CN105385679B - 选择和稳定dsRNA构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及选择和稳定dsRNA构建体。本发明提供用于筛选核苷酸序列的方法，该序列在靶生物中产生dsRNA‑介导的基因抑制并使得其被靶生物摄入。本发明还提供赋予该序列在转基因宿主细胞中稳定表达的表达构建体，以及其应用方法。另外还提供了由本发明的方法制备的生物，细胞和组织。

Description

选择和稳定dsRNA构建体

本申请是申请日为2007年2月12日的中国专利申请200780005386.3“选择和稳定dsRNA构建体”的分案申请。

本发明主张2006年2月13日递交的美国临时专利申请60/772,736的优先权，其通过引用整体导入本文。

技术领域

本发明涉及RNAi构建体在植物中的稳定表达以使得能够对植物病原体和害虫(pest)进行基因控制。本发明提供用于提高源自该构建体的dsRNAs效力的方法和组合物。

背景技术

当互补双链RNA(dsRNA)短链存在于活细胞或被导入活细胞时，当dsRNA和靶基因转录本之间具有核酸序列相似性的区域时，可特异地影响“靶”基因的表达。该RNA分子可包括由“间隔”区分开的互补序列以便形成RNA的双链区。dsRNA可被称作二聚RNase III核糖核酸酶(也称作“dicer”酶)的酶切割成长度约21-25碱基对的节段；称作siRNAs(“短干扰RNAs”(short interfering RNAs)或“小干扰RNAs”)。siRNA在RNA-诱导的沉默复合体(“RISC”)中产生特异的RNAse活性以水解靶基因mRNA，从而转录后抑制靶基因的表达。只有与siRNA互补的转录本被切开并降解，因此该作用(有时也称作RNA干扰(RNAinterference，RNAi))是基因特异的。在许多生物包括秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)(Fire等，1998)，果蝇(Drosophila melanogaster)，昆虫包括鞘翅目(Coleoptera)(Bucher等，2002)和鳞翅目(Lepidoptera)(Uhlirova等，2003；Bettencourt等，2002)，真菌(Cogoni等，2000)，和植物例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)等之中，已使用RNAi特异性地打断基因表达。存在于植物中的dsRNA还可引导靶定的染色质区的DNA甲基化，导致基因沉默(例如Wassenegger等，1994；Carthew，2001；Zilberman等，2004)。

有效使用RNAi导致特定靶基因表达的抑制，因此RNAi构建体在转基因作物中的稳定表达可以允许对害虫控制的新型基因方法。然而，尽管由植物中原位(in planta)转基因产生的dsRNA靶向另一生物，但可引起植物中的原位应答，例如转基因转录本的切开(“切割”)，以及转基因宿主植物中同源转基因的沉默。这些应答可减少或消除dsRNA产生并因此减少或消除其对靶生物的效力。

已经报道了关于用于引起dsRNA-介导的基因表达抑制的构建体的设计(Wesley等，2001；Yuan等，2004；Reynolds等，2004；Arziman等，2005)。在一些生物中，sRNA(“小RNA”)分子(包括dsRNA)的全身转运机制是已知的(例如Voinnet 2005)，并且已知被转运的核糖核苷酸序列对其摄入效率起作用(Winston等，2002)。例如，秀丽线虫(C.elegans)需要长度约100个碱基对(bp)的dsRNA以例如通过SID 1蛋白丰裕地(productively)摄入至肠细胞(Feinberg和Hunter，2003)，而WO9953050描述了在间隔区包括内含子序列的dsRNA构建体。然而，导致对抗靶害虫的活性dsRNA的优化生产、稳定化和摄入，而同时保证编码该dsRNA的转基因的稳定表达，并避免宿主细胞中转基因沉默的参数并未理解清楚。因此需要保证特异的、有效的dsRNA-编码转基因在植物内的稳定转录，以及该生成的dsRNA的随后的转运及摄入，以在靶植物病原体和害虫物种中产生有效且特异的基因抑制。

发明内容

本发明涉及以下内容：

1.一种获得提供期望的靶基因抑制水平的核酸节段的方法，包括：

a)获得基本上与靶基因互补的起始核酸分子；

b)从所述起始核酸分子制备多个核酸节段；

c)检测当在包括所述靶基因的细胞中作为dsRNA表达时，所述核酸节段抑制所述靶基因表达的能力；和

d)从所述多个核酸节段中鉴定至少第一核酸节段，当其作为dsRNA表达时提供期望的靶基因抑制水平。

2.项目1所述的方法，其中所述核酸节段包括所述起始核酸分子的约21至约36个连续核苷酸部分。

3.项目1所述的方法，其中所述核酸节段包括所述起始核酸分子的重叠部分。

4.项目1所述的方法，其中所述核酸节段每个包括约0.1％至约98％的所述靶基因。

5.项目1所述的方法，进一步包括步骤：

e)根据在所述核酸节段作为dsRNA表达时获得的靶基因的抑制水平对所述核酸节段分等。

6.项目1所述的方法，其中所述期望的靶基因的抑制水平是所述靶基因的表达的约1％至约100％的抑制。

7.项目1所述的方法，其中所述期望的抑制水平是所述靶基因的完全抑制。

8.项目1所述的方法，其中所述期望的抑制水平是所述靶基因的不完全抑制。

9.项目1所述的方法，其中所述靶基因来自植物、昆虫、真菌、细菌或脊椎生物。

10.项目1所述的方法，其中所述靶基因是植物基因。

11.项目1所述的方法，其中所述靶基因是作物害虫或病原体基因。

12.项目1所述的方法，其中检测所述核酸节段抑制所述靶基因的能力包括在包含所述靶基因的细胞中以dsRNA表达该节段并确定所述靶基因的抑制水平。

13.项目1所述的方法，其中检测所述核酸节段抑制所述靶基因的能力包括在细胞中以dsRNA表达该节段；允许包含该靶基因的害虫以该植物细胞为食；以及确定该靶基因的抑制水平。

14.项目1所述的方法，其中检测所述核酸节段抑制所述靶基因的能力包括计算该核酸节段的Reynolds分数。

15.项目1所述的方法，其中检测所述核酸节段抑制所述靶基因的能力包括在包含所述靶基因的生物的饮食中提供作为dsRNA分子的所述节段并确定所述靶基因的抑制水平。

16.项目15所述的方法，其中确定所述靶基因的抑制水平包括观察所述生物的发病率、死亡率或生长迟缓。

17.一种抑制细胞中靶基因表达的方法，包括：

a)获得根据项目1所述的方法的核酸节段；和

b)提供从所述核酸表达的dsRNA至包含该靶基因的宿主细胞以抑制所述靶基因的表达。

18.项目17所述的方法，其中提供从所述核酸节段表达的dsRNA至宿主细胞包括在所述宿主细胞中以正义和反义方向表达所述核酸节段。

19.项目17所述的方法，其中提供从所述核酸节段表达的dsRNA至宿主细胞包括提供包含该dsRNA的饮食至所述细胞或包含所述细胞的生物并允许所述细胞摄入该dsRNA。

20.项目17所述的方法，其中所述宿主细胞是害虫细胞以及其中提供从所述核酸表达的dsRNA至害虫细胞包括在植物细胞中表达该dsRNA并允许包含该宿主细胞的昆虫以所述植物细胞为食。

21.项目20所述的方法，其中在所述害虫细胞中抑制所述靶基因表达由所述细胞或包括所述细胞的害虫的表型效应所证实。

22.项目21所述的方法，其中所述表型效应是程序性细胞死亡。

23.一种在生物中调节至少第一基因表达的方法，包括：

a)将由项目1所述方法获得的至少第一核酸节段作为dsRNA提供至所述生物，其中所述dsRNA节段在所述生物中对所述基因是特异的；以及

b)观察所述生物中的表型效应。

24.项目23所述的方法，其中所述表型效应选自由营养生长停止、生殖生长停止、摄食停止、死亡率、发病率、生长迟缓、瘫痪、有性生殖抑制、蜕皮抑制、不能飞行和不能从蛹期羽化组成的组。

25.一种调节植物害虫中基因表达水平的方法，包括在所述害虫的饮食中提供至少第一dsRNA分子，并观察所述害虫中一种或更多种基因抑制的表型效应，其中所述dsRNA分子从显示与所述害虫中一种或更多种必要基因的相应DNA序列基本上同源的核苷酸序列中产生，并且其中所述核苷酸序列是根据项目1所鉴定的核酸节段。

26.一种抑制植物害虫侵染的方法，包括在转基因植物中表达根据项目1获得的至少第一dsRNA分子并提供所述植物或其部分或组织至一种或更多种包括所述靶基因的害虫，并观察所述生物中的表型效应，其中所述表型效应足以抑制所述害虫对所述转基因植物的侵染。

27.一种保护植物免于害虫侵染的方法，包括在转基因植物中表达根据项目1获得的dsRNA分子，提供所述植物或其部分或组织至一种或更多种包括所述靶基因的害虫，并观察所述生物中的表型效应，其中所述表型效应足以抑制所述害虫对所述转基因植物的侵染。

28.项目27所述的方法，进一步包括在所述植物中表达选自由马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacillus laterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白组成的组的至少第一蛋白。

29.一种保护植物或其种子免于害虫侵染的方法，包括将所述植物或其种子与根据项目1获得的dsRNA分子接触。

30.项目29所述的方法，进一步包括使所述植物或其种子接触马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacilluslaterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白、生物控制剂或杀虫剂。

31.一种根据项目23所述的方法保护免于害虫侵染的植物的细胞。

32.一种由项目31所述的植物细胞再生的植物。

33.一种由项目32所述的植物产生的种子或后代，其中所述种子包括所述核苷酸序列。

34.一种生产用于表达具有在植物细胞中的降低的转基因沉默的dsRNA的表达构建体的方法，包括：

a)制备包括第一序列、第二序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列连接至第一多核苷酸序列和第三多核苷酸序列基本上与第一多核苷酸序列反向互补；和

b)导入内含子至第一和第三多核苷酸序列的至少一个中或导入所述表达构建体至内含子中，其中第一和第三多核苷酸序列在转录成RNA时杂交并在内含子剪接后形成由第二多核苷酸序列稳定的dsRNA分子，其中所述表达构建体在以该表达构建体转化的植物细胞中相比于缺少所述内含子的表达构建体显示降低的转基因沉默。

35.项目34所述的方法，其中所述内含子导入至第一和第三多核苷酸序列的至少一个中。

36.项目34所述的方法，其中所述内含子导入至第一和第三多核苷酸序列。

37.项目34所述的方法，其中所述表达构建体导入至内含子中。

38.一种控制由靶作物害虫或病原体或其后代摄食植物的方法，包括向植物中导入由项目34所述的方法制备的表达构建体。

39.一种根据项目34所述的方法制备的表达构建体。

40.一种由项目39所述的表达构建体转化的植物细胞。

41.一种提高dsRNA的害虫或病原体抑制活性的方法，包括：

a)获得第一核酸节段，其在作为dsRNA表达并被靶作物害虫或病原体摄入时抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和

b)连接所述第一核酸节段至第二核酸节段以产生更长的核酸节段，其中所述第二核酸节段是在作为dsRNA表达时不抑制所述靶作物害虫或病原体或其后代摄食的核酸，且其中相比于单从所述第一核酸节段表达的dsRNA，由所述更长核酸表达的dsRNA显示对所述靶作物害虫或病原体或其后代摄食的提高的抑制效力。

42.项目41所述的方法，其中所述第一核酸节段由包括下述步骤的方法获得：

I)获得起始核酸分子，其在作为dsRNA表达并被靶作物害虫或病原体摄入时抑制所述靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和

II)选择所述起始核酸分子的至少第一部分，其在由所述部分表达的dsRNA被摄入后抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和

III)使用所述部分作为步骤a)中所述第一核酸节段。

43.项目42所述的方法，其中所述起始核酸分子是cDNA。

44.项目42所述的方法，其中步骤II)包括从所述起始核酸分子制备一系列重叠或连续部分并从所述部分鉴定至少第一部分，所述第一部分在以dsRNA表达并被所述靶作物害虫或病原体摄入时抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

45.项目41所述的方法，进一步包括生产包括第一、第二和第三多核苷酸序列的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列包括所述更长的核苷酸节段和其中所述第三多核苷酸序列通过所述第二多核苷酸序列连接至所述第一多核苷酸序列，以及其中所述第三多核苷酸序列基本上是所述第一多核苷酸序列的反向互补物以致所述第一和第三多核苷酸序列在转录成核糖核酸时杂交以形成由连接的第二核糖核苷酸序列所稳定的双链核糖核酸分子。

46.项目41所述的方法，其中所述第二核苷酸节段与所述靶作物害虫或病原体的核苷酸序列不是基本上互补。

47.项目41所述的方法，其中所述第一核酸节段和所述第三核酸节段之一或两者包括内含子。

48.项目47所述的方法，包括导入内含子至所述第一核酸节段。

49.项目41所述的方法，其中所述第一核酸节段包括与所述靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的约19至约80个连续碱基。

50.项目41所述的方法，其中所述第一核酸节段包括与所述靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的约19至约50个连续碱基。

51.项目41所述的方法，其中所述第一核酸节段包括与所述靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的约21至约30个连续碱基。

52.项目41所述的方法，其中所述更长的核酸节段包括至少约80个碱基。

53.项目41所述的方法，其中所述更长的核酸节段包括至少约100个碱基。

54.项目41所述的方法，其中所述更长的核酸节段包括约80至约250个碱基。

55.项目41所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是昆虫。

56.项目55所述的方法，其中所述昆虫选自由鞘翅目、鳞翅目、半翅目和同翅目昆虫组成的组。

57.项目55所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是Diabrotica spp。

58.项目41所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是线虫。

59.一种表达构建体，包括根据项目41所述的方法制备的更长核酸节段和可操作地连接至启动子的其反向互补物。

60.一种控制靶作物植物害虫或病原体或其后代摄食植物的方法，包括导入项目59所述的表达构建体至所述植物细胞。

61.一种由根据项目41所述的方法制备的更长核酸所表达的dsRNA。

62.一种由项目59所述的表达构建体转化的植物细胞。

63.一种包括项目59所述的表达构建体的转基因植物。

64.一种生产用于表达具有提高的害虫或病原体抑制活性的特异性的dsRNA的表达构建体的方法，包括：

a)获得与靶作物害虫或病原体的至少第一编码序列基本上互补的起始核酸分子；

b)在所述起始核酸分子内选择区域，所述区域在作为dsRNA表达时，在由所述靶作物害虫或病原体摄入从该区域表达的dsRNA后，抑制所述靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；

c)连接所述区域至第二核酸分子以产生表达构建体，其中所述第二核酸分子在作为dsRNA表达时不抑制所述dsRNA摄入后由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

65.项目64所述的方法，其中所述在起始分子内选择区域包括从所述起始核酸分子中选择一系列重叠或连续区域并从所述区域鉴定至少第一区域，所述区域在作为dsRNA表达并由所述靶作物害虫或病原体摄入时抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

66.项目64所述的方法，其中所述起始核酸分子是来自所述靶作物害虫或病原体的cDNA。

67.项目64所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是昆虫。

68.项目67所述的方法，其中所述昆虫选自由鞘翅目、鳞翅目、半翅目和同翅目组成的组。

69.项目67所述的方法，其中所述昆虫选自由D.virgifera virgifera；D.virgifera zeae；D.undecimpunctata；D.balteata；D.barberi和D.speciosa组成的组。

70.项目64所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是线虫。

71.项目64所述的方法，其中所述靶作物害虫或病原体是Diabrotica spp。

72.项目64所述的方法，其中所述区域包括与所述靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的约19bp至约50bp。

73.项目72所述的方法，其中所述区域包括与所述靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的约21bp至约30bp。

74.项目64所述的方法，包括鉴定所述起始分子内至少第二区域，所述区域在作为dsRNA表达时抑制所述靶作物害虫或病原体或其后代的摄食，以及连接所述第二区域至所述第二核酸分子或第三核酸分子，所述第三核酸分子在作为dsRNA表达时在被靶作物害虫或病原体摄入从所述第三核酸分子表达的dsRNA后，不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

75.项目64所述的方法，其中所述区域与非-靶作物害虫或病原体不是基本上互补。

76.项目64所述的方法，其中所述区域与所述靶作物害虫或病原体被分类入其中的种独有的核酸互补。

77.项目64所述的方法，其中所述区域与所述靶作物害虫或病原体被归类入其中的属独有的核酸互补。

78.项目64所述的方法，其中所述区域是Diabrotica spp独有的。

79.项目78所述的方法，其中所述区域是Diabrotica spp独有的，其选自由Diabrotica undecimpunctata howardii(南部玉米根虫(SCR))、Diabrotica virgiferavirgifera(西部玉米根虫(WCR))、Diabrotica barberi(北部玉米根虫(NCR))、Diabroticavirgifera zeae(墨西哥玉米根虫(MCR))、Diabrotica balteata、Diabrotica viridula和Diabrotica speciosa(巴西玉米根虫(BZR))组成的组。

80.一种控制靶作物害虫或病原体或其后代摄食植物的方法，包括将由项目64所述的方法制备的表达构建体导入所述植物。

81.一种由项目64所述的方法制备的表达构建体所表达的dsRNA。

82.一种由项目64所述的方法制备的表达构建体转化的植物细胞。

83.一种在植物中增强靶作物害虫或病原体控制的方法，包括在所述植物的细胞中表达至少两种dsRNA序列，其在由所述害虫或病原体摄入时发挥功能以抑制所述靶作物害虫或病原体内至少第一靶编码序列的表达，其中所述两种dsRNA序列与所述第一靶编码序列的两个非-连续部分或所述靶作物害虫或病原体的两个不同编码序列基本上互补。

84.项目83所述的方法，其中所述两个dsRNA序列包括约19bp至约80bp。

85.项目83所述的方法，其中所述两个dsRNA序列包括约19bp至约50bp。

86.项目83所述的方法，其中所述两个dsRNA序列包括约21bp至约30bp。

87.项目83所述的方法，其中所述两个dsRNA序列与所述靶作物害虫或病原体的至少两个靶编码序列基本上互补。

88.项目87所述的方法，进一步包括在所述植物的细胞中表达至少第三dsRNA序列，其在由所述靶作物害虫或病原体摄入时发挥功能以抑制所述靶作物害虫或病原体内第三靶编码序列的表达，其中所述第三dsRNA序列与所述第三靶编码序列的一部分基本上互补。

89.项目83所述的方法，其中所述两种dsRNA序列是从选自起始核酸分子的区域表达的，所述起始核酸分子在作为dsRNA表达时在被靶作物害虫或病原体摄入所述dsRNA时，抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

90.项目89所述的方法，其中所述起始核酸分子是来自靶作物害虫或病原体的cDNA。

91.项目83所述的方法，进一步包括在细胞中表达选自由马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacilluslaterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白组成的组的多核苷酸序列。

92.项目91所述的方法，其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自由Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry2、ET29、ET37、双价杀虫蛋白CryET33和CryET34、双价杀虫蛋白CryET80和CryET76、双价杀虫蛋白TIC100和TIC101、双价杀虫蛋白ET29和TIC810、双价杀虫蛋白ET37和TIC812以及双价杀虫蛋白PS149B1组成的组。

93.项目83所述的方法，其中所述靶编码序列编码蛋白，其预测的功能选自由肌肉生成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶的合成、细胞膜电势的维持、摄食部位的形成、摄食部位的发育、摄食部位的维持、感染、蜕皮、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、发育及分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋亡组成的组。

94.项目87所述的方法，其中所述两个靶编码序列执行至少两种由所述dsRNA序列抑制的靶作物害虫或病原体存活所必须的功能，所述功能选自由害虫或病原体摄食、细胞凋亡、细胞分化和发育、有性生殖的能力或欲望、肌肉生成、肌肉抽搐、肌肉收缩、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、幼虫期过渡、蛹化、从蛹羽化、细胞分裂、能量代谢、呼吸和细胞骨架结构的形成组成的组。

95.项目83所述的方法，其中所述靶作物害虫是玉米根虫，其选自由Diabroticaundecimpunctata howardii(南部玉米根虫(SCR))、Diabrotica virgifera virgifera(西部玉米根虫(WCR))、Diabrotica barberi(北部玉米根虫(NCR))、Diabrotica virgiferazeae(墨西哥玉米根虫(MCR))、Diabrotica balteata、Diabrotica viridula和Diabroticaspeciosa(巴西玉米根虫(BZR))组成的组。

96.一种调控作物害虫对用于控制该作物害虫的试剂的抗性的方法，包括接触所述作物害虫与由项目1所述的方法生产的核酸节段以及一种其它的选自马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacilluslaterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白、生物控制剂和杀虫剂组成的组的试剂。

97.项目96所述的方法，其中所述杀虫剂选自由卡巴立杀虫剂、氰戊菊酯、顺式氰戊菊酯、马拉硫磷、克百威杀虫剂、氯蜱硫磷、大福松、甲拌磷、特丁磷、扑灭司林、新烟碱和七氟菊酯组成的组。

98.项目96所述的方法，其中所述其它试剂以种子处理提供。

附图说明

下述附图形成本说明书的一部分并被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文呈现的具体实施方式的详细说明可更好地理解本发明。

图1A-1B：100bp的Dv49靶标节段与来自其它代表多个属、目和门的生物的相关序列的比对。不同于Diabrotica virgifera virgifera(Dv49)的序列被突出。Dv49概念性翻译的氨基酸比对(a.a.)在核苷酸序列下示出。对Dv49序列计算Reynolds分数并在氨基酸比对下示出-分数位置对应于反义链21mer的核苷酸19。在Reynolds分数下显示来自嵌入的26mer效力筛查(scan)的数据。可从各筛查节段产生的可能21mer被加上下划线，每个筛查节段下示出在人工的饮食生物检测中饲以0.2ppm每种嵌入节段时产生的WCR死亡率。*与未处理对照显著不同，P值＜0.05，Planned Contrasts。

图2：与多Diabrotica spp.比对的来自Na/K-交换ATPase(推定的Drosophila基因，CG9261，直系同源物)的编码序列的节段。符合群共有性(group consensus)的序列被框出并且加阴影。测序显示在一些情况下存在等位基因(例如NCR序列位置49处的“R”)。

图3：利用559bp的Dv26节段和DNASTAR软件包中的ClustalW算法(Madison，WI)确定的系统发育树。

图4：降低基因转录本和生成的dsRNA转录本之间的直接连续序列同一性的转基因的设计。转录单元可以由来自非丰裕地(productively)掺入RISC的siRNAs的合成序列终止。

图5：用于在指定位点插入表达盒的小的有效dsRNA节段。

图6：用于在WCR饮食生物检测中作为dsRNA分析的300bp Diabrotica virgiferaV-ATPase A亚基节段。UTC＝未处理对照。EST＝缺少片段1和2的短V-ATPase A亚基cDNA克隆。

图7：以1ppm饲食时Dv49嵌入的约26mer效力筛查。

图8：以0.2ppm饲食时Dv49嵌入的约26mer效力筛查。

图9：以21mers筛查的Dv49筛查14 27mer节段并在0.2ppm检测效力。

具体实施方式

一方面，本发明提供获得提供所需靶基因抑制水平的核酸节段(segment)的方法，包括：a)获得与靶基因基本上互补的起始核酸分子；b)由起始核酸分子制备多个核酸节段；c)当核酸节段在包括该靶基因的细胞中作为dsRNA表达时，检测其抑制靶基因表达的能力；和d)从在作为dsRNA表达时提供所需靶基因抑制水平的多个核酸节段中鉴定至少第一核酸节段。在该方法中，核酸节段可包括约21至约26个所述起始核酸分子的连续核苷酸部分，包括约22、23、24和25个核苷酸部分。在某些实施方式中，节段包括所述起始核酸分子的重叠部分而在具体实施方式中可能是邻近节段。另外的实施方式中，核酸节段可定义为包括约0.1％至约98％的所述靶基因，例如包括约0.2％、0.4％、0.75％、2％、5％、10％、15％、25％、40％、60％、75％和90％。

在发明的一个实施方式中，可根据核酸节段作为dsRNA表达时获得的靶基因抑制水平对所述核酸节段分等(rank)。所需的靶基因抑制水平可以是所述靶基因表达的约1％至约100％的抑制。某些实施方式中，所需的抑制水平可以是靶基因的完全抑制或不完全抑制。具体实施方式中，靶基因可以是植物、昆虫、真菌、细菌或脊椎生物，包括作物害虫(croppest)或病原体基因。检测核酸节段抑制靶基因的能力可包括在包含该靶基因的细胞中作为dsRNA表达所述节段并确定该靶基因的抑制水平。一个实施方式中，这可包括计算核酸节段的Reynolds分数。另一实施方式中，检测核酸节段抑制靶基因的能力包括在包含该靶基因的生物的饮食中以dsRNA分子提供所述节段并确定该靶基因的抑制水平。确定靶基因的抑制水平可包括观察所述生物的发病率、死亡率或生长迟缓(stunting)。

另一方面，本发明提供在细胞中抑制靶基因表达的方法，包括a)根据本文提供的方法获得核酸节段；和b)将由核酸表达的dsRNA提供至包含该靶基因的宿主细胞以抑制靶基因的表达。在该方法中，提供由核酸节段表达的dsRNA至宿主细胞可包括在宿主细胞中以正义和反义方向表达核酸节段。提供由核酸节段表达的dsRNA至宿主细胞可包括提供包括dsRNA的饮食至细胞或包括该细胞的生物并允许细胞摄入该dsRNA。在一个实施方式中，宿主细胞是害虫细胞并且提供由核酸表达的dsRNA至害虫细胞包括在植物细胞中表达该dsRNA并允许包括该细胞的害虫以该植物细胞为食。具体实施方式中，通过对所述细胞或包括该细胞的害虫的表型效应显示害虫细胞中靶基因表达的抑制。该表型效应可以是程序性细胞死亡。

又一方面，本发明提供调节生物中至少第一基因表达的方法，包括(a)将由本发明的方法获得的至少第一核酸节段作为dsRNA提供至所述生物，其中所述dsRNA节段在所述生物中对所述基因特异；和(b)观察所述生物的表型效应。在该方法中，所述表型效应可选自由营养生长停止、生殖生长停止、摄食停止、死亡率、发病率、生长迟缓、瘫痪、有性生殖抑制、蜕皮抑制、不能飞行和不能从蛹期羽化(failure to emerge from pupal stage)组成的组。

又一方面，本发明提供用于调节植物害虫中基因表达水平的方法，包括在所述害虫的饮食中提供至少第一dsRNA分子，并观察所述害虫中一种或更多种基因抑制的表型效应(phenotypic effect)，其中所述dsRNA分子由显示与所述害虫的一种或更多种必要基因的相应DNA序列基本上同源的核苷酸序列产生，并且其中所述核苷酸序列是根据本文提供的方法鉴定的核酸节段。

又一方面，本发明提供用于抑制植物害虫侵染(infestation)的方法，包括在转基因植物中表达根据本发明的方法获得的dsRNA分子并提供该植物或其部分或其组织至一种或更多种包括所述核苷酸序列的害虫，以及观察所述生物中的表型效应，其中该表型效应足以抑制所述害虫侵染所述转基因植物。

又一方面，本发明提供保护植物免于害虫侵染的方法，包括在转基因植物中表达根据本发明获得的dsRNA分子并提供该植物或其部分或其组织至一种或更多种包括所述核苷酸序列的害虫，以及观察所述生物中的表型效应，其中该表型效应足以抑制所述害虫侵染所述转基因植物。本发明还提供根据本文所述任意方法被保护免于害虫侵染的植物，以及从该细胞中再生的植物，还有从该植物产生的种子或后代，其中所述种子或后代包括根据本发明获得的核苷酸序列。

又一方面，本发明提供生产用于在植物细胞中表达具有降低的转基因沉默的dsRNA的表达构建体的方法，包括：(a)制备包括第一序列、第二序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列相连并且第三多核苷酸序列基本上是第一多核苷酸序列的反向互补物；和(b)导入内含子至第一和第三多核苷酸序列的至少一个中或导入所述表达构建体至内含子中，其中第一和第三多核苷酸序列在转录成RNA时杂交并在内含子剪接后形成由第二多核苷酸序列稳定的dsRNA分子，其中表达构建体在用该表达构建体转化的植物细胞中相比于缺乏该内含子的表达构建体显示降低的转基因沉默。一个实施方式中，内含子导入第一和第三多核苷酸序列的至少一个之中。另一实施方式中，内含子导入第一和第三多核苷酸序列。在另外的实施方式中，表达构建体导入内含子中。

又一方面，本发明提供控制靶作物害虫或病原体或其后代对植物的摄食的方法，包括将利用本文公开的任何方法制备的表达构建体导入植物。该构建体可例如通过直接遗传转化或通过亲本植物和/或祖细胞的转化而导入。本发明还提供根据本文公开的任何方法制备的表达构建体。再进一步提供由本文公开的表达构建体转化的转基因植物和植物细胞。

又一方面，本发明提供提高dsRNA的害虫或病原体-抑制活性的方法，包括：(a)获得起始核酸分子，其在作为dsRNA表达并被靶作物害虫或病原体摄入时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和(b)连接第一核酸节段至第二核酸节段以产生更长的核酸节段，其中第二核酸节段是在作为dsRNA表达时不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代摄食的核酸，且其中相比于单从第一核酸节段表达的dsRNA，由更长的核酸表达的dsRNA显示对于靶作物害虫或病原体或其后代摄食的提高的抑制效力。一个实施方式中，通过下述方法获得第一核酸节段，包括步骤：I)获得第一核酸节段，其在作为dsRNA表达并被靶作物害虫或病原体摄入时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；II)选择至少起始核酸分子的第一部分，其在摄入由所述部分表达的dsRNA后抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和III)使用该部分作为步骤a)所述的第一核酸节段。该起始核酸分子可以是cDNA。一个实施方式中，步骤II)包括从起始核酸分子制备一系列重叠或连续部分并从所述部分鉴定至少第一部分，其在作为dsRNA表达并由靶作物害虫或病原体摄入时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。

在具体实施方式中，提高dsRNA的害虫或病原体抑制活性的方法可进一步包括产生包括第一、第二和第三多核苷酸序列的重组载体，其中第一多核苷酸序列包括更长的核苷酸节段而其中第三多核苷酸序列通过第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列相联，其中第三多核苷酸序列基本上是第一多核苷酸序列的反向互补物，从而第一和第三多核苷酸序列在转录成核糖核酸时杂交以形成被连接的第二核糖核苷酸序列所稳定的双链核糖核苷酸分子。在具体实施方式中，第二核苷酸节段不与靶作物害虫或病原体的核苷酸序列基本上互补。另外的实施方式中，第一核酸节段和第三核酸节段之一或二者包括内含子。该方法还可包括导入内含子至所述第一核酸节段。另外的实施方式中，第一核酸节段可包括约19至约80，约19至约50和约21至约30个与靶作物害虫或病原体的编码序列基本上互补的连续碱基。更长的核酸节段可包括至少约80个碱基，包括至少约100个碱基和约80bp至约250个碱基。一个实施方式中，靶作物害虫或病原体是昆虫并且可以是鞘翅目(coleopteran)、鳞翅目(lepidopteran)、同翅目(Homopteran)或半翅目(Hemipteran)，例如Diabroticaspp.。在其它实施方式中，靶作物害虫或病原体是线虫(nematode)。

另一方面，本发明还提供生产用于表达具有提高的害虫或病原体抑制活性的特异性的dsRNA的表达构建体的方法，包括：(a)获得与靶作物害虫或病原体至少第一编码序列基本上互补的起始核酸分子；(b)在起始分子内选择这样的区域，其在靶作物害虫或病原体或其后代摄入由该区域表达的dsRNA后，抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；(c)连接该区域至第二核酸分子以产生表达构建体，其中第二核酸分子在作为dsRNA表达时，不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代在摄入该dsRNA后的摄食。该方法使用的起始核酸分子可以是来自靶作物害虫或病原体(例如昆虫或线虫)的cDNA。具体实施方式中，昆虫可以是鞘翅目、鳞翅目、同翅目或半翅目昆虫，包括选自由下述组成的组的昆虫：D.virgiferavirgifera；D.virgifera zeae；D.undecimpunctata；D.balteata；D.barberi；和D.speciosa。另外的实施方式中，第一核酸节段可包括约19至约80，约19至约50和约21至约30个基本上与靶作物害虫或病原体的编码序列互补的连续碱基。更长的核酸节段可包括至少约80个碱基，包括至少约100个碱基和约80bp至约250个碱基。

本发明的又一方面提供方法，包括在起始分子中鉴定至少第二区域，其在作为dsRNA表达时，抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食，并连接该第二区域至第二核酸分子或第三核酸分子，其在作为dsRNA表达，并随后被靶作物害虫或病原体摄入由第三核酸分子表达的dsRNA时，不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。一些实施方式中，该区域与非靶作物害虫或病原体的核酸不是基本上互补(is not substantiallycomplementary)。其它实施方式中，该区域与靶作物害虫或病原体被分类入其中的种特有的核酸互补。其它实施方式中，该区域与靶作物害虫或病原体被分类入其中的属特有的核酸互补。其它实施方式中，该区域是Diabrotica spp.特有的，包括那些选自由Diabroticaundecimpunctata howardii(南部玉米根虫(SCR))、Diabrotica virgifera virgifera(西部玉米根虫(WCR))、Diabrotica barberi(北部玉米根虫(NCR))、Diabrotica virgiferazeae(墨西哥玉米根虫(MCR))、Diabrotica balteata、Diabrotica viridula和Diabroticaspeciosa(巴西玉米根虫(BZR))组成的组。

另一方面，本发明提供控制由靶作物植物害虫或病原体或其后代摄食植物的方法，包括向植物中导入表达构建体或由前述方法制备的dsRNA。本发明还提供转化有前述方法制备的表达构建体的植物细胞。

又一方面，本发明提供提高植物中对靶作物害虫或病原体的控制的方法，包括在植物的细胞中表达至少两dsRNA序列，其在被害虫或病原体摄入时发挥作用以抑制靶作物害虫或病原体中至少第一靶编码序列的表达，其中两dsRNA序列与第一靶编码序列的两非连续部分或靶作物害虫或病原体的两不同编码序列基本上互补。另外的实施方式中，本发明提供方法，其中两dsRNA序列包括长度约19bp至约80bp，或约19bp至约50bp，或约21bp至约30bp。另一实施方式中，两dsRNA序列与靶作物害虫或病原体的至少两靶编码序列基本上互补。本方法还可包括在植物细胞中表达至少第三dsRNA序列，其在由害虫或病原体摄入时发挥作用以抑制靶作物害虫或病原体中第三靶编码序列的表达，其中第三dsRNA序列与第三靶编码序列的一部分基本上互补。其它实施方式中，提供了方法，其中两dsRNA序列从选自起始核酸分子(其在作为dsRNA表达随后被靶作物害虫或病原体摄入dsRNA时，抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食)的区域所表达。该起始核酸分子还可是来自靶作物害虫或病原体的cDNA。

其它实施方式中，提供的方法还包括在细胞中表达选自由马铃薯块茎蛋白(patatin)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacillus laterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白组成的组的多核苷酸序列。其它实施方式中，示例性的多核苷酸可编码选自由Cry1、Cry2、Cry3组成的组的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白，或选自由TIC851、CryET70、ET29组成的组的鞘翅目毒蛋白，双价杀虫蛋白(binary insecticidal protein)CryET33和CryET34，双价杀虫蛋白CryET80和CryET76，双价杀虫蛋白ET29和TIC810，双价杀虫蛋白TIC100和TIC101和双价杀虫蛋白PS149B1或其它鞘翅目毒蛋白(例如deMaagd等，2003)。其它针对控制其它植物害虫的杀虫组合物是可能的，例如，如在下述网址lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html中罗列的全部毒素，并且也可以包括如其中所述的一种或更多种VIP毒素。因此，某些实施方式中，控制剂(control agent)的组合包括一种或更多种本发明的表达dsRNA的多核苷酸以及至少一种对植物害虫(例如昆虫或线虫)有毒性的其它试剂。

本发明还提供方法，其中靶编码序列编码蛋白，其预测的功能选自由肌肉生成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶的合成、细胞膜电势的维持(maintenance of cell membrane potential)、摄食部位的形成、摄食部位的发育、摄食部位的维持、感染、蜕皮、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、发育及分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋亡组成的组。另一实施方式中，本发明提供方法，其中两编码序列被靶向。该两靶编码序列可行使至少两种对于被dsRNA序列抑制的靶作物害虫或病原体存活所必需的功能，该功能选自由害虫或病原体摄食、细胞凋亡、细胞分化和发育、有性生殖的能力或欲望、肌肉生成、肌肉抽搐、肌肉收缩、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、幼虫期过渡(larval stage transition)、蛹化、从蛹羽化(emergence from pupation)、细胞分裂、能量代谢、呼吸和细胞骨架结构的形成组成的组。

本发明还提供抗性管理的方法，包括使靶生物接触至少本发明的第一核酸节段，以及选自由马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacillus laterosporus杀虫蛋白、Bacillus sphaericus杀虫蛋白、或如网址lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html所述的其它杀虫Bt毒素、生物控制剂和杀虫剂组成的组中的一种或更多种试剂。

发明详细说明

本文描述了用于提高调节植物害虫和病原体中基因表达的dsRNA分子的效力和表达的方法和组合物。该方法提高由编码dsRNA的植物转基因产生的小干扰RNA(siRNA)或相关节段的特异性，并提供植物害虫和植物病原体中dsRNA-介导的靶基因表达抑制。优化转基因构建体和转基因序列大小以生产并递送在特定靶物种的细胞中有效的一种或更多种核糖核苷酸，而避免产生相反可能以不想要的方式调节基因表达的非特异性siRNAs。同时，通过优化靶序列的排列，本发明通过用内含子打断连续的靶序列降低了植物中转基因沉默的可能，从而防止识别该基因并导致植物中沉默的反馈。

特异靶向害虫或病原体种的序列可工程化入植物表达构建体，例如用反向重复的那些方法或通过使用诱发dsRNA形成的其它方法。利用克隆siRNA或利用通过呈递dsRNA片段至筛查(scan)靶序列的细胞或整个害虫而凭经验确定，可以确定有效导致靶信息(message)降解的21-24mers。使用该信息，可以产生用于植物内原位表达的新型序列结构。该序列结构可以进一步设计以产生dsRNA分子，其编码一种或更多种被靶物种有效摄入的siRNA分子，同时导致形成对调节靶物种中靶基因的特定直系同源物、同系物或等位基因表达特异的siRNAs。基于基因家族成员间序列多态性，通过设计靶向该成员的dsRNA构建体可抑制基因家族特定成员的表达。因此，基于其对特定靶种、群或亚群凭经验确定或预测的效力，dsRNA构建体中可包括特定靶序列(例如siRNA大小的(siRNA-sized)，长度约20-25个碱基对)，并且可不包括特异性差或非特异序列，而仍旧实现将有效的转基因编码的dsRNA转运至靶生物的细胞。特异siRNA大小的核糖核酸序列的效力可以通过生物检测法的实际评估或通过使用考虑生物物理参数(对于有效或无效siRNAs是相同的)的预测工具(例如Reynolds评分；Reynolds等，2004)而确定。

对用外源性(例如转基因植物产生的)RNA靶向害虫种所需的特定要求的理解提高生产高效且特异的转基因构建体的能力。在西部玉米根虫(WCR)中，确定WCR V-ATP酶A亚基的50bp片段在串联重复5次(总计250bp)时足以诱发死亡，但作为50bp单体则是无效的。该50bp片段嵌入中性载体序列以产生100bp的总dsRNA也是有效的。因此对于高效摄入至RNAi易感生物存在最优大小。该观察指明对于害虫控制需要“稳定”近似大小的dsRNA的产生。

使用载体概念，可以在更长序列中嵌入一种或更多种siRNA序列用于转录。该序列可用于证明任何候选siRNA(独立于相邻的天然发生序列)的效率，允许在设计编码dsRNA的转基因构建体时提高灵活性。天然发生的相邻序列(其证明效力或特异性更差)可从dsRNA构建体除去，然而该构建体编码必需序列和序列长度，以便在在植物宿主内表达并在靶生物细胞中摄取和加工后产生有效的siRNA。这一知识使得建立将编码siRNAs的被选序列整合至高效初级表达转录本的新型嵌合序列。

利用本发明的方法设计的转基因也可具有编码siRNA序列(通过放置内含子而打断)的dsRNA片段。靶序列中一种或更多种内含子序列的包涵体可提高最终产生有效siRNA的初级转录本的生产和稳定性，而显示将在植物细胞中沉默的降低的倾向。诸如5和3’非翻译区(UTRs)和其它序列的附加序列，例如产生至少植物加工所需的最小尺寸的外显子，可通过组合不诱发有效siRNAs的序列(例如直接串联正义序列)而产生。其它外显子序列可通过不产生丰裕的siRNAs的序列而产生。这种排列可导致转基因沉默(例如通过甲基化和在植物宿主细胞的最终转录沉默)的可能性降低，因为该基因在序列上与产生siRNAs的加工的转录本(其可相反通过染色质结构的改变造成转基因沉默)不同。初级转录本的siRNA区中内含子的存在也可减缓整体加工并提高因此得到的dsRNA的存活力或稳定性(图4)。

其它靶序列可通过用上述设计的多种内含子和外显子延伸该初级转录单元而添加。有效siRNAs的重叠和在重叠内放置内含子可扩大靶序列的数量而最小化构建体内所需内含子的数量(图5)。可以配置一种或更多种不同的序列，每种编码siRNA(针对于一种或更多种靶基因的表达)并调节靶生物中的基因表达。

两种或多种靶基因的表达抑制允许通过dsRNA-介导的基因抑制向靶生物提供多种作用模式。也可通过结合一种或更多种dsRNA-介导的方法与诸如源自芽孢杆菌的杀虫肽(例如晶体蛋白)的其它方法在转基因植物中实现多种作用模式以干扰靶生物的生长和发育。结合几种或多种编码有效siRNAs的序列，可能地于其它方法结合也允许产生持久的害虫抗性管理方案。

A、核酸组合物和构建体

本发明提供重组DNA构建体以用于实现宿主植物细胞的稳定转化。转化的宿主细胞可表达有效水平的优选的dsRNA分子和因此来自重组DNA构建体的siRNA以调节靶细胞中的基因表达。可从cDNA和/或基因组文库提供分离并纯化的核苷酸片段。推导的核苷酸序列信息允许鉴定成对核苷酸序列(其可源自任何优选的无脊椎害虫，例如昆虫)以用作热扩增引物而产生本发明的dsRNA和siRNA分子。

如本文所使用，术语“核酸”指单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的聚合物。该“核酸”也可以任选地含有非天然生成或改变的核糖核苷酸碱基，其允许聚合酶正确通读并且不减少由该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指单个单链或双链核酸的正义和反义链。术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、sRNA(小RNA)、tRNA(转移RNA，带有或者不带有相应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)，而术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。措辞“核酸节段”、“核苷酸序列节段”或更普遍地，“节段”(segment)将被本领域技术人员理解为包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和更小的工程化的核苷酸序列(其表达或可适于表达多核苷酸、蛋白、多肽或肽)的功能性术语。

根据本发明提供核苷酸序列，其表达产生与靶生物中靶基因的RNA分子基本上同源的RNA序列。因此，摄入稳定的RNA序列后，可以获得靶生物的细胞中靶基因核苷酸序列表达的下调，导致靶生物在维持、摄食、生存力、繁殖或再生上的有害效应。

如本文所使用，对于核酸序列的术语“基本上同源的”(substantiallyhomologous)或“基本的同源性”(substantial homology)包括在严谨条件下杂交至如序列表中所述的编码序列的核苷酸序列，或其互补物。在严谨条件下杂交的序列是允许在两序列间发生反平行比对的那些，然后该两序列在严谨条件下能够与相对链上的相应碱基形成氢键以形成在严谨条件下足够稳定至利用本领域公知的方法可检测的双链分子。基本上同源的序列优选地具有与如序列表所述的核苷酸序列或其互补物约70％至约80％的序列同一性，或更优选约80％至约85％的序列同一性，或更优选约90％至约95％的序列同一性，至约99％的序列同一性。

如本文所使用，术语“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”用于描述两个或多个核苷酸序列间的序列关系。通过在对比窗比较两个优化比对的序列确定两序列间的“序列同一性”百分数，其中对比窗中的序列部分相比于参照序列(其不包括添加或缺失)可包括添加或缺失(即缺口)用于两序列的优化比对。这样计算百分数：确定在两序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以获得匹配位置的数量，将该匹配位置的数量除以对比窗中位置总数，并将结果乘以100得到序列同一性的百分数。在比较的每个位置都与参照序列相同的序列被认为与参照序列相同，反之亦然。如果第一多核苷酸序列显示与第二或参照序列完全互补，则认为从5’到3’方向观察时的第一多核苷酸序列是从3’到5’方向观察时的第二或参照核苷酸序列的互补体或与其互补。如本文所使用，当一个序列的每个核苷酸从5’到3’阅读与其它序列的每个核苷酸从3’到5’阅读时互补，认为核酸序列分子显示“完全互补性”。与参照核苷酸序列互补的核苷酸序列将显示与参照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和说明在本领域很好地定义并且易于被本领域普通技术人员所理解。

如本文所使用，“对比窗”指至少6个连续位置的概念性节段，通常约50至约100，更通常约100至约150个位置，其中序列与连续位置数相同的参照序列在两序列优化比对后相比较。对比窗相比于参照序列(其不包括添加或缺失)可包括约20％或更少的添加或缺失(即缺口)用于两序列的优化比对。例如本领域技术人员应参考Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，(Genetics Computer Group，575Science DriveMadison，Wis.，USA)用于序列比对的具体方法。

本发明提供能够在细胞或微生物中表达为RNA以抑制靶生物的细胞、组织或器官中靶基因表达的DNA序列。该序列可包括编码一种或更多种不同核苷酸序列的DNA分子，其中不同核苷酸序列的每个包括正义核苷酸序列和反义核苷酸序列。该序列可通过间隔序列连接。该间隔序列可组成正义核苷酸序列或反义核苷酸序列的一部分并且发现位于正义和反义序列间的dsRNA分子内。正义核苷酸序列或反义核苷酸序列与靶基因或其衍生物的核苷酸序列或其互补序列基本上相同。dsDNA分子可在于表达dsDNA的宿主的细胞、组织或器官中起作用的启动子序列的控制下可操作地放置以产生dsRNA分子。如本文所使用，术语“植物表达构建体”指重组DNA分子，其包括在植物细胞中可操作地连接至编码dsRNA的DNA序列的功能性启动子，以及3’转录末端的多核苷酸分子。

本发明还提供用于在植物细胞中表达的DNA序列，其在DNA表达为RNA并被靶生物(例如植物病原体或植物害虫)摄入时，实现靶生物的细胞、组织或器官中的靶基因抑制。dsRNA可包括一种或更多种结构基因序列，其中每种结构基因序列包括可以被间隔序列(其在互补正义和反义序列内形成环)连接的正义核苷酸序列和反义核苷酸序列。具有适当剪接位点的内含子序列可置于至少正义和反义核苷酸序列之一。没有任何内含子存在的正义核苷酸序列或反义核苷酸序列与靶基因、其衍生物的核苷酸序列或其互补序列基本上相同。一种或更多种结构基因序列可在一种或更多种启动子序列的控制下可操作地放置，至少其一在宿主生物的细胞、组织或器官中对转录本的表达是可操作的。

根据本发明，用于控制靶生物中基因表达的基因序列或片段可克隆于两组织特异性启动子(其在转基因细胞中是可操作的)之间，并在转基因植物细胞中表达以产生mRNA，其与它形成dsRNA分子。植物组织中含有的dsRNA分子可被靶生物摄入从而实现想要的靶基因表达抑制。

本发明提供的核苷酸序列可包括由“间隔序列”分开的反向重复。该间隔序列可以是包括促进每个重复间形成二级结构(在需要的地方)的任何核苷酸序列的区域。本发明的一个实施方式中，间隔序列是mRNA的正义或反义编码序列的一部分。或者间隔序列可包括能够共价连接至核酸分子的核苷酸或其同源物的任何组合。例如，间隔序列可包括长度至少约10-100个核苷酸，或者长度至少约100-200个核苷酸，长度至少约200-400个核苷酸，或长度至少约400-500个核苷酸的核苷酸序列。

核酸分子或核酸分子的片段或序列表中的其它核酸分子能够在某些条件下特异地杂交其它核酸分子。如本文所使用，认为如果两分子能形成反相平行、双链核酸结构，那么两核酸分子能够相互特异杂交。如果核酸分子与又一核酸分子显示完全互补，则认为它们互补。如果两分子能够以允许它们在至少常规“低严谨性”条件下保持相互退火的足够稳定性而相互杂交，则认为其是“最小互补”。类似地，如果它们能够以允许它们在至少常规“高严谨性”条件下保持相互退火的足够稳定性而相互杂交，则认为其互补。Sambrook等(1989)和Haymes等(1985)描述了常规严谨条件。

因此允许并非完全互补，只要其不完全阻碍分子形成双链结构的能力。因此，为了核酸分子或核酸分子的片段用作引物或探针，其只需要序列充分互补以能够在使用特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。

促进DNA杂交的适当的严谨性条件是例如，在约45℃，6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃用2.0x SSC冲洗，这是本领域技术人员已知的或者可以在CurrentProtocols in Molecular Biology(1989)中找到。例如，冲洗步骤的盐浓度可以选择从50℃时约2.0x SSC的低严谨性至50℃时约0.2x SSC的高严谨性。另外，冲洗步骤的温度可以从室温约22℃的低严谨性条件提高至约65℃的高严谨性条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定而改变其它变量。优选地，用于本发明的核酸将显示与如序列表中所述一种或更多种核酸分子至少约80％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％或甚至约100％的序列同一性。

也可利用本领域已知的方法全部或部分(特别是在需要提供植物偏爱的序列时)合成本发明的核酸。因此，利用所选择的宿主偏爱的密码子可以合成本发明的核酸的全部或部分。例如，物种偏爱的密码子可以从在具体宿主物种中所表达蛋白最常用的密码子来确定。核苷酸序列的其它修饰可导致具有略微改变的活性的突变体。

dsRNA或siRNA核苷酸序列包括聚合的核糖核苷酸的双链并且可以包括对磷酸-糖骨架或核苷的修饰。可设计RNA结构的修饰以允许特异的基因抑制。在一个实施方式中，dsRNA分子可通过酶解修饰以便可产生siRNA分子。siRNA可有效介导一些靶生物的一些靶基因的下调效应。该酶解可通过使用存在于昆虫、脊椎动物、真菌或真核RNAi途径的植物(Elbashir等，2002；Hamilton和Baulcombe，1999)的细胞中的RNAse III酶或DICER酶完成。该过程也可使用通过易于被本领域技术人员获知的重组DNA技术导入生物细胞中的重组DICER或RNAse III。生物中天然存在的，或者通过重组DNA技术制造的DICER酶和RNAse III将较大dsRNA链切割成更小的寡核苷酸。DICER酶特异地将dsRNA分子切成每个长度是约19-25个核苷酸的siRNA片段，而RNAse III酶通常将dsRNA分子切成12-15个碱基对的siRNA。由上述任一种酶产生的siRNA分子具有2-3个核苷酸3′突出(overhang)以及5′磷酸和3′羟基末端。在真核RNAi途径中由RNAse III酶产生的siRNA分子与由Dicer酶产生的那些相同，并因此在其随后展开后通过固有的细胞RNA-降解机制被靶向并降解，分离成单链RNA并与由靶基因转录的RNA序列杂交。该过程产生靶生物中由靶基因的核苷酸序列编码的RNA序列被有效降解或除去。结果是靶生物中特定靶核苷酸序列的沉默。可以在Hannon(2002)中找到酶解的详细说明。

本发明的核苷酸序列可以在计算机可读介质上记录。如本文所使用，计算机可读介质”指任何可以被计算机直接读取和存取的有形的表达介质。该介质包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘、存储介质和磁带；光存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；光字符识别格式的计算机文件，以及这些类型的混合，例如磁/光存储介质。熟练的技术人员可以容易地理解任何目前已知的计算机可读介质可以用于生产其上包括记录了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质的产品。

如本文所使用，“记录”指在计算机可读介质上存储信息的过程。熟练的技术人员可以容易地采用任何目前已知的用于在计算机可读介质上记录信息的方法以产生包括本发明核苷酸序列信息的介质。熟练的技术人员可以获得多种数据存储结构以产生在其上记录了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质。数据存储结构的选择通常将基于所选择的用来访问存储信息的方法。此外，多种数据处理程序和格式可用于在计算机可读介质上存储本发明的核苷酸序列信息。序列信息可以用文字处理文本文件(采用市售可得的软件格式(例如WordPerfect和Microsoft Word))表示，或者以ASCII文本文件的形式(存储于诸如DB2，Sybase，Oracle等的数据库应用中)表示。熟练的技术人员可以容易地采用任何数量的数据处理的结构化形式(例如文本文件或数据库)以便获得于其上记录了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质。

计算机软件是公众可得的，其允许熟练的技术人员存取计算机可读介质所提供的序列信息。在Sybase系统实现了BLAST(Altschul等，1990)和BLAZE(Brutlag等，1993)检索算法的软件可被用于鉴定本文提供的和来自含有与其它生物的ORFs或蛋白同源序列的序列(例如Unigenes和EST’s)内的开放读码框(ORFs)。该ORFs是本发明的序列中编码蛋白的片段并且对生产商业上重要的蛋白是有用的，该蛋白例如用于氨基酸生物合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白修饰和DNA复制、限制、修饰、重组和修复的酶。

本发明进一步提供系统，尤其是含有本文所述序列信息的基于计算机的系统。设计该系统以鉴定在商业上重要的本发明核酸分子的片段。如本文所使用，“基于计算机的系统”指用于分析本发明的核苷酸序列信息的硬件工具、软件工具、和数据存储工具。最小硬件指包括中央处理单元(CPU)、输入工具、输出工具和数据存储工具的本发明的基于计算机的系统。熟练的技术人员可以容易地理解任何一种目前可得的基于计算机的系统适合用于本发明。

如本文所使用，“靶结构模体”或“靶模体”(target motif)指任何被合理选择的序列或序列的组合，其中基于靶模体折叠时形成的三维构型选择序列或一条序列。存在多种本领域已知的靶模体。蛋白靶模体包括但不限于酶活性位点和信号序列。核酸靶模体包括但不限于启动子序列、顺式元件、发夹结构、siRNAs、以及诱导型表达元件(蛋白结合序列)。

B、重组载体和宿主细胞转化

例如，重组DNA载体可以是线性或闭合环状的质粒。载体系统可以是一个载体或质粒或者一起含有待导入到细菌宿主基因组的总DNA的两个或多个载体或质粒。另外，细菌载体可以是表达载体。如序列表中所述的核酸分子或其片段可以例如，在适当启动子(其在一种或更多种微生物宿主中起作用以驱动连接的编码序列或其它DNA序列的表达)的控制下，适当地插入载体。许多载体对此目的是可获得的，并且适当载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸大小以及待用该载体转化的特定宿主细胞。每个载体根据其功能(DNA扩增或DNA表达)以及与其相容的特定宿主细胞而含有不同组分。用于细菌转化的载体组分通常包括但不限于，下述一种或更多种：信号序列、复制起点、一种或更多种选择标记基因以及允许表达外源DNA的诱导型启动子。

表达和克隆载体可含有选择基因(也称作选择标记)。该基因编码生长于选择培养基中的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。典型的选择基因编码这样的蛋白(a)赋予抗生素、除草剂或其他毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤、草甘膦或四环素抗性，(b)补充营养缺陷，或(c)供给不能从复合培养基中获得的关键营养，例如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。被外源蛋白或其片段成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白并因此在选择方案中存活。

产生mRNA的表达载体也可以含有诱导型启动子，其被宿主生物识别并可操作地连接至编码目的核酸分子或其片段的核酸。适合与细菌宿主一起使用的诱导型启动子包括β-内酰胺酶启动子、大肠杆菌λ噬菌体PL和PR启动子，大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子，和乳糖操纵子启动子及其变异以及杂合启动子例如tac启动子。然而，其它已知的细菌诱导启动子是适合的。下面讨论植物启动子。

在述及调控序列和结构核苷酸序列时使用的术语“可操作地连接”指调控序列造成连接的结构核苷酸序列的调控表达。“调控序列”或“控制元件”指位于结构核苷酸序列上游(5’非编码序列)，其中，或下游(3’非翻译序列)的核苷酸序列，其影响转录的时序和水平或数量、RNA加工或稳定性或相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏蛋白结合序列以及多聚腺苷酸化识别序列等。

或者，表达构建体可以通过整合载体整合到宿主细胞基因组。整合载体通常含有至少一个与允许载体整合的染色体同源的序列。在细菌的情况下，整合似乎由载体和染色体的同源DNA之间的重组而产生。例如用来自各种芽孢杆菌(Bacillus)株系的DNA所构建的整合载体整合到芽孢杆菌染色体(EP 0 127,328)。整合载体也可由细菌噬菌体或转座子序列所组成。自杀性质粒载体也是本领域已知的。

使用标准重组DNA技术构建含有一种或更多种上述罗列组分的适宜载体。可以以产生需要的质粒所需的形式切割、加工和重连接分离的质粒或DNA片段。有效的细菌表达载体的实例包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如Bluescript^TM(Stratagene，La Jolla，CA)；piN载体(Van Heeke和Schuster，1989)等。

酵母重组构建体可通常包括下述一种或更多种：启动子序列、融合伙伴序列、前导序列、转录终止序列、选择标记。这些元件可以结合到表达盒，其可于复制子中保持，例如能够在诸如酵母或细菌的宿主中保持的染色体外元件(例如质粒)。复制子可具有两个复制系统，从而允许其被保持例如，在酵母中(用于表达和)在原核宿主中(用于克隆和扩增)。该酵母-细菌穿梭载体的实例包括YEp24(Botstein等，1979)，pCl/1(Brake等，1984)，和YRp17(Stinchcomb等，1982)。另外，复制子可为高或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒将通常具有拷贝数在约5至约200的范围，且通常约100至约150。含有高拷贝数质粒的宿主将优选具有至少约10，更优选至少约20个拷贝。

有用的酵母启动子序列可以源自在代谢途径中编码酶的基因。该基因的实例包括乙醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284044)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 3215447)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供有用的启动子序列(Myanohara等，1983)。此外，天然不存在的合成启动子也起酵母启动子的作用。该杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区相联的ADH调控序列(美国专利No.4,876,197和4,880,734)。转录终止子序列和其它酵母识别的终止序列(例如编码糖酵解酶的那些)的实例是本领域技术人员已知的。

或者，表达构建体可以用整合载体整合到酵母基因组。整合载体通常含有至少一种与允许载体整合的酵母染色体同源的序列，并优选含有表达构建体的两个同源侧翼序列。整合似乎产生于载体和酵母染色体的同源DNA之间的重组(Orr-Weaver等，1983)。通过选择载体中适于包涵体的同源序列可将整合载体整合到酵母中的特定座位。参见Orr-Weaver等，上文。可整合一种或更多种表达构建体，可能影响产生的重组蛋白的水平(Rine等，1983)。

本发明还考虑转化本发明的核苷酸序列到植物中以实现一种或更多种dsRNA分子表达水平的抑制。转化载体通常包括一种或更多种能够被转录成与靶生物基因组编码的一种或更多种核苷酸序列基本上同源和/或互补的RNA分子的核苷酸序列，并且可在其它同源或互补的序列中包括内含子序列以至于从一种或更多种核苷酸序列转录和加工的RNA被生物摄入导致靶生物基因组分别的核苷酸序列中至少其一的表达下调。

转化载体可定义为dsRNA构建体并且也可定义为重组分子、害虫或疾病控制剂、遗传分子或嵌合基因构建体。本发明的嵌合基因构建体可包括，例如编码一种或更多种反义转录本、一种或更多种正义转录本、一种或更多种前述每种核苷酸序列，其中因此形成的转录本的全部或部分与靶生物基因组中包括由核苷酸编码的RNA序列的RNA分子的全部或部分同源。

一个实施方式中，植物转化载体包括分离并纯化的DNA分子，其包括可操作地连接至一种或更多种本发明的核苷酸序列的同源启动子。核苷酸序列可选子序列表中所述的那些或其片段。核苷酸序列可包括编码存在于靶生物内的全部或部分RNA的片段。RNA转录本可包括靶RNA的全部或部分的反向重复。包括表达载体的DNA分子也可含有位于编码序列上游或甚至在编码序列内的功能性内含子序列，并且也可在启动子和翻译起始点之间含有五个主要(5’)非翻译前导序列(即UTR或5’-UTR)。

植物转化载体可含有来自一种或更多种基因的序列，因此使得产生一种以上的用于抑制靶生物细胞中基因或多个基因表达的dsRNA。本领域技术人员将容易地理解与不同基因中存在的序列相应的DNA片段可以结合至一个复合DNA片段以在转基因植物中表达。或者，已经含有至少一个DNA片段的本发明质粒可以在增强子和启动子和终止子序列之间通过按顺序插入其它DNA片段而修饰。在本发明设计用于抑制多基因的疾病或害虫的控制剂中，可以从相同的靶物种中获得待抑制的基因以便增强控制剂的效力。在某些实施方式中，基因可以源自不同病原体或害虫生物以便拓宽病原体(试剂对其是有效的)的范围。当针对于多基因的抑制或表达和抑制的组合时，可以按照美国申请公开号No.US 2004-0029283说明并公开制造多顺反子DNA元件。

在不同植物种类中起作用的启动子也是本领域公知的。植物中表达多肽有用的启动子包括如Odell等(1985)所述的诱导型、病毒、合成或组成型的那些，和/或时间调控、空间调控和时空调控的启动子。优选的启动子包括增强型CaMV35S启动子，和FMV35S启动子。也可优选显示根特异性的CaMV35S启动子片段。许多组织特异性启动子已经被鉴定并且是本领域已知的(例如美国专利5,110,732；5,837,848；Hirel等，1992；Stahl等，2004；Busk等，1997)。

本发明的重组DNA载体或构建体通常包括赋予植物细胞选择表型的选择标记。选择标记也可用于筛选含有编码本发明的多肽或蛋白的外源核酸的植物或植物细胞。标记可编码杀虫剂抗性、抗生素抗性(例如卡那霉素、G418博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如草甘膦等)选择标记的实例包括但不限于编码卡那霉素抗性且可以使用卡那霉素，G418等筛选的neo基因，编码除草剂抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变EPSP合成酶基因；赋予溴苯腈抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变乙酰乳酸合成酶基因(ALS)；和抗甲氨喋呤的DHFR基因。该选择标记的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中说明。

本发明的重组载体或构建体也可包括筛选标记。筛选标记可用于监控表达。筛选标记的实例包括β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种生色底物已知的酶(Jefferson，1987；Jefferson等，1987)；R-座位基因，其编码调控植物组织中(Dellaporta等，1988)花色甙色素(红色)生成的产物；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，其是编码各种生色底物已知的酶(例如PADAC，生色头孢菌素)的基因；荧光素酶基因(Ow等，1986)，编码可以转变生色邻苯二酚的邻苯二酚双加氧酶的xylE基因(Zukowsky等，1983)；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，其编码能够氧化酪氨酸为DOPA和多巴醌(其反过来缩合成黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，其催化生色α-半乳糖底物。

优选的植物转化载体包括源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒(例如美国专利Nos.4,536,475，4,693,977，4,886,937，5,501,967和EP 0 122 791)。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)质粒(或“Ri”)也是有用的且是本领域已知的。其它优选的植物转化载体包括那些由例如Herrera-Estrella(1983)；Bevan(1983)，Klee(1985)和EPO 0 120 516公开的。

通常，可优选在植物基因组非特异位置导入功能性重组DNA。在特殊情况下，通过位点特异性重组插入重组DNA构建体可以是有用的。一些已知起外植体作用的存在的位点特异性重组系统包括如美国专利4,959,317公开的cre-lox和如美国专利5,527,695公开的FLP-FRT。

认为与本发明一起使用的适当的转化宿主细胞的方法实际上包括可以将DNA导入至细胞的任何方法(参见，例如Miki等，1993)，例如利用原生质体转化(美国专利No.5,508,184；Omirulleh等，1993)，利用脱水/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)，利用电转化(美国专利5,384,253)，利用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等，1990；美国专利No.5,302,523；和美国专利No.5,464,765)，利用农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；6,384,301)以及利用DNA涂覆颗粒的加速(美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；6,403,865；Padgette等，1995)等。通过诸如此等技术的应用，实际上可稳定转化任何物种的细胞。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可再生至转基因生物。

最广泛使用的导入表达载体至植物的方法是基于农杆菌的天然转化系统(例如Horsch等，1985)。A.tumefaciens和A.rhizogenes是遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。A.tumefaciens和A.rhizogenes的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。众多文献提供了农杆菌载体系统的说明和农杆菌介导的基因转化方法，包括Gruber等，1993；Miki等，1993，Moloney等，1989,和美国专利Nos：4,940,838和5,464,763。其它与植物天然接触的细菌(例如Sinorhizobium，Rhizobium和Mesorhizobium)可以被改良以介导基因转化至许多不同植物。这些植物相关的共生菌可以通过获取卸甲Ti质粒和适当的双元载体(Broothaerts等，2005)被制成基因转化的感受态。

例如，通过将产生本文公开的核酸的dsRNA插入植物转化载体并将其导入植物可以制备植物转化载体。已经通过改良Agrobacterium tumefaciens的天然基因转化系统获得了一种已知的载体系统。该天然系统包括含有大片段(称作T-DNA，其转入转化的植物细胞)的大Ti(肿瘤诱导)质粒。Ti质粒的另一片段(vir区)负责T-DNA转移。T-DNA区由末端重复定界。在改良的双元载体中，肿瘤诱导基因已经被删除且利用vir区的功能转移由T-DNA边界序列定界的外源DNA。T-区也可含有用于有效回收转基因细胞和植物的选择标记，以及用于插入转移序列(例如dsRNA编码核酸)的多克隆位点。

转基因植物可通过植物细胞培养领域公知的方法从转化的植物中再生。利用农杆菌转化方法形成的转基因植物通常含有一个简单的重组DNA序列(插入一条染色体)，这被称作转基因事件(transgenic event)。该转基因植物可以指对插入的外源序列的杂合。通过独立分离子(independent segregant)(含有一个外源基因序列)性交至其自身(自交)，例如F0代植物以产生F1代种子可以获得对于转基因杂合的转基因植物。产生的F1代种子中四分之一对于转基因将是杂合的。F1代种子的萌发导致可以检测植物的杂合度，通常使用SNP检测或热扩增检测以允许区别杂合与纯合(即接合性检测)。将杂合的植物自身或与另一杂合的植物杂交导致只有杂合的后代。

C、核酸表达及靶基因抑制

作为实例，本发明提供致病性靶生物的转化的宿主植物、转化的植物细胞和转化的植物及其后代。在杂合启动子的控制下，转化的植物细胞和转化的植物可被工程化以表达一种或更多种dsRNA序列(包括siRNA)，以提供害虫或病原体保护效应。这些序列可被用于害虫或病原体中基因抑制，从而降低由病原体对保护的转化宿主生物造成的疾病水平或发病率。如本文所使用，措词“基因抑制”意指任何公知的降低蛋白(是基因转录成mRNA和随后mRNA翻译所产生)水平的方法。

基因抑制也意指从基因或编码序列的蛋白表达的减少，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制由所有或部分mRNA(从目的在于抑制的基因或编码序列转录)与相应双链RNA(用于抑制)之间的同源性所介导，并且指在细胞中可获得的由核糖体结合的有效的mRNA量的实质的和可测量的减少。转录的RNA可以是正义方向以起所谓共抑制的作用，是反义方向起所谓反义抑制的作用，或者是产生dsRNA的两方向以起RNA干扰的(RNAi)作用。

转录抑制由细胞中显示序列与靶DNA序列或其互补物基本上相同的dsRNA基因抑制剂的存在所介导。对植物害虫或病原体中可摄入或接触含有基因抑制剂的植物材料的靶基因的基因抑制可以是有效的，尤其是设计为抑制或遏制靶生物的细胞中一种或更多种同源或互补序列的表达。美国专利Nos.5,107,065，5,759,829，5,283,184和5,231,020公开了反义或正义定向的RNA的转录后基因抑制来调节植物细胞中基因表达。dsRNA在抑制植物中基因表达的应用公开于WO 99/53050，WO 99/49029，美国专利公开No.2003/0175965和2003/0061626，美国专利申请系列No.10/465,800和美国专利Nos.6,506,559和6,326,193。

基因抑制的有益方法使用正义方向和反义方向的转录RNA，例如以发夹和茎环结构所稳定。影响靶生物中基因抑制的优选的DNA构建体是这样的，其第一片段编码显示反义方向(显示与目的在于抑制的基因片段基本上相同)的RNA，其连接至第二“间隔”片段，和至第三片段(编码显示与第一片段基本上互补的RNA)。该构建体通过杂交第一片段与第三片段形成茎环结构，和来自连接第一和第三片段的第二多核苷酸序列的环结构(参见WO94/01550，WO98/05770，US 2002/0048814和US 2003/0018993)。

根据本发明的一个实施方式，提供核苷酸序列，其体外表达导致与RNA分子(其包括由靶生物基因组内的核苷酸序列所编码的RNA序列)基本上同源的稳定的RNA序列转录。因此，靶生物摄入稳定的RNA序列后，靶生物细胞中靶基因相应的核苷酸序列的下调被影响。

使用本发明的稳定的dsRNA技术抑制靶基因是序列特异的，因为对应于RNA双链区的核苷酸序列的目的是基因抑制。优选含有与靶基因的部分核苷酸序列相同的RNA用于抑制。相对于靶序列带有插入、缺失和单位点突变的RNA序列也可发现对抑制有效。在进行本发明时，优选抑制性dsRNA和靶基因的部分具有至少约80％序列同一性，或约90％序列同一性，或约95％序列同一性，或约99％序列同一性，或者甚至约100％序列同一性。或者，RNA的双链区可功能性地定义为能够与靶基因转录本的部分杂交的核苷酸序列。展示更高同源性的小于全长序列补偿更长的同源性更差序列。相同核苷酸序列的长度可以是至少约20，50，100，200，300，400，500或至少约1000个碱基。通常，将使用大于约20个核苷酸的序列。相对于靶基因的初级转录产物或完全加工的mRNA，导入的核酸分子可能不需要具有绝对同源性，并且可能不需要是全长。因此，本领域技术人员需要认识如本文所公开，实践本发明的具体实施方式可能不需要RNA和靶基因之间的100％序列同一性。本领域技术人员还将认识导入的核酸与靶序列之间序列相似性程度越大将导致越高的基因抑制水平。

通过测量由靶RNA翻译所产生的外源靶RNA或蛋白，可以量化靶基因表达的抑制并且抑制的结果可以通过检查细胞或生物的明显(outward)特性而确认。用于量化RNA和蛋白的技术是本领域普通技术人员所公知的。

在某些实施方式中，基因表达被抑制至少10％，优选至少33％，更优选至少50％，和还更优选至少80％。在本发明优选的具体实施方式中，靶生物细胞中基因表达被抑制至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，或至少99％以至于发生明显抑制。明显的抑制意指产生可检测的表型(例如营养或生殖生长、摄食停止、死亡等)或RNA和/或蛋白(对应于被抑制的靶基因)可检测的减少的足够抑制。尽管在本发明的某些实施方式中，在靶生物的基本上所有细胞中发生抑制，在其它优选的实施方式中，只在表达基因的细胞亚群中发生抑制。

可以在体内或体外合成dsRNA分子。可通过单个的自身互补RNA链或从两互补RNA链形成dsRNA。细胞的外源性RNA聚合物可介导体内转录，或者克隆的RNA聚合酶可以被用于体内或体外转录。可由器官、组织或细胞类型的特异转录；环境条件的刺激(例如感染、胁迫、温度、化学诱导物)；和/或在发育阶段或时期的工程化转录而靶向抑制。RNA链可能或可能不多聚腺苷酸化；RNA链可能或可能不能够被细胞翻译器翻译成多肽。

本领域的技术人员通过手工或自动反应或在另一生物的体内可以化学地或酶促地产生本发明的RNA，dsRNA，siRNA或miRNA。RNA也可通过部分或全部有机合成产生；任何修饰的核糖核苷酸可以通过体外酶促或有机合成被导入。可由细胞RNA聚合酶或细菌噬菌体RNA聚合酶(例如T3，T7，SP6)合成RNA。表达构建体的使用和产生是本领域已知的(参见例如WO 97/32016；美国专利Nos.5,593,874，5,698,425，5,712,135，5,789,214和5,804,693)。如果化学合成或通过体外酶促合成，可在导入细胞前纯化RNA。例如，通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合可以从混合物纯化RNA。或者，可以使用没有纯化或最小纯化的RNA以避免由于样品加工的损失。RNA可干燥用于储存或溶解于水溶液。溶液可含有缓冲液或盐以促进退火，和/或双链稳定。

对于来自体内转基因或表达构建体的转录，可以使用调控区(例如启动子、增强子、沉默子和聚腺苷酸化)以转录RNA链(或双链)。因此，在一个实施方式中，用于生产RNA分子的核苷酸序列可以被可操作地连接至一种或更多种在微生物、真菌或植物宿主细胞中起作用的启动子序列。理想地，在外源启动子的控制下放置该核苷酸序列，通常置于宿主基因组。因此外源启动子通常是转基因的杂合启动子。在可操作地连接的启动子序列的控制下，本发明的核苷酸序列可进一步通过附加序列(有益地影响其转录和/或生成的转录本的稳定性)而于侧翼相连。该序列通常位于可操作地连接的启动子的上游和/或表达构建体的3’端的下游，并且可出现启动子的上游和表达构建体的3’端的下游，尽管也考虑只有该上游序列。

如本文所使用，术语“基因抑制剂”指由第一RNA片段、第二RNA片段和第三RNA片段组成的特定RNA分子。位于RNA分子的长度内的第一和第三RNA片段，基本上相互反向重复，并且通过第二RNA片段连在一起。至少编码第一和第三RNA片段的核苷酸序列之一可包括内含子序列。在除去内含子时第一和第三RNA片段之间的互补性导致两片段体内和体外杂交以形成双链分子的能力，即在第一和第三片段每个的一端由第二片段(形成环)连在一起的茎，以至于整个结构形成茎环结构，或者更紧密杂交结构可形成茎环成结(knotted)结构。对于从靶生物的靶基因转录的靶RNA(由dsRNA分子的摄入和导入所抑制)，第一和第三片段总是对应于正义和反义序列但并非分别对应于正义和反义序列。控制剂也可以是基本上纯化(或分离的)核酸分子并且更特别地是来自基因组DNA(gDNA)或cDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子。或者该片段可包括具有约15至约250个核苷酸残基，更优选约15至约30个核苷酸残基的更小寡核苷酸。

如本文所使用，术语“基因组”在其应用于靶生物或宿主植物的细胞时，不仅包含核内发现的染色体DNA，还包含细胞亚细胞组分中发现的细胞器DNA。导入植物细胞的本发明的DNA因此可以是染色体整合的或细胞器定位的。术语“基因组”在应用于细菌时，包含细菌宿主细胞中的染色体和质粒。导入细菌宿主细胞的本发明的DNA因此可以是染色体整合的或质粒定位的。

如本文所使用，术语“靶生物”或“靶作物害虫”指环境中存在且可感染、造成疾病或侵染转化的宿主植物材料以表达或包覆有含基因抑制剂的双链基因抑制剂的子囊菌、担子菌、半知菌、卵菌、病毒、线虫，昆虫等。如本文所使用，“植物病原性微生物”指可以造成植物疾病的微生物，包括病毒、细菌、真菌、卵菌、壶菌、藻类和线虫。如本文所使用，术语“植物害虫”指诸如甲虫、蝗虫、象虫、蚜虫、螨虫、叶蝉、蓟马、粉虱、根虫、钻心虫、蛴螬等的昆虫。

如本文所使用，“病原体抗性”或“害虫抗性”性状是造成植物宿主抗来自害虫或病原体袭击(通常能造成植物的损害或损失)的宿主植物特征。该抗性可由中性突变或者更通常从赋予抗性的重组DNA的掺入所产生。为了赋予转基因植物抗性，例如，重组DNA可以被转录到在重组植物的组织或液体中形成dsRNA分子的RNA分子。RNA分子的形成也可包括加工，例如内含子剪接。dsRNA分子部分包括RNA片段，其与优选造成重组植物疾病的害虫或病原体内DNA序列编码的相应RNA片段相同。靶生物内相应基因的表达被dsRNA所抑制，并且靶生物中该基因表达的抑制导致该植物抗害虫或病原体。Fire等(美国专利No.6,506,599)一般性地描述害虫感染的抑制，提供只有约几个核苷酸序列(其对线虫种Caenorhabditiselegans中基因功能的抑制有效)的特效药。类似地，US 2003/0061626描述了使用dsRNA抑制各种线虫害虫中的基因功能。US 2003/0150017描述了利用dsDNA序列转化宿主细胞以表达与特定害虫中靶序列基本上相同的相应dsRNA序列，并且尤其描述构建表达该dsRNA序列的重组植物以被各种植物害虫摄取，促进害虫生物基因组中基因的下调并提高植物对害虫侵染的抗性。

dsRNA的调节效应对害虫或病原体中表达的各种基因是可用的，包括例如，负责细胞代谢或细胞转化的外源基因，包括持家基因、转录因子和其它参与编码细胞代谢的多肽的基因。

如本文所使用，短语“基因表达的抑制”或“靶生物的细胞中靶基因的抑制性表达”指靶生物内不存在(或可观察地减小)蛋白和/或mRNA产物水平的靶基因。特异性指抑制靶基因而不表现对细胞其它基因的作用且对产生dsRNA分子的细胞内的任何基因没有任何作用的能力。靶生物中靶基因的基因表达的抑制可导致靶生物的新表型性状。为了产生持久的转基因性状，将需要在个体转基因作物植物的发育期和靶生物的生育期发生dsRNA的产生和/或其加工成siRNA。

本发明部分地提供通过宿主细胞或细胞内含物的摄取用于递送靶生物控制剂的递送系统。根据另一实施方式，本发明涉及产生含有重组DNA构建体(转录本发明的稳定的dsRNA分子)的转基因植物细胞或植物。如本文所使用，短语“摄入”指试剂与靶生物的细胞接触或进入其中的过程。其可通过例如融合、主动导入、摄取、摄食、注射或浸渍而发生。如本文所使用，术语“产生转基因植物细胞或植物”指使用本领域易于获得的重组DNA技术(例如，Sambrook等，1989)构建转录根据本发明的稳定的dsRNA分子的植物转化载体，以转化植物细胞或植物并产生含有该转录的、稳定的dsRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物的方法。

本发明还提供方法，包括暴露靶生物至一种或更多种本发明的控制剂(其在喷雾混合器中混合并施用至宿主(例如宿主植物)的表面，包括作为种子处理(例如美国专利6,551,962)。该控制剂可因此用于利用本发明的dsRNA结合下述一种或更多种：如网站(lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)所述的Bt毒素、生物控制剂(a biocontrol agent)、杀虫剂和种子处理而靶向抑制靶生物中一种或更多种必要或病原性相关的基因而暴露靶生物。配制和施用该中子处理的方法是本领域已知的。

该应用(包括种子处理)可包括本领域已知的杀虫剂。实例如美国专利6,551,962所述，包括卡巴立(carbaryl)杀虫剂、氰戊菊酯(fenvalerate)、顺式氰戊菊酯(esfenvalerate)、马拉硫磷(malathion)、克百威(carbofuran)杀虫剂、氯蜱硫磷(chloropyrifos)、大福松(fonophos)、甲拌磷(phorate)、特丁磷(terbufos)、扑灭司林(permethrin)、新烟碱(neonicotinoid)和七氟菊酯(tefluthrin)等等。因此，可向靶生物提供致死性的组合，产生阻止抗性发展的抗性管理的工具(通过靶向生物至特定杀虫组合物)。生物控制剂是本领域已知的并且可包括，例如来自Rhizobium，Bacillus，Pseudomonas，Serratia，Clavibacter，Trichoderma，Glomus，Gliocladium属以及菌根真菌等等天然发生或重组的细菌或真菌。本发明也提供了该抗性管理的方法。

可与本发明一起使用的控制剂的组合包括一种或更多种多核苷酸(其包括或表达本发明的dsRNA(和至少一种其它对昆虫(例如鞘翅目)有毒性的试剂。该组合可用于提供“协同”效应。当谈及一些效应是“协同的”时，其意图包括dsRNA和杀虫剂组合对杀虫活性(或效力)的协同效应。然而，该协同效应被限定于杀虫活性是不想要的，因为该效应包括的意想不到的优点：提高的活性范围、涉及损害降低的类型和数量的有益的活性图谱、降低的杀虫剂成本和减少的施用、环境中减少的杀虫剂分布，减少的杀虫剂对生产、处理和植物作物播种的人员的暴露，以及本领域技术人员已知的其它优点。

在示例性实施方式中，害虫或病原体生物对控制剂的摄取递送控制剂至该生物的细胞。在又一实施方式中，RNA分子自身在合成的基质(例如聚合物)中封装并施用于诸如植物的宿主表面。由靶生物摄取的宿主细胞允许递送控制剂至该生物并导致该生物中靶基因的下调。

可以想到本发明的组合物可以作为由重组基因(掺入植物细胞基因组或掺入在种植前施用于种子的包衣或种子处理)表达的产物掺入该植物种的种子中。含有重组基因的植物细胞在本文中认为是转基因事件。

本发明部分提供用于递送疾病控制剂至靶生物的递送系统。本发明的稳定的dsRNA或siRNA分子可直接导入靶生物的细胞，或导入胞外空间(例如植物质外体)。导入的方法可包括直接混合RNA与生物的培养基，以及工程化的方法，其中作为宿主的物种被工程化以表达dsRNA或siRNA。在一个体外实施方式中，例如，dsRNA或siRNA分子可掺入或覆盖于生长培养基上部。在另一实施方式中，RNA可喷涂到植物表面。在又一实施方式中，dsRNA或siRNA可由微生物表达并且该微生物可施用于植物表面或利用物理方法(例如注射)导入根或茎。在又一个实施方式中，植物可被基因工程化以便以足够影响已知感染或侵染植物宿主的靶生物中靶基因表达的量表达dsRNA或siRNA。

也预想由化学或酶促合成所产生的dsRNA可以与常规农业实践一致的方式配制并用作控制植物疾病的喷涂(spray-on)产品。制剂可包括有效叶状覆盖所需的适宜的粘着剂和湿润剂，以及UV防护剂以防止dsRNA被UV损伤。该添加剂是生物杀虫剂工业常规使用的并且是本领域技术人员公知的。该应用可与其它喷涂杀虫剂应用(基于生物地或者不基于生物地)结合，以增强对植物免受感染和昆虫摄食损毁的保护。例如，RNA分子也可与另一控制剂结合，例如杀虫剂(例如Cry蛋白)或其杀虫片段。

本发明还涉及用于在微生物中表达的重组DNA构建体。可以使用本领域已知的方法将外源核酸(转录目的RNA)导入微生物细胞，例如细菌细胞或真菌细胞，

本发明的核酸序列可导入至多种原核和真核微生物宿主以产生稳定的dsRNA或siRNA分子。术语“生物”包括原核和真核物种，例如细菌和真菌。真菌包括酵母和丝状真菌等等。说明性的原核(革兰氏阴性和革兰氏阳性)包括肠杆菌科，例如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌(Shigella)沙门氏菌(Salmonella)和变形杆菌(Proteus)；芽孢杆菌科；根瘤菌科，例如根瘤菌(Rhizobium)；螺旋菌科，例如发光菌，运动发酵单孢菌(Zymomonas)，沙雷氏菌属(Serratia)，气单胞菌(Aeromonas)弧菌属(Vibrio)，脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，螺旋菌属(Spirillum)；乳酸杆菌科；假单胞菌科，例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科，放线菌(Actinomycetales)和硝化菌科。真核中是真菌，例如藻菌和子囊菌，其包括丝状真菌，例如核盘菌属(Sclerotinia)，白粉菌属(Erysiphe)等，和酵母，例如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)；担子菌，例如红酵母属(Rhodotorula)，短梗霉属(Aureobasidium)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)等；以及卵菌，例如疫霉属(Phytophthora)。

D、转基因植物

本发明提供转基因植物，包括但不限于苜蓿、玉米、油菜、水稻、大豆、烟草、草皮草和小麦等。本发明提供具有一种或更多种转基因事件的种子或植物。事件的组合指“层叠(stacked)的”转基因事件。这些层叠的转基因事件可以是针对于相同靶生物的事件，或者其可以是针对于不同靶病原体或害虫。在一个实施方式中，具有表达本文所提供的核酸的能力的种子也具有表达至少一种其它试剂的能力，该试剂包括但不限于RNA分子，其序列源自在靶病原体中表达并且在由种子生长的植物的种子或细胞中表达时形成双链RNA结构的RNA序列，其中靶病原体对一种或更多种植物细胞的摄取导致靶病原体细胞中RNA表达的抑制。

在某些实施方式中，具有表达dsRNA(源自靶生物的序列)的能力的种子也具有提供除草剂耐受的转基因事件。除草剂耐受基因(包括该除草剂的异丙胺盐的形式)的一个有益示例提供草甘膦、N-(膦羧甲基)甘氨酸抗性。

本发明提供的益处可包括但不限于：轻松导入dsRNA至靶生物的细胞、低浓度的可被使用的dsRNA、dsRNA的稳定性以及抑制的效力。使用低浓度的稳定的dsRNA的能力避免反义干扰的若干缺点。与本领域已知的一些有效的方法(例如反义或共抑制)相反，本发明不限于体外使用或特异的序列组合物，特定成套靶基因、靶基因核苷酸序列的特定部分或者特定的转基因或特定的递送方法。此外，遗传操作在并非经典遗传模型的生物中变得可能。

为了实现在需要控制的靶生物种内选择性地抑制靶基因，靶基因应优选显示与植物或脊椎动物的相应基因序列同一性程度低的。优选的序列同一性程度小于约80％。更优选序列同一性程度小于约70％。最优选序列同一性程度小于约60％。

除了用重组DNA构建体直接转化植物，通过将具有重组DNA构建体的第一植物与缺少该构建体的第二植物杂交可以制备转基因植物。例如，用于基因移植的重组DNA可以导入至第一株系(其对易于(amenable)转化)生产可以与第二株系杂交的转基因植物以将用于基因抑制的重组DNA基因渗入至第二株系。

实践中，本发明可以与植物中的其它疾病控制性状组合以实现增强植物疾病控制所需的性状。使用不同作用模式的疾病控制性状的组合可以提供对保护的转基因植物比具有单控制性状的植物更高的同一性和耐久性，因为在田间将产生抗性的可能性减小。

本发明也涉及能够含有本发明的一种或更多种序列的日用品，并且从含有一种或更多种本发明的核苷酸序列的重组植物或种子所产生的作为本发明实施方式具体考虑。含有一种或更多种序列的日用品意图包括但不限于饮食、油、磨碎的植物或植物的整个谷物或植物种子、或者包括任何含有一种或更多种本发明序列的重组植物或种子的磨碎的植物或植物的整个谷物或植物种子的任何食品。在本文考虑的一种或更多种商品或日用品中检测一种或更多种本发明的序列事实上证明由出于使用dsRNA介导的基因抑制方法来控制植物疾病的目的，该商品或日用品由设计为表达一种或更多种本发明的核苷酸序列的转基因植物所组成。

E、获得核酸

本发明提供获得包括用于生产dsRNA(包括siRNA)的核苷酸序列的核酸的方法。在一个实施方式中，该方法包括：(a)用杂交探针(包括来自靶生物的核苷酸序列或其同源物的所有或部分)探查cDNA或gDNA文库；(b)鉴定与杂交探针杂交的DNA克隆；(c)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；和(d)将包括步骤(c)中分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子转录RNA核苷酸序列或其同源物的所有或主要部分。

在另一实施方式中，本发明用于获得核酸片段(包括用于生产dsRNA或siRNA的主要部分的核苷酸序列)的方法包括：(a)合成靶生物的一种核苷酸序列的一部分相应的第一和第二寡核苷酸引物；和(b)使用步骤(a)中的第一和第二寡核苷酸引物扩增存在于克隆载体的cDNA或gDNA插入物，其中扩增的核酸分子转录本发明的dsRNA或siRNA的主要部分的主要部分。

在实践本发明时，靶基因可以源自造成作物植物损毁和随后产量损失的害虫或病原体物种。考虑到在选择优选的靶基因时刻使用若干准则。该基因可以是其蛋白产物具有快速更新(turnover)率的，以至于dsRNA抑制将导致蛋白水平的迅速降低。在某些实施方式中，选择对于靶生物的表达水平小量下降导致有害效应的基因是有益的。如果需要靶向大范围的害虫或病原体物种，选择在这些物种中高度保守的基因。相反，为了赋予特异性的目的，在发明的某些实施方式中，选择这样的基因，其在单个物种间，或者靶生物和其它生物间含有保守性差的区域。如本文所使用，术语“源自”指虽然不必须直接来自该指定的来源或物种，但可从具体指定的来源或物种获得的指定的核苷酸序列。

用于本发明的其它靶基因可包括，例如对靶生物的生存力、生长、摄食、发育、繁殖和感染性起作用的那些。这些靶基因可以是持家基因、转录因子等等之一。另外，用于本发明的核苷酸序列也可源自植物、病毒、细菌或昆虫基因(其功能已从文献证实且其核苷酸序列与靶生物基因组的靶基因具有基本上相似性。根据本发明的一个方面，该靶序列可主要源自靶生物。

为了本发明的目的，可以通过对源自gDNA或cDNA文库或其部分的靶基因序列的聚合酶链式(PCR^TM)扩增获得dsRNA或siRNA分子或编码其的寡核苷酸。DNA文库可使用本领域普通技术人员已知的方法制备。由靶生物产生的基因组DNA或cDNA文库可用于PCR^TM扩增以产生dsRNA或siRNA。可随后使用本领域容易获得的方法PCR^TM扩增靶基因并测序。本领域技术人员可能够改变PCR^TM的条件以保证生成最优PCR^TM产物。被确认的PCR^TM产物可用作体外转录的模板以产生带有内含最小启动子的正义和反义RNA。

本发明人考虑从任何害虫或病原体物种中鉴定并分离的核酸序列可用于本发明以控制植物疾病。在本发明的一个方面，核酸可源自西部玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera)。分离的核酸可用于例如，鉴定靶基因和编码有效siRNA分子的基因中的一种或更多种序列。其也可用于构建根据本发明方法的重组载体，其产生本发明的稳定的dsRNA或siRNA以保护植物免受根虫侵染。因此，在一个实施方式中，本发明包括分离的和纯化的核苷酸序列，其可用作植物害虫或疾病的控制剂。

可用于本发明的核酸也可包括分离的和基本上纯化的Unigenes和EST核酸分子或其核酸片段分子。EST核酸分子可编码多肽的重要部分或实际上绝大部分。或者，该片段可包括具有约15至约250个核苷酸残基，更优选约15至约30个核苷酸残基的更小的寡核苷酸。或者用于本发明的核酸分子可来自目的靶生物的cDNA文库。

来自害虫或病原体物种的核酸分子或其片段可用于获得来自其它物种(用于本发明以产生想要的dsRNA或siRNA分子)的其它核酸分子。该核酸分子包括编码该分子的蛋白和启动子以及侧翼序列的全部编码序列的核酸分子。另外，该核酸分子包括编码基因家族成员的核酸分子。该分子可以利用上述核酸分子或其片段筛选cDNA或基因组DNA文库而容易地获得。形成该文库的方法是本领域已知的。

如本文所使用，短语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”指当置于适当调控序列的控制下时，通常通过mRNA翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5’-末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子所确定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、EST和重组核苷酸序列。

术语“重组DNA”或“重组核苷酸序列”指通过突变、限制性酶等的操作而含有基因工程化的修饰的DNA。

对于众多可能靶向由本发明控制的害虫和病原体，从特定基因突变产生的多数基因序列或表型可能是有限的信息。因此，考虑从用于本发明的病原体中选择适当的基因可通过使用在模式生物(例如Saccharomyces cerevisia，或线虫种，例如C.elegans，昆虫种或植物种，其中基因已被表征)中研究相应基因所获得的信息而实现。在一些情况下，通过使用基因名称或序列(来自例如Drosophila(另一种昆虫)，线虫，或其中基因已被克隆的植物)检索诸如GenBank的数据库可以获得来自靶害虫或病原体的相应基因的序列。

为了从相应基因中获得DNA片段，可以基于在另一生物(已从其中克隆了基因)中发现的序列设计PCR^TM引物。设计引物以扩增长度足够用于本发明的DNA片段。从病原体制备DNA(基因组DNA或cDNA)，并且使用PCR^TM引物扩增DNA片段。选择扩增条件以至于在引物与靶序列不准确匹配时仍发生扩增。或者使用已知的基因作探针，从由病原体种类制备的gDNA或cDNA文库中克隆基因(或其部分)。从文库进行PCR^TM和克隆的技术是已知的。实施例中提供了该方法进一步的细节，通过该方法可基于之前从其它物种中克隆的基因序列分离来自靶病原体物种的DNA片段。本领域技术人员将认识到可使用各种技术从植物害虫和病原体生物中分离与之前从其它物种中所分离基因相应的基因片段。

实施例1、dsRNA呈现大小(presentation size)对玉米根虫中基因抑制的影响

编码西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera；WCR)V-ATP酶A亚基基因的部分的dsRNA构建体的生物检测(bio-assay)显示基因抑制中的效力。其它工作确定了WCR V-ATP酶A亚基基因的50bp节段(SEQ ID NO：1)在表现为dsRNA时，串联重复5次就足以引发死亡(mortality)，但作为50bp的单体时无效(表1)。嵌入总dsRNA为100bp的中性载体的50bp节段(segment)也是有效的，表明对于有效摄入dsRNA至易感于RNAi的昆虫来说存在大小限制。

使用由源自编码Dv49(Drosophila结合/载体蛋白(FlyBase sequence CG8055(SEQ ID NO：3))的推定直系同源物)(SEQ ID NO：2)的D.virgifera virgifera序列的27bp组成的不同基因序列也可以看出更小的单元大小的效力降低。Dv49的合成的27bp dsRNA节段当以1ppm饲食于昆虫时没用显示活性(表2)。嵌入载体骨架序列以产生50bp dsRNA的相同的27bp节段产生提高的效力。然而，该效力仍比嵌入总计206bp的dsRNA的相同的27mer要小(表2)。调节dsRNA的浓度以实现27mer序列的等摩尔比，显示50mer没有造成显著的死亡(表2)。因此，两非常不同的物种，C.elegans和D.virgifera，显示明显需要最小尺寸的dsRNA以允许高效摄入。这一观察表明确保在植物原位生产其大小足够使得能够导入靶害虫并随后控制它的dsRNA，而不是仅仅生产更小的siRNAs(其在接触靶标时有效的可能性更低)的重要性。

表1、在以1ppm饲食时，dsRNA大小对饮食生物检测中WCR控制的影响

¹致死率百分数和平均值的标准误差(standard error)。

*与未处理的对照有显著性差异，P值＜0.05，Planned Contrasts。

表2、饮食生物检测中，dsRNA大小对WCR控制的影响，单独使用27bp的Dv49靶标或嵌入中性载体并以1ppm的最终dsRNA浓度饲食。

¹致死率百分数和平均值的标准误差。

*与未处理的对照有显著性差异，P值＜0.05，Planned Contrasts。

实施例2、有效的玉米根虫基因靶标的精细作图：26-28mer分析

dsRNA序列的有效呈现(effective presentation)(其否则会低于有效摄入大小)通过在“载体”序列内嵌入节段至单siRNAs水平而完成。由于在之前昆虫生物检测中的高效力，选择WCR序列Dv49用于进一步分析。如下，用PCR合成从位于翻译起始点202bp的100bp片段(SEQ ID NO：4)：

利用表4所述的循环条件，扩增Dv49靶标的100bp节段，以利用寡核苷酸Dv49-1(SEQ ID NO：5)和Dv49-2(SEQ ID NO：6)产生反义模板；利用寡核苷酸Dv49-3(SEQ ID NO：7)和Dv49-4(SEQ ID NO：8)产生正义模板。

表3、用于克隆和扩增在26mer筛查评价中使用的Dv49的100bp节段的寡核苷酸。小写字母显示T7RNA聚合酶启动子(SEQ ID NO：5-8)

表4.dsRNA合成中使用的模板扩增的PCR条件。

使用下述反应条件：在50μl反应体积中，1X Sigma REDtaq缓冲液，200μM每种dNTP，0.4μM每种寡核苷酸引物，约200pg的pMON78428模板和2U的REDtaq聚合酶(Sigma，Cat.#D4309)。用MEGAshortscript^TM试剂盒(Ambion，Cat.#1354)根据制造商说明，每种PCR反应使用5μl生产单链转录本。混合正义和反义反应，加热至75℃持续5min并允许冷却至室温。用MEGAscript^TM RNAi试剂盒(Ambion，Cat#1626)根据制造商说明，对退火后的100bpdsRNA产物进一步纯化。该方法产生缺少T7启动子序列的100bp产物。

100bp的片段(fragment)用作dsRNA合成的模板，并且dsRNA进行昆虫生物检测。当饲以0.2ppm的100bp dsRNA时，WCR的死亡率是100％(表5)。当饲以源自载体骨架(180bp)自身的dsRNA时，没有观察到死亡。

表5、饮食生物检测中，dsRNA大小对控制WCR的影响，使用嵌入作为运载体(carrier)的载体序列(vector sequence)的26bp Dv49靶标(最终大小206bp)。以不同次数进行1ppm和0.2ppm的检测。

¹致死率百分数和平均值的标准误差。

*与未处理的对照有显著性差异，P值＜0.05，Planned Contrasts。

NA＝未检测

为了定义活性21bp节段(siRNA大小的)以及单核苷酸多态性(SNPs)对效力的影响，以5bp记录(register)筛查整个100mer碱基序列的26bp节段按下述克隆：合成产生源自100bp Dv49测试序列的26bp节段(Integrated DNA Technologies)作为正义和反义寡核苷酸。用于克隆的成对寡核苷酸(SEQ ID NO：9-38)退火并且通过设置下述反应加入3’A-突出物(overhang)：1X Sigma REDtaq缓冲液，200μM每种dNTP，0.4μM每种寡核苷酸引物和2U的REDtaq聚合酶并在75℃孵育2min随后在50℃20min。根据制造商说明，在TOPO-TA克隆载体(Invitrogen，Cat.#45-0641)中将2μl的每个PCR反应连接到PCR2.1-TOPO载体并且转化入E.coli TOP10细胞。在含有100μg/ml的羧苄青霉素且用40μl的50mg/ml X-Gal处理表面的LB平板上选择白色至浅蓝色的菌落。筛选序列正确且在载体中正义方向一致的菌落。除了相对于其它克隆的序列为反向的筛查7节段(pMON98376)以外，所有的都在相同的相对方向。

使用寡核苷酸pCR2.1-5和pCR2.1-6(SEQ ID NO：39-40)制备用于RNA合成的模板，循环条件如表4，并且使用与扩增Dv49 100mer模板相同的反应条件。扩增空载体(没有玉米根虫序列)pMON98397以用作载体序列的对照。从被证实的克隆扩增新鲜的PCR产物用于dsRNA合成。在由溴化乙锭染色的1-3％琼脂糖凝胶上显现扩增以保证合适的大小和质量。直接来自PCR试管的5μl等分试样用于dsRNA合成。根据MEGAscript^TM RNAi试剂盒(Ambion，Cat#1626)进行合成，进行下述改变：在对流加热炉中于37℃过夜进行转录。最终的dsRNA产物由260nm的吸收所量化，并且在1-3％琼脂糖凝胶上显现以保证产物的完整性。用于昆虫生物检测的所有样品在10mM Tris pH 6.8中稀释至终浓度(例如1ppm)。20μl的每种样品施用于200μl的昆虫饮食并允许在加入新生WCR前吸收到饮食中。在第12天对幼虫的生长迟缓和死亡计分。

使用pCR2.1-5和pCR2.1-6寡核苷酸，在更大的中性载体(载体骨架序列)中扩增对应于生成片段筛查0-筛查14的dsRNA(图1)，并且合成总dsRNA长度为206bp的dsRNA。由于克隆到pCR2.1-TOPO载体重现(recapitulate)了一些克隆的26mer节段的原始Dv49内容，某些情况下，被探询(interrogate)效力的序列实际上为27-28bp大小。当饲以1ppm从26mers合成的dsRNAs时，导致死亡率的范围从无显著性差异(相对于未处理的对照)到约95％死亡率(用筛查7节段)(图7，表5)。当饲以0.2ppm从26mers合成的dsRNAs时，导致死亡率的范围从无显著性差异(相对于未处理的对照)到约97％死亡率(用筛查3节段)(图8，表5)。

所测试的更低剂量证明在鉴别最具活性的节段中有用。从Dv49的每个克隆的节段的dsRNA中，若干21bp的siRNAs可能由内源WCR DICER活性产生。

实施例3、有效的玉米根虫基因靶标的精细作图：对筛查14区域的21mer分析

除了修饰末端以外，按上面所述合成源自26mer分析的筛查节段14(Scan segment14)的21bp节段，以便当退火时，在每个寡核苷酸(SEQ ID NO：41-54)的5’端产生Hind III限制性位点相容性突出和在3’端产生Spe I限制性位点相容性突出。这些被连接至HindIII/Spe I切割的pCR2.1-TOPO骨架。试图克隆可从筛查14产生的所有7种可能的21mer序列。对筛查15的克隆失败了并且发现克隆的筛查17序列含有点突变，这可能对其较差活性负责。扩增筛查节段16-21以产生模板并且对26mer筛查制备dsRNA。每个dsRNA的最终大小是184bp。样品被稀释，以0.2ppm施用并按上述计分。

在饮食生物检测中测试筛查14(筛查15-21)的这些21bp子序列并发现多数具有针对WCR的显著活性(表6；图9)。通常，正Reynolds分数(Reynolds等，2004)越高，表明基因抑制的可能性越大。显著的差异突出了在精细测绘抗害虫物种(例如根虫)的效力中经验测试的需要。

表6、饮食生物检测中，dsRNA大小对控制WCR的影响，使用嵌入作为运载体的载体序列的21bp Dv49靶标。也评估了来自Dv49的亲本嵌入26bp序列(筛查14)和100bp基础序列。同时进行1ppm和0.2ppm检测。示出了21bp序列的Reynolds分数。

¹致死率百分数和平均值的标准误差。

*与未处理的对照有显著性差异，P值＜0.05，Planned Contrasts。

NA＝未检测

实施例4、Dy49序列多态性对效力的影响

精细测绘靶基因的能力允许理解序列变异对效力的影响。图1中，在26bp筛查中使用的WCR Dv49的100bp节段与来自其它物种的多个相关序列进行对比(表7；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：55-72)。发现在Diabrotica sp.中Dv49直系同源物的序列高度保守。从比对中有可能看出一些位置的变异(例如高度有效筛查3节段)，其在Diabrotica和检测的所有其它物种(甚至其它甲虫物种，例如Tribolium castaneum)之间显著不同。因此可能制造新型嵌合序列，其掺入在靶Diabrotica种内具有高活性和保守性，但相反在该分类学类群外保守性差的小节段(siRNA大小的部分)。该新序列可产生针对Diabrotica sp.的高活性，但针对非靶物种(即使通过饮食表现物种是易感于RNAi的)的活性低。这些可以通过亚基的并列(由生物信息评估确定)而以不产生与其它基因序列偶然匹配的新型多连体(concatemers)排列。

表7、从Genbank中获得的(列出登陆号)或通过测序努力而确定的动物物种的基因序列，其在氨基酸水平与Dv49具有高度同一性。使用代表性的序列制备与Dv49的核苷酸比对。(SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NOs：55-72)

诸如筛查3节段的小的有效单元可能易于核苷酸变异。种内或种间的天然突变或之前存在的等位基因变异可降低启动靶向生物的基因抑制的能力。使用对应于Dv49(筛查节段3，来自Diabrotica barber)的序列检测该可能的影响。当与所有其它被测序的Diabrotica sp.比较时，该物种具有单核苷酸多态性(图1)。对来自Diabrotica barberi(Db49筛查3节段)的筛查3节段的检测显示其比天然Diabrotica virgifera筛查3节段在启动WCR幼虫死亡率上效力更差(表8)。用于害虫RNAi的最优序列应减缓这一可能的基因多样性，通过保证足够数量的高效siRNAs可以从转基因构建体产生，以靶向全部的期望物种范围。

表8、当在西部玉米根虫生物检测中检测时，Dy49 dsRNA单核苷酸多态性对从两Diabrotica种中克隆的26bp节段(筛查3)的影响。

¹致死率百分数和平均值的标准误差。

*与未处理的对照有显著性差异，P值＜0.05，Planned Contrasts。

检查来自表7罗列的生物的Dv49-相关序列的比对，结合对可产生有效dsRNA的那些序列内的区域的分析(例如，高Reynolds分数)，允许鉴定可能在昆虫生物检测中产生有效siRNAs的节段。

想要的转基因RNAi作物将特异地靶向某些害虫种但最小化与不希望的物种间相互作用的可能性。例如，理想地，该作物将具有单个简单的dsRNA构建体，其靶向来自Diabrotica virgifera virgifera(西部玉米根虫，WCR)，Diabrotica virgifera zeae(墨西哥玉米根虫，MCR)，和Diabrotica barberi(北部玉米根虫，NCR)的重要基因。靶物种也可包括其它物种，例如Diabrotica undecimpunctata howardii(南部玉米根虫，SCR)，Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata(西部有斑纹的黄瓜甲虫)；Diabroticaspeciosa；和Diabrotica viridula。通过对来自多个物种和种群以及适当的非靶生物的基因靶标进行比对，在dsRNA构建体中包括的基因序列的选择将是最优的。编码来自多种生物和种群的Dv49直系同源物的cDNA节段被测序用于比较。

使用源自成虫和/或幼虫的RNA的RT-PCR提供源材料以获得新序列。根据靶标，基于来自内部WCR EST文库的信息和公众可得的昆虫序列，使用特异或简并引物对扩增序列。至少两独立PCR产物被检测以产生每种序列的共有序列。

一些情况下，在来自多个个体的扩增产物中可观察到等位基因。当给定序列存在多个重复ESTs时，从存在于EST集合中的序列自身也可辨别等位基因。这些情况下，简并核苷酸标记被给出。这些简并性不表示有歧义的序列阅读。可对来自被选物种的多个区域代表的靶节段进行测序以便理解区域尺度的等位基因变异。

通常，序列同一性对应于之前观察到的系统发育关系(例如Clark等，2001)。WCR和MCR紧密相关，而NCR，也在virgifera种类群中，具有许多相同的同一性区段。SCR和BCB作为fucata种类群的成员明显更不同。每种Diabrotica spp.展示独有的小核苷酸多态性(SNPs)。如果任何SNPs落入关键区(其产生有效siRNAs)，它们可能影响dsRNA构建体所用的给定序列的效力。如果使用有限的靶序列组，例如在dsRNA构建体中的大约一个或小量的有效siRNAs，这可能变得很重要。具有可获得的序列允许对dsRNA构建体中的靶序列进行明智选择。然而，这些必须在生物检测中针对效力进行确证。

当序列信息不可知时，检查来自相关的Diabrotica spp.(例如BCB和SCR)的靶序列也可帮助确定diabroticine beetles的相对紧密相关的种间的可能的多态性区域。

实施例5、其它靶序列中的多态性

也获得了来自其它靶基因的序列。除了载体蛋白Flybase CG8055直系同源物(SEQID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：61-64)以外，这些靶序列包括下述基因的推定直系同源物：mov34(Flybase CG3416；SEQ ID NO：107-109)；Na/K-交换ATPase(Flybase CG9261；SEQID NO：110-114)；核糖体蛋白L19(Flybase CG2746；SEQ ID NO：115-118)；RNA聚合酶(Flybase CG3180；SEQ ID NO：119-121)；核糖体蛋白S9(Flybase CG3395；SEQ ID NO：122-125)；v-ATPase亚基2(Flybase CG3762；SEQ ID NO：126-135)。进行序列比较。不同甲虫种的Flybase CG9261直系同源物之间的序列关系(图2)允许系统发育比较(图3)，其区分virgifera类群(group)与fucata类群。这些序列扩大了可用于设计RNAi和其它用途中使用的最优节段的序列数。

实施例6、有效的玉米根虫基因靶标的作图：对V-ATP酶A亚基的26mer分析

选择100bp的Diabrotica virgifera V-ATP酶A亚基的100bp节段，以与筛查100bp的Dv49节段所用类似的方式进行详细的效力测绘。该100bp节段取自在区分剂量显示高效力的更大区域(图6)。该100bp区域具有多个可能的siRNAs，其具有高的预测的Reynolds分数高和低的二级结构)。合成寡核苷酸对(vATP100-1和vATP100-2；vATP100-3和vATP100-4(SEQ ID NO：73-76)以允许扩增正义或反义链转录本的模板。然后转录本链可以退火以产生100bp的dsRNA。

选择26bp节段用于精细测绘效力，以5bp记录盖住(tile)基础序列。对于每个合成寡核苷酸作为正义和反义对(vATP_26-1至vATP_26-30；SEQ ID NO：77-106)。退火后，使用被加入用于与Spe I/Eco RI切割载体(pCR2.1-TOPO)退火的核苷酸，通过粘末端连接克隆双链体。一旦克隆的序列被验证，如同对于实施例2中的Dv49筛查，使用寡核苷酸pCR2.1-5和pCR2.1-6制备用于dsRNA合成的模板。利用WCR饮食生物检测来检测生成的嵌入节段(包括候选靶序列)的效力。在RNAi表达构建体中可包括源自Diabrotica virgifera V-ATP酶A亚基的编码强力siRNA的核苷酸序列以及例如来自Diabrotica virgifera Dv49的序列，以产生编码dsRNA的构建体，其展示抑制靶生物生长和发育的多种作用模式。

表9、允许扩增Diabrotica virgifera V-ATP酶A亚基的100bp节段的寡核苷酸。插入了T7RNA聚合酶启动子(小写字母)(SEQ ID NOs：73-76).

表10、允许扩增Diabrotica virgifera V-ATP酶A亚基的26bp节段的寡核苷酸(小写字母)。大写字母表示被掺入的限制位点突出物以助于克隆(SEQ ID NOs：77-106)。

实施例7、用于基因抑制的转基因的优化

也可引入对于靶物种和非靶物种内变异的知识以选择最特异靶向目的害虫的siRNA-大小的区域，同时使可能降低有效性的SNP变异最小化。当源于已知转基因的植物产生的siRNAs被克隆并通过生物检测确认效力时，在给规定相同基础靶序列的情况下，作物和害虫种之间在有效的siRNA生产中的任何差别可变得很明显。在靶昆虫中有效抑制基因表达且具有降低的启动植物原位(in planta)转基因抑制的能力(以帮助防止转基因植物中的转基因沉默和切割)的那些序列可以被选择用于进一步分析。另外，对有效的和无效的siRNA的鉴定允许构建体的进一步优化。如果UTRs或其它表达元件被选择用于包括在编码dsRNA的转基因构建体中，那么选择那些具有产生有效的siRNAs最小可能性的元件可能是令人期望的。当进行密码子优化时，这可以扩展到编码区，导致有效siRNA生产或与内源性miRNAs匹配的潜能的降低，除非siRNA是令人期望的。

实施例8、工程化dsRNA的稳定表达

选择害虫RNAi靶标后，通过植物原位转基因稳定表达一种或更多种对应的dsRNA节段。目标是生产这样的初级转录本，其在被靶害虫消耗后最终产生有效siRNA，但经受转录后基因沉默(PTGS)的倾向降低，因为该转基因具有产生通过内含子放置而被打断的siRNA的序列(例如，图4-5所示)。

其它序列，例如5’和3’非翻译区(UTRs)和“填充”(产生至少植物加工所需最小大小的外显子)可以通过结合不引发有效siRNAs的序列(例如，直接串联正义序列)而产生。通过在生物检测中实际评估这些或使用考虑对于有效或无效siRNAs相同的生物物理参数的预测工具(例如Reynolds分数)可以确定效力。

该构建体设计可来自对害虫种显示高效力的小区域的鉴定。产生强力siRNAs的区域可被内含子打断，例如天然基因靶顺序的小节段或合成的排列，例如图5所示的重叠siRNAs。可以从不产生丰裕siRNAs的序列(即生物检测中或通过预测算法显示被RNA-诱导的沉默复合体(RISC)利用较差(Hammond等，2000)的那些序列)产生其它外显子序列和UTRs。由于工程化的转基因与加工的转录本不同，这是因为打断了潜在siRNAs的连续性的结果，因此该排列可以导致使转基因沉默的可能性的降低，包括甲基化和通过转录基因沉默(RITS)复合体(Verdel等，2004)的RNA-诱导的启动的最终转录沉默。初级转录本中内含子的存在也可减缓整个加工并可能提高更大初级dsRNA转录本的寿命，从而增强摄入可能。用于稳定“大”dsRNAs的其它设计(例如包括入靶向核仁的序列)将与这种风格的转基因构建相容。

通过用一个或更多个按上述设计的内含子和外显子延伸初级转录单元而添加其它靶序列，以便可以产生更长的dsRNA转录本。重叠强力siRNAs并在重叠中放置内含子可增大潜在靶序列的数量而最小化构建体内所需内含子的数量。

参考文献

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Claims (36)

1.提高dsRNA的昆虫作物害虫抑制活性的方法，包括：

(a)获得第一核酸节段，其在作为第一dsRNA表达并被昆虫作物害虫摄入时抑制所述昆虫作物害虫或其后代中靶基因的表达并且抑制由所述昆虫作物害虫或其后代的摄食，其中所述第一核酸节段的靶基因选自SEQ ID NOs:1和2；

(b)连接所述第一核酸节段至第二核酸节段以产生作为第三dsRNA表达的第三核酸节段，其中所述第二核酸节段是中性载体序列，并且在作为dsRNA表达时不抑制所述靶基因的表达和由昆虫作物害虫或其后代摄食，并且其中相对于单独的所述第一dsRNA，所述第三dsRNA显示对于昆虫作物害虫或其后代摄食的提高的抑制效力，其中所述第三核酸节段包含至少80个碱基；以及

(c)在植物或植物细胞中表达所述第三核酸节段，

其中所述昆虫作物害虫包括西部玉米根虫。

2.权利要求1的方法，其中所述第一核酸节段是通过包括以下步骤的方法获得的：

I） 获得起始核酸分子，其在作为dsRNA表达并被昆虫作物害虫摄入时抑制所述昆虫作物害虫或其后代的摄食；和

II）选择所述起始核酸分子的至少第一部分，所述第一部分在由所述部分表达的dsRNA被摄入后抑制昆虫作物害虫或其后代的摄食；和

III）使用所述部分作为步骤a）中所述第一核酸节段。

3.权利要求2所述的方法，其中所述起始核酸分子是cDNA。

4.权利要求2所述的方法，其中步骤II）包括从所述起始核酸分子制备一系列重叠或连续部分并从所述部分鉴定至少第一部分，所述第一部分在作为dsRNA表达并被昆虫作物害虫摄入时抑制所述昆虫作物害虫或其后代的摄食。

5.权利要求1所述的方法，进一步包括生产包括第一、第二和第三多核苷酸序列的重组载体，其中所述第一多核苷酸序列包括所述第三核酸节段且其中所述第三多核苷酸序列通过所述第二多核苷酸序列连接至所述第一多核苷酸序列，以及其中所述第三多核苷酸序列是所述第一多核苷酸序列的反向互补物以致所述第一和第三多核苷酸序列在转录成核糖核酸时杂交以形成由连接的第二核糖核苷酸序列所稳定的双链核糖核苷酸分子。

6.权利要求1所述的方法，其中所述第二核苷酸节段与所述昆虫作物害虫的核苷酸序列不是互补的。

7.权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸节段和所述第三核酸节段之一或两者包括内含子。

8.权利要求7所述的方法，包括导入内含子至所述第一核酸节段。

9.权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸节段包括与所述昆虫作物害虫的编码序列互补的19至80个、19至50 个或21至30 个连续碱基。

10.表达构建体，包括根据权利要求1所述的方法制备的第三核酸节段和可操作地连接至启动子的其反向互补物。

11.控制昆虫作物害虫或其后代摄食植物的方法，包括导入权利要求10所述的表达构建体至所述植物细胞。

12.由根据权利要求1所述的方法制备的第三dsRNA，其中所述第三dsRNA是重组dsRNA。

13.生产植物细胞的方法，包括用权利要求10所述的表达构建体转化植物细胞。

14.生产转基因植物的方法，包括用权利要求10所述的表达构建体转化植物。

15.生产用于表达具有提高的昆虫作物害虫抑制活性的特异性的dsRNA的表达构建体的方法，包括：

a） 获得起始核酸分子；

b） 在所述起始核酸分子内选择区域，所述区域在作为dsRNA表达时，在由所述昆虫作物害虫摄入从该区域表达的dsRNA后，抑制所述昆虫作物害虫或其后代中靶基因的表达并且抑制所述昆虫作物害虫或其后代的摄食，其中所述起始核酸的靶基因选自SEQ ID NOs:1和2；

c） 连接所述区域至第二核酸分子以产生第三核酸分子，所述第二核酸分子是中性载体序列，其中所述第三核酸分子包含至少80个碱基；

d） 产生表达构建体，其中所述第二核酸分子在作为dsRNA表达时不抑制所述dsRNA摄入后所述靶基因的表达和由昆虫作物害虫或其后代的摄食，其中相对于从该区域表达的dsRNA，所述第三核酸分子当作为dsRNA表达时显示对于昆虫作物害虫或其后代摄食的提高的抑制效力，

其中所述昆虫作物害虫包括西部玉米根虫。

16.权利要求15所述的方法，其中在所述起始分子内选择区域包括从所述起始核酸分子中筛选一系列重叠或连续区域并从所述区域鉴定至少第一区域，所述第一区域在作为dsRNA表达并由昆虫作物害虫摄入时抑制所述昆虫作物害虫或其后代的摄食。

17.权利要求15所述的方法，其中所述起始核酸分子是来自所述昆虫作物害虫的cDNA。

18.权利要求15所述的方法，其中所述区域包括与所述昆虫作物害虫的编码序列互补的19bp至50 bp。

19.权利要求18所述的方法，其中所述区域包括与所述昆虫作物害虫的编码序列互补的21bp至30 bp。

20.权利要求15所述的方法，包括鉴定所述起始分子内的至少第二区域，所述区域在作为dsRNA表达时抑制所述昆虫作物害虫或其后代的摄食，以及连接所述第二区域至所述第二核酸分子或第三核酸分子，所述第三核酸分子在作为dsRNA表达时在被昆虫作物害虫摄入从所述第三核酸分子表达的dsRNA后，不抑制由昆虫作物害虫或其后代的摄食。

21.权利要求15所述的方法，其中所述区域与非-昆虫靶作物害虫的核酸不是互补的。

22.权利要求15所述的方法，其中所述区域与所述昆虫作物害虫被分类入其中的种独有的核酸互补。

23.权利要求15所述的方法，其中所述区域与所述昆虫作物害虫被归类入其中的属独有的核酸互补。

24.权利要求15所述的方法，其中所述区域是西部玉米根虫独有的。

25.控制昆虫作物害虫或其后代摄食植物的方法，包括将由权利要求15所述的方法制备的表达构建体导入所述植物。

26.生产植物细胞的方法，包括用由权利要求15所述的方法制备的表达构建体转化植物细胞。

27.在植物中增强昆虫作物害虫控制的方法，包括在所述植物的细胞中表达至少两个dsRNA序列，其在由所述害虫摄入时发挥功能以抑制所述昆虫作物害虫内选自SEQ ID NOs:1和2的至少第一靶编码序列的表达，并且其中所述两个dsRNA序列的至少一个被连接到中性载体序列，并且所述dsRNA序列和所述中性载体序列一起包含至少80个碱基，并且其中所述昆虫作物害虫包括西部玉米根虫。

28.权利要求27所述的方法，其中所述两个dsRNA序列中的至少一个包括19bp至80 bp、19bp至50 bp或21bp至30 bp。

29.权利要求27所述的方法，其中所述两个dsRNA序列与所述昆虫作物害虫的至少两个靶编码序列互补。

30.权利要求29所述的方法，进一步包括在所述植物的细胞中表达至少第三dsRNA序列，其在由所述昆虫作物害虫摄入时发挥功能以抑制所述昆虫作物害虫内第三靶编码序列的表达，其中所述第三dsRNA序列与所述第三靶编码序列的一部分互补。

31.权利要求27所述的方法，其中所述两个dsRNA序列是从选自起始核酸分子的区域表达的，所述起始核酸分子在作为dsRNA表达时在被昆虫作物害虫摄入所述dsRNA后，抑制昆虫作物害虫或其后代的摄食。

32.权利要求31所述的方法，其中所述起始核酸分子是来自昆虫作物害虫的cDNA。

33.权利要求27所述的方法，进一步包括在细胞中表达选自由马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、Bacillus laterosporus杀虫蛋白和Bacillus sphaericus杀虫蛋白组成的组的多核苷酸序列。

34.权利要求33所述的方法，其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自由Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry2、ET29、ET37、二元杀虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、二元杀虫蛋白ET29和TIC810、二元杀虫蛋白ET37 和TIC812以及二元杀虫蛋白PS149B1组成的组。

35.权利要求27所述的方法，其中所述靶编码序列编码蛋白，所述蛋白预测的功能选自由肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶合成、细胞膜电势的维持、摄食部位形成、摄食部位发育、摄食部位维持、感染、蜕皮、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、发育及分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋亡组成的组。

36.权利要求29所述的方法，其中所述两个靶编码序列执行至少两种由所述dsRNA序列抑制的昆虫作物害虫存活所必须的功能，所述功能选自由害虫摄食、细胞凋亡、细胞分化和发育、有性生殖的能力或欲望、肌肉形成、肌肉抽搐、肌肉收缩、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、幼虫期过渡、蛹化、从蛹羽化、细胞分裂、能量代谢、呼吸和细胞骨架结构的形成组成的组。

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