CN103974620B - 用于防治赤霉病病害的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了包含微生物菌株和培养物的组合物及其使用方法。某些菌株、培养物，及其组合物可用于防治例如各种作物植物的赤霉病病害。还提供了生物防治组合物及使用其预防、抑制或治疗植物病原体的发育或病害的发展以及维护植物产量的方法。

Description

用于防治赤霉病病害的组合物和方法

序列表的并入

所附序列表的内容以引用的方式完整地并入本文。所附的名称为“SGI1520-1WO_ST25.txt”的文件是2012年7月24日创建的，大小为55Kb。该文件可在使用Window OS的计算机上使用Microsoft Word存取。

技术领域

本发明涉及植物病原性病害的生物防治。具体地，它涉及可用于防治诸如小麦和大麦的谷类植物上的赤霉病病害的组合物和方法。

发明背景

赤霉病，也称为头部疮痂病(head scab)、粉红色霉菌(pink mold)、头部发白(whiteheads)和硬化疮痂病(tombstone scab)，是折磨着全世界，尤其美国、欧洲和中国的小麦、大麦和数种其他谷类作物的破坏性病害。在世界上的潮湿和半潮湿谷类种植区，包括印度、俄罗斯、法国、德国和英国，这种病害可达到流行水平并且对谷物，尤其小麦和大麦造成大范围损害。尤其，在美国，小麦疮痂病或赤霉病是更具损害性的小麦病害之一。从全国范围来看，这种病害已经使小麦产业蒙受数百万美元的产量损失。在中西部和高平原，小麦疮痂病是近年来小麦生产的主要障碍。赤霉病除了攻击小麦外，还攻击大麦、燕麦、玉米和许多其他谷类并在其上繁殖。

这种严重的植物病害可由数种植物病原体引起，但主要由真菌属镰刀菌属(Fusarium)的数种物种引起。例如，小麦赤霉病病害的致病物包括许多不同的镰刀菌属物种，例如，黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)(有性型，玉米赤霉菌(Gibberella zeae))、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)(有性型，燕麦赤霉菌(G.avenacea))、梨孢镰刀菌(F.poae)，以及非镰刀菌属病原体诸如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale)(有性型，雪腐明梭孢菌(Monographella nivalis))和Microdochium majus。在美国、欧洲和世界上大多数农业重要国家，赤霉病的主要致病物为禾谷镰刀菌(有性型，狭义的玉米赤霉菌)。

这些病原体通常在植物残体上生存。它们在开花期间侵袭并损害谷物头部的小穗，从而阻止或部分阻碍谷物的谷物头部的发育。因此，侵袭的疮痂病病原体可灭杀谷物头部的一部分或整个谷物头部。一些受感染种子活力低下并且经常无法发芽。发芽的受感染种子由于冠腐病或根腐病而经常在苗期早期死亡，导致后面的作物植物站立欠佳。健康幼苗在出苗时也可能会被感染。除了站立欠佳、不稳(unthrifty)之外，如果条件对病害发展有利，那么病原体侵染造成的产量损失也可能会相当高。

镰刀菌属的真菌病原体蔓延到世界各地的谷物栽培区，并且已知会造成严重的损害，尤其是在开花期和灌浆期之间具有高降雨量的地区更是如此。当禾谷镰刀菌是致病物时，这种病害是首要关注的，不但因为它除了造成产量损失之外还会降低受污染谷物的商业价值，而且还因为镰刀菌感染还可能会导致单端孢霉烯霉菌毒素在谷物中的累积，从而威胁到人类和牲畜的健康。单端孢霉烯是全世界谷类的主要霉菌毒素污染物，导致非反刍动物拒食、呕吐、腹泻和体重减轻并且在暴露水平高时对其他动物和人类的健康构成威胁。这一威胁已因为在美国禾谷镰刀菌菌株最近朝向更高的产毒能力或活力的转变而加剧。最经常发现的霉菌毒素是脱氧瓜萎镰菌醇(DON，也称为呕吐毒素)和玉米烯酮(ZEA)。尤其是脱氧瓜萎镰菌醇是非常危险的毒素，导致食用受感染谷物的人和动物发生胃肠功能紊乱，伴有出血性病状等，在一些情况下导致死亡。因为脱氧瓜萎镰菌醇对pH的变化和高温一般具有稳定性，所以解毒可能非常困难。因此，受污染超出一定水平的谷物不能以任何的酿造、加工或牲畜饲料的形式使用，因而经常需要销毁。

迄今为止，已利用各种策略防治作物植物上的赤霉病。有前途的供选方案包括化学措施、对抗性作物栽培品种的开发，及田地作物轮作和耕作的传统实践。在这些供选方案中，化学杀害虫剂在减轻赤霉病侵染方面可能有些效果，但是有关杀真菌剂在作物发育后期，通常在就在收获前几周的开花期的使用的残留担忧减低了它们的吸引力。使用传统育种和遗传工程开发抗性栽培品种代表另一种可选的病害防治替代方案，这方面也出现进展。报道的遗传工程进展的实例包括改变植物激素的产量或操纵植物激素信号转导途径。近年来，在传统育种领域中，已在理解对赤霉病病害的抗性的遗传基础方面取得相当大的进展，并且已报道赋予抗性的许多基因和数量性状基因座(QTL)。然而，在提高作物对赤霉病病害的抗性方面的进展缓慢，主要是因为研究这种病害的难度。事实上，目前对牵涉到抗性或敏感性的机制的了解相对很少。另外，作为该病害的主要致病物的镰刀菌属物种的遗传多样性经常引发关于化学杀真菌剂和抗性栽培品种的功效将如何耐久的担忧。因此，目前大规模生产的几乎所有的小麦栽培品种仍然易受感染。

另外，尽管有望通过传统实践诸如在收获后犁地来掩埋受致病物，例如，禾谷镰刀菌侵染的作物残茬在防治赤霉病病害方面取得一些成功，但是常规的收获后田地耕作与少耕的土壤保持实践不相容。鉴于接种物可能会长距离散布并且多种多样的作物可以充当病原体的替代寄主，作物轮作经常是站不住脚的解决方案。除了环境中杀害虫剂残留问题之外，杀害虫剂抗性及谷物中DON含量增加的实例的报告也可能会影响到它们的使用。进一步地，成本及公共和私营部门对环境和食品安全中杀害虫剂残留的越来越多的担忧使得这种病害防治替代方案不那么有吸引力，并且已导致要求使用尽可能少的杀害虫剂进行作物栽培。

总起来说，尽管在开发防治赤霉病的技术方面取得相当大的进展，但是减少这种破坏性病害对谷物产量和质量的影响仍然是一个棘手的问题。因此，鉴定和开发新赤霉病防治技术是改进许多谷类作物的产量和质量所必不可少的。这些问题不仅在美国，而且在全球各地，包括亚洲和欧洲，都亟待解决。

自从20世纪90年代中期以来，赤霉病病害的生物防治已经吸引相当大的关注。生物防治剂(BCA)，尽管目前的数量非常有限，但可能是显著降低由诸如镰刀菌的病原体引发的病害的水平的环境上可接受的方法。公众接受度、与其他病害管理措施的相容性，及耐久性是支持开发生物防治赤霉病病害的策略的有利因素之一。生物防治剂可在有机谷类生产中发挥重要作用。在常规生产中，此类药剂在化学杀真菌剂不能再施加后，可延长对穗的保护至跨越开花期。迄今为止，已经在生物防治领域取得显著进展。例如，产孢子细菌(诸如芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的物种)和酵母菌(诸如隐球菌属(Cryptococcus)的物种)的某些菌株在防治赤霉病病害和减少霉菌毒素污染上显示出一些前景。然而，尽管取得这些和其他进展，但仍然需要用于赤霉病病害的生物防治的改良微生物体。尽管BCA已成为更能让人接受的植物病原体解决方案并且BCA产品已得到比以往任何时候都更高的程度的销售，但是迄今为止很少有人尝试开发生物防治赤霉病病害的策略和拮抗微生物体。此外，镰刀菌属某些种及赤霉病病害的其他致病物的生命周期提示，该病原体可以潜在地易受使用处于不同发育阶段的拮抗微生物体的生物防治技术影响。因而，需要鉴定优选具有不同作用模式的新生物防治剂，以及可帮助有效预防或阻抑赤霉病病害发展的生物防治方法。

发明概述

本文提供了包含微生物菌株和培养物的组合物。某些菌株、培养物，及其组合物可用于防治，例如，包括小麦和其他谷类植物在内的各种作物植物的赤霉病病害。还提供了生物防治组合物及使用其预防、抑制或治疗植物病原体的发育或病害的发展以及维护植物产量的方法。还提供了作为生物防治剂的此类组合物与其他农业上有效的防治有害植物病原体的化合物或组合物组合使用的方法。

在一方面，本发明提供了具有对抗赤霉病病害的阻抑活性的分离的微生物菌株。根据本发明这个方面的微生物菌株选自由微杆菌属、芽孢杆菌属、球腔菌属和贪噬菌属组成的组。在一些优选实施方案中，微生物菌株选自由以下组成的组：球腔菌属菌株SGI-010-H11(保藏号为NRRL50471)、微杆菌属菌株SGI-014-C06(保藏号为NRRL B-50470)、微杆菌属菌株SGI-005-G08(保藏号为NRRL_-___)、贪噬菌属菌株SGI-014-G01(保藏号为NRRL B-50469)、芽孢杆菌属菌株SGI-015-F03(保藏号为NRRL B-50760)、芽孢杆菌属菌株SGI-015-H06(保藏号为NRRL B-50761)，及其中任何一者的杀虫活性变异体。根据一些其他优选实施方案的微生物菌株可包含与序列表中任何一个核苷酸序列展现至少85%的序列同一性的DNA序列。进一步提供了本文所公开的微生物菌株的生物上纯的培养物和富集培养物。

还在本发明的另一方面提供了组合物，其包含本发明微生物菌株或其培养物，及农业上有效的量的选自由以下组成的组的化合物或组合物：杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂、杀害虫剂和肥料。在这个方面的一些实施方案中，组合物可被制备成选自由以下组成的组的制剂：乳状液、胶体、粉状物(dust)、颗粒剂、小丸剂、粉剂(powder)、喷洒剂、乳状液和溶液。在一些其他实施方案中，组合物可与载体一起提供。在一些优选实施方案中，载体为农业上可接受的载体。在一些特别优选的实施方案中，载体为植物种子。在其他优选实施方案中，组合物为种子包衣制剂。在本公开中进一步提供了用根据本发明的组合物包衣的种子。

在本发明的另一方面，提供了预防、抑制或治疗植物病原体的发育的方法。该方法涉及在寄主植物的生长培养基或土壤中的寄主植物生长之前或与其同时，让本发明微生物菌株或其培养物在该生长培养基或土壤中生长。在这个方面的一些优选实施方案中，该植物病原体引起赤霉病病害。在一些特别优选的实施方案中，该植物病原体为禾谷镰刀菌。

在本发明的又一个方面，提供了预防、抑制或治疗植物赤霉病病害的发展的方法。该方法涉及将有效量的本发明微生物菌株或其培养物施加至植物上，或施加至植物的周围环境中。在一个实施方案中，此种赤霉病病害由真菌禾谷镰刀菌引起。在这个方面的一些实施方案中，将微生物菌株或其培养物施加至土壤、种子、根、花、叶、植物的一部分，或整株植物上。在优选实施方案中，该植物易受禾谷镰刀菌感染。在一些其他优选实施方案中，该植物为小麦植物、玉米植物、大麦植物，或燕麦植物。在另一个优选实施方案中，本发明微生物菌株或其培养物被确定为植物上的内生菌。

本发明的另一个进一步方面提供了非天然产生的植物。非天然产生的植物经受本发明微生物菌株或其培养物的人工感染。在这个方面的一些优选实施方案中进一步提供了非天然产生的植物的种子、生殖组织、营养组织、植物部件和子代。

本发明的又一个方面提供了制备农业组合物的方法。该方法涉及将根据本发明的微生物菌株或其培养物接种到底土层(substratum)中或底土层上，并让它在1-37℃的温度下生长直至获得许多的、每毫升或每克至少10²-10³个的细胞或孢子。

根据本发明的以下详细描述和权利要求书，本发明的这些和其他目的和特征将变得更为显而易见。

发明详述

一些定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号及其他科学术语或专门名词意图具有本发明所属领域技术人员所通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中出于清楚和/或便于参考的目的加以定义，并且在本文中纳入此类定义应不必解释为代表与本领域中一般理解的含义有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是熟知的并且通常由本领域技术人员通过使用常规方法加以采用。

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该(所述)”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括它们的混合物。

在本文可互换使用的关于微生物体的措辞“拮抗微生物体”和“微生物拮抗剂”，意图意指受试者菌株表现出的赤霉病病害的抑制程度以统计学上显著的水平超过未经处理的对照。

抗生素：如本文所使用的术语“抗生素”是指能够灭杀微生物体或抑制微生物体的生长的任何物质。抗生素可以通过以下任一种或多种方式生产：1)微生物体、2)合成工艺，或3)半合成工艺。抗生素可以是分泌挥发性有机化合物的微生物体。此外，抗生素可以是由微生物体分泌的挥发性有机化合物。

杀细菌：如本文所使用的术语“杀细菌”是指组合物或物质增加细菌的死亡率或抑制细菌的生长速率的能力。对细菌生长速率的抑制通常可量化为随着时间的推移能存活的细菌细胞的减少。

生物防治：如本文所使用的术语“生物防治”和其缩写形式“生物防治(biocontrol)”被定义为使用至少一种除人以外的第二生物体来防治病原体或昆虫或任何其他不期望的生物体。已知的生物防治机制的实例是使用通过与真菌争夺根表面上的空间而防治根腐病的微生物体或抑制病原体生长或灭杀病原体的微生物体。在生物防治的上下文中的“寄主植物”是易受病原体引起的病害感染的植物。在将诸如真菌物种的生物体从其天然环境分离出来的上下文中，“寄主植物”是支持真菌生长的植物，例如真菌作为内生菌的物种的植物。

如本文所使用的术语“谷类”意图指可能易受赤霉病病害感染的任何谷类物种。报道易受感染的谷类包括小麦、大麦、燕麦和黑小麦，尽管小麦和大麦是这种病害在其中带来显著经济问题的两种作物。

“有效量”是指足以影响有益或所需结果的量。就病害管理、治疗、抑制或保护来说，有效量是足以阻抑、稳定、逆转、减慢或延迟靶标感染或病害状态的进展的量。因此，措辞“有效量”在本文中用于指相对于未经处理的对照中发生的情况获得病原体发育水平的降低和/或病原性病害水平的降低所必需的拮抗剂处理剂的量。通常，给定拮抗剂处理剂的有效量在合适的处理条件下提供了相对于未经处理的对照中发生的病害水平和/或病原体发育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之间，更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，以及甚至更通常介于90%至95%之间的降低。有效量可以在一次或多次施用中施用。液体制剂的实际施加速率范围将通常在最小约1×10³至约1×10¹⁰能存活细胞/mL，优选在约1×10⁶至约5×10⁹能存活细胞/mL。在大多数情况下，下面实施例中描述的本发明拮抗微生物菌株在范围为约1×10⁶至1×10⁹能存活细胞/mL的施加速率下将是最佳有效的，假定施加模式将实现与至少约50%的植物组织基本上均匀地接触。如果拮抗剂作为固体制剂来施加，则应该控制施加速率以使得每单位面积的植物组织表面的能存活细胞数量与通过前述的液体处理速率获得的数量相当。通常，当以超过10⁶CFU/g(菌落形成单位/克)，优选超过10⁷CFU/g，更优选10⁸CFU/g，最优选10⁹CFU/g的浓度递送时，本发明的生物防治剂是生物上有效的。

进一步地，如本文使用的关于微生物体的措辞“有效微生物拮抗剂”意图意指受试者微生物菌株表现出的赤霉病病害的抑制程度以统计学上显著的水平超过未经处理的对照的水平。通常，有效的微生物拮抗剂在合适的处理条件下具有实现相对于未经处理的对照中发生的病害水平和/或病原体发育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之间，更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，以及甚至更通常介于90%至95%之间的降低的能力。

组合物：“组合物”意图表示活性剂与至少另一种化合物、载体或组合物的组合，所述至少另一种化合物、载体或组合物是惰性的(例如，可检测试剂或标记或液体载体)或活性的，诸如杀虫剂。

分离的微生物菌株、分离的培养物、生物上纯的培养物和富集培养物：如本文所使用的，如应用于微生物体(例如，细菌或微真菌)上的术语“分离的”是指已从其天然产生的环境中移出和/或纯化出的微生物体。因此，如本文所使用的微生物的“分离菌株”是指已从其天然的周围环境中移出和/或纯化出的菌株。因而，“分离的微生物体”不包括寄居在其天然产生的环境中的微生物体。进一步地，术语“分离的”未必反映微生物纯化的程度。微生物菌株的“实质上纯的培养物”是指实质上不含除所需的一种或多种微生物菌株以外的其他微生物的培养物。换句话说，微生物菌株的实质上纯的培养物实质上不含其他污染物，所述污染物可以包括微生物污染物以及不期望的化学污染物。进一步地，如本文所使用的，“生物上纯的”菌株意图表示与在自然界通常与其相关联的物质分离的菌株。应注意，与在自然界通常未发现的其他菌株或化合物或物质相关联的菌株仍被定义为“生物上纯的”。特定菌株的单一培养物当然是“生物上纯的”。如本文所使用的，术语分离的微生物菌株的“富集培养物”是指含有超过50%、60%、70%、80%、90%或95%的分离菌株的微生物培养物。

如本文所使用的，“内生菌”是在其生命期的至少一部分时间内定居在植物内而不引起明显病害的内生共体。内生菌可垂直传播(从亲代直接传播至后代)或水平传播(从个体传播至无亲缘关系的个体)。垂直传播的内生真菌通常是无性的，并且经由透入寄主种子的真菌菌丝从母体植物传播至后代。内生细菌也可以从种子垂直转移至幼苗中(Ferreira等，2008)。相反地，水平传播的内生菌通常是有性的，并且经由可被风和/或昆虫媒介扩散的孢子传播。作物植物的内生菌由于它们的防治病害和昆虫侵染以及促进植物生长的能力而获得相当多的关注。

功能相当的蛋白质：如本文所使用的短语“功能相当的蛋白质”描述具有至少一种共同特征的那些蛋白质。此类特征包括序列相似性、生物化学活性、转录模式相似性和表型活性。通常，功能相当的蛋白质共享一些序列相似性或至少一种生物化学活性。在这个定义内，同系物、直向同系物、旁向同系物和类似物被认为是功能相当的。另外，功能相当的蛋白质一般共享至少一种生物化学和/或表型活性。功能相当的蛋白质将会引起类似，但未必相同的程度的相同性质。通常，在定量测量时，由于功能相当的蛋白质中的一者是另一者的至少20%，更通常介于30%至40%之间，甚至更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，甚至更通常介于90%至95%之间，甚至更通常介于98%至100%之间，功能相当的蛋白质给出相同的特征。

杀真菌：如本文所使用的，“杀真菌”是指组合物或物质降低真菌的生长速率或增加真菌的死亡率的能力。

镰刀菌属真菌：为了本发明的目的，应理解，术语镰刀菌属真菌的使用意图包括这种生物体的有性(有性型)阶段，并且还包括无性(无性型)阶段，它们也分别称为完全和非完全真菌阶段。例如，禾谷镰刀菌的变形阶段是玉米赤霉菌，赤霉病病害的致病物。这种病害通常在当花或种子头部接种了分生孢子时发生，该分生孢子由子囊孢子的不完全形式产生，子囊孢子由这种真菌的完美形式产生。

突变体：如本文所使用的，有关微生物体的术语“突变体”或“变异体”是指亲代菌株的修饰，其中所需生物活性与亲代菌株表达的生物活性类似。例如，在微杆菌属的情况下，“亲代菌株”在本文被定义为诱变之前的原始微杆菌属菌株。突变体或变异体可以自然产生，无需人为干预。它们也可以通过用本领域技术人员已知的多种方法和组合物处理获得或者通过本领域技术人员已知的多种方法和组合物获得。例如，亲代菌株可用化学物诸如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、乙基甲烷砜处理，或通过使用γ、X射线照射处理，或UV-照射处理，或通过本领域技术人员熟知的其他方式处理。

杀线虫：如本文所使用的术语“杀线虫”是指物质或组合物增加线虫的死亡率或抑制线虫的生长速率的能力。

病原体：如本文所使用的术语“病原体”是指能够在植物或动物中产生疾病的生物体，诸如藻类、蛛形纲动物、细菌、真菌、昆虫、线虫、寄生植物、酵母菌、原生动物或病毒。如本文所使用的术语“植物病原体”是指感染植物的病原性生物体。

同一性百分比：如本文所使用的“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳局部比对的序列确定的，所述比较窗口由两个序列之间的局部比对的长度限定。与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比较，比较窗口中的氨基酸序列可包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。两个序列之间的局部比对仅包括根据取决于用来进行比对的算法(例如BLAST)的标准视为足够相似的每个序列的区段。如下计算同一性百分比：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目从而产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100。比较用序列的最佳比对可通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970)的总体同源性比对算法、Pearson和Lipman(Proc,Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988)的相似性搜索方法、这些算法的探试实施(NCBI BLAST,WU-BLAST,BLAT,SIM,BLASTZ)或通过观察来进行。假设有两个经鉴定用于比较的序列，优选使用GAP和BESTFIT确定它们的最佳比对。通常，使用默认值缺口权重5.00和缺口权重长度0.30。多核苷酸或多肽序列之间的术语“基本序列同一性”是指这样的多核苷酸或多肽，其包含使用该程序与参考序列相比较具有至少50%的序列同一性，优选至少70%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%，最优选至少96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。

可针对存在于公共或专有数据库中的提交核酸或氨基酸序列搜索查询核酸和氨基酸序列。此类搜索可使用National Center for Biotechnology Information BasicLocal Alignment Search Tool(NCBI BLAST v2.18)程序完成。NCBI BLAST程序可在因特网上从National Center for Biotechnology Information(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得。通常，可以使用以下的NCBI BLAST参数：过滤选项设为“默认”，比较矩阵设为“BLOSUM62”，缺口成本设为“存在：11，延伸：1”，字体大小设为3，预期值(E阈值)设为le-3，并且局部比对的最小长度设为查询序列长度的50%。序列同一性和相似性也可以使用GenomeQuest^TM软件(Gene-IT,Worcester Mass.USA)确定。

如本文所使用的术语“杀害虫”是指物质或组合物降低害虫，即不期望生物体的生长速率，或增加害虫的死亡率的能力。

生物防治剂对植物病原体的“阻抑活性”意指该药剂阻抑、抑制、稳定、逆转、减慢或延迟病原体本身的发育，或由病原体引起的感染或病害状态的进展的能力。

变异体：如本文所使用的关于微生物体的“变异体”是这样的菌株，其具有它所属的物种的识别特征，同时相对于亲代菌株具有至少一种核苷酸序列变异或可识别的不同性状，其中该性状以基因为基础(可遗传的)。例如，对于具有杀真菌活性的微杆菌属SGI-SGI-014-C06菌株，可识别的性状包括1)阻抑禾谷镰刀菌及其有性型玉米赤霉菌的生长的能力；2)阻抑赤霉病病害的发展的能力；3)具有与微杆菌属SGI-014-C06的管家基因有大于95%、大于96%、大于97%、大于98%，或大于99%的序列同一性的管家基因，可用于证实变异体为微杆菌属SGI-014-C06。

对于核酸和多肽，术语“变异体”在本文用于表示与参考多肽或多核苷酸相比较分别在其氨基酸或核酸序列上具有一些合成产生或天然产生的差别的多肽、蛋白质或多核苷酸分子。例如，这些差别包括在参考多肽或多肽中的置换、插入、缺失或任何所需的此类变化的组合。多肽和蛋白质变异体可进一步由电荷变化和/或翻译后修饰(诸如糖基化、甲基化、磷酸化等)组成。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，引用程度如同每篇单独的出版物或专利申请均被具体单独地指出以引用的方式并入。

不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述陈述其作者所声称的内容，本申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地了解，尽管在本文中提及许多现有技术出版物，但是这种提及并不构成对任何这些文献形成本领域中公知常识的一部分的承认。

分类学鉴定的方法

微生物体经常可基于直接显微镜分析(检查时样品中的所有细胞是否看起来一样)、染色特征、简单分子分析(诸如简单的限制性片段长度多态性(RFLP)测定)等辨别。除了如在本公开的实施例2-3中描述的此类分类学分析技术的说明性实例之外，微生物体的分类学鉴定还可涉及多达数种不同水平的分析，并且每种分析可基于生物体的不同特征。此类分类学分析可包括基于核酸的分析(例如，针对个别特定基因的关于它们的存在或它们的确切序列的分析，或者对具体基因或基因家族的表达的分析)、基于蛋白质的分析(例如，在功能水平上使用直接或间接酶测定，或者在结构水平上使用免疫检测技术)，等等。

a.基于核酸的分析：本领域普通技术人员将会意识到，多种多样的基于核酸的技术是已知的并且可用于获得给定微生物体的分类学鉴定。这些技术可用来通过基因序列鉴定细胞或者可用来鉴定具有具体基因或基因家族的细胞。可用于分类学研究的常见基因家族包括16S基因家族、肌动蛋白基因家族和重组酶A(recA)基因家族。这些方法通常包括从非常少数量的细胞中扩增和测序基因，因此经常克服了从稀释的悬浮液浓缩细胞及其DNA的问题。术语“核酸扩增”一般是指增加样品或样本中核酸分子的拷贝数的技术。可用于核酸扩增的技术是本领域中熟知的。核酸扩增的实例是聚合酶链反应(PCR)，其中使从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物在允许该引物与样品中的核酸模板杂交的条件下接触。将引物在合适的条件下延伸，从模板解离，并接着再退火，延伸并解离从而扩增核酸的拷贝数。活体外扩增技术的其他实例包括链置换扩增、无转录等温扩增、修复链反应扩增、连接酶链反应、缺口填充连接酶链反应扩增、联合的连接酶检测和PCR，以及无RNA转录的扩增。

除了本文提供的说明性实例引物之外，参见，例如，实施例2-3和序列表，对于个别物种或系统发育组的微生物体，也已经照惯例地设计了引物并且新的引物正在不断被设计。此类被狭窄靶向的引物可以与本文所描述的方法一起使用，从而仅特异性地筛选和/或鉴定感兴趣的微生物体。

用于制备和使用核酸引物的方法描述在例如Sambrook等(见Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSHL,New York,1989)，Ausubel等(编著)(见Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中。扩增引物对可以来源于已知的序列，例如通过使用预期用于这一目的的计算机程序诸如Primer(WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)获得。本领域普通技术人员将了解，具体探针或引物的特异性随着它的长度而增加。因此，例如，包含rRNA编码核苷酸或其侧接区域的30个连续核苷酸的引物将退火至具有比仅15个核苷酸的对应引物的特异性更高的特异性的靶标序列。因此，为了获得更高特异性，可以选择包含诸如16S rRNA的靶标核苷酸序列的至少20、25、30、35、40、45、50或更多个连续核苷酸的探针和引物。

用于制备可用于核酸应用(例如，PCR)的核酸的常见技术包括苯酚/氯仿提取或者使用在市场上可获得的许多DNA提取试剂盒中的一种。可以进行DNA扩增的另一种方式是通过将细胞直接添加至核酸扩增反应混合物中并且依靠扩增的变性步骤来裂解细胞和释放DNA。

核酸扩增反应的产物可以通过本领域中熟知的一种或多种标准技术来进一步表征，这些技术包括电泳、限制性核酸内切酶酶切图谱、寡核苷酸杂交或连接，和/或核酸测序。当杂交技术用于细胞鉴定目的时，多种探针标记方法可能是有用的，包括荧光标记法、放射性标记法和非放射性标记法。当使用核酸测序技术时，可以使用各种已知序列数据库进行经扩增核酸分子的核苷酸序列的同系物搜索，所述数据库包括但不限于DDBJ/GenBank/EMBL数据库。

b.基于蛋白质的分析：除了核酸的分析之外，还可以直接基于特定蛋白质的存在(或不存在)在分类学上表征和鉴定微生物体。此种分析可以是基于具体指定的蛋白质的活性，例如通过酶测定或通过共培养的生物体的反应，或通过具体指定的蛋白质的单独存在(其例如可以使用免疫学方法诸如原位免疫荧光抗体染色来测定)。

酶测定：举例来说，可以将荧光或发色底物类似物包括进生长培养基(例如，微量滴定板培养物)中，接着进行温育并针对反应产物进行筛选，从而基于它们的酶活性来鉴定培养物。

共培养反应：在本发明的一些实施方案中，可以基于共培养生物体(例如报告生物体)的反应(或反应程度)来测定由微生物分离株携带的酶的活性。

还可以使用多种方法通过使至少一种抗体或抗体来源分子结合至微生物体的分子或更具体地分子的表位来鉴定从源环境中选择和分离的微生物体。

抗微生物体蛋白质抗体可以使用描述于许多教科书中的标准程序来产生，所述教科书包括Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHL,New York,1988)。可以通过使用常规程序或通过修改常规程序来容易地确定特定试剂实质上仅结合至所需微生物体的蛋白质。一种合适的活体外测定利用了蛋白质印迹程序(描述于许多标准教科书中，包括Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHL,New York,1988))。

更短的抗体片段(抗体来源分子，例如FAb、Fv和单链Fv(SCFv))也可以用作特异性结合试剂。制备这些片段的方法是常规的。

与本发明阵列上的细胞结合的抗体的检测可以使用提供可检测的信号例如荧光或发光信号的标准技术，例如ELISA测定。

本发明的分离的培养物

如在本公开的实施例部分中更详细描述的，申请人已发现数种农业上有益的新型微生物体，例如，赤霉病病害的有效阻抑剂。具体地，这些新型拮抗微生物体对于降低赤霉病的严重性以及对于抑制小麦赤霉病病害的主要致病物禾谷镰刀菌的生长有效。从具有大约5,000个微生物菌株的库鉴定微生物拮抗剂，所述大约5,000个微生物菌株是从收集自美国不同地点的野生植物样品中获得的。基于在活体外拮抗测定中拮抗微生物体阻抑禾谷镰刀菌病原体及其有性型玉米赤霉菌的发育的能力，对该微生物体进行初步选择。然后，针对微生物菌株降低真菌感染的严重性的能力及针对它们维护种子产量的能力，在温室研究中在小麦幼苗上对所选择的微生物拮抗剂进行生物测定，其涉及给幼苗接种微生物菌株，接着重复接种禾谷镰刀菌孢子。发现以这种方式选择的拮抗微生物体在温室试验中有效地降低赤霉病的严重性。

分类学分析进一步确定本公开中描述的每种拮抗微生物体均是具有近亲缘关系的细菌的微杆菌属、细菌的芽孢杆菌属、细菌的贪噬菌属，或真菌的球腔菌属。

微杆菌属是微杆菌科的典型属，一般被认为提供革兰氏阳性、不形成孢子、呈杆状的细菌，其最初在产乳酸细菌的早期研究期间分离出来。微杆菌属成员最初的主要特征是它们的显著耐热性、存在于乳制品中，及从葡萄糖产生少量L(+)乳酸。与其中物种以相关肽聚糖类型为特征的微杆菌科的其他属相比，微杆菌属物种在肽间桥中或在B型肽聚糖的3位处具有鸟氨酸或赖氨酸。在诸如类异戊二烯醌(MK-11、MK-12、MK-13)、极性脂质、脂肪酸及DNA碱基组成的其他化学分类学性质中，该属的成员表现出在微杆菌科的其他属中发现的通常的多样性范围。微杆菌属和金杆菌属这两个细菌属可以根据一些分类学研究联系起来。迄今为止，微杆菌属的成员包含至少33个物种，它们已从包括土壤、乳制品、植物虫瘿、昆虫或临床标本在内的广泛范围的生境分离出来。Evtushenko和Takeuchi(2006)最近概述了它们的生态学、系统发育、分类学、培养方法和长期保存条件的各个方面。本领域技术人员将容易了解可以主要通过以下任一项技术在分类学上鉴定微杆菌属的微生物体：包括细胞壁肽聚糖的化学分类学分析在内的上文描述的分类学鉴定技术，及如Evtushenko和Takeuchi(2006)和其中引用的参考文献中描述的16S rDNA序列比较分析，以及本公开的实施例2-3中描述的那些。如下面详细论述的，迄今为止，数种天然产生的微生物体已被报道具有对抗赤霉病病害的拮抗活性。然而，在本发明之前没有描述具有此种拮抗活性的微杆菌属微生物体的报道。进一步地，在本发明之前，本发明人没有获悉使用微杆菌属细菌菌株作为生物防治剂来预防、抑制或治疗赤霉病病害的致病病原体的发育的任何方法或工艺。

芽孢杆菌属是革兰氏阳性/可变、形成孢子、呈杆状的细菌的属。与和微生物学早期历史相关的其他属诸如假单胞菌属或弧菌属类似，芽孢杆菌属的将近266个物种成员遍在地存在，并且它被广泛地认为是具有最大16S多样性和环境多样性的属之一。芽孢杆菌属物种可以是专性需氧菌或兼性厌氧菌，并且对过氧化氢酶测试呈阳性。芽孢杆菌属在自然界遍在地存在，既包括独立生存的物种，又包括病原物种。在应激的环境条件下，细胞产生可保持长时间休眠的椭圆形内生孢子。这些特征最初定义了该属，但是并非所有此类物种都具有近亲缘关系并且许多被转移至其他属。事实上，数项研究已试图重建该属的系统发育。覆盖有最大多样性的芽孢杆菌属特定研究由Xu和Cote[Intl.J.ofSyst.Evol.Microbiol.53(3):695-704;2003]使用16S和ITS区进行，在这里该属被分成10个组，包括嵌套(nested)的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短小芽孢杆菌属(Brevibacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、海洋芽孢杆菌属(Marinibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。然而，根据更新的研究，芽孢杆菌属含有非常大的数量的嵌套分类群且尤其在16S和23S中，它由于Bacillus coahuilensis和其他而被认为是乳杆菌目(乳杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、李斯特菌属等)的并系群(参见，例如，Yarda等，Syst.Appl.Microbiol.31(4):241-250,2008；Yarda等，Syst.Appl.Microbiol.33(6):291-299,2010]。在目前分类标准下由炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)形成的一个特定分支应当是单一物种(在97%的16S同一性内)，但是由于医学原因，它们被认为是分开的物种。除了本公开的实施例2-3中描述的分类学分析方法之外，芽孢杆菌属物种的系统发育和分类学分析还可以通过多种技术进行，所述技术包括在Xu和Cote,2003；Yarda等，2008；Yarda等，2010中详细论述的那些。

贪噬菌属最初是通过将争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)再分类为争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)(Willems等，1991)而创建的，争论贪噬菌被广泛地认为是这个属的典型物种。争论贪噬菌作为新型生物降解剂以及微生物/微生物相互作用和微生物/植物相互作用的模型得到广泛研究。其他物种包括V.dokdonensis、V.soli(Kim等，2006)和V.boronicumulans(Miwa等，2008)。贪噬菌属物种在分解代谢上是非常多样的并且与其他细菌物种以互利相互作用的方式参与许多生物降解，并因此具有生态重要性和高应用潜力。例如，土壤甲烷营养菌(soilmethanotroph)仅在与争论贪噬菌菌株一起共培养时才表现出对甲烷(非常强烈的温室气体)的高亲和力，并且这种性状在实验室培养物中通常观察不到。类似地，已发现贪噬菌属的近亲属为光合营养聚生体“聚生染绿菌(Chlorochromatium aggregatum)”内的核心非光合成伴侣。贪噬菌属的一些物种也具有干扰其他细菌通讯的能力。贪噬菌属的另一些其他物种可以与各种生态系统中的其他生物群(例如，植物)紧密地相互作用。而且，一些寄居于刚好在植物根部外面和/或在植物内的区域中的贪噬菌属物种已被报道能够经由以下方式促进植物生长：减少乙烯的水平、阻遏群体感应控制的发病机制，及增加对重金属的抵抗力，这些大大有利于植物修复。除了本公开的实施例2-3中描述的分类学分析方法之外，贪噬菌属物种的系统发育和分类学分析还可以通过包括本文其他地方详细论述的技术在内的多种技术进行。

球腔菌属是非常大的真菌属，具有超过2,000个物种名称和至少500个与多于40个无性型属(尤其尾孢菌属(Cercospora)、假尾孢菌属(Pseudocercospora)、壳针孢属(Septoria)、柱隔孢属(Ramularia)等)相关的物种。另外，数千个无性型缺乏有性型。球腔菌属包括作为病原体、污水生物、内生菌，或具有共生关系的物种。它们的生态学、系统发育、分类学、培养方法和长期保存条件的各个方面最近已被报道(参见，例如，Crous等，Persoonia,23:119-146,2009)。本领域技术人员将容易了解可通过上文描述的任何分类学技术或它们的组合在分类学上鉴定球腔菌属的微生物体。最常用的技术包括如在例如Crous等，Studies in Mycology, 55:235-253,2006；Crous等，2009，同上文；Goodwin等，Phytopathology 91: 648-658, 2001描述的使用16S rDNA序列和内转录间隔区的序列比较分析；及本公开的实施例2-3中描述的那些。

生物材料的保藏

已经依据用于专利程序的布达佩斯条约和其下的规定(布达佩斯条约)，将鉴定出具有对抗赤霉病病害的阻抑活性的纯化的微生物菌株培养物保藏于农业研究服务培养物保藏中心(位于1815N.University Street,Peoria,IL61604,USA)(NRRL)。这些保藏物的登录号如下：

SGI菌株号	登录号	暂时性分类
			SGI-005-G08	NRRL_-____	微杆菌属
SGI-010-H11	NRRL50471	球腔菌属
			SGI-014-C06	NRRLB-50470	微杆菌属
SGI-014-G01	NRRLB-50469	贪噬菌属
			SGI-015-F03	NRRLB-50760	芽孢杆菌属
SGI-015-H06	NRRLB-50761	芽孢杆菌属

微生物菌株已在下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物代表所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了主题申请的副本或其后续文本的国家，依据外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的可获得性并不构成对实施主题发明的许可，实施主题发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

本发明的优选微生物体具有所保藏菌株的所有识别特征，具体地，能够阻抑如本文所描述的赤霉病病害的发展的识别特征，以及阻抑如本文所描述的禾谷镰刀菌病原体及其有性型玉米赤霉菌的发育的识别特征。具体地，本发明的优选微生物体是指如上文所描述的保藏微生物体及其突变体。

微生物组合物

包含分离的微生物菌株或其培养物的本发明微生物组合物可以为多种形式，包括但不限于，静止培养物(still culture)，完整培养物(whole culture)，储存的细胞储液、菌丝体和/或菌丝的储液(特别是甘油储液)，琼脂条，储存的在甘油/水中的琼脂塞、冻干的储液，及干燥的储液诸如干燥到滤纸或谷物种子上的冻干物或菌丝体。如本文其他地方定义的，如本公开和本领域中使用的“分离的培养物”或语法等价形式应理解为意指所提到的培养物为培养流体、粒状物、刮屑(scraping)、干燥的样品、冻干物，或切片(例如，菌丝或菌丝体)；或含有单一类型的生物体的支持物、容器，或介质诸如板、纸、过滤器、基质、禾秆(straw)、移液器或移液器吸头、纤维、针、凝胶、棉签(swab)、管、小瓶、颗粒物等。在本发明中，分离的微生物拮抗剂培养物是不存在其他生物体的培养流体或刮屑、粒状物、干燥的制剂、冻干物，或所述微生物体的切片，或含有所述微生物体的支持物、容器或介质。

本公开进一步提供了含有至少一种本发明的分离的微生物菌株或其培养物及载体的组合物。该载体可以为赋予诸如增加的稳定性、润湿性、分散性等多种性质的许多载体中的任一种或多种。润湿剂可以包括在本发明组合物中，所述润湿剂诸如可为非离子表面活性剂或离子表面活性剂或其组合的天然或合成表面活性剂。油包水乳状液可用来调配包括至少一种本发明的分离的微生物体的组合物(参见，例如，美国专利第7,485,451号，其以引用的方式并入本文)。可制备的合适的制剂包括可湿性粉剂、颗粒剂、凝胶、琼脂条或小丸剂、增稠剂等；微囊颗粒等；液体，诸如水性流动剂(aqueous flowable)、水性混悬剂、油包水乳状液，等等。该制剂可包括谷物或豆类产品(例如，碾碎的谷物或豆类，来源于谷物或豆类的肉汤或面粉)、淀粉、糖或油。该载体可为农业载体。在某些优选实施方案中，该载体为种子，并且可将组合物施加或涂布到种子上或让组合物浸透种子。

在一些实施方案中，农业载体可为土壤或植物生长培养基。可使用的其他农业载体包括水、肥料、基于植物的油、湿润剂，或它们的组合。替代地，农业载体可为固体，诸如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳(seed case)、其他植物和动物产品，或包括颗粒剂、小丸剂，或混悬剂在内的组合。还考虑将任何前述成分的混合物作为载体，诸如但不限于，面团(pesta)(面粉和高岭土)、在壤土、砂或粘土中的基于琼脂或面粉的粒状物，等等。制剂可包括所培养生物体的食物源，诸如大麦，大米或其他生物材料诸如种子，植物部件，甘蔗渣，来自谷物加工的外壳或秸秆，碾碎的植物材料(例如“庭院废物”)或者来自建筑工地垃圾的木材，锯末或来自纸、植物或木材的再循环的小纤维。其他合适的制剂将是本领域技术人员已知的。

在液体形式，例如溶液或悬浮液中，微生物体可与水或水溶液混合或者悬浮在水或水溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水、水溶液、石油馏出物，或其他液体载体。

可通过将拮抗剂微生物体分散在适当切割的固体载体中和其上来制备固体组合物，所述固体载体诸如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、巴氏杀菌的土壤等。当此类制剂用作可湿性粉剂时，可使用生物上相容的分散剂诸如非离子型、阴离子型、两性或阳离子型分散剂和乳化剂。

在优选实施方案中，当以足够的量使用时，本文所考虑的组合物阻止赤霉病病害攻击植物，特别是谷类植物诸如小麦、大麦、燕麦和玉米，从而充当微生物拮抗剂。与其他生物防治剂类似，这些组合物具有高安全界限，因为它们通常不灼伤或损伤植物。

如贯穿本公开极详细描述的，赤霉病病害的防治可通过将一种或多种本发明的微生物组合物施加至寄主植物或寄主植物的部件上来实现。该组合物可以以相对于未经处理的对照有效降低赤霉病水平的量施加。活性组分以当施加至谷类植物上时足以抑制被靶向的植物病原体的植物病原体发育的浓度使用。如本领域技术人员将会了解的，有效浓度可随着此类因素变化，如：(a)植物或农业商品的类型；(b)植物或农业商品的生理状态；(c)影响植物或农业商品的病原体的浓度；(d)植物或农业商品上的病害损伤的类型；(e)天气状况(例如，温度、湿度)；及(f)植物病害的阶段。根据本发明，典型的浓度为高于1×10²CFU/mL载体的浓度。优选的浓度范围为约1×10⁴CFU/mL至约1×10⁹CFU/mL，诸如范围为1×10⁶CFU/mL至1×10⁸CFU/mL的浓度。更优选的浓度为约35mg至约150mg干微生物质量/克载体(干制剂)或者约35mg至约150mg干微生物质量/毫升载体(液体组合物)的浓度。在固体制剂中，则应该控制施加速率以使得每单位面积的植物组织表面的能存活细胞数量与通过前述的液体处理速率获得的数量相当。通常，当以超过10⁶CFU/g(菌落形成单位/克)，优选超过10⁷CFU/g，更优选10⁸CFU/g，最优选10⁹CFU/g的浓度递送时，本发明的生物防治剂是生物上有效的。

在一些实施方案中，一种或多种生物防治剂在本发明微生物组合物中的量可随着最终制剂以及所利用的植物或种子的大小或类型而变化。优选地，一种或多种生物防治剂在微生物组合物中以占整个制剂的约2%w/w/至约80%w/w的量存在。更优选地，组合物中采用的一种或多种生物防治剂以整个制剂的重量计为约5%w/w至约65%w/w，最优选约10%w/w至约60%w/w。

如本领域技术人员将会了解的，本发明微生物组合物可使用多种常规方法施加至小麦植物或其他谷类上，所述常规方法诸如撒粉、涂布、注入、涂擦、滚涂、浸泡、喷洒，或涂刷，或不显著损伤待处理的小麦植物或其他谷类的任何其他合适的技术。特别优选喷洒方法。

通常，本发明组合物在化学上是惰性的；因此它们与喷洒计划(spray schedule)中的基本上任何其他组分相容。它们还可以与生物相容的杀虫活性剂组合使用，所述杀虫活性剂例如除草剂，杀线虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂等。它们也可以与影响植物生长的物质诸如肥料、植物生长调节剂等组合使用，条件是此类化合物或物质是生物上相容的。

当以其市售制剂形式及由这些制剂制备的使用形式用作杀害虫剂或杀真菌剂时，根据本发明的活性微生物拮抗剂和组合物此外可以以与协作剂的混合物形式存在。协作剂为可增加活性组合物的活性的化合物，但添加到活性物中的协作剂本身不必具有活性。

当以其市售制剂形式及由这些制剂制备的使用形式用作杀害虫剂时，根据本发明的活性微生物拮抗剂和组合物此外可以以与抑制剂的混合物形式存在，所述抑制剂在施加后可减少活性组合物在植物生境中、在植物部件表面上或植物组织中的降解。

根据本发明的活性微生物拮抗剂和组合物，其本身或其制剂形式，也可以作为与已知杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂，杀害虫剂或它们的组合的混合物使用，例如以便加宽作用谱或者以这种方式阻止抗性的形成。在许多情况下，协同作用导致混合物的活性可超过单独组分的活性。还考虑了与其他已知活性化合物诸如肥料、生长调节剂、安全剂和/或化学信息素的混合物。

在本发明的优选实施方案中，组合物可进一步包括至少一种化学物或生物杀害虫剂。组合物中采用的至少一种化学物或生物杀害虫剂的量可随着最终制剂以及待处理的植物和种子的大小而变化。优选地，所采用的至少一种化学物或生物杀害虫剂为约0.1%w/w至约80%w/w，以整个制剂为基准。更优选地，所述至少一种化学物或生物杀害虫剂以约1%w/w至约60%w/w，最优选约10%w/w至约50%w/w的量存在。

多种杀害虫剂是本领域技术人员显而易见的并且可以使用这些杀害虫剂。示例性化学杀害虫剂包括属于氨基甲酸脂、有机磷酸酯、有机氯和拟除虫菊酯(prethroid)类别的那些。还包括化学防治剂诸如但不限于：苯菌灵(benomyl)、硼砂(borax)、敌菌丹(captafol)、克菌丹(captan)、百菌清(chorothalonil)、含有铜的制剂；含有二氯萘醌、氯硝胺(dicloran)、碘、锌的制剂；抑制麦角固醇生物合成的杀真菌剂，诸如但不限于灭瘟素(blastididin)、霜脲氰(cymoxanil)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)、氟硅唑(flusilazole)、灭菌丹(folpet)、抑霉唑(imazalil)、异菌脲(ipordione)、代森锰(maneb)、代森锰锌(manocozeb)、甲霜灵(metalaxyl)、氧化萎锈灵(oxycarboxin)、腈菌唑(myclobutanil)、氧四环素(oxytetracycline)、PCNB、五氯苯酚(pentachlorophenol)、咪鲜胺(prochloraz)、丙环唑(propiconazole)、灭螨猛(quinomethionate)、亚砷酸钠(sodium aresenite)、DNOC钠、次氯酸钠、苯基苯酚钠(sodiumphenylphenate)、链霉素、硫、戊唑醇(tebuconazole)、terbutrazole、噻苯咪唑(thiabendazolel)、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、三唑酮(triadimefon)、三环唑(tricyclazole)、嗪氨灵(triforine)、井冈霉素(validimycin)、乙烯菌核利(vinclozolin)、代森锌(zineb)，和福美锌(ziram)。多种杀昆虫化合物可用于本发明组合物中，包括但不限于美国专利申请第20110033432A1号中引用的那些。

本发明微生物组合物优选包括至少一种生物杀害虫剂。适合于本文使用并且可包括在根据本发明的微生物组合物中用于预防植物病原性病害的示例性生物杀害虫剂包括：微生物、动物、细菌、真菌、遗传物质、植物，及活生物体的天然产物。在这些组合物中，本发明微生物体在与另外的生物体一起调配之前被分离出来。例如，微生物诸如但不限于白粉寄生菌属(Ampelomyces)、短梗霉属(Aureobasidium)、芽孢杆菌属、白僵菌属(Beauveria)、念珠菌属(Candida)、毛壳菌属(Chaetomium)、虫草属(Cordyceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、德巴利氏酵母属(Dabaryomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、外瓶霉属(Exophilia)、胶枝霉属(Gliocladium)、马利亚霉属(Mariannaea)、拟青霉属(Paecilomyces)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、毕赤酵母属(Pichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、踝节菌属(Talaromyces)，及木霉属(Trichoderma)的物种可提供在含有本发明拮抗微生物体的组合物中，其中产气霉属(Muscodor)的真菌菌株是特别优选的。还特别优选根据本发明的微生物组合物与美国专利第7,518,040号、美国专利第7,601,346号、美国专利第6,312,940号中公开的微生物拮抗剂的组合使用。

还可与本发明的微生物拮抗剂和组合物组合在组合物中的真菌的实例包括而不限于，产气霉属物种、粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(“白毒蝇碱”)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、蜡叶芽枝霉(Chladosporium herbarum)、棒形虫草(Cordyceps clavulata)、Cordycepsentomorrhiza、Cordyceps facis、黑槌虫草(Cordyceps gracilis)、Cordycepsmelolanthae、蛹虫草(Cordyceps militaris)、蚁虫草(Cordyceps myrmecophila)、Cordyceps ravenelii、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、蜂头虫草(Cordycepssphecocephala)、Cordyceps subsessilis、单侧虫草(Cordycepsunilateralis)、变形虫草(Cordyceps variabilis)、Cordyceps washingtonensis、棒孢蚊霉(Culicinomyces clavosporus)、蝗噬虫霉(Entomophaga grylli)、舞毒蛾噬虫霉(Entomophaga maimaiga)、蝇虫霉(Entomophaga muscae)、Entomophaga praxibulli、菜蛾蝇霉(Entomophthora plutellae)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)、桔形被毛孢(Hirsutella citriformis)、汤普松被毛孢(Hirsutella thompsoni)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)(“绿毒蝇碱”)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flaviride)、白色产气霉(Muscodor albus)、Neozygitesfloridana、莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)、粉拟青霉(Paecilomyces farinosus)、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)、柱胞弯颈霉(Tolypocladium cylindrosporum)、蜡蚧轮枝孢(Verticillium lecanii)、根虫瘟霉(Zoophthora radicans)，及菌根(mycorrhizal)物种诸如双色蜡蘑(Laccaria bicolor)。其他真菌类杀害虫(mycopesticidal)物种将是本领域技术人员显而易见的。

本发明还提供了处理植物的方法，该方法通过将有效量的多种惯用制剂中的任一种施加至土壤上(即施加在犁沟内(in-furrow))、施加至植物的部分上(即灌注(drench))，或者在种植前施加在种子上(即种子包衣或拌种)进行。惯用制剂包括溶液、可乳化浓缩物、可湿性粉剂、悬浮液浓缩物，可溶性粉剂、颗粒剂、悬浮液-乳状液浓缩物、用活性化合物浸润过的天然和合成材料，及由聚合物物质制成的非常精细的控释胶囊。在本发明的某些实施方案中，生物防治组合物被调配成以即用型制剂形式获得的粉末或使用时混合在一起的粉末。在任一实施方案中，可在种植前或种植时将该粉末与土壤混合在一起。在替代实施方案中，生物防治剂或昆虫防治剂中的任一者或二者为液体制剂，其在处理时被混合在一起。本领域普通技术人员理解，本发明组合物的有效量取决于组合物的最终制剂以及待处理植物的大小或待处理种子的大小。

根据最终制剂和施加方法，还可将一种或多种合适的添加剂引入到本发明组合物中。可将粘合剂诸如羧甲基纤维素及粉末形式、颗粒形式或乳胶形式的天然和合成聚合物，诸如阿拉伯胶、甲壳质、聚乙烯醇和聚醋酸乙酸酯，以及天然磷脂诸如脑磷脂和卵磷脂，以及合成磷脂添加到本发明组合物中。

在优选的实施方案中，微生物组合物被调配成单一的稳定溶液或乳状液或悬浮液。就溶液而言，在加入生物防治剂之前通常将活性化合物(即昆虫防治剂)溶解于溶剂中。合适的液体溶剂包括石油基芳香族化合物，诸如二甲苯、甲苯或烷基萘；脂肪烃，诸如环己烷或石蜡，例如石油馏分、矿物和植物油；醇，诸如丁醇或甘醇及其醚和酯；酮，诸如甲乙酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂诸如二甲基甲酰胺和二甲亚砜。就乳状液或悬浮液而言，液体介质为水。在一个实施方案中，将化学防治剂和生物防治剂悬浮在单独的液体内，并在施加时予以混合。在悬浮液的优选实施方案中，将昆虫防治剂和生物防治剂组合在具有至少两年保质期的即用型制剂中。在使用时，该液体可以作为雾化喷洒剂喷洒或施加在叶面上，或者在种植作物时喷洒或施加在犁沟内。可利用本领域已知的多种技术将液体组合物在种子发芽前引入到土壤中，或者直接引入到与根部接触的土壤中，所述多种技术包括但不限于，滴灌、喷灌(sprinkler)、土壤注入或土壤灌注。

任选地，可加入稳定剂和缓冲剂，包括碱金属和碱土金属盐及有机酸诸如柠檬酸和抗坏血酸，无机酸诸如盐酸或硫酸。还可加入杀生物剂，该杀生物剂可包括甲醛或甲醛释放剂及苯甲酸衍生物诸如对羟基苯甲酸。

种子包衣制剂

在一些特别优选的实施方案中，本发明的生物防治组合物被调配成种子处理剂。该种子处理剂优选包含至少一种昆虫防治剂和至少一种生物防治剂。考虑了通过使用专门设计和制造用于准确、安全且高效地将种子处理产品施加至种子上的处理剂施加装备，使用常规的混合、喷洒方法或其组合，在种子上基本均匀地涂布一层或多层本文所公开的生物防治组合物。此种装备使用各种类型的涂布技术诸如旋转涂布机、滚筒式涂布机、流化床技术、喷射床、旋转薄雾(rotary mist)或它们的组合。液体种子处理剂诸如本发明的那些可经由旋转“雾化器”盘或喷嘴施加，所述旋转“雾化器”盘或喷嘴在种子处理剂移到通过喷洒模块(spray pattern)时将该种子处理剂均匀地分配到种子上。优选地，然后将种子再混合或翻滚一段时间以获得另外的处理剂分配和干燥。种子在用本发明组合物包衣之前可进行预处理或不进行预处理以便增加发芽和出苗的均匀性。在替代实施方案中，可将干粉末制剂计量添加到移动的种子上，并让其混合至完全分配为止。

本发明的另一方面提供了用主题微生物组合物处理的种子。一个实施方案提供了至少一部分表面区域涂布有根据本发明的微生物组合物的种子。在具体实施方案中，经微生物体处理的种子的孢子浓度或微生物细胞浓度为约10⁶至约10⁹个/粒种子。该种子每粒种子还可具有更多个孢子或微生物细胞，诸如，例如每粒种子具有10¹⁰、10¹¹或10¹²个孢子。微生物孢子和/或细胞可以游离地涂布到种子上，或者优选地，它们在涂布到种子上之前可被调配成液体或固体组合物。例如，包含微生物体的固体组合物可通过将固体载体与孢子悬浮液混合在一起直至固体载体被孢子或细胞悬浮液浸润来制备。然后可干燥这种混合物从而获得所需的颗粒物。

在一些其他实施方案中，考虑了本发明的固体或液体生物防治组合物进一步含有能够保护种子免受选择性除草剂的有害影响的功能性试剂，诸如活性炭、营养素(肥料)及其他能够改善发芽和产品质量或其组合的试剂。

当通过加入本发明的实施方案之一进行修饰时，本领域已知的种子包衣方法和组合物可能特别有用。此类包衣方法及用于其应用的设备公开在例如美国专利第5,918,413号、第5,554,445号、第5,389,399号、第4,759,945号和第4,465,017号中。各种种子包衣组合物公开在例如美国专利申请第US20110033432号、第US20100154299号，美国专利第5,939,356号、第5,876,739号、第5,849,320号、第5,791,084号、第5,661,103号、第5,580,544号、第5,328,942号、第4,735,015号、第4,634,587号、第4,372,080号、第4,339,456号和第4,245,432号等中。

可将多种添加剂加入到包含本发明组合物的种子处理制剂中。可加入粘结剂，其包括优选由粘合聚合物构成的那些，所述粘合聚合物可为不会对待包衣种子产生毒害植物的影响的天然或合成的粘合聚合物。粘结剂可选自聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；乙烯醋酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯基吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐和壳聚糖；脂肪；油；蛋白质，包括明胶和玉米醇溶蛋白；阿拉伯胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚乙烯基丙烯酸酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体；及聚氯丁烯。

可采用多种着色剂中的任一种，包括分类为亚硝基、硝基的有机发色团；偶氮基，包括单偶氮基、双偶氮基或多偶氮基；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯甲烷、吲达胺、靛酚、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、氧杂蒽。可加入的其他添加剂包括微量营养素诸如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌盐。可运用聚合物或其他灰尘控制剂使处理剂保留在种子表面上。

在一些具体实施方案中，除了微生物细胞或孢子之外，包衣还可进一步包含粘着剂层。粘着剂应当无毒、可生物降解且可粘合。此类材料的实例包括但不限于，聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，诸如甲基纤维素、羟甲基纤维素，及羟甲基丙基纤维素；糊精；藻酸盐；糖；糖蜜；聚乙烯基吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯胶；明胶；糖浆；及淀粉。更多的实例可见于例如美国专利第7,213,367号和美国专利申请第US20100189693号。

各种添加剂，诸如粘着剂、分散剂、表面活性剂，及营养素和缓冲液成分也可以包括在种子处理制剂中。其他常规种子处理添加剂包括但不限于，包衣剂、润湿剂、缓冲剂和多糖。可在种子处理制剂中添加至少一种农业上可接受的载体，诸如水、固体或干粉末。干粉末可来源于多种材料诸如碳酸钙、石膏、蛭石、滑石、腐殖质、活性炭，和各种磷化合物。

在一些实施方案中，种子包衣组合物可包含至少一种填料，该填料为有机或无机、天然或合成的组分，其与活性组分组合从而使种子包衣组合物容易施加至种子上。优选地，填料为惰性固体诸如粘土、天然或合成的硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)，天然土壤矿物质诸如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、硅镁土、蒙脱土、膨润土或硅藻土，或合成的矿物，诸如二氧化硅、氧化铝或硅酸盐，具体地，硅酸铝或硅酸镁。

种子处理制剂可进一步包括一种或多种以下成分：其他杀害虫剂，包括仅在地下起作用的化合物；杀真菌剂，诸如克菌丹(captan)、福美双(thiram)、甲霜灵(metalaxyl)、咯菌腈(fludioxonil)、恶霜灵(oxadixyl)，及这些物质中的每一种的异构体等等；除草剂，包括选自草甘膦(glyphosate)、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙酰胺、三嗪、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、含苯氧基化合物(phenoxys)、尿素和苯甲酸的化合物；除草剂安全剂诸如苯并噁嗪，二苯甲基衍生物、Ν,Ν-二烯丙基二氯乙酰胺，各种二卤酰基(dihaloacyl)、噁唑烷基和噻唑烷基化合物，乙酮(ethanone)，萘酐化合物和肟衍生物；肥料；及生物防治剂诸如来自以下的其他天然产生或重组的细菌和真菌：根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、木霉属(Trichoderma)、球囊霉属(Glomus)、胶枝霉属(Gliocladium)和菌根真菌(mycorrhizal fungi)。这些成分可作为单独的层添加在种子上，或者替代地可以作为本发明种子包衣组合物的一部分添加。

优选地，种子处理剂中使用的新型组合物和其他成分的量不能抑制种子发芽或者对种子产生毒害植物的损害。

经微生物体处理的种子还可以进一步包裹有膜外覆层以保护包衣。此类外覆层是本领域中已知的并且可使用流化床和滚筒式膜涂布技术施加。

原则上，可根据本发明处理能够发芽从而形成易受线虫和/或病原真菌攻击的植物的任何植物种子。合适的种子包括谷类、咖啡、油菜作物、纤维作物、花卉、水果、豆类、油料作物、树、块茎作物、蔬菜，以及其他单子叶和双子叶植物物种的种子。优选地，对作物种子进行包衣，该作物种子包括但不限于豆、胡萝卜、玉米、棉花、草、莴苣、花生、辣椒(pepper)、马铃薯、油菜籽、稻、黑麦、高粱、大豆、甜菜、向日葵、烟草，和番茄种子。最优选地，用本发明组合物对大麦或小麦(春小麦或冬小麦)种子进行包衣。

还在本发明的另一方面提供了通过将本发明的内生微生物人工引入到不含内生微生物体的谷类植物中来创建的新型谷类植物。在这个方面的一些实施方案中，引入到谷类植物中的内生微生物可以为具有对抗赤霉病病害或赤霉病病害致病物的阻抑活性的内生拮抗剂。此外，引入到谷类植物中的内生拮抗剂可为真菌菌株SGI-010-H11。先前被发现能有效地将内生微生物引入到谷类禾草物种中的多种方法是本领域中已知的。此类方法的实例包括美国专利申请第20030195117A1号、美国专利申请第20010032343A1号和美国专利第7,084,331号等中描述的那些。对于本领域技术人员显而易见的，许多前述方法可用于制备本发明的新型谷类植物。

在人工感染后，优选通过PCR扩增分离的内生拮抗剂的DNA，并通过执行所扩增DNA的同源性搜索来证实该拮抗剂。进一步地优选将表达可鉴定标识物(identifiable means)的外源基因引入到上述内生拮抗剂中，并使用该外源基因通过上述可鉴定标识物证实感染植物的上述内生拮抗剂的定殖的存在。

制备根据本发明的生物防治组合物

可使用本领域中已知的标准静态干燥和液体发酵技术制备用在本发明生物防治组合物中的微生物拮抗剂培养物。生长通常在生物反应器中实现。

生物反应器是指支持生物活性环境的任何装置或系统。如本文所描述的，生物反应器是包括本发明微生物拮抗剂在内的微生物体可在其中生长的器皿。生物反应器可以为用于使微生物体生长的任何合适的形状或尺寸。生物反应器的大小和规模可在10mL至10升至10立方米的范围内，并且可由不锈钢或如本领域中已知和使用的任何其他合适的材料制成。生物反应器可为分批式生物反应器，分批补料式或连续式生物反应器(例如连续搅拌反应器)。例如，生物反应器可为如微生物学领域中已知并用于使细菌生长和收获细菌的恒化器。生物反应器可获自任何商业供应商(还可参见Bioreactor System Design,Asenjo&Merchuk,CRC Press,1995)。

对于小规模的操作，分批式生物反应器可，例如，用于测试和开发新工艺，以及用于不能转化成连续操作的工艺。

可使在生物反应器中生长的微生物体悬浮或固定化。在生物反应器中的生长一般在需氧条件下在适合于生长的温度和pH下进行。对于本发明的生物体，细胞生长可在介于5℃与37℃之间的温度下实现，优选的温度在15℃至30℃、15℃至28℃、20℃至30℃，或15℃至25℃的范围内。营养培养基的pH可在4.0与9.0之间变化，但是优选的操作范围通常是pH4.0至7.0，或4.5至6.5，或pH5.0至6.0的弱酸性至中性。通常，最大细胞产量在接种后的20-72小时获得。

用于培养本发明拮抗剂的最优条件将当然取决于具体菌株。然而，根据选择过程中运用的条件和大多数微生物体的一般要求，本领域普通技术人员将能够确定必需的营养素和条件。微生物拮抗剂将通常在培养基上的需氧液体培养物中生长，所述培养基含有可被微生物体同化并且支持细胞高效生长的碳源、氮源和无机盐源。优选的碳源为己糖诸如葡萄糖，但是容易被同化的其他源诸如氨基酸也可替代使用。可以使用许多无机材料和蛋白质材料作为生长过程中的氮源。优选的氮源是氨基酸和尿素，但是其他氮源包括气态氨、硝酸根与铵的无机盐、维生素、嘌呤、嘧啶、酵母提取物、牛肉提取物、示蛋白胨(proteosepeptone)、大豆粕、酪蛋白的水解产物、酒槽可溶物(distiller's solubles)等。在可掺入到营养培养基中的无机矿物中是能够产生钙、锌、铁、锰、镁、铜、钴、钾、钠、钼酸根、磷酸根、硫酸根、氯离子、硼酸根等离子的惯用盐。优选针对真菌拮抗剂使用马铃薯葡萄糖液体培养基并且针对细菌菌株使用R2A肉汤预混料，但不局限于此。

贯穿本公开，提及并以引用方式并入各种信息源。信息源包括例如科学期刊文章、专利文件、教科书和万维网浏览器不活动页面地址。提及此类信息源仅仅是为了提供在申请时本领域的一般状态的指示。尽管本领域的技术人员可依靠并利用每一个信息源的内容和教导来制造和使用本发明的实施方案，但是特定信息源中的任何论述和评论绝不应视为承认此种评论被广泛公认为该领域的一般性意见。

本文给出的一般方法的论述意图仅用于说明目的。本领域技术人员在回顾本公开后将明了其他替代方法和实施方案，它们将包括在本申请的精神和范围内。

还应理解，提供以下实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。

实施例

实施例1：能够阻抑赤霉病病害的致病物禾谷镰刀菌和玉米赤霉菌的发育的拮抗 微生物体的发现。

本实施例描述了收集和筛选候选微生物体的高通量工艺，该工艺已由SyntheticGenomics,Inc.内部开发用于分离具有对抗赤霉病病害的致病物，特别是对抗禾谷镰刀菌的阻抑活性的微生物体菌株。新型微生物拮抗菌株是从收集自美国各地数个地点的植物组织样品中分离的。细菌菌株SGI-014-C06、SGI-014-G01、SGI-015-F03和SGI-015-H06是从收集自Julian,CA附近的EaglePeak Preserve的植物根部组织中分离的。真菌菌株SGI-010-H11和细菌菌株SGI-005-G08是从收集自San Elijo Lagoon,Encinitas,CA的两种不同植物样品的茎部组织中分离的。

如下分离微生物体。为进行细菌菌株分离，超声处理植物根部组织，并将其在2×YT(酵母提取物和胰蛋白胨)和无氮琼脂培养基平板上连续稀释。然后基于形态特征选择各个菌落，并在液体肉汤培养基中予以单独地培养。为进行真菌分离，首先通过将植物组织浸入70%乙醇中并使其短暂地从火焰上穿过来对该植物组织进行表面灭菌。然后剖取组织并放在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，接着在室温下温育。当观察到菌丝体生长时，将菌丝体生长的区段转移至另一个PDA平板中。对微生物体菌株加以分离，纯化，对于细菌菌株在-80℃下保存在15%甘油中，而对于真菌菌株在-80℃下保存在干燥的大麦种子上。

此后，在活体外拮抗作用测试中测定如上所述的那样分离的微生物体菌株阻抑禾谷镰刀菌的菌丝体生长的能力，该测试在含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)生长培养基的琼脂平板中根据美国专利申请第US20120107915A1号中描述的高通量筛选程序并稍作修改来执行，该美国专利申请以引用的方式并入本文。简言之，分离的微生物体菌株在使用前在五分之一强度胰蛋白酶大豆肉汤琼脂(TSBA/5)上生长24小时。通过将菌丝尖端从活跃生长的真菌菌落中移出并将菌丝束转移至PDA琼脂培养基中来制取禾谷镰刀菌NRRL-5883的分生孢子接种物。在将平板在12h/天光周期下于25℃温育7天后，使用弱磷酸盐缓冲液(0.004%磷酸盐缓冲液，pH7.2，含有0.019%MgCl₂)从PDA平板上洗去分生孢子。然后立即将禾谷镰刀菌分生孢子在弱磷酸盐缓冲液中的悬浮液(1×10⁵个分生孢子/ml)散布在琼脂表面上，并然后将平板在25℃下温育48-72小时。为了启动拮抗作用测试，将分离的微生物菌株的细胞以相等的间距点接种在平板的周边内。五天后，当缺少菌丝体生长的清晰可见的区域存在于微生物菌落的周边的周围时，菌株被评分为抗生作用阳性。

分离出超过4,000个微生物菌株并通过上述程序对它们进行测定。在这些当中，六个菌株被发现显著阻抑PDA培养基上禾谷镰刀菌NRRL-5883的菌丝体生长。这些新微生物拮抗剂被鉴定为SGI-005-G08、SGI-010-H11、SGI-014-C06、SGI-014-G01、SGI-015-F03，和SGI-015-H06。

还针对阻抑真菌病原体玉米赤霉菌的生长的能力对新微生物拮抗剂进行拮抗作用测试，所述玉米赤霉菌是禾谷镰刀菌的有性型物种。所有程序与上面描述的那些相同，不同的是在这个测定中测试的病原体菌株是真菌玉米赤霉菌的病原菌株。在这六种微生物拮抗剂中，四个菌株SGI-010-H11、SGI-014-C06、SGI-015-F03和SGI-015-H06被发现显著阻抑玉米赤霉菌的菌丝体生长。

实施例2：DNA提取、测序和分类学

真菌细胞裂解和获取ITS-5.8S rDNA序列信息

将真菌生物质转移至含有50μl2×裂解缓冲液(100mM Tris HCL，pH8.0，2mMEDTA，pH8.0，1%SDS，400μg/ml蛋白酶K)的96-孔PCR微板中。裂解条件如下：55℃持续60分钟、94℃持续4分钟。裂解产物的等分试样用作用于PCR扩增的模板DNA来源。使用两个引物M13-ITS1(SEQ ID NO:15)和ITS4M13加尾(SEQ ID NO:16)经由PCR对ITS-5.8S rDNA序列进行扩增。

对于ITS-5.8S rDNA区域的扩增，每种PCR混合物被制备成20-μl最终体积的反应物，其含有4μl真菌裂解反应物、0.2μΜ的每种引物(ITS1/ITS4)、6%Tween-20和10μl2×ImmoMix(Bioline USA Inc,Taunton,MA)。PCR条件如下：94℃持续10分钟；94℃持续30秒、52℃持续30秒、72℃持续75秒，进行30个循环；72℃持续10分钟。取2-μl PCR产物等分试样在1.0%琼脂糖凝胶上电泳以证实预期大小的单一条带。阳性条带被送出用于在正向和反向上使用M13引物的Sanger测序。真菌菌株SGI-010-H11的5.8S基因间区(ITS)的序列作为SEQID NO:11提供在序列表中。使用DDBJ/GenBank/EMBL数据库对所确定的5.8S基因间区(ITS)的核苷酸序列进行同源性搜索。随后，使用ClustalW系统发育树构建程序，在本文所描述的分离的真菌拮抗剂SGI-010-H11、与分离的真菌拮抗剂SGI-010-H11展现高序列同源性的属和物种的微生物体，以及其他种类繁多的微生物体属和物种之间，分析5.8S基因间区(ITS)的核苷酸序列的系统发育关系。真菌菌株SGI-010-H11被认为与球腔菌科有亲缘关系，根据它的ITS-5.8S rDNA序列与点状球腔菌(Mycosphaerella punctiformis)(GenBankEU343182)和草地柱隔孢原变种(Ramularia pratensis)(GenBank EU019284)的那些具有～97%的相似性，它的5.8S ITS序列与球腔菌科表现出明显的亲缘关系。

细菌细胞裂解和获取16S rRNA序列信息

将20-μl细胞悬浮液等分试样转移至96孔PCR平板中，该平板中含有20μl2×裂解缓冲液(100mM Tris HCL，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0，1%SDS，400μg/ml蛋白酶K)。裂解条件如下：55℃持续30分钟、94℃持续4分钟。裂解产物的等分试样用作用于PCR扩增的模板DNA来源。使用M13-27F(SEQ ID NO:17)和1492R M13-加尾(SEQ ID NO:18)引物经由PCR对16SrRNA序列进行扩增。

为进行16S rRNA区域的扩增，每种PCR混合物被制备成20-μl最终体积的反应物：其含有4μl细菌裂解反应物、2μΜ的每种引物(27F/1492R)、6%Tween-20和10μl2×ImmoMix(Bioline USA Inc.Taunton,MA)。PCR条件如下：94℃持续10分钟；94℃持续30秒、52℃持续30秒、72℃持续75秒，进行30个循环；72℃持续10分钟。取2-μl PCR产物等分试样在1.0%琼脂糖凝胶上电泳以证实预期大小的单一条带。阳性条带被送出用于在正向和反向上使用M13引物的Sanger测序。细菌菌株SGI-014-C06、SGI-005-G08、SGI-014-G01、SGI-015-F03和SGI-015-H06的16S rRNA的序列的长度大约为1.4-Kb，并且它们分别作为SEQ ID NO:1、10、12、13和14提供在序列表中。使用DDBJ/GenBank/EMBL数据库对所确定的核苷酸序列进行同源性搜索。随后，使用ClustalW系统发育树构建程序，在本文所描述的分离的细菌拮抗剂、与分离的细菌拮抗剂展现高序列同源性的属和物种的细菌，以及其他种类繁多的细菌属和物种之间，分析16rRNA基因的核苷酸序列的系统发育关系。还使用GenomeQuest^TM软件(Gene-IT,Worcester Mass.USA)确定序列同一性和相似性。序列分析结果揭示细菌分离株SGI-014-G01可被认为与贪噬菌属有亲缘关系，根据它的16S rRNA序列与包括贪噬菌属R-21938(GenBank AJ786799)和争论贪噬菌(GenBank GU186109)在内的数个贪噬菌属物种的那些具有～99%的相似性，它的16S rRNA序列与贪噬菌属表现出近亲缘关系。进一步地，序列分析结果还揭示SGI-015-F03和SGI-015-H06这两个细菌分离株可被认为与芽孢杆菌科有亲缘关系，根据它们各自的16S序列与数个芽孢杆菌属某些种的那些具有>99%的相似性。

序列分析结果揭示SGI-014-C06和SGI-055-G08这两个细菌分离株可以被认为与微杆菌科有亲缘关系，根据它们各自的16S序列与数个微杆菌属物种的那些具有>99%的相似性。值得注意的是，SGI-014-C06(SEQ ID NO:1)的16S rRNA基因的1430-nt序列在其整个1430-nt长度上与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)菌株DSM20578和数个其他微杆菌属菌株(例如，GenBank序列Y17227.1、FJ200406、EU086800和EU714335)的16S rRNA基因相同。

具体地，在如实施例1中所描述的那样分离并针对阻抑镰刀菌发育的能力在拮抗作用测定中进行测试的成千上万个微生物菌株当中，基于16S序列与已知微杆菌属某些种的那些的序列相似性，总共88个菌株随后被鉴定为微杆菌属物种。然而，申请人已发现SGI-014-C06和SGI-055-G08是仅有的两个具有对抗禾谷镰刀菌的阻抑活性的微杆菌属菌株。迄今为止，如上文所论述的，数个天然产生的微生物已被报道具有对抗赤霉病病害的拮抗活性。然而，在本发明之前没有描述具有此种拮抗活性的微杆菌属微生物体的报道。进一步地，在本发明之前，本发明人没有获悉使用微杆菌属细菌菌株作为生物防治剂来预防、抑制或治疗赤霉病病害的致病病原体的发育的任何方法或工艺。

实施例3：分离株SGI-014-C06的管家基因的序列分析

Richert等(Syst.Appl.Microbiol.30:102-108,2007)最近报道了来自微杆菌属的27个物种的数个管家基因的系统发育研究。该研究的结论是，尽管用于系统分类学的16SrRNA序列分析的优点是无法超越的，但是只强调单一分类学参数不能指导系统性总结。如上面所公开的，SGI-014-C06(SEQ NO:1)的16S rRNA基因的核苷酸序列与数个微杆菌属菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列相同，包括纳入在Richert等(2007)研究中的氧化微杆菌菌株DSM20578(GenBank Accession Y17227.1)的16S rRNA基因的核苷酸序列。申请人继续对分离株SGI-014-C06的四个管家基因进行系统发育分析，所述的四个管家基因为DNA旋转酶亚基B(gyrB)、RNA-聚合酶亚基B(rpoB)、重组酶A(recA)和聚磷酸盐激酶(ppk)。为此，通过使用PCT专利申请第WO2010115156A2号中描述的程序对分离株SGI-014-C06的整个基因组进行鸟枪法测序、组装和注释。从新鲜的SGI-014-C06培养物制备基因组DNA。细胞沉淀用于高分子量DNA提取，其使用来自MO BIO Laboratories,Inc.的Mega SoilDNA Isolation Kit(Cat.No12900-10)根据制造商建议的方案进行。然后制备SGI-014-C06的基因组DNA用于鸟枪法454-焦磷酸测序。使用基因组DNA(7.5μg)根据用于单一长读数(single long reads)的建议方案(454Life Sciences)构建文库。通过运行两次GS FLXTitanium系列测序产生序列。

分离株SGI-014-C06的四个管家基因gyrB、rpoB、recA和ppk的序列提供在序列表中。使用DDBJ/GenBank/EMBL数据库对所确定的核苷酸序列进行同源性搜索。还使用GenomeQuest^TM软件(Gene-IT,Worcester Mass.USA)确定序列同一性和相似性。如下面所详细论述的，管家基因的序列分析结果揭示本公开中描述的分离株SGI-014-C06是新型细菌菌株并且可被认为与微杆菌科有亲缘关系。

SGI-014-C06的gyrB基因的多核苷酸序列与GenBank登录号为AP012052的砖红色微杆菌(Microbacterium testaceum)的gyrB基因具有最高的序列同一性(在936/2172核苷酸比对上82.69%)。当与氧化微杆菌菌株DSM20578(GenBank AM181493；Richert等，2007)的gyrB基因相比较时，这两个基因的序列同源性在核苷酸水平上为～62%相同，在氨基酸水平上为～37%相同。

SGI-014-C06的rpoB基因的多核苷酸序列与GeneBank登录号为AM181582的Microbacterium maritypicum的rpoB基因具有最高的序列同一性(在1093/3504核苷酸比对上96.98%)。当与氧化微杆菌菌株DSM20578(GenBank AM181583；Richert等，2007)的rpoB基因相比较时，这两个基因之间的序列同源性在核苷酸水平上为～96%相同，在氨基酸水平上为99%相同。

SGI-014-C06的recA基因的多核苷酸序列与GeneBank登录号为AP012052的砖红色微杆菌的recA基因具有最高的序列同一性(在962/1188核苷酸比对上85.45%)。当与氧化微杆菌菌株DSM20578(GenBank AM181527；Richert等，2007)的recA基因相比较时，这两个基因之间的序列同源性在核苷酸水平上为～92%相同，在氨基酸水平上为100%相同。

SGI-014-C06的ppk基因的多核苷酸序列与GenBank登录号为AM181554的微黄微杆菌(Microbacterium luteolum)的ppk基因具有最高的序列同一性(在1380/2175核苷酸比对上91.38%)。当与氧化微杆菌菌株DSM20578(GenBankAM181556；Richert等，2007)的ppk基因相比较时，这两个基因之间的序列同源性在核苷酸水平上为～91%相同，在氨基酸水平上为～98%相同。

实施例4：使用微生物拮抗剂微杆菌属(NRRL B-50470)、球腔菌属(NRRL50471)和 贪噬菌属(NRRL B-50469)保护小麦免受禾谷镰刀菌感染

通过基于植物的生物测定进一步评价在实施例1中描述的拮抗作用筛选中被发现抗生作用呈阳性的微生物菌株，在该基于植物的生物测定中，将微生物菌株的细胞直接施加到易感谷类栽培品种的种子上，接着接种禾谷镰刀菌的分生孢子。让微生物菌株生长至足够的浊度并且将其稀释在水中。将易感小麦栽培品种(Hank;WestBred LLC,Bozeman,MT)的2克小麦种子播入含有巴氏杀菌的土壤介质的1升盆中。播入后，将20mL微生物培养物稀释液转移至所播入的种子的顶部。让小麦种子在温室条件下在具有14小时光周期的荧光照明下发芽。在小麦开始开花时，通过喷洒禾谷镰刀菌NRRL5883分生孢子来攻击小麦头部。通过如下方式从五日龄PDA平板收获分生孢子：在平板上倒入含有0.01%Tween20的水并将孢子刮入悬浮液中。喷洒孢子后，将小麦植物转移至具有100%湿度的薄雾室中三天从而允许感染。该处理为：

1.未经处理：无微生物或化学杀真菌剂处理+镰刀菌攻击。

2.未感染：无微生物或化学杀真菌剂处理、无镰刀菌攻击。

3.SGI-010-H11：真菌处理+镰刀菌攻击。

4.SGI-014-G01：细菌处理+镰刀菌攻击。

5.SGI-014-C06：细菌处理+镰刀菌攻击。

感染后20天，停止浇水并让小麦植物干燥三周，然后收获。收获并收集各个小麦头部。针对显示出赤霉病病害症状的每个头部确定病害严重性。病害严重性由患病小穗的数目除以每个头部的小穗总数目来计算。结果(表2)揭示用所测试的三种微生物拮抗剂SGI-014-C06(NRRL B-50470)、SGI-010-H11(NRRL50471)和SGI-014-G01(NRRL B-50469)中的每一种处理的小麦植物与在相同条件下生长的“未经处理”的对照相比较具有显著较低的禾谷镰刀菌侵染的严重性和发病率(P<0.05)。

手工收获来自每个头部的种子并称量种子质量。计算在每种处理中每只盆的平均种子重量。如表3中所报告的，发现每种微生物拮抗剂均显著降低由赤霉病侵染引起的产量损失。

表2.微生物拮抗剂在降低小麦的赤霉病发病率方面的功效。

处理	严重性百分比(%)	标准差	P值
				未感染	1.30	0.0025	<.0001
未经处理	15.46	0.0364	NA
				SGI-010-H11	7.42	0.0219	0.0005
SGI-014-G01	6.59	0.0315	0.0001
				SGI-014-C06	7.21	0.0225	0.0004

表3.微生物拮抗剂在维护患有赤霉病病害的小麦植物的种子产量方面的功效。

处理	种子质量(g)	P值
			未感染	0.8438±0.1633	0.0191
未经处理	0.4669±0.1209	NA
			SGI-010-H11	0.6200±0.1844	0.7025
SGI-014-G01	0.7963±0.2032	0.5277
			SGI-014-C06	0.6744±0.0948	0.0551

实施例5：小麦幼苗上的微生物拮抗剂对禾谷镰刀菌的生长抑制

针对降低小麦上赤霉病发病率的能力，进一步调查在拮抗作用平板测定中被发现具有对抗禾谷镰刀菌的阻抑活性的微生物菌株。将易感小麦栽培品种(Hank;WestBredLLC,Bozeman,MT)的种子播入1升盆中，每只盆均在20cm直径的塑料盆中含有巴氏杀菌的土壤介质。如下制备微生物细胞悬浮液。从分离株甘油储液或划线平板接种2YT，或类似生长培养基、肉汤培养物。通常，在生长室、温室或田地中使用之前启动培养物48-72小时，从而让培养物达到晚期指数期。进一步提前启动具有较长倍增时间的分离株。在30℃下在旋转式摇床上以200rpm温育培养物。在生长后，在4℃以10,000x g使细胞沉淀15min，并将其重悬在10mM MgSO₄缓冲液(pH7.0)中。在CFU/mL(细胞执行单位/毫升)基础上针对每个分离株进行细胞密度归一化。通常，为每个分离株制备～10⁹CFU/mL悬浮液，并在冰上将其运送至接种场所。通过将这些细胞悬浮液以1/20稀释在灌溉水中至最终密度为5×10⁷CFU/mL来进行接种。对于1-L盆试验，将20mL这种稀释的细胞悬浮液均匀地分配在每个重复盆的表面上。对于微试验(micro-trial)盆，不稀释细胞悬浮液，直接用移液管将1mL每种10⁹CFU/mL悬浮液转移到每个复制盆的表面上作为土壤灌注剂施加在浸没的种子顶部上。将种子和植物维持在处于室温下具有14h光照期的温室中。

让禾谷镰刀菌菌株NRRL-5883的菌丝体在PDA平板上在恒定光照下生长5天。通过将几毫升无菌水(0.01%Tween20)倒入平板上并用刮刀刮擦琼脂表面来收获菌丝和分生孢子。接种物中孢子的浓度为大约2×10⁵个孢子/mL，但是没有测定菌丝片段浓度。

在种子萌发苗芽之后开始接种禾谷镰刀菌并继续每隔一晚接种一次，持续10天。用喷洒器以约30mL/盆施加禾谷镰刀菌接种物。每次接种后，立即用顶部弥雾机朝植物喷薄雾。当使用化学杀真菌剂时，杀真菌剂(Banner Maxx,Syngenta)通过将2mL杀真菌剂储液稀释在1L蒸馏水中来配制，并利用喷洒器以约30mL/盆来施加。

通过镰刀菌侵染严重性评价赤霉病，镰刀菌侵染严重性通过植物组织的镰刀菌菌落形成单位/克(CFU/g)的数量来确定。在四个区组中用四个重复盆执行所有处理。该处理为：

1.未经处理：无微生物或化学杀真菌剂处理+镰刀菌攻击。

2.未感染：无微生物或化学杀真菌剂处理，无镰刀菌攻击。

3.杀真菌剂：化学杀真菌剂处理+镰刀菌攻击。

4.SGI-010-H11：真菌处理+镰刀菌攻击。

5.SGI-014-G01：细菌处理+镰刀菌攻击。

6.SGI-014-C06：细菌处理+镰刀菌攻击。

如表4中所报告的结果揭示，与感染的对照相比较，所有三种微生物处理都使FHB严重性显著降低。具体地，当与在相同条件下生长的未经处理的对照相比较时，两种微生物拮抗剂，SGI-014-C06和SGI-010-H11，显著降低了禾谷镰刀菌对小麦植物的侵染。由SGI-014-C06和SGI-010-H11这两种微生物体中的每一种实现的使小麦植物免受镰刀菌侵染的保护与由市售化学杀真菌剂实现的保护在统计学上相当。当施加微生物体SGI-014-G01时，观察到的使小麦植物免受镰刀菌侵染的保护很不显眼并且它的效果在重复盆之间有很大的差别。

表4：微生物拮抗剂对镰刀菌侵染的影响。

处理	CFU/g	P值
			未经处理	1487±600	N/A
未感染	0±0	<.0001

化学杀真菌剂	290±146	<.0001
			SGI-010-H11	671±450	0.0077
SGI-014-G01	1246±465	0.8387
			SGI-014-C06	367±234	0.0001

实施例6：微生物拮抗剂的生长和储存

球腔菌属：数种方法用于储存作为纯培养物的分离的真菌，其中一种是滤纸技术。还让真菌在PDA上生长，然后将它切成小方块，然后将该小方块放在含有15%甘油的小瓶中并储存在-70℃下。还通过类似的方法使用蒸馏水而不是甘油将真菌储存在4℃下。然而，一种优选的储存方法是在-80℃下在受侵染的无菌大麦种子上进行。

芽孢杆菌属、微杆菌属和贪噬菌属：分离的细菌作为纯培养物储存。将细菌菌落转移至含有R2A肉汤液体培养基(Tecknova)的小瓶中，并让其在30℃在以250rpm振荡的条件下生长两天。然后将培养物转移到含有15%甘油的小瓶中并储存在-80℃下。

实施例7：孢子产生和种子包衣处理

孢子产生：在典型的孢子产生程序中，在1升2×YT生长培养基(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/LNaCl)中接种5mL起子培养物或陪替氏培养皿刮屑，并在设定在225rpm的旋转式摇床中在30℃温育过夜。通过离心使细菌细胞沉淀，并用PBS缓冲液(8g/LNaCl；0.2g/LKCl；1.44g/LNa₂HPO₄；0.24gKH₂PO₄；pH7.4)洗涤一次。将细胞重悬在CDSM培养基(Hageman等，J.Bacteriol,438-441,1984)中，并让其在旋转式摇床中在30℃再生长四夜。通过使用相差显微镜每日监测细菌培养物中的孢子形成直至整个培养物实际上由自由浮动的孢子构成。根据物种，温育时间通常少于四天或超过六天。在相差显微镜下，在细胞内检测到内生孢子为明亮的白色扁圆球体。通过以10,000Xg离心15分钟来使细菌孢子沉淀，用无菌dH₂0洗涤两次(必要时浓缩至50mL)，其可以立即使用或冷藏供以后使用。在OD₆₀₀下测量孢子浓度。这种程序通常产生至少2000OD的细菌孢子。

具体地，本发明的数个细菌菌株，例如芽孢杆菌属SGI-015-F03在温育4天后可以方便地产生大量孢子，其中将大型过夜起子培养物(～15mL)简单地接种到1升2×SG生长培养基中，接着在设定在225rpm的旋转式摇床中在合适温度下温育4天。2×SG生长培养基的配方如下：16g/L营养肉汤、0.25g/LMgSO₄、2.0g/L KCl、0.15g/L CaCl₂.2H₂O、0.025g/LMnCl₂.2H₂O、0.28mg/LFeSO₄·7H₂O、1.0g/L右旋糖。

小麦和玉米种子的种子包衣处理：按照Sudisha等，2009中描述的程序稍作修改来进行小规模种子处理实验。通常，通过如下方式制备生物聚合物储液：在50mL Falcon管中将6克阿拉伯胶粉末(MP Biomedical)加入到36mL水中，随后使用轮式混合器(wheelmixer)混合至匀质。当需要较大量的包衣种子时，使用搅拌板(stir plate)进行混合。

当使用营养细胞时，用PBS清洗活跃生长的微生物细胞的混浊培养物，并将其调节至OD₆₀₀为～5.0。替代地，如上所述的那样制备微生物孢子悬浮液。在1L瓶中将细菌孢子和/或营养细胞充分地重悬在～32mL如上所述的那样制备的阿拉伯胶生物聚合物储液中，并充分混合所得悬浮液。将大约400g种子(小麦或玉米)加入到瓶中，并剧烈地振荡或涡旋以确保阿拉伯胶/细胞悬浮液均匀分布。然后将包衣种子散布在整个无菌塑料称量舟中以便在定期混合条件下在层流罩中干燥至不再发粘，一般3-6小时。在一些情况下，可将用孢子包衣的种子干燥过夜。然而，用营养培养物包衣的种子在完全变干之前通常被储存起来。对种子包衣制剂中使用的微生物定期进行的存活力测试显示微生物仍能存活至少三个月。已确定包衣种子的发芽率与对照未包衣种子基本上相同。

实施例8：微生物种子处理剂对小麦上镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight)的发展的影响

根据实施例8中描述的程序，用微生物体SGI-014-C06、SGI-015-F03和SGI-015-H06中的每一种对FHB易感小麦栽培品种(RB07)的种子进行包衣。随后将包衣种子播入含有巴氏杀菌的土壤介质[(Metromix-Mix200；Scotts-Sierra Horticultural Products,Marysville,OH；和3克肥料14-14-14(N-P-K)]的1升盆中。以每盆7-8棵植物在盆中播种，随后在3叶期间苗至每盆5棵植物。将盆安排在随机化区组中，每个处理具有5只盆。然后让包衣种子在温室条件下在每天光照16小时的荧光照明下发芽。在小麦开始开花(开花期)时，通过喷洒100,000个孢子/毫升浓度的禾谷镰刀菌NRRL5883大分生孢子攻击小麦头部。喷洒孢子后，将小麦植物转移至具有100%湿度的露水室中三天以允许感染。该处理为：

1.未经处理：无微生物或化学杀真菌剂处理+镰刀菌攻击。

2.SGI-014-C06：细菌种子处理+镰刀菌攻击。

3.SGI-015-F03：细菌种子处理+镰刀菌攻击。

4.SGI-015-H06：细菌种子处理+镰刀菌攻击。

在感染后的十天和二十一天视觉评估赤霉病病害的严重性。针对显示出赤霉病病害症状的每个穗确定病害严重性，并将其计算为有症状的小穗的百分比，即，显示出FHB症状的小穗的数目除以小穗的总数目。结果(表5)揭示，当与在相同条件下生长的“未经处理的”对照相比较时，用所测试的三种微生物拮抗剂，SGI-014-C06、SGI-015-F03和SGI-015-H06中的每一种包衣的小麦种子具有显著较低的禾谷镰刀菌侵染严重性(P<0.05)。

表5：在用拮抗微生物体处理种子后小麦的赤霉病症状的发展

实施例9：在温室试验中小麦的赤霉病病害的生物防治

在较大规模的温室试验中进一步测试微生物体SGI-014-C06、SGI-015-F03和SGI-015-H06中的每一种。该试验在位于Synthetic Genomics,Inc.的“安全生长遏制室(plantgrowth containment room)”(PGCR)中进行，并包括以下对照处理：感染的对照、未感染的对照，以及四种市售杀真菌剂基准物。基准化学杀真菌剂各自为作为叶面喷洒剂按照制造商的建议施加的浓度为2ml/L的Banner(Syngenta)和浓度为3ml/L的(Bayer CropScience)。基准生物杀真菌剂各自为作为土壤灌注剂按照制造商建议的说明手册施加的(Natural Industries)和Rhizo(ABiTEPGmbH)。

制备微生物处理剂并将其作为土壤灌注剂或作为种子包衣剂施加。当微生物处理剂作为土壤灌注剂施加时，在用较多的生长培养基盖住种子之前将每种微生物体的细胞悬浮液单独地施加至种子上。为此，使新制备的培养物沉淀以除去生长培养基，并重悬在10mM硫酸镁(MgSO₄)缓冲液中。然后通过如下方式添加细胞悬浮液：按每盆～10⁹个细胞的总细胞数目用移液管吸取20毫升细胞悬浮液并将其均匀地分配在整个种子。当微生物处理剂作为种子包衣施加时，基本上如上文实施例8中所描述的那样制备微生物体细胞/孢子。通过如下方式制取包衣种子：将细胞悬浮液与阿拉伯胶溶液一起掺入从而形成发粘的包衣混合物，随后将该包衣混合物施加至种子上。然后让微生物种子包衣干燥从而形成包埋微生物体细胞/孢子的坚硬但溶于水的生物聚合物。目标是达到在至少10⁶-10⁷个能存活细胞/粒种子范围内的细胞滴度。在本温室试验性实验中，种子包衣在种子播入前一天制备。

每种处理设有四个重复(replicate)，其以随机化完全区组设计(RandomizedComplete Block Design,RCBD)安置在沿着生长室侧面布置成两排的三个调平架(leveledrack)上。调平架装配有荧光灯(Agrosun,5850K)，该荧光灯产生如在盆表面测得的平均800μmol光强度。每个重复均由四个容纳在半扁平状结构物(half flat)中的1升盆组成。盆中装有由3:1比率(v/v)的Arabidopsis Growth Medium AIS(Lehle Seeds)和砂子(WashedCoarse)组成的合成生长培养基。在每只盆中，将两克春小麦种子(Hank,WestBred)撒播在生长培养基的表面上。通过在盆基座存放～2cm水来在盆底部浇水，并观察发芽和生长。

在开花阶段(Feekes10.5.1)，通过喷洒禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液来感染小麦头部。对于本温室尝试性实验，通过如下方式制备真菌孢子：将均质化的禾谷镰刀菌菌株NRRL5883的菌丝体铺入大型PDA平板上，接着在恒定光照下在室温下温育五天。然后在平板中注满硫酸镁缓冲液(10mM MgSO₄；0.01%Tween20)并用无菌刮刀轻轻地刮擦琼脂表面来收获真菌孢子。调节孢子浓度并用加压手动喷洒器在每个头部上施加大约50,000个分生孢子。将生长室相对湿度增加至90%并保持三天，从而允许在再次正常化之前进行感染。在小麦结种子后，停止浇水并让小麦头部完全干燥。收获并收集各个小麦头部。针对显示出赤霉病病害症状的每个小麦头部确定病害严重性。病害严重性由患病小穗的数目除以每个头部的小穗总数目来计算。结果(表6)揭示，当与在相同条件下生长的“未经处理的”对照相比较时，用所测试的三种微生物拮抗剂，SGI-014-C06、SGI-015-F03和SGI-015-H06中的每一种处理的小麦具有显著较低的禾谷镰刀菌侵染严重性和发病率(P<0.05)。

表6.微生物拮抗剂在降低小麦上的赤霉病发病率方面的功效。

为了确定小麦产量，手工使小麦头部单独脱粒，收集种子并将谷壳和其他碎屑清除掉，计数并称重。总种子产量被确定为由每种处理的16只盆产生的总种子质量。如表7中报告的，发现所测试的三种微生物拮抗剂中的每一种均显著保护种子产量，即，显著降低由赤霉病侵染引起的产量损失。

表7.微生物拮抗剂在维护患有赤霉病病害的小麦植物的种子产量方面的功效。

因而，用每种所测试的微生物体处理小麦植物显著保护小麦植物免受由镰刀菌侵染引起的产量损失。具体地，当与未感染对照相比较时，用SGI-014-C06或SGI-015-F03处理的小麦植物表现出显著提高的总种子产量，即，分别为110%和120%。相比之下，基准杀真菌剂和似乎没有显著保护经处理的小麦植物免受由镰刀菌引起的赤霉病侵染所造成的产量损失。

实施例10：在田地条件下的小麦疮痂病的生物防治。

针对在如实施例4-9中描述的活体外拮抗作用测定和温室研究中被发现具有对抗病原体禾谷镰刀菌和赤霉病病害的阻抑活性的微生物体拮抗剂，在位于美国各地的不同地理位置的系列田地实验中进行进一步评价。一些实验在用于小麦疮痂病的微生物防治的农业区进行，在这里有天然病害感染发生。测试中使用的小麦品种为禾谷镰刀菌易感品种。一般来说，将经受每种处理的小麦植物播入地块中，该地块有12排，每排长约3米。各排之间的间隔为约20cm。每个实验中的经处理地块以随机化区组设计布置。还评估了各种含有本发明微生物拮抗剂的可湿性粉剂组合物在降低赤霉病严重性和发病率方面的功效。在这些实验中，微生物拮抗剂单独地评价或以组合的方式进行评价。

在这些测试中，微生物体拮抗剂在各种种子包衣处理和/或田地测试中加以评价，其中将微生物悬浮液直接施加到开花的小麦头部上。在每一个实验中，在重复的地块中评估微生物体。如实施例4-9中所描述的拮抗剂、病原体和植物产生方法可用在这些实验中。

种子包衣处理-除了上文实施例7中所描述的种子包衣方法之外，还可以利用本领域中已知的多种技术和种子包衣制剂用微生物拮抗剂处理小麦种子，所述的多种技术和种子包衣制剂诸如先前由Fernando等，2002；Bello等，2002；及Kim等，1997所描述的那些。一般来说，将小麦种子预润湿并储存在室温下以促进发芽。然后在播种前可将发芽的种子浸入微生物悬浮液中。病原体孢子可在细菌接种之前或之后接种。如实施例4和5中所描述的拮抗剂、病原体和植物产生方法可用于这些种子处理。

病害严重性和产量评估-通过使用多种方法和程序，通常例如Schisler,PlantDisease,Vol86(12),1350-1356,2002；Schisler等Biological Control,39:497-506,2006；及Khan和Doohan,Biological Control,48:42-47,2009中所描述的那些，在温室和田地评价中进一步评价拮抗剂对处于开花阶段的小麦和大麦上的赤霉病病害的阻抑活性。在一个此类实验中，如Khan等(Biological Control,29:245-255,2004)所描述的那样在无菌黄色马齿种玉米上制备玉米赤霉菌接种物。用磷酸盐缓冲液将完全定殖的微生物菌株的脂质培养物(48-小时培养物)稀释至四分之一强度。拮抗剂处理剂的最终CFU/mL计数在1×10⁹CFU/mL与6×10⁹CFU/mL之间。然后使用CO₂背负式喷洒器将处理悬浮液施加至开花的小麦头部。通常在日落后施加处理以使拮抗剂细胞的潜在UV降解减至最低。每种处理设有5个重复，其以随机化区组设计布置。主要对照处理由用缓冲溶液处理的植物组成。次要对照由未经处理的植物组成。通过评价在植物发育达到介于乳熟期中期(mid-milk)与软糊熟期(soft dough)发育之间时每个重复的60个头部(即，300个头部/种处理)，对赤霉病病害和发病率进行田地评估。当谷物达到完全成熟时，手工收获小麦头部并使用Almaco单株植物头部脱粒机(single plant and head thresher)(Almaco,IA)脱粒。评价从每个重复排获得的谷物样品的100粒重。使用单向方差分析(ANOVA)分析病害严重性、发病率和100粒重。

发现，含有单独的或组合形式的本发明微生物拮抗剂的组合物显著降低病害发病率。这些结果表明使用这些活性微生物剂的生物防治措施可在诸如小麦植物的谷类植物上的疮痂病的管理中发挥着重要作用。

实施例11：非天然产生的栽培品种和育种方案的开发

使用与包括美国专利申请第20030195117A1号、美国专利申请第20010032343A1号和美国专利第7,084,331号等中描述的程序在内的本领域已知的程序类似的程序，将本发明的内生微生物体引入到缺少此类内生生物体的来自不同地理来源的具有不同基因型的作物植物(包括谷类)中，从而创建具有改进的农艺学特性的植物内生菌组合。因而，给定的合成的植物-内生菌组合可以在育种/栽培品种开发方案中基于它们形成和维持导致农艺学益处的互利共生组合的能力加以创建和选择。该组合的农艺学特性的评级也可以用在此种育种方案中。这些特性可包括而不限于，耐旱性、生物质积累、对昆虫侵染的抵抗力、对牲畜(例如，食草动物)的适口性、易繁殖性和种子产量等。此类组合可能会在包括麦角生物碱水平、黑麦草碱(loline)水平、波胺(peramine)水平，或黑麦震颤素(lolitrem)水平在内的对害虫和杂草有毒的微生物代谢物的累积水平上所有不同，同时显示出所需的作物植物农艺学特性，包括对昆虫取食或侵染的抵抗力、对非生物逆境的抵抗力、对牲畜的适口性、生物质积累、易繁殖性和种子产量等其他性状。

己经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，应理解，可将本文描述的实施方案的要素组合从而形成另外的实施方案，并且可在不背离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，其他实施方案、替代方案和等效物落在如本文所描述和要求保护的本发明的范围内。

本申请内的标题仅仅是为了方便读者，而不以任何方式限制本发明或其实施方案的范围。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，引用程度如同每篇单独的出版物或专利申请均被具体单独地指出以引用的方式并入。

Claims (28)

1.一种分离的微生物菌株，其选自由以下组成的组：球腔菌属菌株SGI-010-H11(保藏号为NRRL 50471)、微杆菌属菌株SGI-014-C06(保藏号为NRRL B-50470)、贪噬菌属菌株SGI-014-G01(保藏号为NRRL B-50469)、芽孢杆菌属菌株SGI-015-F03(保藏号为NRRL B-50760)、芽孢杆菌属菌株SGI-015-H06(保藏号为NRRL B-50761)，其中所述微生物菌株具有对抗赤霉病病害的阻抑活性。

2.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株包含与序列表中任何一个核苷酸序列展现至少99％的序列同一性的DNA序列。

3.一种根据权利要求1所述的微生物菌株的生物上纯的培养物。

4.一种根据权利要求1所述的微生物菌株的富集培养物。

5.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株或其培养物，及农业上有效的量的选自由以下组成的组的化合物或组合物：杀微生物剂、杀害虫剂和肥料。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述农业上有效的量的化合物或组合物选自杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂和杀线虫剂。

7.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株或其培养物，及载体。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述载体为农业上可接受的载体。

9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述载体为植物种子。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被制备成选自由以下组成的组的制剂：乳状液、胶体、粉状物、颗粒剂、喷洒剂和溶液。

11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被制备成小丸剂或粉剂的制剂。

12.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物为种子包衣制剂。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述种子包衣制剂施加在种子上。

14.一种预防、抑制或治疗植物病原体的发育的方法，其中所述方法包括在寄主植物的生长培养基或土壤中的寄主植物生长之前或与其同时，让根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株或其培养物在所述生长培养基或土壤中生长。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述植物病原体引起赤霉病病害。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物病原体为禾谷镰刀菌。

17.一种预防、抑制或治疗植物赤霉病病害的发展的方法，其中所述方法包括将有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株或其培养物施加至所述植物上，或施加至所述植物的周围环境中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述微生物菌株或其培养物施加至土壤、植物的一部分，或整株植物上。

19.根据权利要求17所述的方法，其中将所述微生物菌株或其培养物施加至种子、根、花或叶上。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述植物易受禾谷镰刀菌感染。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述植物为小麦植物、玉米植物、大麦植物，或燕麦植物。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述微生物菌株或其培养物被确定为在所述植物上的内生菌。

23.一种制备农业组合物的方法，其中所述方法包括将根据权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株或其培养物接种到底土层中或底土层上，并让所述微生物菌株或其培养物在1-37℃的温度下生长直至获得每毫升或每克至少10²-10³个的细胞或孢子。

24.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株是球腔菌属菌株SGI-010-H11(保藏号为NRRL 50471)。

25.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株是微杆菌属菌株SGI-014-C06(保藏号为NRRL B-50470)。

26.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株是贪噬菌属菌株SGI-014-G01(保藏号为NRRL B-50469)。

27.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株是芽孢杆菌属菌株SGI-015-F03(保藏号为NRRL B-50760)。

28.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株是芽孢杆菌属菌株SGI-015-H06(保藏号为NRRL B-50761)。