente de planta. Em outras modalidades preferenciais, a composição é uma formulação de revestimento de semente. São adicionalmente providas na presente divulgação sementes que são revestidas com uma composição de acordo com a presente invenção.

[0014] Em outro aspecto da presente invenção, são providos métodos para prevenir, inibir ou tratar o desenvolvimento de um patógeno de planta. Os métodos envolvem cultivar uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura da mesma em um meio de cultivo ou solo de uma planta hospedeira antes ou concorrente com crescimento da planta hospedeira no meio de cultivo ou solo. Em algumas modalidades preferenciais deste aspecto, o patógeno de planta causa doença da fusariose de cereais. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, o patógeno de planta é Fusarium graminearum.

[0015] Ainda em outro aspecto da presente invenção, são providos métodos para prevenir, inibir ou tratar o desenvolvimento da doença da fusariose de cereais de uma planta. Os métodos envolvem aplicar à planta, ou às cercanias da planta, uma quantidade eficaz de uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura da mesma. Em uma modalidade, tal doença da fusariose de cereais é causada pelo fungo Fusarium graminearum. Em algumas modalidades deste aspecto, a cepa microbiana ou uma cultura da mesma é aplicada ao solo, uma semente, uma raiz, uma flor, uma folha, uma porção da planta ou a planta intei

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9/75 ra. Em uma modalidade preferencial, a planta é suscetível à Fusarium graminearum. Em algumas outras modalidades preferenciais, a planta é planta de trigo, uma planta de milho, uma planta de cevada, ou uma planta de aveia. Em outra modalidade preferencial, a cepa microbiana da presente invenção ou uma cultura da mesma é estabelecida como um endófito sobre a planta.

[0016] Outro aspecto adicional da invenção provê plantas de ocorrência não natural. As plantas de ocorrência não natural são artificialmente infectadas com uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura da mesma. São adicionalmente providas em algumas modalidades preferenciais deste aspecto semente, tecido reprodutor, tecido vegetativo, partes de planta e progenia das plantas de ocorrência não natural.

[0017] Ainda outro aspecto da invenção provê um método para preparar uma composição agrícola. O método envolve inocular a cepa microbiana de acordo com a presente invenção ou uma cultura da mesma dentro ou sobre um substrato e permití-la crescer em uma temperatura de 1-37°C até obter um número de células ou esporos de pelo menos 102-10³ por milímetro ou por grama.

[0018] Esses e outros objetivos e recursos da da invenção se tornarão totalmente evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção e as reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Algumas definições [0019] A menos que definido de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizados aqui são destinados a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica a qual esta invenção pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são definidos aqui para clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais defi

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10/75 nições aqui não devem ser necessariamente interpretadas para representar uma diferença substancial sobre a qual é geralmente entendida na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos descritas ou referenciadas aqui são bem entendidas e comumente empregadas utilizando metodologia convencional por aqueles versados na técnica.

[0020] A forma singular um, uma, e o/a incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo uma célula inclui uma ou mais células, incluindo misturas das mesmas.

[0021] As expressões micro-organismo antagônico e antagonista microbiano são utilizados aqui intercaladamente em referência a um micro-organismo que é destinado a significar que a cepa de objeto exibe um grau de inibição de doença da fusariose de cereais excedente, em um nível estatísticamente significante, que de um controle não tratado.

[0022] Antibiótico: o termo antibiótico, como utilizado aqui, referese a qualquer substância que é capaz de matar ou inibir o crescimento de um micro-organismo. Antibióticos podem ser produzidos por qualquer um ou mais dos seguintes: 1) um micro-organismo, 2) um processo sintético, ou 3) um processo semisintético. Um antibiótico pode ser um micro-organismo que secreta um composto orgânico volátil. Além disso, um antibiótico pode ser um composto orgânico volátil secretado por um micro-organismo.

[0023] Bactericida: o termo bactericida, como utilizado aqui, refere-se com a capacidade de uma composição ou substância aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento da bactéria. Inibição da taxa de crescimento da bactéria pode ser comumente quantificada como a redução de células bacterianas viáveis ao longo do tempo.

[0024] Controle biológico: o termo controle biológico e sua forma abreviada biocontrole, como utilizado aqui, é definido como um con

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11/75 trole de um patógeno ou inseto ou qualquer outro organismo indesejável pelo uso de pelo menos um seguindo organismo que não humano. Um exemplo de um mecanismo conhecido de controle biológico é o uso de micro-organismos que controlam podridão radicular competindo fora do fungo por espaço na superfície da raiz, ou micro-organismos que ou inibem o crescimento de ou matam o patógeno. A planta hospedeira no contexto do controle biológico é a planta que é suscetível à doença causada pelo patógeno. No contexto do isolamento de um organismo, tal como uma espécie de fungo, de seu ambiente natural, a planta hospedeira é uma planta que suporta o crescimento dos fungos, por exemplo, uma planta de uma espécie o fungo é um endófito.

[0025] O termo cereal como utilizado aqui é destinado a referirse a qualquer espécie de cereal que pode ser suscetível à doença da fusariose de cereais. Cereais reportados para ser suscetíveis incluem trigo, cevada, aveias, e tritical, embora trigo e cevada são as duas culturas em que essa doença apresenta um problema econômico significativo.

[0026] Uma quantidade eficaz refere-se a uma quantidade suficiente para afetar resultados benéficos ou desejados. Em termos de gerenciamento de doença, tratamento, inibição ou proteção, uma quantidade eficaz é aquela quantidade suficiente para suprimir, estabilizar, reverter, diminuir ou atrasar a progressão da infecção alvo ou estados de doença. Como tal, a expressão uma quantidade eficaz é utilizada aqui em referência àquela quantidade de tratamento de antagonista que é necessária para obter uma redução no nível de desenvolvimento de patógeno e/ou no nível de doença patogênica em relação àquela que ocorre em um controle não tratado. Normalmente, uma quantidade eficaz de um dado tratamento de antagonista provê uma redução de pelo menos 20%; ou mais tipicamente, entre 30 a 40%; mais normalmente, entre 50-60%; ainda mais normalmente, entre 70 a 80%; e ain

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12/75 da mais normalmente, entre 90 a 95%, em relação ao nível de doença e/ou o nível de desenvolvimento de patógeno ocorrendo em um controle não tratado sob condições adequadas de tratamento. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. A taxa real de aplicação de uma formulação líquida irá normalmente variar de um mínimo de cerca de 1 X 103 a cerca de 1 X 10¹⁰ células/mL viáveis e preferencialmente de cerca de 1 X 106 a cerca de 5 x 10⁹ células/mL viáveis. Sob a maioria das condições, as cepas microbianas antagonistas da invenção descritas nos Exemplos abaixo, seriam otimamente eficazes em taxas de aplicação na faixa de cerca de 1 X 10⁶ a 1 x 10⁹ células/mL viáveis, assumindo um modo de aplicação que atingiria contato sunstancialmente uniforme de pelo menos cerca de 50% de tecidos de planta. Se os antagonistas são aplicados como uma formulação sólida, a taxa de aplicação deve ser controlada para resultar em um número comparável de células viáveis por área de unidade de superfície de tecido de planta como obtido pelas taxas mencionadas anteriormente de tratamento líquido. Normalmente, os agentes de controle biológico da presente invenção são biologicamente eficazes quando entregues em uma concentração em excesso de 10⁶ CFU/g (unidades formadoras de colônia por grama), preferencialmente em excesso de 10⁷ CFU/g, mais preferencialmente 108 CFU/g, e mais preferencialmente em 10⁹ CFU/g.

[0027] Adicionalmente, a expressão antagonista microbiano eficaz utilizado aqui em referência a um micro-organismo é destinado a significar que a cepa microbiana de sujeito exibe um grau de inibição da doença da fusariose de cereais excedente, em um nível estatísticamente significativo, aquele de um controle não tratado. Normalmente, um antagonista microbiano eficaz tem a capacidade de efetuar uma redução de pelo menos 20%; ou mais normalmente, entre 30 a 40%; mais normalmente, entre 50-60%; ainda mais normalmente, entre 70 a

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80%; e ainda mais normalmente, entre 90 a 95%, em relação ao nível de doença e/ou o nível de desenvolvimento de patógeno ocorrendo em um controle não tratado son condições adequadas de tratamento.

[0028] Composição: A composição é destinada a significar uma combinação de agente ativo e pelo menos outro composto, veículo ou composição, inerte (por exemplo, uma agente detectável ou rótulo ou veículo líquido) ou ativo, tal como um pesticida.

[0029] Cepa microbiana isolada, cultura isolada, cultura biologicamente pura, e cultura enriquecida: como utilizado aqui, o termo isolado como aplicado a um micro-organismo (por exemplo, bactéria ou microfungo) refere-se a um micro-organismo que foi removido e/ou purificado de um ambiente em que ele ocorre naturalmente. Como tal, uma cepa isolada de um micróbio como utilizado aqui é uma cepa que foi removida e/ou purificada de seu meio natural. Consequentemente, um micro-organismo isolado não inclui um residente em um ambiente em que ocorre naturalmente. Adicionalmente , o termo isolado não reflete necessariamente a extensão do que o micróbio foi purificado. Uma cultura substancialmente pura da cepa do micróbio refere-se a uma cultura que contém substancialmente nenhum outro micróbio que a cepa desejada ou cepas de micróbios. Em outras palavras, uma cultura substancialmente pura de uma cepa de micróbio é substancialmente livre de outros contaminantes, o que pode incluir contaminantes microbianos bem como contaminantes químicos indesejáveis. Adicionalmente, como utilizado aqui, uma cepa biologicamente pura é destinada a significar a cepa separada dos materiais com os quais é normalmente associado na natureza. Note que uma cepa associada com outras cepas ou com compostos ou materiais que não é normalmente encontrados na natureza, é ainda definido como biologicamente puro. Uma monocultura de uma cepa particular é, evidentemente, biologicamente pura. Como utilizado aqui, o termo

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14/75 cultura enriquecida de uma cepa microbiana isolada refere-se a uma cultura microbiana que contém mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% da cepa isolada.

[0030] Como utilizado aqui, um endófito é um endosimbionte que vive com uma planta durante pelo menos parte de sua vida sem causar doença aparente. Endófitos podem ser transmitidos ou verticalmente (diretamente do pai para filhos) ou horizontalmente (do indivíduo para indivíduo não relacionado). Endófitos fúngicos transmitidos verticalmente são normalmente assexuados e transmitem de planta materna para filhos por meio de hifas fúngicas penetrando as sementes hospedeiras. Endófitos bacterianos também podem ser transferidos verticalmente das sementes para semeaduras (Ferreira et al., 2008). Ao contrário, endófitos transmitidos horizontalmente normalmente sexuados, e transmitem por meio de esporos que podem ser espalhados pelo vento e/ou vetores de insetos. Endófitos de cereais têm recebido atenção considerável com relação a sua capacidade de controlar tanto a doença quanto a infestação de inseto, bem como promover crescimento de planta.

[0031] Proteína funcionalmente comparável: a frase proteína funcionalmente comparável como utilizada qui descreve aquelas proteínas que tem pelo menos uma característica em comum. Tais características incluem similaridade de sequência, atividade bioquímica, similaridade de padrão transcricional e atividade fenotípica. Normalmente, as proteínas funcionalmente comparáveis compartilham alguma similariedade de sequência ou pelo menos um bioquímico. Dentro dessa definição, homólogos, ortólogos, parálogos e análogos são considerados para ser funcionalmente comparáveis. Adicionalmente, proteínas funcionalmente comparáveis geralmente compartilham pelo menos uma atividade bioquímica e/ou fenotípica. Proteínas funcionalmente comparáveis darão surgimento às mesmas características a um similar, mas

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15/75 não necessariamente o mesmo, grau. Normalmente, proteínas funcionalmente comparáveis dao as mesmas características onde a medição quantitativa devido a um dos comparáveis é pelo menos 20% de outro; mais normalmente, entre 30 a 40%; mais normalmente, entre 50-60%; ainda mais normalmente, entre 70 a 80%; ainda mais normalmente, entre 90 a 95% ou; ainda mais normalmente, entre 98 a 100% do outro.

[0032] Fungicida: Como utilizado aqui, fungicida refere-se à capacidade de uma composição ou substância diminuir a taxa de crescimento do fungo ou aumentar a mortalidade do fungo.

[0033] Fungo Fusarium: para os propósitos dessa invenção entende-se que o uso do termo fungo Fusarium é destinado a incluir tanto o estágio sexual (teleomórfico) desse organismo quanto o estágio assexuado (anamórfico), também referido como os estágios perfeitos e imperfeitos, respectivamente. Por exemplo, o estágio anamórfico de Fusarium graminearum é0 Gibberella zeae, um agente causador da doença da fusariose de cereais. Esta doença normalmente ocorre quando a flor ou cabeça de semente começam inocular com conídia produzida pela forma imperfeita ou ascosporos produzidos pela forma perfeita desse fungo.

[0034] Mutante: Como utilizado aqui, o termo mutante ou variante em referência a um micro-organismo refere-se a uma modificação da cepa parental em que a atividade biológica desejada é similar àquela expressa pela cepa parental. Por exemplo, no caso da Microbacterium a cepa parental é definida aqui como a cepa de Microbacterium original antes da mutagênese. Mutantes ou variantes podem ocorrer na natureza sem a intervenção do homem. Eles também são obteníveis por tratamento com ou por uma variedade de métodos e composições conhecidas daqueles versados na técnica. Por exemplo, uma cepa parental pode ser tratada com um químico tal como N-metil-N'-nitro

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N-nitrosoguanidina, etilmetanosulfona, ou por irradiação utilizando raio X gama ou irradiação UV, ou por outros meios bem conhecidos daqueles praticados na técnica.

[0035] Nematicida: O termo nematicida, como utilizado aqui, refere-se à capacidade de uma substância ou composição aumentar a mortalidade ou inibir a taxa de crescimento de nematodos.

[0036] Patógeno: O termo patógeno como utilizado aqui referese a um organismo tal como uma alga, um arácnídeo, uma bactéria, um fungo, um inseto, um nematodo, uma planta parasita, levedura, um protozoário, ou um vírus capaz de produzir uma doença em uma planta ou animal. O termo fitopatógeno como utilizado aqui refere-se a um organismo patogênico que infecta uma planta.

[0037] Porcentagem de indentidade percentual: porcentagem da identidade de sequência, como utilizado aqui, é determinada comparando duas sequências localmente alinhadas otimamente sobre uma janela de comparação definida pelo comprimento do alinhamento local entre as duas sequências. A sequência de aminoácido na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (por exemplo, vãos ou saliências) quando comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo de duas sequências. Alinhamento local entre duas sequências inclui apenas segmentos de cada sequência que são considerados suficientemente similares de acordo com um critério que depende do algoritmo utilizado para realizar o alinhamento (por exemplo BLAST). A indentidade de porcentagem é calculada determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para render o número de posições equivalidas, dividindo o número de posições equivalidas pelo total de número de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100. Alinhamento ótimo de sequências para comparação po

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17/75 de ser conduzido por algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Add. APL. Math. 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia global de Needleman e Wunsch (J.Mol. Biol. 48:443, 1970), pela pesquisa por método de similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), por implementações heurísticas desses algoritmos (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ), ou por inspeção. Dado que duas sequências foram identificadas para comparação, GAP e BESTFIT são preferencialmente empregados para determinar seu alinhamento ótimo. Normalmente, os valores prédefinidos de 5.00 para peso de vão e 0.30 para comprimento de peso de vão são utilizados. O termo identidade de sequência substancial entre polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeo refere-se ao polinucleotídeo ou polipeptídeo compreendendo uma sequência que tem pelo menos 50% de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85% ou mais preferencialmente pelo menos 90%, até mais preferencialmente pelo menos 95%, e mais preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência comparada a uma sequência de referência utilizando os programas.

[0038] Sequências de aminoácido e ácido nucleico de consulta podem ser pesquisadas contra sequências de aminoácido ou ácido nucleico objetos residentes em bancos de dados públicos ou privados. Tais pesquisas podem ser feitas utilizando o programa de Centro Nacional para Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico de Informação sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI BLAST v 2.18). O programa NCBI BLAST está disponível na internet a partir do Centro Nacional para Informação sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Normalmente os seguintes parâmetros para NCBI BLAST podem ser utilizados:

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18/75 opções de filtro ajustadas para preajustes, a Matriz de Comparação ajustada para BLOSUM62, so Custos de Gap ajustado para Existence: 11, Extension: 1, o Tamanho de Palavra ajustado para 3, o Expect (limite E) ajustado para le-3, e o comprimento mínimo do alinhamento local ajustado para 50% do comprimento de sequência de consulta. Identidade de sequência e similaridade também podem ser determinadas utilizando software GenomeQuest^TM (Gene-IT, Worcester Mass. EUA).

[0039] O termo pesticida, como utilizado aqui, refere-se à capacidade de uma substância ou composição diminuir a taxa de crescimento de uma peste, ou seja, um organismo indesejado, [0040] Por atividade supressora de um agente de controle biológico contra um fitopatógeno significa-se a capacidade do agente em suprimir, inibir, estabilizar, reverter, diminuir, ou atrasar ou aumentar a mortalidade de uma peste. Desenvolvimento do próprio patógeno, ou a progressão da infecção ou estados da doença provocados pelo patógeno.

[0041] Variante: um variante, como utilizado aqui em referência a um micro-organismo, é uma cepa tendo características identificantes das espécies a qual pertence, embora tendo pelo menos uma variação de sequência de nucleotídeo ou traço identificavelmente diferente com relação à cepa parental, onde o traço é baseado geneticamente (transmissível). Por exemplo, para uma cepa de Microbacterium sp. SGI-SGI-014-C06 tendo atividade fungicida, traços identificáveis inclui 1) a capacidade de suprimir o crescimento de Fusarium graminearum e sua Gibberella zeae teleomorfa; 2) a capacidade de suprimir o desenvolvimento da doença da fusariose de cereais; 3) tendo genes de manutenção com identidade de sequência superior a 95%, superior a 96%, superior a 97%, superior a 98%, ou superior a 99% aos genes de manutenção de Microbacterium sp. SGI-014-C06 podem ser utilizados

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19/75 para confirmar uma variante como Microbacterium sp. SGI-014-C06. [0042] Para ácidos nucleicos e polipeptídeos, o termo variante é utilizado aqui para denotar um polipeptídeo, proteína ou molécula de polinucleotídeo com algumas diferenças, geradas sinteticamente ou naturalmente, em suas sequências de aminoácido ou ácido nucleico quando comparadas a um polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência, respectivamente. Por exemplo, essas diferenças incluem substituições, inserções, deleções ou quaisquer combinações desejadas de tais alterações em um polipeptídeo de referência ou polipeptídeo. Variantes de polipeptídeo e proteína podem consistir adicionalmente de alterações em modificações de carga e/ou pós-translacionais (tais como glicosilação, metilação, fosforilação, etc.).

[0043] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente tivesse especificamente e individualmente indicado para ser incorporada por referência.

[0044] Nenhuma admissão é feita que qualquer referência contitui estado da técnica. A discussão dos estados de referências que seus autores afirmam, e os requerentes reservam o direito de desafiar a precisão e pertinência dos documentos citados. Será claramente entendido que, embora um número de publicações do estado da técnica são referidas aqui, esta referência não constitui uma admissão que quaisquer desses documentos formam parte de conhecimento comum geral no estado da técnica.

Métodos para Identificacao Taxonômica [0045] Micro-organismos podem frequentemente ser distinguidos com base em análise microscópica direta (fazer todas das células em uma amostra parecerem o mesmo em exame), características de coloração, análise molecular simples (tal como uma determinacao de poli

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20/75 morfismo de comprimento de fragmento de restrição simples (RFLP)), e assim por diante. Além dos exemplos ilustrativos de tais técnicas de análise taxonômica como descritos nos Exemplos 2-3 da presente divulgação, identificação taxonômica de um micro-organismo pode envolver até vários níveis diferentes de análise, e cada análise pode ser baseada em uma característica diferente do organismo. Tais análises taxonômicas podem incluir análise com base em ácido nucleico (por exemplo, análise de genes específicos individuais, ou como para sua presença ou sua sequência exata, ou expressão de um gene particular ou uma família de genes), análise com base em proteína (por exemplo, em um nível funcional utilizando ensaios de enzima diretos ou indiretos, ou em um nível estrutural utilizando técnicas de detecção imunológica), e assim por diante.

[0046] Ánalise com base em ácido nucleico: alguém versado ordinariamente na técnica irá apreciar que uma ampla variedade de técnicas com base em ácido nucleico são conhecidas e podem ser úteis na obtenção de identificação taxonômica de um dado micro-organismo. Essas técnicas podem ser utilizadas para identificar células por sequência de gene ou para identificar células que tenham genes particulares ou famílias de gene. Famílias de gene comum úteis para estudos taxonômicos incluem família de gene 16S, família de gene de actina, e família de gene de recombinase A (recA). Esses métodos normalmente incluem ampliação e sequenciação de genes a partir de números muito pequenos de células, e, portanto, superam frequentemente os problemas de contração de células e seus DNAs de suspensões diluídas. O termo ampliação de ácido nucleico geralmente refere-se às técnicas que aumentam o número de cópias de uma molécula de ácido nucleico em uma amostra ou espécime. Técnicas úteis para ampliação de ácido nucleico são bem conhecidas na técnica. Um exemplo de ampliação de ácido nucleico é a reação de cadeia de polimerase

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21/75 (PCR), em que uma amostra biológica coletada de um sujeito é contactada com um par de iniciadores de oligonucleotídeo, sob consdições que permitem a hibridação dos iniciadores para modelo de ácido nucleico na amostra. Os iniciadores são estendidos sob condições adequadas, dissociados do modelo, e então re-hibridados, estendidos e dissociados para ampliar o número de cópias do ácido nucleico. Outros exemplos de técnicas de ampliação in vitro incluem ampliação de deslocamento de filamento; ampliação isotérmica livre de transcrição; ampliação de reação de cadeia de reparo; reação de cadeia de ligase; ampliação de reação de cadeia de ligase de preenchimento de vão; detecção de ligase acoplada e PCR; e ampliação livre de transcrição de RNA.

[0047] Além dos iniciadores de exemplo ilustrativos providos aqui, ver, por exemplo Exemplos 2-3 e a Listagem de Sequência, iniciadores também foram projetados rotineiramente, e novos estão sendo continuamente projetados, para espécies individuais ou grupos filogenéticos dos micro-organismos. Tais iniciadores estritamente direcionados podem ser utilizados com os métodos descritos aqui para ocultar e/ou identificar especificamente apenas os micro-organismos de interesse. [0048] Métodos para preparar e utilizar iniciadores de ácido nucleico são descritos, for exemplo, em Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1998). Pares de iniciador de ampliação podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, utilizando programas de computador destinados para aquele fim tal como Iniciador (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Alguém versado ordinariamente na técnica apreciará que a especificidade de uma sonda particular ou iniciador aumenta com seu comprimento. Consequentemente, por exemplo, um iniciador compreendendo 30 nucleotídeos

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22/75 consecutivos de um nucleotídeo codificante de rRNA ou região de flanqueamento dos mesmos irão sedimentar a uma sequência alvo com uma especificidade mais alta do que um iniciador correspondente de apenas 15 nucleotídeos. Consequentemente, para obter maior especificidade, sondas e iniciadores podem ser selecionados que compreendem pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeo alvo tal como o 16S rRNA.

[0049] Técnicas comuns para a preparação de ácidos nucleicos úteis para aplicações de ácidos nucleicos (por exemplo, PCR) incluem extração de fenol/clorofórmio ou uso de um dos muitos kits de extração de DNA que estão disponíveis no mercado. Outro modo que DNA pode ser ampliado é adicionando células diretamente à mistura de reação de ampliação de ácido nucleico e baseando-se na estapa de desnaturação da ampliação para lise das células e liberação de DNA.

[0050] O produto das reações de ampliação de ácido nucleico pode ser adicionalmente caracterizado por uma ou mais técnicas padrões que são bem conhecidas na técnica, incluindo eletroforese, padrões de clivagem de endonuclease de restrição, hibridação ou ligação de oligonucleotídeo, e/ou seqüenciamento de ácido nucleico. Quando em técnicas de hibridação são utilizados para fins de identificação celular, uma variedade de métodos de rotulagem de sonda pode ser útil, incluindo rotulagem fluorescente, rotulagem radioativa e rotulagem não radioativa. Quando técnicas de seqüenciamento de ácido nucleico são utilizadas, pesquisa de homologia para a sequência de nucleotídeo das moléculas de ácido nucleico ampliadas pode ser conduzida utilizando vários bancos de dados de sequências conhecidas, incluindo mas não limitados aos bancos de dados DDBJ/GenBank/EMBL.

[0051] b. Análise com base em proteína: além da análise de ácidos nucleicos, micro-organismos podem ser caracterizados taxonomi

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23/75 camente e identificados com base na presença (ou ausência) de proteínas específicas diretamente. Tal análise pode ser baseada na atividade de proteína específica, por exemplo, através de um ensaio de enzima ou pela resposta de organismos co-culturados, ou pela mera presença de proteína especificada (que pode, por exemplo, ser determinada utilizando métodos imunológicos, tal como coloração de anticorpo imunofluorescente in situ).

[0052] Ensaios de enzima: a título de exemplo, análogos de substrato fluorescente ou cromogênicos podem ser incluídos dentro do meio de crescimento (por exemplo, culturas de placa de micro titulação), seguido pela incubação e triagem dos produtos de reação, assim identificando culturas em uma base de suas atividades enzimáticas.

[0053] Resposta de co-cultivo: Em algumas modalidades da presente invenção, a atividade de uma enzima executada por um micróbio isolado pode ser ensaiada com base na resposta (ou grau de resposta) de um organismo co-culturado (tal como um organismo repórter).

[0054] Uma variedade de métodos também pode ser utilizada para identificar micro-organismos selecionados e isolados de um ambiente de fonte por ligação de pelo menos uma molécula derivada de anticorpo a uma molécula, ou mais particularmente um epítopo de uma molécula, do micro-organismo.

[0055] Anticorpos de proteína de anti-micro-organismo podem ser produzidos utilizando procedimentos padrão descritos em um número de textos, incluindo Harlow e Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). A determinação que um agente particular se liga substancialmente apenas a uma proteína do micro-organismo desejado por ser feita prontamente utilizando ou adaptando procedimentos de rotina. Um ensaio in vitro adequado faz uso de procedimento de Western blotting (descrito em muitos textos padrão, incluindo Harlow e Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)).

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24/75 [0056] Fragmentos menores dos anticorpos (moléculas derivadas de anticorpo, por exemplo, FAbs, Fvs, e Fvs de cadeia única (SCFvs)) também podem servir como agentes de ligação específicos. Métodos de fazer esses fragmentos são rotina.

[0057] Detecção de anticorpos que se ligam às células em um arranjo dessa invenção pode ser realizada utilizando técnicas padrão, por exemplo ensaios ELISA que provêm um sinal detectável, por exemplo um sinal fluorescente ou luminescente.

Culturas isoladas da invenção [0058] Como descrito em mais detalhes na seção de Exemplos da presente divulgação, requerentes constataram vários micro-organismos novos agricolamente benéficos, por exemplo, supressores eficazes da doença da fusariose de cereais. Particularmente, esses novos micro-organismos antagonistas são eficazes para redução da gravidade da fusariose de cereais e para inibição do crescimento da Fusarium graminearum, um agente causador primário da doença da fusariose de cereais no trigo. Os antagonistas microbianos foram identificados de um conjunto de aproximadamente 5.000 cepas microbianas obtidas de amostras de planta selvagem coletadas de várias localizações nos Estados Unidos. Seleção inicial do micro-organismo antagônico foi com base na capacidade dos micro-organismos suprimirem o desenvolvimento de patógeno de F. graminearum e aquele de seu Gibberella zeae teleomorfo em um ensaio de antagonismo in vitro. Antagonistas microbianos selecionados foram então bio-ensaiados em um estudo de efeito estufa em semeaduras de trigo, que envolveu a inoculação das semeaduras com as cepas microbianas, seguido por inoculações repetidas de esporos de F. graminearum, para a capacidade das cepas microbianas reduzir a gravidade de infestação por fungo e para sua capacidade de preservar o rendimento da semente. Os microorganismos antagônicos selecionados dessa maneira foram constata

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25/75 dos efetivos na redução da gravidade da fusariose de cereais em tentativas de efeito estufa.

[0059] Análise taxonômica determinou ainda que cada um dos micro-organismos antagônicos descritos na presente divulgação são proximamente relacionados ou ao gênero bacteriano Microbacterium, o gênero bacteriano Bacillus, o gênero bacteriano Variovorax, ou o gênero fúngico Mycosphaerella.

[0060] O gênero Microbacterium, o gênero de tipo da família Microbacteriaceae, é geralmente considerado para acomodar não esporo Gram-positivo formando bactérias em formato de haste que foram originalmente isoladas durante os estudos anteriores sobre bactérias produtoras de ácido lático. Membros do gênero Microbacterium são originalmente caracterizados amplamente por sua resistência ao calor notada, presença em diários, e produção de pequenas quantidades de L(+) ácido lático a partir da glicose. Ao contrário de outros gêneros da família Microbacteriaceae em que espécies são caracterizadas por um tipo de peptidoglicano coerente, espécies de Microbacterium possuem ornitina ou lisina ou em ponte de inter-peptídeo ou na posição 3 do peptidoglicano do tipo B. Em outras propriedades quimiotaxonômicas, tais quinonas isoprenoides (MK-11, MK-12, MK-13), lipídeos polares, ácidos graxos e composição base de DNA, membros do gênero exibem a faixa usual de diversidade encontrada em outros gêneros de Microbacteriaceae. Dois gêneros bacterianos Microbacterium e Aureobacterium podem ser unidos de acordo com alguns estudos de taxonomia. Até agora, membros do gênero Microbacterium compreendem pelo menos 33 espécies, que foram isoladas de uma ampla faixa de habitats, incluindo solo, produtos lácteos, galhas de planta, insetos ou especimens clínicos. Vários aspectos de sua ecologia, filogenia, taxonomia, métodos de cultura, e condições de preservação a longo prazo foram recentemente resumidos por Evtushenko e Takeuchi

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26/75 (2006). Alguém versado na técnica irá apreciar prontamente que o micro-organismo do gênero Microbacterium pode ser taxonomicamente identificado amplamente por quaisquer técnicas de identificação taxonômica descritas acima, incluindo a quimioanálise taxonômica do peptidoglicano de parede celular e análise de sequência de 16S rDNA comparativa como descrito no Evtushenko e Takeuchi (2006) e referências citadas nele, bem como naquelas descritas nos Exemplos 2-3 da presente divulgação. Como discutido em detalhes abaixo, até agora vários micro-organismos de ocorrência natural foram relatados como tendo atividade antagonista contra doença da fusariose de cereais. No entanto, não há relatos antes da presente invenção que descrevem um micro-organismo do gênero Mycobacterium tendo tal atividade antagonista. Adicionalmente, antes da presente invenção, os presentes inventores não estavam conscientes de quaisquer métodos ou processos de utilização de uma cepa bacteriana do gênero Mycobacterium como agente de biocontrole na prevenção, inibição ou tratamento do desenvolvimento de um patógeno causador da doença da fusariose de cereais.

[0061] O gênero Bacillus é um gênero de bactérias em formato de haste, formadoreas de esporo, Gram-positivas/variáveis. Similarmente a outros gêneros associados com a história anterior da microbiologia, tal como Pseudomonas ou Vibrio, aproximadamente 266 membros de espécies do gênero Bacillus são encontradas ubíquas, e isso é amplamente considerado como um dos gêneros com a maior diversidade de 16S e diversidade ambiental. Espécies de Bacillus podem ser aeróbicos obrigados ou anaeróbios facultativos, e teste positivo para a enzima catalase. Ubíquo na natureza, Bacillus inclui tanto espécies vivendo livres como patogênicos. Sob condições ambientais estressantes, as células produzem endoesporos que podem permanecer dormentes por períodos longos. Essas características originalmente defi

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27/75 niram o gênero, mas nem todas de tais espécies são intimamente relacionadas, e muitas foram removidas para outros gêneros. De fato, vários estudos tentaram reconstruir a filogenia do gênero. O estudo específico de Bacillus com a maior diversidade coberta é por Xu e Cote [Intl. J. of Syst. Evol. Microbiol. 53 (3): 695-704; 2003], utilizando 16S e a região ITS, onde eles dividem o gênero em 10 grupos, que incluem os gêneros aninhados Paenibacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Marinibacillus e Virgibacillus. No entanto, de acordo com estudos mais recentes, o gênero Bacillus contém um grande número de taxa aninhada e especialmente em ambos 16S e 23S é considerado como parafilético aos Lactobacillales (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, etc.), devido ao Bacillus coahuilensis e outros (ver, por exemplo, Yarda et al., Syst. Appl. Microbiol. 31 (4): 241-250, 2008; Yarda et al., Syst. Appl. Microbiol. 33 (6): 291-299,2010]. Um Glade particular, formado por B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis e B. weihenstephanensis sob padrões de classificação atuais, deve ser uma espécie única (dentro de 97% de identidade de 16S), mas devido a razões médicas, eles são considerados espécies separadas. Além dos métodos de análise de taxonomia descritos nos Exemplos 2-3 da presente divulgação, as análises filogenéticas e taxonômicas das espécies de Bacillus podem ser realizadas por uma variedade de técnicas, incluindo aquelas discutidas em detalhes em Xu e Cote, 2003; Yarda et al., 2008; Yarda et al., 2010.

[0062] O gênero Variovorax foi criado originalmente pela reclassificação de Alcaligenes paradoxus como Variovorax paradoxus (Willems et al., 1991), o qual é amplamente considerado como espécie do tipo desse gênero. V paradoxus foi muito estudado como um modelo para agentes de biodegradacção novos, bem como as interações de micróbio/micróbio e micróbio/planta. Outras espécies incluem V. dokdonen

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28/75 sis, V. soli (Kim et al., 2006), e V. boronicumulans (Miwa et al., 2008). Espécies Variovorax são catabolicamente muito diversas e engajam em interacoes mutualmente benéficas com outras espécies bacterianas em muitas biodegradações, e portanto possuem importância ecológica e alto potencial de aplicação. Por exemplo, um metanotrofo de solo, apenas quanto co-culturado junto com uma cepa de V. paradoxus, exibe alta afinidade para metano (um gás de efeito estufa potente), e esse traço não é normalmente observado em culturas de laboratório. Similarmente, um relativo próximo de Variovorax foi relatado ser o par central, não fotosintético dentro do consórcio fototrófico Chlorochromatium aggregatum. Algumas espécies do gênero Variovorax também tem a capacidade de interferir com a comunicação de outras bactérias. Ainda algumas outras espécies do gênero Variovorax podem interagir intimamente com outro biota (por exemplo, plantas) em vários ecossistemas. Além disso, algumas espécies de Variovorax, residentes na área apenas do lado de fora de raízes da planta e/ou dentro de uma planta, foram relatadas para serem capazes de promover crescimento da planta por meio de redução de níveis de etileno, a repressão de patogênese controla por sensibilidade de quórum, e o aumento da resistência a metais pesados que beneficia amplamente a fitoremediação. Além da análise de taxonomia métodos descritos nos Exemplos 2-3 da presente divulgação, as análises filogenéticas e taxonômicas de espécies de Variovorax podem ser realizadas por uma variedade de técnicas incluindo aquelas discutidas em detalhes em qualquer outro local aqui.

[0063] Mycosphaerella é um gênero muito grande de fungo, com mais de 2.000 nomes de espécies e pelo menos 500 espécies associadas com mais de 40 gêneros anamorfos (especialmente Cercospora, Pseudocercospora, Septoria, Rarnularia, etc.). Além disso, vários milhares anamorfos carecem telomorfos. O gênero de Mycosphaerella

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29/75 inclui espécies que são patógenos, saprobos, endófitos, ou associações mutualísticas. Vários aspectos de sua ecologia, filogenia, taxonomia, métodos de cultura, e condições de preservação a longo prazo foram recentemente relatadas (ver, por exemplo Crous et al., Persoonia, 23:119-146,2009). Alguém versado na técnica irá apreciar prontamente que o micro-organismo do gênero Mycosphaerella pode ser identificado taxonomicamente por qualquer uma das técnicas taxonômicas descritas acima, ou uma combinação das mesmas. Técnicas mais comuns incluem análises de sequência comparativas utilizando sequências de 16S rDNA e as regiões de espaçador transcritas internas como descrito no, por exemplo, Crous et al., Studies in Mycology, 55:235-253,2006; Crous et al., 2009, supra; Goodwin et al., Phytopathology 91: 648-658, 2001; e aqueles descritos nos Exemplos 2-3 da presente divulgação.

Depósito de Material Biológico [0064] Culturas purificadas de cepas microbianas identificadas como tendo atividade supressora contra doença da fusariose de cereais foram depositadas na Coleta de Cultura de Serviço de Pesquisa Agrícola (Agricultural Research Service Culture Collection) localizado a 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, EUA (NRRL) de acordo com o Tratado de Budapeste para o propósito do procedimento de patente e as regulações sob ele (Tratado de Budapeste). Números de acesso para esses depósitos são como a seguir:

SGI Cepa ID	No de acesso	Taxonomia Provisória
SGI-005-G08	NRRL__-___	Microbacterium sp.
SGI-010-H11	NRRL 50471	Mycosphaerella sp.
SGI-014-C06	NRRL B-50470	Microbacterium sp.
SGI-014-G01	NRRL B-50469	Variovorax sp.
SGI-015-F03	NRRL B-50760	Bacillus sp.
SGI-015-H06	NRRL B-50761	Bacillus sp.

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30/75 [0065] As cepas microbianas foram depositadas sob condições que garantem à cultura estar disponível durante a pendência desse pedido de patente a alguém deerminado pelo Comissionário de Patentes e Marcas Registradas a ser intitulado ali sob 37 G.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. § 122. Os depósitos representam culturas substancialmente puras das cepas depositadas. Os depósitos estão disponíveis como solicitado por leis de patente estrangeiras em países onde contrapartes do pedido de objeto ou sua progenia são depositadas. No entanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção de objeto na derrogação de direitos de patente concedidos por ação governamental.

[0066] Micro-organismos preferenciais da presente invenção têm todas as características de identificação de cepas de depósito e, em particular, as características de identificação de ser capaz de suprimir o desenvolvimento da doença da fusariose de cereais como descrito aqui, e como sendo capaz de suprimir o desenvolvimento de patógeno de Fusarium graminearum e sua Gibberella zeae teleomorfa como descrito aqui. Em particular, os micro-organismos preferenciais da presente invenção referem-se aos micro-organismos depositados como descritos acima, e mutantes dos mesmos.

Composições Microbiologicas [0067] As composições microbiológicas da presente invenção que compreendem cepas microbianas isoladas ou culturas das mesmas podem estar em uma variedade de formas, incluindo, mas não limitadas as, ainda culturas, culturas totais, estoques armazenados de células, micélio e/ou hifae (particularly estoques de glicerol), tiras de ágar, plugues de Agar armazenados em glicerol/água, estoques secos congelados, e estoques secos tais como liofilisados ou micélia secos sobre papel de filtro ou sementes de grãos. Como definido em qualquer local aqui, cultura isolada ou equivalentes gramáticos como utilizado

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31/75 nessa divulgação e na técnica é entendido significando que a referida cultura é um fluido de cultura, pellet, raspagem, amostra seca, liofilato, ou seção (for exemplo, hifae ou micélia); ou um suporte, vasilhame ou meio tal como uma placa, papel, filtro, matriz, canudo, pipeta ou ponta de pipeta, fibra, agulha, gel, cotonete, tubo, frasco, partícula, etc. que contém um tipo único de organismo. Na presente invenção, uma cultura isolada de um antagonista microbiano é um fluido de cultura ou uma raspagem, pellet, preparação seca, liofilato, ou seção do microorganismo, ou um suporte, vasilhame, ou meio que contém o microorganismo, na ausência de outros organismos.

[0068] A presente divulgação adicionalmente provê composições que contém pelo menos uma cepa microbiana isolada ou culturas da mesma da presente invenção e um veículo. O veículo pode ser qualquer ou ou mais de um número de veículos que conferem uma variedade de propriedades, tal como estabilidade elevada, molhabilidade, dispersibilidade, etc. Agentes molhantes tais como surfactantes naturais ou sintéticos, que podem ser surfactantes não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos podem ser incluídos em uma composição da invenção. Emulsões de água em óleo também podem ser utilizadas para formular uma composição que inclui pelo menos um micro-organismo isolado da presente invenção (ver, por exemplo, Patente No. U.S. 7,485,451, incorporada por referência aqui). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou pellets, espessantes, e outros, patículas microencapsuladas e outros, líquidos tais como fluidos aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir produtos de grão ou legume (por exemplo, grão de chão ou feijões, caldo ou farinha derivada de grão ou feijões), amido, açúcar ou óleo. O veículo pode ser um veículo agrícola. Em certas modalidades preferenciais, o veículo é uma semente, e a composição pode ser

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32/75 aplicada ou revestida sobre a semente ou permitida saturar a semente. [0069] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser solo ou meio de crescimento de planta. Outros veículos agrícolas que podem ser utilizados incluem água, fertilizantes, óleos a base de planta, umectantes, ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, tal como uma terra diatomácea, marga, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculite, casos de semente, outros produtos de planta e animal, ou combinações, incluindo grânulos, pellets, ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes mencionados anteriormente são também contempladas como veículos, tal como mas não limitado a, pesta (farinha e argila caolina), ágar ou pellets a base de farinha em marga, areia, ou argila, etc. Formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos culturados, tal como cevada, arroz ou outros materiais biológicos taus como semente, partes da planta, bagaço da cana de açúcar, cascas ou talos do processamento de grão, material de planta rasteira (por exemplo, resíduos de jardim) ou refugo de madeira de local de contrução, serragem de fibras pequenas de reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas daqueles versados na técnica.

[0070] Na forma líquida, por exemplo soluções ou suspensões, os micro-organismos podem ser misturados ou resuspensos em água ou em soluções aquosas. Diluentes líquidos adequados ou veículos incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros veículos líquidos.

[0071] Composições sólidas podem ser prepapradas por dispersão de micro-organismos anatgonistas em e sobre um veículo sólido dividido apropriadamente, tal como turfa, trigo, farelo, vermiculite, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de fuller, solo pasteurizado, e outros. Quando tais formulações são utilizadas como pós molháveis,

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33/75 agentes de dispersão biologicamente compatíveis tais como agenets não iônicos, aniônicos, anfotéricos, ou de dispersão catiônica e emulsificantes podem ser utilizados.

[0072] Em uma modalidade preferencial, as composições contempladas aqui podem evitar ataque por doença da fusariose de cereais em plantas, particularmente plantas de cereal, tal como trigo, cevada, aveia, e milho e, quando utilizadas em quantias sufientes, para agir como antagonistas microbianos. Essas composições, similarmente a outros agentes de biocontrole, têm uma margem alta de segurança porque eles normalmente não queimam ou machucam a planta.

[0073] Como descrito em mais detalhes ao longo da presente divulgação, controle da doença de fusariose de cereais pode ser efetuado pela aplicação de uma ou mais composições microbiológicas da presente invenção para uma planta hospedeira ou partes da planta hospedeira. As composições podem ser aplicadas em uma quantia efetica para reduzir o nível de fusariose de cereais em relação aquele em um controle não tratado. Os contituintes ativos são utilizados em uma concentração suficiente para inibir desenvolvimento de patógeno de planta do patógeno de planta direcionado quando aplicado a uma planta de cereal. Como será aparente a uma pessoa versada na técnica, concentrações eficazes podem varias dependendo de fatores como: (a) o tipo de planta ou produto agrícola; (b) a condição fisiológica da planta ou produto agrícola; (c) a concentração de patógenos afetando a planta ou produto agrícola; (d) o tipo de lesão de doença sobre a planta ou produto agrícola; (e) condições do tempo (por exemplo temperatura, umidade); e (f) o estágio da doença da planta. De acordo com a invenção, concentrações típicas são aquelas mais altas que 1 X 10² CFU/mL do veículo. Faixa de concentrações preferenciais de cerca de 1 X 104 a cerca de 1 x 109 CFU/mL, tal como as concentrações variando de 1 X 106 a 1 X 108 CFU/mL. Concentrações mais preferenciPetição 870190046231, de 17/05/2019, pág. 38/90

34/75 ais são aquelas de cerca de 35 a cerca de 150 mg de massa microbiana seca por grama de veículo (formulação seca) ou por milímetro de veículo (composição líquida). Em formulações sólidas, a taxa de aplicação deve ser controlada para resultar em um número comparável de células viáveis por área de unidade da superfície de tecido da planta como obtido pelas taxas mencionadas anterioremente de tratamento líquido. Normalmente, os agentes de controle biológico da presente invenção são biologicamente eficazes quando entregues em uma concentração em excesso de 106 CFU/g (colônia formando unidades por grama), preferencialmente em excesso de 10⁷ CFU/g, mais preferencialmente 108 CFU/g, e mais preferencialmente a 109 CFU/g.

[0074] Em algumas modalidades, a quantidade e um ou mais dos agentes de controle biológico nas composições microbianas da presente invenção pode variar dependendo da formulação final bem como tamanho ou tipo de planta ou semente utilizado. Preferencialmente, o um ou mais agentes de controle biológico nas composições microbianas estão presentes em cerca de 2% p/p/ a cerca de 80% p/p de toda a formulação. Mais preferencialmente, o um ou mais agentes de controle biológico empregados nas composições é cerca de 5% p/p a cerca de 65% p/p e mais preferencialmente cerca de 10% p/p a cerca de 60% p/p em peso de toda a formulação.

[0075] Como será apreciado por aqueles versados na técnica, as composições microbiológicas da invenção podem ser aplicadas a planta do trigo ou outros cereais utilizando uma variedade de métodos convencionais tal como sova, revestimento, injeção, fricção, rolamento, imersão, pulverização, ou escovamento, ou qualquer outra técnica apropriada que não lese significativamente a planta de trigo ou outros cereais a serem tratados. É particularmente preferencial o método de pulverizar.

[0076] Normalmente, as composições da invenção são quimica

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35/75 mente inertes; consequentemente elas são compatíveis com substancialemnte quaisquer outros constituintes da programação de pulverização. Elas também podem ser utilizadas em combinação com agentes ativos pesticidas biologicamente compatíveis como por exemplo, herbicidas, nematicidas, fungicidas, insecticidas, e outros. Ele podem ser utilizados também em combinação com substâncias afetas ao crescimento de planta, tais como fertilizantes, reguladores de crescimento de planta e outros, desde que tais compostos ou substâncias sejam biologicamente compatíveis.

[0077] Quando utilizados como pesticidas ou fungicidas em suas formulações comercialmente disponíveis e nas formas de uso, preparadas dessas formulações formulations, os antagonistas microbianos ativos e composições de acordo com a presente invenção podem ainda estar presentes na forma de uma mistura com sinergistas. Sinergistas são compostos pelos quais a atividade das composições ativas é aumentada sem esta ser necessária para o sinergista adicionado para ser ele próprio ativo.

[0078] Quando utilizados como pesticidas em suas formulações comercialmente disponíveis e nas formas de uso, preparadas dessas formulações, os antagonistas microbianos ativos e composições de acordo com a invenção podem adicionalmente estar presente na forma de uma mistura com inibidores que reduzem a degradação de composições de ativo após aplicação no habitat da planta, na superfície das partes de plantas ou em tecidos de plantas.

[0079] Os antagonistas microbianos ativos e composições de acordo com a invenção, como tal ou em suas formulações, também podem ser utilizados como uma mistura com acaricidas conhecidos, bactericidas, fungicidas, inseticidas, microbicidas, nematicidas, pesticidas, ou combinações dos mesmos, por exemplo para ampliar o espectro de ação ou para evitar o desenvolvimento de resistências nesse

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36/75 sentido. Em muitos casos, efeitos sinergisticos resultam, isto é a atividade da mistura pode exceder a atividade os componentes individuais. Uma mistura com outros compostos ativos conhecidos, tal como fertilizantes, reguladores de crescimento, protetores e/ou semioquímicos também é contemplada.

[0080] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as composições podem incluir ainda pelo menos um pesticida químico ou biológico. A quantidade de pelo menos um pesticida químico ou biológico empregada nas composições pode variar dependendo da formulação final bem como o tamanho da planta e semente a ser tratada. Preferencialmente, o pelo menos um pesticida químico ou biológico empregado é cerca de 0.1% p/p a cerca de 80% p/p com base em toda a formulação. Mais preferencialmente, o pelo menos um pesticida químico ou biológico está presente em uma quantia de cerca de 1% p/p a cerca de 60% p/p e mais preferencialmente cerca de 10% p/p a cerca de 50% p/p.

[0081] Uma variedade de pesticidas é aparente para alguém versado na técnica e pode ser utilizada. Pesticidas químicos exemplares incluem aqueles na classe do carbamato, organofosfato, organoclorina, e pretroide. Também estão incluídos agentes de controle químico tais como, mas não limitados a, benomil, borax, captafol, captano, chorotalonil, formulações contendo cobre; formulações contendo diclono, dicloran, iodina, zinco; fungicidas que inibem biossíntese de ergosterol tal como mas não limitada a blastididina, cimoxanil, fenarimol, flusilazol, folpet, imazalil, ipordiona, maneb, manocozeb, metalaxil, oxicarboxina, miclobutanil, oxitetraciclina, PCNB, pentaclorofenol, procloraz, propiconazol, quinometionato, aresenito de sódio, DNOC de sódio, hipoclorito de sódio, fenilfenato de sódio, estreptomicina, enxofre, tebuconazol, terbutrazol, tiabendazolel, tiofanato-metil, triadimefon, triciclazol, triforina, validimicina, vinclozolin, zineb, e ziram. Uma variedade

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37/75 de compostos inseticidas pode ser útil para as composições da invenção, incluindo mas não limitados àqueles citados no Ped. De Pat. No. US 20110033432A1.

[0082] As composições microbiológicas da presente invenção incluem preferencialmente pelo menos um pesticida biológico. Pesticidas biológicos exemplares que são adequados para uso aqui e podem ser incluídos em uma composição microbiológica de acordo com a presente invenção para evitar doença patogênica de planta inclui micróbios, animais, bactérias, fungos, material genético, planta, e produtos naturais de organismos vivos. Nessas composições, o microorganismo da presente invenção é isolado antes da formulação com um organismo adicional. Por exemplo, micróbios tal como mas não limitado às espécies de Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces, e Trichoderma podem ser providos em uma composição com os micro-organismos antagônicos da presente invenção, com cepas fungais do gênero Muscodor sendo particularmente preferenciais. Uso das composições microbiológicas de acordo com a presente invenção em combinação com os antagonistas microbianos divulgados na Patente No. US 7,518.040; Patente No. US 7,601.346; Patente No. US 6.312,,940 é também particularmente preferencial.

[0083] Exemplos de fungos que podem ser combinados com antagonistas microbianos e composições da presente invenção em uma composição incluem, sem limitação, Muscodor species, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana (white muscarine), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps facts, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cor

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38/75 dyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutellae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae (muscarina verde), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, e espécies de microrrhizal tal como Laccaria bicolor. Outras espécies de micropesticida serão aparentes daqueles versados na técnica.

[0084] A presente invenção também provê métodos de tratamento de uma planta por aplicação de qualquer variedade de formulações costumeiras en uma quantidade eficaz ou para o solo (isto é, emsulco), uma porção da planta (isto é, rega) ou sobre a semente antes do plantio (isto é., revestimento ou vestimento da semente). Formulações costumeiras incluem soluções, concentrado emulsificavel, pós molháveis, concentrado de suspensão, pós solúveis, grânulos, concentrado de emulsão de suspensão, materiais naturais e sintéticos impregnados com composto ativo, e cápsulas de liberação de ocntrole muito finas em substâncias poliméricas. Em certas modalidades da presente invenção, as composições de controle biológico são formuladas em pós que são disponíveis ou uma formulação pronta pra uso ou são misturadas juntas no momento do uso. Em outra modalidade, o pó pode ser admisturado com o solo antes de ou no momento do plantio. Em uma modalidade alternativa, um ou ambos do agente de controle biológico ou agente de controle de inseto é uma formulação líquida que é misturada junto no momento do tratamento. Alguém versado ordinariamente na técnica entende que uma quantidade eficaz das com

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39/75 posições inventivas depende da formulação final de uma composição bem como o tamanho da planta ou o tamanho da semente a ser tratada.

[0085] Dependendo da formulação final e método de aplicação, um ou mais aditivos adequados também podem ser introduzidos para as composições da presente invenção. Adesivos tais como carboximetilcelulose e polímeros naturais e sintéticos na forma de pós, grânulos ou latexes, tal como goma arábica, quitina, álcool polivinílico e acetato de polivinil, bem como fosfolipídeos naturais, tal como cefalinas e lecitinas, e fosfolipídeos sintéticos podem ser adicionados ãs composições presentes.

[0086] Em uma modalidade preferencial, as composições microbiológicas são formuladas em uma solução estável única, ou emulsão ou suspensão. Para soluções, os compostos químicos ativos (isto é, os agentes de controle de peste) são normalmente dissolvidos em solventes antes do agente de controle biológico ser adicionado. Solventes líquidos adequados incluem aromáticos a base de petróleo, tal como xileno, tolueno ou alquinaftalenos, hidrocarbonetos alifáticos, tais como ciclohexano ou parafinas, por exemplo frações de petróleo, óleos minerais e vegetais, alcoóis, tal como butanol ou glicol bem como seus éteres e ésteres, cetonas,tal como metil etil cetona, metil isobutil cetona ou ciclohexanona, solventes fortemente polares, tal como dimetilformamida e dimetil sulfóxido. Para emulsão e suspensão, o meio líquido é água. Em uma modalidade, o agente de controle químico e agente de controle biológico são suspensos em líquidos separados e misturados no momento da aplicação. Em uma modalidade preferencial de suspensão, o agente de controle de inseto e biológico são combinados em uma formulação pronta para uso que exibe uma vida útil de pelo menos dois anos. Em uso, o líquido pode ser pulverizado ou pode ser aplicados foliarmente como um spray atomizado ou em

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40/75 sulco no momento do plantio da cultura. A composição liquida pode ser introduzida para o solo antes da germinação da semente ou diretamente ao solo em contato com as raízes utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a, irrigação por gotejamento, borrifador, injeção de solo ou encharque de solador.

[0087] Opcionalmente, estabilizantes e tampões podem ser adicionados, incluindo sais alcalinos e de metais terrosos alcalinos e ácidos orgânicos, tal como ácido cítrico e ácido ascórbico, ácidos inorgânicos, tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Biocidas também podem ser adicinados e podem incluir formaldeídos ou agentes de liberação de formaldeídos e derivados de ácido benzoico, tal como ácido phidroxibenzoico.

Formulações de revestimento de semente [0088] Em algumas modalidades particularmente preferenciais, as composições de biocontrole da presente invenção são formuladas como um tratamento de semente. O tratamento de semente compreende preferencialmente pelo menos um agente de controle de inseto e pelo menos um agente de controle biológico. Contempla-se que as sementes podem ser substancialmente uniformamente revestidas com uma ou mais camadas das composições de biocontrole divulgadas aqui utilizando métodos convencionais de mistura, pulverização ou uma combinação dos mesmos através do uso de equipamento de aplicação de tratamento que é especificamente projetada e fabricada para aplicar precisamente, seguramente e eficientemente prodiutos de tratamento de semente para sementesz. Tal equipamento utiliza vários tipos de tecnologoa de revestimento tais como revestidores rotativos, revestidores cilíndricos, técnicas de núcleo fluidizado, núcleos de jorro, mistos rotativos ou uma combinação dos mesmos. Tratamentos de semente líquida tal como aqueles da presente invenção podem ser aplicados

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41/75 por meio ou de um disco “atomizador” de fiação ou um bocal de spray que distribui uniformemente o tratamento de semente sobre a semente a medida que ela se move através do modelo de spray. Preferencialmente, a semente é então misturada ou tombada durante um período adicional de tempo para atingir distribuição de tratamento adicional e secagem. As sementes podem ser preparadas ou não preparadas antes de revestir com as composições inventivas para aumentar a uniformidade de germinação e emergência. Em uma modalidade alternativa, uma formulação de pó seco pode ser medida sobre a semente movente e permitida misturar até que completamente distribuída.

[0089] Outro aspecto da invenção providê sementes tratadas com as composições microbiológicas de objeto. Uma modalidade provê sementes tendo pelo menos parte da área de superfície revestida com uma composição microbiológica de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade específica, as sementes tratadas por microorganismo têm uma concentração de esporo ou concentração de célula microbiana de cerca de 106 a cerca de 10⁹ por semente. As sementes também podem ter mais esporos ou células microbianas por semente, tal como, por exemplo 10¹⁰, 1 0¹¹ ou 10¹² esporos por semente. Os esporos microbianos e/ou células podem ser livremente revestidos sobre as sementes ou, preferencialmente, eles podem ser formulados em uma composição líquida ou sólida antes de ser revestida sobre as sementes. Por exemplo, uma composição sólida compreendendo os micro-organismos pode ser preparada misturando um veículo sólido com uma suspensão dos esporos até que os veículos sólidos sejam impregnados com a suspensão de esporo ou celular. Essa mistura podem então ser seca para obter as partículas desejadas.

[0090] Em algumas outras modalidades, contempla-se que as composições de biocontrole sólidas ou líquidas da presente invenção contêm adicionalmente agentes funcionais capazes de proteger se

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42/75 mentes de efeitos prejudiciais dos herbicidas seletivos tal como carbono ativado, nutrientes (fertilizantes), e outros agentes capazes de melhorar a germinação e qualidade dos produtos ou uma combinação dos mesmos.

[0091] Métodos de revestimento de semente e composições que são conhecidos na técnica podem ser particularmente úteis quando eles são modificados pela adição de uma das modalidades da presente invenção. Tais métodos de revestimentos e aparelhos para sua aplicação são divulgados em, por exemplo, Pat. Nos. US 5,918,413; 5,554,445; 5.389.399; 4,759,945; e 4,465.017. Várias composições de revestimento de semente são divulgadas, por exemplo, em Ped. De Pat. Appl. Nos. US20110033432, US20100154299, U.S. Pat. Nos. 5,939.356; 5,876,739, 5,849.320; 5,791.084, 5,661.103; 5,580,544,

5.328,942; 4,735.015; 4,634,587; 4.372.080, 4.339,456; e 4.245,432, dentre outros.

[0092] Uma variedade de aditivos pode ser adicionada às formulações de tratamento de semente compreendendo as composições inventivas. Ligantes podem ser adicionados e incluem aqueles preferencialmente compostos de um polímero de adesivo que pode ser natural ou sintético sem efeito fitotóxico sobre a semente a ser revestida. O ligante pode ser selecionado de acetatos de polivinil; copolímeros de acetatos de polivinil; copolímeros de acetato de vinil etileno (EVA); alcoóis polivinílicos; copolímeros de álcool polivinílico; celuloses, incluindo etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilcelulose; polivinilpirrolidonas; polissacarídeos, inlcuindo amido, amido modificado, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas; gorduras; óleos; proteínas, inlcuindo gelatina e zeínas; goma arábica; goma laca; cloreto de vinilideno e copolímeros de cloreto de vinilideno; lignosulfonatos de cálcio; copolímeros de acrílico; polivinilacrilatos; óxido polietileno; polímeros de acrilamida e copolímeros;

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43/75 polihidroxietil acrilato, monômeros de metilacrilamida; e policloropreno. [0093] Qualquer uma de uma variedade de corantes pode ser empregada, incluindo cromóforos orgânicos classificados como nitroso; nitro; azo, incluindo monoazo, bisazo e poliazo; acridina, antraquinona, azina, difenilmetano, indamina, indofenol, metina, oxazina, fthalocianina, tiazina, tiazol, triarilmetano, xanteno. Outros aditivos que podem ser adicionados incluem nutrientes de traço tais como sais de ferro, manganês, boro, cobre, cobalto, molibdênio e zinco. Um polímero ou outro agente de controle de poeira pode ser aplicado para reter o tratamento sobre a superfície da semente.

[0094] Em algumas modalidades específicas, além das células microbianas ou esporos, o revestimento pode compreender adicionalmente uma camada de aderente. O aderente deve ser um não tóxico, biodegradável e adesivo. Exemplos de tais materiais incluem, mas não são limitados a, acetatos de polivinil; copolímeros de acetato de polivinil; alcoóis polivinílicos; copolímeros alcoóis polivinílicos; celuloses, tais como metil celuloses, hidroximetil celuloses, e hidroximetil propil celuloses; dextrinas; alginatos; açúcares; melaço; polivinil pirrolidonas; polissacarídeos; proteínas; gorduras; óleos; goma arábica; gelatinas; xaropes e amidos. Mais exemplos podem ser encontrados em, por exemplo, Pat. No. U.S,7.213.367 e Ped. De Pat. No. US20100189693.

[0095] Vários aditivos, tais como aderentes, dispersantes, surfactantes, e nutriente e ingredientes de tampão, também podem ser incluídos na formulação de tratamento de semente. Outros aditivos de tratamento de semente convencionais incluem, mas não estão limitados a, agentes molhantes, agentes de tamponamento e polissacarídeos. Pelo menos um veículo agricolamente aceitável pode ser adicionado à formulação de tratamento de semente tal como água, sólidos ou pós secos. Os pós secos podem ser derivados de uma variedade de materiais tal como carbonato de cálcio, gipsita, vermiculite, talco, humus,

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44/75 carvão ativado e vários compostos fosforosos.

[0096] Em alguma modalidade, a composição de revestimento de semente pode compreender pelo menos um preenchedor que é um componente natural ou sintético, orgânico ou inorgânico com o qual os componentes ativos são combinados para facilitar sua aplicação sobre a semente. Preferencialmente, o preenchedor e um sólido inerte tal como argolas, silicatos naturais ou sintéticos, sílica, resinas, ceras, fertilizantes sólidos (por exemplo sais de amônia), minerais de solo natural, tal como caolinas, argilas, talco, cal, quartzo, atapulgita, montmorilonita, bentonita ou terras diatomáceas, ou minerais sintéticos, tal como sílica, alumina ou silicatos, em particular alumínio ou silicatos de magnésio.

[0097] A formulação de tratamento de semente pode incluir ainda um ou mais dos seguintes ingredientes: outros pesticidas, incluindos compostos que agem apenas abaixo do chão; fungicidas, tal como captano, tiram, metalaxil, fludioxonil, oxadixil, e isômeros de cada um daqueles materiais, e outros; herbicidas, incluindo compostos selecionados de glifosateo, carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas, triazinas, dinitroanilinas, glicerol etéres, piridazinonas, uracils, fenóxis, ureias, e ácidos benzoicos; protetores herbicidas tais como benzoxazina, derivados de benzhidril, N,N-dialil dicloroacetamida, vários compostos de dihaloacil, oxazolidinil e tiazolidinil, etanona, compostos de anidridos naftálicos, e derivados de oxima; fertilizantes; e agentes de biocontrole tal como outras bactérias recombinantes ou de ocorrência natural e fungos dos gêneros Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium e fungo micorrhizal. Esses ingredientes podem ser adicionados como uma camada separada sobre a semente ou alternativamente podem ser adicionados como parte da composição da invenção de revestimento de semente.

[0098] Preferencialmente, a quantidade da nova composição ou

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45/75 outros ingredientes utilizada no tratamento de semente não deve inibir germinação da semente; ou provocar dano fitotóxico à semente.

[0099] As sementes tratadas com micro-organismo também podem ser adicionalmente envelopadas com um sobrerevestimento de filme para proteger o revestimento. Tais sobre revestimentos são conhecidos na técnica e podem ser aplicados utilizando núcleo fluidizado e técnicas de revestimento de filme cilíndrico.

[00100] Em princípio, qualquer semente de planta capaz de germinar para formar uma planta que é suscetível a ataque por nematodos e/ou fungo patogênico pode ser tratada de acordo com a invenção. Sementes adequadas incluem aquelas de cereais, café, culturas de cole, culturas de fibra, flores, frutas, legumes, culturas de óleo, árvores, culturas de tubérculos, vegetais, bem como outras plantas de monocotiledoneas,e espécies de dicotiledoneas. Preferencialmente, sementes de culturas são revestidas o que inclui, mas não está limitado a feijão, cenoura, milho, algodão, gramíneas, alface, amendoim, pimenta, batata, colza, arroz, centeio, sorgo, grão de soja, beterrada de sacarina, girassol, tabaco, e sementes de tomate. Mais preferencialmente, sementes de cevada ou trigo (trigo primaveril ou trigo de inverno) são revestidas com as composições presentes.

[00101] Também é provido, em outro aspecto da presente invenção, uma nova planta de cereal criada pela introdução artificial de um endófito microbiano da invenção dentro de uma planta de cereal que é livre de micro-organismos endofíticos. Em algumas modalidades deste aspecto, o endófito microbiano introduzido dentro da planta de cereal pode ser um antagonista endofítico tendo atividade supressora contra doença da fusariose de cereais ou um agente causador de doença da fusariose de cereais. Além disso, o antagonista endofítico introduzido dentro da planta cereal pode ser uma cepa de fungo SGI-010-H11. Uma variedade de métodos anteriormente encontrada eficaz para a

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46/75 introdução de uma espécie de gramínia cereal é conhecida na técnica. Exemplos de tais métodos incluem aqueles descritos no Ped. De Pat. No. US 20030195117A1, Ped. De Pat. No. US 20010032343A1, e Pat. No. U.S,7.084.331, dentre outros. Se tornará evidente para aqueles versados na técnica que muitos dos métodos mencionados anterioremnte podem ser úteis para fazer uma nova planta de cereal da invenção.

[00102] Após infecção artificial, é preferencial que DNA do antagonista endofítico isolado seja ampliado por PCR e o antagonista seja confirmado executando pesquisa de homologia para o DNA ampliado. Adicionalmente é preferencial que um gene estranho que expresse um meio identificável seja introduzido dentro do antagonista endofítico mencionado acima, e a presença da colonização do antagonista endofítico mencionado acima infectando a planta seja confirmado pelos meiosidentificáveis acima utilizando o gene estranho

Preparando as composições de biocontrole de acordo com a presente invenção [00103] Culturas dos antagonistas microbianos podem ser preparadas para uso nas composições de biocontrole da invenção utilizando técnicas de fermentação líquida e secagem estática padrão conhecidas na técnica. Crescimento é comumente efetuado em um biorreator. [00104] Um biorreator refere-se a qualquer dispositivo ou sistema que suporta um ambiente biologicamente ativo. Como descrito aqui um biorreator é um frasco em que micro-organismos incluindo os antagonistas microbianos da invenção podem ser cultivados. Um biorreator pode ser qualquer formato adequado ou tamanho para cultivo dos micro-organismos. Um biorreator pode variar em tamanho e escala de 10 mL para litros a metros cúbicos e pode ser feito de aço inoxidável ou qualquer outro material adequado como conhecido e utilizado na técnica. O biorreator pode ser um biorreator do tipo lote, o tipo lote de

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47/75 alimentação ou um biorreator do tipo contínuo (por exemplo, um reator agitado contínuo). Por exemplo, um biorreator pode ser um quimiostato como conhecido e utilizado na técnica de microbiologia para cultivo e colheita da bactéria. Um biorreator pode ser obtido de qualquer fornecedor comercial (ver também Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995).

[00105] Para operações de pequena escala, um biorreator de lote pode ser utilizado, por exemplo, para testar e desenvolver novos processos, e para processos que não podem ser convertidos para operações contínuas.

[00106] Micro-organismos cultivados em um biorreator podem ser suspensos ou imobilizaods. Cultivo no biorreator é geralmente sob condições aeróbicas em temperaturas adequadas e pH para crescimento. Para os organismos da invenção, crescimento celular pode ser atingido em temperaturas entre 5 e 37°C, com a temperatura preferencial estando na faixa de 15 a 30°C, 15 a 28°C, 20 a 30°C, ou 15 a 25°C. O pH do meio de nutriente pode variar entre 4.0 e 9.0, mas a faixa de operação preferencial é normalmente levemente ácida para neutra a pH 4.0 a 7.0, ou 4,5 a 6,5, ou pH 5.0 a 6.0. Normalmente, rendimento de célula máximo é obtido em 20-72 horas após inoculação.

[00107] Condições ótimas para o cultivo de antagonistas dessa invenção irão, evidentemente, depender da cepa particular. No entanto, em virtude das condições aplicadas no processo de seleção e exigências gerais da maioria dos micro-organismos, uma pessoa ordinariamente versada na técnica seria capaz de determinar nutrientes essenciais e condições. Os antagonistas microbianos seriam normalmente cultibado em culturas de líquido aeróbicos em meio que contém fontes de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos que podem ser assimilados pelo micro-organismo e suportador de crescimento celular eficiente. Fontes de carbono preferenciais são hexoses tal como glicose, mas

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48/75 outras fontes que são prontamente assimiladas tais como aminoácidos, podem ser substituídas. Muitos materiais inorgânicos ou proteicos podem ser utilizados como fontes de nitrogênio no processo de crescimento. Fontes de nitrogênio preferenciais são aminoácidos e uréia, mas outras incluem amônia gasosa, sais inorgânicos de nitrato e amônio, vitaminas, purinas, pirimidinas, extrato de levedura, extrato de bife, proteose peptona, farelo de soja, hidrolisatos de caseína, solúveis de destiladores, e outros. Dentre os materiais inorgânicos que podem ser incorporados dentro do meio de nutriente são os sais costumeiros capazes de render cálcio, zinco, ferro, manganês, magnésio, cobre, cobalto, potássio, sódio, molibdato, fosfato, sulfato, cloreto, borato, e íons semelhantes. Sem ser limitado a eles, o uso de meio líquido de dextrose de batata para antagonistas fúngicos e pré-mistura de caldo de R2A para cepas bacterianas é preferencial.

[00108] Em toda a divulgação, várias fontes de informação são referidas como e incorporadas por referência. As fontes de informação incluem, por exemplo, artigos científicos de jornais, documentos de patente, livros texto e endereços de páginas inativas da internet (World Wide Web browser-inactive page addresses). A referência para tais fontes de informação é unicamente para fins de prover uma indicação do estado geral da técnica no momento do depósito. Embora os conteúdos e ensinamentos de cada um de todoas as fontes de informações possa ser apoiados e utilizados por alguém versado na técnica para fazer e utilizar modalidades da invenção, qualquer discussão e comentário em uma fonte de informação específica deve de modo algum ser considerada como uma admissão de que tal comentário foi amplamente aceito como opinião geral no campo.

[00109] A discussão dos métodos gerais dados aqui é destinada apenas para fins ilustrativos. Outros métodos e modalidades alternativos serao evidentes para aquel;es versados na técnica mediante revi

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49/75 são dessa divulgação, e são para ser incluídos dentro do espírito e alcance desse pedido.

[00110] Deve ser entendido que os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: descoberta dos micro-organismos antagônicos capazes de suprimir o desenvolvimento de Fusarium graminaerum e Gibberella zeae, agentes causadores da doença fusariose de cereais.

[00111] Este exemplo descreve um processo de alto rendimento de coleta e triagem de micro-organismos candidatos que foram desenvolvidos internamente na Synthetic Genomics, Inc. para isolar cepar dos micro-organismos tendo atividade supressora contra agentes causadores da doença da fusariose de cereais, particularmente contra Fusarium graminearum. Novas cepas de antagonistas microbianos foram isoladas das amostras de tecidos da planta coletadas de várias localizações através dos Estados Unidos. As cepas bacterianas SGI-014C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03, e SGI-015-H06 foram isoladas dos tecidos radiculares da planta coletado de Eagle Peak Preserve próximo a Julian, CA. A cepa fúngica SGI-010-H11 e a cepa bacteriana SGI-005-G08 foram isoladas dos tecidos do caule de duas plantas diferentes coletadas de San Elijo Lagoon, Encinitas, CA.

[00112] Os micro-organismos foram isolados como a seguir. Para isolamento de cepa bacteriana, tecidos radiculares de planta foram sonicados e sujeitos à diluições em série sobre 2xYT (extrato de levedura e triptona) e placas de meio de Agar livre de N. Colônias individuais foram então selecionadas sobre características morfológicas, e cultivadas individualmente em meio de caldo líquido. Para isolamento fúngico tecido de planta foi esterilizado na primeira superfície mergulhando em 70% de etanol e passando brevemente através de uma chama. O tecido foi então dissecado e colocado em meio de Agar de

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50/75 dextrose de batata (PDA), seguido por incubação em temperatura ambiente. Quando crescimento micelial foi observado, um segmento de crescimento micelial foi então transferido para outra placa de PDA. Cepas de micro-organismos foram isoladas, purificadas e preservadas em -80°C em 15% de glicerol em para cepas bacterianas e sobre semente de cevada seca para cepas fúngicas.

[00113] Cepas de micro-organismos isoladas como descritas acima foram portanto ensaiadas para sua capacidade de suprimir crescimento micelial de F. graminearum em um teste de antagonismo in vitro, o qual foi realizado em placas de Agar contendo meido de crescimento de Agar de dextrose e batata (PDA) de acordo com um procedimento de triagem de alto rendimento descrito no Ped. De Pat U.S. No. US20120107915A1, que é incorporado por referência aqui, com pequenas modificações. Resumidamente, cepas isoladas de microorganismos foram cultivadas em Agar de caldo de soja Triptico de for;a de um quinto (TSBA/5) durante 24 horas antes do uso. Inóculo Conidial de F. graminearum NRRL-5883 foi produzido por tipificação hifal de uma colônia de cultivo ativamente sobre fungos e transferindo os filamentos hifal para o meio Agar PDA. Após incubar as placas durante 7 dias a 25^°C utilizando um fotoperíodo de 12 h/dia, conidias foram lavadas de placas PDA utilizando um tampão de fosfato fraco (0.004% de tampão fosfato, pH 7.2, com 0.019% MgCb). Uma suspensão de conídia de F. graminearum no tampão fosfato fraco (1 ^x 10⁵ conidia/ml) foi então espalhada imediatamente sobre uma superfície de ágar, e as placas foram então incubadas a 25^°C durante 4872 horas. Para iniciar o teste de antagonismo, células de cepas microbianas isoladas foram inoculadas por ponto em distâncias iguais dentro do perímetro da placa. Após cinco dias as cepas foram pontuadas como antibiose positiva quando uma área visivelmente clara que careceu de crescimento micelial existiu ao redor do perímetro de colônias microbianas.

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51/75 [00114] Mais de 4.000 cepas microbianas foram isoladas e ensaiadas pelo proceidmento descrito acima. Daquelas, seis cepas foram encontradas para suprimir significativamente o crescimento de micélio de F. graminearum NRRL-5883 em meio de PDA. Esses novos antagonistas são identificados como SGI-005-G08, SGI-010-H11, SGI-014C06, SGI-014-G01, SGI-015-F03, e SGI-015-H06.

[00115] Teste de antagonismo foi realizado também para os novos antagonistas microbianos para sua capacidade de suprimir o crescimento de patógeno fungal Gibberella zeae, que é uma espécie teleomórfica de Fusarium graminearum. Todos os procedimentos foram idênticos àqueles descritos acima, exceto pelo fato de que a cepa de patógeno testada neste ensaio foi uma cepa patogênica do fungo Gibberella zeae. Desses seis antagonistas microbianos, quatro cepas SGI-010-H11, SGI-014-C06, SGI-015-F03, e SGI-015-H06 foram encontradas para suprimir significativamente o crescimento micelial de Gibberella zeae.

EXEMPLO 2: Extração de DNA, Sequenciamento e Taxonomia [00116] Lise de célula fungal e Aquisição de Informações de sequência de ITS-5,8S rDNA [00117] A biomassa fúngica foi transferida para uma microplaca de 96 poços de PCR contendo 50 pl de um tampão de 2 x lise (100 mM de Tris HCL, pH 8.0, 2 mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS, 400 pg/ml Proteinase K). condições de lise foram como a seguir: 55°C durante 60 minutos, 94°C durante 4 minutos. Uma alíquota do produto de lise foi utilizada como a fonte de DNA de modelo para ampliação de PCR. A sequência de ITS-5,8S rDNA foi ampliada por meio de PCR utilizando dois iniciadores M13-ITS1 (SEQ ID NO: 15) e com cauda ITS4 M13 (SEQ ID NO: 16).

[00118] Para a amplificação da região ITS-5,8S rDNA, cada mistura PCR foi preparada em uma reação de volume final de 20-pl contendo

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52/75 μΙ a partir da reação de lise fúngica, 0.2 μΜ de cada iniciador (ITS1/ITS4), 6% Tween-20, e 10 μl de 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Condições de PCR foram como segue: 94°C por 10 minutos; 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos, 72°C por 75 segundos durante 30 ciclos; 72°C por 10 minutos. Uma 2-μΙ alíquota do produto de PCR foi corrida num gel de agarose a 1,0% para confirmar uma única banda do tamanho esperado. Bandas positivas foram enviadas para sequenciamento Sanger nas direções em sentido para frente e reversa usando iniciadores M13. Sequência da região intergênica 5,8S (ITS) da cepa fúngica SGI-010-H11 é provida na Listagem de Sequência como SEQ ID NO: 11. Pesquisa de homologia para a sequência de nucleotídeos determinada da região intergênica 5,8S (ITS) foi conduzida utilizando o bando de dados de DDBJ/GenBank/EMBL. Subsequentemente, a relação filogenética da sequência de nucleotídeos da região intergênica 5,8S (ITS) foi analisada entre o antagonista fúngico isolado SGI-010-H11 descrito aqui, micro-organismos dos gêneros e espécies que apresentam altas homologias de sequência com o antagonista fúngico isolado SGI-010H11, e outras amplas variedades de gêneros e espécies de microrganismo, usando o programa de construção de árvore filogenética ClustalW. A cepa fúngica SGI-010-H11 é considerada estar relacionada com a família de Mycosphaerellaceae com base em —97% de similaridade de sua sequência de ITS-5,8S rDNA àquelas de Mycosphaerella punctiformis (GenBank EU343182) e Ramularia pratensis (GenBank EU019284), cujas sequências de 5,8S ITS mostram parentesco claro para Mycosphaerellaceae.

[00119] Lise celular bacteriana e Aquisição de informação de Sequência de rRNA 16S [00120] Uma 20^l alíquota de suspensão de células foi transferida para uma placa PCR de 96-poços contendo 20 p.1 de um tampão 2x

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53/75 lise (100 mM Tris HCL, pH 8.0, 2 mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS, 400 pg/ml Proteinase K). Condições lise foram como segue: 55°C por 30 minutos, 94°C por 4 minutos. Uma alíquota do produto lise foi utilizada como a fonte de DNA modelo para amplificação de PCR. A sequência de rRNA 16S foi amplificada através de PCR utilizando M13-27F (SEQ ID NO: 17) e iniciadores 1492R de cauda M13 (SEQ ID NO: 18).

[00121] Para amplificação de região de rRNA 16S, cada mistura de PCR foi preparada em uma reação de volume final 20-pl contendo 4 da reação da lise bacteriana, 2 pM de cada iniciador (27F/1492R), 6% Tween-20, e 10 pl de 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Condições de PCR foram como segue: 94°C por 10 minutos; 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos, 72°C por 75 segundos durante 30 ciclos; 72°C por 10 minutos. Uma 2-pl alíquota do produto de PCR foi corrida num gel de agarose a 1,0% para confirmar uma única banda do tamanho esperado. Bandas positivas foram enviadas para sequenciamento Sanger nas direções em sentido para frente e reversa usando iniciadores M13. Sequências do rRNA16S das cepas bacterianas SGI-014-C06, SGI-005-G08, SGI-014-G01, SGI-015-F03, e SGI-015H06 são aproximadamente 1,4-Kb em comprimento e são providas na Listagem de Sequência como SEQ ID NOs: 1, 10, 12, 13, e 14 respectivamente. Pesquisa de homologia para a sequência de nucleotídeos determinada foi conduzida utilizando o bando de dados de DDBJ/GenBank/EMBL. Subsequentemente, a relação filogenética da sequência de nucleotídeos dos genes 16 rRNA foi analisada ente os antagonistas bacterianos isolados descritos aqui, bactérias dos gêneros e espécies que apresentam altas homologias de sequência com os antagonistas bacterianos isolados, e outras amplas variedades de dos gêneros e espécies bacterianos, usando o programa de construção de árvore filogenética ClustalW. Identidade e similaridade de sequência também foram determinadas usando o software GenomeQuest (Gene

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IT, Worcester Mass. USA). O resultado da análise de sequência revelou que o isolado bacteriano SGI-014-G01 pode ser considerado relacionado com o gênero de Variovorax com base em —99% de similaridade de sua sequência de rRNA 16S àquelas de várias espécies de Variovorax, incluindo Variovorax sp. R-21938 (GenBank AJ786799) e Variovorax paradoxes (GenBank GU186109), cujas sequências de rRNA 16S mostram parentesco claro para Variovorax sp. Adicionalmente, o resultado da análise de sequência também revelou que os dois isolados bacterianos SGI-015-F03 e SGI-015-H06 podem ser considerados relacionados com a família de Bacillaceae, com base em >99% de similaridade de suas respectivas sequências 16S àquelas de várias Bacillus spp.

[00122] O resultado da análise de sequência revelou que os dois isolados bacterianos SGI-014-C06 e SGI-055-G08 podem ser considerados relacionados com a família de Microbacteriaceae com base em >99% de similaridade de suas respectivas sequências 16S àquelas de várias Microbacterium spp. Notavelmente, a sequência 1430-nt do gene 16S rRNA deSGI-014-C06 (SEQ ID NO: 1) é idêntica ao gene 16S rRNA de uma cepa Microbacterium oxydans DSM 20578 e várias outras cepas de Microbacterium sp. (por exemplo, sequências GenBank Y17227.1, FJ200406, EU086800, e EU714335) ao longo de seu comprimento 1430-nt.

[00123] Em particular, entre as centenas de cepas microbianas que foram isoladas e testadas para a capacidade de suprimir desenvolvimento de Fusarium em ensaios de antagonismo como descrito no Exemplo 1, um total de oitenta e oito cepas foi subsequentemente identificado como espécies de Microbacterium com base na similaridade de sequência de suas sequências 16S àquelas de known Microbacterium spp. Contudo, Requerentes verificaram que SGI-014-C06 e SGI-055-G08 foram as únicas duas cepas Microbacterium que possuí

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55/75 am atividade de supressão contra Fusarium graminearum. Até o momento, como discutido acima, vários micróbios que ocorrem naturalmente foram relatados como tendo atividade antagônica contra doença da fusariose de cereais. Contudo, não há relatos anteriores à presente invenção que descrevem um micro-organismo do gênero Mycobacterium tendo tal atividade antagônica. Adicionalmente, antes da presente invenção, os presentes inventores não estavam ciente de quaisquer métodos ou processos de uso de uma cepa bacteriana do gênero Mycobacterium como agente de biocontrole na prevenção, inibição ou tratamento do desenvolvimento de um patógeno causador de doença da fusariose de cereais.

EXEMPLO 3: Análise de SequÇencia de Genes de manutenção a apartir do isolado SGI-014-C06 [00124] Um estudo filogenético de vários genes de manutenção a partir de 27 espécies do gênero Microbacterium foi relatado recentemente por Richert et al. (Syst. Appl. Microbiol. 30:102- 108, 2007). O estudo concluiu que, embora os méritos da análise de sequência de16S rRNA de taxonomia sistemática são insuperáveis, ênfase exclusiva em um único parâmetro taxonômico não deve guiar conclusões sistemáticas. Como divulgado acima, a sequência de nucleotídeos do gene 16S rRNA de SGI-014-C06 (SEQ p NO: 1) é idêntica ao gene 16S rRNA gene de várias cepas Microbacterium sp., incluindo a sequência de nucleotídeos de um gene 16S rRNA de uma cepa Microbacterium oxydans DSM 20578 que foi incluída no estudo de Richert et al. (2007) (Acesso GenBank Y17227.1). Requerentes passaram a realizar uma análise filogenética em quatro genes de manutenção do isolado SGI-014-C06, os quais são DNA girase subunidade B (gyrB), RNA-polimerase subunidade B (rpoB), recombinase A (recA), e quinase polifosfato (ppk). Para este fim, o genoma inteiro do isolado SGI014-C06 sofreu sequenciamento shotgun, foi disposto e anotado ao

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56/75 utilizado procedimentos descritos no Pedido de Patente PCT No. W02010115156A2. DNA genômico foi preparado a partir de uma cultura fresca de SGI-014-C06. Pellet celular foi usado para extração de DNA de elevado peso molecular utilizando o Kit de Isolamento UltraClean® Mega Soil DNA (Cat. No 12900-10) de MO BIO Laboratories, Inc. de acordo com o protocolo recomendado de fabricação. O DNA genômico deSGI-014-C06 foi então preparado por 454-pirosequenciamento shotgun. DNA genômico (7,5pg) foi utilizado para a construção da biblioteca de acordo com o protocolo recomendado (454 Life Sciences) para leituras longas únicas. As sequências foram geradas por dois acionamentos de seqüenciamento de série GS FLX Titanium (series sequencing runs).

[00125] As sequências de quatro genes de manutenção gyrB, rpoB, recA, e ppk do isolado SGI-014-C06 são providas na Listagem de Sequências. Pesquisa de homologia para a sequência de nucleotídeos determinadas foi conduzida utilizando o bando de dados de DDBJ/GenBank/EMBL. Identidade e similaridade de sequência também foram determinadas usando GenomeQuest^TM software (Gene-IT, Worcester Mass. USA). Conforme discutido detalhadamente abaixo, o resultado da análise de sequência dos genes de manutenção revelou que o isolado SGI-014-C06 descrito na presente descrição é uma nova cepa bacteriana e pode ser considerado relacionado com a família de Microbacteriaceae.

[00126] A sequência de polinucleotídeo do gene gyrB de SGI-014C06 tem a maior identidade de sequência com um gene gyrB de Microbacterium testaceum tendo número de acesso de GenBank AP012052 (82,69% sobre um alinhamento de nucleotídeos 936/2172). Quando comparadas ao gene gyrB da Cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181493; Richert et al., 2007), as homologias de sequências entre os dois genes foram —62% idênticas

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57/75 no nível nucleotídico e —37% idênticas no nível de aminoácidos.

[00127] A sequência de polinucleotídeo do gene rpoB de SGI-014C06 tem a maior identidade de sequência com um gene rpoB de Microbacterium maritypicum tendo número de acesso de GeneBank AM181582 (96,98% sobre um alinhamento de nucleotídeos

1093/3504). Quando comparadas ao gene rpoB da Cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181583; Richert et al, 2007), as homologias de sequências entre os dois genes foram -96% idênticas no nível nucleotídico e 99% idênticas no nível de aminoácidos.

[00128] A sequência de polinucleotídeo do gene recA de SGI-014C06 tem a maior identidade de sequência com um gene recA de Microbacterium testaceum tendo número de acesso de GeneBank AP012052 (85,45% sobre um alinhamento de nucleotídeos 962/1188). Quando comparadas ao gene recA da cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181527; Richert et al., 2007), as homologias de sequências entre os dois genes foram —92% idênticas no nível nucleotídico e 100% idênticas no nível de aminoácidos.

[00129] A sequência de polinucleotídeo do gene ppk de SGI-014C06 tem a maior identidade de sequência com um gene ppk de Microbacterium luteolum tendo número de acesso de GenBank AM181554 (91.38% sobre um alinhamento de nucleotídeos 1380/2175). Quando comparadas ao gene ppk da Cepa de Microbacterium oxydans DSM 20578 (GenBank AM181556; Richert et al., 2007), as homologias de sequências entre os dois genes foram —91% idênticas no nível nucleotídico e —98% idênticas no nível de aminoácidos.

EXEMPLO 4: Proteção de trigo da infecção de Fusarium graminearum utilizando os antagonistas microbianos Microbacterium sp. (NRRL B50470) Mycophaerella sp. (NRRL 50471), e Variovorax sp. (NRRL B50469)

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58/75 [00130] Cepas microbianas que foram verificadas positivas para antibiose na triagem de antagonismo descrita no Exemplo 1 foram avaliadas adicionalmente através de um bioensaio à base de planta no qual células das cepas microbianas foram aplicadas diretamente em sementes de um cultivo de cereal suscetível, seguido de inoculação com esporos conidiais de F. graminearum. As cepas microbianas foram crescidas a uma turbidez suficiente e diluídas em água. Dois gramas de sementes de trigo de um cultivo de trigo suscetível (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) foram semeados em potes de um litro contendo meio solo pasteurizado. Após a semeadura, 20 mL da diluição de cultura microbiana foi transferida no topo das sementes semeadas. As sementes de trigo foram deixadas para germinar em condições de estufa sob iluminação fluorescente com um fotoperíodo de 14 horas. No início do florescimento do trigo, as cabeças de trigo foram desafiadas por pulverização com esporos conidiais de F. graminearum NRRL 5883. Esporos conidiais foram colhidos de placas PDA de 5 dias de idade ao verter água com 0.01% Tween20 nas placas e ao raspar os esporo em suspensão. Após pulverização de esporos, plantas de trigo foram transferidas para uma câmara de nebulização com 100% de umidade por três dias para permitir infecção. Os tratamentos foram:

1. Não tratado: desafio de nenhum tratamento fungicida microbiano ou químico + Fusarium.

2. Não infectado: desafio de nenhum tratamento fungicida microbiano ou químico, sem Fusarium.

3. SGI-010-H11: desafio de tratamento fúngico + Fusarium.

4. SGI-014-G01: desafio de tratamento bacteriano + Fusarium.

5. SGI-014-C06: desafio de tratamento bacteriano + Fusarium.

[00131] Vinte dias após a infecção, a rega foi parada e plantas de trigo foram deixadas para secar durante três semanas antes da colhei

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59/75 ta. Cabeças de trigo individuais foram colhidas e coletadas. A gravidade da doença foi determinada para cada cabeça mostrando sintomas da doença da fusariose de cereais. A gravidade da doença foi calculadas com o número de espiguetas doentes dividido pelo número total de espiguetas por cabeças. Os resultados (TABELA 2) revelaram que plantas de trigo tratadas com cada um dos três antagonistas microbianos testados, SGI-014-C06 (NRRL B-50470), SGI-010-H11 (NRRL 50471), e SGI-014-G01 (NRRL B-50469), tiveram gravidade e incidência de infestação de Fusarium graminearum significantemente menores quando comparadas ao crescimento controle não tratado nas mesmas condições (P<0.05).

[00132] As sementes de cada cabeça foram colhidas a mão e a massa de semente foi pesada. O peso de semente médio por pote em cada um dos tratamentos foi calculado. Como relatado na TABELA 3, cada um dos antagonistas microbianos foi encontrado para reduzir significativamente a perda causada pela infestação por fusariose de cereais.

TABELA 2. Eficácia dos antagonistas microbianos na redução da incidência de fusariose de cereais no trigo.

Tratamento	Gravidade Percentual (%)	STDEV	Valor de P
Não infectado	1,30	0,0025	<,0001
Não tratado	15,46	0,0364	NA
SGI-010-H11	7,42	0,0219	0,0005
SGI-014-G01	6,59	0,0315	0,0001
SGI-014-C06	7,21	0,0225	0,0004

TABELA 3. Eficácia dos antagonistas microbianos na preservação de rendimento de semente em plantas de trigo tendo doença da fusariose de cereais.

Tratamento	Massa da semente (g)	Valor de P
Não infectado	0,8438 ± 0,1633	0,0191

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Não tratado	0,4669 ± 0,1209	NA
SGI-010-H11	0,6200 ± 0,1844	0,7025
SGI-014-G01	0,7963 ± 0,2032	0,5277
SGI-014-C06	0,6744 ± 0,0948	0,0551

EXEMPLO 5: Inibição de crescimento de Fusarium graminearum por antagonistas microbianos em semeaduras de trigo [00133] As cepas microbianas encontradas para possuírem atividade supressora contra F. graminearum no ensaio de antagonismo foram investigadas ainda para sua capacidade em reduzir a incidência de fusariose de cereais no trigo. Sementes de um cultivar de trigo suscetível (Hank; WestBred LLC, Bozeman, MT) foram semeadas em potes de 1 litro cada um contendo meio de solo pasteurizado em potes plásticos de diâmetro de 20 cm. Suspensões celulares microbianas foram preparadas como a seguir: 2YT, ou meio de crescimento similar, culturas de caldo foram inoculada de estoques de glicerol isolados ou placas de estrias. Normalmente, culturas foram iniciadas 48 — 72 horas antes do uso em câmara de crescimento, efeito estufa ou campo permitindo a cultura atingis fase exponencial posterior. Isolados que tiveram momentos de duplicação mais longos foram iniciados adicionalmente antecipadamente. Culturas foram incubadas a 30^°C em um agitador de rotação a 200 rpm. Após o crescimento, a células foram sedimentadas a 10.000 x g durante 15 min a 4°C e resuspensas em 10 mM de tampão de MgSO4 (pH 7,0). Densidades de células foram normalizadas para cada isolado em uma base de CFU/mL (unidades de desempenho celular por milímetro). Normalmente, —suspensões de 109 CFU/ mL foram preparadas para cada isolado e transportadas para o sítio de inoculação em gelo. Inoculações foram realizadas por diluição dessas suspensões celulares 1/20 na água de irrigação para uma densidade final 5 X 10⁷ CFU/mL. Para tentativas de pote de 1-L, 20 mL dessa suspensão de célula diluída foi distribuída uniformemente sobre

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61/75 a superfície de cada pote replicado. Para potes de micro-tentativa, suspensões celulares não foram diluídas e 1 mL de cada suspensão de 109 CFU/mL foi pipetada diretamente sobre a superfície de cada pote de réplica como encharque de solo no topo de sementes submersas. As sementes e plantas foram mantidas em um efeito estufa em temperatura ambiente com um fotoperíodo de 14 h de luz.

[00134] Micelio de cepa de Fusarium graminearum NRRL-5883 foi cultivado em placas de PDA durante 5 dias sob luz constante. Hifae e conídia foram colhidas vertendo alguns mL de água estéril (0,01% o Tween 20) sobre as placas e raspando a superfície de ágar com uma espátula estéril. A concentração de esporos na inoculação foi aproximadamente 2x10⁵ esporos/mL, mas concentração de fragmento de hifal não foi determinada.

[00135] Inoculação com F. graminearum começou após disparo emergindo das sementes e continuados a cada outra tarde durante 10 dias. O inoculo de F. graminearum foi aplicado com um pulverizador em cerca de 30 mL por pote. Imediatamente depois de cada inoculação, as plantas foram aspergidas com mister de sobrecarga. Quando fungicida químico foi utilizado, o fungicida (Banner Maxx, Syngenta) foi preparado diluindo 2 mL de estoque de fungicida em 1L de água destilada e foi aplicado com um pulverizador em cerca de 30 mL por pote.

[00136] Fusariose de cereais foi avaliada pela gravidade da infestação por Fusarium, como determinado pelo número de unidades formadoras de colônia de Fusarium por grama (CFU/g) de tecidos de planta. Todos os tratamentos foram realizados em quatro blocos com quatro potes replicados. Os tratamentos foram:

[00137] 1. Não tratado: nenhum tratamento fungicida microbiano ou químico, nenhum desafio de Fusarium [00138] 2. Não infectado: nenhum tratamento fungicida microbiano ou químico, nenhum desafio de Fusarium.

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62/75 [00139] 3. Fungicida: desafio de tratamento fungicida químico + Fusarium.

[00140] 4. SGI-010-H11: desafio de tratamento fúngico + Fusarium.

[00141] 5. SGI-014-G01: desafio de tratamento bacteriano + Fusarium.

[00142] 6. SGI-014-C06: desafio de tratamento bacteriano + Fusarium.

[00143] Os resultados, como relatados na TABELA 4, revelaram que todos os três tratamentos microbianos providenciaram uma diminuição significativa na severidade de FHB quando comparada com o controle infectado. Em particular, dois antagonistas microbianos, SGI014-C06 e SGI-010-H11, reduziram significativamente a infestação de plantas de trigo por Fusarium graminearum quando comparadas com o crescimento do controle não tratado nas mesmas condições. A proteção das plantas de trigo da infestação por Fusarium efetuada por cada um dos dois micro-organismos SGI-014-C06 e SGI-010-H11 foi estatisticamente comparável com a proteção efetuada pelo fungicida químico comercial. Quando o micro-organismo SGI-014-G01 foi aplicado, a proteção observada das plantas de trigo da infestação por Fusarium foi muito menos conspícua e sua efetividade variou grandemente dentre os potes replicados.

TABELA 4: Efeito de antagonistas microbianos sobre infestação de Fusarium.

Tratamento	CFU/g	Valor P
Não tratado	1487 ±600	N/A
Não infectado	0 ± 0	<,0001
Fungicida químico	290±146	<,0001
SGI-010-H11	671 ± 450	0,0077
SGI-014-G01	1246 ±465	0,8387
SGI-014-C06	367 ± 234	0,0001

EXEMPLO 6: Crescimento e armazenamento dos antagonistas microPetição 870190046231, de 17/05/2019, pág. 67/90

63/75 bianos [00144] Mycosphaerella sp.: vários métodos foram utilizados para armazenar os fungos isolados como uma cultura pura, uma da qual foi a técnica de papel de filtro. O fungo foi permitido também crescer em PDA, e então foi cortado em pequenos quadrados que foram colocados em frascos contendo 15% de glicerol e armazenados em -70°C. o fungo foi armazenado também a 4°C por um método similar, utilizando água destilada que não glicerol. No entanto, um dos métodos preferenciais de armazenamento foi sobre semente de cevada estéril infestada a -80°C.

[00145] Bacillus sp., Microbacterium sp. e Variovorax sp.: as bactérias isoladas foram armazenadas como uma cultura pura. Uma colônia bacteriana foi transferida para um frasco contendo meio líquido de caldo R2A (Tecknova) e permitido crescer a 30°C com agitação a 250 rpm durante dois dias. A cultura foi então transferida para dentro de frascos contendo 15% de glicerol e armazenada a - 80°C.

EXEMPLO 7: Produção de esporo e tratamentos de revestimento de semente [00146] Produção de esporo: em um procedimento de produção de esporo típico, um litro de meio de crescimento 2xYT (16 g/L de Triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl) foi inoculado com 5 mL de cultura iniciadora ou raspagem de louça de petri e inoculado durante a noite a 30°C em um agitador de rotação que foi ajustado em 225 rpm. Células bacterianas foram sedimentadas por centrifugação, e lavadas lx com tampão PBS (8 g/L de NaCl; 0,2 g/L de KCI; 1,44 g/L de Na2HPO4; 0,24g de KH2PO4; pH 7,4). Células foram resuspensas em meio CDSM (Hageman et al., J. Bacteriol., 438-441, 1984), e foram cultivadas durante quatro noites adicionais em 30°C no agitador de rotação. Esporulação na cultura bacteriana foi monitorada diariamente pelo uso de microscópio de contraste de fase até que a cultura interia

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64/75 tivesse feita virtualmente de esporos flutuantes livres. O tempo de incubação normalmente leva menos que quatro dias ou mais que seis dias dependendo das espécies. Sob microscópio de contraste de fase, endoesporos foram detectados dentro de células como esferoides oblatos brancas brilhantes. Esporos bacterianos foram sedimentados por centrifugação a 10,000 X g durante 15 minutos, lavados duas vezes com dH20 estéril e, se necessário, concentrados até 50 mL e poderiam ou ser utilizados imediatamente ou refrigerados para uso posterior. Concentração de esporo foi medida a OD600· Este procedimento normalmente produziu pelo menos 2000 OD's de esporos bacterianos. [00147] Em particular, várias cepas bacterianas da presente invenção, por exemplo Bacillus sp. SGI-015-F03, poderiam produzir convenientemente grandes quantias de esporos após 4 dias de incubação com uma inoculação simples de uma cultura iniciadora durante a noite grande (-15 mL) em para 1 litro de 2x SG de meio de crescimento, seguido por uma incubação de 4 dias em temperatura adequada em um agitador de rotação ajustado a 225 rpm. A receita do meio de crescimento 2x SG foi como a seguir: 16 g/L de caldo de nutriente; 0,25 g/L de MgSO4; 2,0 g/L de KC1; 0,15 g/L de CaCl2,2H2O; 0,025 g/L de MnCl2,2H2O; 0,28 mg/L de FeSO4,7H2O; 1,0 g/L de Dextrose.

[00148] Tratamentos de revestimento de semente das sementes de trigo e milho: experimentos de tratamento de semente de pequena escala foram conduzidos seguindo um procedimento descrito em Sudisha et al., 2009 com pequenas modificações. Normalmente, uma solução de estoque de biopolímero foi feita pela adição de 6 gramas de pós de goma Arábica (MP Biomedical) a 36 mL de água em um tubo Falcon de 50 mL, que foi subsequentemente misturado para homogeneidade utilizando um misturador de roda. Uma placa de agitação foi utilizada para misturar quando quantidades maiores de sementes revestidas foram necessárias.

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65/75 [00149] Quando células vegetativas foram utilizadas, culturas turvas de células microbianas de crescimento ativo foram lavadas com PBS e ajustadas para um OD600 de —5,0. Alternativamente, suspensões de esporo microbiano foram preparadas como descrito acima. Esporos bacterianos e/ou células vegetativas foram resuspensas cuidadosamente em —32 mL de solução de estoque de biopolímero de goma Arábica preparados como descrito acima, e a suspensão resultante foi misturada cuidadosamente em uma garrafa de 1 L. Aproximadamente 400 g de sementes (seja trigo ou milho) foram adicionados à garrafa e agitadas vigorosamente ou submetida a vórtice para garantir uma distribuição uniforme da suspensão de goma/célula. Sementes revestidas foram então espalhadas através de botes de peso plástico estéril para secar em um exaustor de fluxo laminar até que não mais pegajoso, geralmente 3-6 horas com mistura periódica. Em alguns casos sementes revestidas com esporos poderiam ser secas durante a noite. No entanto, sementes revestidas com culturas vegetativas foram normalmente armazenadas fora antes de elas desidratarem completamente. Teste de viabilidade realizado periodicamente nos micróbios utilizados em formulação de revestimento de semente mostrou que os micróbios permaneceram viáveis durante pelo menos três meses. Taxa de germinação das sementes revestidas foi determinada par ser essencialmente idêntica às sementes não revestidas de controle.

EXEMPLO 8: Efeito de tratamentos de semente microbiana sobre o desenvolvimento de Fusarium fusariose de cereais em trigo [00150] Sementes de um cultivo de trigo suscetível a FHB (RB07) foram revestidas com cada um dos micro-organismos SGI-014-C06; SGI-015-F03, e SGI-015-H06, de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 8. Sementes revestidas foram subseqüentemente semeadas em potes de um litro contendo meio de solo pasteurizado [(Metromix-Mix 200; Scotts-Sierra Horticultural Products, Marysville, OH; e 3

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66/75 gramas de fertilizante 14-14-14 (N-P-K)]. Potes foram semeados em 78 plantas por pote e subsequentemente diluídos para 5 plantas por pote no estágio de 3 folhas. Potes foram arranjados em blocos randomizados com 5 potes por tratamentos. As sementes revestidas foram então permitidas germinarem em condições de efeito estufa sob iluminação fluorescente com 16 horas de iluminação por dia. No início da florada do trigo (antesis), as cabeças de trigo foram desafiadas por pulverização com macroesporos conidiais de F. graminearum NRRL 5883 em uma concentração de 100,000 esporos/mL. Após a pulverização de esporos, plantas de trigo foram transferidas para uma câmara de orvalho com 100% de umidade durante três dias para permitir a infecção. Os tratamentos foram:

1. Não tratado: nenhum desafio de tratamento fungicida microbiano ou químico + Fusarium.

2. SGI-014-C06: desafio de tratamento de semente bacteriana + Fusarium.

3. SGI-015-F03: desafio de tratamento de semente bacteriana + Fusarium.

4. SGI-015-H06: desafio de tratamento de semente bacteriana + Fusarium.

[00151] Gravidade da doença da fusariose de cereais foi avaliada visualmente em dez dias e vinte um dias após a infecção. Severidade da doença foi determinada para cada pico mostrando sintomas da doença da fusariose de cereais, e calculada como a porcentagem de espiguetas sintomáticas; ou seja o número de espiguetas apresentando sintomas de FHB dividido pelo número total de espiguetas. Os resultados (TABELA 5) revelaram que sementes de trigo revestidas com cada um dos três antagonistas microbianos testados, SGI-014-C06; SGI015-F03, e SGI-015-H06, tiveram severidade significativamente inferior da infestação por Fusarium graminearum quando comparada ao conPetição 870190046231, de 17/05/2019, pág. 71/90

67/75 trole não tratado crescendo nas mesmas condições (P<0,05).

Tabela 5: Desenvolvimento de sintomas da fusariose de cereais no trigo após tratamentos de semente com micro-organismos antagônicos

Tratamento	Gravidade da infecção (% o)
	10 dias pós infecção	21 dias pós infecção
Controle Não tratado	49,31	66,10
SGI-014-C06	2,08	7,74
SGI-015-F03	23,12	31,53
SGI-015-1106	9,42	19,81

EXEMPLO 9: Biocontrole de doença de fusariose de cereais de trigo em tentativas de efeito estufa [00152] Cada um dos micro-organismos SGI-014-C06; SGI-015F03, e SGI-015-H06 foram testados adicionalmente em tentativas de efeito estufa em escala maior. As tentativas foram conduzidas em uma sala de contenção de cultivo de planta (PGCR) localizadas em Synthetic Genomics, Inc., e incluíram os tratamentos de controle seguinte: controle infectado, controle não infectado, bem como quatro parâmetros de comparação de fungicida comercial. Os fungicidas químicos de parâmetros de comparação foram Banner MAXX® (Syngenta) em uma concentração de 2 ml/L e ProsaroO (Bayer CropScience) em uma concentração de 3 ml/L, cada um aplicado como um spray foliar, recomendação de fabricação seguinte. Os fungicidas biológicos de parâmetros de avaliação foram Actinovate® (Natural Industries) e RhizoVital® (ABiTEP GmbH), cada um aplicado como um encharque de solo como por manuais de instrução recomendados por fabricantes. [00153] Os tratamentos microbianos foram preparados e aplicados ou como um encharque de solo ou como um revestimento de semente. Quando tratamentos microbianos foram aplicados como um encharque de solo, suspensões celulares de cada um dos micro-organismos foram aplicadas individualmente às sementes antes de revestir as sementes com mais meio de cultivo. Para este fim, culturas preparadas

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68/75 frescas foram sedimentadas para remover o meio de cultivo e resuspensas em 10 mM de tampão de sulfato de magnésio (MgSO4). Suspensões celulares foram então adicionadas pipetando e distribuindo 20 mililitros uniformemente através das sementes em um número de células total de —109 células por pote. Quando tratamentos microbianos foram aplicados como um revestimento de semente, células/esporos de micro-organismos foram essencialmente preparados como descrito no Exemplo 8 acima. Sementes revestidas foram produzidas incorporando suspensões celulares com uma solução de goma Arábica para formar uma mistura de revestimento pegajosa que foi aplicada subsequentemente para as sementes. O revestimento de semente microbiana foi então permitido secar para formar um biopolímero solúvel em água exceto a dura aprisionando as células/esporos de microorganismos. O objetivo foi atingir uma titulação celular na faixa de pelo menos 10⁶ - 10⁷ de células/semente viáveis. Neste experimento de tentativa de efeito estufa, os revestimentos de semente foram preparados no dia anterior para semeadura das sementes.

[00154] Cada tratamento teve quatro réplicas que foram posicionadas em um Desenho de Bloco Completo Randomizado (RCBD) em três prateleiras niveladas arranjadas em duas filas ao longo dos lados de uma sala de cultivo. As prateleiras foram equipadas com luzes fluorescentes (Agrosun, 5850K) que geraram uma média de 800 pmole de intensidade de luz como medido na superfície de pote. Cada réplica consistiu de quatro potes de 1 litro contidos em um meio plano. Os potes foram preenchidos com um meio de cultivo sintético consistido de uma razão de 3:1 (v/v) de Meio de Cultivo de Arabidopsis AIS (Lehle Seeds) para areia (Washed Coarse). Em cada pote, duas gramas de sementes de trigo primaveril (Hank, WestBred) foram espalhadas sobre a superfície do meio de cultivo. Os potes foram aguados no fundo mantendo —2 cm de água em sua base e observados para germinaPetição 870190046231, de 17/05/2019, pág. 73/90

69/75 ção e crescimento.

[00155] No estágio de florada (Feekes 10,5,1) as cabeças de trigo foram infectadas por pulverização com uma suspensão de esporo conidial Fusarium graminearum. Para este experimento de tentativa de efeito estufa, esporos fúngicos foram preparados emplacando micelia homogeneizada de cepa de F, graminearum NRRL 5883 sobre grandes placas de PDA, seguido por incubação de cinco dias sob luz constante em temperatura ambiente. Os esporos fúngicos foram então colhidos inundando as placas com tampão de sulfato de magnésio (10 mM de MgSO4, 0,01% de Tween 20) e raspando gentilmente a superfície de ágar com uma espátula estéril. A concentração de esporo foi ajustada e aproximadamente 50,000 esporos conidiais foram aplicados por cabeça com um pulverizador manual pressurizado. A umidade relativa da sala de cultivo foi aumentada para 90% durante três dias permitindo a infecção antes ser novamente normalizada. Depois da cabeça de semente de trigo ter ajustado, aguamento foi interrompido e as cabeças de trigo foram permitidas secar completamente. Cabeças de trigo individuais foram colhidas e coletadas. Gravidade da doença foi determinada para cada cabeça de trigo apresentando sintomas da doença da fusariose de cereais. Gravidade da doença foi calculada como o número de espiguetas doentes dividido pelo número total de espiguetas por cabeça. Os resultados (TABELA 6) revelaram que trigo tratado com cada um dos três antagonistas microbianos testados, SGI014-C06; SGI-015-F03, e SGI-015-H06, tiveram gravidade e incidência significativamente inferiores de infestação por Fusarium graminearum quando comparados ao controle não tratado cultivado nas mesmas condições (P<0,05).

TABELA 6. Eficácia dos antagonistas microbianos na redução de incidência de fusariose de cereais no trigo.

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Tratamento	Gravidade da infecção (%)	Proteção da infecção%
Não infectado	2,1 ± 2,9	N/A
Infectado	37,2 ± 9,8	0,00
Prosario®	4,6 ± 2,8	93,00
Banner-	12,5 ± 5,8	70,00
Actinovate®	38,9 ± 12,1	-5,00
RhizoVital®	28,0 ± 5,4	26,00
SGI-014-C06	18,4 ± 9,1	30,00
SGI-015-F03	25,4 ± 6,9	54,00
SGI-015-H06	26,6 ± 7,4	34,00

[00156] Para determinar o rendimento de semente, cabeças de trigo foram debulhadas individualmente a mão, as sementes coletadas e limpas de joio e outros detritos, contadas e pesadas. O rendimento de semente total foi determinado como a massa de semente total produzida por 16 potes de cada um dos tratamentos. Como relatado na TABELA 7 cada um dos três antagonistas microbianos testados foi encontrado para proteger significativamente o rendimento de semente; isto é a perda de rendimento causada por infestação de fusariose de cereais foi reduzida significativamente.

TABELA 7. Eficácia dos antagonistas microbianos na preservação de rendimento de semente em plantas de trigo tendo doença da fusariose de cereais.

Tratamento	Rendimento de semente total (g)	Proteção de rendimento (%)
Não infectado	14,36	N/A
Não tratado	11,05	0,00
Prosario®	13,44	72,00
Banner-MAXX®	14,41	102,00
Actinovate®	11,99	28,00
RhizoVitalO	12,65	48,00

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SGI-014-C06	14,70	110,00
SGI-015-F03	15,03	120,00
SGI-015-H06	14,14	93,00

[00157] Consequentemente, tratamentos de plantas de trigo com cada um dos micro-organismos testados preservou significativamente as plantas de trigo contra perda de rendimento causada por infestação de Fusarium. Em particular, plantas de trigo tratadas com ou SGI-014C06 ou SGI-015-F03 apresentaram uma melhoria significante no rendimento de semente total; ou seja 110% e 120% respectivamente, quando comparado ao controle não infectado. Ao contrário, os fungicidas de avaliação comparativa Actinovatee, RhizoVital® e Prosario® não pareceram proteger significativamente as plantas de trigo tratadas da perda de rendimento provocada por infestação de fusariose de cereais Fusarium.

EXEMPLO 10: Biocontrole da sarna de trigo sob condições de campo [00158] Antagonistas de micro-organismo que foram considerados tendo atividade supressora contra o patógeno F graminearum e doença da fusariose de cereais em ensaios de antagonismo in vitro e estudos de efeito estufa, como descrito nos Exemplos 4-9, são avaliados adicionalmente em uma série de experimentos de campo em localizações geográficas diferentes ao longo de todo os Estados Unidos. Alguns experimentos são executados nas área agrícolas que são utilizadas para controle microbiológico de sarna de trigo, onde ocorre infecção de doença natural. A variedade de trigo utilizada no teste é uma variedade suscetível de F graminearum. Geralmente, plantas de trigo com cada tratamento foram semeadas em parcelas de 12 filas, cerca de 3 metros de comprimento. O espaço entre filas é cerca de 20 cm. Plots(parcelas) tratadas em cada experimento são arranjados em um desenho de bloco randomizado. A eficácia de várias composições em pó umidificáveis contendo os antagonistas microbianos da presente

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72/75 invenção na redução da gravidade e incidência de fusariose de cereais também são avaliadas. Nesses experimentos, os antagonistas microbianos são avaliados seja individualmente ou em combinação.

[00159] Nesses testes, antagonistas de micro-organismos são avaliados em vários tratamentos de revestimento de semente e/ou testes de campo onde suspensões microbianas são aplicadas diretamente sobre cabeças de trigo em florada. Em cada um dos experimentos, os micro-organismos são avaliados em parcelas replicadas. Métodos de produção de antagonista, patógeno e planta como descritos nos Exemplos 4 -9 podem ser utilizados nesses experimentos.

[00160] Tratamento de revestimento de semente — além do método de revestimento de semente descrito no Exemplo 7 acima, uma variedade de técnicas e formulações de revestimento de semente conhecidas na técnica podem ser empregadas para o tratamento de sementes de trigo com antagonistas microbianos, tal como aqueles descritos previamente por Fernando et al., 2002; Bello et al., 2002; e Kim et al., 1997. Em geral, sementes de trigo são pré-umedecidas e armazenadas em temperatura ambiente para promover germinação. Sementes germinadas podem então ser imersas dentro das suspensões microbianas antes da semeadura. Os esporos de patógenos podem ser inoculados seja ante ou após a inoculação bacteriana. Métodos de produção de antagonista, patógeno e planta como descritos nos exemplos 4 e 5 podem ser utilizados para esses tratamentos de sementes.

[00161] Avaliação de gravidade e rendimento de doença — Os antagonistas são sujeitos à avaliação adicional na avaliação de efeito estufa e de campo para sua atividade supressora contra doença da fusariose de cereais em trigo e cevada nos estágios de florecimento, utilizando uma variedade de métodos e procedimentos, normalmente aqueles descritos em, por exemplo, Schisler, Plant Disease, Vol

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86(12), 1350-1356, 2002; Schisler et al. Controle biológico, 39:497506, 2006; and Khan and Doohan, Controle biológico, 48:42-47, 2009. Em um de tais experimentos, inoculações de G. zeae são preparadas em milho dentado amarelo, estéril como descrito por Khan et al. (Controle biológico, 29:245-255, 2004). Culturas de lipídeo totalmente colonizadas (cultura de 48-horas) de cepas microbianas são diluídas a força de um quarto com tampão fosfato. Contagens de CFU total por mL para tratamentos de antagonista são entre 1 X 10⁹ CFU/mL e 6 X 10⁹ CFU/mL. Suspensões de tratamento são então aplicadas para florecer cabeças de trigo utilizando um pulverizador costal de CO2. Tratamentos são normalmente aplicados após o sol para minimizar potencial degradação por UV de células antagonistas. Há 5 replicas por tratamento que são arranjadas em um desenho e bloco randomizado. O tratamento de controle primário consiste de plantas tratadas com uma solução tampão. Um segundo controle consiste de plantas não tratadas. Avaliações de campo da doença da fusariose de cereais e incidência são feitas avaliando 60 cabeças por réplica (ou seja, 300 cabeças/tratamento) quando o desenvolvimento da planta atinge entre desenvolvimento de meio leite e leite macio. Cabeças de trigo são colhidas a mão e debulhadas utilizando uma planta única de Almaco single e debulhador de cabeça (Almaco, IA) quando grãos atingem a maturidade completa. Amostras de grão obtidas de cada filha replicada são avaliadas para peso de 100-kernel. Gravidade da doença, incidência e dados de peso de 100-kernel são analisados utilizando uma análise de uma via de variância (ANOVA).

[00162] As composições contendo os antagonistas microbianos da invenção, seja individualmente ou em combinação, são encontrados para diminuir significativamente a incidência de doença. Esses resultados mostram que as medições de controle biológico utilizando esses agentes microbianos ativos desempenham um papel importante no

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74/75 gerenciamento de sarna em plantas de cereais tais como plantas de trigo.

EXEMPLO 11: Desenvolvimento de cultivares de ocorrência não natural e programa de reprodução [00163] Micro-organismos endofíticos da presente invenção são introduzidos em plantas de cultura, incluindo cereais, de genótipos e origem geográfica variáveis, carecendo de tais micro-organismos endofíticos, para criar combinações de planta-endófita com características agronômicas aprimoradas, utilizando procedimento análogos àqueles conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no Ped. de Pat. No. US 20030195117A1; Ped. de Pat. No. US 20010032343A1; e Ped. de Pat. No. US 7,084,331, dentre outros. Consequentemente , dadas as combinações de planta-endófita sintéticas pode ser criado e selecionado em um programa de desenvolvimento de reprodução/cultivo com base em sua capacidade para formar e manter uma combinação mutualística que resulta em um benefício agronômico. Classificação das características da combinação também pode ser utilizada em tal programa de reprodução. Essas características podem incluir, sem limitação, tolerância à seca, acúmulo de biomassa, resistência à infestação de inseto, palatabilidade ao gado (por exemplo, herbívoros), facilidade de reprodução, e rendimento de semente, dentre outras. Tais combinações podem diferir em níveis de acúmulo de metabólitos microbianos que são tóxicos às pragas e ervas daninhas, incluindo níveis de alcaloide da cravagem do centeio, níveis de lolina, níveis de peramina, ou níveis de lolitrem, enquanto mostrando características agronômicas desejadas de cereais, incluindo resistência à alimentação ou infestação por insetos, resistência à tensão abiótica, palatabilidade ao gado, acúmulo de biomassa, facilidade de reprodução, e rendimento de semente, dentre outros traços.

[00164] Uma quantidade de modalidades da invenção foi descrita.

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Todavia, será entendido que elementos das modalidades descritas aqui podem ser combinados para fazer modalidade adicionais e várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. De acordo, outras modalidades, alternativas e equivalentes estão dentro do escopo da invenção como descrito e reivindicado aqui. [00165] Títulos dentro do pedido são unicamente para a conveniência do leitor, e não limitam de qualquer modo a invenção ou suas modalidades.

[00166] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nessa especificação estão incorporados aqui com referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente tivesse sido especificamente indicado individualmente a ser incorporado por referência.

Claims (21)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa microbiana ou cultura da mesma, em que a cepa microbiana é selecionada do grupo consistindo em:

a) cepa SGI-014-C06 de Microbacterium sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50470;

b) cepa SGI-010-H11 de Mycosphaerella sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL 50471;

c) cepa SGI-014-G01 de Variovorax sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50469;

d) cepa SGI-015-F03 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50760; e

e) cepa SGI-015-H06 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50761;

a composição compreendendo ainda uma quantidade agricolamente eficaz de um composto ou composição selecionada do grupo constituído por um acaricida, um bactericida, um fungicida, um inseticida, um microbicida, um nematicida, um pesticida e um fertilizante.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa microbiana é a cepa SGI-014-C06 de Microbacterium sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50470.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa microbiana é a cepa SGI-010-H11 de Mycosphaerella sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL 50471.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa microbiana é a cepa SGI-014-G01 de Variovorax sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50469.

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5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa microbiana é a cepa SGI-015-F03 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50760.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa microbiana é a cepa SGI-015-H06 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50761.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido veículo é um veículo agricolamente aceitável.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido veículo é uma semente de planta.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição é preparada como uma formulação selecionada do grupo constituído por uma emulsão, um coloide, uma poeira, um grânulo, uma pastilha, um pó, um spray, uma emulsão e uma solução.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição é uma formulação de revestimento de semente.

12. Semente, caracterizada pelo fato de que possui um revestimento que compreende a composição, como definida na reivindicação 1.

13. Método para prevenir o desenvolvimento de fusariose de cereais, caracterizada pelo fato de que compreende cultivar uma cepa microbiana ou cultura da mesma em um meio de cultivo ou solo de uma planta hospedeira antes da ou concorrente com o crescimento

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3/5 da planta hospedeira no referido meio de crescimento ou solo, em que a cepa microbiana é selecionada do grupo consistindo em:

a) cepa SGI-014-C06 de Microbacterium sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50470;

b) cepa SGI-010-H11 de Mycosphaerella sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL 50471;

c) cepa SGI-014-G01 de Variovorax sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50469;

d) cepa SGI-015-F03 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50760; e

e) cepa SGI-015-H06 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50761.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença da fusariose de cereais é causada por Fusarium graminearum.

15. Método para prevenir, inibir ou tratar o desenvolvimento da doença da fusariose de cereais de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar à planta, ou às cercanias da planta, uma quantidade eficaz de uma cepa microbiana ou cultura da mesma, em que a cepa microbiana é selecionada do grupo consistindo em:

a) cepa SGI-014-C06 de Microbacterium sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50470;

b) cepa SGI-010-H11 de Mycosphaerella sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL 50471;

c) cepa SGI-014-G01 de Variovorax sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50469;

d) cepa SGI-015-F03 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50760; e

e) cepa SGI-015-H06 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50761.

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16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida cepa microbiana ou cultura da mesma é aplicada ao solo, uma semente, uma raiz, uma flor, uma folha, uma porção da planta ou a planta inteira.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida planta é suscetível à Fusarium graminearum.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de trigo, uma planta de milho, uma planta de cevada, ou uma planta de aveia.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida cepa microbiana ou cultura da mesma é estabelecida como um endófito sobre referida planta.

20. Método para preparar uma composição agrícola, caracterizado pelo fato de que compreende inocular uma cepa microbiana ou cultura da mesma dentro ou sobre um substrato e permitir a referida cepa microbiana ou cultura da mesma crescer a uma temperatura de 1-37°C até obter um número de células ou esporos de pelo menos 10²-10³ por milímetro ou por grama, em que a cepa microbiana é selecionada do grupo consistindo em:

a) cepa SGI-014-C06 de Microbacterium sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50470;

b) cepa SGI-010-H11 de Mycosphaerella sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL 50471;

c) cepa SGI-014-G01 de Variovorax sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50469;

d) cepa SGI-015-F03 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50760; e

e) cepa SGI-015-H06 de Bacillus sp., uma amostra representativa da mesma depositada como NRRL B-50761.

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21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa microbiana ou cultura da mesma, em que a cepa microbiana compreende uma sequência de DNA de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, ou SEQ ID NO:14; a composição compreendendo ainda uma quantidade agricolamente eficaz de um composto ou composição selecionada do grupo constituído por um acaricida, um bactericida, um fungicida, um inseticida, um microbicida, um nematicida, um pesticida e um fertilizante.