RU2576197C1 - Способ получения композиции для выращивания растений - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Способ получения композиции для выращивания растений включает раздельную активизацию штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae, глубинное культивирование в ферментере консорциума штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae в культуральной жидкости, в которую вводится патока сахарной свеклы в качестве питательной среды размножения бактерий в массовой доле преимущественно 1,5% от объема культуральной жидкости с наличием посторонней микрофлоры не более 5%, культуры вносятся в культуральную жидкость в соотношении 1:100 и культивируются 3-5 дней при температуре 30 градусов до достижения значений рН 5,5-8,5, затем в подготовленный микробиологический препарат добавляют взятый в виде размолотого порошка в массовой доле около 10% - цеолиты кристаллические NaA, NaX, где Na - преобладающий в данном цеолите металл, а А и X - тип кристаллической решетки, полученная смесь далее ферментируется в течение 5 суток в ферментере при температуре 32-35 градусов Цельсия и постоянном перемешивании не менее чем 60 дисками диаметром 5 см, изготовленными из керамики, обработанной и выдержанной в микробиологическом растворе в течение 2-3 лет с последующим обжигом, собранными на металлические стрежни по 10 штук на каждом, которые прикреплены в виде колонн к крышке ферментера. Изобретение позволяет повысить активность композиции для выращивания растений по защите от болезней, повысить урожайную стабильность. 3 табл.

Description

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к растениеводству, и может быть использовано для улучшения питания сельскохозяйственных культур, защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, уменьшения потерь сельхозпродукции при хранении.

Известен способ получения субстрата для выращивания растений по патенту СССР №1829892 с использованием биомассы бактерий рода Псевдомонас - супрессоров фитопатогенов. По данному способу получают субстрат путем внесения в торф известковых, минеральных и бактериальных удобрений с последующим перемешиванием компонентов, а в качестве бактериального удобрения используют биомассу штамма бактерий Pseudomonas putida fluorescens ЦМПМ В-3481.

Известен способ получения биоудобрений по патенту РФ №2130005. Способ заключается в том, что штамм или сообщество микроорганизмов стерильно культивируют на питательной среде до достижения титра бактериальной массы 10⁸-10⁹ кл/мл. Полученную биомассу отделяют от среды, концентрируют. Концентрированную биомассу наносят на высушенный гранулированный куриный помет. Иммобилизованную таким образом биомассу высушивают.

Данный способ недостаточно обеспечивает повышение выживаемости микроорганизмов и повышение биологической активности почвы.

Известна группа изобретений: способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур по патенту РФ №2140138. Указанные способы осуществляются с помощью биофунгицидного препарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 (депонирован под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606 в группе эпифитных микроорганизмов). Способ получения биофунгицидного препарата заключается в смешивании культуральной жидкости, содержащей штамм B.s. Ч-13, предварительно культивированный в жидкой стерильной питательной среде с эмульсией ПВА, водным разбавителем и стерильным мелом или доломитом в определенных пропорциях. Изобретения позволяют повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов путем предпосевной обработки семян.

Известен способ получения композиции для выращивания растений по патенту РФ №2264999. Этот способ заключается в активизации наряду с другими следующих штаммов биомассабактерий: Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae и приготовлении суспензии. Указанный способ недостаточно эффективен для защиты растений от инфекционных болезней и повышения урожайности.

Задачей изобретения является создание композиции для выращивания растений, обеспечивающей высокую защиту от инфекционных болезней, предотвращающую использование пестицидов, фунгицидов и т.п., повышения урожайности и стабильности за счет использования цеолитов.

Вообще микробиологические препараты известны уже более ста лет, однако зачастую их эффективность оказывалась недостаточной или нестабильной, из-за чего они не смогли сыграть значительную роль в повышении продуктивности сельскохозяйственного производства.

В последнее время было открыто явление интеграции генетических систем микроорганизмов и растений в процессе их взаимодействия. Удалось показать, что как бактерии, так и растения обладают наборами симбиотических генов, которые “молчат” в отсутствии соответствующего партнера, а при наличии партнеров с определенными генотипами устанавливается симбиоз. При этом процесс установления симбиотических взаимоотношений - это экологический процесс, протекающий в почве. С помощью микроорганизмов растение обеспечивает свои потребности в элементах питания (азот, фосфор и другие), микроорганизмы способны защитить растение от фитопатогенов, причем наиболее опасных - почвенных инфекций, для борьбы с которыми пока нет эффективных средств. Такая система контролирует выработку надорганизменных признаков или адаптации, которыми не обладали ни бактерии, ни растения до взаимодействия. Данный аспект микробно-элементного взаимодействия использован в заявленном изобретении.

Технический результат заключается в повышении активности композиции для выращивания растений по защите от болезней, повышению урожайности стабильности.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения композиции для выращивания растений включает раздельную активизацию штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae, глубинное культивирование в ферментере консорциума штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae в культуральной жидкости, в которую вводится патока сахарной свеклы в качестве питательной среды размножения бактерий в массовой доле преимущественно 1,5% от объема культуральной жидкости с наличием посторонней микрофлоры не более 5%, культуры вносятся в культуральную жидкость в соотношении 1:100 и культивируются 3-5 дней при температуре 30 градусов до достижения значений рН 5,5-8,5, затем в подготовленный микробиологический препарат добавляют взятый в виде размолотого порошка в массовой доле около 10% - цеолиты кристаллические NaA, NaX, где Na - преобладающий в данном цеолите металл, а A и X - тип кристаллической решетки, полученная смесь далее ферментируется в течение 5 суток в ферментере при температуре 32-35 градусов Цельсия и постоянном перемешивании не менее чем 60 дисками диаметром 5 см, изготовленными из керамики, обработанной и выдержанной в микробиологическом растворе в течение 2-3 лет с последующим обжигом, собранными на металлические стрежни по 10 штук на каждом, которые прикреплены в виде колонн к крышке ферментера.

Так как биомассабактерии культивируются на патоке сахарной свеклы, то они приобретают дополнительные ценные продукты, являющиеся результатом бактериального сбраживания разжиженной биомассы из сахарной свеклы, включающие нижеследующее, но не ограничиваются только этим: органические кислоты (например, уксусная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, пропионовая кислота и глюкуроновая кислота), аминокислоты (например, глютаминовая кислота, лейцин, лизин, треонин, аспарагиновая кислота, фенилаланин, цистеин), капролактамы (например, альфа-аминокапролактам), антибиотики (например, блеомицин, вирджиниамицин, линкомицин, моненсин, бластицидин, тетрациклин), витамины (например, витамин В₂, В₁₂ и С), ферменты, нуклеотиды/нуклеозиды (например, НАДН, АТФ, цАМФ, ФАД, кофермент А), биополимеры (например, полигидроксибутират, полиамиды/фиброины), полисахариды (например, ксантан, декстран), аминоглюканы (например, гиалуроновая кислота), а также органические растворители и биотополива (например, ацетон, этанол, бутанол, пропандиол).

Еще дополнительные ценные продукты, являющиеся результатом дрожжевого сбраживания разжиженной биомассы из сахарной свеклы, включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: органические растворители (например, этанол, пропанол), нуклеотиды (например, РНК), биологические поверхностно-активные вещества (например, липиды софорозы), ферменты и биополимеры (например, спидроины), органические кислоты (лимонная кислота, фумаровая кислота), антибиотики (например, пенициллин, цефалоспорин), ферменты и полисахариды (например, хитин).

Все эти ценные продукты в дальнейшем переносятся в почву или на растения, позволяя получить высокую устойчивость к заболеваниям и высокую урожайность.

Наличие цеолитов обеспечивает высокую стабильность композиции.

Штаммы культур приобретаются в Государственном научном центре Российской Федерации (ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»)). Культуры активизируются раздельно согласно инструкции (сведения ниже), затем составляется питательная среда.

Сведения о составе и свойствах активного ингредиента и препаративной формы (бактериальных, грибных, на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов)

1. Свойства штамма-продуцента Lactobacillus casei

1. Видовое название штамма (изолята)

Lactobacillus casei

2. Номер, название штамма

№2872, Lactobacillus casei

3. Источник выделения штамма

Слюна человека

4. Культурально-морфологические и биохимические свойства, тесты и критерии идентификации (указать также организацию, проводившую идентификацию)

Короткие толстые палочки, преимущественно в коротких цепочках. Не спорообразующие, клетки не подвижны. Грамположительные. На твердых питательных средах образует круглые колонии белого цвета, полупрозрачные. Профиль колоний выпуклый, край ровный. По штриху рост умеренный, видно цепь изолированных колоний. Оптимальная температура роста 35-37°C.

Конечным продуктом метаболизма лактобацилл является D- и L-молочная кислота. У гомоферментативных лактобацилл лактат составляет 90% всех продуктов брожения. Бактерии рода Lactobacillus усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина.

Биохимические и морфорлогические свойства являются критериями идентификации в лабораторных условиях.

Предприятие, проводившее идентификацию: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).

5. Патогенность и антагонизм по отношению к вредному объекту

Непатогенны, способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать лизоцим и вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин.

6. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма

Хранение осуществляется методом субкультивирования, он заключается в пересевах культуры на свежую питательную среду ГМС два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5-8°C.

Состав ГМС: обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г, агар 20 г/л. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут.

7. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизмов.

Размножение осуществляется методом пересева активной культуры микроорганизмов на жидкую питательную среду ГМС и культивирование при температуре 40°C в течение 24 ч, при доведении рН до 6,8-7,0 через 12 ч.

Состав ГМС: для размножения обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут. После стерилизации добавляют аскорбиновой кислоты - 0,15 г/дм³.

8. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале

Для обнаружения микроорганизмов используют полутвердую питательную среду ГМС, которую разливают в чашки Петри и культивируют после засевания образца методом предельных разведений в течение 72 ч при температуре 40°C.

Состав ГМС: обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г, агар 10 г/л. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем добавляют агар, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут.

9. Продукт, синтезируемый штаммом (химический состав, структурная формула, стабильность, метод определения остатков)

Молочная кислота, формула С₃Н₆O₃, химическое название - 2-гидроксипропионовая кислота. Для определения используется метод нейтрализации.

В колбу на 200 мл вносят 1 мл жидкого агрохимиката, добавляют 24 мл воды из бюретки по 5 мл хлористого бария, 0,1 Н (NaOH) и сернокислого цинка. Одновременно реактивы вносят в той же последовательности в холостую пробу (25 мл воды). После образования осадка растворы фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр. Затем от содержимого отбирают в мерную колбу на 100 мл прозрачный фильтрат, добавляя к содержимому 0,5 мл 1% раствора FeCl₃ и доведя объем до 100 мл дистиллированной водой. После развития окраски колориметруют раствор в кюветах на 10 мл со светофильтром №2. Затем показатель оптической плотности переводят по предварительно построенной калибровочной кривой на % молочной кислоты.

2. Свойства штамма-продуцента Lactococcus lactis

8. Видовое название штамма (изолята)

Lactococcus lactis

9. Номер, название штамма

№4462, Lactococcus lactis

10. Источник выделения штамма

Коровье молоко

11. Культурально-морфологические и биохимические свойства, тесты и критерии идентификации (указать также организацию, проводившую идентификацию)

Диплококки в основном растут парами и в коротких цепочках по 4-6 клеток. Неспорообразующие, клетки не подвижны. Форма овальная, ближе к округлой. На твердых питательных средах образует круглые колонии белого цвета диаметром 1-2 мм. Профиль колоний конусовидный, край гладкий, колонии мягкие однородные. На жидких питательных средах образует тонкую пленку, осадка нет. Грамположительные бактерии, оптимальная температура роста 30°C. Главным конечным продуктом метаболизма лактококков является D- и L-молочная кислота. Большинство из них не обладают выраженной протеолитической активностью, не выделяют каталазы. Вызывают расщепление углеводов гомо- или гетероферментативным путем (такое деление связано с небольшим количеством получаемых при молочнокислом брожении побочных продуктов летучих кислот, спирта, диацетила и пр.). Хорошо сбраживают лактозу, не сбраживают рамнозы, сахарозы, раффинозы. Образуют антибиотик низин.

Биохимические и морфологические свойства являются критериями идентификации в лабораторных условиях.

Предприятие проводившее идентификацию: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).

12. Патогенность и антагонизм по отношению к вредному объекту

Непатогенны, способны образовывать молочную кислоту, перекись водорода, продуцировать низин и другие вещества с антибиотической активностью.

13. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма

Хранение осуществляется методом субкультивирования, он заключается в пересевах культуры на свежую питательную среду ГМС два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5-8°C.

Состав ГМС: обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г, агар 20 г/л. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут.

14. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизмов.

Размножение осуществляется методом пересева активной культуры микроорганизмов на жидкую питательную среду ГМС и культивирование при температуре 40°C в течение 24 ч, при доведении рН до 6,8-7,0 через 12 ч.

Состав ГМС: для размножения обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут. После стерилизации добавляют аскорбиновой кислоты - 0,15 г/дм³.

8. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале

Для обнаружения микроорганизмов используют полутвердую питательную среду ГМС, которую разливают в чашки Петри и культивируют после засевания образца методом предельных разведений в течение 72 ч при температуре 40°C.

Состав ГМС: обезжиренное молоко - 1 дм³; панкреатин - 1,5 г, агар 10 г/л. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при t=30°C в течение 18-24 часов. Затем добавляют агар, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 минут.

9. Продукт, синтезируемый штаммом (химический состав, структурная формула, стабильность, метод определения остатков)

Молочная кислота, формула С₃Н₆O₃, химическое название - 2-гидроксипропионовая кислота. Для определения используется метод нейтрализации:

В колбу на 200 мл вносят 1 мл жидкого агрохимиката, добавляют 24 мл воды из бюретки по 5 мл хлористого бария, 0,1 Н (NaOH) и сернокислого цинка. Одновременно реактивы вносят в той же последовательности в холостую пробу (25 мл воды). После образования осадка растворы фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр. Затем от содержимого отбирают в мерную колбу на 100 мл прозрачный фильтрат, добавляя к содержимому 0,5 мл 1% раствора FeCl₃, и доведя объем до 100 мл дистиллированной водой. После развития окраски колориметруют раствор в кюветах на 10 мл со светофильтром №2. Затем показатель оптической плотности переводят по предварительно построенной калибровочной кривой на % молочной кислоты.

3. Свойства штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae

1. Видовое название штамма (изолята)

Saccharomyces cerevisiae

2. Номер, название штамма

№22, Saccharomyces cerevisiae

3. Источник выделения штамма

Виноград

4. Культурально-морфологические и биохимические свойства, тесты и критерии идентификации (указать также организацию, проводившую идентификацию)

Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae неподвижные, крупные, размером 5/6×10/14 мкм. Форма округлая, овальная, яйцевидная или слегка удлиненная. При микроскопировании в дрожжевой клетке можно различить оболочку, протоплазму, вакуоль. Размножаются почкованием, способность к спорообразованию у них ослаблена или полностью утрачена. Грамположительные. При росте на жидкой питательной среде они вызывают ее помутнение. В результате интенсивного газообразования клетки дрожжей выносятся в верхние слои бродящей жидкости, а на поверхности образуется пена. По окончании брожения среда становится более прозрачной, дрожжи оседают на дно, образуя плотный осадок желтовато-белого цвета. Пленка на поверхности среды не развивается. Штрих на косом сусло-агаре выпуклый, с ровными краями, сочной консистенции, желтовато-белого цвета, маслянистый.

На сусло-агаре формируются колонии круглой формы диаметром 0,5-1 см с выпуклым центром и ровными краями желтовато-белого цвета.

Они сбраживают и усваивают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, частично рафинозу и простые декстрины солодового сусла, не сбраживают и не усваивают лактозу, пентозы (ксилозу и арабинозу), крахмал, клетчатку. Источником азотного питания для них служат аминокислоты и аммонийные соли.

Оптимальная температура развития 30°C. Оптимальное значение рН в зоне 4,5-5. Добавление в питательную среду сахара (свыше 15%) или соли (свыше 1-1,5%) отрицательно влияет на жизнедеятельность дрожжей. Образуют этиловый спирт.

Биохимические и морфологические свойства являются критериями идентификации в лабораторных условиях.

Предприятие, проводившее идентификацию: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).

5. Патогенность и антагонизм по отношению к вредному объекту

Непатогенны, способны образовывать этиловый спирт, небольшое количество многоатомных спиртов, органические кислоты с антибактериальной активностью.

6. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма

Хранение осуществляется методом субкультивирования, он заключается в пересевах культуры на твердую питательную среду Сабуро два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5-8°C.

Состав среды Сабуро: глюкоза - 40 г/л; пептон - 10 г/л; вода - 1 дм³; агар-агар - 2%. Готовую среду Сабуро стерилизуют при 0,5 атм, в течение 25 минут, стерильную расплавленную среду разливают в стерильные чашки Петри.

7. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизмов.

Размножение осуществляется методом пересева активной культуры микроорганизмов на жидкую питательную среду Сабуро и культивирование при температуре 30°C в течение 24-72 ч, при доведении рН до 4,5-5,0 через 12 ч.

Состав жидкой среды Сабуро для размножения: глюкоза - 40 г/л; пептон - 10 г/л; вода - 1 дм³; агар-агар - 0,2%. Готовую среду Сабуро стерилизуют при 0,5 атм, в течение 25 минут и охлаждают до 30°C, засевают культуру и выдерживают в течение 24-72 ч.

8. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале

Для обнаружения микроорганизмов используют полутвердую питательную среду Сабуро, которую разливают в чашки Петри и культивируют после засевания образца методом предельных разведений в течение 72 ч при температуре 30°C.

Состав среды Сабуро: глюкоза - 40 г/л; пептон - 10 г/л; вода - 1 дм³; агар-агар - 1%. Среду Сабуро стерилизуют при 0,5 атм, в течение 25 минут, стерильную расплавленную среду разливают в стерильные чашки Петри.

9. Продукт, синтезируемый штаммом (химический состав, структурная формула, стабильность, метод определения остатков)

Этиловый спирт, формула С₂Н₅ОН, химическое название спирт этиловый. Определение спирта производится по ГОСТ 3639-79 с помощью ареометра АСп-1.

5. Свойства штамма-продуцента Rhodopseudomonas palustris

1. Видовое название штамма (изолята)

Rhodopseudomonas palustris

2. Номер, название штамма

№100 И, Rhodopseudomonas palustris

3. Источник выделения штамма

Илистый грунт пресного водоема

4. Культурально-морфологические и биохимические свойства, тесты и критерии идентификации (указать также организацию, проводившую идентификацию)

Колонии на плотных средах мелкие до средних, круглые, блестящие от светло-розового до красно-пурпурного цвета, на жидких средах образуют муть и клеточная масса (осадок) имеет красно-пурпурный оттенок. Клетки палочковидные, некоторые из них имеют выраженную тенденцию к образованию изогнутых и искривленных палочек, молодые клетки короткие, активно подвижные, с полярно расположенными жгутиками, грамотрицательные, в старых культурах появляются длинные клетки, неспороносные, слизи не образуют. Фотогетеротрофные факультативные анаэробные бактерии. Хорошо развиваются при доступе света. Хемотрофный рост наблюдается в темноте в аэробных и в микроаэробных условиях. Окраска клеток одинаковая как при аэробных, так и анаэробных условиях роста. Цвет клеток определяется наличием бактериохлорофила и каратиноидов. Для оптимального развития требуется п-аминобензойная кислота. Желатину не разжижают. Характерно отсутствие роста штамма на средах с 0,2% и более моносахаридами, основными окисляемыми соединениями являются глюкоза, манноза и многоатомный спирт - сорбит. Окисляют тиосульфат, не окисляют сернистый водород. Грамотрицательные. Образуют красный пигмент. Оптимум температуры - 27-30°C. Оптимальное значение рН 7,0-7,5 ед.

Биохимические и морфологические свойства являются критериями идентификации в лабораторных условиях.

Предприятие, проводившее идентификацию: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).

5. Патогенность и антагонизм по отношению к вредному объекту

Непатогенны, способны к утилизации сложных углеводородов, осуществляя тем самым трансформацию нефтепродуктов при загрязнении почв, окисляют сероводород до сульфатов через образование молекулярной серы, обладающей бактерицидным действием, разлагают органические субстраты с выделением молекулярного водорода.

6. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма

Хранение осуществляется методом субкультивирования, он заключается в пересевах культуры на твердую стерилизованную питательную среду Ван Ниля. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5-8°C.

Состав среды Ван Ниля, (%): NH₄Cl - 0,1; MgCl₂ - 0,02-0,05; KH₂PO₄ - 0,05-0,1; NaHCO₃ - 0,5; Na₂S × 9Н₂0 - 0,1; NaCl - 0,1-2, агар 20 г/л.

7. Способ, условия и состав питательных сред для размножения микроорганизмов.

Размножение осуществляется методом пересева активной культуры микроорганизмов на жидкую питательную среду Ван Ниля и культивирование при температуре 27-30°C в течение 24-72 ч, при доведении рН до 7,0-7,5 через 12 ч.

Состав жидкой среды Ван Ниля, (%): NH₄Cl - 0,1; MgCl₂ - 0,02-0,05; KH₂PO₄ - 0,05 - 0,1; NaHCO₃ - 0,5; Na₂S × 9Н₂O - 0,1; NaCl - 0,1-2.

Готовую среду Ван Ниля стерилизуют при 0,5 атм, в течение 25 минут, охлаждают до 30°C, засевают культуру и выдерживают в течение 24-72 ч.

8. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале

Для обнаружения микроорганизмов используют полутвердую питательную среду Ван Ниля, которую разливают в чашки Петри и культивируют после засевания образца методом предельных разведений в течение 72 ч при температуре 27-30°C.

Состав жидкой среды Ван Ниля, (%): NH₄Cl - 0,1; MgCl₂ - 0,02-0,05; KH₂РO₄ - 0,05-0,1; NaHCO₃ - 0,5; Na₂S × 9Н₂O - 0,1; NaCl - 0,1-2, агар 10 г/л.

Среду стерилизуют при 0,5 атм, в течение 25 минут, стерильную расплавленную среду разливают в стерильные чашки Петри.

9. Продукт, синтезируемый штаммом (химический состав, структурная формула, стабильность, метод определения остатков)

Культура осуществляет нитратредукцию. Для ее определения производится посев на среды Пфеннига, различающиеся по рН (от 3,0-9,0) и источнику азота: азот воздуха, либо азот нитратов (3 г/л KNO₃). Через трое суток инкубации на свету и в темноте производят измерения плотности выросших культур и газохроматографический анализ. Нитратредуктазную активность оценивают по образованию закиси азота после внесения ацетилена. Нитрогеназную активность (азотфиксация) культур оценивали по восстановлению ацетилена.

Результаты раздельной активизации штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae, глубинного культивирования в ферментере консорциума штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae в культуральной жидкости, в которую вводится патока сахарной свеклы в качестве питательной среды размножения бактерий в массовой доле преимущественно 1,5% от объема культуральной жидкости с наличием посторонней микрофлоры не более 5%, культуры вносятся в культуральную жидкость в соотношении 1:100 и культивируются 3-5 дней при температуре 30 градусов до достижения значений рН 5,5-8,5 приведены в таблице 1.

Помимо консорциума микроорганизмов, которые находятся в коллекции предприятия в процессе приготовления «ЭМИКС» (препарат), используются следующие материалы:

В дальнейшем в подготовленный микробиологический препарат добавляют взятый в виде размолотого порошка в массовой доле около 10% - цеолиты кристаллические NaA, NaX, где Na - преобладающий в данном цеолите металл, а A и X - тип кристаллической решетки, полученная смесь далее ферментируется в течение 5 суток в ферментере при температуре 32-35 градусов Цельсия и постоянном перемешивании не менее чем 60 дисками диаметром 5 см, изготовленными из керамики, обработанной и выдержанной в микробиологическом растворе в течение 2-3 лет с последующим обжигом, собранными на металлические стрежни по 10 штук на каждом, которые прикреплены в виде колонн к крышке ферментера.

Из уровня техники известна керамика, состоящая из глины, замешанной на препарате и обжига ее с ЭМ полезными эффективными микроорганизмами, состоящими из ряда молочнокислых и фотосинтезирующих бактерий, дрожжей, сохраняющих свои жизнеспособность и свойства (энергетические, фунгистатические, бактерицидные) будучи внедренными в керамику (Higa Teruo. An Earth Saving Revolution. - Sunmark Publishing Inc, Tokyo Japan, 1994, стр. 311-367). Воздействие такой керамики недостаточно изучено, но уже представляет научный интерес.

Поэтому в конструкцию ферментера введены диски, изготовленные из ЭМ-керамики. ЭМ-керамика - это керамика, обработанная и выдержанная в микробиологическом растворе в течение 2-3 лет с последующим обжигом. В конструкции используются 60 дисков из ЭМ-керамики, каждый диаметром 5 см. Диски собраны на металлические стрежни по 10 штук на каждом. Стержни с дисками (6 штук) прикреплены в виде колонн к крышке ферментера.

Применение таких дисков позволяет стабилизировать процесс ферментации, ускорить его и увеличить содержание живых микроорганизмов в готовом продукте. Применение цеолита значительно обогащает минеральный состав готового средства «ЭМИКС».

По завершению процесса снимают показатели: кислотности, определяют титр микроорганизмов, готовый раствор отправляют на розлив.

По внешнему виду и физико-химическим показателям готовое удобрение «ЭМИКС» (название - товарный знак принадлежит заявителю) должно соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.

Благодаря сочетанию всех вышеописанных факторов композиция «ЭМИКС»:

- выступает в роли накопителя и регулятора питательных элементов почвы, особенно тех которые легко вымываются: фосфор, железо, цинк, марганец и другие.

- оздоравливает почву и восстанавливает ее естественное плодородие,

- эффективно поддерживает необходимый уровень влажности,

- положительно влияет на рост и развитие растений,

- повышает урожайность,

- повышает иммунитет и невосприимчивость растений к болезням и вредителям,

- эффективна против колорадского жука,

- увеличивает устойчивость растений к неблагоприятным воздействиям внешней среды: морозу, жаре, засухе и др.,

- при высокой эффективности абсолютно безопасна для человека и домашних животных,

- позволяет проводить эффективную профилактику мест хранения урожая.

Композиция не содержит токсически значимых компонентов.

Композиция не представляет выраженной ингаляционной опасности.

В опытах на мышах и крысах при пероральном введении специфические симптомы острого отравления не выявлены.

Кожу не раздражает, слизистые оболочки глаза раздражает слабо.

Сенсибилизирующее и иммунотоксическое действие не установлено.

Нет необходимости исследовать на кумуляцию, кумулятивное действие для препаратов на основе живых бактерий нехарактерно.

Полученная согласно изобретению композиция является пожаро-взрывобезопасным веществом.

Рекомендуемые средства тушения пожаров на складах с удобрениями: вода, химическая и воздушно-механическая пена, углекислый газ.

Полученная согласно изобретению композиция может храниться в упаковке в прохладном сухом месте, отдельно от продуктов, лекарств и кормов; в местах недоступных для детей и животных, защищенных от прямых солнечных лучей. Температура хранения от 0 до 30°C. Вентиляция: не требуется. После контакта следует мыть руки в целом и лицо водой с мылом, перед тем как есть, пить или курить.

Стабильность композиции: стабильна в течение 12 месяцев при температуре от 0 до 30°C, но нужно защищать от прямого воздействия солнечных лучей. Хранится при температуре от 0 до 30°C.

Исследование показало, что полимеризация не произойдет.

Композиция несовместима с химическими пестицидами, обычно используемыми в обработки семян и посевов.

Проверка на токсичность показала:

Острая пероральная токсичность (ЛД₅₀)

ЛД₅₀ для мышей > 10000 мг/кг.

ЛД₅₀ для крыс > 10000 мг/кг.

Острая дермальная токсичность (ЛД₅₀)

ЛД₅₀ для крыс > 2000 мг/кг.

Острая ингаляционная токсичность (ЛК₅₀)

Микробиологические препараты не представляют выраженной ингаляционной опасности.

Клинические проявления острой интоксикации.

В опытах на мышах и крысах при пероральном введении специфические симптомы острого отравления не выявлены.

Раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки (на крысах или кроликах)

Кожу не раздражает, слизистые оболочки глаза раздражает слабо.

Сенсибилизирующее и иммунотоксическое действие не установлено.

Нет необходимости исследовать на кумуляцию, кумулятивное действие для препаратов на основе живых бактерий нехарактерно.

Штаммы микроорганизмов непатогенны, невирулентны, не обладают токсичностью и токсикогенностью, не способны к диссеминации во внутренние органы теплокровных животных.

Штаммы микроорганизмов выделены из природных компонентов, продуктами метаболизма их при взаимодействии с почвой и растениями являются ферменты и физиологически активные вещества, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и т.п. соединения, которые оказывают положительное влияние на рост и развитие растений.

Claims (1)

1. Способ получения композиции для выращивания растений, включающий раздельную активизацию штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae, глубинное культивирование в ферментере консорциума штаммов биомассабактерий Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Rhodopseudomonas palustris и Saccharomices cerevisiae в культуральной жидкости, в которую вводится патока сахарной свеклы в качестве питательной среды размножения бактерий в массовой доле преимущественно 1,5% от объема культуральной жидкости с наличием посторонней микрофлоры не более 5%, культуры вносятся в культуральную жидкость в соотношении 1:100 и культивируются 3-5 дней при температуре 30 градусов до достижения значений рН 5,5-8,5, затем в подготовленный микробиологический препарат добавляют взятый в виде размолотого порошка в массовой доле около 10% - цеолиты кристаллические NaA, NaX, где Na - преобладающий в данном цеолите металл, а А и X - тип кристаллической решетки, полученная смесь далее ферментируется в течение 5 суток в ферментере при температуре 32-35 градусов Цельсия и постоянном перемешивании не менее чем 60 дисками диаметром 5 см, изготовленными из керамики, обработанной и выдержанной в микробиологическом растворе в течение 2-3 лет с последующим обжигом, собранными на металлические стрежни по 10 штук на каждом, которые прикреплены в виде колонн к крышке ферментера.